KR20080073740A - 폐암 진단 검사 - Google Patents

Abstract

환자 내의 폐암의 존재를 결정하는 진단 검사는 부분적으로 폐암과 관련된 항체의 존재 확인에 달려있다. 검사는 방사선촬영상으로 발견가능한 암 조직의 증거가 있기 전에 폐암을 예측하였다.

진단 검사, 비소 세포 폐암(NSCLC), 생물표지, 자가항체, 방사선촬영 분석

Description

폐암 진단 검사{LUNG CANCER DIAGNOSTIC ASSAY}

폐암은 미국과 수많은 다른 나라들의 남녀 모두에게 발생하는 암 사망의 주요 원인이다. 이 질병으로 사망하는 사망자들의 수는 지난 5 년에 걸쳐 매년 증가하여, 미국에서만 거의 164,000명에 이르는 사망자가 발생하였으며, 그 대부분은 비소세포암들(NSCLC)로 인한 것이다. 이는 유방암, 전립선암 및 결직장암을 합친 사망률을 넘어서는 것이다.

수많은 전문가들은 폐암의 조기 발견은 생존율을 올리는 핵심이다라고 믿는다. 연구에 따르면 이 질병이 조기에 국소 단계에서 발견되고 외과적으로 제거될 수 있다면, 5년간 생존하는 생존율이 85 %에 이를 수 있다는 것을 보인다. 그러나 생존율은 암이 다른 기관들, 특히 멀리 떨어져 있는 부위들로 퍼지게 된 후에는 급속하게 감소되어, 겨우 2 %의 환자들 정도가 5년간 생존한다. 불행하게도, 폐암은 이종 질환(heterogeneous disease)이며 진행 단계(advanced stage)에 이를 때까지 대체로 무증상이다. 따라서, 겨우 15 %의 폐암이 조기 국소 단계에서 발견된다. 그러므로, 가장 빠르고 가장 처리하기 쉬운 단계에서 폐암을 발견하도록 무증상인 사람들을 스크리닝하는 데 도움이 되는 도구들에 대한 절실한 요구가 있다.

흉부 X선과 컴퓨터 단층촬영(computed tomography: CT) 스캐닝은 폐암 조기 발견을 위한 잠재적인 스크리닝 기구로서 연구되어 왔다. 불행하게도, 높은 비용과 높은 오진율로 인하여 이러한 방사선촬영 기구들의 광범위한 사용을 어렵게 하고 있다. 예를 들어, 미국 국립 암 연구소는 흉부 X선에 의한 폐암 스크리닝으로 폐암을 조기 발견할 수 있지만, 수많은 오진의 결과들을 일으켜서, 불필요한 추적 검사를 하게 되었다고 결론 지었다(Oken et al., Journal of the National Cancer Institute, 97(24)1832-1839, 2005). 시험에 들어가는 즉시 기초 X선을 받았던 67,000 명의 환자들 중에서, 거의 6,000명(9 %)이 추적 검사를 필요로 했던 비정상적인 결과들을 보였다. 이들 중에서, 겨우 126 명(비정상적인 X선 결과를 보인 6000 명의 참여자들 중 2 %)만이 최초 흉부 X선 검사를 받은 후 12 개월 이내에 폐암으로 진단되었다.

오진의 유사한 문제는 CT 스캐닝들과 관련한 진행중인 시험들에서 마주치게 된다. CT 스크리닝의 특이성은 미정(indeterminate) 방사선촬영 발견물들의 숫자들에 기반하여 약 65 %로 계산된다.

전문가들은 초래된 건강 보호 비용의 상당 부분은 더 많은 조사를 필요로 하는, 최종적으로는 많은 수가 양성(benign)인 것으로 발견되는 조사를 필요로 하는 유병률 스캐닝에 대해 발견되는 미정 폐 결절(indeterminate pulmonary nodule)들의 숫자로 원인을 돌릴 수 있기 때문에, 수행된 CT 스크리닝 스캐닝들의 숫자당 발견된 암 발생의 숫자를 산정할 경우에 치료된 환자 일인당 건강 비용에 대한 심각한 우려를 표시한다.

PET 스캐닝들은 다른 진단 옵션이지만, PET 스캐닝은 비용이 많이 들고, 일반적으로 스크리닝 프로그램들에 사용하기 적합하지 않다.

최근에는, 연령과 흡연 이력이 규모가 큰 스크리닝 연구들에 의한 선별 기준으로 사용되는 유일한 두 가지 위험 인자들이다.

잠재성 및 전암 상태의 암(방사선촬영 검출 한계 미만)뿐만 아니라 방사선촬영상으로 명백한 암들(>0.5 ㎝)을 발견할 수 있는 혈액 시험은 방사선 스크리닝이 가장 담보되는 개인들을 확인하고 정밀검사를 더 필요로 하는 양성 폐 진단들의 숫자를 사실상 줄여줄 것이다.

그러므로, 상기 방사선촬영 기법들의 한계들을 극복하는 개선된 폐암 스크리닝과 검출 기구들에 대한 절실한 수요가 있다는 것은 명백하다.

본 발명은 체액 표본들을 사용하는 폐암의 조기 발견을 위한 검사, 방법 및 키트들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가항체 생물표지들과 같은 하나의 표지 또는 표지들의 일 패널의 존재를 평가하여 폐암을 발견하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 특히 방사선촬영 이미징과 다른 스크리닝 양식들과 함께 이용되는 경우 포괄적인 폐암 스크리닝 전략에서 이용될 수 있다. 본 발명은 폐암의 존재 가능성을 배제하는 다른 방사선촬영 분석에 대한 모집단을 풍부하게 하는 데 이용될 수 있다.

간단히 말해서, 본 발명은 하나의 실시예에서, 환자로부터 얻은 혈액 표본을 제공하고 폐암과 관련된 자가항체들의 하나의 표지 또는 표지들의 일 패널의 존재 여부를 위하여 환자의 혈액 표본을 분석하여 환자에게서 폐암의 존재 가능성을 발견하는 방법에 관한 것이다. 상기 패널은 예를 들어, 상기 패널의 구성요소들과 관련된 암의 최대 존재가능성을 평가하여 확인될 수 있다. 다양한 통계적 도구들 중 임의의 것을 이용하여 결과에 미치는 다변수들의 동시적 기여도를 평가할 수 있다.

본 발명은 주요한 CT 스크리닝 시험을 하는 도중에 구해진 표본들을 분석하고 잠재성 질병상태뿐만 아니라 조기 및 말기 단계 폐암을 위험-대조된 대조군들(risk-matched controls)과 구별하기 위하여 이용되었다. 당해 검사는 방사선촬영 검출 전 5년 정도의 기간까지 폐암의 존재를 거의 90 % 정확도로 예측하였다. 당해 검사는 수용가능한 시험들과 프로토콜들을 이용하여 예를 들어, 방사선촬영상으로 검출될 수 있는 폐암에는 미치지 않아서 폐암으로 진단되지 않았지만, 무증상 환자들 또는 높은 위기의 군의 환자들에 대한 스크리닝 시험으로 이용될 수 있다.

본 발명은 흉부 X선이나 저 선량(Low Dose) CT와 같은 현재 사용되는 폐암 스크리닝 방법들의 높은 비용과 낮은 특이성에 대한 대안을 제공한다. 당해 검사는 평가를 더 필요로 할 수 있는 양성(benign) 폐 결절들의 검출을 제한하면서 암 발견율을 최대화하고 포괄적인 조기 발견 전략으로 용이하게 포함될 수 있는 강력한 비용 효율적인 도구이다.

본 발명의 모든 특징, 태양 및 장점들은 하기의 설명과 청구항들로 인하여 더 잘 이해될 것이다.

병리적 상태의 조기 진단은 유익하다. 그러나, 모든 병리적 상태들이 용이하게 발견가능한 단순한 특징이 있는 것은 아니다. 다른 병리적 상태들은 병인이나 표현형에서 또는 그 발달 단계 전체에 걸쳐서 이질적이다. 그러한 상황에서, 단일 의 민감하고 특이적인 진단 특징이나 표지는 존재하지 않을 것 같다.

그러나, 단독으로는 충분한 예측력을 가질 수 있는 것은 아니지만, 조합을 하게 되면 일 패널은 실제 사용을 위한 충분한 특이성(specificity)과 민감도(sensitivity)를 가지는 복수개의 표지들을 사용하는 적당한 진단 표지의 개발이 이제는 가능하다. 더구나, 다양한 기법들과 데이터 처리 능력으로 인하여 특정된 모집단들 또는 일반적인 모집단에 대하여 사용 편이와 더 뛰어난 예측력으로 특정화되고 개인화된 진단 검사들의 유연한 개발을 가능하게 하였다.

본 발명은 폐암과 같은 질병을 종래 수단들보다 더 조기에 그리고 더 정확히 발견하는 새로운 검사 및 방법을 제공한다. 간단히 말해서, 혈액 표본과 같이 환자 또는 피검자로부터 표본이 구해지고 항체 생물표지들의 일 패널의 존재 또는 부재 여부에 대하여 분석된다. 폐암에 대하여, 각각의 표지는 어느 정도 폐암과 관련되어 있는 표지들의 하나 이상의 패널이 사용되며, 그 대부분은 일 패널이 사용되는 경우에, 이질적인 모집단에서 폐암을 가지는 가능성의 예측가능한 척도를 배출한다.

하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명에 따른 검사 및 방법은 조기 및 말기 단계 폐암 환자들을 정확히 확인하였다. 조기 단계 폐암 환자들의 확인은 현재 검사들과 스크리닝 양식들이 확고하고 비용효율적인 방식으로 상기와 같은 능력을 지니지 않으므로 특히 가치가 있다고 할 수 있다. 당해 스크리닝 검사는 더 뛰어난 예측성을 제공하고, 종종 비용도 들어가는 기존에 이용되는 검사들보다는 오인율을 더 낮추었다. 당해 검사는 또한 마이크로어래이(microarray)의 사용과 같 이, 수많은 표본들의 동시적인 시험을 가능하게 하는 검사 포맷을 사용한다는 점에서 다목적이며, 임의의 모집단에 대한 대조 표본들이 동시에 작동되어 높은 신뢰도의 감별 데이터(discriminating data)를 얻을 수 있으며, 그러한 복수개의 대조군들은 그 시험 모집단과 가능한 많은 파라미터들과 부합하게 된다. 이로 인하여 종족, 성, 연령, 다형태성(polymorphism) 등과 같이, 일어날 수 있으며 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 모집단 차이들에 대한 교정을 가능하게 한다.

정의

여기에 사용된 하기의 용어들은 다음과 같은 의미들을 가진다.

"폐암"은 폐의 악성 과정, 상태 및 조직을 의미한다.

"단백질"은 아미노산들의 중합체인 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드이며, 그 용어들은 여기에 호환되어 사용된다. 라이브러리의 맥락에서, 폴리펩티드는 생물학적 활성을 지닌 분자를 엔코딩할 필요가 없다. 중요한 항체는 에피토프(epitope) 또는 결정인자(determinant)를 결합한다. 에피토프들은 손상되지 않은 기능 분자의 부분들이며, 단백질의 맥락에서, 약 3 내지 약 5 개의 인접하는 아미노산들만큼을 포함할 수 있다.

"정규화된(Normalized)"은 계량(metric), 통계 또는 측정(measure)이 반응의 진정한 반영, 반응 또는 결과인지 아니면 의미가 없고 무작위적인지의 여부를 결정하기 위하여 관찰된 결과에 미치는 배경과 무작위 기여들에 대하여 교정 또는 조절하는 계량 또는 측정의 통계적 처리에 관한 것이다.

"비소 세포 폐암(NSCLC)"은 일명 귀리 세포암이라고 하는, 소형 타원 세포들 로 특징되는 소형 세포암과 비교하여 모든 폐암들의 약 80 %를 차지하는 폐암의 아형이다. NSCLC 아형에 편평 세포 암종, 선암종 및 대세포 암종이 포함된다.

"체액"은 시험용 환자 표본으로 사용될 수 있는 혈액, 타액, 정액, 눈물, 조직 추출물, 삼출물, 체강 세척액(body cavity wash), 혈청, 혈장, 조직액 등과 같은 신체로부터 구해지거나 유래한 임의의 액체 표본이다. 그러나, 바람직하게는 사용될 수 있는 유체는 시험 전에 이용될 수 있는 예를 들어, 원심분리에 의한 청정화와 같은 처리이다. 체액 표본은 유체 표본이다.

"혈액 표본"은 일반적으로 개인으로부터 얻은 정맥혈의 소 분취량을 의미한다. 혈액은 예를 들어, 가공될 수 있으며, 응고 인자들은 헤파린이나 EDTA와 같은 것으로 비활성화되며, 적혈구들은 제거되어 혈장 표본을 배출하게 된다. 혈액은 응고되게 할 수 있으며, 고체 및 액체상들이 분리되어 혈청을 배출한다. 그러한 모든 "가공된" 혈액 표본들은 여기에 사용된 "혈액 표본"의 정의의 범위 내에 있다.

"에피토프"는 항체에 의하여 결합되는 특정한 분자 구조를 의미한다. 동의어는 "결정인자"이다. 폴리펩티드 에피토프는 3 내지 5 개의 아미노산일 만큼 작을 수 있다.

"생물표지"는 생물학적 실체 내에서의 현 상태 또는 미래의 건강 상태와 같은 결과를 예측하는 데 유용하다고 평가되고 알려진 인자, 지시약, 점수(score), 계량, 수학적 조작 등을 나타낸다. 생물표지는 표지와 동의어이다.

"패널"은 검사에서 함께 측정되는 표지들의 편집된(compiled) 세트를 의미한다. 일 패널은 2 개 표지들, 3 개 표지들, 4 개 표지들, 5 개 표지들, 6 개 표지 들, 7 개 표지들, 8 개 표지들, 9 개 표지들, 10 개 표지들, 11 개 표지들, 12 개 표지들 이상을 포함할 수 있다. 당해 출원에서 가르치고 당해 발명의 실행에 적용될 수 있는 통계적 처리와 검사 방법들은 중요한 검사에서 정보를 제공하는 수많은 표지들 중 임의의 것의 사용을 제공한다.

"결과"는 예측되거나 발견되는 것이다.

"자가항체들"은 감염된 세포들과 종양 세포들과 같은 병든 세포들을 포함하여 "자가유래의(autologous)"(자가) 단백질들에 관한 면역글로불린들 또는 항체들(여기에 상기 용어들은 호환적으로 사용된다)을 의미한다. 이 경우에, 종양에 대항하는 항체들은 자기 자신 세포들의 유전적 변이인 개인 자신의 종양으로부터 유래한다.

"가중 합계(weighted sum)"는 예측 수치로 각각 개별 표지들로부터 유래한 점수들의 편집물을 의미한다. 예측 수치가 큰 표지들은 점수에 더 많이 기여한다. 개별 표지들의 상대적 수치는 로지스틱 회귀와 같은 알려진 통계 패러다임들을 이용하여, 다변수의 발현을 최대화하도록 통계적으로 유도된다. 수많은 상용 통계 패키지들이 이용될 수 있다. 상가 인자들의 회귀식과 같은 공식에서, 각각의 인자(표지)의 "가중치"는 그 인자의 계수인 것으로 드러난다.

"통계적으로 의미있는"은 단독으로 일어나는 것으로 관련될 것 같지않은 차이들을 의미한다.

"표지"는 진단에 평가되고 이용될 수 있는 인자, 지시약, 계량, 점수, 수학적 조작 등이다. 표지는 예를 들어, 폴리펩티드 또는 항원일 수 있거나 항원과 결 합하는 항체일 수 있다. 표지는 또한 항체와 항원, 호르몬과 수용체, 리간드와 리간드가 결합하여 효소 및 조효소, 효소 및 기질 등의 복합체를 형성하는 분자와 같이 서로 간에 특이성을 지닌 실체인 결합 짝 또는 결합 파트너들 중 임의의 것일 수 있다.

"예측 표지(Forecast marker)"는 알려진 기법들을 이용하여 폐암을 발견하기 전에 존재하는 표지이다. 따라서, 당해 검사는 예를 들어, 방사선촬영으로 발견가능한 암이 관찰되기 전에 최대 5년까지 방사선촬영으로 발견가능한 암이 환자에게서 발견되기 전에 폐암-특이적인 자가항체들을 발견한다. 그러한 자가항체들은 예측 표지들이다.

"표적 모집단(Target population)"은 특정한 표지, 상태, 조건, 질병 등으로 유형화되는 모집단의 임의의 서브세트(subset)를 의미한다. 따라서, 표적 모집단은 특정한 형태 또는 단계의 폐암을 지닌 특정한 환자들일 수 있거나, 예를 들어, 흡연자들의 모집단일 수 있다. 표적 모집단은 하나 이상의 위험 인자들을 가진 사람들을 포함할 수 있다. 표적 모집단은 더 심화되고 더 시의적절한 모니터링을 받기에 충분하다고 할 수 있는 폐의 이상 존재와 같은 의심스러운 시험 결과들을 가진 사람들을 포함할 수 있다.

"방사선촬영의(radiographic)"는 CAT, PET, X선 등과 같은 임의의 이미징 방법을 뜻한다.

"방사선촬영으로 발견가능한 암(radiographically detectable cancer)"은 방사선촬영의 수단에 의한 암의 진단 또는 발견을 뜻한다. 암의 존재는 일반적으로 병력에 의하여 확인된다.

"조직 표본"은 특정한 조직으로부터 나온 표본을 뜻한다. 액체 형태인 조직 표본에 대하여, 표본은 체액일 수 있거나 혈액과 같은 액체 조직이나 가공된 혈액 분취량으로부터 유래할 수 있다. 또한 상기 어귀는 예를 들어, 삼출물, 사용된 조직 배양 유체, 잘게 다진 고체 조직 등의 세척액들과 같이 고체 조직으로부터 얻어진 유체를 뜻한다.

생물표지 선별

자가항체들과 같은 폐암 관련 표지들과 거기로 특이적인 친화도를 가지거나 그것에 의하여 결합된 단백질들의 선별 및 확인은 당업자에게 이용가능한 방법들을 이용한 임의의 수단에 의할 수 있다. 항체 생물표지들인 경우에, 다양한 면역학 기반 방법들 중 임의의 것이 실행될 수 있다. 업계에 알려진 바와 같이, 결합 특이성을 가진 앱타머들, 거울상체(spiegelmer)들 등도 항체를 대신하여 사용될 수 있다. 항체-항원 반응에 의존하는 수많은 알려진 높은 처리율(throughput)의 방법들이 당해 발명에 실시될 수 있다.

표적 모집단의 개인들로부터 유래한 분자들은 대조 모집단으로부터 유래한 분자들과 비교되어 예를 들어, 차감 선별 등을 이용하여 폐암-특이적인 임의의 것을 확인할 수 있다. 또한, 표적 모집단과 보통의(대조) 모집단 표본들이 사용되어 분자들의 라이브러리로부터 표적 모집단에 특이적인 분자들을 확인할 수 있다.

친화도 선별의 형태는 후보 분자들의 라이브러리를 스크리닝하는 프로브(probe)로서 항체를 사용하여, 라이브러리들로 실행될 수 있다. 상기 후보자들을 스크리닝하는 항체의 사용은 "바이오패닝(biopanning)"으로 알려져 있다. 이후 그것은 표적 모집단-특이적 분자들과 그 사용을 검정하고, 이후에 표적 모집단의 구성요소들의 예측인자들로서 개별 표지들의 능력을 결정한다.

적당한 수단은 폐암에 특이적이든 그렇지 않든 분자들의 라이브러리들을 얻는 것이며 표적 모집단의 구성요소들에서 항체들을 결합하는 분자들에 대한 그러한 라이브러리들을 스크리닝한다. 단백질이나 폴리펩티드 에피토프들은 3 개의 아미노산들일 만큼 작을 수 있지만, 길이가 10 아미노산들 미만, 길이가 20 아미노산들 미만 등일 수 있기 때문에, 상기 라이브러리의 개별 구성요소들의 평균 크기는 설계 선택(design choice)이다. 따라서, 상기 라이브러리의 더 작은 구성요소들은 약 3 내지 5 개의 아미노산들로서 단일한 결정인자를 모방하는 반면에, 20 개 이상의 아미노산들의 구성요소들은 2 개 이상의 결정인자들을 모방하거나 함유할 수 있다. 라이브러리는 또한 탄수화물들, 지질들, 핵산들 및 그 조합물들과 같은 다른 분자들로서 폴리펩티드들에 한정될 필요가 없으며, 에피토프들일 수 있으므로, 폐암의 표지들로서 사용되거나 폐암의 표지들을 확인하는 데 사용될 수 있다.

생물표지 확인 과정은 손상되지 않은 단백질들이나 다른 분자들이라기 보다는 에피토프들을 확인하려고 하기 때문에, 스캔닝되거나 스크리닝된 라이브러리들은 폐암-특이적일 필요는 없지만, 비록 폐암 환자들로부터 유래한 표본들의 사용이 적당한 폐암 생물표지들을 확인할 가능성을 높일 수 있다고 해도, 정상적인 개인들의 분자들로부터 구해지거나 무작위적 분자들의 모집단들로부터 구해질 수 있다. 그럼에도, 에피토프들이나 상호-반응적인 분자들은 존재하며 상기 에피토프들을 함 유하는 분자들의 기능에 관계없이 폐암을 지닌 환자들 내에서 면역원성이다.

그러한 방법들의 예시들은 T7 폐암-특이적인 cDNA 파지(phasge) 라이브러리들과 M13 무작위 펩티드 라이브러리를 사용하여 예들에서 기술되어 있다. 양쪽 모두가 업계에 알려진 바와 같이, 파지 디스플레이 라이브러리들에서 실행되었다. 사용된 T7 파지 NSCLC cDNA 라이브러리들 중 하나는 상용(Novagen, Madison, WI, USA)이며 나머지 T7 라이브러리는 아데노암종 세포계 NCI-1650(NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA의 H. Oie의 기증품)로부터 구성되었다.

따라서, 파지 라이브러리는 업계에 알려진 바와 같이 구성될 수 있다. 표적 조직 또는 세포들로부터 유래한 총 RNA는 추출되고 선별된다. 제1 가닥 cDNA 합성이 실시되어 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열들 양쪽 모두의 재현을 확보한다. cDNA 생성물은 호환가능한 파지 벡터로 결찰되어(ligated) 라이브러리를 발생시킨다. 라이브러리는 적당한 박테리아 숙주 내에서 증폭되고 T7과 같은 용균 파지에 대하여, 세포들이 용균되어 파지 제제를 얻는다. 용해질들은 표준 조건하에서 역가되고 정제 후에 저장된다. 다른 파지에 대하여, 바이러스는 M13과 같은 배지로 발산되며, 이러한 경우에 바이러스는 상청액으로부터 채집되고 역가된다.

파지 라이브러리는 바람직하게는 폐암 환자들로부터 유래한 혈장이나 혈청과 같은 유체 표본과 같은 조직 표본과 함께, 그리고 정상적인 건강한 기증자들로부터 유래한 혈장이나 혈청과 같은 상동성 조직 표본과 함께 바이오패닝되거나 스크리닝되어 폐암 환자들 내에서 순환하는 항체들과 같은 리간드들에 의하여 인식되는 잠재적 표시된 분자들을 확인하게 된다.

일 실시예에서, 조직 표본은 혈장이나 혈청과 같은 혈액 표본이며, 그 목적은 비-소 세포 폐암 환자들과 같은 표적 모집단의 혈장이나 혈청 내에서 발견되는 항체들에 의하여 인식되는 표지들을 확인하는 데 있다. 라이브러리로부터 비-표적 모집단의 항체들에 의하여 인식되는 파지들을 제거하기 위하여, 파지 디스플레이 라이브러리는 예를 들어, 정상적인 혈청이나 혼주 혈청(pooled sera)에 노출된다. 반응되지 않은 파지들은 비-표적 모집단 표본들과 반응하는 파지들로부터 분리된다. 반응되지 않은 파지들은 이후에 NSCLC 혈청에 노출되어 NSCLC 환자의 혈청들 내에 있는 항체들에 의하여 인식되는 파지들을 분리한다. 반응성 파지는 채집되고 적당한 박테리아 숙주 내에서 증폭되고, 용해질들은 채집, 저장 및 "표본 1" 또는 "바이오팬 1"으로 확인된다. 바이오팬과 증폭 과정들은 일반적으로 정제 과정을 증진시키기 위한 동일한 대조 및 표적 표본들을 이용하여 복수 회 반복될 수 있다.

바이오팬들로부터 유래한 파지들은 NSCLC 환자들로부터 유래한 표본들 내의 항체들에 의하여 특이적으로 인식되는 발현된 분자들을 함유할 것 같은 풍부하게 된 모집단을 나타낸다. 수많은 파지 라이브러리들이 폴리펩티드들을 발현하듯이, 선별된 파지들은 NSCLC 관련된 항체들에 대한 "포획 펩티드(capture peptide)들"을 발현하고 나타내는 것이라고 전해질 수 있다.

NSCLC-특이적 항체들에 의하여 결합되는 분자들을 발현시키는 파지 클론들을 더 선별하기 위하여, 바이오팬들 내에서 선별된 개별 파지 용해질들은 NSCLC 환자들의 혈청들 내에서의 항체들에 의하여 결합되는 복수개의 후보 파지-발현된된 분자들로 마이크로어래이를 생성할 Arrayer(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 사용하 여 예를 들어, 슬라이드들(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 상에 로보트에 의하여 찍힐 수(spotted) 있다.

어떤 파지 디스플레이 분자들이 NSCLC-특이적 포획 분자들일 수 있는지(NSCLC-특이적 항체들을 결합할 수 있는지)를 확인하기 위하여, 스크리닝 슬라이드는 예를 들어, 이상적으로는 바이오팬들 내에서 사용되는 혈청 표본들이 아닌 개별 NSCLC 환자 혈청 표본들로 배양되고 표준 면역검사 방법론을 이용하여 더 스크리닝 된다. 파지들에 결합된 항체들은 예를 들어, 업계에 알려진 적당한 면역 시약들로 이중 염색 라벨링에 의하여 확인될 수 있으며, 파지 벡터 발현 생성물은 제 1 염색되거나 검출가능한 보고자 분자로 라벨링되어 각각의 사이트에서 발현 생성물의 양을 차지하며, 상기 파지 발현된 폴리펩티드에 결합된 항체는 상기 제 1 보고자 분자와는 구별될 수 있는 제 2 염색되거나 검출가능한 보고자 분자로 라벨링된다.

NSCLC 표본들 내의 항체들에 의하여 결합되는 NSCLC와 관련되거나 그에 특이적인 포획 분자들을 확인하는 데이터를 해석하는 간편한 방법은 슬라이드 상의 모든 폴리펩티드들의 평균 신호와 표준 편차를 나타내는, 다변수들의 컴퓨터 보조 회귀 분석에 의한 것이다. 통계적 처리는 개별 파지에서 특이성을 결정하도록 지시되며, 또한 복수개의 단계들에서 표본이 NSCLC를 가진 환자로부터 온 것이거나 NSCLC를 가질 것 같은지의 여부를 결정하는 더 강력한 예측력을 파지의 서브세트가 제공할 수 있는 지의 여부를 결정하도록 지시된다. 복수의 표본들을 모니터링하는 통계적 처리로 검사 내의 변이성(variability)의 레벨을 결정하게 할 수 있다. 모집단 표본추출이 증가함에 따라, 검사 변이성 사이에서 평가하고 신뢰할 만한 모집단 파라미터들을 제공하도록 변이성이 이용될 수 있다.

따라서, 슬라이드, 칩 등 상에서 다른 파지보다 더 큰 정도로 환자 표본들 내에서 항체들을 결합하는 파지들은 예를 들어, 신호가 기준(칩 상의 평균 신호)으로부터 >1, >2, >3 또는 그 이상의 기준으로부터 벗어난 표준 편차들일 경우에 후보들인 것으로 여겨진다. 여기에 기술된 몇몇 실험들에서, 후보들은 바이오패닝된 T7 라이브러리로 4 회 구성된 스크리닝 칩 상에서 파지 디스플레이 폴리펩티드들의 약 1/100을 나타내었다.

후보 파지 클론들은 "진단 칩" 상에서 편집되며 NSCLC 환자들의 표본들과 비-NSCLC 모집단의 표본들을 구별하는 데 독립적인 예측 수치에 대하여 더 평가된다.

진단 표지들은 피검자 내의 방사선촬영으로 발견가능한 폐암의 존재 또는 장래의 존재를 신호/발견/확인하는 능력에 대하여 선별된다. 몇몇 조건들이 다수의 병인들, 다중 세포 기관들 등을 가지듯이, 임의의 질병은 이질적인 배경 상에 제시되며, 표지들의 패널 또는 다수개의 패널들이 특정한 조건을 더 잘 예측하거나 진단할 수 있다. 폐암은 그러한 조건이다.

생물통계 업계에 알려진 바와 같이, 표지들의 패널이나 표지들의 패널을 지닌 반응성과 같은 관련된 다변수들의 집합적인 예측 능력을 확인하도록 실행될 수 있는 수많은 상이한 통계적 계획들이 있다. 따라서, 예를 들어, 동적 통계 모델링을 이용하며, 복수개의 인자들로부터 유래한 데이터를 해석하여 둘 이상의 그러한 인자들의 이용에 의존하는 예측 시험을 개발할 수 있다. 다른 방법들은 진단 검사 내에 포함되기 위하여 적당한 표지들의 패널을 선별하는 조건 확률들, 최소 자승 분석(least square analysis), 부분 최소 자승 분석, 로지스틱 다중 회귀, 중립 네트워크들(neutral networks), 판별 분석, 분포-자유 랭크-기본 분석(distribution-free ranked-based analysis), 그들의 조합, 그들의 변화 등을 이용하는 베이시안 모델링을 포함한다. 그 목적은 다변수들의 취급이며, 이후에 데이터를 처리하여 원하는 계량을 최대화하며, 예를 들어, Pepe & Thompson, Biostatistics 1, 123-140, 2000; Mclntosh & Pepe, Biometrics 58, 657-664, 2002; Baker, Biometrics 56, 1082-1087, 2000; DeLong et al, Biometrics 44, 837-845, 1988; 및 Kendziorski et al., Biometrics 62, 19-27, 2006 참조.

따라서, 몇몇 상황들에서, 통계적 처리는 수신 동작 특성(ROC) 곡선들의 곡선하 면적(AUC)과 같은 예측 계량을 최대화하려고 한다. 처리를 하게 되면 공식 접근법이나 알고리즘을 생성시켜 선별된 변수들의 세트에 의존하는 결과들을 최대화하며, 그러한 변수들 중 임의의 것이나 모든 것의 상대적인 영향을 상기 최대화된 결과에 드러내 보인다. 표지의 상대적인 영향은 변수의 계수로서 관계를 기술하는 유도된 공식에서 조사될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이하에서 기술되어 있는 예시된 연구들에서 확인된 다섯 가지의 표지들의 두 개 패널들은 그러한 분석으로부터 선택되어, 하나의 점수이기도 한 최대 AUC는 상기 다섯 가지 표지들을 포함하는 공식에 의하여 기술되며, 상기 공식 내에서 임의의 표지의 상대적인 가중치로 그러한 임의의 변수의 계수로서 표시되는 최대 예측 능력을 구한다. 상기 계수는 가중치를 가하는 것을 나타내며, 유도된 공식은 가중 합계를 배출하는 가중된 변수들의 합계로 볼 수 있다.

그 목적은 예를 들어, 선택되고 바람직하게는 최소한의 복수개의 변수들(표지들)에 걸쳐서 특이성 및 민감도 또는 양성 예측 수치를 최소화하는 균형을 찾아서 그러한 파라미터들의 견지에서 강건한 진단 검사를 가능하게 할 수 있는 데 있다. 상기 최대화된 결과에 변수의 가중이나 영향은 지금까지 확인되고 분석된 데이터로부터 유래하며, 분석된 환자들의 숫자가 증가함에 따라 재계산된다. 환자들의 숫자가 증가함에 따라, 계량이 평균 정도의 수치들의 신뢰성 제한 범위로 모집단 평균 수치를 나타내는 신뢰도도 그렇게 증가할 수 있다.

이하의 예들에서 보는 바와 같이, 예시된 5 개의 표지 패널들은 CT 스캐닝의 관찰된 특이성을 뛰어넘는 개별 특이성을 가진 표지들을 포함한다. 따라서, 65 %를 초과하는 특이성을 가진 표지들 중 임의의 것은 당해 검사가 폐암 진단에서 현재 표준으로 효과가 있듯이, 진단 검사로서 장점이 되게 사용될 수 있으며, 더 낮은 비용으로 그리고 좀 더 비침습성 방법으로 전달될 수 있다.

또한, 5 개 표지들은 함께 하나의 임의의 표지보다는 그 계량이 무엇이든 간에, 더 높은 예측력을 제공한다는 것에 유의한다. 상기 표지들은 상이한 부모집단(subpopulation)들에서 예측될 수 있거나, 2 개 이상의 표지들의 발현은 예를 들어, 조화될 수 있으며, 이들이 공통의 생물학적 존재 또는 기능을 공유할 수 있다. 집합적인(aggregate) 예측 수치는 언제나 부가적인 것은 아니며 표지들의 상이한 조합들은 상이한 예측 정확도들을 제공할 수 있다. 사용된 통계적 처리는 예측력을 최대화하였으며 상기 5 개 표지 조합은 조사된 기준 모집단들에 근거한 결과였다. 따라서, 환자 표본은 상기 5 개 표지들로 시험되고, 진단은 원칙적으로 2 개 이상의 표지들의 조정된 존재와 하기에 나와있는 5 개 표지 패널들 중 하나와 같은 복수개의 표지들에 근거한 진단 계량으로 인하여 상기 5 개 표지들에 근거하여 계산된다. 여기에 토론된 바와 같이, 로지스틱 회귀와 같은 통계적 처리로 인하여, 다변수 계량에 기여하는 변수들 중 임의의 것은 최대화된 총계에 다소간 기여할 수 있다. 만약 환자가, 심지어 환자가 심하게 가중된 표지들의 어느 정도 이상이 양성이기 때문에, 하나 이상의 표지들에 대하여 환자가 음성일 수 있는 상황에서조차도, 상기 5 가지 표지의 집합적인 계량의 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 % 이상인 점수, 합계 등을 가진다면, 그 환자는 폐암에 대하여 쉽게 더 양성일 것 같은 것으로 여겨진다. 기준 또는 표준 수치일 수 있으며, 모집단 평균 수치일 수는 한계 점수, 합계 등과 폐암이 존재할 가능성을 보여주는 것인 환자의 수용가능한 레벨/양성 시험 결과를 배출할 것 같은 그런 점수, 합계 등과 환자의 실험 표본 유사성은 설계 선택이며 가양성의 위험을 무릅쓰고 양성 표본을 발견하는 신뢰성 한계 또는 레벨을 제공하거나 실험적으로 개발될 수 있는 통계적 분석에 의하여 결정될 수 있다. 상기에서 가르치는 바와 같이, 그러한 레벨은 5 개 표지들의 집합적인 계량 또는 모집단 합계, 기준 수치 등의 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 % 이상 일수 있다. 한계치 또는 "허용 한계", 즉, 모집단 점수, 합계 등으로부터 유래한 환자의 점수, 합계 등의 수용가능한 유사성의 정도는 증가될 수 있으며, 즉, 환자 점수는 민감도를 증가시키도록 모집단 점수에 아주 근접해야 한다.

비록 ROC 곡선의 모양이 업계에서 알려진 바와 같이, 예측 수치 등의 적절한 고려사항이라는 것이 알려져 있어도, 표지 또는 패널의 예측력은 특이성과 민감도 사이의 관계인 예를 들어, ROC 곡선들의 특이성, 민감도, 양성 예측 수치, 음성 예측 수치, 진단 정확도, AUC와 같은 다양한 통계들 중 임의의 것을 이용하여 측정될 수 있다.

다중 표지들의 사용은 임의의 표지 단독으로 사용되는 것과 비교하여 함께 고려되는 복수개의 표지들의 더 큰 집합적인 예측력으로 인하여 더 큰 모집단에서의 더 강력하고 진단 시험이 더 잘되게 한다.

하기에서 더 상세히 토론되는 바와 같이, 당해 발명은 상이한 진단 포맷들의 사용을 고찰한다. 마이크로어레이들은 다중 표본들의 동시 시험을 가능하게 한다. 따라서, 양성이든 음성이든 수많은 대조 표본들이 상기 마이크로어레이에 포함될 수 있다. 이후 상기 검사는 시험되고 비교되는 하나 이상의 표본들, 실험들, 환자 표본, 시험되는 표본 등과 함께, 하나 이상의 알려진 감염된 환자 표본들로부터 유래한 표본과 같은 복수개의 표본들 및 정상으로부터 유래한 하나 이상의 표본들을 동시 처리하여 작동될 수 있다. 내부 대조들을 검사에 포함시키면 검사 내에서의 표준화, 교정(calibration) 및 표준화를 가능하게 한다. 예를 들어, 양성 대조, 음성 대조 및 실험들의 각각은 복수로 작동될 수 있으며, 상기 복수 표본들은 계열 희석일 수 있다. 대조 및 실험 사이트들도 상기 마이크로어레이 장치상에 무작위로 배열되어 상기 시험 장치상의 표본 사이트 위치로 인한 변화를 최소화시킬 수 있다.

따라서, 내부 대조들과의 그러한 마이크로어레이 또는 칩은 상기 마이크로어레이 또는 칩상에 동시에 시험되는 실험들(환자들)의 진단을 가능하게 한다. 대조 방식으로 시험과 데이터 취득의 그러한 멀티플렉스 방법은 적당한 대조들이 차지될 수 있기 때문에 검사 장치 내에서 환자들의 진단을 가능하게 하며, 만약 표지들의 패널이 예를 들어, ROC 곡선에 대한 >.85의 AUC 및 5 개 표지들을 가로지르는 >.95의 전체 AUC와 같은 합리적으로 높은 예측력을 개별적으로 가지고 있는 표지들이라면, 보호 진단 결과의 포인트는 그때 구해질 수 있다.

검사는 패널의 표지들 각각이 하기의 예들의 특징들과 같이 상대적으로 필적할만한 특징들을 가진 것으로 발견되는 경우에 정량적인 방식으로 작동될 수 있다. 따라서, 폐암 환자 표본은 5 개 표지들 모두에 대하여 양성일 것이며, 그러한 표본은 폐암 양성일 가능성이 있다. 그와 같은 것은 여기에 토론된 전체로서 상기 5 개 표지들에 근거한 가능성(odds)을 측정하고, 환자에 대한 상기 5 개 표지들의 계량의 합계 또는 점수를 구하고 이후에 상기에서 토론된 통계 도구를 이용하여 유도된 표지들의 예측력과 그 숫자를 비교하여 입증될 것이다. 상기 표지들 중 4 개에 대하여 양성인 환자는 상기 4 개의 표지들의 능력이 실질적인 상태를 유지할 것 같기 때문에, 위험한 상태인 것으로 여겨지며, 폐암으로 진단될 수 있으며/있거나 더 상세히 검사되어야 한다. 단지 3 개 표지들에 대하여 양성인 환자는 재시험, 다른 표지들을 사용하는 시험, 방사선촬영 또는 다른 시험에 대한 요구를 촉발할 수 있거나 주어진 다른 시간 간격 내에서 당해 검사와 함께 다른 시험을 할 것이 요구될 수 있다.

따라서, n 개의 표지들의 패널에 대하여, 상기 5 개 표지들에 그 결과와의 관계를 정의하는 최대 개연성 그래프(maximal likelihood graph)를 정의하는 회귀식과 같은 유도된 예측력 공식이 있다. 환자는 n 개 미만의 표지들에 대하여 양성일 수 있으며, 이러한 경우에 환자는 양성인 것으로 고려될 수 있거나, 가령 50 % 이상의 표지들의 대부분이 그러한 환자 내에 존재한다면 다른 고려사항에 대하여 양성일 수 있을 것 같다. 또한, NSCLC와 같은 특정 질병에 대하여 몇몇 패널들이 특이적일 수 있는 바와 같이, 폐 이상의 잠재적인 증세가 있음을 나타내는 명백한 징후들이 있는 환자가 있다면, 그 환자는 다른 폐 이상들을 배제하도록 더 분석될 필요가 있을 듯하다.

따라서, n 개의 표지들을 사용하는 임의의 검사에서, 예비적인 정성적 결과는 시험되는 표적들의 총 숫자의 양성 신호들의 총 수에 근거하여 얻어질 수 있다. 적절한 한계치는 50 % 이상의 표지들에 대하여 양성일 수 있다. 따라서, 4 개의 표지들이 시험된다면, 상기 표지들의 2, 3 또는 4 개에 대하여 양성인 표본은 아마도 폐암을 지닌 것으로 추정될 수 있다. 5 개 표지들이 시험된다면, 3, 4 또는 5 개 표지들에 대하여 양성인 표본은 양성으로 추정될 수 있다. 한계치는 설계 선택으로 변화될 수 있다.

모집단의 관점으로부터 데이터의 취득과 통계적 처리에 근거하여, 표지들의 최적화된 패널은 동적일 수 있으며 시간에 걸쳐서 변화할 수 있으며, 새로운 표지들의 개발과 함께 변화할 수 있으며, 상기 모집단이 변화함에 따라 변화할 수 있으며, 증가하기도 한다.

또한, 시험된 모집단이 크기가 증가함에 따라, 표지 서브세트의 신뢰도, 가중 계수들 및 정확한 진단의 가능성은 표지들이 생물학적이거나 기계적으로 관련되어 있다면 더 확실해 질 수 있으며, 따라서 편차들, 신뢰도 한계들 또는 오차 한계들이 증가할 것이다. 그러므로, 본 발명은 일반적인 모집단 내에 사용가능한 표지들의 서브세트의 사용을 고려하기도 한다. 또한, 중요한 검사 장치는 하기에 나와있는 예들에서 사용되었던 5 개 표지들의 패널과 같은 특정한 모집단에 대하여 최적화된 표지들의 서브세트만 포함할 수 있다.

폴리펩티드들을 엔코딩하는 파지 클론 인서트들은 발현된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하도록 분석될 수 있다. 예를 들어, 파지 인서트들은 상용 파지 벡터 프라이머들을 사용하여 PCR-증폭될 수 있다. 독특한 클론들이 크기와 상기 PCR 생성물들의 효소 소화 패턴에서의 차이점들에 근거하여 확인된다. 엔코딩된 폴리펩티드들은 BLAST 서치 프로그램을 이용하여 유전자 은행(GenBank) 데이터베이스와 같은 알려진 서열들과의 비교에 의하여 확인된다.

따라서, 예를 들어, 하기 표 1과 2는 폐암 환자들에서 자가항체를 결합하는 폐암 cDNA의 T7 파지 클론들을 요약한 것이다.

파지 클론 #	ID - 유전자 심볼	펩티드 서열
PC84	ZNF440	TLERNHVNVNSVVNPLVILLPIEYIKELTLEKSLMNIRNVGKHFIVPDPIVDMKGFTWEKRLINVRNVEKHSRVPVMFVYMKGPTLGKISMNVSSVGKHYPLLQVFKHT(서열번호: 1)
PC87	STK2	GKVDVTSTQKEAENQRRVVTGSVSSSRSSEMSSSKDRPLSARERRRQACGRTRVTS(서열번호: 2)
PC125	SOCS5	SRRNQNCATEIPQIVEISIEKDNDSCVTPGTRLARRDSYSRHAPWGGKKKHSCSTKTQSSLDADKKF(서열번호: 3)
PC123	RPL4	RNTILRQARNHKLRVDKAAAAAAALQAKSDEKAAVAGKKPVVGKKGKACGRTRVTS(서열번호: 4)
PC88 PC114 PC126**	RPL15	YWVGEDSTYKFFEVILIDPFHKAIRRNPDTQWITKPVHKHREMRGLTSAGRKSRGLGKGHKFHHTIGGSRRAAWRRRNTLQLHRYR(서열번호: 5)
PC40	NPM1	KLLSISGKRSAPGGGSKVPQKKVKLAADEDDDDDDEEDDDEDDDDDDFDDEEAEEKAPVKKSIRDTPAKN(서열번호: 6)
PC20 PC22 G1802	p130	NKPAVTTKSPAVKPAAAPKQPVGGGQKLLTRKADSSSSEEESSSSEEEKTKKMVATTKPKATAKAALSLPAKQAPQGSRDSSSDSDSSSSEEEEEKTSKSAVKKKPQKVAGGAAPXKPASAKKGKAESSNSSSSDDSSEEE(서열번호: 7)
PC57	NFI-B	ASFPQHHHPGIPGVAHSVISTRTPPPPSPLPFPTQAILPPAPSSYFSHPTIRYPPHLNPQDTLKNYVPSYDPSSPQTSQSWYLG(서열번호: 8)
PC94	HMG14	PKRRSARLSAKPPAKVEAKPKKAAAKDKSSDKKVQTKGKRGAKGKQAEVANQETKEDLPAENGETKTEESPASDEAGEKEAKSD(서열번호: 9)
PC16	COX4	AMFFIGFTALVIMWQKHYVYGPLPQSFDKEWVAKQTKRMLDMKVNPIQGLASKWDYEKNEWKK(서열번호: 10)
PC112	SFRS11	ATKKKSKDKEKDRERKSESDKDVKVTRDYDEEEQGYDSEKEKKEEKKPIETGSPKTKECSVEKGTGDS(서열번호: 11)
PC91	AKAP12	ESFKRLVTPRKKSKSKLEEKSEDSIAGSGVEHSTPDTEPGKEESWVSIKKFIPGRRKKRPDGKQEQAPVEDAGPTGANEDDSDVPAVVPLSEYDAVEREKLAAALE(서열번호: 12)
L1864 L1873 L1862 L1804	GAGE7	5'3'Frame1 MLGDPNSSRPSSSVMKWNQQHLKKGNQQLNVRILQLLRRERMREHLQVKGRSLKLIVRNRVTHRLGVSVKMVLMGRRWTRQIQRR(서열번호: 13) 5'3'Frame3 ARGSEFKSPEQFSDEVEPATPEEGEPATQRQDPAAAQEGEDEGASAGQGPKPEAHSQEQGHPQTGCECEDGPDGQEMDPPNPEEVKTPEEGEKQSQC(서열번호: 14)
G922	Plakophillin	Frame3 ARGSEFKHGTVELQGSQTALYRTGSVGIGNLQRTSSQRSTLTYQRNNYALNTTATYAEPYRPIQYRVQECNYNRLQHAVPADDGTTRSPSIDSIQDHARQTPWGPSEACGRTRVTS(서열번호: 15)
L1747	EEFIA	5'3'Frame3 LAFVPISGWNGDNMLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEA(서열번호: 16)
L1761	PMS2L15	5'3'Frame1 MLGDPNSSISLKFQAMDVG(서열번호: 17) 5'3'Frame3 ARGSEFKHLIEVSGNGCGVEEENFEGLISFSSETSHI(서열번호: 18)
G2004 G313 G1896 G1750 L1857 L1839 G1792 G1923	Paxillin(PXN)	LGDRTLGPKVHTLHSLVKTRRPGNKKGSPNTAVYKTVLVSYEVKEGESQSCSQFTCLC(서열번호: 19)
PC6 PC8	RAB7	5'3'Frame3 ARGSEFKLLLKVIILGDSGVGKTSLMNQYVNKKFSNQYKATIGADFLTKEXMVDDRLVTMQIWDTAGQERFQSLGVAFYRGADCCVLVFDVTAPNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPLVCFRGQSCFPTQQACGRTRVTS(서열번호: 20)
L1318 L1847 L968	UROD	CSGTXTISDIAGQPGPLMPCMHLRPFXGQLVKQMLDDFXXHRYIANLGHGLYPDMDPEHVGAFVDAVHKHSRLLRQN(서열번호: 21)
L1864 L1873 L1862 L1804	GAGE7	5'3'Frame1 MLGDPNSSRPSSSVMKWNQQHLKKGNQQLNVRILQLLRRERMREHLQVKGRSLKLIVRNRVTHRLGVSVKMVLMGRRWTRQIQRR(서열번호: 22) 5'3'Frame3 ARGSEFKSPEQFSDEVEPATPEEGEPATQRQDPAAAQEGEDEGASAGQGPKPEAHSQEQGHPQTGCECEDGPDGQEMDPPNPEEVKTPEEGEKQSQC(서열번호: 23)

*이 표와 다음에 오는 표들의 파지 클론명의 알파벳 부분은 실험실 지정(laboratory designation)으로 고정되어있다. 여기에 사용된 파지 클론명의 숫자 부분은 클론의 불분명하지 않은 상대지정(unambiguous identification)이다.

**중복 클론들(Redundant clones).

표 2는 알려진 폴리펩티드를 엔코딩하는 것으로 보이지 않는 NSCLC와 관련된 것으로 확인된 다른 클론들을 제공한다.

파지 클론 #	ID - 유전자 심볼	뉴클레오티드 서열
L1896	BAC 클론 RP11-499F19	TCCGGGGACGAATTCCTGGTAGCCTCATTCAGCCGATGGAAGGTAGAAGGGACTCAGAACTTCAGGCCTNATTCTGCGTTTTTGTATGCCCCAAGAATGAAAGGGCTCTTTGTGAATTTGCATGTAGATTTATTTAACATTCAACCGGCAGAAAACGGAAGGTAGTGCATGACACTGGGGGGAACCAGGCCCCCGCCCACCTCACTCTTTGTGAATTTGCATGTAGATTTATTTAAACATTCAACCGGCAGAAAACGGAAGGTAGTGCATGACACTGGGGGGAACCAGGCCCCCGCCCACCTCACATCGTCATGGCATTAGCTGTTTACTGGCTCCCGTGGAAACATTGGAAGGGGATTTGTTTTGTGGTTGGGTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTAACCAG(서열번호: 24)
L1919	SEC15L2	GATTCTTCCTACCTTTGTCAGCTACTGAGTTGCTTCTGGGGAGGGAAGTACTTCCTTGCCCCTCCCCAACCCCCCTACCTCACCATATCCTATCATATCTTGATAGTCATGGGGAAGAGGATGTGCACACAGACATACAAATTTCCTCAAAGCTGGAGAGACCAGGCTACATGTGAGCTCATAGATGCTGCTGAGGCTCATCCTGTCATGGGGAAGAGGATGTGCACACAGACAATACAAATTTCCTCAAAGCTGGAGAGACCAGGCTACATGTGAGCTCATAGATGCTGCTGAGGCTCATCCTGAGGGCTGGATGGTTGGCCAGGGTTTCAGAATGAGGGTAAGGGATGAGCACTGCCACCCAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAATGGTTGGCCAGGGTTTCAGAATGAGGGTAAGGGATGAGCACTGCCACCCAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTAANTAGTGACTCGAGTGCGGCCGCA(서열번호: 25)
L1761	PMS2L15	ATGCTCGGGGATCCGAATTCAAGCATCTCATTGAAGTTTCAGGCAATGGATGTGGGGTAGAAGAAGAAAACTTCGAAGGCTTAATCTCTTTCAGCTCTGAAACATCACACATCTAAGATTCGAGAGTTTGCCGACCTAACTCGGGTTGAAACTTTTGGCTTTCAGGGGAAACTTTTGGCTTTCAGGGGAAAGCTCTGAGCTCACTTTGTGCACTGAGTGATGTCACCATTTCTACCTGCCACGTATCGGCGAAGGTTGGGACTCGACTGGTGTTTGATCACGATGGGAAAATCATCCAGAAAACCCCCTACCCCCACCCCAGAGGGACCACAGTCTGCCACGTATCGGCGAAGGTTGGGACTCGAACTGGTGTTTGATCACGATGGGAAAATCATCCAGAAAACCCCCTACCCCCACCCCAGAGGGACCACAGTCAGCGTGAAGCAGTTATTTTCTACGCTACCTGTGCGCCATAAGGAATTTCAAAGGAATATTAAGAAGTACAGAACCTGCTAAGGCCATCAAACCTATTGATCGGAAGTCAGTCCATCANATTTGCTCTGGGCCGGCCATAAGGAATTTCAAAGGAATATTAAGATAGTACAGAACCTGCTAAGGCCATCAAACCTATTGATCGGAAGTCAGTCCATCANATTTGCTCTGGGCCGGTGGTACTGAGTCTAAGCACTGCGGTGAAGAAGATAGTAGGAAACAGTCTGGATGCTGGTGCCACTAATATTGATCTAAAGCTTG(서열번호: 26)
L1747	EEFIA	GGGACGATTAGCTAGCATTTGTGCCAATTTCTGGTTGGAATGGTGACAACATGCTGGAGCCAAGTGCTAACATGCCTTGGTTCAAGGGATGGAAAGTCACCCGTAAGGATGGCAATGCCAGTGGAACCACGCTGCTTGAGGCTCTGGACTGCATCCTACCACCAACTCGTCCAACTGACAAGCCCTTGCGCCTGCCTCTCCAGGATGTCTACAAAATTGGTGGTATTGGTACTGTTCCTGTTGGCCGAGTGGAGACTGGTGTTCTCAAACCCGGTATGGTGGTCACCTTTGCTCCAGTCAACGTTACAACGGAAGTAAAATCTGTCGAAATGCACCATGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGGAGGGGTTAACNAGTTGCTCGAGTGGGGCGGCNGGCTNCTTGGTGGTTTATTTCAGA(서열번호: 27)
G1954	MALAT1	CTCGGGGATCCGAATTTCAAGCGGCAAGAAGTTTCAGAATAAGAAAATGAAAAACAAGCTAAGACAAGTATTGGAGAAGTATAGAAGATAGAAAAATATAAAGCCAAAAATTGGATAAAATAGCACTGAAAAAAGAGGAAATTATTGGTAACCAATTTATTTTAAAAGCCCATCAATTTAATTTCTGGTGGTGCAGAAGTTAGAAGGTAAAGCTTGAGAAGATGAGGGTGTTTACGTAGACCAGAACCAATTTAGAAGAATACTTGAAGCTAGAAGGGGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTAACTCGAGTTACTCGTGGGCGCAGCTCTTTGCTTAGTATTTTTAATGGTTGGTTGTAACCTTTCGTTTCTCATCGCCGAATTATGATGGTTTTAAATAATGATCATAATTCTTTCTTTTTACTTGGTTTTTTTTTTTCACTTTTACTTTCTGTTTATGAAGCACGCCCGCCCCACAA(서열번호: 28)
G1689	XRCC5	ATGCTCGGGGATCCGAATTCAGCTTGGGAACGCGGCCATTTCAAAGGGGAAGCCAAAATCTCAAGAAATTCCCAGCAGGTTACCTGGAGGCGGATCATCTAATTCTCTGTGGAATGAATACACACATATATATTACAAGGGATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGACTTGAGGGGTAAGCTAGTTACTCGAGGGCGAGCTTATGGGAAATATATATTGCGGTATTTAAGGAATTAGTTACCCGCTCGCTGGCCTTTGAACTGTTGTTTGAGGCCTTAAATTGATGATCGTGGTGGGAAACAAGAGGTGGGGTGGGAGATTTGTTTTTTGTTCTGAAGCGGGGAGGGGACTAGACCCTAAAAGCATTTAAATATAAGACAACCCAAT(서열번호: 29)
G740	CD44 전사 변이체 5	GGGACGATCAGCATTGAATGAATGTTGGCTACAAAATCAATTCTTGGTGTTGTATCAGAGGAGTAGGAGAGAGGAAACATTTGACTTATCTGGAAAAGCAAAATGTACTTAAGAATAAGAATAACATGGTCCATTCACCTTTATGTTATAGATATGTCTTTGTGTAAATCATTTGTTTTGAGTTTTCAAAGAATAGCCCATTGTTCATTCTTGTGCTGTACAATGACCACTGNTTATTGTTACTTTGACTTTTCAGAGCACACCCTTCCTCTGGTTTTTGTATATTTATTGATGGATCAATAATAATGAGGAAAGCATGATATGTATATTGCTGAGTTGTTAGCCTTTTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTA(서열번호: 30)
L1829 L1841 L1676 L1916	BMI-1	GGTACGAATTAGCCAGANATCGGGGCGAGTACAATGGGGATGTGGGCGCGGGAGCCCCGCTCCCCTTTTTTAGCAGCACCTCCCAGCCCCGCAGAATAAAACCGATCGCNNCCCCTCCGCGCGCGCCCTCCCCCGAGATGCGGAGCGGGAGGAGGCGGCGGCGGCCGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCCCCGGAGGAGGAGGCGTTGGAGGTCGAGGCGGAGGCGGAGGAGGAGGAGGCCGAGGCGCCGGANGAGGCCNAGGCGCCGGAGCAGGAGGAGGCCGGCCGGAGGCGGCATGAGACGAGCGTGGCGGCCGCGGCTGCTCGGGGCCGCGCTGGTTGCCCATTGACAGCGGCGTCTGCAGCTCGCTTCAAGATGGCCGCTTGGCTCGCATTCATTTTCTGCTGAACGACTTTTAACTTTCNTTGTCTTTTCCGCCCGCTTCNATCGCCTCNCGCCGGCTGCTCTTTCCGGGATTTTTTATCAAGCAGAAATGCATCG(서열번호: 31)

무작위 펩티드 라이브러리들도 정상인이 아닌 NSCLC 환자들의 순환하는 항체들을 결합시키는 후보 폴리펩티드들을 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 바이러스 마이너 외피 단백질로 융합되는 10⁹ 무작위 펩티드들을 포함하는 파지 디스플레이 펩티드는 마이크로어레이들과 같이 상기 기술된 것과 유사하고 업계에 알려져 있는 기법들을 이용하여 폐암 환자 항체를 결합시키는 포획 단백질들에 대하여 스크리닝될 수 있다. 이용된 하나의 M13 라이브러리(New England Biolabs)는 파지 표면상에 루프 구조로서 7 아미노산 폴리펩티드 인서트를 발현한다.

여기에 기술된 바와 같이, 상기 라이브러리는 NSCLC 환자 혈청 내에서 순환하는 항체들에 의하여 특이적으로 인식되는 파지-발현된된 단백질들을 풍부하게 하도록 바이오패닝된다. 선별된 클론들의 파지 용해질들은 슬라이드들(Schleicher and Schuell, Keene, NH)상에 두 벌씩 로보트(Affymetrix, Santa Clara, CA)에 의하여 찍히게 된다. 어레이된 파지는 NSCLC 환자로부터 유래한 혈청 표본으로 배양되어 순환하는 폐 종양-관련 항체들에 의하여 결합된 파지-발현된된 단백질들을 확인하게 된다.

알려진 면역검사를 이용하며, 적당한 보고자 분자들에 의하여 상기 슬라이드 상의 모든 폴리펩티드들의 평균 신호와 표준 편차를 나타내는 컴퓨터 발생 회귀선들이 이용되어 NSCLC 환자 혈장 내의 항체에 의하여 결합된 펩티드들을 확인한다. NSCLC 혈장 표본으로부터 유래한 항체의 파지 결합 상당량들(예를 들어, 기준으로부터 >3 표준 편차들)은 다른 평가를 위한 후보들로 여겨진다.

하기 표 13은 M13 클론들에 관한 것이다.

파지 ID	뉴클레오티드 서열	아미노산 서열(3 글자)
MC0457	ATTGTGAATAAGCATAAGGTT(서열번호: 32)	Ile Val Asn Lys His Lys Val
MC0908	GAGCGGTCTCTGAGTCCGATT(서열번호: 33)	Glu Arg Ser Leu Ser Pro Ile
MC0919	TTGAGTCAGAATCCGCATAAG(서열번호: 34)	Leu Ser Gln Asn Pro His Lys
MC1484	AATGCGAGTCATAAGTGTTCT(서열번호: 35)	Asn Ala Ser His Lys Cys Ser
MC1509	AATGCGCTGGCTAATCCTTCG(서열번호: 36)	Asn Ala Leu Ala Asn Pro Ser
MC1521	GCGAAGCCGCCGAAGCTGTCT(서열번호: 37)	Ala Lys Pro Pro Lys Leu Ser
MC1524	AGGGCTCTGGATCCGGATTCG(서열번호: 38)	Arg Ala Leu Asp Pro Asp Ser
MC1760	ATACTACTGGGTCGCCTCTGT(서열번호: 39)	Ile Leu Leu Gly Arg Leu Cys
MC1786	AAGGTTAATACTCATCATACT(서열번호: 40)	Lys Val Asn Thr His His Thr
MC2541	CTGTTTCTGACGGCGCAGGCG(서열번호: 41)	Leu Phe Leu Thr Ala Gln Ala
MC2720	TTTAATTGGTATAATTCGTCG(서열번호: 42)	Phe Asn Trp Tyr Asn Ser Ser
MC2729	CTTCCGCATCAGCTGCGGTGG(서열번호: 43)	Leu Pro His Gln Leu Ala Trp
MC2853	CTTGCGTGGTATGCGAAGAGT(서열번호: 44)	Leu Ala Trp Tyr Ala Lys Ser
MC2900	AAGATTGGGACGGCGTGGCTT(서열번호: 45)	Lys Ile Gly Thr Ala Trp Leu
MC2986	ACGCCTACTCATGGTGGGAAG(서열번호: 46)	Thr Pro Thr His Gly Gly Lys
MC2996	ACTCCTACTTATGCGGGGTAT(서열번호: 47)	Thr Pro Thr Tyr Ala Gly Tyr
MC2998	ATGCCGGCTACTACGCCTCAG(서열번호: 48)	Met Pro Ala Thr Thr Pro Gln
MC3000	AAGGCGTGGTTTGGGCAGATT(서열번호: 49)	Lys Ala Trp Phe Gly Gln Ile
MC3018	AAGAATTGGTTTGGTCATACG(서열번호: 50)	Lys Asn Trp Phe Gly His Thr
MC3023	CATACTCATCATGATAAGCAT(서열번호: 51)	His Thr His His Asp Lys His
MC3046	ATTACGAATAAGTGGGGGTAT(서열번호: 52)	Ile Thr Asn Lys Trp Gly Tyr
MC3050	CTGAATACGCATTCGTCTCAG(서열번호: 53)	Leu Asn Thr His Ser Ser Gln
MC3143	GGGCCTGCGTGGGAGGATCCG(서열번호: 54)	Gly Pro Ala Trp Glu Asp Pro
MC3146	AGTCAGTCTTATCATAAGCGTACTAGC(서열번호: 55)	Ser Gln Ser Tyr His Lys Arg Thr Ser

아직 서열화되지 않은 다른 폐암-특이적 클론들은 하기 표 4에 제공된다. 하기 표 4는 M13클론들을 나타낸 것이다.

파지 ID
MC1011	MC1805	MC2987
MC2106	MC2238	MC3019
MC2628	MC2645	MC3045
MC2829	MC3047	MC3048
MC3052	MC3156	MC3135
MC3096	MC3090

라이브러리들의 높은 처리율(throughput) 스크리닝의 목적은 모든 암-특이적 단백질들을 확인하는 것이 아니고, 오히려 피검자의 폐암 코호트(cohort)로의 포함을 예측하는데 사용될 수 있거나 최대의 특이성과 민감도가 아닌 패널로서 예측 표지들의 코호트를 확인하는 것이다. 그래서, 그 접근법은 광범위한 프로테오믹 프로파일을 발생하도록 표적하는 것이나 폐암 단백질들과 같은 질병 단백질들 자체를 확인하는 것이 아니라, 질병을 예측하고 패널로서 집합되는 경우에, 이질적인 모집단에서의 이질적인 질병에 대한 강력한 예측 검사를 가능하게 하는 수많은 표지들을 확인하는 것이다. 하나의 임의의 표지는 폐 종양형성에서 또는 펩티드로서 직접적인 역할을 가지거나 가지지 않을 수 있으며, 상기 펩티드가 유래하는 분자의 실질적인 역할은 현재로서는 알려지지 않을 수 있다.

개별 포획 단백질들과 결합하는 항체 측정

진단 칩 상에 편집된 포획 단백질들은 혈액 표본 내에서 항체들의 폐암-특이적인 항체들의 상대적인 양을 측정하는데 사용될 수 있다. 이것은 다양한 플랫폼들, 폴리펩티드의 상이한 제형들(예컨대, 발현된 파지, 유도된 cDNA, 펩티드 라이브러리 또는 정제된 단백질) 및 표본들 사이에서의 비교를 허용하게 하는 상이한 통계적 순열들을 이용하여 실행될 수 있다. 비교는 외부 교정(external calibration) 또는 내부 정규화 중 어느 하나에 의하여 측정들이 표준화되는 것을 필요로 할 것이다. 따라서, 다중 파지-발현된된 포획 단백질들(예를 들어, M13 및 T7 파지)와 스크리닝 수단으로서의 면역검사를 이용하는 다중 음성 외부 대조 단백질들(환자 혈장들 내에서의 항체들에 의하여 결합되지 않은 파지들과 인서트들을 가지지 않은 M13이나 T7 파지들 - "공백(empty)" 파지들이라고 불림)로 구성된 예시된 글라스 슬라이드에서, 데이터는 파지 캡시드들과 2 가지 비한정적인 통계적 접근법들을 이용하는 혈장 표본 항체의 2 가지 색깔의 형광 라벨링에 의하여 정규화(normalize)되었다.

1) 항체/파지 캡시드 신호 비율 단일 진단 칩상에 다중 비반응성 파지들과 "공백" 파지들의 스크리닝에서 확인된 포획 단백질들은 표준 면역화학적 기법들과 이중 색채 염색을 이용하여 표본(들)로 배양되었다. 포획 단백질을 결합하는 항체의 중간값(또는 평균) 신호는 찍힌 점(spot) 내의 전체 단백질의 양을 차지하는 파지 캡시드 단백질에 대항하여 상용 항체의 중간값(또는 평균) 신호에 의하여 나누어진다. 따라서, 혈장/파지 캡시드 신호 비율(예를 들어, Cy5/Cy3 신호 비율)은 독특한 파지-발현된된 단백질에 대항하는 인간 항체의 정규화된 측정을 제공한다. 이후 공백 파지에 대항하는 배경 반응성을 차감하고 파지 신호의 중간값(또는 평균)으로 나누어서,([(파지의 Cy5/Cy3)-(공백 파지의 Cy5/Cy3)/(공백 파지의 Cy5/Cy3)]) 더 정규화될 수 있다. 이러한 방법론은 표본들의 비교를 가능하게 하는 칩 대 칩(chip-to-chip) 변이성에 대한 정량화된 재현가능한 보상(compensate)들이다.

2) 표준화된 잔차 ( residual ) 단일 진단 칩들 상에 다중 비반응성 파지들과 "공백 파질들의 스크리닝에서 확인된 포획 단백질들은 표준 면역화학적 기법들과 이중 색채 염색을 이용하여 표본(들)로 배양된다. 통계적으로 결정된 회귀선으로부터의 거리는 측정되고, 이후에 잔차 표준 편차에 의한 측정을 나누어서 표준화된다. 이런 접근법은 각각의 찍힌 점에서의 단백질 양에 걸쳐서 각각의 독특한 파지-발현된 단백질과 결합하는 항체의 양의 신뢰할 만한 측정을 제공도 하고, 표본들의 비교를 가능하게 하는 칩 대 칩 변이성에 대한 정량화된 재현가능한 보상들이다.

그러한 신호의 정규화는 환자가 표지에 대하여 양성이냐 그렇지 않느냐를 결정하는 데 진단 검사에서 시험되는 미지수들과 함께 이용될 수 있다. 상기 검사는 항체 존재의 정성적 결정에 의존할 수 있으며, 예를 들어, 백그라운드를 초과하는 임의의 정규화된 수치는 그러한 항체의 증거로 여겨진다. 또한, 상기 검사는 항체 반응의 활력의 반영으로서, 표본에 대한 신호의 세기 결정에 의하여 정량화될 수 있다. 따라서, 표지와의 반응의 실질적인 수량적 정규화된 수치는 여기에 기술된 암을 진단하는 공식적 결정에 이용될 수 있다.

예측 표지들의 확인

모든 후보 파지-발현된 단백질들의 정규화된 측정들은 환자군과 정상군 사이의 통계적으로 의미있는 차이들, 예를 들어, JMP 통계 소프트웨어(SAS, Inc., Cary, NC)를 이용하는 t-시험에 의하여 독립적으로 분석될 수 있다. 시험되는 표본들에 대한 독립적인 결정의 레벨들을 달리하여 다양한 표지들의 조합들이 다양한 방법들로 통계적으로 조합될 수 있다. 상기 통계적 처리는 다변수 분석 양식으로 다양한 조합들로 모든 표지들을 비교하여 질병의 존재와 관련되는 최대의 가능성을 지닌 표지들의 패널을 획득하는 처리이다. 임의의 모집단 통계에서, 표지들의 선별은 사용된 표본들의 숫자와 유형에 의한 것이다. 그래서, "표지들의 최적 조합"은 모집단에 따라 변할 수 있거나 예를 들어, 비정상 단계에 근거할 수 있다. 표지들의 최적 조합은 더 작은 표본 크기들(<100) 내에서는 명백하지 않을 수 있는 변이성에 근거하여 더 큰 표본 세트(>1000)에서 시험되는 경우에 변화될 수 있거나, 상기 표지의 모집단 유병률(prevalence)의 검정(validation)으로 인하여 감소된 편차를 보여줄 수 있다. 가중된 로지스틱 회귀는 다소간의 독립적인 예측 수치를 지닌 표지들을 조합하는 논리적인 접근법이다. 시험된 표본들을 구별하는 표지들의 최적 조합은 예를 들어, ROC 곡선들을 이용하는 데이터를 조직하고 분석하여 정의될 수 있다.

클래스( class ) 예측

모든 후보 파지-발현된된 단백질들에 대한 표준화된 반응들은 예를 들어 t-시험에 의하여 환자군과 정상군 사이의 통계적으로 의미있는 차이들에 대하여 독립적으로 분석된다. 통계적 처리는 다변수 분석 양식으로 다양한 조합에서 모든 표지들을 비교하여 암의 존재와 관련되는 최대 가능성을 지닌 표지들의 패널을 얻는다.

폐암에 대하여 여기에 예시된 패널들(두 개 이상의 표지들의 조합된 측정들)은 높은 조합된 예측 수치를 가지며 뛰어난 구별(암 있음(yes) 대 암 없음(no))을 보여준다. 본 발명이 이용가능한 암과 정상 표본들 사이를 구별하는 능력에 대하여 선택되었던 특정한 펩티드 패널들을 포함하는 반면에, 본 발명은 모든 확인된 표지들이 아니며, 모든 잠재적으로 확인가능한 표지들 또는 그 조합들이 아닌 몇몇 표지들을 이용하여 개발되었다는 것을 알 것이다. 따라서, 패널은 적어도 두 개의 표지들; 적어도 세 개의 표지들; 적어도 네 개의 표지들; 적어도 다섯 개의 표지들; 적어도 여섯 개의 표지들; 적어도 일곱 개의 표지들; 적어도 여덟 개의 표지들; 적어도 아홉 개의 표지들; 적어도 열 개의 표지들 등을 포함할 수 있으며, 표지들의 숫자는 결과들의 최대 예측성을 획득하는 통계적 분석에 의하여 통제된다. 따라서, 예를 들어, 여기에 기술된 예들과 패널들은 단지 예들일 뿐이다.

통계적 관점에서, 최종적으로 다른 표지들의 포함은 표본에서 영향받는 모든 개인들을 확인할 시험으로 이어질 것이다. 그러나, 상업적인 실시예는 비용적 고려사항들 때문에 수많은 표지들을, 수많은 변수들이 고려되고 있기 때문에 필요로 될 수 있는 통계적 처리를, 아마도 한번에 시험될 수 있는 수많은 실험들 등을 줄이게 되는 수많은 대조들에 대한 필요를 요구하지 않을 수 있거나 필요로 하지 않을 수 있거나 원하지 않을 수 있다. 상업성은 과학적 확실성과는 상이한 종료점을 가진다.

그러나, 수많은 표지들이나 표지들의 상이한 패널은 특이성 및/또는 민감도를 증진할 수 있다는 관찰은 적은 수의 표지들을 지닌 양성 검사에 뒤따르는 후속 연구들이 다소간의 표적들로 시험되는 환자 표본 또는 오진의 가능성을 배제하는 상이한 표지들의 패널을 가지게 될 실시예로 이어진다. 생물표지들의 재구성된 패널로 중요한 검사를 이용하는 그러한 후속 연구들은 환자를 높은 레벨의 방사선에 노출시키는 CT와 같이 비용이 더 많이 들거나 잠재적으로 침습성인 기법들이나 생검에 대한 매력적인 대안이다. 따라서, 예를 들어, 다섯 개의 표지 패널의 세개 이하에 대하여 양성을 보인 환자는 더 큰 표지들의 패널에 대하여 확인적인 시험으로 시험될 수 있다.

당해 검사는 특히, X선이나 CT 스캔이 결정적인 진단을 제공하지 않는 것이라면, 재시험에 대한 필요성, 재빠른 후속 조치, 다음번 시험이 있을 때까지 연장되거나 감축된 기간 등에 대한 필요로 이어질 X선이나 CT 스캔과 같은 다른 검사 포맷의 확인으로도 작용할 수 있다. 따라서, 당해 검사는 그러한 환자들에서의 후속 조치로서 이용될 수 있다. 양성 시험은 폐암의 가능성을 확인할 것이며, 음성 시험은 양성 암이나 암이 전혀 없는 것 중 어느 하나를 나타내게 되며, 비진단성 X선이나 CT 스캔은 정상적인 조직 변이를 드러내었다.

"상업적 준비된" 검사에서의 정확한 클래스 예측은 광범위한 인구통계로부터 얻은 수많은 표본들로부터 유래한 측정들에 근거한 것이기 때문에, 개발 도중의 모든 회귀적인 표본 시험은 궁극적으로 분류자(classifier)들로서 최종적으로 포함될 수 있으며, 예측 수치와 같은 검사 능력은 계속 개선될 것이다. 이러한 검사 개발의 동적인 태양에 더하여, 멀티플렉스(다중 표지) 검사의 성격은 개발 또는 실행에서의 임의의 지점에서 예측 표지들이 첨가되게 하는 것이다.k

문맥에 따라, 진단에의 사용을 위한 표지들의 검정은 "정상 범위"를 정의함으로써 예측 정확도를 올리는 고도로 안정한 분류자들의 세트를 발생시키는 2차 목적의 역할을 할 것이다. 그러한 정상 범위로부터 벗어난 편차는 비록 임상적인 진단에서 가장 적절한 절사(cutoff) 수치들이 주어진 표적 모집단에서의 변이성에 의하여 결정되어야 할 것이라 하여도 질병의 통계적 확률(예를 들어 기준으로부터의 >2 표준 편차들)을 제공할 것이다.

다중 표지 검사들과 응용

여기에 더 상세히 토론된 바와 같이, 당해 발명은 상이한 검사 포맷들의 사용을 고찰한다. 마이크로어레이들은 다중 표본들의 동시적 시험을 가능하게 한다. 따라서, 양성이든 음성이든 수많은 대조 표본들이 상기 마이크로어레이 내에 포함될 수 있다. 그러므로, 상기 검사는 시험되는 표본과 함께 영향받은 것으로 알려진 환자로부터 나온 표본과 정상적인 표본과 같은 다수 표본들의 동시적인 처리로 작동될 수 있다. 내부 대조들을 작동시키면 검사 내의 신호 세기의 정규화, 교정 및 표준화를 가능하게 한다.

따라서, 그러한 마이크로어레이, MEMS 장치, 내부 대조들이 있는 NEMS 장치 또는 칩은 상기 장치상에 동시에 시험되는 실험들(환자들)의 보호 진단의 포인트를 가능하게 한다. 상기 MEMS 및 NEMS 장치들은 마이크로어레이 검사들에 대하여 사용되는 그러한 것들일 수 있거나 다른 검사 포맷들이나 보고들을 가능하게 할 마이크로플루이딕들 등을 포함시키는 것과 같은 "칩상의 랩(lab on a chip)" 포맷으로 될 수 있다.

예측력과 수치 및 전체 모집단들에 대한 응용성을 올리고 비용을 낮추기 위하여, 당해 검사 포맷은 낮은 제작 비용으로 동시적으로 하나 또는 적은 수의 표적들을 일반적으로 발견하는 딥스틱(dipstick)과 측면 유동 면역검사들과 같은 표준 면역검사들에서부터 예를 들어, 96,384 개 이상의 표본들을 동시에 처리할 수 있으며 임상 실험실 세트팅들에 흔히 있으며, 자동화에 적합한 다중 웰 배양 접시에서 작동하도록 종종 구성된 ELISA-형 포맷들 및 수많은 표본들이 높은 처리율 방식으로 동시에 시험되는 어레이 및 마이크로어레이 포맷들에 이르기까지 다양할 수 있다. 상기 검사는 간단하고 정성적인 구별(암 있음 대 암 없음)을 내어놓도록 구성될 수도 있다.

그러나 질병 관리에 다중적인 다양한 응용들이 가능하며 임의의 일 응용에 대하여 독특한 표지들은 여기에 가르친 바와 같이 제작될 수 있다. 표지들의 상이한 세트들은 폐암과 다른 유형의 암 구별, 조기 단계 암과 말기 단계 암 구별, 암의 특이적 아형들의 구별 및 치료적 간섭 후에 질병의 진전을 추적하기 위하여 얻어진 것이다. 따라서, 처리 요법은 처리 또는 면제(remission)의 진전을 모니터링 하도록 당해 검사로 반복된 계열 시험에 의하여 평가되고 필요에 따라 조작될 수 있다. 예를 들어, 포획 분자들의 계열 희석을 포함하여 상기 검사의 정량적 버전은 처리로 암 크기의 감소를 구별할 수 있다.

펩티드들과 같은 특정한 에피토프들이 일단 순환하는 자가항체를 발견하는 데 확인되면, 상기 특정한 에피토프들은 업계에 알려진 포맷들에서와 같이 진단 검사들에서 사용될 수 있다. 상호작용이 면역 반응인 것과 같이, 적당한 진단은 다양한 알려진 면역검사 포맷들 중 임의의 것에서 제시될 수 있다. 따라서, 에피토프는 예를 들어, 알려진 화학기법들을 이용하여 고체상(solid phase)으로 부착될 수 있다. 또한, 에피토프들은 종종 에피토프보다 더 큰 다른 분자에 접합되어 합성 접합 분자를 형성할 수 있거나, 업계에 알려진 것과 같은 재조합 방법들을 이용하여 복합 분자로서 제작될 수 있다. 수많은 폴리펩티드들이 멀티웰 플레이트들과 같은 조직 배양 장치들 내에서 발견될 수 있는 폴리에틸렌 표면들과 같은 합성수지(plastic) 표면들에 자연적으로 결합한다. 종종, 그러한 합성수지 표면들은 처리되어 생물학적으로 융합가능한 분자들의 결합을 증가시킨다. 따라서, 폴리펩티드들은 포획 요소를 형성하며, 그러한 에피토프를 특이적으로 결합하는 자가항체를 운반하는 것으로 의심되는 액체는 상기 포획 요소에 노출되며, 항체는 상기 포획 요소에 부착되고 고정되며, 이후에 세척을 한 다음, 결합된 항체는 콜로이드성 금과 같은 콜로이드성 금속, 플루오로세인과 같은 형광색소 등으로 라벨된 항-인간 항체와 같은 발견용으로 라벨된 적당한 보고자 분자를 사용하여 발견된다. 그러한 매커니즘은 예를 들어, ELISA, RIA, 웨스턴 블롯 등에 의하여 제시된다. 자가항체를 발견하는 면역검사의 특정한 포맷은 설계 선택이다.

또한, 특정 파지가 폐암 환자들에서 발견되는 자가항체들에 의하여 특이적으로 결합된 에피토프(클론들은 스탁들로 특이적으로 명명되고 저장되며, 환자가 당해 응용으로부터 성숙하는 경우에 요청하면 이용될 수 있다)를 발현하듯이, 검사의 포획 요소는 세포 용해질로부터 구해진 바와 같은, 각각이 고체상의 포획 사이트에 있는 개별적인 파지일 수 있다. 또한, 발현된 에피토프가 부착되는, 알부민과 매부리구멍삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌과 같은 단백질로 된 반응적으로 비활성인 담체 또는 담체 상의 합텐(hapten)과 유사한 합성 고분자와 같은 합성 담체 또는 면역검사를 위한 고체상에서의 중요한 에피토프를 제시하는 임의의 다른 수단이 사용될 수 있다.

또한, 포맷은 고체상에 부착된 포획 요소가 항체의 F_c 부분과 같은 면역 글로불린의 비-항원-결합 부분들과 결합하는 요소인 구성을 취할 수 있다. 따라서, 적당한 포획 요소는 단백질 A, 단백질 G 또는/및 α-F_c 항체일 수 있다. 환자 혈장은 상기 포획 시약에 노출되며 이후 폐암-특이적 항체의 존재는 예를 들어, 업계에 알려진 바와 같은 직접적이거나 경쟁적인 포맷으로 라벨된 표지를 사용하여 발견된다.

유사하게도, 포획 요소는 상기에서 토론된 바와 같이, 특이적인 포획 시약을 생성하는 다른 수단들을 제공하는 에피토프를 보여주는 파지를 결합하는 항체일 수 있다.

면역검사 업계에 알려진 바와 같이, 포획 요소는 항체가 결합하는 결정인자이다. 여기에서 가르치는 바와 같이, 상기 결정인자는 생물학적 분자와 같은 임의의 분자 또는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 다당류 등과 같은 그 일부 및 당단백질 또는 지질단백질과 같은 그 조합들일 수 있으며, 그것의 존재는 폐암 환자들에게서 발견되는 항체의 존재와 관련된다. 상기 결정인자는 예를 들어, 자연발생적이고 정제될 수 있다. 또한, 상기 결정인자는 교차 반응성을 최소화시킬 수 있는 재조합 수단에 의하여 제작되거나 합성하여 제작될 수 있다. 그러나, 상기 결정인자는 명백한 생물학적 기능을 가지지 않을 수 있거나, 중요한 진단 검사에서 그 사용으로부터 벗어나지 않는 특정한 상태와 항상 관련되어 있는 것이 아닐 수 있다.

면역검사의 고체상은 업계에 알려진 것들 중 임의의 것일 수 있으며 업계에 알려진 것과 같은 형태일 수 있다. 따라서, 고체상은 폴리스타이렌 또는 폴리프로필렌과 같은 합성수지, 유리, 실리콘 칩과 같은 실리콘 계열 구조, 나일론과 같은 막, 종이 등일 수 있다. 고체상은 막, 마이크로타이터 플레이트, 슬라이드, 칩 등을 일반적으로 사용하는 딥스틱 또는 측면 유동 장치의 부분으로서의 종이 포맷, 비드와 같은 수많은 다양한 알려진 포맷들로 제시될 수 있다. 고체상은 유리 슬라이드에서 발견되거나 칩상에서의 단단한 평면으로 제시될 수 있다. 몇몇 자동화된 검출 장치들은 광자계열(photon-based) 신호를 발견하고 판독하기 위하여 예를 들어, 분광광도계, 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter), 색도계(colorimeter), 형광계 등과 같은 발견가능한 신호를 판독하는 수단과 관련된 전용의 1 회용 수단들을 가지고 있다.

결합된 항체를 발견하는 다른 면역 시약들이 업계에 알려져 있다. 예를 들어, 항-인간 Ig 항체는 포획 결정인자, 자가항체 및 항-인간 Ig 항체를 포함하는 샌드위치를 형성하는 데 적당할 것이다. 발견자(detector) 구성요소인 항-인간 Ig 항체는 효소, 콜로이드성 금속, 방사성핵종, 염료 등과 같은 보고자 분자로 직접 라벨링될 수 있거나 보고자 기능의 역할을 하는 제 2 분자에 의하여 스스로 결합될 수 있다. 근본적으로, 결합된 항체를 발견하는 임의의 수단이 사용될 수 있으며, 그러한 임의의 수단은 운용자에 의하여 구별가능한 신호를 생성해 내는 보고 기능을 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 보고자를 형성하는 분자들의 라벨링은 업계에 알려져 있다.

다수 표본들의 동시적인 분석을 가능하게 하는 장치의 맥락에서, 양성이든 음성이든 양쪽 모두의 수많은 대조 구성요소들이 검사 장치에 포함되어 검사 성능, 시약 성능, 특이성 및 민감도에 대한 대조(controlling)를 가능하게 한다. 자주 많이 언급되는 바와 같이 중요한 장치를 제작하는 데 모두라고는 할 수 없지만 수많은 단계들과 많은 검사 단계들이 로보트와 같은 기계적 수단에 의하여 수행되어 테크니션의 실수를 최소화할 수 있다. 또한, 그러한 장치들로부터 얻은 데이터는 스캐닝 수단에 의하여 디지털화될 수 있으며, 그러한 디지털 정보는 데이터 저장 수단으로 소통되며 그러한 데이터도 데이터 처리 수단으로 소통되어, 여기에서 토론되거나 업계에 알려진 통계 분석 종류가 그러한 데이터 상에 달성되어 결과의 측정을 생성하고, 이후에 진단 정보를 제공하기 위하여 기준 표준과 비교될 수 있거나 내부적으로 비교되어 스크린과 같은 데이터 표현 수단에 의하여 검사 결과로 표현되거나 정보 외에서 판독될 수 있다.

더 적은 숫자의 표본들을 분석하는 장치들에 대하여 또는 충분한 모집단 데이터가 이용가능한 곳에서, 적절한 오차 측정이 된 양성 결과와 음성 결과를 구성하는 것에 대한 유도된 계량이 제공될 수 있다. 그러한 경우에, 단일 양성 대조와 단일 음성 대조는 업계에 알려진 바와 같이 내부 타당성을 위하여 필요로 되는 그 모든 것일 수 있다. 그러한 검사 장치는 예를 들어, 폐암 클러스터에 포함되거나 그렇지 않은 것처럼 좀더 정성적인 결과를 내놓을 수 있도록 구성될 수 있다.

다른 높은 처리율 및/또는 자동화된 면역검사 포맷들이 알려진 바와 같이 사용될 수 있고 업계에서 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 염료-충진 미세구들에 의존하는 Luminex(Austin, TX) 기술 및 BD(Franklin Lakes, NJ) 세포계산기 비드 어레이 시스템과 같은 예를 들어, 비드-계열(bead-based) 검사가 색도계, 형광 또는 발광 신호들 상에 이용될 수 있다. 어느 경우에서나 중요한 에피토프들은 비드에 부착된다.

다른 멀티플렉스 검사는 Gannot et al., J. Mol. Diagnostics 7, 427-436, 2005의 층을 이루는 어레이들의 방법이다. 상기 방법은 다층 막들의 사용에 의존하며, 각각은 항원이나 표지와 같은 표적 분자와 같은 결합 쌍의 상이한 것을 지니고 있으며, 레지스터 내에서의 크로마토그래픽 전달을 위하여 상기 결합 쌍의 다른 쪽을 지니고 있는 것을 생각되는 표본을 수용하는 것으로 레지스터 내에서 막들이 구성된다. 상기 표본은 심지를 가지게 되거나(wick) 수많은 정렬된 막들을 통하여 전달되어 삼차원 매트릭스를 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 수많은 막들이 분리 겔(separating gel)의 꼭대기에 적층될(stacked) 수 있으며 상기 겔 내용물들이 분리 겔을 빠져나와 상기 쌓여진 막들을 통과하게 된다. 임의의 막에 부착된 것과 막 적층을 통해 수송되는 것 사이에서의 분자들의 임의의 화합은 알려진 보고자 및 발견 물질들과 방법들을 이용하여 시각화될 수 있으며, 예를 들어, U.S. Nos. 20050255573과 20040081987뿐만 아니라 U.S. Pat. Nos. 6,602,661 및 6,969,615 참조.

다른 실시예들에서, 중요한 조성물이나 장치가 사용되어 폐암과 관련되거나 상관된 상이한 분자들의 클래스들을 발견할 수 있다. 따라서, 검사는 폐암 항원과 같은 폐암과 관련되거나 상관된 순환하는 자가항체 및 비-항체 분자들을 발견할 수 있으며, 예를 들어, Weynants et al., Eur. Respir. J., 10:1703-1719 및 Hirsch et al., Eur. Respir. J., 19:1151-1158, 2002 참조. 따라서, 장치는 포획 구성요소로서 특이적인 항체들, 앱타머들, 리간드들 등과 같은 자가항체들에 대한 에피토프들과 폐암 분자들에 대한 결합 분자들을 포함할 수 있다.

표본추출과 시험의 예시화

특히, 스크리닝 검사들에서의 시험에 적합한 표본들은 일반적으로 환자로부터 용이하게 구할 수 있고, 아마도 비-침습성 또는 최소한의 침습적인 방식으로 용이하게 구할 수 있는 표본들이다. 상기 표본은 자가항체를 지니고 있는 것으로 알려진 표본이다. 혈액 표본은 적당한 그러한 표본이며 대부분의 면역검사 포맷들에 용이하게 적절하다.

혈액 표본의 맥락에서, 유체 5 또는 10 ㎖를 채집하는 수많은 알려진 혈액 채집 튜브들이 있다. 가장 흔히 주문되는 진단 혈액 시험들에 유사하게 혈액 5 ㎖가 채집되지만, 마이크로어레이로서 작동하는 당해 검사는 혈액 1 ㎖ 미만을 필요로 할 수 있다. 혈액 채집 용기는 헤파린, 시트르산염 또는 EDTA와 같은 항응고제를 포함할 수 있다. 세포 구성요소들은 예를 들어, 4 ℃에서 10 분 동안 1000x g(RCF)(분석을 위하여 ~40 % 혈장을 생성)의 원심분리에 의하여 일반적으로 분리되며 사용할 때까지 냉장 온도나 4 ℃에서 일반적으로 저장될 수 있다. 혈장 표본들은 바람직하게는 채집한 지 3일 이내에 검사되거나 예를 들어, -20 ℃에서 냉동된 채로 저장된다. 여분의 표본은 필요한 반복되는 분석을 위하여 최대 2 주 동안 -20 ℃(표본의 동결 해동을 피하기 위하여 성에(frost)가 없는 냉장고에서)에서 저장된다. 2 주를 초과하는 기간 동안 저장하려면 -80 ℃에서 이어야 한다. 업계에 알려진 항체 구조와 기능을 보존하는 표준 처리 및 저장 방법들이 실행된다.

이후에 유체 표본들은 예를 들어, 적절한 양성 및 음성 표본들과 함께 여기에 토론된 5 개 표지 패널들 중 하나의 정제된 폴리펩티드들의 표본들로 적재된 사이트들을 포함하는 마이크로어레이와 같은 시험 조성물에 응용된다. 표본들은 정량화가 가능하도록 계열 희석과 같이 눈금이 계량된 양으로 제공될 수 있다. 표본들은 임의의 위치적인 효과를 해결하기 위하여 마이크로어레이 상에 무작위로 위치될 수 있다. 배양한 이후에, 마이크로어레이는 세척되고 이후에 특정한 표지로 라벨링되는 항-인간 항체와 같은 발견자에 노출된다. 신호의 정규화를 가능하게 하기 위하여, 제 2 발견자가 예를 들어, 각각의 사이트에서 표본의 측정을 제공하도록 마이크로어레이에 첨가될 수 있다. 그것은 분리된 폴리펩티드 표본들 상의 다른 사이트로 지향된 항체일 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 다른 서열들이나 특이적인 반응에 비활성인 분자를 포함하도록 변형될 수 있거나 상기 폴리펩티드들은 마이크로어레이상으로 첨가되기 전에 보고자를 운반하도록 변형될 수 있다. 상기 마이크로어레이는 다시 세척된 후에 필요하다면, 상기 보고자의 발견이 가능하도록 시약에 노출된다. 따라서, 만약 상기 보고자 금속 졸(sol)들과 같은 색채 입자들을 포함한다면, 특정한 발견 수단이 필요하지 않다. 만약 형광 분자들이 사용된다면, 적절한 입사광이 사용된다. 효소들이 사용된다면, 상기 마이크로어레이는 적절한 기질들에 노출된다. 이후 상기 마이크로어레이는 상기 사이트들과 결합하는 반응 산물에 대하여 평가된다. 그것이 시각적 평가일 수 있는 반면에, 신호를 발견하고 필요하다면 신호의 세기를 정량화할 장치들이 있다. 이후 그러한 데이터는 예를 들어, 음성 및 양성 대조 표본들을 관찰하여 반응의 타당성에 대한 정보를 제공하기 위하여 해석되며, 타당하다면 실험 표본들이 평가된다. 이후 그러한 정보는 암의 존재에 대하여 해석된다. 예를 들어, 환자가 세 가지 이상의 항체들에 대하여 양성이라면, 상기 환자는 폐암에 대하여 양성으로 진단된다. 또한, 표지들 상의 정보는 폐암이 존재한다는 결과에 5 가지 표지들을 함께 그것의 최대 가능성 관계를 기술하는 공식에 응용될 수 있으며, 환자의 점수의 단서(clue)가 동일한 패널의 점수의 수치의 50 %를 초과한다면, 환자는 암에 대하여 양성인 것으로 진단된다. 적당한 점수는 계산된 AUC 수치들일 수 있다.

키트의 사용과 검사

본 발명에 따른 혈액 시험은 비록 조기 진단이나 잇따르는 후속 조치들에 대한 조기 경고가 질병 결과들에 미치는 그 잠재적 충격으로 인하여 상당히 긴급하다 하여도 다수의 사용들과 응용들을 가진다. 본 발명은 폐암에 대한 방사선촬영 스크리닝을 수행하는 도구로 채용될 수 있다. 계열 CT 스크리닝은 일반적으로 폐암에 대하여 민감하지만, 대단히 비싸며 비특이적(64 %로 보고된 특이성)인 경향이 있다. 따라서, CT는 거의 10 건중에 4 건이 수많은 오진의 결과로 나온다. 방사선촬영 이미징하는 동안에 미정 폐 결절들의 일상적인 확인은 때때로 비싼 정밀검사와 중대한 수술을 포함하는 잠재적으로 해로운 간섭으로 이어진다. 최근에, 연령과 흡연 이력은 폐암에 대한 대규모 스크리닝 연구들에 의하여 선별 기준으로 사용되어 왔던 유일한 두 가지 위험 인자들이다.

방사선촬영으로 명백한 암들(>0.5 ㎝) 및/또는 잠재성이나 전암 상태의 암(통상적인 방사선촬영 발견의 한계 미만)을 발견하기 위하여 본 발명에 따른 혈액 시험의 사용은 다른 스크리닝이 매우 필요시 되는 개인들을 정의하게 한다. 따라서, 당해 검사는 1차 스크리닝 시험의 기능을 할 수 있으며, 양성 결과는 CT, PET, X선 등과 같은 방사선촬영 분석과 같은 통상적이고 업계에 알려진 바와 같은 시험을 더 필요로 한다는 것을 나타낸다. 또한, 주기적인 재시험은 부상하는 NSCLC를 확인할 수 있다.

피검자 시험이 어떻게 의료적인 실시로 포함될 수 있느냐의 예는 고도의 위험이 있는 흡연자들(예를 들어, 20년 이상 동안 매일 한 갑에 해당하는 담배를 흡연했던 사람들)에게 매년 신체 검사의 일부로 피검자 혈액 시험이 주어질 수 있는 곳에서 일 것이다. 임의의 다른 드러나는 징후들이 없는 음성 결과는 적어도 매년 시험을 더 해야 한다는 것을 드러나게 한다. 만약 시험 결과가 음성이라면, 환자는 종양의 가능성을 확인하기 위하여 당해 검사의 반복 및/또는 CT 스캔 또는 X선과 같은 시험을 더 받아야할 것이다. 만약 어떠한 종양도 CT 스캔 또는 X선 상에 명백하지 않다면, 아마도 당해 검사는 검사를 받은 그해 안에 1회 또는 2회 반복되어야 하며, 종양의 지름이 적어도 0.5 ㎜가 될 때까지 이후 년도들에 복수 회 반복되어야 하며 발견하여 외과적으로 제거할 수 있다.

이하의 예들에서 기술되는 바와 같이, 예시적인 5 개 표지 패널을 이용하는 NSCLC에 대한 자가항체 프로파일링의 ~90 % 민감도는 CT 스크리닝 단독의 민감도와 상당히 호의적으로 비교하며, 비교에 의하여 작은 종양들과 특히 우수하게 작용할 수 있으며, 잠재성 질병의 발견에서 견줄만한 것이 없는 향상을 나타낸다. 게다가, 당해 검사의 80 %를 초과하는 특이성이 더 초과하면 할수록 고위험의 모집단에서 양성(benign) 폐 결절들의 백분율이 증가함에 따라, 예를 들어, Mayo Clinic Screening Trial에 참여한 참여자들의 약 70 %의 수준들로 증가하여, 점점 더 중요해지는 CT 스캐닝의 특이성을 상당히 초과하게 된다.

스크리닝에의 사용뿐만 아니라, 본 발명의 검사와 방법은 CT 스크리닝 상에서 확인된 악성 결절들과 양성을 구별하는 밀접하게 관련된 임상적 문제에도 유용할 수 있다. 고립성 폐 결절(SPN)은 정상적인 폐 조직에 의하여 완전히 둘러싸인 직경이 3 ㎝ 미만인 단일한 구형 병변으로 정의된다. 비록 SPN들의 악성의 보고된 유병률이 약 10 %에서 약 70 %에 달한다고 하지만, SPN의 최신 정의를 이용한 가장 최근의 연구들에 의하면 약 40 %에서 약 60 %에 달하는 악성의 유병률을 보인다. 대부분의 양성 병변들은 육아종들(granulomas)의 결과인 반면에, 대부분의 악성 병변들은 주요한 폐암이다. SPN의 최초 진단 평가는 연령, 흡연 이력, 과거의 악성 이력 및 과거 흉부 X선의 평가에 근거한 크기, 석회화, 연변부(뾰쪽하거나 매끈한) 및 성장 패턴과 같은 결절의 흉부 방사선촬영의 특징들과 같은 악성에 대한 위험 인자들의 평가에 근거한 것이다. 이후 이러한 인자들은 악성의 가능성을 결정하고 환자 관리를 더 유도하기 위하여 이용된다.

최초 평가 이후에, 많은 결절들은 악성일 가능성이 중간 정도인 것으로 분류될 것이다(25 - 75 %). 이 군내의 환자들은 생검이나 수술로 진행되기 전에 당해 검사로 추가적인 시험을 받아 혜택을 받을 수 있다. 성장 또는 대사적 이미징(예컨대, PET 스캐닝)을 평가하는 계열적 스캐닝은 현재 이용가능한 유일한 비침습성 옵션들이며 이상적이라고는 할 수 없다. 계열 방사선촬영 분석은 성장의 측정에 의존하며, 2 년이라는 시간범위에 걸쳐서 아무런 성장을 보이지 않음을 요하며; 스캔을 하는 사이의 이상적인 간격은 비록 2 년 동안에 매 3 개월마다의 CT 스캐닝이 통상적인 장기적인 평가라고 하더라도 아직 정해지지 않았다고 할 수 있다. PET 스캔은 폐암에 대하여 90 - 95 % 특이성과 80 - 85 % 민감도를 가진다. 이러한 예측 수치들은 양성 육아종성 질병(예컨대, 히스토플라스마증)의 국부적 유병률에 근거하여 변화할 수 있다.

PET 스캔닝들은 현재 시험당 $2000 및 $4000 사이의 비용에 달한다. 기관지경술(bronchoscopy) 또는 경흉(transthoracic) 바늘 생검(TTNB)와 같은 비-수술적인 절차들로부터 진단 수율들은 40 %에서 95 %에 이른다. 비진단 절차의 세팅에서 후속 관리는 문제가 많을 수 있다. 수술적 간섭이 다른 진단의 정밀검사가 있거나 없을 때에 가장 실용적인 옵션으로서 종종 수행된다. 그 선택은 악성의 사전시험 위험이 높으냐 낮으냐의 여부, 특정한 기관에서의 시험의 이용가능성, 상기 결절의 특징들(예컨대, 크기 및 부위), 환자의 수술 위험 및 환자 성향 여부에 달려있다. 다른 경흉 악성의 사전 이력은 즉각적으로 폐에 미치는 전이성 암의 가능성을 암시하며, 비침습성 시험의 적절성은 무시할 정도가 된다. 폐암에 대한 미정 임상적 의심이 있는 SPN의 혼란스러운 임상적 시나리오에서, 종양 표지들을 순환시키면 잠재적으로 해로운 침습성 진단 정밀검사들을 회피하도록 보조할 수 있으며 공격적인 수술의 간섭에 대한 이론적 해석을 역으로 지지하게 할 수 있다.

따라서 본 발명은 침습성 진단을 대신하여 결절을 계열적으로 이미지하는 데 선택하는 임상적 편리함을 증진시킨다. 본 발명은 또한 계열 X선 또는 CT 스크리닝에 대한 간격에서 영향을 가질 것이며, 이로써 임상적 건강 보호 비용을 낮추게 된다. 본 발명은 폐암이 존재하거나 부재한다는 가능성을 더 올리는 비용 효과적인 방법으로서 PET 스캐닝을 보조하거나 대체할 것이다.

본 발명은 치료적 간섭을 따르는 질병 재발을 평가하는 데 유용할 것이다. 결장 및 전립선암 이러한 능력에 흔히 채용되며, 표지 레벨들은 처리 성공이나 실패의 지표로서 따르게 되며, 표지 레벨들의 증가는 치료적 간섭으로 이끄는 재발에 대한 추가적인 진단 평가에 필요성을 나타낸다.

본 발명은 종양 특성들에 대한 중요한 정보를 제공할 것이다; 불충분한 전조로서 종양 아형들을 결정하면 검사가 복수의 표지들에 의존하며, 그 중 임의의 것은 특정한 암이나 그것의 독특한 파라미터를 특징으로 할 수 있기 때문에 잠재적인 독성을 지닌 추가적인 치료법을 추천하는 임상적 결정에 상당히 영향을 줄 수 있다. 통상적인 수술이나 화학요법의 장기적인 강화에 이용되는 더 새로운 처리들의 개발은 신중한 비용/이익 분석과 환자 선별을 요구할 것이다.

그러므로, 당해 검사는 스크리닝, 처리의 선택 및 처리의 절차, 처리의 성공, 재발, 치료 등을 모니터링하기 위하여 처리하는 동안 계속적인 사용에 대한 귀중한 도구가 될 것이다. 특정한 표지들의 패널인 당해 검사의 시약들은 특정한 목적에 적합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 검사에서, 표지들의 더 큰 패널이나 아주 유력한 표지들의 패널이 사용되어 더 큰 숫자의 개체들에 대한 예측력을 최대화한다. 그러나, 치료를 받는 개인의 맥락에서, 예를 들어, 환자 종양의 특정한 항체 지문이 얻어질 수 있으며, 이는 스크리닝에 사용되는 표지들 모두를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있으며, 표지들의 특정화된 서브세트는 그 환자에게서 종양의 존재와 후속적인 치료 간섭을 모니터링 하는데 사용될 수 있다.

중요한 검사의 구성요소들이 분산 등에 대한 수많은 상이한 포맷들에서 구성될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 에피토프들이 분취되어 유리 바이알, 원심분리 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기들 내에 저장될 수 있다. 에피토프 용액은 업계에 알려진 바와 같은 보존제들, 항균제들, 안정화제들 등을 포함하여 적당한 완충제 등을 포함할 수 있다. 에피토프는 건조, 동결-건조 등과 같은 보존된 형태로 있을 수 있다. 에피토프들은 특정한 검사에 사용되기 위하여 적당한 고체상에 위치될 수 있다. 따라서, 에피토프들은 배양 플레이트의 웰들 내에 위치되고 건조되며 층을 이룬 어레이 또는 측면 유체 면역검사 장치 내의 막 상에 찍히거나, 슬라이드 또는 마이크로어레이 등에 대한 다른 지지체 상으로 찍히게 될 수 있다. 아이템들이 합성수지 필름 랩 또는 불투명 랩과 같은 업계에 알려진 바와 같이 패키지되거나 포장되어 최대 보존 수명(shelf life)을 보장할 수 있게 된다. 검사 용기는 표본이 액체인 경우 드로퍼(dropper)를 지닌 용기 또는 방울을 배분할 수 있는 캡을 가진 용기, 표본 채집 장치들, 다른 액체 전달 장치들, 발견자 시약들, 은 염색 시약들과 효소 기질, 산/염기 용액, 물 등과 같은 전개 시약들을 포함하는 용기 내에 각각 양성 및 음성 대조 표본들도 포함할 수 있다. 사용에 대한 적당한 지시사항들도 포함될 수 있다.

비드-계열 검사를 이용하는 것과 같은 다른 포맷들로, 복수의 에피토프들이 비드들의 상이한 모집단들에 부착될 수 있으며, 이후에 단일 시약으로 조합되어 환자 표본으로 노출될 준비가 될 수 있다.

본 발명은 여기에 그대로 그 내용들이 포함되어 있는 Zhong et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172:1308-1314, 2005 및 Zhong et al., J. Thoracic Oncol., 1:513-519, 2006에 데이터가 보고되어 있는 비한정적 예들에서 예시될 것이다.

예

예 1- NSCLC 진단 검사

본 예에서, 이후 단계(II, III 및 IV) NSCLC를 진단하는 표지들의 확인이 수행되었다. 두 개의 T7 파지 NSCLC 라이브러리들은 NSCLC 환자 및 정상 혈장으로 바이오패닝되어 NSCLC 환자들 내에서 순환하는 항체에 의하여 인식되는 폴리펩티드들을 발현시키는 면역원성의 클론들의 모집단을 풍부하게 하였다.

T7 파지 NSCLC cDNA 라이브러리는 구매되었으며(Novagen, Madison, WI, USA) 제 2 라이브러리는 Novagen OrientExpress cDNA 합성과 클로닝 시스템들을 이용하여 선암종 세포계 NCI-1650으로부터 구성된다. 상기 라이브러리들은 5 명의 NSCLC 환자들(단계 2-4; 진단은 조직학으로 확인됨)과 정상적인 건강한 기증자들로부터 얻은 혈장 풀로 바이오패닝되어 종양-관련 항체들에 의하여 인식되는 파지-발현된 단백질들의 모집단을 풍부하게 하였다. 간단히 말해서, 파지 발휘된 라이브러리는 지-종양 특이적 단백질을 제거하기 위하여 정상적인 혈청들의 풀(4 ℃에서 1:20으로 희석된 250 ㎕ 정상적인 혈청 풀)로부터 온 항체들로 코팅된 단백질 G 아가로스 비드들로 배양되어 선택된 친화도였다. 결합되지 않은 파지는 원심분리에 의하여 정상적인 혈장 내에서 항체들에 결합된 파지로부터 분리된다. 이후 상청액은 환자 혈청 풀(4 ℃)로 코팅된 단백질 G 아가로스 비드들에 대하여 바이오패닝 되었으며 원심분리에 의하여 결합되지 않은 파지로부터 분리된다. 결합/반응성 파지는 1 % SDS로 용출되며 이후 원심분리에 의하여 채집되었다. 파지는 용균될 때까지 1 mM IPTG 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린(carbenicillin)이 존재하는 곳에서 E coli NLY5615(Gibco BRL Grand Island, NY) 내에서 증폭되었다. 증폭된 파지-함유 용해질들이 채집되고 3 번의 추가적인 연속적인 회수의 바이오팬 풍부화(biopan enrichment)를 겪게 된다. 4 번째 바이오팬으로부터 나온 파지-함유 용해질들이 증폭되며, 개별 파지 클론들은 분리되며 이후에 하기에서 기술된 바와 같이 단백질 어레이들로 포함된다.

어레이 구성 및 고-처리율 스크리닝

바이오패닝의 4 번째 라운드로부터의 파지 용해질들은 증폭되고 개별 파지를 분리하기 위하여 6 % 아가로스로 덮힌 LB-아가 플레이트들 상에 성장된다. 군체-채집(colony-picking) 로보트(Genetic QPix 2, Hampshire, UK)가 사용되어 4000 개의 개별 군체들(2000/라이브러리)을 분리하였다. 채집된 파지는 95-웰 플레이트들 내에서 증폭되며, 이후에 각각의 웰로부터 나온 맑은 용해질 5 nl은 Affymetrix 417 Arrayer(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 사용하여 로보트로 2 벌씩 FAST 슬라이드들(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 상에 찍혀졌다.

이후 상기 4000 파지는 면역원성 파지를 확인하는 바이오팬에 사용되지 않은 5 개의 개별 NSCLC 환자 혈장들로 스크리닝되었다. 토끼 항-T7 1차 항체(Jackson Immuno-Research, West Grove, PA)가 사용되어 파지 양에 대한 대조로서 T7 캡시드 단백질들을 발견하였다. 사전 흡수된 혈장(혈장:박테리아 용해질, 1:30) 표본들과 항-T7 항체들 양쪽 모두는 0.1 % Tween 20 (TBST)이 더해진 1 X TBS로 1:3000 희석되며 1 시간 동안 상온에서 스크리닝 슬라이드들과 함께 배양되었다. 슬라이드들은 세척되고 이후 Cy5-라벨된 항-인간 및 Cy3-라벨된 항-토끼 2차 항체들(Jackson ImmunoResearch; 1 X TBST 내에서 1:4000 각각의 항체)과 함께 1 시간 동안 상온에서 프로브되었다. 슬라이드들은 다시 세척되어 이후에 Affymetrix 428 스캐너를 사용하여 스캔되었다. GenePix 5.0 소프트웨어(Axon Instruments, Union City, CA)를 사용하여 영상들이 분석되었다. Cy5/Cy3 직선 회귀로부터 2 표준 편차들을 초과하는 Cy5/Cy3 신호를 가지는 파지는 "진단 칩" 상에 사용되는 후보들로 선별되었다.

진단 칩 설계 및 항체 측정

상기 고-처리율 스크리닝에서 확인된 2백 12개 면역반응성 파지에 더하여 120 개 "공백" T7 파지가 조합되어 재증폭되며 단일 진단 칩들로서 FAST 슬라이드들 상으로 두 벌씩 찍혔다. 복제 칩들이 사용되어 상기 스크리닝에 대하여 기술된 프로토콜을 이용하여 40 개의 말기 단계 NSCLC 표본들을 검사하였다. Cy5 신호의 중간값은 독특한 파지-발현된 단백질에 대하여 인간 항체의 측정으로서 Cy3 신호로 정규화 되었다(Cy5/Cy3 신호 비율). 칩 대 칩 변이성을 보상하기 위하여, 측정들은 공백 T7 파지 단백질들에 대항하여 혈장의 백그라운드 반응성을 차감하고 T7 신호의 중간값을 나누어서[(파지의 Cy5/Cy3)-(T7의 Cy5/Cy3)/(T7의 Cy5/Cy3)] 더 정규화되었다.

40 명의 환자들(II-IV 단계)과 41 명의 정상인들로부터 얻은 정규화된 신호의 학생 t-시험은 각각의 후보 표지의 상대적 예측 수치를 암시했던 통계적 절사(p<0.01)를 부여하였다. 그러한 212 명의 후보들 중, 17 명이 그러한 절사 기준(p=0.00003 내지 p=0.01)을 충족시켰다.

상기 군 내의 중복은 7 개의 복제 및 3 벌의 클론들을 드러내 보이는 PCR 및 서열 분석에 의하여 평가되었다. 중복된 클론들이 제거되는 경우, 7 개의 파지-발현된 단백질들의 한 세트가 확인되었다.

통계 분석

로지스틱 회귀 분석은 실행되어 표본이 NSCLC 환자로부터 유래하였다는 확률을 예측하였다. 총 81 명의 환자와 정상 표본들이 2 개 군들로 나뉘어졌다. 환자들은 NSCLC의 II-IV 단계들에서 진단되었다. 무작위로 선택된 21 개의 정상인과 20 개의 환자 혈장 표본들로 구성된 제 1 군은 개별 또는 표지들의 조합을 사용하는 환자 표본들과 정상 표본들 사이의 구별되는 표지들을 확인하기 위한 연습용 세트로 사용되었다. 20 개의 환자와 20 개의 정상 표본들로 구성된 제 2 군이 사용되어 연습군을 사용하여 확인된 표지들의 예측률을 정당화하였다. 수신 동작 특성(ROC) 곡선들이 발생되어 예측성 민감도와 특이성을 상이한 표지들과 비교하며, 곡선하 면적(AUC)이 측정되었다. 판별자들은 leave-one-out 교차 검정(cross-validation)을 이용하여 더 검사되었다. 흡연 이력과 질병 단계도 분석되고 비교되었다.

이후 상기 2 개 군들이 반대로 하였으며, 상기 40 명의 군이 연습군이 되어 NSCLC의 존재를 나타내는 표지들을 확인하였다. 최대 예측력을 제공하는 것으로 그렇게 확인된 표지들이 이후에 사용되어 41 개의 표본들의 다른 군 내의 NSCLC를 진단하였다.

하기 표 5는 ROC 곡선들하의 면적들과 예측 정확도를 나타낸 것이다.

	연습 세트*			검정 세트†
파지 클론	AUC§	특이성, %	민감도, %	특이성, %	민감도, %
1864	.857	75	81	65	85
1896	.857	70	86	70	75
1919	.824	75	81	70	90
1761	.798	70	81	70	85
1747	.864	70	86	70	80
5 개 조합	.983	92	95	90	95

^*21 개의 정상 및 20 개의 NSCLC 환자 표본들로 구성된 연습 세트.

^†20 개의 정상 및 20 개의 NSCLC 환자 표본들로 구성된 검정 세트.

^§AUC: ROC 곡선하의 면적

하기 표 6은 Leave-one-out 검정^*을 나타낸 것이다:

파지 클론	특이성, %	민감도, %	진단 정확도†, %
1864	70	82.9	76.5
1896	70	82.9	75.3
1919	70	82.9	76.5
1761	60	82.9	71.6
1747	72.5	82.9	77.8
5 개 조합	87.5	90.2	88.9

*Leave-one-out 검정: 한 개 표본이 총 81 개의 표본들을 포함하는 시험 세트로부터 제거되고, 분류자가 상기 표본들의 나머지를 이용하여 제거된 표본들의 상태(정상 또는 환자)를 예측하도록 발생 되었다. 이러한 절차가 모든 표본들에 대하여 반복되었다. ^†진단 정확도 = (실제 양성의 숫자 + 실제 음성의 숫자)/표본들 총 숫자.

파지-발현된 단백질들의 서열 분석

t-시험과 p 수치 <0.01을 이용하여 추정적인 예측 수치로 인하여 선택된 17 개 파지들은 서열화되어 7 개의 독특한 서열들을 보였던 중복성을 확인하였다. 비록 파지-발현된 단백질들의 동일성이 중요한 진단 검사에 사용을 위해 중요하지 않지만, 서열들이 상이한(독립적인) 스크리닝 방법론을 이용했던 예전의 연구들에서 구해진 서열들과 비교되었고 또한 유전자 은행 데이터베이스와 비교되어 가능한 동일성을 구하였다. 상기 7 개의 클론들로부터 구해진 뉴클레오티드 서열들은 GAGE 7, NOPP140, EEFIA, PMS2L15, SEC15L2, 팍실린(paxillin) 및 BAC 클론 RP11-499F19와 상동성을 보였다.

상기 7 개의 단백질들 중에서, 단백질 합성 장치(machinery)의 구성요소인 EEF1A(진핵 번역 연장 인자 1)와 암 고환 항원인 GAGE7이 몇몇 폐암들 내에서 과잉 발현된다. 팍실린은 세포 접착과 이동을 조절하는 핵심적인 부착 단백질이다. 팍실린의 변종 발현과 비정상 활성은 폐암을 포함하여 몇몇 악성들에서 공격적인 전이성 표현형과 관련되어 있다. PMS2L은 DNA 부정합 짝-관련 단백질이지만 어떠한 돌연변이도 암에서 아직까지 확인되지 않았다. 유사하게도, 세포간 이송 단백질(trafficking protein)인 SEC15L2와 전사 활성의 조절에 관련된 핵소체 단백질인 NOPP140은 알려진 악성 회합(association)을 가지지 않는다. 그러나, 그러한 3 가지 단백질들의 생리적인 기능은 각각이 악성 표현형에서 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다.

통계적 모델링과 검사 예측 정확도

더 높은 예측률을 위하여 독특한 7 개의 파지 발현 단백질들을 사용하는 분별자들을 개발하기 위하여, 상기 81 개의 표본들이 무작위로 2 개 군들로 나뉘어졌으며, 하나는 연습 목적들을 위하여 사용되었고 나머지 하나는 검정 목적으로 사용되었다. 로지스틱 회귀는 다수의 파지 발현 표지들의 조합뿐만 아니라 개별 파지 발현 단백질들을 사용하여 예측 정확도에 대한 민감도와 특이성을 계산하기 위하여 이용되었다. 결과들은 5 개의 파지 표지들이 환자 표본들과 연습 세트 내의 정상적인 대조들을 구별하는 상당한 능력을 가졌다는 것을 보여준다. 각각에 대한 ROC AUC는 개별적으로 0.79에서 0.86까지의 범위에 이르렀다. 5 개의 표지들의 조합은 95 % 민감도와 85 % 특이성을 지닌 전도가 좋은 예측률(AUC=0.98)을 달성하였다(표 5).

20 개의 대조 정상 및 20 개의 NSCLC 표본들로 구성된 검정군을 시험하는 통계 모델을 이용하여, 검정은 90 % 민감도와 95 % 특이성을 제공하였다(표 5).

진단 민감도와 특이성를 지닌 분류자들의 회합을 더 조사하기 위하여, 모든 81 개 칩들 상에 leave-one-out 교차 검정을 이용하는 클래스 예측을 실시하였다.

81 개 표본들에 대하여, 민감도와 특이성은 각각 90 %와 87 %였으며, 전체 진단 정확도는 89 %였다(표 6). 모든 81 개 표본들을 사용하여, 해당 클론 ID, 유전자명과 p 수치는 하기와 같다: 1864, GAGE7, p=9.1x10^-9; 1896, BAC 클론 RP11-499F19, p=3.5x10^-8; 1919, SEC15L2, p=1.2x10^-6; 1761, PMS2L15, p=5.2x10^-7; 및 1747, EEFIA, p=5.9x10^-7. 모든 5 개의 표지들은 0.001/262=3.8x10^-6의 본페로니(Bonferroni) 교정을 통과하여 그들 중 하나 이상의 확률을 0.001 미만의 오인 양성으로 만들었다.

그러므로, 전체적으로 5 가지 표지들의 패널은 표본이 5 개 표지들 모두를 포함하였을 경우에 성공적인 확인의 89 % 비율을 지닌 40 명의 NSCLC 환자들과 41 명의 정상인들로부터 온 표본들을 분리하는 데 사용되었다.

예 2-조기 단계 폐암 발견

본 예에서, 단계 I 폐암과 잠재성 질병과 위험-대조된 대조 표본들을 구별할 수 있는 표지들을 확인하는 본 발명에 따른 검사와 방법의 능력이 조사되었다.

인간 피검자들

환자 동의서를 따르면서, 혈장 표본들은 University of Kentucky and Lexington Veterans Administration Medical Center에서 NSCLC 확인된 이력을 지닌 개인들로부터 혈장 표본들이 구해졌다. 비-암 대조들은 Mayo Clinic Lung Screening Trial에 참여한 1520 명의 피검자들로부터 무작위로 선택되었다. 간단히 말해서, 최소 20 개 갑(pack)-년도 흡연 이력이 있는 50 세에서 75 세에 이르는 연령과 연구에 들어온 지 5 년 이내에 다른 악성이 없는 개인들이 CT 스크리닝 시험을 받을 자격이 있었다. Mayo Lung Screening Trial로부터 비-암(non-cancer) 표본들에 더하여, 6 개의 단계 I NSCLC 표본들과 40 개의 사전 진단 표본들이 분석을 위하여 이용될 수 있었다. 사전 진단 표본들은 표본 기증 이후 1 년 내지 5 년에 CT 스크리닝 상의 NSCLC 발생 암들로 진단된 피검자들로부터 얻은 연구 입수에서 뽑은 것이었다.

파지 라이브러리

파지 라이브러리들, 패닝 및 스크리닝은 상기에 기술된 바와 같다.

진단 칩 설계와 항체 측정

상기 고-처리율 스크리닝에서 확인된 2백 12개의 면역반응성 파지에 더하여 120 개의 "공백" T7 파지가 조합되어, 재증폭되고 2 벌씩 단일 진단 칩들로서 FAST 슬라이드들 상에 찍혔다. 복제 칩들은 상기에서 스크리닝을 위하여 기술된 프로토콜을 이용하여 23 개의 단계 I NSCLC와 23 개의 위험-대조된 혈장을 검사하는 데 사용되었다.

통계적 분석

212 개의 파지-발현된 단백질들 각각에 대한 정규화된 Cy5/Cy3 비율은 이전 예에서 기술된 바와 같이 JMP 통계적 소프트웨어(SAS, Inc., Cary, NC)를 이용하여 t-시험에 의하여 23 개의 환자와 23 개의 대조 표본들 사이의 통계적으로 의미있는 차이에 대하여 독립적으로 분석되었다. 46 개 표본들 모두가 사용되어 개별 또는 표지들의 조합을 사용하여 환자와 정상인 표본들을 구별할 수 있는 분별자들을 확립하였다. ROC 곡선들이 예측적인 민감도, 특이성을 비교하도록 발생되었으며, AUC는 결정되었다. 이후에 상기 분별자들은 모든 46 개 표본들에 대하여 leave-one-out 교차-검정을 이용하여 검사되었다.

이후 분별자들의 세트는 Mayo Clinic Lung Screening Trial로부터 102 개 케이스들과 위험-대조된 대조들의 독립된 세트에서 질병의 확률를 예측하는 데 사용되었다. 흡연과 다른 비-악성 폐암의 효과적인 효과들도 평가되었다.

예측 능력을 추정하기 위한 46 개 모든 표본들을 검사하여 달성된 각각의 개별 표지에 대한 ROC AUC는 .74에서 .95에 이르며 5 개 표지들의 조합은 조기 상태 환자 표본들과 위험-대조된 대조들(AUC=0.99)을 구별하는 의미있는 능력을 나타내었다. leave-one-out 교차-검정을 이용하여 계산된 민감도와 특이성은 각각 91.3 %와 91.3 %이었다(표 7).

진단 전 0 년 내지 5 년에서 뽑은 46 개의 표본들과 스크리닝된 모집단으로부터 얻은 56 개의 위험-대조된 표본들을 포함했던 Mayo Clinic CT Screening 시험으로부터 표본 코호트 이후에 독립적인 데이터 세트로서 분석되었다. 결과들은 49/56 비암 표본들, CT 스크리닝 상에 방사선촬영 발견시에 뽑은 6/6 암 표본들, 진단 전 1 년에 뽑은 9/12 표본들, 진단 전 2 년에 뽑은 8/11, 진단 전 3 년에 뽑은 10/11, 진단 전 4 년에 뽑은 4/4 및 진단 전 5 년에 뽑은 1/2 표본들의 정확한 분류를 나타내었으며, 이는 87.5 % 특이성과 82.6 % 민감도에 해당한다. 검사에 의하여 부정확하게 분류된 8 개의 사전 암 표본들 중 3 개는 기관지폐포 세포 이력을 가졌었다.

시험 세트들에서, 6/6 비-암 대조들은 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD)의 임상 진단으로 적절히 확인되었으며, 사르코이드증을 지닌 한 개인과 유방암의 간격 진단(interval diagnosis)을 받은 한 개인. 후자의 독립적인 시험 세트에서, 국소화된 전립선암을 지닌 두 명의 개인들도 정확히 정상인 것으로 분류되었다. 유방암으로 사전 진단되었던(진단 전 >5 년) 한 개인은 비-암으로 분류되었지만, 2 번째는 암으로 분류되었다. 79 명의 비-암 피검자들 중 34 명은 CT 스캐닝들의 스크리닝 상에 양성으로 발견된 결절들을 가졌다. 현재 흡연하고 있는 이력과 과거 흡연의 이력은 시험의 예측성 정확도에 영향을 주는 것 같지 않았다. 또한 진단의 시점과 검사 민감도와는 관련이 없었다.

파지-발현된 단백질들의 서열 분석

5 개의 예측된 파지-발현된 단백질들의 뉴클레오티드 서열들은 유전자 은행 데이터베이스와 비교되었다. 최종 예측 모델에서 사용된 5 개 클론들로부터 구해진 뉴클레오티드 서열들은 팍실린, SEC15L2, BAC 클론 RP11-499F19, XRCC5 및 MALAT1과 대단한 상동성을 보였다. 처음 3 개는 이전 예에서 기술된 진전된 단계 폐암을 지닌 환자들로부터 얻은 혈장과 면역반응성으로 확인되었다. XRCC5는 몇몇 폐암들에서 과잉 발현된 DNA 복구 유전자이다. 중심 부착 단백질인 팍실린의 비정상적인 활성과 벗어난 이상 발현은 폐암과 다른 악성들에서 적극적인 전이성 표현형과 관련되어 있다. MALAT1은 폐암에서 이상적으로 발현되는 것으로 알려진 조절 RNA이다.

폐암에 대한 방사선촬영 스크리닝을 보충하는 당해 검사의 잠재력은 이러한 5 가지 항체 표지들의 조합된 측정들이 정확히 방사선촬영 발견 전 1 년 내지 5 년에 뽑은 혈액으로부터 6/6 유병률 암들과 32/40 발생 암들뿐만 아니라, Mayo Clinic Lung Screening Trial로부터 얻은 49/56 비-암 표본들을 정확히 예측하였는데 이는 87.5 % 특이성과 82.6 % 민감도에 해당하며, 여기 후속 검정에서 인식될 수 있다.

Mayo Clinic Lung Screening Trial의 최초 보고에 의하면 CT 단독에 의하여 진단된 35 명의 NSCLC 기술하였으며, 객담 세포 검사만으로 발견된 하나의 NSCLC 및 매년 스크리닝 스캐닝들 사이에서 임상적으로 발견된 한 명의 단계 IV NSCLC였으며, 이는 CT 스캐닝 단독의 94.5 %에 해당한다. 또한, 최초 년도 발생 스캔을 따르는 회고적인 검토에 의하면 작은 폐 결절들은 유병률 스캐닝들이 26 %에 미치지 못하였는데, 이는 다른 CT 스크리닝 시험들에서 보고된 의미있는 가양성률과 일치한다. 과거에 확인된 결절들의 지름은 231 명의 참여자들에게서(375 명의 참여자들의 62 %) 4 ㎜였으며, 173 명(37 %)에서 4-7 ㎜ 및 6 명에게서 8-20 ㎜였다. 그래서, NSCLC에 대한 자가항체 프로파일링의 82.6 % 민감도는 CT 스크리닝 단독의 민감도에 상당히 필적하며, 비교에 의하여 작은 종양들에 대하여 특히 잘 작동할 수 있으며 잠재성 질병의 발견에서 비할 바 없는 진전을 나타낸다. 또한, 당해 검사의 87.5 % 특이성은 CT 스캐닝의 특이성을 훨씬 뛰어넘는 것이며, 양성 폐 결절들의 백분율이 위험에 처한 모집단에서 증가함에 따라 Mayo Clinic Screening Trial에서의 참가자들의 69 % 레벨로 뛰어오르면 더욱 중요해 진다.

하기 표 7은 연습군에서의 로지스틱 회귀 및 leave-one-out 검정에 관한 것이다:

파지 클론	연습*			검정†
	AUC§	특이성, %	민감도, %	특이성, %	민감도, %
L1919	0.85	82.6	78.3	82.6	60.9
L1896	0.95	87	87	87	87
G2004	0.80	82.6	65.2	82.6	65.2
G1954	0.74	82.6	87	73.9	69.6
G1689	0.82	82.6	65.2	82.6	65.2
5 개 조합	0.99	100	95.7	91.3	91.3

^*23 개의 높은 위험 정상 및 23 개의 NSCLC 단계-환자 표본들로 구성된 연습 세트.

^†Leave One-Out 검정: 45 개의 경우들과 대조들에 근거한 단독 표본의 예측 구성된 검정 세트.

^§AUC: ROC 곡선하의 면적

상기 5 개 표지들은 정확히 잠재성과 I 단계 폐암으로 정확히 검사되었다.

한 피검자 내에서 다섯 개의 표지들의 존재는 표준적인 방법론을 이용하는 진단 전에 암을 예측할 수 있고 예측하였다. NSCLC 세포들과 결합하는 순환하는 항체들은 이용가능한 방법들을 이용가능한 방법론들을 이용하여 현재 음성으로 진단된 환자들에게서 존재한다.

여기에 인용된 모든 기준들은 여기에 그대로 참고로 포함된다.

여기에서 가르친 사항들에 당해 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형을 가할 수 있다는 것은 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Kentucky 20/20 Gene Systems Hirschowitz, Edward A. Zhong, Li Stromberg, Arnold J. Khattar, Nada H. <120> Lung Cancer Diagnostic Assay <130> 0712.0006C <150> PCT/ US 06/060796 <151> 2006-11-10 <150> 60/806,778 <151> 2006-07-08 <150> 60/735,418 <151> 2005-11-10 <150> 60/735,555 <151> 2005-11-10 <160> 55 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu Glu Arg Asn His Val Asn Val Asn Ser Val Val Asn Pro Leu 1 5 10 15 Val Ile Leu Leu Pro Ile Glu Tyr Ile Lys Glu Leu Thr Leu Glu Lys 20 25 30 Ser Leu Met Asn Ile Arg Asn Val Gly Lys His Phe Ile Val Pro Asp 35 40 45 Pro Ile Val Asp Met Lys Gly Phe Thr Trp Glu Lys Arg Leu Ile Asn 50 55 60 Val Arg Asn Val Glu Lys His Ser Arg Val Pro Val Met Phe Val Tyr 65 70 75 80 Met Lys Gly Pro Thr Leu Gly Lys Ile Ser Met Asn Val Ser Ser Val 85 90 95 Gly Lys His Tyr Pro Leu Leu Gln Val Phe Lys His Thr 100 105 <210> 2 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Lys Val Asp Val Thr Ser Thr Gln Lys Glu Ala Glu Asn Gln Arg 1 5 10 15 Arg Val Val Thr Gly Ser Val Ser Ser Ser Arg Ser Ser Glu Met Ser 20 25 30 Ser Ser Lys Asp Arg Pro Leu Ser Ala Arg Glu Arg Arg Arg Gln Ala 35 40 45 Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 50 55 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Ser Arg Arg Asn Gln Asn Cys Ala Thr Glu Ile Pro Gln Ile Val Glu 1 5 10 15 Ile Ser Ile Glu Lys Asp Asn Asp Ser Cys Val Thr Pro Gly Thr Arg 20 25 30 Leu Ala Arg Arg Asp Ser Tyr Ser Arg His Ala Pro Trp Gly Gly Lys 35 40 45 Lys Lys His Ser Cys Ser Thr Lys Thr Gln Ser Ser Leu Asp Ala Asp 50 55 60 Lys Lys Phe 65 <210> 4 <211> 56 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Arg Asn Thr Ile Leu Arg Gln Ala Arg Asn His Lys Leu Arg Val Asp 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gln Ala Lys Ser Asp Glu Lys 20 25 30 Ala Ala Val Ala Gly Lys Lys Pro Val Val Gly Lys Lys Gly Lys Ala 35 40 45 Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 50 55 <210> 5 <211> 86 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Tyr Trp Val Gly Glu Asp Ser Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Val Ile Leu 1 5 10 15 Ile Asp Pro Phe His Lys Ala Ile Arg Arg Asn Pro Asp Thr Gln Trp 20 25 30 Ile Thr Lys Pro Val His Lys His Arg Glu Met Arg Gly Leu Thr Ser 35 40 45 Ala Gly Arg Lys Ser Arg Gly Leu Gly Lys Gly His Lys Phe His His 50 55 60 Thr Ile Gly Gly Ser Arg Arg Ala Ala Trp Arg Arg Arg Asn Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu His Arg Tyr Arg 85 <210> 6 <211> 70 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Lys Leu Leu Ser Ile Ser Gly Lys Arg Ser Ala Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Val Pro Gln Lys Lys Val Lys Leu Ala Ala Asp Glu Asp Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Phe 35 40 45 Asp Asp Glu Glu Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val Lys Lys Ser Ile Arg 50 55 60 Asp Thr Pro Ala Lys Asn 65 70 <210> 7 <211> 141 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> X may be any naturally occurring amino acid <400> 7 Asn Lys Pro Ala Val Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val Lys Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Pro Lys Gln Pro Val Gly Gly Gly Gln Lys Leu Leu Thr Arg Lys 20 25 30 Ala Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu 35 40 45 Lys Thr Lys Lys Met Val Ala Thr Thr Lys Pro Lys Ala Thr Ala Lys 50 55 60 Ala Ala Leu Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Pro Gln Gly Ser Arg Asp 65 70 75 80 Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Lys 85 90 95 Thr Ser Lys Ser Ala Val Lys Lys Lys Pro Gln Lys Val Ala Gly Gly 100 105 110 Ala Ala Pro Xaa Lys Pro Ala Ser Ala Lys Lys Gly Lys Ala Glu Ser 115 120 125 Ser Asn Ser Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ser Glu Glu Glu 130 135 140 <210> 8 <211> 84 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Ala Ser Phe Pro Gln His His His Pro Gly Ile Pro Gly Val Ala His 1 5 10 15 Ser Val Ile Ser Thr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Phe 20 25 30 Pro Thr Gln Ala Ile Leu Pro Pro Ala Pro Ser Ser Tyr Phe Ser His 35 40 45 Pro Thr Ile Arg Tyr Pro Pro His Leu Asn Pro Gln Asp Thr Leu Lys 50 55 60 Asn Tyr Val Pro Ser Tyr Asp Pro Ser Ser Pro Gln Thr Ser Gln Ser 65 70 75 80 Trp Tyr Leu Gly <210> 9 <211> 84 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Pro Lys Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Pro Ala Lys Val 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Asp Lys Ser Ser Asp Lys 20 25 30 Lys Val Gln Thr Lys Gly Lys Arg Gly Ala Lys Gly Lys Gln Ala Glu 35 40 45 Val Ala Asn Gln Glu Thr Lys Glu Asp Leu Pro Ala Glu Asn Gly Glu 50 55 60 Thr Lys Thr Glu Glu Ser Pro Ala Ser Asp Glu Ala Gly Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ala Lys Ser Asp <210> 10 <211> 63 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Ala Met Phe Phe Ile Gly Phe Thr Ala Leu Val Ile Met Trp Gln Lys 1 5 10 15 His Tyr Val Tyr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Phe Asp Lys Glu Trp Val 20 25 30 Ala Lys Gln Thr Lys Arg Met Leu Asp Met Lys Val Asn Pro Ile Gln 35 40 45 Gly Leu Ala Ser Lys Trp Asp Tyr Glu Lys Asn Glu Trp Lys Lys 50 55 60 <210> 11 <211> 68 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 11 Ala Thr Lys Lys Lys Ser Lys Asp Lys Glu Lys Asp Arg Glu Arg Lys 1 5 10 15 Ser Glu Ser Asp Lys Asp Val Lys Val Thr Arg Asp Tyr Asp Glu Glu 20 25 30 Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Glu Lys Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Pro 35 40 45 Ile Glu Thr Gly Ser Pro Lys Thr Lys Glu Cys Ser Val Glu Lys Gly 50 55 60 Thr Gly Asp Ser 65 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 12 Glu Ser Phe Lys Arg Leu Val Thr Pro Arg Lys Lys Ser Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Glu Glu Lys Ser Glu Asp Ser Ile Ala Gly Ser Gly Val Glu His 20 25 30 Ser Thr Pro Asp Thr Glu Pro Gly Lys Glu Glu Ser Trp Val Ser Ile 35 40 45 Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Arg Lys Lys Arg Pro Asp Gly Lys Gln 50 55 60 Glu Gln Ala Pro Val Glu Asp Ala Gly Pro Thr Gly Ala Asn Glu Asp 65 70 75 80 Asp Ser Asp Val Pro Ala Val Val Pro Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Val 85 90 95 Glu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 100 105 <210> 13 <211> 85 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser Arg Pro Ser Ser Ser Val Met Lys 1 5 10 15 Trp Asn Gln Gln His Leu Lys Lys Gly Asn Gln Gln Leu Asn Val Arg 20 25 30 Ile Leu Gln Leu Leu Arg Arg Glu Arg Met Arg Glu His Leu Gln Val 35 40 45 Lys Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ile Val Arg Asn Arg Val Thr His Arg 50 55 60 Leu Gly Val Ser Val Lys Met Val Leu Met Gly Arg Arg Trp Thr Arg 65 70 75 80 Gln Ile Gln Arg Arg 85 <210> 14 <211> 97 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 14 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Ser Pro Glu Gln Phe Ser Asp Glu Val 1 5 10 15 Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr Gln Arg Gln Asp 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala Ser Ala Gly Gln 35 40 45 Gly Pro Lys Pro Glu Ala His Ser Gln Glu Gln Gly His Pro Gln Thr 50 55 60 Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu Met Asp Pro Pro 65 70 75 80 Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Gly Glu Lys Gln Ser Gln 85 90 95 Cys <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 15 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys His Gly Thr Val Glu Leu Gln Gly Ser 1 5 10 15 Gln Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Gly Ser Val Gly Ile Gly Asn Leu Gln 20 25 30 Arg Thr Ser Ser Gln Arg Ser Thr Leu Thr Tyr Gln Arg Asn Asn Tyr 35 40 45 Ala Leu Asn Thr Thr Ala Thr Tyr Ala Glu Pro Tyr Arg Pro Ile Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gln Glu Cys Asn Tyr Asn Arg Leu Gln His Ala Val Pro 65 70 75 80 Ala Asp Asp Gly Thr Thr Arg Ser Pro Ser Ile Asp Ser Ile Gln Asp 85 90 95 His Ala Arg Gln Thr Pro Trp Gly Pro Ser Glu Ala Cys Gly Arg Thr 100 105 110 Arg Val Thr Ser 115 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 16 Leu Ala Phe Val Pro Ile Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Leu Glu 1 5 10 15 Pro Ser Ala Asn Met Pro Trp Phe Lys Gly Trp Lys Val Thr Arg Lys 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Ser Gly Thr Thr Leu Leu Glu Ala Leu Asp Cys Ile 35 40 45 Leu Pro Pro Thr Arg Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln 50 55 60 Asp Val Tyr Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val 65 70 75 80 Glu Thr Gly Val Leu Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val 85 90 95 Asn Val Thr Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala 100 105 110 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser Ile Ser Leu Lys Phe Gln Ala Met 1 5 10 15 Asp Val Gly <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 18 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys His Leu Ile Glu Val Ser Gly Asn Gly 1 5 10 15 Cys Gly Val Glu Glu Glu Asn Phe Glu Gly Leu Ile Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Glu Thr Ser His Ile 35 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 19 Leu Gly Asp Arg Thr Leu Gly Pro Lys Val His Thr Leu His Ser Leu 1 5 10 15 Val Lys Thr Arg Arg Pro Gly Asn Lys Lys Gly Ser Pro Asn Thr Ala 20 25 30 Val Tyr Lys Thr Val Leu Val Ser Tyr Glu Val Lys Glu Gly Glu Ser 35 40 45 Gln Ser Cys Ser Gln Phe Thr Cys Leu Cys 50 55 <210> 20 <211> 143 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> X may be any naturally occurring amino acid <400> 20 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Leu Leu Leu Lys Val Ile Ile Leu Gly 1 5 10 15 Asp Ser Gly Val Gly Lys Thr Ser Leu Met Asn Gln Tyr Val Asn Lys 20 25 30 Lys Phe Ser Asn Gln Tyr Lys Ala Thr Ile Gly Ala Asp Phe Leu Thr 35 40 45 Lys Glu Xaa Met Val Asp Asp Arg Leu Val Thr Met Gln Ile Trp Asp 50 55 60 Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Gln Ser Leu Gly Val Ala Phe Tyr Arg 65 70 75 80 Gly Ala Asp Cys Cys Val Leu Val Phe Asp Val Thr Ala Pro Asn Thr 85 90 95 Phe Lys Thr Leu Asp Ser Trp Arg Asp Glu Phe Leu Ile Gln Ala Ser 100 105 110 Pro Arg Asp Pro Glu Asn Phe Pro Leu Val Cys Phe Arg Gly Gln Ser 115 120 125 Cys Phe Pro Thr Gln Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 130 135 140 <210> 21 <211> 77 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X may be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> X may be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> XX may be any naturally occurring amino acids <400> 21 Cys Ser Gly Thr Xaa Thr Ile Ser Asp Ile Ala Gly Gln Pro Gly Pro 1 5 10 15 Leu Met Pro Cys Met His Leu Arg Pro Phe Xaa Gly Gln Leu Val Lys 20 25 30 Gln Met Leu Asp Asp Phe Xaa Xaa His Arg Tyr Ile Ala Asn Leu Gly 35 40 45 His Gly Leu Tyr Pro Asp Met Asp Pro Glu His Val Gly Ala Phe Val 50 55 60 Asp Ala Val His Lys His Ser Arg Leu Leu Arg Gln Asn 65 70 75 <210> 22 <211> 85 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 22 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser Arg Pro Ser Ser Ser Val Met Lys 1 5 10 15 Trp Asn Gln Gln His Leu Lys Lys Gly Asn Gln Gln Leu Asn Val Arg 20 25 30 Ile Leu Gln Leu Leu Arg Arg Glu Arg Met Arg Glu His Leu Gln Val 35 40 45 Lys Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ile Val Arg Asn Arg Val Thr His Arg 50 55 60 Leu Gly Val Ser Val Lys Met Val Leu Met Gly Arg Arg Trp Thr Arg 65 70 75 80 Gln Ile Gln Arg Arg 85 <210> 23 <211> 97 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 23 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Ser Pro Glu Gln Phe Ser Asp Glu Val 1 5 10 15 Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr Gln Arg Gln Asp 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala Ser Ala Gly Gln 35 40 45 Gly Pro Lys Pro Glu Ala His Ser Gln Glu Gln Gly His Pro Gln Thr 50 55 60 Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu Met Asp Pro Pro 65 70 75 80 Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Gly Glu Lys Gln Ser Gln 85 90 95 Cys <210> 24 <211> 301 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 tccggggacg aattcctggt agcctcattc agccgatgga aggtagaagg gactcagaac 60 ttcaggcctn attctgcgtt tttgtatgcc ccaagaatga aagggctctt tgtgaatttg 120 catgtagatt tatttaacat tcaaccggca gaaaacggaa ggtagtgcat gacactgggg 180 ggaaccaggc ccccgcccac ctcacatcgt catggcatta gctgtttact ggctcccgtg 240 gaaacattgg aaggggattt gttttgtggt tgggtttcct tttttttttt tttttaacca 300 g 301 <210> 25 <211> 354 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (332)..(332) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 gattcttcct acctttgtca gctactgagt tgcttctggg gagggaagta cttccttgcc 60 cctccccaac ccccctacct caccatatcc tatcatatct tgatagtcat ggggaagagg 120 atgtgcacac agacatacaa atttcctcaa agctggagag accaggctac atgtgagctc 180 atagatgctg ctgaggctca tcctgagggc tggatggttg gccagggttt cagaatgagg 240 gtaagggatg agcactgcca cccaagcttg cggccgcact cgagtaacta gttaacccct 300 tggggcctct aaacgggtct tgaggggtta antagtgact cgagtgcggc cgca 354 <210> 26 <211> 533 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (433)..(433) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 atgctcgggg atccgaattc aagcatctca ttgaagtttc aggcaatgga tgtggggtag 60 aagaagaaaa cttcgaaggc ttaatctctt tcagctctga aacatcacac atctaagatt 120 cgagagtttg ccgacctaac tcgggttgaa acttttggct ttcaggggaa agctctgagc 180 tcactttgtg cactgagtga tgtcaccatt tctacctgcc acgtatcggc gaaggttggg 240 actcgactgg tgtttgatca cgatgggaaa atcatccaga aaacccccta cccccacccc 300 agagggacca cagtcagcgt gaagcagtta ttttctacgc tacctgtgcg ccataaggaa 360 tttcaaagga atattaagaa gtacagaacc tgctaaggcc atcaaaccta ttgatcggaa 420 gtcagtccat canatttgct ctgggccggt ggtactgagt ctaagcactg cggtgaagaa 480 gatagtagga aacagtctgg atgctggtgc cactaatatt gatctaaagc ttg 533 <210> 27 <211> 455 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (410)..(410) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (431)..(431) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (436)..(436) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 gggacgatta gctagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac atgctggagc 60 caagtgctaa catgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgtaaggat ggcaatgcca 120 gtggaaccac gctgcttgag gctctggact gcatcctacc accaactcgt ccaactgaca 180 agcccttgcg cctgcctctc caggatgtct acaaaattgg tggtattggt actgttcctg 240 ttggccgagt ggagactggt gttctcaaac ccggtatggt ggtcaccttt gctccagtca 300 acgttacaac ggaagtaaaa tctgtcgaaa tgcaccatga agcttgcggc cgcactcgag 360 taactagtta accccttggg gcctctaaac gggtcttgga ggggttaacn agttgctcga 420 gtggggcggc nggctncttg gtggtttatt tcaga 455 <210> 28 <211> 523 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 28 ctcggggatc cgaatttcaa gcggcaagaa gtttcagaat aagaaaatga aaaacaagct 60 aagacaagta ttggagaagt atagaagata gaaaaatata aagccaaaaa ttggataaaa 120 tagcactgaa aaaatgagga aattattggt aaccaattta ttttaaaagc ccatcaattt 180 aatttctggt ggtgcagaag ttagaaggta aagcttgaga agatgagggt gtttacgtag 240 accagaacca atttagaaga atacttgaag ctagaagggg aagcttgcgg ccgcactcga 300 gtaactagtt aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggttaact cgagttactc 360 gtgggcgcag ctctttgctt agtattttta atggttggtt gtaacctttc gtttctcatc 420 gccgaattat gatggtttta aataatgatc ataattcttt ctttttactt ggtttttttt 480 tttcactttt actttctgtt tatgaagcac gcccgcccca caa 523 <210> 29 <211> 418 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 29 atgctcgggg atccgaattc agcttgggaa cgcggccatt tcaaagggga agccaaaatc 60 tcaagaaatt cccagcaggt tacctggagg cggatcatct aattctctgt ggaatgaata 120 cacacatata tattacaagg gataagcttg cggccgcact cgagtaacta gttaacccct 180 tggggcctct aaacgggact tgaggggtaa gctagttact cgagggcgag cttatgggaa 240 atatatattg cggtatttaa ggaattagtt acccgctcgc tggcctttga actgttgttt 300 gaggccttaa attgatgatc gtggtgggaa acaagaggtg gggtgggaga tttgtttttt 360 gttctgaagc ggggagggga ctagacccta aaagcattta aatataagac aacccaat 418 <210> 30 <211> 416 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (233)..(233) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 gggacgatca gcattgaatg aatgttggct acaaaatcaa ttcttggtgt tgtatcagag 60 gagtaggaga gaggaaacat ttgacttatc tggaaaagca aaatgtactt aagaataaga 120 ataacatggt ccattcacct ttatgttata gatatgtctt tgtgtaaatc atttgttttg 180 agttttcaaa gaatagccca ttgttcattc ttgtgctgta caatgaccac tgnttattgt 240 tactttgact tttcagagca cacccttcct ctggtttttg tatatttatt gatggatcaa 300 taataatgag gaaagcatga tatgtatatt gctgagttgt tagcctttta agcttgcggc 360 cgcactcgag taactagtta accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggtta 416 <210> 31 <211> 499 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (110)..(111) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (250)..(250) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (257)..(257) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (423)..(423) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (444)..(444) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (453)..(453) <223> nn is a, c, g, or t <400> 31 ggtacgaatt agccaganat cggggcgagt acaatgggga tgtgggcgcg ggagccccgc 60 tccccttttt tagcagcacc tcccagcccc gcagaataaa accgatcgcn ncccctccgc 120 gcgcgccctc ccccgagatg cggagcggga ggaggcggcg gcggccgagg aggaggagga 180 ggaggccccg gaggaggagg cgttggaggt cgaggcggag gcggaggagg aggaggccga 240 ggcgccggan gaggccnagg cgccggagca ggaggaggcc ggccggaggc ggcatgagac 300 gagcgtggcg gccgcggctg ctcggggccg cgctggttgc ccattgacag cggcgtctgc 360 agctcgcttc aagatggccg cttggctcgc attcattttc tgctgaacga cttttaactt 420 tcnttgtctt ttccgcccgc ttcnatcgcc tcncgccggc tgctctttcc gggatttttt 480 atcaagcaga aatgcatcg 499 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 32 attgtgaata agcataaggt t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 33 gagcggtctc tgagtccgat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 34 ttgagtcaga atccgcataa g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 35 aatgcgagtc ataagtgttc t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 36 aatgcgctgg ctaatccttc g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 37 gcgaagccgc cgaagctgtc t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 38 agggctctgg atccggattc g 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 39 atactactgg gtcgcctctg t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 40 aaggttaata ctcatcatac t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 41 ctgtttctga cggcgcaggc g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 42 tttaattggt ataattcgtc g 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 43 cttccgcatc agctgcggtg g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 44 cttgcgtggt atgcgaagag t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 45 aagattggga cggcgtggct t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 46 acgcctactc atggtgggaa g 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 47 actcctactt atgcggggta t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 48 atgccggcta ctacgcctca g 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 49 aaggcgtggt ttgggcagat t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 50 aagaattggt ttggtcatac g 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 51 catactcatc atgataagca t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 52 attacgaata agtgggggta t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 53 ctgaatacgc attcgtctca g 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 54 gggcctgcgt gggaggatcc g 21 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 55 agtcagtctt atcataagcg tactagc 27

Claims (23)

1. (a) 환자로부터 얻은 유체 표본을 제공하는 단계;

   (b) 상기 표본 내의 폐암과 관련된 표지의 존재를 결정하는 단계; 및

   (c) 상기 표본 내의 상기 표지를 가진 환자들을 시험하는 방사선촬영을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암에 대한 방사선촬영 시험을 받는 환자를 선별하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 표지는 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 환자는 무증상인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 환자는, 폐암을 방사선촬영상으로 발견할 수 없는, 높은 위험의 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 1에 있어서,

   상기 표지는, 방사선촬영상으로 발견할 수 있는 폐암이 상기 환자 내에 존재 하기 이전 최대 5년간 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 폐암 표지를 포함하는 조성물로서, 상기 표지는 방사선촬영상으로 발견할 수 있는 폐암이 상기 환자 내에 존재하기 이전 최대 5년간 환자의 유체 표본 내에 존재하는 분자의 결합 파트너(binding partner)인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 청구항 6에 있어서,

   상기 표본 내의 상기 분자는 자가항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 청구항 6에 있어서,

   비드(bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 청구항 6에 있어서,

   막을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 청구항 6에 있어서,

    평면(planar surface)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 청구항 6에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
12. 청구항 11에 있어서,

    마이크로어레이(microarray)를 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
13. (1) 피검자로부터 표본을 제공하는 단계; 및

    (2) 폐암과 관련된 적어도 두 개의 표지들의 존재에 대하여 상기 표본을 분석하는 단계로서;

    (a) 상기 표지들의 적어도 반이 상기 표본 내에 존재한다면 폐암이 상기

    피검자 내에 존재할 수 있다; 또는

    (b) 폐암은 상기 피검자 내에서 하기의 조건이 있다면 존재할 수 있다

    (i) 상기 표본 내에서 상기 적어도 두 개의 표지들의 각각의 존재와

    상관되는 정규화된 수치를 획득하는 경우,

    (ii) 합계를 내놓기 위하여 상기 정규화된 수치들을 모으는 경우;

    및

    (iii) 상기 합계를 상기 적어도 두 개 표지들의 폐암의 최대 예측

    수치인 기준 수치와 비교하는 경우로서, 상기 합계가 상기 기준 수

    치의 적어도 30 %인 경우

    상기 (1), (2) 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 피검자 내의 폐암의 존재 가능성을 발견하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서,

    상기 적어도 두 개의 표지들은 자가항체들인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 13에 있어서,

    적어도 세 개의 표지들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 13에 있어서,

    적어도 네 개의 표지들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 13에 있어서,

    적어도 다섯 개의 표지들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 13에 있어서,

    적어도 여섯 개의 표지들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 적어도 두 개의 폐암 표지들과 고체상(solid phase)을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 장치.
20. 청구항 19에 있어서,

    상기 표지들은 자가항체들의 에피토프들인 것을 특징으로 하는 장치.
21. 청구항 19에 있어서,

    상기 고체상은 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
22. 청구항 19에 있어서,

    상기 고체상은 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
23. 청구항 19에 있어서,

    어레이를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.