ES2381729B1 - Test predictor de supervivencia global de adenocarcinoma de pulmón - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos in vitro para determinar el pronóstico de un sujeto diagnosticado de adenocarcinoma de pulmón. En particular, la invención se refiere a una firma de genes cuya expresión está correlacionada con el pronóstico de un sujeto que ha sido diagnosticado de adenocarcinoma de pulmón.

Description

Test predictor de supervivencia global de adenocarcinoma de pulmón.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un método in vitro para determinarel pronósticodeunsujeto diagnosticado de adenocarcinoma de pulmón.

Antecedentes de la invención

El cáncer de pulmón es una enfermedad desencadenada por el crecimiento descontrolado de las células en tejidos pulmonares. Este crecimiento da lugar a metástasis, cuando se produce la invasión de tejidos adyacentes e infiltración másalládelos pulmones.El cáncerdepulmóneselquemás muertes produceen hombresymujeres, siendo responsable de 1,3 millones de muertes anuales. Los síntomas más frecuentes incluyen dificultad respiratoria, tos, incluyendo tos sanguinolenta,ypérdidade peso.

La causamás frecuentede cáncerde pulmóneslaexposiciónalargoplazodel humodel tabaco.La apariciónde cáncerdepulmónenno fumadores representael15%delos casosyfrecuentementeseatribuyeauna combinaciónde factores genéticos,gas radón, asbestosycontaminación del aire incluyendo humo secundario (fumadores pasivos).

El cáncer de pulmón se clasifica en fases según el sistema TNM. El pronóstico está íntimamente unido a los resultadosdela clasificaciónenfasesyla clasificaciónenfasestambiénse usapara asignarpacientesa tratamientos tanto en ensayos clínicos como en la práctica médica. En el año 2009 se ha publicado una actualización del sistema TNM para la clasificación del cáncer depulmón (Rami-Porta R. et al., Ann Thorac Cardiovasc SurgVol. 15, No. 1), teniendo en cuenta los descriptoresT(tamaño del tumor),N(afectaciónganglionar)yM(presenciade metástasis).

Teniendo en cuenta el tamaño del tumor se puede clasificar en:

-

TX: el tumor no puede verse, sólo se detectan células de lavados bronquiales o esputos.

-

T0: no hay evidencia del tumor primario,

-

Tis: carcinoma in situ,

-

T1: tumorde hasta3cm,

-

T2: de hasta7cm,

-

T3: tumor mayorde7cm,

-

T4: tumorqueseextiendepornódulo/s adicional/esenlóbulo homolateral diferentedeltumor primario.

Segúnla afectaciónganglionar: -N0: no hay metástasis en losganglios regionales, -N1: Metástasis en adenopatías homolaterales intrapulmonares, peribronquiales y/ohiliares, incluyendo afec

tación por extensión directa, -N2: Metástasis en adenopatías homolaterales mediastínicas y/o subcarínicas, -N3: Metástasisen adenopatías contralaterales hiliareso mediastínicas,o escalénicas homo-o contralateraleso

supraclaviculares homo o contralaterales.

Teniendo en cuenta la presencia de metástasis a distancia se clasifica como:

-

M0: no hay metástasis,

-

M1: metástasis a distancia.

Existen46 tipos distintosde cáncer pulmonar, siendoel95%de origen epitelial (carcinomas)y se incluyenen5 tipos principales: carcinoma escamoso, carcinoma de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de células grandesytumor carcinoide.La distinción es importante porqueel tratamientovaríade tal manera queel adenocarcinoma de células grandes suele tratarse con cirugía, mientras que el carcinoma de células pequeñas suelen responder mejor a quimioterapiayradioterapia.El cáncerde pulmón puede visualizarse mediante radiografíaytomografía computariza-da.El diagnósticose confirma mediante biopsiageneralmente realizada mediante broncoscopiao biopsia guiadapor tomografía computarizada.

El adenocarcinoma es un cáncer epitelial originado en tejidos glandulares. Los tejidos epiteliales incluyen, pero nose limitan,apiel, glándulasy unagranvariedadde otros tejidosque recubrenlascavidadesyórganosdel cuerpo. Para ser clasificado como adenocarcinoma, las células no necesariamente deben formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular ya que derivan de ellos, en cambio esto no ocurre en los no diferenciados. Mediante la tinción de células procedentes de biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma u otro tipo de cáncer. Los adenocarciomas se pueden desarrollar en cualquier tejido debido a la naturaleza ubicua de las glándulas. Ya que las glándulas no secretanlas mismas substancias,debidoala funciónexocrina,se considera glandular comola forma malignaypor ello se denomina adenocarcinoma. Los tumores de glándulas endocrinas, como insulinoma, feocromocitoma, etc... no se suelen denominar adenocarcinomas, generalmente se denomina tumores neuroendocrinos. Si el tejido glandular es anormal, pero benigno, se denomina adenoma. Los adenomas benignos típicamente no invaden otros tejidos y raramente metastatizan, en cambio los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos. El adenocarcinoma de pulmón esuntipo concretodecarcinomade células grandesque comienzaenlascélulas glandularesquerevistenlos bronquios.

La cirugía es el principal tratamiento del adenocarcinoma de pulmón cuando no hay evidencias de diseminación en otras partes fueradel pulmón. Otros tratamientos posibles incluyen quimioterapiayradioterapia.Laevaluaciónde la función pulmonar es importante antes de recurrir a la cirugía por la eliminación parcial o total del pulmón que se produce.Siel tumor seha diseminado significativamente, es necesario recurriralaquimioterapia.

Elpronósticodelos pacientes concáncerde pulmón depende claramentedel estadio tumoralenquese diagnostica la enfermedad.Lasupervivenciaglobalalcáncerdepulmónesbaja(sólodel10-13%alos5años)y nohacambiado sustancialmente durantelas últimasdos décadasa pesardel desarrollode tratamientos multidisciplinariosen pacientes con estadios másavanzadosdela enfermedad.

La necesidad de un método para predecir supervivencia reside en la posibilidad de seleccionar una terapia adicional parapoder administrarlaenaquellos pacientesconbaja esperanzadesupervivenciayporel contrario espaciarenel tiempo aquellas terapias con mayores efectos secundarios a los pacientes con probabilidad alta de supervivencia.

Se han descrito distintos métodos para predecir supervivencia en los que se relacionan la presencia de varios marcadores pronósticos, en combinación con características patológicas, como el grado de diferenciación, tamaño del tumorylainvasión linfovascular. Sin embargo, ningunodeellos sehavalidado para su uso rutinario en clínica (Brundage MD. et al., Chest. 2002 Sep; 122(3):1037-57; Thunnissen FB. et al, Histopathology. 2006 Jun; 48(7):77986)).

Otros métodos predictores basados en perfiles de expresión no han sido útiles en clínica por la necesidad de laboratorios especializadosy complejos análisis estadísticos, por ejemplo, el método descrito en Potti A. et al., (N EnglJMed. 2006 Aug 10; 355(6):570-80).

Por tanto existe la necesidad de desarrollar nuevos métodos que permitan identificar los genes más relevantes implicados en adenocarcinomade pulmón,de forma que se puedan obtener firmas más fiablesybasadas en un menor número de genes. Dichas firmas permitirán la predicción del pronóstico de un paciente que sufre adenocarcinomade pulmónde forma más eficaz que los métodos descritos enel estadodela técnica.La identificaciónde nuevosfactores de pronóstico servirá para guiar en la selección de los tratamientos más adecuados.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico de un sujeto diagnosticado con adenocarcinoma de pulmón que comprende determinar los niveles de expresión de los genes identificados en lasTablas1y2 en una muestrade tejido tumoral procedentede dicho sujeto.

Enunsegundo aspecto,lainvenciónse refiereaun reactivo capazde detectarlosnivelesdeexpresióndelos genes de lasTablas1y2.

En otro aspecto,lainvenciónse refiereaunkitque comprendeal menosun reactivosegúnlainvención.

Enotro aspecto,lainvenciónse relaciona conel usodeunkitsegúnlainvenciónparael pronósticode pacientes diagnosticados con adenocarcinoma de pulmón.

Asimismo,lainvenciónse refiereenotro aspectoaun métodoparaseleccionar marcadores genéticospara predecir el pronóstico de un paciente con adenocarcinoma de pulmón que comprende:

(i) determinar los genes cuya expresión se encuentra alterada respecto a un valor de referencia en una muestra detumordeun animalno humano genéticamente modificadoque muestra propensióna desarrollar tumores de forma espontánea;

(ii) identificar los genes homólogos en humanos correspondientesa los genes identificados enla etapa (i);y

(iii) seleccionaraquellosgenes identificadosenlaetapa(ii)cuyaexpresiónen muestrasde tumoresde pacientes con adenocarcinomade pulmón con supervivenciade hasta5años está alterada con respectoalaexpresión de dichos genes en tumoresde pacientes con supervivencia inferiora5años.

Breve descripción de la figura

La Figura1muestrala representaciónde curvas Kaplan-Meierenlasque representanlas probabilidadesde supervivencia en relación al tiempo, tanto para el global de los pacientes (n=196) (Figura 1A) como para los pacientes de estadios tempranos (n=88) (Figura 1B).A:Pacientesde alto riesgo,B: pacientesde bajo riesgo,I: pacientesde riesgo intermedio.

Descripción detalladadelainvención

Los autores de la presente invención han seleccionado una firma de genes que son capaces de hibridar con unas sondas específicasy cuyaexpresión está correlacionada conla prediccióndela supervivenciade un sujeto diagnosticadocon adenocarcinomade pulmón.Los ensayosllevadosa caboporlosinventoreshan puestode manifiestoque dicha firma de genes se puede utilizar para predecir la supervivencia global con alta significancia, tal como se muestra en el Ejemplo 2.

Método para la determinación del pronóstico de adenocarcinoma de pulmón

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico de un sujeto diagnosticado con adenocarcinoma de pulmón que comprende determinar los niveles de expresión de los genes identificados en laTabla1y en laTabla2 en una muestra de tejido tumoral procedente de dicho sujeto, endonde un aumentodelaexpresióndelos genes identificadosenlaTabla1y una disminucióndelaexpresióndelosgenes identificados enlaTabla2 respectoa una muestra control es indicativode un peor pronóstico.

El término “pronóstico”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere, en general, al conjunto de datos que posee la ciencia médica sobre la probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso del tiempo

o historia natural de una enfermedad; es decir, es la predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo de una enfermedad en términos estadísticos. En particular, el término “pronóstico de un sujeto diagnosticado con adenocarcinoma de pulmón”, tal como aquí se utiliza, se refiere al conjunto de datos que permite asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso del adenocarcinoma de pulmón. Así, de acuerdo con la presente invención, incluye la capacidad de asignar una probabilidad de que ocurran determinadas situaciones en el transcurso de la enfermedad, basado en un método de determinación de los niveles de expresión de los genes identificados en la Tablas1y2de muestras de pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Esta asignación talycomo es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas,e.g., mediantela determinaciónde intervalosde confianza,determinacióndelp-valor,test de Student, funciones discriminantes de Fisher,etc. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el p-valor es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001.

Enel contextodela presenteinvención,el término“aumentodeexpresióndelos genes”se refiereaquelosniveles deexpresióndeungense encuentranelevadoscon respectoalosvaloresde referenciaocontroles,que corresponderían alniveldeexpresióndel mismogenen una muestra control.De acuerdo conla presenteinvención,se consideraque los niveles de expresión de un gen están aumentados con respecto a un valor de referencia cuando los niveles en la muestra del paciente están aumentados al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos un 110%, al menos un 120%, al menos un 130%, al menos un 140%, al menos un 150% o más.

Por otrolado,enel contextodela presenteinvención,eltérmino “disminucióndeexpresióndelosgenes”se refiere aquelosnivelesdeexpresiónungense encuentran disminuidosoreprimidoscon respectoalosvaloresde referenciao controles,que corresponderíanalniveldeexpresióndel mismogenen una muestra control.De acuerdo conla presente invención,se consideraquelosnivelesdeexpresióndeungenestán disminuidosconrespectoaunvalorde referencia cuando los niveles en la muestra del paciente están disminuidos al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un80%,al menosun85%,al menosun90%,al menosun95%,al menosun100%,al menosun110%,al menosun 120%, al menos un 130%, al menos un 140%, al menos un 150% o más.

En una realización particular del métododelainvención, dichos genes son los genes identificados en lasTablas1 y2, cuyas secuenciasde nucleótidos hibridan con las sondas identificadas enlaTabla3.

En una realización particular de la invención, dicha muestra de tejido tumoral es una muestra de un tumor primario, en particular, dicho tumor es de adenocarcinoma de pulmón. Así, a modo ilustrativo, dicha muestra de tejido tumoral puede ser una muestra de biopsia obtenida, por ejemplo, por resección quirúrgica.

La cuantificacióndelosnivelesdeexpresióndelosgenes identificadosenlasTablas1y2puede realizarseapartir delARN resultantedela transcripcióndedichosgenes(ARNm)o, alternativamente,apartirdelADN complementario (ADNc)de dichos genes.Por tanto,en una realización particular,la cuantificacióndelosnivelesdeexpresióndelos genes identificadosenlasTablas1y2comprendela cuantificacióndelARN mensajero (ARNm)de dichos genes,o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dichos genes, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

Adicionalmente, el método de la invención puede incluir la realización de una etapa de extracción con el fin de obtenerelARNtotal,loquepuede realizarse mediante técnicasconvencionales (Chomczynskiycols.,Anal. Biochem., 1987, 162:156; ChomczynskiP., Biotechniques, 1993, 15:532).

Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marcodelainvención para detectary cuantificar losnivelesde ARNmcodificados por los genes cuyas secuenciasde nucleótidos hibridan con los genesde lasTablas1y2 odesu ADNc correspondiente.Amodo ilustrativo,no limitativo,losnivelesde ARNm codificados por dichos genes pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNmyla cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesisytinción,o alternativamente, mediante Northern blotyempleode sondas específicas del ARNm delosgenesdeinterésodesuADNc correspondiente,mapeoconla nucleasaS1,RT-PCR, hibridación, microarrays, sondas luminex, etc. Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dichos ARNm codificados por los genes de lasTablas1y2también puede ser cuantificado mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) delARNm correspondienteseguidade amplificaciónycuantificacióndelproductodela amplificacióndedichoADNc.

Enuna realizaciónparticulardelainvención,la cuantificacióndelosnivelesdeexpresióndelosgenes identificados enlasTablas1y2se realiza mediante una reacciónen cadenadela polimerasa(PCR) cuantitativa multiplexoun array de ADN o ARN.

En otra realización particular de la invención, la determinación de los niveles de expresión de los genes identificados en lasTablas1y2 se realiza mediante un array de ADNque comprende las sondas identificadas en laTabla

3.

TABLA3

Así,dicho método comprendela determinacióndelosnivelesdeexpresiónde dichosgenesdelasTablas1y2con respectoaunvalorde referencia.Enuna realización particulardelainvención,dichovalorde referenciaeselvalorde expresióngénicadedichosgenesdelasTablas1y2enunamuestrade tumoresprimariosdepacientesconsupervivenciaglobal superiora5años. Preferiblemente, se considerará que los genes presentan unaexpresión aumentada cuando la relación de expresión de un gen es de al menos 1,5 veces con respecto a un valor de referencia, preferiblemente superiora2veces, más preferiblemente superiora,3,4,5y10veces.De igual modo, en una realización particularde la invención, se considerará que los genes presentan una expresión disminuida con respecto a un valor de referencia, cuando la relación de expresión de un gen es de al menos 1,5 veces inferior con respecto al valor de referencia.

Enuna realización particulardelainvención,el métodoparala determinacióndelmejoropeor pronósticodeun sujeto que ha sido diagnosticado de adenocarcioma de pulmón, comprende la realización de un análisis de regresión de riesgos proporcionalesen funciónde dichosvaloresdeexpresióndelos genes identificadosenlasTablas1y2.Por tanto, en una realización particulardelainvención,la determinaciónde dicho pronóstico comprende un análisisderegresiónde riesgos proporcionalesde dicho pronósticoen funcióndelosnivelesdeexpresióndelosgenes identificados en lasTablas1y2.

El término “análisisde regresiónde riesgos proporcionales”, tal como se utiliza enla presente memoria, se refiere a un método semiparamétrico que permite representar los efectosde un conjuntodevariables explicativas sobrela variabletiempodecambio(tiempodesupervivencia)omásbiensobrela probabilidadcondicionaldecambio,esdecir sobre la función de riesgo.

Tal comose describeenel Ejemplo2que acompañala presente descripción,losinventoreshan empleadoun análisis de regresión de riesgos proporcionales de tipo Cox para la determinación del pronóstico de un sujeto diagnosticado con adenocarcinomadepulmón. Dicho análisisde Cox asigna un coeficientede regresión para cada gen,de tal forma que el gen cuya expresión esté directamente correlacionada con la variable pronóstico, por ejemplo con aparición de muerte, es > 0,ysi suexpresión está relacionadainversamente con muerte es < 0. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicho análisis de regresión de riesgos proporcionales es un análisis de tipo Cox. En una realización más particular, en dicho análisis de tipo Cox se establece aparición de muerte como variable pronóstico. En una realización preferida, dicha apariciónde muerte es apariciónde muertea los3o5años.

Los inventores han demostrado que mediante el método de la invención es posible determinar el pronóstico de un pacienteconunaalta sensibilidadyespecificidad.Así,apartirdelosvaloresdeexpresióngénicadelosgenesdelas Tablas1y2según seha descrito anteriormente,ydelvalor estadísticodeWald del análisisde regresiónde riesgos proporcionales, los inventores han demostrado que es posible determinar dicho pronóstico determinando el valor de riesgo genómico, VRgen, aplicando la siguiente fórmula:

dondexieselvalordelniveldeexpresiónenlog2 estandarizado (media=0ydesviación estándar=1)decada uno de dichos genes identificados en lasTablas1y2;y

sieselvalordelestadísticodeWalddel análisisderegresióndetipoCoxparacada unode dichos genesidentificados en lasTablas1y2,

endondesidichovaloresmayorque ceroentonceses indicativodequedicho paciente presentapeor pronósticoy dondesi dichovalores menorque ceroes indicativodeque dicho paciente presentamejor pronóstico.

(Edad · 2,09) EST+(Sexo · 1,71) EST+(Estadio · 6,48) EST

en donde la edad es el valor en años del paciente en el momento del diagnóstico, el sexo se codifica como hombre: 1, mujer:-1y el estadio se codifica como IA:1,IB:2y estadios másavanzados:3. EST:valores estandarizados (media=0ydesviación estándar=1).

El término “estadio” del cáncer, según se utiliza enla presenteinvención, se refierea cada unade las etapasde desarrollo de un cáncer.Teniendo en cuenta la combinación de los descriptoresT(tamaño del tumor),N(afectación ganglionar)yM(presenciade metástasis),el adenocarcinomade pulmón se clasifica en distintos estadios.

El “estadio IA”, según la presente invención, se refiere a un tumor T1, N0, M0, es decir de hasta 3 cm y sin metástasis. El “estadio IB”, según se emplea en la presente invención, se refiere a un tumor T2, N0, M0, es decir de hasta7 cmy sinmetástasis. Por“estadios másavanzados” se entienden aquellos tumores mayoresde7 cmoque presentan algún tipo de metástasis.

En una realización preferida de la invención, la determinación del pronóstico de un paciente se lleva a cabo medianteel predictor genómico-clínico que combina ambosvaloresde riesgo,VRgenyVRclin, segúnla fórmula:

(VRgen)EST+(VRclin)EST

en donde EST representa los valores estandarizados (media=0; desviación estándar=1). Los valores más altos de VRgen−clin implican mayor riesgodefallecimiento tras padecer adenocarcinomade pulmón.

Comose observaenlaTabla6 enel Ejemplo3,losvaloresdel áreabajola curvadel predictor genómico-clínico son mayores,lo que indicaquela prediccióna partirde datos genómicosyclínicos combinados es mejor.

El valor del estadístico de Wald es un valor empleado comúnmente por el experto en la materia para saber si las variables que se introducen en el análisis estadístico son o no relevantes. Dicho valor se puede calcular según se describe enWaldA.(Transactionsofthe American Mathematical Society. 1943; 54: 426-482)ySilvey(SilveySD. Annals of Mathematical Statistics. 1959; 30: 389-407).

Por otro lado, para la puesta en práctica de la invención, aparte de cuantificar los niveles de expresión de los genes identificadosenlasTablas1y2, tambiénsepuede cuantificarelniveldeexpresióndelas proteínas codificadaspor dichos genes. Así, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de las proteínas codificadas porlos genes identificados en lasTablas1y2comprendela cuantificaciónde dichas proteínasovariablesde las mismas.

El término “proteína”, tal como aquí se utiliza, se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye, además, todas las formas de modificaciones químicas posttraduccionales, relevantes fisiológicamente, por ejemplo, glicosilación, fosforilación o acetilación, etc.

En la presente invención se entiende por “variante”, una proteína cuya secuencia de aminoácidos es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos de una proteína concreta. Una secuencia de aminoácidos es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 75%, típicamente de, al menos, un 80%, preferentemente de, al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún más preferentementede, al menos, un 95%, 97%, 98%ó99%, respecto a dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al.,. Basic local alignment search tool.JMol Biol. 1990 Oct5; 215(3):403-10].

El experto en la materia entiende que, las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína, son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención.

Por tanto, tal como aquí se utiliza, el término “variante” también incluye cualquier fragmento de una de las proteínas descritas en la presente invención. El término “fragmento” se refiere a un péptido que comprende una porción de una proteína.

Elniveldeexpresiónde las proteínas codificadas por los genes identificados en lasTablas1y2puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectarycuantificar dichas proteínas en una muestrade un sujeto.Amodo ilustrativo,no limitativo,losnivelesde dichas proteínas pueden cuantificarse,por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas (o a fragmentos de las mismas que contenga un determinante antigénico)yla posterior cuantificaciónde los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario)yanticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicasse incluyenelWestern-bloto transferenciaWestern, ELISA (ensayo inmuno absorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectarycuantificar dichas proteínas, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.

En una realización particular, la cuantificación de los niveles de proteína codificada por los genes identificados en lasTablas1y2 se realiza mediante western blot, ELISA, inmunohistoquímicao un arrayde proteínas.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un reactivo, de aquí en adelante reactivo de la invención, capazde detectar losnivelesdeexpresiónde los genesde lasTablas1y2.

En una realización particular,dicho reactivodelainvención comprende

(i)

un conjunto de ácidos nucleicos que comprende las secuencias de nucleótidos de las sondas identificadas enlaTabla3 o los productosde su transcripción,o

(ii)

un conjunto de anticuerpos, o un fragmento de los mismos capaz de detectar un antígeno, consistente en que cada anticuerpo o fragmento es capaz de unirse específicamente a una de las proteínas codificadas por los genes identificados enlasTablas1y2.

En una realización particular de la invención, dichos ácidos nucleicos son sondas y/o cebadores de ADN, ADNc o ARN. La obtención de dichos ácidos nucleicos puede realizarse por técnicas convencionales conocidas por el experto enla materiaa partirde las secuenciasde nucleótidosde los genesde lasTablas1y2.En general, dichas sondasy/o cebadores se pueden obtener de casas comerciales por síntesis química. Por otro lado, dichas secuencias de los dichos genes están bien descritasenla literaturay, por tanto, son conocidas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos un reactivo según la invención. Enuna realización particulardelainvención, dichokitesun arraydeADNoARNque comprendeun conjuntode ácidos nucleicos,en donde dicho conjuntode ácidos nucleicos comprendelas secuenciasde nucleótidosdelas sondas delaTabla3 o un fragmentode los mismos,o los productosde su transcripción.En una realización más particular, dicho kit comprende, además, una molécula de ácido nucleico de uno o varios genes de expresión constitutiva.

En la presente invención se entiende por “genes que se expresan de forma constitutiva” o “genes de expresión constitutiva”,aaquellosgenesquesiempreestánactivosoquese transcribende manera constante.Ejemplosdegenes que seexpresande forma constitutiva son2-mioglobulina, ubiquitina, proteína ribosomal 18S, ciclofilinaA, receptor de transferían, actina, GAPDH, proteína de activación de la tirosina3-monooxigenasa/triptófano5-monooxigenasa (YWHAZ), ubiquitina, beta-actinay β-2-microglobulina.

En otra realización particular de la invención, el kit de la invención comprende un conjunto de anticuerpos, en donde dicho conjunto de anticuerpos consiste en anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente conlas proteínas codificadasporlos genes identificadosenlasTablas1y2 o cualquiervariantede dichas proteínas. En una realización particular, dicho kit comprende, además, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capacesde unirse específicamente con las proteínas codificadas por unoovarios genesdeexpresión constitutiva.

Métodode selecciónde marcadoresgenéticosde adenocarcinomade pulmón

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar marcadores genéticos para predecir el pronóstico de un paciente de adenocarcinoma de pulmón que comprende:

(i)

determinar los genes cuya expresión se encuentra alterada respecto a un valor de referencia en una muestra detumordeun animalno humano genéticamente modificadoque muestra propensióna desarrollar tumores de forma espontánea;

(ii)

identificar los genes homólogos en humanos correspondientesa los genes identificados enla etapa (i);y

(iii) seleccionaraquellosgenes identificadosenlaetapa(ii)cuyaexpresiónen muestrasde tumoresde pacientes con adenocarcinomade pulmón con supervivenciade hasta5años está alterada con respectoalaexpresión de dichos genes en tumoresde pacientes con supervivencia inferiora5años.

El término “gen supresor de tumores”, según se emplea aquí, se refiere a un gen que reduce la probabilidad de que una célula en un organismo multicelular se transforme en una célula cancerígena, inhibiendo la proliferación celular excesiva.

El término “expresión alterada”, según se emplea en la presente invención, se refiere a un aumento o disminución de los niveles de ARNm o proteína con respecto a los niveles de expresión en una muestra de referencia o control de un sujeto que no presenta la enfermedad.

El término “propensióna desarrollar tumores”,segúnse utilizaenla presenteinvención,se refiereala situaciónen la que el sujeto presenta al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100% de probabilidades de desarrollar tumores a lo largo del tiempo.

El término “gen homólogo”, según se emplea aquí, se refiere a una secuencia nucleítidica relacionada con un segundogenpor descendenciade una secuenciadeADN ancestral comúnyseparadosporelprocesode especiación

o duplicación genética, pero con expresiones fenotípicas similares.

El término “supervivencia”, según se emplea enel presente documento, se refierea un períodode tiempo definido desdeel diagnóstico del cáncer en queel paciente permanecevivo hasta queel pacientefallece.

Enel Ejemplo1que acompañala presenteinvención se describe un modode realización particular del métodode la invención. Así, en una realización particular, se extrae el ARN total de dicha muestra de tejido tumoral de animal no humanoydicho ARN se analiza para determinar los genes cuyaexpresión se encuentra alterada en dicha muestra de tumor con respecto a un valor de referencia. En una realización particular, dicho valor de referencia es el valor de la expresión génica en una muestra de tejido no tumoral procedente de dicho animal. Dicho valor de expresión se puede obtener,por ejemplo,apartirdelosvalores resultantesdelaseñaldeexpresióngénicaenunarraydeexpresión génicade dicho modelo animalno humanosegúnseexplicaenel Ejemplo1que acompañala presente descripción. Así, dichos valores corresponden con los valores en los archivos tipo CEL (formato CEL) según el software GCOS (GeneChip®Operating Software) de Affymetrix.

En una realización particular del método para la selección de marcadores genéticos de la invención, dicho animal no humano es un animal en el que la expresión génica del gen Tp53 se encuentra inhibida. En otra realización particular, dicho animal presenta inhibida, además,laexpresión génicadelgenRb.Los genesTp53yRb1 codifican respectivamente los supresores tumorales p53ypRb.Dichos modelos animales, deficientes para los genes p53yRb (p53-yRb-), desarrollan espontáneamente carcinomasepidérmicos, altamenteinvasivos.Portanto,enuna realización particular, dicho animal es un animal no humano que desarrolla carcinomas epidérmicos de forma espontánea.

Para poner en práctica la etapa (ii)del método para seleccionar marcadores genéticos para predecir el pronóstico de un paciente con adenocarciomade pulmón, se identifican los genes homólogos en humanos correspondientesa los genes identificados en la etapa (i).Para ello, se emplean técnicas convencionales de mapeo de genes homólogos conocidas por el experto en la materia. En particular, los inventores han mapeado los identificadores de sondas de Affymetrix del animal no humano con símbolosde genes humanosa travésdela búsquedade identificadores U133A mediante el empleo de la utilidad web AILUM (Array Information Library Universal Navigator) (Chen R, et al., Nat Methods 2007; 4(11): 879).

En una última etapa de dicho método, se seleccionan aquellos genes identificados en la etapa (ii) cuya expresión en muestrasde tumoresde pacientes con supervivenciade hasta5años está alterada con respectoalaexpresiónde dichos genes en tumoresdepacientes con supervivencia inferiora5años.

En una realización particular de la invención, la etapa (iii) se lleva a cabo mediante un análisis de regresión de riesgos proporcionales según se ha comentado anteriormente. En una realización más particular, dicho análisis de regresión es un análisis de tipo Cox. En una realización preferida, dicho método de tipo Cox establece aparición de muerte comovariable pronóstico.En una realización aún más preferidadelainvención,la aparicióndemuerte esa5 años.

Además,losinventoreshanaplicadoeltestdeWald(WaldA.TransactionsoftheAmerican MathematicalSociety 1943; 54: 426-482; SilveySD. Annals of Mathematical Statistics 1959; 30: 389-407) para analizar la hipótesis nula de queel coeficientesea0(norelacionadoconlavariable pronóstico), asignándoseacadagenunvalorde estadísticode Wald, su correspondiente p-valor.

En una realización particular, la determinación de la expresión de dichos genes según la etapa (iii) comprende la cuantificacióndelARN mensajero (ARNm)de dichos genes,ounfragmentode dichoARNm,elADN complementario (ADNc), o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

En una realización más particular,la cuantificaciónde losnivelesdeexpresiónde los genes segúnla etapa (iii) se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa multiplex o un array de ADN o ARN.

En una realización particular,la cuantificaciónde losnivelesdeexpresiónde los genessegúnla etapa (iii) comprende la cuantificación de los niveles de proteína codificada por dichos genes. En una realización más particular,la cuantificaciónde losnivelesde proteína se realiza mediante western blot, ELISAo un arrayde proteínas.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo1

Análisis de tumores epidérmicos de ratón

Una caracterización previa de los ratones transgénicos utilizados se ha publicado recientemente (Martínez-Cruz,

A. et al.,CancerRes 200868: 683-92).Los modelos descritos son ratones K14Cre(expresanla recombinasaCreenla capa basal de epitelios estratificados) cruzados con ratones con exones esenciales flanqueados por secuencias loxP en losalelosdelosgenesTp53(modelop53-),oenlosalelosTp53yRb1 simultáneamente(modelop53-;pRb-).Tp53 yRb1 codifican respectivamente los supresores tumorales p53ypRb. Se trata pues de modelos de deleción génica en epitelios estratificados. Ambos modelos desarrollan espontáneamente carcinomas escamosos epidérmicos de tipo poco diferenciado o indiferenciado, altamente invasivos.

Se purificóARNde carcinomas epidérmicos congeladosde ratonesdeficientesenp53(p53-)(7tumores)ydeficientesenp53ypRb (p53-/pRb-)(8tumores).Como controles,seobtuvoARNdepielnormalpreservadaenRNAlater de animales adultos(8 semanas edad,5muestrascontrol).La integridaddelas poblacionesdeARNse chequeómediante el uso del sistema Bioanalyzer (Agilent). Todas las muestras de ARN pasaron los criterios de calidad para análisis de microarrays (número RIN (del inglés, RNA integrity number) por encima de 6). La hibridación al GeneChip de Affymetrix Mouse GeneExpression MOE430 2.0 se realizó en el Servicio de Genómica del Centro de Investigacióndel CáncerdeSalamanca, utilizandolosprotocolos estándardeAffymetrix.Losvaloresdeexpresiónse extrajeron de los archivos CEL (resultantes del escaneo de la fluorescencia según el software GCOS de Affymetrix), medianteel métodoRobust MultichipAverage(RMA) (Bolstad,B.M et al., Bioinformatics 2003 19: 185-93, Irizarry,

R. A., et al., Biostatistics 2003 4: 249-64).Todas las hibridaciones pasaron los criterios de calidad incluidos en el programa informático RMAExpres, usando las gráficas RLEyNUSE. Los datos se encuentran disponibles enla base dedatos GEO del NCBI, bajoel identificador GSE11990.Se realizaron análisisdeexpresión génica diferencialde los tumores de ratón comparados con tejido normal mediante elTest de laTde Student (Ttest)ySAM (Significant Analysis of Microarrays) (Tusher, V. G. et al., ProcNatl Acad SciUSA 2001 98: 5116-21) en el software libre MultiexperimentViewer 4.0 (MeV4) (Saeed,A.I et al., Biotechniques2003 34: 374-8). Las sondas se seleccionaron si pasaban dos criterios: (i) análisis Ttest conp-valor de probabilidad, corregido por el métodoFalse Discovery Rate

(1)óFDR < 3x10−7;y(ii) análisis SAM con FDR< 1x10−3.Un totalde682 sondasse seleccionaron comoexpresados diferencialmente, siendo 371 sobreexpresadosy311 regulados negativamente en los tumores frentea tejido normal. Los identificadores de Affymetrix del chip usado (MOE430 2.0) se mapearon al símbolo de gen homólogo de humano usando la utilidad web Ailun (Chen R. et al., Nat Methods 2007 4: 879), lo que resultó en un número de 427 genes humanos.

Ejemplo2

Predictorde supervivencia globalgenómico-clínicode adenocarcinomade pulmón

2.1 Obtención delpredictorgenómicode supervivencia global

Los datos crudosde hibridación a microarraysde tumores primariosde adenocarcinomade pulmón humanoy sus correspondientes datos clínicos, realizados con la versión de GeneChip de Affymetrix Human Gene Expression U133A, se descargaron desde la página web https://array.nci.nih.gov/caarray/project/jacob-00182. Estos datos correspondenaun estudio multicéntricocondatosdeexpresiónde442adenocarcinomasdepulmón,cuyoobjetivofueelde realizarprediccionesdesupervivenciabasadoenexpresióngénica(Director’sChallenge ConsortiumfortheMolecular Classification of Lung Adenocarcinoma) (Shedden, K. et al Nat Med 2008 14:822-7), con muestras provenientes de 4instituciones distintas: “University of Michigan Cancer Center” (UM), “Moffitt Cancer Center” (HLM), “Memorial Sloan-Kettering Cancer Center” (MSK),y“Dana-Farber Cancer Institute” (CAN/DF). Los archivos CEL se tomaron para extraer los valores de intensidad de señal usando el programa RMAExpress.

Los tumoresde estadioIAyIB (n=275)se utilizaron como grupode entrenamiento(training set). Un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox se realizóusandosupervivenciaglobal(SG) a5añosparalas707sondas de U133A correspondientes a los 427 genes humanos mapeados del análisis de expresión diferencial de los tumores de ratón, usando la utilidad de supervivencia implementada en la página web GEPAS (www.gepas.org) (Vaquerizas,

J.M et al., Nucleic Acids Res 200533: W616-20).Elanálisisde Cox asigna un coeficientede regresiónde Cox para cada sonda, de tal forma que una sonda cuya expresión esté directamente correlacionada con aparición de muerte es > 0,ysi suexpresión está relacionadainversamente con muerte es < 0. Además, se aplica el test deWald (Silvey,

S. D. Annals of Mathematical Statistics 1959 30: 389-407, Wald, A. Transactions of the American Mathematical Society 1943 54: 426-482) para analizar la hipótesis nula de que el coeficiente sea0 (no relacionado con muerte), asignándosea cada sonda unvalorde estadísticodeWald, su correspondiente p-valor (Benjamini,Y et al., Journal of theRoyal Statistical SocietyB1995 57: 289-300). Las sondas convaloresde estadísticodeWald >2,5 o <-2,5 fueron elegidas para análisis posteriores (36 sondas) (Tabla 4). Estos análisis tienen como objetivo comprobar la capacidad de predicción de supervivencia global de adenocarcinoma de pulmón humano de los patrones de expresión génica.

Se aplicó una fórmula para calcular un “valor de riesgo genómico” (VRgen)de cada tumor basado en las 36 sondas

dondexieselvalordelniveldeexpresiónenlog2 estandarizado (media=0ydesviación estándar=1)decada uno de dichos genes identificados en lasTablas1y2;y

sieselvalordel estadísticodeWalddel análisisderegresióndetipoCoxparacada unode dichos genes identificados en lasTablas1y2.

Dicha fórmula asignaunvalor numéricoa cada muestra(VRgen),basadoenla sumadelos productosdelosvalores de expresión estandarizados de cada gen (media=0, desviación estándar=1) y los valores del estadístico de Wald respectivos obtenidossegúnel análisisdeCoxexplicado anteriormente(Tabla4).LosvaloresVRgendelos275 tumores delos estadiosIAyIBdel estudiodel “Director’s Challenge Consortium” fueron calculados.Se computaron Curvas Operador Receptor (COR)paralosVRgen usandocomovariable dependientelavariabledeSupervivenciaGlobala3ó 5años, censurada. El test basado en la firma de 36 sondas nos permite predecir Supervivencia Global con significación (área bajola curva (ABC)=0,664, p-val=0,0004a3años; ABC=0,654, p-val=0,00007a5años).

(Tabla pasa a página siguiente)

ES2381 729A1 2.2 Obtención de un predictor clínico de supervivencia global

Simultáneamente, se realizó un análisis similarde Cox, pero para lasvariables estadio,EdadySexo del paciente. En esta ocasiónse utilizaronlos datosde todoslos pacientesdeUM,ydeHLM (n=253).Enel casodelavariable estadio,de codificó comovalor=1al estadioIA, comovalor=2al estadioIB,ycomovalor=3a estadiosmásavanzados comoII,IIIóIV.Enel casodelavariable Edaddel paciente,se consideró dichavariable como continua.Enelcaso delavariableSexo, se codificó comovalor=1al sexo=hombre,y comovalor=-1al sexo=mujer.

TABLA5

Valores estadísticos del análisis de Cox de las variables clínicas

Paracada pacientese calculóunvalorderiesgo clínico(VRclin)similaralVRgen,peroapartirdelostres parámetros clínicos descritosydelosvaloresdelos estadísticosdeWald mencionados(Tabla5), usandolacodificación descrita de dichos parámetros clínicosy segúnla fórmula descritaa continuación:

VRclin = (Edad · 2,09) EST+(Sexo · 1,71) EST+(estadio · 6,48) EST

En donde la Edad indica el valor en años del paciente en el momento del diagnóstico, la variable Sexo se ha codificado comovarón=1, hembra=-1yel estadio fue codificado como IA=1; IB=2; resto=3.

EST: valores estandarizados (media=0; desviación estándar=1).

Se calcularonlosvaloresVRclindelos253 tumoresdelos pacientesdeUM,ydeHLMdel estudiodel “Director’s Challenge Consortium”. Se computaron Curvas Operador Receptor (COR) para los VRclin usando como variable dependientelavariabledeSupervivencia Globala3ó5años, censurada.El test clínico permitió predecir Supervivencia Globalcon significación(ABC=0,631,p-val=0,0006a3años; ABC=0,657,p-val=0,000001a5años).

2.3 Obtenciónde unpredictor combinadogenómico-clínicode supervivencia global

Se calculó para cada paciente un valor de riesgo genómico-clínico (VRgen−clin), basado en losVRgenyVRclin según la fórmula

VRgen−clin =(VRgen)EST+(VRclin)EST

EST: valores estandarizados (media=0; desviación estándar=1).

Se calcularonlosvaloresdelostresVR(VRgen,VRclinyVRgen−clin)yse usaronparala prediccióndelasupervivencia global en nuevos tumores.

Ejemplo3

Validacióndelospredictoresgenómico, clínico,ógenómico-clínicode supervivencia en gruposde adenocarcinomas de pulmón externos de otros estudios

Se utilizarondos gruposdetumoresparalavalidaciónque contienenla información genómicayclínica necesaria:

(1) tumoresde estadiosII,IIIyIVdelos centrosMSKyCAN/DFdel mismo estudio “Director’s Challenge Consortium” (n=67)y(2)grupode tumores del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center independiente del incluido enel estudio del “Director’s Challenge Consortium”(Nguyen,D.X. et al., Cell 2009 138:51-62),yque incluye pacientes detodoslos estadios(I,II,IIIyIV) (n=129).Se analizaronlos tumoresen grupo,biendetodos ellosen conjunto,bien del subconjuntode tumoresde estadiosIAyIB,cuyo comportamiento clínicoesengeneralmás difícilde predecir.

En primerlugar, se computaron curvas COR parala predicciónde supervivencia globala5años, tanto del total delos tumores (n=196) comodel subgrupode tumoresde estadioI(n=88). Comose muestraenlaTabla6, tantoel predictor genómico comoel genómico-clínicoposeenvaloresde ABC significativos tanto en tumoresde todoslos estadios comoenlos tumorestempranos.Además,sepuede apreciarquelosvaloresdeABCson mayoresenel caso del predictor genómico-clínico,lo que indica quela predicciónapartirde datos genómicosyclínicos combinadoses mejor.

TABLA6

Análisis CORdelapredicciónde supervivencia globala5años

En segundo lugar, se decidió dividir los tumores en tres percentiles o grupos de riesgo en función del VRgen−clin:(i) percentil33devalores altos=grupodealtoriesgo(A);(ii) percentil66devalores intermedios=grupoderiesgointermedio (I);y(iii) percentil 100devalores bajos=grupode bajo riesgo (B).Apartirde esta estratificaciónde pacientes, se representaron curvas de Kaplan-Meier, tanto para el global de los pacientes (n=196), (Figura 1A) como para los pacientes de estadios tempranos (n=88) (Figura IB). Como se puede observar, las probabilidades de supervivencia de los3gruposesacordeconelgrupoderiesgoalque pertenece.Además,enelgrupodebajoriesgodelospacientesde estadio tempranonoexiste ningún pacientequehayafallecido,loque demuestraqueel método basadoenel cálculo de VRgen−clin es muy sensible.

Por otro lado,sejuntaronlos pacientesde riesgo alto(A) e intermedio(I)enun único grupo(AI)y, comparando conel grupode riesgo bajo (B), se calculó especificidady sensibilidaddela predicciónde supervivenciaa5años (Tabla7). Finalmente,sehizo análisisderegresióndeCox tambiéna5años,tantodelavariableVRgen−clin continua como dicotómica (grupo AI frente a B) (Tabla 8). Los resultados demuestran que el test genómico-clínico es capaz de distinguir grupos de pacientes con riesgo de muerte significativamente distinto tras padecer adenocarcinomade pulmón.

TABLA7

Sensiblidadyespecificidaddelaprediccióngenómico-clínicade supervivencia globala5años

TABLA8

AnálisisderegresióndeCoxdepredicciónde supervivenciagenómico-clínica

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método in vitro para determinar el pronóstico de un sujeto diagnosticado con adenocarcinoma de pulmón que comprende determinarlosnivelesdeexpresióndelos genes identificadosenlasTablas1y2 en una muestrade tejido tumoral procedentede dicho sujeto,en dondeun aumentodelaexpresióndelosgenes identificadosenlaTabla 1yuna disminucióndelaexpresióndelos genes identificadosenlaTabla2 con respectoaunvalorde referenciaes indicativo de un peor pronóstico.

2. 2.

   Método segúnla reivindicación1, en dondela cuantificaciónde losnivelesdeexpresiónde los genes identificados en lasTablas1y2comprendela cuantificación del ARN mensajero (ARNm)de dichos genes,o un fragmentode dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dichos genes, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

3. 3.

   Método según cualquierade las reivindicaciones1 a2, en dondela cuantificaciónde losnivelesdeexpresión de los genes identificados en lasTablas1y2 se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa multiplex o un array de ADN o ARN.

4. 4.

   Métodosegúncualquieradelasreivindicaciones1a3, dondela determinacióndelosnivelesdeexpresióndelos genes identificados en lasTablas1y2 se realiza mediante un array de ADN que comprende las sondas identificadas en lasTabla3.

5. 5.

   Método según cualquierade las reivindicaciones1 a4, dondeladeterminaciónde dicho pronóstico comprende un análisis de regresión de riesgos proporcionales de dicho pronóstico en función de los niveles de expresión de los genes identificados en lasTablas1y2.

6. 6.

   Método según la reivindicación 5, donde dicho análisis de regresión de riesgos proporcionales es un análisis de tipo Cox.

7. 7.

   Método según la reivindicación 6, donde en dicho análisis de tipo Cox se establece aparición de muerte como variable pronóstico.

8. 8. Método segúnla reivindicación7, donde dicha apariciónde muerte esa5años.
9. 9. Método según cualquierade las reivindicaciones6 a8, dondela determinaciónde dicho pronóstico se llevaa cabo aplicandola siguientefórmula:

   en dondexi eselvalor delniveldeexpresiónen log2 estandarizado (media=0ydesviación estándar=1)de cada unode dichos genes identificados en lasTablas1y2;y

   sieselvalordelestadísticodeWalddel análisisderegresióndetipoCoxparacada unode dichos genesidentificados en lasTablas1y2 según las reivindicaciones6 a8,

   endondesidichovaloresmayorque ceroentonceses indicativodequedicho paciente presentapeor pronósticoy dondesi dichovalores menorque ceroes indicativodeque dicho paciente presentamejor pronóstico.

10. 10.

    Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones6 a9,que comprendeademás determinaral menosun parámetro clínico seleccionado entrela edad del sujeto,el sexo del sujetoyel estadio tumoral, en dondea menor edaddel sujeto, sexo masculinoygrado tumoral másavanzado, es indicativode un peor pronóstico.

11. 11.

    Método según la reivindicación 1, en donde la cuantificación de los niveles de expresión de los genes identificados en lasTablas1y2comprendela cuantificaciónde losnivelesde proteína codificada por dichos genesode una variante de la misma.

12. 12.

    Método según la reivindicación 11, en donde la cuantificación de los niveles de proteína se realiza mediante western blot, ELISA o un array de proteínas.

13. 13.Un reactivo capazde detectarlosnivelesdeexpresióndelosgenes identificados enlasTablas1y2,que comprende:

    (i)

    un conjunto de ácidos nucleicos que comprende las secuencias de nucleótidos de las sondas identificadas enlaTabla3 o los productosde su transcripción,o

    (ii)

    un conjuntode anticuerpos,oun fragmentodelos mismos capazde detectarun antígeno, consistenteen que cada anticuerpo o fragmento es capaz de unirse específicamente a una de las proteínas codificadas por los genes cuyas secuenciasde nucleótidos hibridan con las sondas identificadas enlaTabla3.

14. 14. Reactivo según la reivindicación 13, en donde los ácidos nucleicos son sondas y/o cebadores de ADN, ADNc

    o ARN.
15. 15. Un kit que comprende al menos un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.

16. 16.

    Kit según la reivindicación 15, donde dicho kit es un array de ADN o ARN que comprende un conjunto de ácidos nucleicos, en donde dicho conjunto de ácidos nucleicos comprende las secuencias de nucleótidos de las sondas delaTabla3,o un fragmentode los mismos,o los productosde su transcripción.

17. 17.

    Kit según la reivindicación 16, que comprende además, una molécula de ácido nucleico de uno o varios genes de expresión constitutiva.

18. 18.

    Kit según la reivindicación 17 que comprende un conjunto de anticuerpos, en donde dicho conjunto de anticuerpos consiste en anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente con las proteínas codificadas por los genes identificados en lasTablas1y2 o cualquiervariantede dichas proteínas.

19. 19.

    Kit según la reivindicación 18, que comprende además, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente con las proteínas codificadas por uno o varios genes de expresión constitutiva.

20. 20.

    Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 para el pronóstico de pacientes diagnosticados con adenocarcinoma de pulmón.