ES2640532T3

ES2640532T3 - Métodos para la detección de papilomavirus humano y proporcionar un pronóstico para el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello

Info

Publication number: ES2640532T3
Application number: ES12850526.0T
Authority: ES
Inventors: Elizabeth Franzmann; Lutecia PEREIRA; Isildinha M. REIS; Robert C. Duncan
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2032-11-15
Also published as: AU2018203361A1; WO2013074793A1; US20140329230A1; PE20141565A1; IL232556A; EP2780714B1; JP2014533372A; EP2780714A4; US10180430B2; BR112014011563B1; CN104067126B; AU2020277155A1; MX2014005887A; AU2012340441A1; CA2855971A1; CO6980621A2; CN104067126A; MX352642B; AU2018203361B2; IL232556A0

Abstract

Un método para determinar un riesgo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) en un sujeto infectado con papilomavirus humano (HPV), comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra obtenida a partir de un fluido corporal del sujeto; b) ensayar un nivel de solCD44 en la muestra; c) ensayar un nivel de proteína total en la muestra; d) combinar el nivel de solCD44 medido en la muestra con el nivel de proteína total medido en la muestra y el estado de HPV del sujeto, proporcionando así una puntuación combinada; e) proporcionar una puntuación predictiva para tener el riesgo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, en el que la puntuación predictiva se obtiene mediante un análisis estadístico de solCD44 y la proteína total medida y estado de HPV de una población con un riesgo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; y f) determinar el riesgo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello en el sujeto cuando la puntuación combinada excede la puntuación predictiva.

Description

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Metodos para la deteccion de papilomavirus humano y proporcionar un pronostico para el carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello

CAMPO

La materia de estudio divulgada aqrn se relaciona generalmente con metodos y kits para la evaluacion del riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello.

ANTECEDENTES

El carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) afecta a 50.000 personas en los Estados Unidos y 600.000 personas en todo el mundo cada ano. Los principales factores de riesgo son el consumo de tabaco y alcohol y la infeccion por el virus del papiloma humano (HPV).

Hasta la fecha, no hay un programa o prueba de deteccion de HNSCC ampliamente aceptado (vease, por ejemplo, Vokes et al., N Engl J Med, 328: 184-94 (1993), Lingen et al., Curr Opin Oncol, 13:176-82 (200l), Forastiere et al., N Engl J Med 345:1890-1900 (2001); Patton, Orol Oncol, 39: 708-723 (2003), O'Hara et al., Clin Otolaryngol, 27:133-4 (2002); Smart, Cancer 72:1061-5 (1993); Sankaranarayanan et al., Cancer, 88: 664-73 (2000), Sankaranarayanan et al., Lancet 365:1927-33 (2005)) porque el estandar de oro, la criba mediante examen ffsico seguida de una biopsia, tiene una sensibilidad y una especificidad limitadas (64 % y 74 %, respectivamente) (Brocklehurst et al., Cochrane Database Syst Rev. 11: CD004150 (2010)) y pruebas diagnosticas moleculares todavfa se encuentran en desarrollo (Nagler, Oral Oncol., 45: 1006-10 (2009), Mahfouz et al., Eur Arch Otorhinolaryngol, 267:851-60 (2010)). Se dispone de tecnicas auxiliares para la deteccion del cancer oral que utilizan colorantes, autofluorescencia o citoiogfa exfoliativa, pero las revisiones recientes cuestionan si mejoran las tasas de deteccion temprana (Patton et al., J Am Dent Assoc, 139:896-905 (2008); Lingen et al., Oral Oncol 44:10-22 (2008)). Por lo tanto, los esfuerzos se han centrado en herramientas de diagnostico molecular. Varios estudios que probaron saliva para perfiles de expresion de ARN (Li et al., Clin Cancer Res, 10:8442-8450 (2004)), descubrimiento de microARN (Park et al., Clin Cancer Res, 15:5473-5477 (2009)), y el analisis proteomico (Hu et al., Clin Cancer Res, 14:6246-6252 (2008)) son prometedores pero son algo complicados y no validados (Nagler, Oral Oncol., 45:1006-10 (2009), Mahfouz et al Eur Arch Otorhinolaryngol, 267:851-60 (2010)).

Esta complejidad puede verse por el numero de diferentes metodos de cribA molecular para HNSCC propuesta hasta la fecha en la literatura. Por ejemplo, Franzmann et al. (Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 14(1): 735-739 (2005)) sugirio el uso de CD44 salival soluble (solCD44) como un biomarcador para HNSCC, y el mismo grupo sugirio en Franzmann et al., Head Neck, 34(5): 687-695 (2013) que los niveles de solCD44 podnan usarse en combinacion con los niveles totales de protemas salivales en la criba de HNSCC. Pereira et al. (Cancer Biomark, 10: 241-249 (2012)) ensayaron un analisis multivariante alternativo para la criba de HNSCC, que comprende medir los niveles de solCD44, protemas salivales totales, acido hialuronico e IL-8, mientras que Hafkamp et al., (Int J Cancer, 107(3): 394-400 (2003)) sugirieron una correlacion entre HNSCC e infeccion por Papilomavirus Humano (HPV) y mostraron que los tumores de HNSCC asociados al HPV estan asociados con niveles aumentados de expresion de p16INK4A y niveles reducidos de expresion de pRb.

Como resultado, la mayona de los pacientes son diagnosticados en una etapa tardfa, cuando las tasas de curacion son de 40 % o menos. Por lo tanto, se necesitan pruebas de deteccion temprana.

RESUMEN

Tal como se describe aqrn, la materia divulgada, se relaciona con metodos para determinar el riesgo de HNSCC en un sujeto infectado con HPV y kits que pueden usarse para el mismo proposito.

Espedficamente, la invencion proporciona:

1) Un metodo para determinar un riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) en un sujeto infectado con papilomavirus humano (HPV), comprendiendo el metodo:

a) proporcionar una muestra obtenida a partir de un fluido corporal del sujeto;

b) ensayar un nivel de so1CD44 en la muestra;

c) ensayar un nivel de protema total en la muestra;

d) combinar el nivel de so1CD44 medido en la muestra con el nivel de protema total medido en la muestra y el estado de HPV del sujeto, proporcionando asf una puntuacion combinada;

e) proporcionar una puntuacion predictiva para tener el riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, en el que la puntuacion predictiva se obtiene mediante un analisis estadfstico de solCD44 y la protema total medida y estado de HPV de una poblacion con un riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello; y

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determinar el riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello en el sujeto cuando la puntuacion combinada excede la puntuacion predictiva; y

2) Un kit, que comprende:

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al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16 ;

al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44;

y un reactivo para determinar la concentracion de protefna total en una muestra.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Las figuras 1A a 1B son graficos que muestran la supervivencia libre de progresion (PFS) (figura 1A) y la

supervivencia general (OS) (figura 1B) de los pacientes en el estudio. La figura 1C es una tabla que muestra la PFS

mediana y el fndice de PFS y OS a los 12, 24 y 36 meses.

La figura 1D es una tabla que muestra OS y PFS total, medial, mfnimo, maximo, media y desviacion estandar.

Las figuras 2A a 2RR son graficas que muestran PFS (figuras 2A, 2C, 2E, 2G, 2I, 2K, 2M, 2O, 2Q, 2S, 2U, 2W, 2Y, 2AA, 2CC, 2EE, 2GG, 2II, 2KK, 2MM, 2OO, 2QQ) y OS (figuras 2B, 2D, 2F, 2H, 2J, 2L, 2N, 2P, 2R, 2T, 2V, 2X, 2Z, 2BB, 2DD, 2FF, 2HH, 2JJ, 2LL, 2NN, 2PP, 2RR) en sujetos caracterizados como nuclear p16 vs. citoplasmaticos/sin tincion (Figuras 2A-2B), tincion p16+ vs. p16- (Figuras 2C-2D), solCD44 > 10ng/ml vs. <10 ng/ml (Figuras 2E-2F), protefna total <1mg/ml vs. >1mg/ml (Figuras 2G-2H), tincion CD44 vs. no tincion (Figuras 2I-2J), solo membrana CD44/tincion universal vs. no tincion/otro (Figuras 2K-2L), membrana de EGFR y tincion citoplasmatica vs. no tincion /otro (Figuras 2M-2N), membrana de EGFR y citoplasmatica vs. otro vs. no tincion (Figuras 2O-2P), membrana de EGFR vs. citoplasmatica/no tincion (Figuras 2Q-2R), membrana de EGFR vs. solo citoplasmatica vs. no tincion (Figuras 2S-2T), queratinizante vs. no queratinizante (Figuras 2U-2V) fumador actual vs. no/ex fumador (Figuras 2W- 2X), no exposicion a alcohol vs. exposicion leve/moderada a alcohol vs. exposicion severa a alcohol (Figuras 2Y-2Z), exposicion severa vs. leve/no exposicion a alcohol (Figuras 2AA-2BB), cancer de labios y de cavidad oral vs. cancer orofarfngeo (Figuras 2CC-2DD), cancer en etapa I/II vs. cancer en etapa III/IV (Figuras 2EE-2FF), cancer en etapa I/II/III vs. cancer en etapa IV (Figuras 2GG-2HH), cancer T1-T3 vs. T4 (Figuras 2II-2JJ), N0 vs. N1-N3, Nx (Figuras 2KK-2LL), mujer vs. hombre (Figuras 2MM-2NN), blanco vs. negro (Figuras 2OO-2PP) o hispano vs. no hispano (Figuras 2QQ-2RR).

Las figuras 3A-3C son graficos que muestran que la sobreexpresion de CD44 aumento la proliferacion (Figura 3A), migracion (Figura 3B) y la resistencia al cisplatino (Figura 3C).

La figura 4A es una prueba de inmunoprecipitacion Western de clones estables con CD44 subregulado. La figura 4B es una grafica que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral en ratones lampinos para dos de los clones CD44siARN en comparacion con CAL 27 mezclada o de tipo salvaje.

La figura 5 contiene diapositivas histologicas que muestran tincion con CD44, EGFR y pEGFR (Y1068) en los xenoinjertos CAL 27 despues del tratamiento con siARN de CD44 o una secuencia mezclada. Subregulacion de CD44 inhibe la expresion de EGFR y su fosforilacion (Y1068) en xenoinjertos CAL 27.

La figura 6 muestra la tincion con inmunohistoqufmica (IHC) de p16, CD44 y EGFR en cancer p16-, donde la tincion de p16 es citoplasmatica y difusa. En este caso, la CD44 tiene tincion en la membrana y universalmente en todo el tumor. CD44 y EGFR se co-localizan en la membrana celular y tambien hay cierta tincion citoplasmatica de EGFR.

La figura 7 muestra la tincion con IHC de p16, CD44 y EGFR en tumores p16+ en los que los nucleos se tinen fuertemente para p16 y tambien hay cierta tincion citoplasmatica. Sin embargo, la tincion de la membrana CD44 se pierde, solo los linfocitos invasores retienen la expresion de CD44. La expresion de EGFR no se ve en absoluto.

DESCRIPCION DETALLADA

Los materiales, compuestos, composiciones y metodos descritos aquf pueden entenderse mas facilmente haciendo referencia a la siguiente descripcion detallada de aspectos especfficos de la materia de estudio divulgada, y los ejemplos no limitativos incluidos en la misma.

Definiciones

En esta especificacion y en las reivindicaciones que siguen, se hara referencia a una serie de terminos, que se definiran para tener los siguientes significados:

A lo largo de la especificacion y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" y otras formas de la palabra, tales como "comprendiendo" y "comprende", significa incluyendo pero no se limita a, y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, enteros, o etapas.

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Como se usa en la descripcion y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede o no puede ocurrir, y que la descripcion incluye instancias donde ocurre el evento o circunstancia y casos donde no ocurre.

Los intervalos se pueden expresar aquf como desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. "Aproximadamente" puede significar dentro del 5 % del valor indicado. Cuando se expresa tal intervalo, otro aspecto incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entendera que el valor particular forma otro aspecto. Se entendera ademas que los puntos extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el otro punto final, como independientemente del otro extremo. Tambien se entiende que hay una serie de valores divulgados aquf y que cada valor se divulga tambien aquf como "aproximadamente" ese valor particular ademas del propio valor. Por ejemplo, si se divulga el valor "2.000", tambien se divulga "aproximadamente 2.000". Tambien se entiende que cuando se divulga un valor, entonces tambien se divulgan "menor o igual que" el valor, "mayor o igual que el valor" e intervalos posibles entre valores, segun se comprende apropiadamente por la persona experimentada en la tecnica.

Por ejemplo, si se divulga el valor "2.000", tambien se divulga "menor o igual que 2.000", asf como "mayor o igual que 2.000". Tambien se entiende que a lo largo de la aplicacion los datos se proporcionan en un numero de formatos diferentes y que estos datos representan puntos finales y puntos de partida e intervalos para cualquier combinacion de los puntos de datos. Por ejemplo, si se divulga un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular "15", se entiende que mayor que, mayor o igual que, menor que, menor o igual e igual a 10 y 15 se consideran divulgados asf como entre 10 y 15. Tambien se entiende que cada unidad entre dos unidades particulares tambien se describen. Por ejemplo, si se divulgan 10 y 15, tambien se divulgan 11, 12, 13 y 14.

Las referencias en la especificacion a partes en peso de un elemento o componente particular en una composicion denotan la relacion de peso entre el elemento o componente y cualquier otros elementos o componentes en la composicion o artfculo para el que se expresa una parte en peso. Por lo tanto, en un compuesto que comprende 2 partes en peso del componente X y 5 partes en peso del componente Y, X y Y estan presentes en una proporcion en peso de 2:5 y estan presentes en dicha proporcion independientemente de si los componentes adicionales estan comprendidos en la composicion.

Un porcentaje en peso ( % en peso) de un componente, a menos que se indique especfficamente lo contrario, se basa en el peso total de la formulacion o composicion en la que se incluye el componente.

El termino "individuo", "huesped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente para referirse a cualquier individuo que sea el blanco del diagnostico, pronostico, administracion o tratamiento. El sujeto puede ser un vertebrado, por ejemplo, un mamffero. Por lo tanto, el sujeto puede ser un paciente humano o veterinario.

Un "biomarcador" es cualquier gen o protefna cuyo nivel de expresion en un tejido o celula esta alterado en comparacion con el de una celula o tejido normal o sano.

El termino "pronostico" se reconoce en la tecnica y abarca predicciones sobre el curso probable de la enfermedad o progresion de la enfermedad, particularmente con respecto a la probabilidad de remision de la enfermedad, recafda de la enfermedad, recurrencia del tumor, metastasis y muerte. "Buen pronostico" se refiere a la probabilidad de que un paciente afligido con cancer, como el carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, permanezca libre de enfermedad (es decir, libre de cancer). Se entiende por "mal pronostico" la probabilidad de una recafda o recurrencia del cancer o tumor subyacente, metastasis o muerte. Los pacientes con cancer clasificados como que tienen un "buen resultado" permanecen libres del cancer o tumor subyacente. En contraste, los pacientes con cancer de "mal resultado" experimentan recidiva de la enfermedad, recurrencia tumoral, metastasis o muerte. En realizaciones particulares, el marco de tiempo para evaluar el pronostico y el resultado es, por ejemplo, de menos de un ano, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o mas anos. Como se usa aquf, el tiempo relevante para evaluar el pronostico o el tiempo de supervivencia sin enfermedad comienza con la extirpacion quirurgica del tumor o la supresion, mitigacion o inhibicion del crecimiento del tumor. Por lo tanto, por ejemplo, en realizaciones particulares, un "buen pronostico" se refiere a la probabilidad de que un paciente con carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello permanezca libre del cancer o tumor subyacente durante un perfodo de al menos cinco, mas particularmente, un perfodo de por lo menos diez anos. En otros aspectos de la invencion, un "mal pronostico" se refiere a la probabilidad de que un paciente con carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello experimente recidiva de la enfermedad, recurrencia de tumor, metastasis o muerte dentro de menos de cinco anos, mas particularmente de menos de diez anos. Los marcos de tiempo para evaluar el pronostico y el resultado proporcionados anteriormente son ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

El termino "tratamiento" se refiere al manejo medico de un paciente con la intencion de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, condicion patologica o trastorno. Este termino incluye el tratamiento activo, es decir, el

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tratamiento dirigido especfficamente hacia la mejora de una enfermedad, estado patologico o trastorno, e incluye tambien el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminacion de la causa de la enfermedad asociada, estado patologico o trastorno. Ademas, este termino incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento disenado para el alivio de los sfntomas mas que la curacion de la enfermedad, condicion patologica o trastorno; tratamiento preventivo, es decir, tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o totalmente el desarrollo de la enfermedad asociada, estado patologico o trastorno; y el tratamiento de soporte, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia especffica dirigida hacia la mejora de la enfermedad asociada, estado patologico o trastorno.

El termino “anticuerpo” se refiere a anticuerpos naturales o sinteticos que se enlazan selectivamente a un antfgeno diana. El termino incluye anticuerpos policlonales y monoclonales. Ademas de las moleculas de inmunoglobulina intactas, tambien se incluyen en el termino "anticuerpos" fragmentos o polfmeros de esas moleculas de inmunoglobulina, y versiones humanas o humanizadas de moleculas de inmunoglobulina que se enlazan selectivamente al antfgeno diana.

Tambien, se divulgan aquf materiales, compuestos, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparacion para, o son productos de los metodos y composiciones divulgados. Estos y otros materiales se describen aquf y se entiende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, mientras que la referencia especffica de cada una de varias combinaciones individuales y colectivas y permutacion de estos compuestos no se pueden divulgar explfcitamente, cada uno se contempla y describe especfficamente aquf. Por ejemplo, si se divulga una composicion y se discuten una serie de modificaciones que se pueden hacer a una serie de componentes de la composicion, se contemplan especfficamente cada combinacion y permutacion, a menos que se indique especfficamente lo contrario. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgacion, incluyendo, pero sin limitarse a, composiciones y etapas en metodos de fabricacion y uso de las composiciones divulgadas. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden llevar a cabo, se entiende que cada una de estas etapas adicionales puede realizarse con cualquier aspecto especffico o combinacion de aspectos de los metodos divulgados, y que cada combinacion se contempla especfficamente y debe considerarse como divulgado.

A continuacion se hara referencia en detalle a aspectos especfficos de los metodos y kits divulgados, ejemplos de los cuales se ilustran en la siguiente descripcion y ejemplos, y en las figuras y su descripcion anterior y siguiente.

Ensayos de biomarcadores

Se describen ensayos eficaces, economicos y no invasivos para determinar el riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) en un sujeto infectado con HPV. Los ensayos divulgados implican la deteccion de biomarcadores incluyendo CD44 soluble (solCD44) y niveles de protefna total en una muestra obtenida a partir de un fluido corporal del sujeto. Los niveles elevados de estos biomarcadores son capaces de distinguir a los pacientes con cancer de los controles con alta precision y especificidad. Sin embargo, estos biomarcadores se reducen en ciertas poblaciones de sujetos a pesar de la presencia de HNSCC.

Por ejemplo, se ha demostrado que solCD44 y los niveles de protefna total combinados son mas eficaces para distinguir el HNSCC de los controles que cualquiera de los dos marcadores por si solos. Sin embargo, los niveles de solCD44 pueden ser mas bajos en sujetos con infeccion por papilomavirus humano (HPV). De hecho, el analisis bivariado utilizando solCD44 y niveles de protefna total funciona mejor en hombres de raza negra, donde la infeccion por HPV es menos comun. Por lo tanto, la inclusion del estado de HPV en un analisis multivariado puede mejorar la sensibilidad y la precision del ensayo y permitir la deteccion de HPV+ HNSCC.

Otros biomarcadores asociados con la deteccion o pronostico de HNSCC pueden usarse en combinacion con la deteccion de protefnas totales, solCD44 y HPV para mejorar la sensibilidad y/o la precision del metodo divulgado. Por ejemplo, los niveles de solCD44 pueden variar segun la edad y el estado de fumador. Ejemplos de factores de riesgo de HNSCC y factores demograficos que pueden ser utilizados en el analisis multivariado incluyen exposicion al tabaco, exposicion al alcohol, raza, etnia, salud dental, genero, nivel de educacion, edad, salud general, antecedentes familiares de cancer, historia sexual y estado socioeconomico y usando uno o mas factores de riesgo o factores demograficos en el analisis multivariado para determinar la puntuacion combinada.

Por lo tanto, se divulgan ensayos y metodos de utilizacion de los ensayos para diagnostico y pronostico, que implican analisis multivariante de los biomarcadores y factores de riesgo divulgados para determinar una puntuacion combinada para un sujeto individual. La puntuacion combinada puede usarse entonces para determinar la presencia de HNSCC, o el riesgo de reaparicion de HNSCC en un sujeto. En particular, los valores lfmite de puntuacion combinados se pueden determinar empfricamente comparando valores de control positivos y negativos.

Los biomarcadores descritos aquf incluyen genes y protefnas. Dichos biomarcadores incluyen ADN que comprende la secuencia completa o parcial de la secuencia de acido nucleico que codifica el biomarcador, o el complemento de dicha secuencia. Los acidos nucleicos de biomarcador tambien incluyen ARN que comprende la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias de acido nucleico de interes. Una protefna biomarcadora es una protefna

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codificada por o correspondiente a un biomarcador de ADN de la invencion. Una protefna biomarcadora comprende la secuencia de aminoacidos total o parcial de cualquiera de las protefnas o polipeptidos biomarcadores. Los fragmentos y variantes de genes y protefnas de biomarcadores estan tambien abarcados por la presente invencion. Por "fragmento" se entiende una porcion del polinucleotido o una porcion de la secuencia de aminoacidos y, por lo tanto, la protefna codificada por ella. Los polinucleotidos que son fragmentos de una secuencia de nucleotidos de biomarcador comprenden generalmente al menos 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 o 1.400 nucleotidos contiguos, o hasta el numero de nucleotidos presentes en un polinucleotido biomarcador de longitud completa divulgado aquf. Un fragmento de un polinucleotido biomarcador codificara generalmente al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, o 250 aminoacidos contiguos, o hasta el numero total de aminoacidos presentes en una protefna biomarcadora de longitud completa de la invencion. Se pretende que "variante" signifique secuencias sustancialmente similares. Generalmente, las variantes de un biomarcador particular de la invencion tendran al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identidad de secuencia con ese biomarcador, segun se determina mediante programas de alineacion de secuencias.

Los biomarcadores descritos aquf son genes y protefnas cuya sobreexpresion se correlaciona con el pronostico de cancer, en particular el HNSCC. La sobreexpresion selectiva de un biomarcador o combinacion de biomarcadores de interes en una muestra de paciente es indicativa de un mal pronostico de cancer. Por "indicativo de un mal pronostico" se pretende que la sobreexpresion del biomarcador particular o combinacion de biomarcadores este asociada con una mayor probabilidad de recafda o recurrencia del cancer o tumor subyacente, metastasis o muerte, como se define aquf anteriormente. Por ejemplo, "indicativo de un mal pronostico" puede referirse a una mayor probabilidad de recafda o recurrencia del cancer o tumor subyacente, metastasis o muerte dentro de los cinco anos, mas particularmente diez anos. Los biomarcadores que son indicativos de un mal pronostico pueden denominarse aquf como "biomarcadores de pronostico pobre". Alternativamente, la ausencia de sobreexpresion de un biomarcador o combinacion de biomarcadores de interes es indicativa de un buen pronostico. Como se usa aquf, "indicativo de un buen pronostico" se refiere a una mayor probabilidad de que el paciente permanezca libre de cancer, como se ha definido anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, "indicativo de un buen pronostico" se refiere a una mayor probabilidad de que el paciente permanezca libre de cancer durante al menos cinco, mas particularmente al menos diez anos. Dichos biomarcadores pueden denominarse “biomarcadores de buenos resultados”.

Los biomarcadores divulgados incluyen genes y/o protefnas cuya sobreexpresion (en comparacion con un control) se correlaciona con el pronostico de HNSCC. Un gen o una protefna puede sobreexpresarse en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o mayor en comparacion con un control. Los biomarcadores incluyen genes y protefnas que son indicativos de un mal pronostico de HNSCC (es decir, biomarcadores de resultado pobre) asf como aquellos que son indicativos de un buen pronostico (es decir, biomarcadores de buen resultado). Los biomarcadores de interes particular incluyen genes y protefnas que estan implicados en la regulacion del crecimiento y proliferacion celular, control del ciclo celular, replicacion y transcripcion del ADN, apoptosis, transduccion de senales, angiogenesis/linfogenesis o metastasis. Algunos de los biomarcadores regulan los sistemas de proteasa implicados en la remodelacion de tejidos, la degradacion de la matriz extracelular y la invasion de tejidos adyacentes. Otros biomarcadores incluyen reguladores de la expresion genica tales como hipermetilacion o microARN. Con el fin de practicar los metodos y ensayos divulgados para determinar el riesgo de HNSCC en un sujeto infectado con HPV, los biomarcadores utilizados incluyen el estado de HPV, niveles de protefna total y niveles de solCD44.

La infeccion por HPV se puede determinar midiendo el HPV directa o indirectamente. Actualmente se dispone de tres categorfas de ensayos moleculares para la deteccion de la infeccion por HPV en muestras de tejidos y de celulas exfoliadas. Todos estan con base en la deteccion de ADN de HPV e incluyen: (1) ensayos de hibridacion no amplificados (hibridacion de transferencia Southern, (STH), hibridacion de inmunoprecipitacion en punto (DB) e hibridacion in situ (ISH)); (2) ensayos de hibridacion amplificada de senal tales como ensayos hfbridos de captura; y (3) ensayos diana de amplificacion, tales como PCR y PCR in situ. La hibridacion de inmunoprecipitacion Southern requiere grandes cantidades de ADN, es laboriosa y no es reproducible, mientras que la hibridacion in situ solo tiene una sensibilidad moderada para el HPV. La deteccion con base en PCR del HPV es extremadamente sensible y especffica. Utilizando esta metodologfa, el ADN viral se amplifica in vitro mediante ADN polimerasa para generar una cantidad adecuada de diana, que luego se visualiza directamente sobre geles o (el enfoque mas especffico) es detectado mediante sonda especffica usando metodos de hibridacion tradicionales. En la practica, la sensibilidad del metodo con base en PCR es de aproximadamente 10-100 genomas virales de HPV en un fondo de 100 ng de ADN celular. Dado que el PCR puede realizarse en cantidades muy pequenas de ADN (10-100 ng), es ideal para ser usada en especfmenes con bajo contenido de ADN.

Actualmente, el unico metodo de deteccion de HPV aprobado por la FDA es el ensayo Hybrid capture II (Qiagen, Valencia, CA). En este ensayo, los ADNs de HPV se hibridan a sondas de ARN, y los hfbridos de ARN-ADN son capturados y detectados por un sistema quimioluminiscente. La sensibilidad de este ensayo es similar a la de los ensayos con base en PCR, obteniendose alta sensibilidad mediante senal, en lugar de la amplificacion del objetivo. El ensayo HC II actual tiene la sensibilidad para detectar 1 pg de HPV (aproximadamente 50.000 copias) por ml de muestra. La recoleccion apropiada de la muestra es esencial para lograr una maxima sensibilidad, y se ha

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demostrado que el dispositivo de muestreo por pincel es optimo. El ensayo de HC II contiene sondas de ARN sinteticas complementarias a la secuencia genomica de 13 tipos de alto riesgo (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y 5 tipos (6, 11, 42, 43, 44) de HPV de bajo riesgo.

Alternativamente, se puede determinar el estado de infeccion por HPV detectando las transcripciones de mARN viral o mediante la deteccion de la protefna celular p 16. Para que el HPV cause cancer, es necesaria una infeccion persistente y un entorno celular que permita una expresion de alto nivel de los oncogenes E6 y E7 virales (inicialmente en la capa de celulas basales y luego a lo largo del epitelio). Por lo tanto, la deteccion de mARN E6/E7 puede identificar una infeccion clfnicamente mas significativa que una metodologfa de ADN.

El inhibidor 2A de la quinasa dependiente de ciclina (CDKN2A, p16Ink4A, p16) es un correlato celular de la expresion aumentada del ARNm oncogenico E6/E7. Las principales acciones de los oncogenes del HPV son la degradacion de p53 por E6 y por lo tanto la abrogacion de la apoptosis, asf como la liberacion de E2F de pRb que conduce a la activacion continua del ciclo celular. Fisiologicamente, la activacion de E2F esta mediada por la fosforilacion de la protefna Rb. Esta via esta estrictamente regulada por un conjunto de inhibidores de la quinasa dependientes de ciclina, entre ellos p16, que bloquean las enzimas que fosforilan pRb (quinasas dependientes de ciclina). En las celulas con infecciones de HPV transformantes, la regulacion de la via Rb-E2F es perturbada por E7 y la activacion de p16 no tiene efecto corriente abajo. Como resultado, el p16 esta fuertemente sobreexpresado y se acumula en las celulas. La sobreexpresion de p16 se ha demostrado en la gran mayorfa de precanceres y canceres cervicales, mientras que en el tejido normal, la expresion de p16 se encuentra solo raramente.

Tambien se pueden utilizar efectos epigeneticos de la infeccion por HPV para detectar el HPV. Los loci diferenciadamente metilados entre las lfneas celulares HPV+ y HPV- HNSCC se describen en Sartor MA, et al. Epigenetics 6(6): 777-87 (2011).

Por lo tanto, la infeccion por HPV puede detectarse usando anticuerpos que se enlazan especfficamente a p16 .

Alternativamente, la infeccion por HPV se puede determinar detectando ADN, ARN o protefna de HPV. Del mismo modo, la infeccion por HPV puede determinarse detectando oncogenes virales (por ejemplo, E6/E7) o cambios epigeneticos.

METODOS

Se describen metodos para diagnosticar HNSCC en un sujeto, estadificacion de un tumor HNSCC en un sujeto, supervision de la eficacia de un tratamiento para HNSCC, o determinacion del pronostico de un sujeto diagnosticado con HNSCC o prediccion de recurrencia de HNSCC en un sujeto. Estos metodos comprenden cada uno el ensayo de una muestra corporal del sujeto para la presencia de protefna total, solCD44 y HPV. La combinacion de los niveles de protefna total, HPV y CD44 se puede utilizar en un analisis multivariante para determinar una puntuacion combinada. El metodo puede comprender ademas el ensayo de la muestra corporal para la presencia de acido hialuronico (HA), hialuronidasa (HAasa), IL-8, o una combinacion de las mismas. Los factores de riesgo de HNSCC y/o factores demograficos tambien pueden usarse en combinacion con la deteccion de protefnas totales, solCD44 y HPV para mejorar la sensibilidad y/o la precision del metodo divulgado.

El analisis multivariado se basa en el principio estadfstico de las estadfsticas multivariantes, que implica la observacion y el analisis de mas de una variable de resultado estadfstico a la vez. Por ejemplo, existen varios metodos de regresion que pueden usarse con analisis multivariante, incluyendo, pero no limitados a regresiones lineales y no lineales generalizadas, regresiones logfsticas y de Poisson, algoritmos supervisados de aprendizaje de maquina, redes neuronales, maquinas vectoriales de apoyo, modelado de superficies de respuesta y ejes de regresion adaptativa multivariante. En algunas realizaciones, se usa la regresion logfstica.

Por ejemplo, el analisis multivariante puede implicar en primer lugar la determinacion de como los niveles de protefna total, solCD44 y p16 cambian en funcion de variables de riesgo como la raza, el genero, consumo de tabaco y el consumo de alcohol. Entonces se pueden desarrollar modelos matematicos cuyos terminos incluyen los niveles de biomarcadores y las variables de riesgo para predecir la probabilidad de cancer. La importancia estadfstica asociada con los terminos refleja su importancia para la prediccion. Un modelo matematico puede ser utilizado entonces para estimar una puntuacion predictiva, lo que permite desarrollar una puntuacion de probabilidad general de cancer. Por ejemplo, despues de investigar como se asocian los niveles de marcadores y las variables de riesgo (por ejemplo, raza, genero, consumo de tabaco y alcohol) con el resultado, incluidas las interacciones, se puede obtener un modelo ajustado relacionando las probabilidades logarftmicas de biomarcadores y covariables. Con base en este modelo, una puntuacion o una probabilidad predictiva de cancer puede ser estimada a valores especificados de todas las variables incluidas en el modelo.

Un aumento de la puntuacion combinada (predictiva) por encima de un punto lfmite distingue los sujetos con HNSCC de aquellos sin HNSCC o con bajo riesgo de su aparicion futura. Un aumento de la puntuacion combinada por encima de un punto lfmite puede identificar HNSCC en fase tumoral, predecir la eficacia de un tratamiento para HNSCC, predecir el pronostico de un sujeto diagnosticado con HNSCC, o predecir el riesgo de recurrencia de

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HNSCC. Por ejemplo, un aumento en la puntuacion por encima de un punto limite puede estar asociado con un mal pronostico o probabilidad de recurrencia.

Los ensayos y metodos divulgados pueden usarse para guiar el tratamiento terapeutico de un sujeto con HNSCC o con riesgo de desarrollar HNSCC. Por ejemplo, un sujeto con una puntuacion combinada baja puede recibir un tratamiento de modalidad unica tal como solamente cirugfa o radiacion en lugar de terapia combinada. Esto reducirfa la morbilidad relacionada con el tratamiento. En contraste, a un sujeto con una alta puntuacion combinada se le pueden ofrecer tratamientos mas agresivos, como la cirugfa, la radiacion y la quimioterapia, ya que una mayor morbilidad relacionada con el tratamiento se justificarfa dado el mayor riesgo de muerte por la enfermedad. Por lo tanto, un sujeto diagnosticado con HNSCC o determinado que tiene un pronostico de HNSCC pobre puede tratarse con cirugfa, radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinamica, terapia dirigida, o cualquier combinacion de los mismos.

Cada uno de los biomarcadores descritos se puede detectar en un sujeto usando muestras obtenidas de un fluido corporal del sujeto. Los fluidos corporales utiles en la presente invencion incluyen sangre, linfa, orina, fluidos ginecologicos, saliva, aspirados de los pezones, lavados o cualquier otra secrecion corporal o derivado de los mismos. La sangre puede incluir sangre entera, plasma, suero o cualquier derivado de sangre. En realizaciones preferidas, la muestra comprende enjuagues orales. Los metodos para recolectar diversas muestras corporales son bien conocidos en la tecnica.

Los metodos son utiles para detectar individuos con riesgo de cancer de cabeza y cuello, incluyendo, por ejemplo, fumadores, abusadores de alcohol y sujetos expuestos al virus del HPV. Los metodos descritos aquf tambien pueden permitir la evaluacion mejorada del pronostico de HNSCC en comparacion con el analisis de otros indicadores pronosticos conocidos. La sensibilidad y especificidad puede ser igual o mayor que la de los metodos conocidos de evaluacion pronostica del cancer. El punto final para evaluar la especificidad y la sensibilidad es la comparacion del resultado predicho usando los metodos de la invencion con el resultado clfnico real (es decir, si el paciente permanecio sin cancer o sufrio una recurrencia dentro de un perfodo de tiempo especificado). Como se usa aquf, "especificidad" se refiere al nivel al cual un metodo de la invencion puede identificar con precision negativos verdaderos. En un estudio clfnico, la especificidad se calcula dividiendo el numero de negativos verdaderos por la suma de negativos verdaderos y falsos positivos. Por "sensibilidad" se entiende el nivel al cual un metodo de la invencion puede identificar con precision muestras que son verdaderos positivos. La sensibilidad se calcula en un estudio clfnico dividiendo el numero de verdaderos positivos por la suma de verdaderos positivos y falsos negativos. En algunas realizaciones, la sensibilidad de los metodos divulgados para la evaluacion de HNSCC es al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas. Ademas, la especificidad de los presentes metodos es de manera preferible al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas. En realizaciones adicionales, se evalua el valor combinado de sensibilidad y especificidad para los metodos de pronostico de la invencion. Por "valor combinado de sensibilidad y especificidad" se entiende la suma de los valores de especificidad y sensibilidad individuales, como se ha definido anteriormente. El valor combinado de sensibilidad y especificidad de los presentes metodos es preferiblemente al menos aproximadamente 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 % o mas.

Como se usa aquf, las definiciones de positivos y negativos "verdaderos" y "falsos" dependeran de si la combinacion de biomarcadores considerados es un biomarcador de buen resultado o un de mal resultado. Es decir, en el caso de biomarcadores de buen resultado (es decir, aquellos indicativos de un buen pronostico), "verdadero positivo" se refiere a aquellas muestras que muestran sobreexpresion del biomarcador de interes, segun se determina mediante un examen ffsico seguido de biopsia. Una biopsia positiva en patologfa puede indicar si una muestra es positiva o negativa.

Se incluye aquf cualquier metodo disponible en la tecnica para detectar la expresion de biomarcadores. La expresion de un biomarcador de la invencion se puede detectar a un nivel de acido nucleico o un nivel de protefna. Por "deteccion de expresion" se pretende determinar la cantidad o presencia de un gen o protefna biomarcador. Por lo tanto, la “deteccion de expresion” abarca los casos en los que se determina que un biomarcador no se expresa, no se expresa de forma detectable, se expresa en un nivel bajo, se expresa a un nivel normal o se sobreexpresa. Con el fin de determinar la sobreexpresion, la muestra obtenida a partir del fluido corporal del sujeto a examinar puede compararse con una muestra correspondiente. Por ejemplo, una muestra correspondiente de fluido corporal que se origina de una persona sana. Es decir, el nivel de expresion "normal" es el nivel de expresion del biomarcador en, por ejemplo, una muestra de un sujeto humano o paciente no afligido con HNSCC. La muestra corporal tambien se puede comparar con una muestra de cuerpo correspondiente de un sujeto tratado para HNSCC. Dicha muestra puede estar presente en forma estandarizada. En algunas realizaciones, la determinacion de la sobreexpresion de biomarcadores no requiere comparacion entre la muestra corporal y una muestra de cuerpo correspondiente que se origina de una persona sana. Por ejemplo, la deteccion de la sobreexpresion de un biomarcador indicativo de un mal pronostico en una muestra de tumor puede excluir la necesidad de comparacion con una muestra correspondiente que se origina de una persona sana. Ademas, en algunos aspectos de la invencion, ninguna expresion, subexpresion o expresion normal (es decir, la ausencia de sobreexpresion) de un biomarcador o combinacion de biomarcadores de interes proporciona informacion util con respecto al pronostico de un paciente.

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Los metodos para detectar la expresion de los biomarcadores de la invencion comprenden cualquier metodo que determine la cantidad o la presencia de los biomarcadores ya sea a nivel de acido nucleico o de protefna. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitarse a, “tiras de analisis” de flujo lateral, inmunoprecipitacion Western, inmunoprecipitacion Northern, inmunoprecipitacion Southern, ELISA,

inmunoprecipitacion, inmunofluorescencia, citometrfa de flujo, inmunohistoqufmica, tecnicas de hibridacion de acido nucleico, metodos de transcripcion inversa acidos nucleicos y metodos de amplificacion de acidos nucleicos, por ejemplo, PCR. En realizaciones particulares, la expresion de un biomarcador se detecta en un nivel de protefna utilizando, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra protefnas biomarcadoras especfficas. Estos anticuerpos pueden usarse en diversos metodos tales como inmunoprecipitacion Western, ELISA, inmunoprecipitacion, o tecnicas de inmunohistoqufmica. Igualmente, la inmunotincion de tejido puede combinarse con la evaluacion de informacion clfnica, metodos de pronostico convencionales y expresion de marcadores moleculares (por ejemplo, p16INK4a y solCD44) conocidos en la tecnica. De esta manera, los procedimientos divulgados pueden permitir la determinacion mas precisa del pronostico de HNSCC.

Kits

Tambien se proporcionan aquf kits que pueden usarse para diagnosticar un sujeto con HNSCC o para determinar el pronostico de un sujeto con HNSCC. El kit incluye al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16INK4a, al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44, y un reactivo para determinar la concentracion total de protefna en una muestra. Por ejemplo, el kit puede incluir una pluralidad de anticuerpos que se enlazan especfficamente a p16INK4a. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende el idiotipo del clon del anticuerpo E6H4. El kit puede incluir ademas un agente de deteccion (por ejemplo, anticuerpos secundarios y/o agente colorimetrico) para detectar los anticuerpos contenidos. El kit puede incluir ademas una pluralidad de anticuerpos que se enlazan especfficamente a CD44 (por ejemplo, solCD44). El kit incluye ademas un reactivo para determinar la concentracion de protefna total en una muestra. El kit tambien puede incluir una muestra de referencia de p16INK4a y/o solCD44. El kit puede incluir adicionalmente instrucciones para el uso del kit (por ejemplo, instrucciones para diagnosticar un sujeto), un contenedor y/o un portador. En particular, el kit puede contener un medio legible por ordenador o un hipervfnculo que utiliza algoritmos y tablas de referencia para convertir los valores de deteccion en una puntuacion combinada. En algunas realizaciones, el kit es un inmunoensayo de flujo lateral. Alternativamente, el kit puede comprender una placa de multiples pozos, opcionalmente recubierta con el anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16INK4a, el anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44, o una combinacion de los mismos.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente ciertos aspectos de los metodos y composiciones descritos aquf, y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen a continuacion para ilustrar los metodos y resultados de acuerdo con la materia de estudio divulgada. Estos ejemplos no pretenden incluir todos los aspectos de la materia de estudio divulgada aquf, sino mas bien ilustrar metodos y resultados representativos. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero algunos errores y desviaciones deben tenerse en cuenta. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura esta en °C o esta a temperatura ambiente y la presion esta en o cerca de la presion atmosferica. Existen numerosas variaciones y combinaciones de condiciones de reaccion, por ejemplo, concentraciones de componentes, temperaturas, presiones y otros intervalos de reaccion y condiciones que se pueden usar para optimizar la pureza del producto y el rendimiento obtenido a partir del proceso descrito. Solo se requerira una experimentacion razonable y rutinaria para optimizar tales condiciones del proceso.

Ejemplo 1:

La relacion entre la prueba descrita aquf y el HNSCC relacionado con HPV se estudio observando como los marcadores descritos aquf mejoran en pacientes cuyos tumores son positivos para p16INK4a. Catorce sujetos con cancer orofarfngeo fueron evaluados. Para cada sujeto, se obtuvieron resultados de la inmunohistoqufmica p16INK4a de su tejido tumoral y solCD44 y se obtuvieron los resultados de la protefna de sus enjuagues orales. Los niveles medios de solCD44 y el nivel de protefna fueron mas bajos en los casos de HPV+ (CD44: 3,17 vs. 4,2, p=0,55, protefna: 0,83 vs.1,07, p=0,49), aunque las diferencias no alcanzaron significacion estadfstica. Las pruebas de solCD44 y protefna que se midieron utilizando los sobrenadantes de enjuagues orales se combinaron con los niveles de p16IN 4a detectados usando las pellas de los mismos enjuagues orales.

Se realizo un ensayo in vitro para la determinacion cuantitativa de la protefna p16 humana en muestras lisadas de las pellas del enjuague oral. Se colocaron pellas de muestra en 200 pl de regulador de lisis celular (SIGMA) que contenfa inhibidor de proteasa (Thermo Scientific) para la estabilizacion de p16INK4a solubilizado. A continuacion, las muestras se calentaron a 95 °C durante 10 minutos, lo que facilita la lisis completa de las celulas para una mejor deteccion de p16INK4a. La protefna p16INK4a se cuantifico usando una tecnica de emparedado ELISA colorimetrica usando tiras de microtitulacion recubiertas con el anticuerpo especffico p16INK4a monoclonal E6H4™ (Roche mtm laboratories AG) y un segundo anticuerpo especffico p16INK a monoclonal marcado con HRP.

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La cuantificacion se realizo generando una curva estandar con base en los niveles conocidos de p16 (estandar 1-6). Los niveles en las muestras de prueba se determinaron mediante interpolacion con base en la curva estandar. Se utilizo un lector de placa de microtitulacion para medir la absorbancia en cada pozo a una longitud de onda de 450 nm (longitud de onda de referencia: 620 nm). Se utilizo un programa de calculo con base en el metodo de 4 parametros para obtener las concentraciones finales de la muestra de p16INK4a. Los resultados se indican en U/ml y las muestras de estudio se midieron en duplicados, cada una con un volumen de 100 pl. Se verifico un valor lfmite de 15 U/mL como el umbral adecuado para clasificar una muestra clfnica individual como positiva para el resultado de ELISA de p16INK4a de Cervatec™ (Roche mtm laboratories AG) mediante un estudio clfnico multicentrico (Protocolo No. 9502-06-REG-DE-001).

Usando este metodo combinado, se probo p16 en combinacion con CD44 y protefna en 14 pacientes con HNSCC incluyendo pacientes con carcinoma de celulas escamosas de cavidad oral u orofarfngeas (CA) o carcinomas primarios desconocidos (UK1 CA). Tambien se probaron tres voluntarios sanos (HV) (ver Tabla 1). Dos pacientes con niveles bajos de CD44 (lfmite establecido en 2,7 ng/ml) y protefna (lfmite establecido en 1,0 mg/ml) tenfan niveles de p16INK4a por encima del lfmite de 15 U/ml. El CD44 y protefna tambien identificaron tumores que no fueron detectados por las otras pruebas. Por lo tanto, la adicion de p16INK4a al panel mejora la sensibilidad. Los 3 voluntarios sanos que formaron parte de la prueba todos tenfan niveles para cada marcador por debajo de los lfmites.

Tabla 1

Conc. Conc.

N: U/ml* p16INK4a Conc. g/ml CD44 (x5) mg/ml Protefna Muestra Grupo** Genero Edad Raza Etnia

1: 0 1,6 0,63 17 UK1CA Femenino 47 Blanco Hispano

2: 3,099 4,19 0,398 79 CA Femenino 65 Blanco No- Hispano

3: 16,981 2,536 0,583 167 CA Femenino 50 Blanco Hispano

4: 12,554 4,29 0,716 262 UK1CA Masculino 56 Blanco No- Hispano

5: 3,529 8,88 0,892 86 CA Masculino 67 Blanco Hispano

6: 7,758 3,355 0,781 24 UK1CA Masculino 66 Negro No- Hispano

7: 0 1,645 1,054 221 UK1CA Masculino 50 Blanco Hispano

8: 5,687 4 1,262 239 UK1CA Masculino 58 Blanco Hispano

9: 0 10,325 1,309 273 CA Masculino 46 Blanco No- Hispano

10: 6,896 1,13 0,604 345 CA Masculino 59 Blanco No- Hispano

11: 5,123 0,93 0,472 367 CA Masculino 58 Blanco No- Hispano

12: 16,752 1,18 0,469 370 CA Masculino 62 Blanco Hispano

13: 8,812 4,555 0,792 374 CA Masculino 60 Blanco Hispano

14: 9,421 2,56 1,037 377 CA Femenino 63 Blanco No- Hispano

NL1: 0 1,645 0,797 UM001 HV Femenino 41 Blanco No- Hispano

NL2: 0 1,295 0,329 UM009 HV Femenino 49 Blanco Hispano

NL3: 0,141 0,545 0,378 UM030 HV Femenino 57 Asiatico No- Hispano

*1 U/ml=2,8 pg/ml de protefna p16INK4a.

**CA: Cancer, UK 1 CA: cancer primario desconocido, HV: voluntario sano

Ejemplo 2:

Utilizando inmunohistoqufmica en tejidos de cancer oral, se evaluo un panel de marcadores (CD44 y EGFR), que se asocian con mal pronostico. Se determino la relacion entre la expresion de CD44, EGFR y p16 (el marcador sustituto de HPV) en el tejido con solCD44 y los niveles de protefnas en enjuague oral.

Tabla 2. Demograficas del paciente y otras caracteristicas

Variable: N %

Edad (anos)

Media (desviacion estandar): 60,4 (9,8)

Mediana (mfnimo - maximo): 61 (40- 83)

Genero

Femenino: 6 16,2

Masculino: 31 83,8

Etnia

Hispano: 22 59,5

No-Hispano: 15 40,5

Raza

Blanco: 29 78,4

Negro: 8 21,6

Fumador

Nunca: 5 13,5

Anteriormente: 8 21,6

Actualmente: 24 64,9

Alcohol, pasado

Nunca: 8 22,2

Leve(<3 bebidas/dfa): 10 27,8

Severo(>= 3 bebidas/dfa): 18 50,0

Sin respuesta: 1

Alcohol, actual

Ninguna: 12 37,5

Leve: 8 25,0

Severo: 12 37,5

Sin respuesta: 5

Atencion sanitaria

Si: 20 54,1

No: 17 45,9

Educacion

Grados 1-8 (Elemental): 6 16,2

Grados 9-11 (Parte de bachillerato): 5 13,5

Grado 12 o GED (graduado de bachillerato) 12: 32,4

Universidad 1-3 anos

(parte de universidad/escuela tecnica): 6 16,2

Universidad 4+anos (graduado universidad): de8 21,6

Empleo

Empleado asalariado: 7 19,4

Autonomo: 6 16,7

Retirado: 8 22,2

Incapaz de trabajar: 6 16,7

Desempleado por menos de 1 ano: 3 8,3

Desempleado por mas de 1 ano: 6 16,7

Sin respuesta: 1

Salario

Menos que $10.000: 16 57,1

$10.000 a < $15.000: 1 3,6

$20.000 a < $25.000: 2 7,1

$25.000 a < $35.000: 2 7,1

$35.000 a < $50.000: 2 7,1

$50.000 a < $75.000: 2 7,1

$75.000 o mas: 3 10,7

Sin respuesta: 9

Tabla 3. Caracteristicas de la enfermedad, tratamiento, y resultado

Variable: N % Variable N %

Enfermedad

Cancer de labios y cavidad oral 13: 35,1

Cancer Orofarfngeo: 24 64,9

Etapa: Patologfa

I: 3 8,11 Biopsia 25 67,6

II: 1 2,7 Reseccion quirurgica 12 32,4

III: 8 21,6 (margenes todos negativos)

IV: 9 24,3

IVA: 12 32,4 Linfovascular

IVB: 4 10,8 Si 2 16,7

Etapa-T: No 10 83,3

T1: 5 13,5 Sin respuesta 25

T2: 5 13,5

T3: 11 29,7 Perineural

T4: 4 10,8 Si 3 25,0

T4a: 10 27,0 No 9 75,0

T4b: 2 5,4 Sin respuesta 25

Etapa-N

Nx: 1 2,7 Diferenciacion (Velos)

N0: 14 37,8 Buena 6 18,8

N1: 3 8,1 Moderada 17 53,1

N2a: 1 2,7 Moderada-Pobre 2 6,3

N2b: 6 16,2 Pobre 7 21,9

N2c: 9 24,3 Sin respuesta 5

N3: 3 8,1

Etapa-M: Invasion (Velos)

M0: 33 89,2 Si (., 5, 10, 15, 22 mm) 5 17,2

Mx: 4 10,8 No 24 82,8



: Sin respuesta 8

Tratamiento

Quimio/RT: 16 43.2 Resultado

Cirugfa/Quimio/RT: 9 24,3 Progresion/Recurrencia 21 56,8

Cirugfa: 5 13,5 Libre de eventos 16 43,2

Cirugfa/RT: 2 5,4

Cirugfa/Quimio: 1 2,7 Estado

Quimio 1 2,7 Fallecido 16 43,2

Ninguno/sin respuesta 2 5,4 Con vida 21 56,8



: CD44 lo^2C044 Prdeina

: N Mv- a SO SE P N Mad a SO SE P N Meda SD SE p

: 56 7.91 10.55 1.31 56 2,35 120 0.20 36 1,03 0.55 0.10

pie

Posiliyo: 16 0,15 14,52 5,56 0,576 16 2.47 1,26 0,51 0j&01 16 1,10 0,64 0,16 0,557

: 20 6.92 7.25 1.62 20 2.26 1.13 0.26 20 0.95 0,53 0.12

P 16 nueyadefiraciOn

N udear/ N udear-Ka 1 14: 6,06 4.14 i,16 0,115 14 2,29 0,97 0,26 0.61i 14 M2 0,61 0,16 0,474

Cp1 adamenta'-a n linain 22: 0.00 15,45 267 22 2,50 1,55 0,20 22 0,06 0,57 0.12

CCn*

Membrana: 22 9,26 11,42 2,56 22 2,45 1,11 0,26 22 1,05 0,64 0,14

Cuopi-sanai co: 2 10,60 6,52 461 2 5.27 0.04 0.67 2 1.50 0,70 0.49

M yC: 2 5.55 5,06 2.17 2 1,46 1,46 1,05 2 0,62 0,14 0,24

SinlibOSn: 10 5.27 5,65 1.16 10 2.13 0.91 0.29 10 1.04 0.45 0.15

TmcidnC044: 26 5,95 12,49 2,45 0,166 26 2,44 1.30 0,26 0,506 26 1,03 0,62 0,12 0,966

5m liraOn: 10 5.27 5,66 1,16 10 2.15 0,01 0,20 10 1,04 0,45 0,15

Membfana: idamerte.il 9.55 15,67 2.95 21 2.50 1.52 0.29 21 105 0.65 0.14

unverad Olio: 5 6.20 5,47 2.45 5 2.17 1,53 0.59 5 0.94 0.52 0.25

5m linden: 10 5.27 1,66 i,16 10 2,13 0,91 0,29 10 1,04 0,45 0,15

yen-i brana: 9danienle.2l 0,56 15,67 2,06 0210 21 2,50 1.52 0,20 0902 21 1.05 0,65 0,14 0.604

univerad Qlro/5mlin&On: 15 5.56 4,17 1,06 15 2.15 1.02 0,26 15 1.00 0,45 0.12

EGFR

Mem brana: 5 5,55 i.fll 1,06 1 1,66 0,61 0,46 1 1,11 0,65 0,49

Cnopiaamai oo: 0 12,52 20,05 7,00 6 2,50 1.62 0,57 6 1.25 0,71 0,25

M y C: 21 7.66 7,07 1,54 21 2,40 1.10 0,24 21 0,06 0,51 0.11

SmlibOSn: 4 3,57 1.64 0.92 4 1.66 0.55 0.44 4 0.67 0,51 0.15

T'rciin EGFR: 52 5.46 H.19 2.01 0,015 12 2,44 1.22 0,22 0221 12 1,06 0,59 0.10 0,i66

Sin lindin

A 6,57 i,64 0,92

A i,66 0,55 0,44

4 0,67 0,5i 0,15

lop2CD44 PrcJlsina

Hi

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La tincion nuclear con p16 es un indicador eficaz de la infeccion por HPV. Los niveles de SolCD44 son mas altos en HPV que en HPV+.

Tabla 5. Efectos univariados de factores de pronostico potenciales sobre PFS y OS

PFS OS

Factor de pronostico HR (95 % CI) Valor-P HR (95 % CI)__________Valor- P

Log2 CD44 aumento de 1-unidad: 1,407 (0,989, 2,001) 0,0574 1,638 (1,081, 2,482) 0,0200 0,0013 0,0046 0,0173 |

Protefna aumento de 1-unidad CD44>=10 vs. <10 Protefna >=1 vs. <1: 3,607 (1,626, 7,999) 3,180 (1,306, 7,742) 3,243 (1,349, 7,798) 0,0016 0,0108 0,0086 3,897 (1,701, 8,928) 4,595 (1,601, 13,186) 3,379 (1,239, 9,214)

Fumador: actual vs.: 0,911 (0,155, 4,993) 0,9148 3,099 (0,346, 0,3117

no fumador: 27,738)

Fumador: ex vs. no: 1,410 (0,321, 6,198) 0,6496 2,750 (0,355, 0,3331

fumador: 21,328)

Fumador: actual vs.: 1,501 (0,575, 3,915) 0,4069 1,261 (0,436, 3,642) 0,6688

no/ex

Alcohol: pesado vs.: 2,236 (0,919, 5,439) 0,0759 2,775 (0,959, 8,031) 0,0598

no/leve

P16+ vs. P16": 0,674 (0,268, 1,693) 0,4014 0,748 (0,265, 2,113) 0,5831

P16 nuclear vs. solo: 0,628 (0,240, 1,640) 0,3420 0,765 (0,261, 2,242) 0,6251

cist/sin tincion

CD44:: 1,763 (0,698, 4,452) 0,2304 2,407 (0,765, 7,579) 0,1333

memb solamente,

universal vs. otro

EGFR: memb&cit,: 1,691 (0,686, 4,173) 0,2539 1,203 (0,427, 2,289) 0,7269

universal vs. otro

Etapa IV vs. I-III: 2,994 (1,005, 8,921) 0,0490 2,824 (0,802, 9,939) 0,1059

Etapa III-IV vs. I-II: 2,732 (0,367, 0,3268 2,164 (0,285, 0,4552

: 20,355) 16,415)

T4- vs. T1-3: 3,055 (1,260, 7,408) 0,0135 2,973 (1,078, 8,204) 0,0353

Negro vs. blanco: 5,432 (2,152, 0,0003 6,530 (2,286, 0,0005

: 13,714) 18,658)

No-hispano: 3,001 (1,254, 7,182) 0,0136 4,009 (1,431, 0,0083

vs.hispano: 11,234)

Genero: femenino: 2,388 (0,924, 6,170) 0,0723 1,770 (0,494, 6,338) 0,3801

vs. masculino

Edad aumento de 1-: 1,003 (0,961, 1,047) 0,8778 1,043 (0,991, 1,096) 0,1046

unidad

HR (95 % CI): estimacion de riesgo y el correspondiente intervalo de confianza del 95 % a partir de modelos de Cox univariado

5

La seccion encerrada en la Tabla 5 muestra asociaciones significativas entre los niveles de marcador y las variables pronosticas.

Tabla 6. Modelos de regresion de Cox bivariados

: PFS OS

Factor de pronostico: HR (95 % CI) Valor-P HR (95 % CI) Valor-P

CD44 > =10 vs. <10: 2,327 (0,891, 6,078) 0,0847 4,370 (1,489, 12,824) 0,0073

: 2,197 (0,675, 7,148) 0,1910 1,487 (0,188, 0,7073

Etapa IV vs. I-III: 11,784)

CD44 > =10 v. <10: 2,949 (1,195, 7,281) 0,0190 3,610 (1,164, 11,194) 0,0262

: 2,014 (0,262, 0,5014 1,894 (0,488, 7,348) 0,3558

Etapa III-IV v. I-II: 15,498)

Protefna > =1 v. <1: 2,470 (0,956, 6,381) 0,0619 2,710 (0,921, 7,974) 0,0702

Etapa IV v. I-III: 2,059 (0,630, 6,734) 0,2321 1,886 (0,486, 7,319) 0,3589

Protefna > =1 v. <1: 3,018 (1,223, 7,446) 0,0165 3,256 (1,139, 9,305) 0,0276

Etapa III-IV v. I-II: 1,728 (0,219, 13,667) 0,6040 1,260 (0,151, 10,506) 0,8312

5

10

15

20

25

30

35

El efecto de solCD44 y la protefna total en la prediccion de la supervivencia libre de progresion (PFS) y la supervivencia global (OS) parece ser independiente de la etapa.

Ejemplo 3:

Existe una tremenda necesidad de una prueba simple, de bajo coste, no invasiva de deteccion temprana para HNSCC. Los esfuerzos previos se han centrado en CD44, una glicoprotefna transmembrana que esta emergiendo como un marcador crftico de iniciacion tumoral de HNSCC. Cuando las celulas SCC-25 (CD44 bajo) se transfectaron con CD44 de forma estandar, se demostro que la sobreexpresion de CD44 dio como resultado un aumento de la proliferacion, migracion y resistencia al cisplatino (Figuras 3A, 3B, 3C). Ademas, la anulacion de CD44 usando la lfnea celular alta CAL27 de CD44 y EGFR da lugar a un crecimiento tumoral muy disminuido en ratones lampinos (Figura 4A, 2B) (P<0,05). Los interactuantes CD44 han demostrado interactuar con las principales tirosina quinasas tales como EGFR (el objetivo de la terapia de cetuximab) para inducir el crecimiento y la migracion. Los datos divulgados en la Figura 5 muestran que el EGFR total y su forma fosforilada (Y1068) se reducen en xenoinjertos de CD44-siARN que indican que las dos moleculas estan funcionalmente relacionadas.

Debido a la necesidad crftica de una prueba de deteccion temprana y el conocimiento de que CD44 podrfa escindirse a una forma soluble, se evaluo la solCD44 en los enjuagues orales de pacientes con cancer y controles. En un estudio piloto que incluyo 26 pacientes con HNSCC y 10 voluntarios sanos, se demostro que el solCD44 podia detectarse en los enjuagues orales y podia distinguir a los pacientes con enfermedad invasiva de los voluntarios normales con una sensibilidad de 79 % y 100 % de especificidad. Para determinar si esta prueba funcionarfa en una poblacion de mayor riesgo, se desarrollo una cohorte de control con antecedentes de uso de tabaco y/o alcohol y enfermedad benigna de cabeza y cuello. En este estudio con 102 HNSCC y 69 controles, se demostro que la prueba ELISA solCD44 tenia una sensibilidad del 62 % y una especificidad del 88 %, y se demostro que las enfermedades benignas no tenfan un impacto significativo en los resultados. Se determino que los niveles de los marcadores eran mas bajos en sujetos con tumores laringeos/hipofaringeos que son menos frecuentes y localizados mas distalmente en el tracto aerodigestivo superior (UADT).

Para mejorar la sensibilidad, se examinaron marcadores adicionales. Se encontro que la protefna total, medida mediante un ensayo simple de tipo Lowry y usada originalmente como normalizador para el estado de hidratacion, era elevada en HNSCC en comparacion con los controles. Cuando se evaluo la misma cohorte, se demostro por primera vez que solCD44 y los niveles totales de protefna combinados, son mas eficaces para distinguir el HNSCc de los controles que cualquiera de los dos marcadores. Un trabajo mas reciente en una cohorte de 39 controles y 40 casos demostro que la inclusion de otras variables de riesgo como la perdida de dientes y la educacion mejora la prueba, resultando en un area bajo la curva (AUC) para el analisis multivariado de 0,85.

Tabla 7. Modelos logfsticos ajustados para edad

Grupo

Hombre negro

Hombre blanco

Mujer negra

Mujer blanca

Casos: Controles Modelo Variables OR p AUC


: 1 Log2 CD44 2,878 0,0457 0,853



: Protefna 13,378 0,0250 0,862

15
15: 2 Log2 CD44 2,078 0,2405 0,889



: & Protefna 5,450 0,1582

3


: 1 Log2 CD44 2,410 <,0001 0,723



: Protefna 2,101 0,0594 0,609

90: 76 2 Log2CD44 2,965 <,0001 0,739


: 3 & Protefna 0,468 0,1768

7: 17 1 Log2CD44 1,963 0,2204 0,647



: Protefna 3,796 0,2238 0,672


: 2 Log2CD44 1,554 0,6705 0,689


: 3 & Protefna 1,747 0,7916


: 1 Log2CD44 1,262 0,6988 0,600



: Protefna 1,896 0,3557 0,594

19: 14 2 Log2CD44 0,989 0,9823 0,594


: 3 & Protefna 1,919 0,5364

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 8. ^ SolCD44, log2solCD44 y niveles de proteina en los enjuagues bucales


: Cancer (N=132) Control (N=124)

: N Media SD SE Media SD SE Valor-P

CD44: 132 5,83 7,19 0,63 2,95 1,92 0,17 <,0001

Log2 CD44: 132 2,01 1,16 0,10 1,30 0,87 0,08 <,0001

Proteina: 132 0,98 0,55 0,05 0,77 0,41 0,04 <,001

Este estudio utilizo un diseno caso-control para evaluar los marcadores solubles para HNSCC en 150 pacientes con HNSCC orofarfngea y de cavidad oral y 150 controles de frecuencia emparejada para las variables importantes. La Tabla 7 muestra un analisis provisional de solCD44, log2 solCD44 y niveles de proteina total en 132 casos y 124 controles. Los casos y controles fueron exitosamente emparejados en frecuencia por edad, sexo, raza y etnia (p> 0,5). Tanto los niveles de proteina total como los de solCD44 estan significativamente elevados. Los modelos logfsticos de la Tabla 8 se ajustan para edad. La prueba detecto cancer oral mejor en hombres negros. Para las mujeres negras, el tamano de la muestra era menor. No hubo un efecto significativo de los marcadores, ya sea individualmente o en conjunto, sin embargo, las proporciones de probabilidades correspondientes estaban en la misma direccion que los hombres negros. Entre los hombres blancos, el efecto de log2 cD44 fue significativo por si mismo o cuando se anadio proteina. Hubo una ligera mejorfa para el modelo 3 comparado con el modelo 1. Finalmente, entre las hembras blancas, los marcadores fueron menos efectivos, con AUCs cercanos a 0,60. Dado que la prueba de marcador funciono mejor en hombres negros, un grupo donde la infeccion por HPV es menos comun, la expresion de HPV se examino en los casos de cancer oral.

Se identificaron 37 casos con el tejido FFPE disponible. A excepcion de un paciente con seguimiento de 13,9 meses, todos los 20 pacientes vivos restantes tuvieron seguimiento en el intervalo de 27 a 54,4 meses (mediana 37 meses). Catorce de 16 muertes ocurrieron dentro de los primeros 2 anos de seguimiento. solCD44 y los niveles de proteina total se evaluaron en los enjuagues orales, y varios patrones de tincion de CD44, EGFR y p16 (como un sustituto de la infeccion por HPV) se examinaron utilizando IHC. Tambien se determinaron asociaciones con supervivencia libre de progresion y global. Tambien se evaluaron importantes comportamientos demograficos y de factores de riesgo como genero, raza, etnia, consumo de tabaco y alcohol. Esta cohorte tenia los siguientes datos demograficos: la edad media era de 60,4 anos, el 16,2 % eran mujeres, el 59,5 % eran hispanos, el 21,6 % eran negros, el 64,9 % eran fumadores actuales, el 50 % eran bebedores intensos y el 57,1 % tenia ingresos inferiores a $10.000 por ano. Las caracterfsticas de la enfermedad del grupo fueron las siguientes: 35,1 % fueron cavidad oral (OC) y el resto fueron canceres orofarfngeos (OP); solo el 32,4 % de los sujetos eran etapa III o inferior; los pacientes fueron tratados con quimiorradioterapia (43,2 %), cirugfa y quimiorradioterapia (24,3 %), cirugfa sola (13,5 %), cirugfa mas radiacion (5,4 %), cirugfa y quimioterapia (2,7 %), quimioterapia sola (2,7 %) y nada o faltaban los datos (5,4 %). Casi el 57 % regreso o progreso y el 43,2 % fallecio.

Cuarenta y cuatro por ciento de los tumores fueron p16+ como se define por el 50 % o mas de las celulas tumorales de tincion positiva para p16. La comparacion de los patrones de IHC revelo que la tincion positiva de p16, la falta de tincion de membrana cD44, la falta de la tincion de membrana de EGFR y el patron de tincion citoplasmatica, y los tumores no queratinizantes se asociaron significativamente con OP en comparacion con los tumores OC. No hubo diferencias en la estadificacion ni en los resultados por sitio del tumor. Con respecto a la localizacion de la tincion, la positividad de p16 se asocio significativamente con la tincion nuclear o nuclear y citoplasmatica p16 (p<0001) en comparacion con solo tincion citoplasmatica o ninguna tincion. De manera similar, la falta de tincion universal de la membrana CD44 (p<0,0001) se asocio con la positividad p16. La falta de membrana universal EGFR y tincion citoplasmatica en los tumores p16 positivos tambien alcanzo importancia estadfstica (p=0,02). La queratinizacion, el genero, la etnia, la raza, el consumo de tabaco y de alcohol no estaban significativamente relacionados con la positividad de p16 en este estudio.

Los niveles de SolCD44 y de protefnas totales en el enjuague oral no mostraron diferencias significativas con base en el estado de p16 si se uso la definicion de p16+ como 1) 50 % o mas celulas tumorales p16+ o 2) cualquier tincion nuclear p16 en oposicion a solamente tincion citoplasmatica/sin tincion. Sin embargo, tanto para solCD44 como para la proteina total, los niveles significativamente mas altos se asociaron con recidiva o progresion (CD44: 10,8 vs. 4,3 p=0,043, proteina 1,2 vs. 0,8 p=0,030). Con base en Kaplan-Meier, prueba de grado logarftmico y analisis de regresion de Cox, los predictores significativos de supervivencia libre de progresion fueron CD44 (> 10 vs. <10, HR=3,18 p=0,011), proteina (>1 vs. <1, HR=3,24 , p=0,009), etapa T (T4 vs. TI-III, HR=2,99, p<0,049), raza (Negro vs. Blanco, HR=5,43, p<0,0001) y etnia (no-hispano vs. hispano, HR=3,00, p<0,014). El genero casi alcanzo significacion (femenino vs. masculino, HR=2,39, p<0,072). De manera similar, los predictores significativos de supervivencia global fueron CD44>10 (HR=4,60, p=0,005), proteina >1 (HR=3,38, p=0,17), etapa T4 (HR=2,97, p=0,035), raza negra (HR=6,53, p<0,001) y la etnia no hispana (HR=4,01, p=0,008). Las siguientes variables no mostraron importancia como predictor de la supervivencia libre de progresion y de la supervivencia global: el estado de p16, patron de tincion de CD44, patron de tincion de EGFR, queratinizacion, historia de consumo de tabaco, historial de consumo de alcohol, sitio (cavidad oral versus orofaringe), estado del nodulo y edad. Ademas, CD44 y

protefna conservaron la magnitud de efecto y la significacion en el analisis bivariado, incluida la etapa de la enfermedad.

En este grupo de HNSCC, solo 5 sujetos nunca fueron fumadores; de estos, 4 fueron HPV+. De los nunca fumadores 5 y HPV+ todos estaban vivos y 1 en recidiva. Por lo tanto, la falta de asociacion entre el estado p16 y el pronostico puede deberse a los pocos nunca fumadores en el estudio, ya que varios estudios muestran que los HPV+ no fumadores tienen un pronostico notablemente mejor en comparacion con los HPV+ fumadores.

Para investigar mas a fondo las asociaciones significativas entre p16, CD44 y localizacion EGFR, se realizo tincion 10 de inmunofluorescencia. La Figura 6 muestra la tincion de p16- IHC tfpica donde la tincion es citoplasmatica y difusa. En este caso, CD44 se tine en la membrana y universalmente a lo largo del tumor. CD44 y EGFR se colocalizan en la membrana celular y tambien hay cierta tincion citoplasmatica de EGFR.

Sin embargo, cuando los tumores son p16+, como se muestra en la Figura 7, los nucleos se tinen fuertemente para 15 p16 y tambien hay tincion citoplasmatica. Sin embargo, la tincion de la membrana CD44 se pierde, solo los linfocitos

invasores retienen la expresion de CD44. La expresion de EGFR no se ve en absoluto.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para determinar un riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) en un sujeto infectado con papilomavirus humano (HPV), comprendiendo el metodo:

a) proporcionar una muestra obtenida a partir de un fluido corporal del sujeto;

b) ensayar un nivel de solCD44 en la muestra;

c) ensayar un nivel de protefna total en la muestra;

d) combinar el nivel de solCD44 medido en la muestra con el nivel de protefna total medido en la muestra y el estado de HPV del sujeto, proporcionando asf una puntuacion combinada;

e) proporcionar una puntuacion predictiva para tener el riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, en el que la puntuacion predictiva se obtiene mediante un analisis estadfstico de solCD44 y la protefna total medida y estado de HPV de una poblacion con un riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello; y

f) determinar el riesgo de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello en el sujeto cuando la puntuacion combinada excede la puntuacion predictiva.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el riesgo es un riesgo de recurrencia de HNSCC.
3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el fluido corporal es saliva.
4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la muestra de saliva es un enjuague oral.
5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se usa un anticuerpo dirigido contra CD44 para ensayar el nivel de solCD44.
6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el ensayo es un Ensayo de Inmunoabsorcion Ligado a Enzima, un ensayo de flujo lateral o inmunoprecipitacion Western, o comprende tecnicas de inmunoprecipitacion, inmunofluorescencia o inmunohistoqufmica.
7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas el ensayo del nivel de al menos uno de: acido hialuronico (HA) e hialuronidasa (HAasa) en la muestra.
8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sujeto infectado con papilomavirus humano se identifica detectando p16INK4a.
9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el sujeto infectado con papilomavirus humano se identifica detectando ADN o ARN de HPV, protefna de HPV o cambios epigeneticos.
10. Un kit, que comprende:

INK4a

al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16 ;

al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44; y un reactivo para determinar la concentracion de protefna total en una muestra.

INK4a
11. El kit de la reivindicacion 10, en el que al menos un anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16 comprende el idiotipo del clon del anticuerpo E6H4.
12. El kit de la reivindicacion 10 u 11, que comprende ademas una muestra de referencia de CD44, una muestra de referencia de p16, o una combinacion de los mismos.
13. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende ademas uno o mas agentes colorimetricos para la deteccion del anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16INK4a, el anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44, o una combinacion de los mismos.
14. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el kit es un inmunoensayo de flujo lateral.
15. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el kit comprende una placa de pozos multiples

opcionalmente revestida con el anticuerpo que se enlaza especfficamente a p16INK4a, el anticuerpo que se enlaza especfficamente a CD44, o una combinacion de los mismos.