CN104067126A - 用于检测人乳头瘤病毒并提供头颈部鳞状细胞癌预后的方法 - Google Patents

用于检测人乳头瘤病毒并提供头颈部鳞状细胞癌预后的方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于头颈部鳞状细胞癌的诊断及确定其预后的方法和试剂盒。一种用于诊断受试者中的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的示例性方法可包括测定得自所述受试者的唾液样品的总蛋白、solCD44和HPV的存在性，以及在多变量分析中使用总蛋白、HPV和CD44水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而将患有HNSCC、或其将来复发风险升高的受试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的受试者区分开来。

Description

用于检测人乳头瘤病毒并提供头颈部鳞状细胞癌预后的方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年11月15日提交的美国临时专利申请第61/559,974号以及2012年6月1日提交的美国临时专利申请第61/654,595号的优先权权益，它们各自整体以引用方式并入本文。
政府支持确认
本发明根据国立卫生研究院的第R01CA118584-NIH号资助在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本文所公开的主题一般涉及用于头颈部鳞状细胞癌的检测、治疗和预后的方法和试剂盒。
发明背景
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)每年在美国影响着50,000人并在全世界影响着600,000人。主要风险因素包括吸烟和饮酒以及人乳头瘤病毒(HPV)感染。
迄今为止，尚无得到广泛接受的HNSCC筛查方案或检验(参见例如Vokes等人,N Engl J Med,328:184-94(1993)；Lingen等人,Curr Opin Oncol,13:176-82(2001)；Forastiere等人,N Engl J Med345:1890-1900(2001)；Patton,Orol Oncol,39:708-723(2003)；O’Hara等人,Clin Otolaryngol,27:133-4(2002)；Smart,Cancer72:1061-5(1993)；Sankaranarayanan等人,Cancer,88:664-73(2000)；Sankaranarayanan等人,Lancet365:1927-33(2005))，原因是金标准(通过体检筛查然后进行活组织检查)具有有限的灵敏性和特异性(分别为64％和74％)(Brocklehurst等人,Cochrane DatabaseSyst Rev,11:CD004150(2010))并且分子诊断测试仍在开发中(Nagler,Oral Oncol.,45:1006-10(2009)；Mahfouz等人,Eur Arch Otorhinolaryngol,267:851-60(2010))。使用染料、自体荧光或脱落细胞学的检测口腔癌的辅助技术是可用的，但是最近的评论提出了它们是否改善早期检出率的疑问(Patton等人,J Am Dent Assoc,139:896-905(2008)；Lingen等人,Oral Oncol44:10-22(2008))。因此，努力已集中于分子诊断工具。测试唾液的RNA表达谱的多项研究(Li等人,Clin Cancer Res,10:8442-8450(2004))、微RNA发现(Park等人,Clin Cancer Res,15:5473-5477(2009))和蛋白质组学分析(Hu等人,Clin Cancer Res,14:6246-6252(2008))显示出前景，但是有些复杂并且未得到验证(Nagler,Oral Oncol.,45:1006-10(2009)；Mahfouz等人,Eur Arch Otorhinolaryngol,267:851-60(2010))。因此，大部分患者在晚期才被诊断，此时治愈率为40％或更低。因此，需要早期检测测试。
发明概要
根据在本文具体体现并广泛描述的所公开的材料、化合物、组合物和方法的目的，所公开的主题在一个方面涉及用于头颈部鳞状细胞癌检测、治疗及提供其预后的方法和试剂盒。
另外的优点将在下文的描述中部分地示出，并部分地将通过该描述显而易见，或可通过实践下述方面得以了解。下述优点将通过在所附权利要求书中具体指出的要素和组合而实现和得到。应当理解，前文一般性描述和下文详细描述均仅仅为示例性和阐释性的，而非限制性的。
附图简述
图1A至1B是示出了研究中的患者的无进展生存率(PFS)(图1A)和总生存率(OS)(图1B)的图。图1C是示出了在12、24和36个月的中位PFS、PFS率和OS的表格。图1D是示出了总、中位、最小、最大、平均OS和PFS以及标准偏差的表格。
图2A至2RR是示出了如下表征的受试者中的PFS(图2A、2C、2E、2G、2I、2K、2M、2O、2Q、2S、2U、2W、2Y、2AA、2CC、2EE、2GG、2II、2KK、2MM、2OO、2QQ)和OS(图2B、2D、2F、2H、2J、2L、2N、2P、2R、2T、2V、2X、2Z、2BB、2DD、2FF、2HH、2JJ、2LL、2NN、2PP、2RR)的图：p16细胞核对细胞质/无染色(图2A-2B)、p16+对p16-染色(图2C-2D)、solCD44≥10ng/ml对solCD44<10ng/ml(图2E-2F)、总蛋白<1mg/ml对≥总蛋白1mg/ml(图2G-2H)、CD44染色对CD44无染色(图2I-2J)、CD44仅细胞膜/普遍染色对CD44无染色/其他(图2K-2L)、EGFR细胞膜和细胞质染色对EGFR细胞膜和细胞质无染色/其他(图2M-2N)、EGFR细胞膜和细胞质对其他对无染色(图2O-2P)、EGFR细胞膜对细胞质/无染色(图2Q-2R)、EGFR细胞膜对仅细胞质对无染色(图2S-2T)、角质化对非角质化(图2U-2V)、现时吸烟者对未/曾吸烟者(图2W-2X)、无酒精对轻度/中度酒精对重度酒精暴露(图2Y-2Z)、重度对轻度/无酒精暴露(图2AA-2BB)、唇和口腔癌对口咽癌(图2CC-2DD)、I/II期对III/IV期癌(图2EE-2FF)、I/II/III期对IV期癌(图2GG-2HH)、T1-T3对T4癌(图2II-2JJ)、N0对N1-N3、Nx(图2KK-2LL)、女性对男性(图2MM-2NN)、白人对黑人(图2OO-2PP)或西班牙对非西班牙人(图2QQ-2RR)。
图3A-3C是示出了CD44过表达增加了增殖(图3A)、迁移(图3B)和顺铂耐药性(图3C)的图。
图4A是CD44下调的稳定克隆的Western印迹。图4B是示出了与乱序或野生型CAL27相比对于两个CD44siRNA克隆而言在裸小鼠中的肿瘤生长抑制。
图5包括组织学载玻片，其示出了在用CD44siRNA或乱序序列处理后在CAL27异种移植物中的CD44、EGFR和pEGFR(Y1068)染色。CD44下调抑制CAL27异种移植物中的EGFR表达及其磷酸化(Y1068)。
图6示出了p16-癌症中p16、CD44和EGFR的免疫组织化学(IHC)染色，其中p16染色为细胞质和扩散的。在此情况下，CD44在细胞膜以及在整个肿瘤中普遍染色。CD44和EGFR在细胞膜上共定位，并且也存在一定的EGFR细胞质染色。
图7示出了p16+肿瘤中p16、CD44和EGFR的IHC染色，其中对于p16而言细胞核强烈染色，并且也存在一定的细胞质染色。然而，CD44细胞膜染色丧失，仅入侵淋巴细胞保持CD44表达。EGFR表达完全未观察到。
具体实施方式
本文所述的材料、化合物、组合物和方法可通过参考所公开主题的具体方面的以下详细描述以及其中所含的实施例而容易地理解。
在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物和方法之前，应当理解下述方面不限于具体的合成方法或具体的试剂，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定的方面，并非旨在进行限制。
另外，在此整个说明书中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容整体据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述所公开的主题所属的现有技术。所公开的参考文献对于在该参考文献所处的句子中讨论的其所含内容也单独地且具体地以引用方式并入本文。
定义
在本说明书及其之后的权利要求书中，将提及许多术语，它们应被定义为具有以下含义：
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及该词语的其他形式(诸如“包含”和“含有”)意指包括但不限于，而并非意图将其他添加剂、组分、整数或步骤排除在外。
如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况会发生或不会发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的情形以及不发生的情形。
范围可在本文表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。“约”可意指指定值的5％以内。当表达这样的范围时，另一个方面包括从所述一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，所述特定值形成另一个方面。还应当理解，范围每一个的端点在与另一个端点的关系中均是重要的并独立于另一个端点。也应当理解，存在本文所公开的许多值，并且每个值也在本文公开为除了该值本身外还包括“约”该特定值。例如，如果公开了值“2000”，则也公开了“约2000”。也应当理解，当公开一个值时，则也公开了“小于或等于该值”、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如技术人员适当地理解。例如，如果公开了值“2000”，则也公开了“小于或等于2000”以及“大于或等于2000”。也应当理解，在整个申请中，以许多不同的格式提供了数据，并且该数据代表端点和起点以及数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10和15之间也应被视为进行了公开。也应当理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
在说明书和最后的权利要求书中提及组合物中特定要素或组分的重量份是指组合物或制品中该要素或组分与任何其他要素或组分之间以重量份表示的重量关系。因此，在包含2重量份组分X和5重量份组分Y的配混物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且无论组合物中是否包含另外的组分均以该比率存在。
除非具体指出有相反含义，否则组分的重量百分比(重量％)基于包含该组分的制剂或组合物的总重量。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用以指代为诊断、预后、施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如，哺乳动物。因此，受试者可以是人类或兽医患者。
“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。
术语“预后”是本领域中公认的并包括关于疾病的可能过程或疾病进展的预测，特别是关于疾病缓解、疾病再现、肿瘤复发、转移和死亡的可能性。“良好预后”是指受癌症(诸如头颈部鳞状细胞癌)影响的患者将保持无疾病(即，无癌症)的可能性。“不良预后”意在表示潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或死亡的可能性。被归类为具有“良好转归”的癌症患者保持无潜在癌症或肿瘤。相比之下，“不良转归”的癌症患者经历疾病再现、肿瘤复发、转移或死亡。在特定的实施方案中，用于评估预后和转归的时间范围为例如短于一年、一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十五年、二十年或更多年。如本文所用，用于评估预后或无疾病生存时间的相关时间从手术摘除肿瘤或肿瘤生长得到控制、减轻或抑制开始。因此，例如，在特定的实施方案中，“良好预后”是指头颈部鳞状细胞癌患者将保持无潜在癌症或肿瘤至少五年的一段时间，更特别是至少十年的一段时间的可能性。在本发明的另外方面，“不良预后”是指头颈部鳞状细胞癌患者在短于五年，更特别是短于十年内经历疾病再现，肿瘤复发、转移或死亡的可能性。上面提供的用于评价预后和转归的时间范围是例证性的，并非意图进行限制。
术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。
术语“抗体”是指选择性结合目标抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语“抗体”的范围内。
另外，本文公开的是可用于所公开的方法和组合物的产品、可与所公开的方法和组合物的产品联合使用、可用于制备所公开的方法和组合物的产品或为所公开的方法和组合物的产品的材料、化合物、组合物和组分。这些及其他材料在本文予以公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能不会明确地具体提及这些化合物的每一个和集体组合以及排列，但是在本文具体设想和描述每一个。例如，如果公开了一种组合物并且讨论了可对该组合物的许多组分进行的许多修改，则除非具体地相反指出，否则具体设想了可能的每一种组合和排列。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于组合物以及在制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤的每一个可通过所公开的方法的任一具体的方面或多个方面的组合而执行，并且具体设想了每一个这样的组合，它们应被视为都予以了公开。
现在将详细参考所公开的材料、化合物、组合物、组分、装置、制品和方法的具体方面，其实例在以下的描述和实施例中以及在附图及其之前和以下的描述中示出。
生物标志物测定法
描述了用于头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的诊断及确定其预后的有效、低成本、非侵入性测定法。所公开的测定法涉及检测得自受试者的样品中的一种或多种生物标志物，诸如CD44(例如可溶性CD44(solCD44))。Franzmann等人的美国专利第8,088,591号对于其可用于诊断和监测受试者中的HNSCC的生物标志物的描述整体以引用方式并入。这些生物标志物的水平升高能够以高准确度和特异性将癌症患者与对照区分开来。然而，这些生物标志物在某些受试者群体中降低，尽管存在HNSCC。
因此，本发明公开可用于提高HNSCC测定法的准确度和特异性的另外的生物标志物和风险因素。例如，已表明，相结合的solCD44和总蛋白水平在区分HNSCC与对照方面比任一单独的标志物更有效。然而，solCD44水平在具有人乳头瘤病毒(HPV)感染的受试者中可能较低。事实上，使用solCD44和总蛋白水平的双变量分析在黑人中最有效，在黑人中HPV感染不太常见。因此，在多变量分析中包括HPV状态可提高测定法的灵敏性和准确度并使得能够检测HPV+HNSCC。
其他与HNSCC检测或预后相关的生物标志物可与总蛋白、solCD44和HPV检测结合使用以提高所公开的方法的灵敏性和/或准确度。例如，solCD44水平可根据年龄和吸烟状况而变化。可用于多变量分析的HNSCC风险因素和人口因素的实例包括烟草暴露、酒精暴露、种族、民族、牙齿健康、性别、教育水平、年龄、一般健康状况、癌症家族史、性经验和社会经济状况，以及在多变量分析中使用一个或多个风险因素或人口因素以确定综合分数。
因此，公开了涉及所公开的生物标志物和风险因素的多变量分析以确定各个受试者的综合分数的测定法以及将所述测定法用于诊断和预后的方法。然后可将综合分数用于确定受试者中HNSCC的存在性或HNSCC复发的风险。具体地讲，可通过比较阳性和阴性对照值从经验上确定综合分数截止值。
本文所述的生物标志物包括基因和蛋白。此类生物标志物包括含有编码生物标志物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。生物标志物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标志物蛋白是由本发明的DNA生物标志物编码的或对应于本发明的DNA生物标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白的一部分。为生物标志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续的核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长生物标志物多核苷酸中的核苷酸个数。生物标志物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续氨基酸，或存在于本发明的全长生物标志物蛋白中的氨基酸的总数。“变体”旨在表示基本上相似的序列。一般来讲，本发明的特定生物标志物的变体将具有通过序列比对程序测定的与所述生物标志物至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本文所述的生物标志物是其过表达与癌症(尤其是HNSCC)预后相关的基因和蛋白。在特定的实施方案中，在患者样品中所关注的生物标志物或生物标志物组合的选择性过表达表明不良癌症预后。所谓“表明不良预后”是指特定生物标志物或生物标志物组合的过表达与潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或死亡的可能性增加相关，如上文所定义。例如，“表明不良预后”可表示潜在癌症或肿瘤的再现或复发、转移或五年内(更特别是十年内)死亡的可能性增加。表明不良预后的生物标志物可在本文称为“不良转归生物标志物”。在其他实施方案中，不存在所关注的生物标志物或生物标志物组合的过表达表明良好预后。如本文所用，“表明良好预后”是指患者将保持无癌症的可能性增加，如上文所定义。在一些实施方案中，“表明良好预后”是指患者将保持无癌症至少五年，更特别是至少十年的可能性增加。此类生物标志物可称为“良好转归生物标志物”。
所公开的生物标志物包括其过表达(与对照相比)与HNSCC预后相关的基因和/或蛋白。基因或蛋白与对照相比可过表达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。生物标志物包括表明不良HNSCC预后的基因和蛋白(即，不良转归生物标志物)以及表明良好预后的那些基因和蛋白(即，良好转归生物标志物)。尤其关注的生物标志物包括在细胞生长和增殖的调控、细胞周期控制、DNA复制和转录、细胞凋亡、信号转导、血管生成/淋巴生成或转移中涉及到的基因和蛋白。在一些实施方案中，生物标志物调控组织重塑、细胞外基质降解和相邻组织浸润中涉及到的蛋白酶系统。其他生物标志物包括基因表达(诸如高甲基化)的调控子或微RNA。虽然其表达模式表明HNSCC预后的任何生物标志物均可用于实践本发明所公开的方法和测定法，但是在特定的实施方案中，生物标志物选自HPV、总蛋白和CD44。在一个实施方案中，CD44生物标志物为solCD44。
HPV感染可通过直接或间接测量HPV而测定。三类分子测定法目前可用于检测组织和脱落细胞样品中的HPV感染。它们全部都基于检测HPV DNA并包括：(1)非扩增杂交测定法(Southern转移杂交(STH)、斑点印迹杂交(DB)和原位杂交(ISH))；(2)信号扩增杂交测定法，诸如杂交捕获测定法；以及(3)靶标扩增测定法，诸如PCR和原位PCR。Southern印迹杂交需要大量DNA、费力并且无法重现，而原位杂交对于HPV仅具有中度的灵敏性。基于PCR的HPV检测及其灵敏而又具有特异性。使用该方法，通过DNA聚合酶在体外扩增病毒DNA以生成足量的靶标，然后直接在凝胶上可视化，或(更特异性的方法)使用传统杂交方法通过特异性探针进行检测。在实践中，基于PCR的方法的灵敏性在100ng细胞DNA的背景下为约10-100个HPV病毒基因组。由于PCR可以非常小量的DNA(10-100ng)进行，因此理想的是用于具有低DNA含量的标本。
目前，唯一可用的经FDA批准的HPV检测方法是第二代杂交捕获测定法(Hybridcapture II assay)(Qiagen,Valencia,CA)。在该测定法中，将HPV DNA杂交到RNA探针，然后捕获并通过化学发光系统检测RNA-DNA杂交体。该测定法的灵敏性类似于基于PCR的测定法，其中高灵敏性通过信号而实现，而非靶标扩增。当前的第二代杂交捕获(HC II)测定法具有检测每毫升样品中的1pg HPV(约50,000个拷贝)的灵敏性。正确的样品采集对于实现最高的灵敏性必不可少，并且已表明刷子采样装置是最佳的。HC II测定法包含与13种高风险(类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5种低风险(6、11、42、43、44)HPV类型的基因组序列互补的合成的RNA探针。
作为另外一种选择，HPV感染可通过检测病毒mRNA转录物或通过检测细胞蛋白p16而测定。HPV要导致癌症，允许病毒致癌基因E6和E7(最初在基底细胞层中，然后在整个上皮中)高水平表达的持续性感染和细胞环境必不可少。因此，检测E6/E7mRNA可比DNA方法鉴定临床上更显著的感染。
周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A、p16Ink4A、p16)是致癌E6/E7mRNA的表达增加的细胞关联物。HPV致癌基因的主要作用是通过E6下调p53，并因而取消细胞凋亡并从pRb释放E2F，其导致细胞周期的连续激活。在生理上，E2F激活由Rb蛋白的磷酸化介导。该通路受到一系列阻断酶磷酸化pRB(周期蛋白依赖性激酶)的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(尤其是p16)的严格调控。在具有转化HPV感染的细胞中，Rb-E2F通路的调控受到E7的干扰，并且p16的激活无下游效应。因此，p16强烈过表达并在细胞中蓄积。已在宫颈癌前期和宫颈癌的绝大部分中证实了p16过表达，而在正常组织中，只在极少数情况下发现了p16表达。
HPV感染的表观遗传效应也可用于检测HPV。HPV+与HPV-HNSCC细胞系之间的差异甲基化基因座在Sartor MA等人，Epigenetics6(6):777-87(2011)中有所描述，其对于这些表观遗传谱以引用方式并入。
因此，可使用特异性结合p16INK4a的抗体检测HPV感染。作为另外一种选择，HPV感染可通过检测HPV DNA、RNA或蛋白而确定。同样，HPV感染可通过检测病毒致癌基因(例如E6/E7)或表观遗传改变而确定。
方法
本发明公开了用于诊断受试者中的HNSCC、对受试者中的HNSCC肿瘤分期、监测HNSCC治疗的效果、或确定经诊断患有HNSCC的受试者的预后、或预测HNSCC在受试者中的复发的方法。这些方法各自包括对得自受试者的身体样品测定总蛋白、solCD44和HPV的存在性。总蛋白、HPV和CD44水平的组合可用于多变量分析以确定综合分数。该方法还可以包括测定身体样品的透明质酸(HA)、透明质酸酶(HAase)、IL-8或其组合的存在性。HNSCC风险因素和/或人口因素也可与总蛋白、solCD44和HPV检测结合使用以提高所公开的方法的灵敏性和/或准确性。
多变量分析基于多变量统计学的统计原理，其涉及一次观察并分析多于一个统计转归变量。例如，存在若干可与多变量分析一起使用的回归方法，包括但不限于广义线性和非线性回归、逻辑和泊松回归、监督机器学习算法、神经网络、支持向量机、响应面建模和多元自适应回归样条。在一些实施方案中，使用逻辑回归。
例如，多变量分析可首先涉及确定总蛋白、solCD44和p16水平基于诸如种族、性别、吸烟和饮酒的风险变量而变化的方式。然后可开发数学模型，其术语包括生物标志物水平和风险变量以预测癌症的概率。与术语相关的统计显著性反映其对预测的重要性。然后可将数学模型用于估计预测分数，其允许建立癌症的总体概率分数。例如，在研究标志物水平和风险变量(例如种族、性别、吸烟和饮酒)与转归的关联方式(包括相互作用)后，可得到涉及生物标志物和协变量的对数优势的拟合模型。基于该模型，可在模型所包括的所有变量的指定值下估计患癌症的分数或预测概率。
在一些实施方案中，综合(预测)分数增加到截止点以上可区分患有HNSCC的受试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的那些受试者。在一些实施方案中，综合分数增加到截止点以上可确定HNSCC肿瘤分期、预测HNSCC治疗的有效性、预测经诊断患有HNSCC的受试者的预后或预测HNSCC复发的风险。例如，分数增加到截止点以上可与不良预后或复发可能性相关。
所公开的测定法和方法可用于指导患有HNSCC的受试者或处于发生HNSCC风险的受试者的治疗性治疗。例如，可向具有低综合分数的受试者给予单模式治疗，诸如单独的手术或放疗而非联合疗法。这将导致与治疗相关的发病率降低。相比之下，可向具有高综合分数的受试者提供更积极的治疗，诸如手术、放疗和化疗，因为鉴于疾病的较高死亡风险，将会发生较高的治疗相关发病率。因此，所公开的方法还可以包括通过手术、放疗、化疗、光动力疗法、靶向疗法或其任何组合对经诊断患有HNSCC或经确定具有不良HNSCC预后的受试者进行治疗。
所公开的生物标志物的每一者可使用身体样品在受试者中进行检测。所谓“身体样品”是指对可在其中检测生物标志物的表达的细胞、组织或体液的任何取样。此类身体样品的实例包括但不限于血液、淋巴、尿液、妇科体液、活组织检查样品和涂片。可用于本发明的体液包括但不限于血液、尿液、唾液、乳头抽吸液、灌洗液或任何其他身体分泌物或其衍生物。血液可包括全血、血浆、血清或血液的任何衍生物。在优选的实施方案中，身体样品包括口腔含漱液。采集各种身体样品的方法是本领域中熟知的。
所述方法可用于检测存在头颈癌风险的个体，例如吸烟者、酗酒者和暴露于HPV病毒的受试者。本文所述的方法还允许与其他已知预后指标的分析相比增强对HNSCC预后的评估。在特定的方面，灵敏性和特异性等于或大于已知癌症预后评价方法的灵敏性和特异性。用于评估特异性和灵敏性的终点是将使用本发明的方法预测的预后或转归(即，在诊断时或附近)与实际的临床转归(即，患者是保持无癌症还是在规定的时间周期内出现复发)进行比较。如本文所用，“特异性”是指本发明的方法可准确鉴定真阴性所处的水平。在临床研究中，通过将真阴性的数量除以真阴性和假阳性的总和而计算特异性。所谓“灵敏性”是指本发明的方法可准确鉴定真阳性样品所处的水平。在临床研究中，通过将真阳性的数量除以真阳性和假阴性的总和而计算灵敏性。在一些实施方案中，用于评价HNSCC的本发明所公开的方法的灵敏性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。此外，本发明的方法的特异性优选地为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在另外的实施方案中，对本发明的预后方法的灵敏性和特异性综合值进行评估。所谓“灵敏性和特异性综合值”是指如上文所定义的各个特异性和灵敏性值的总和。本发明的方法的灵敏性和特异性综合值优选地为至少约105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％或更高。
如本文所用，“真”和“假”阳性和阴性的定义将取决于所考虑的生物标志物或生物标志物组合是良好转归还是不良转归生物标志物。也就是说，就良好转归生物标志物(即，表明良好预后的那些生物标志物)而言，“真阳性”是指表现出所关注的生物标志物的过表达的那些样品(如通过体检然后通过活组织检查所确定)。病理学阳性活组织检查表明样品是阳性还是阴性。
如上所述，在一些实施方案中，使用两个或更多个生物标志物，更优选地，两个或更多个互补生物标志物。所谓“互补”是指检测身体样品中生物标志物的组合导致与仅使用一种生物标志物时所鉴定的相比在更大百分比的情况下准确确定癌症预后。因此，在一些情况下，可通过使用所公开的生物标志物中的至少两种更准确地确定癌症预后。
在本领域中可用于检测生物标志物表达的任何方法均包括在本文中。本发明的生物标志物的表达可在核酸水平或蛋白水平上检测。所谓“检测表达”是指确定生物标志物基因或蛋白的量或存在性。因此，“检测表达”涵盖以下情况：确定生物标志物未表达、未以可检测的程度表达、以低水平表达、以正常水平表达或过表达。为了确定过表达，可将待检验的身体样品与相应的样品进行比较。例如，相应的身体样品源于健康人。也就是说，“正常的”表达水平是生物标志物在例如得自未患有HNSCC的人类受试者或患者的样品中的表达水平。还可以将身体样品与得自进行HNSCC治疗的受试者的相应身体样品进行比较。这样的样品可以标准形式存在。在一些实施方案中，确定生物标志物过表达不需要身体样品与源自健康人的相应身体样品之间的比较。例如，检测肿瘤样品中表明不良预后的生物标志物的过表达可无需与源自健康人的相应样品进行比较。此外，在本发明的一些方面，所关注的生物标志物或生物标志物组合无表达、低表达或正常表达(即，不存在过表达)提供关于患者预后的有用信息。
用于检测本发明的生物标志物的表达的方法包括在核酸或蛋白水平上确定生物标志物的量或存在性的任何方法。此类方法在本领域中是熟知的，并包括但不限于横向流“试纸”、Western印迹、Northern印迹、Southern印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫组织化学、核酸杂交技术、核酸逆转录方法以及核酸扩增方法，例如PCR。在特定的实施方案中，使用例如抗特异性生物标志物蛋白的抗体在蛋白水平上检测生物标志物的表达。这些抗体可用于各种方法中，诸如Western印迹、ELISA、免疫沉淀或免疫组织化学技术。同样，可将组织的免疫染色与本领域已知的临床信息评估、常规预后方法和分子标志物(例如p16INK4a和solCD44)的表达相结合。以此方式，本发明所公开的方法可允许更准确地确定HNSCC预后。
试剂盒
本文还提供用于诊断受试者患有HNSCC或确定患有HNSCC的受试者的预后的试剂盒。该试剂盒可包含用于测定p16INK4a、solCD44和/或总蛋白的装置。例如，该试剂盒可包含特异性结合p16INK4a的多种抗体。在一些实施方案中，抗体包括E6H4抗体克隆的个体基因型。该试剂盒还可以包含用于检测所包含的抗体的检测剂(例如二抗和/或比色剂)。该试剂盒还可以包含特异性结合CD44(例如solCD44)的多种抗体。该试剂盒还可以包含用于确定样品中的总蛋白浓度的试剂。该试剂盒也可以包含p16INK4a和/或solCD44的参比样品。该试剂盒还可以包含试剂盒的使用说明(例如，诊断受试者的说明)、容器和/或托架。具体地讲，该试剂盒可包含计算机可读介质或超链接，其使用算法和参考表将检测值转化成综合分数。在一些实施方案中，该试剂盒为横向流免疫测定试剂盒。作为另外一种选择，该试剂盒可包含多孔板，其任选地包被有特异性结合p16INK4a的抗体、特异性结合CD44的抗体或其组合。
以下实施例旨在进一步阐述本文所述的方法和组合物的某些方面，而非意图限制权利要求书的范围。
实施例
在下文示出以下实施例以阐述根据所公开的主题的方法和结果。这些实施例并非意图包括本文所公开的主题的所有方面，而是阐述代表性方法和结果。这些实施例并非意图排除对本领域的技术人员显而易见的本发明的等同形式和变型形式。
已作出了努力以确保关于数值(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。除非另外指明，否则份数均为重量份，温度均以℃表示或处于环境温度下，并且压力为大气压或接近大气压。存在反应条件(例如组分浓度、温度、压力和其他反应范围)以及可用于优化通过所述工艺得到的产物纯度和收率的条件的多种变型形式和组合。将只需要合理的常规实验来优化此类工艺条件。
实施例1：
通过考察本文所述的标志物在其肿瘤为p16INK4a阳性的患者中改善的方式而研究了本文所述的测试与HPV相关HNSCC之间的关系。对十四名口咽癌受试者进行了评价。对于各受试者，获得了得自其肿瘤组织的p16INK4a免疫组织化学结果以及得自其口腔含漱液的solCD44和蛋白结果。solCD44和蛋白水平的平均水平在HPV+病例(CD44：3.17对4.2，p＝0.55；蛋白：0.83对1.07，p＝0.49)中较低，但差异未达到统计显著性。将使用得自口腔含漱液的上清液进行的solCD44和蛋白测试与使用得自相同口腔含漱液的沉淀检测的p16INK4a水平相结合。
进行了体外测定以定量测定得自口腔含漱液沉淀的裂解样品中的人p16INK4a蛋白。将相同的沉淀置于200μL含有蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific)的细胞裂解缓冲液(SIGMA)中，以使溶解的p16INK4a稳定化。然后将样品在95℃加热10分钟，其有利于细胞完全裂解以更好地检测p16INK4a。使用比色ELISA夹心技术对p16INK4a蛋白进行了定量，其中使用包被有p16INK4a特异性单克隆抗体E6H4TM(Roche mtmlaboratories AG)和第二种用HRP标记的p16INK4a特异性单克隆抗体的微量滴定板。通过生成基于p16INK4a水平(标准品1-6)的标准曲线进行了定量。测试样品中的水平通过基于标准曲线的内推法而确定。将酶标仪用于在450nm的波长下(参考波长：620nm)测量各孔中的吸光度。将基于4参数方法的计算程序用于获得最终p16INK4a样品浓度。结果以U/mL陈述，并且对研究样品一式两份地进行测量，各自的体积为100μL。经确认15U/mL的截止值为适当的阈值，以通过多中心临床研究(方案号9502-06-REG-DE-001)将各个临床标本分类为CervatecTMp16INK4a ELISA(Roche mtmlaboratories AG)结果阳性。
使用该组合方法，在14名HNSCC患者中测试了与CD44和蛋白相结合的p16INK4a，这些患者包括患有口腔或口咽鳞状细胞癌(CA)或未知原发癌(UK1CA)的患者。还测试了三名健康自愿者(HV)(参见表1)。具有低水平CD44(截止值设定为2.7ng/ml)和蛋白(截止值设定为1.0mg/ml)的两名患者具有高于15U/ml的截止值的p16INK4a水平。CD44和蛋白还各自鉴定出了未被其他测试法检出的肿瘤。因此，向检查中增加p16INK4a提高了灵敏性。所测试的3名健康自愿者均具有低于截止值的各标志物水平。
表1
*1U/ml＝2.8pg/ml的p16INK4a蛋白。
**CA：癌症，UK1CA：未知原发癌，HV：健康自愿者
实施例2：
使用对口腔癌组织的免疫组织化学，评价了与不良预后相关的一组标志物(CD44和EGFR)。我们确定了组织中CD44、EGFR和p16(HPV的替代标志物)的表达与solCD44和蛋白口腔含漱液水平之间的关系。
表2.患者人口统计数据和其他特征
表3.疾病特征、治疗和转归
表4.按IHC变量、PD状态和体征状态划分的口腔含漱液中的CD44、Log2CD44和蛋白
CD44以ng/ml(x5)表示，蛋白以mg/ml表示。
SD：标准偏差，SE：标准误差。P：学生t检验的P值。
p16细胞核染色是HPV感染的有效指标。SolCD44水平在HPV-中比在HPV+中更高。
表5.潜在预后因素对PFS和OS的单变量影响
HR (95％ CI)：单变量Cox模型的估计危险比和相应的95％置信区间。
表5中的方框区显示了标志物水平与预后变量之间的显著关联。
solCD44和总蛋白在预测无进展生存率(PFS)和总生存率(OS)方面的作用似乎与分期无关。
实施例3：
对于简单、低成本、非侵入性HNSCC早期检测测试存在巨大的需求。之前的努力已关注于CD44，这是一种作为关键的HNSCC肿瘤初发标志物而出现的跨膜糖蛋白。当将SCC-25细胞(CD44低)用CD44标准形式转染时，已表明CD44的过表达导致了增加的增殖、迁移和顺铂耐药性(图3A、3B、3C)。此外，使用CD44和EGFR高细胞系CAL27对CD44的敲低导致了裸小鼠中大大削弱的肿瘤生长(图4A、2B)(P<0.05)。已表明，CD44与关键的酪氨酸激酶诸如EGFR(西妥昔单抗疗法的靶标)发生相互作用从而诱导生长和迁移。图5中的公开数据表明，总EGFR及其磷酸化形式(Y1068)在CD44-siRNA异种移植物上减少，从而表明两种分子在功能上相关。
由于对早期检测测试的迫切需求以及对CD44可裂解成可溶形式的认识，在得自癌症患者和对照的口腔含漱液中评价了solCD44。在包括26名HNSCC患者和10名健康自愿者的预试研究中，已表明，solCD44可在口腔含漱液中检出并可以79％的灵敏性和100％的特异性将具有侵袭性疾病的患者与正常自愿者区分开来。为了确定该测试是否在较高风险的群体中有效，建立了具有吸烟和/或饮酒史和头颈良性疾病的对照队列。在具有102名HNSCC患者和69名对照患者的该研究中，已表明，solCD44ELISA测试具有62％的灵敏性和88％的特异性，并且未表明良性疾病会明显影响结果。据确定，标志物的水平在具有喉/下咽肿瘤的受试者中较低，这些肿瘤不太常见并在上呼吸消化道(UADT)中位于更远侧。
为了提高灵敏性，研究了另外的标志物。据发现，总蛋白(通过Lowry类测定法测量并最初用作水合状态的标准化物)在HNSCC中与对照相比升高。当评价相同的队列时，已首次表明，相结合的solCD44和总蛋白水平比任一单独的标志物更有效地区分HNSCC与对照。最近在39个对照和40个病例的队列中开展的工作证实，包括其他风险变量(诸如牙缺失和教育)改善了测试，从而导致多变量分析0.85的曲线下面积(AUC)。
表7.针对年龄而调整的逻辑模型
表8.口腔含漱液中的SolCD44、log2solCD44和蛋白水平
该研究使用了病例对照研究以在150名口咽和口腔HNSCC患者和针对重要变量进行了频率匹配的150名对照中评价HNSCC的可溶性标志物。表7示出了132个病例和124个对照中的solCD44、log2SolCD44和总蛋白水平的期中分析。病例和对照针对年龄、性别、种族和民族进行了成功的频率匹配(p>0.5)。solCD44和总蛋白水平均显著升高。表8中的逻辑模型均针对年龄进行了调整。该测试在黑人男性中最佳地检出了口腔癌。对于黑人女性，样本大小较小。单独的或一起的标志物不存在明显的影响，但是，相应的优势比与黑人男性处于相同的方向。在白人男性之中，log2CD44的作用单独地或在添加蛋白时均显著。对于模型3，与模型1相比存在轻微的改善。最后，在白人女性之中，标志物的有效性最差，其中AUC接近0.60。由于标志物测试在黑人男性(HPV不太常见的组)中最有效，因此在口腔癌病理中研究了HPV表达。
通过可用的FFPE组织鉴定了三十七个病例。除了一名随访期为13.9个月的患者外，所有其余20名存活患者均具有27至54.4个月范围内的随访期(中位值37个月)。16例死亡中有14例发生在随访期的前2年。在口腔含漱液中评价了solCD44和总蛋白水平，并使用IHC研究了CD44、EGFR和p16(作为HPV感染的替代标志物)的各种染色模式。还确定了与无进展生存率和总生存率的关联。还评价了重要的人口统计和风险因素行为，诸如性别、种族、民族、吸烟和饮酒。该队列具有以下人口统计数据：平均年龄为60.4岁，16.2％为女性，59.5％为西班牙人，21.6％为黑人，64.9％为现时吸烟者，50％为重度饮酒者，57.1％收入低于每年10,000美元。该组的疾病特征如下：35.1％为口腔(OC)癌而其余的为口咽癌(OP)；仅32.4％的受试者处于III期或更早期；患者接受的治疗为化疗(43.2％)、手术与化疗(24.3％)、仅手术(13.5％)、手术与放疗(5.4％)、手术与化疗(2.7％)、仅化疗(2.7％)以及无治疗或数据缺失(5.4％)。几乎57％复发或进展，并且43.2％死亡。
44％的肿瘤为p16+，如通过50％或更多的肿瘤细胞p16染色阳性所定义。IHC模式的比较揭露出，阳性p16染色、不存在CD44细胞膜染色、不存在EGFR细胞膜和细胞质染色模式以及非角质化肿瘤与OP肿瘤比与OC肿瘤明显相关。在分期或按肿瘤部位划分的转归中不存在差异。对于染色的位置，p16阳性与细胞核或细胞核和细胞质p16染色(p<0001)比与仅细胞质染色或无染色明显相关。相似地，不存在普遍CD44细胞膜染色(p<0.0001)与p16阳性相关。在p16阳性肿瘤中不存在普遍EGFR细胞膜和细胞质染色还达到了统计显著性(p＝0.02)。角质化、性别、民族、种族、吸烟和饮酒在本研究中不与p16阳性明显相关。
SolCD44和总蛋白口腔含漱液水平表明基于p16状态无显著性差异，无论是使用以下哪一种p16+定义：1)50％或更多的肿瘤细胞p16+，还是2)与仅细胞质/无染色相对的任何细胞核p16染色。然而，对于solCD44和总蛋白两者，明显更高的水平与复发或进展相关(CD44：10.8对4.3，p＝0.043；蛋白：1.2对0.8，p＝0.030)。基于Kaplan-Meier、对数秩检验和Cox回归分析，无进展生存率的显著性预测因子为CD44(≥10与<10，HR＝3.18，p＝0.011)、蛋白(≥1对<1，HR＝3.24，p＝0.009)、T期(T4与TI-III，HR＝2.99，p<0.049)、种族(黑人与白人，HR＝5.43，p<0.0001)和民族(非西班牙人与西班牙人，HR＝3.00，p<0.014)。性别几乎达到了显著性(女性与男性，HR＝2.39，p<0.072)。相似地，总生存率为的显著性预测因子为CD44≥10(HR＝4.60,p＝0.005)、蛋白≥1(HR＝3.38,p＝0.17)、T4期(HR＝2.97,p＝0.035)、黑人种族(HR＝6.53,p<0.001)和非西班牙人民族(HR＝4.01,p＝0.008)。以下变量表明作为无进展生存率和总生存率的预测因子无显著性：p16状态、CD44染色模式、EGFR染色模式、角质化、吸烟史、饮酒史、位置(口腔与口咽)、淋巴结状态和年龄。此外，CD44和蛋白在包括疾病分期的双变量分析中保持了影响和显著性的幅度。
在该组HNSCC中，仅有5名受试者为从不吸烟者；其中4名为HPV+。在HPV+从不吸烟者中，所有的都活着并且1例复发。因此，在p16状态与预后之间缺乏关联可能是由于该研究中从不吸烟者较少，因为多项研究表明HPV+不吸烟者与HPV+吸烟者相比具有明显更好的预后。
为了进一步研究p16、CD44和EGFR定位之间的显著关联，进行了免疫荧光染色。图6显示了典型的p16-IHC染色，其中染色为细胞质和扩散的。在此情况下，CD44在细胞膜以及在整个肿瘤中普遍染色。CD44和EGFR在细胞膜上共定位，并且也存在一定的EGFR细胞质染色。
然而，当肿瘤为p16+时，如图7中所示，细胞核呈强p16染色，并且也存在一定的细胞质染色。然而，CD44细胞膜染色丧失，仅入侵淋巴细胞保持CD44表达。EGFR表达完全未观察到。
所附权利要求书的方法在范围上不受限于本文所述的具体方法，这些具体方法旨在示出权利要求书的几个方面，并且在功能上等同的方法也在本公开的范围内。除了本文所示和所述的那些外，对方法的各种修改也旨在落在所附权利要求书的范围内。另外，虽然只具体描述了某些代表性的方法以及这些方法的多个方面，但是其他方法以及方法的各种特征的组合也旨在落在所附权利要求书的范围内，即使未具体叙述。因此，可在本文明确提及步骤、要素、组分或成分的组合；然而，也包括步骤、要素、组分和成分的所有其他组合，即使未明确陈述。

Claims (13)

1.一种用于诊断受试者中的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法，包括测定得自所述受试者的唾液样品的总蛋白、solCD44和HPV的存在性，以及在多变量分析中使用总蛋白、HPV和CD44水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而将患有HNSCC、或其将来复发风险升高的受试者与没有HNSCC或其将来复发风险较低的受试者区分开来。
2.一种用于确定经诊断患有(HNSCC)的受试者的预后的方法，包括测定得自所述受试者的唾液样品的总蛋白、solCD44和HPV的存在性，在多变量分析中使用总蛋白、HPV和CD44水平的组合以确定综合分数，分数增加到截止点以上因而与较差的预后相关。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，还包括通过手术、放疗、化疗、光动力疗法、靶向疗法或其任何组合对经诊断患有HNSCC的或经确定具有不良预后的受试者进行治疗。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过检测p16INK4a来检测HPV。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过检测HPV DNA或RNA、HPV蛋白或表观遗传改变来检测HPV。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括对所述受试者评估选自由烟草暴露、酒精暴露、种族、民族、口腔健康、性别、教育水平和年龄组成的组的一个或多个风险因素或人口统计因素，以及在所述多变量分析中使用所述一个或多个风险因素或人口统计因素以确定所述综合分数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述唾液样品为口腔含漱液。
8.一种试剂盒，包括：
特异性结合p16INK4a的至少一种抗体；
特异性结合CD44的至少一种抗体；以及
用于确定样品中的总蛋白浓度的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中特异性结合p16INK4a的所述至少一种抗体包括E6H4抗体克隆的个体基因型。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，还包含CD44参比样品、p16参比样品或其组合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，还包含用于检测特异性结合p16INK4a的所述抗体、特异性结合CD44的所述抗体或其组合的一种或多种比色剂。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒为横向流免疫测定试剂盒。
13.根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括任选包被有特异性结合p16INK4a的所述抗体、特异性结合CD44的所述抗体或其组合的多孔板。
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