ES2216295T5 - Metodo para la identificacion de antigenos tumorales con autoanticuerpos en suero. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para identificación de antígenos de proteínas celulares para los que pueden desarrollar autoanticuerpos pacientes con cáncer, o pacientes con riesgo de cáncer. El procedimiento de la invención implica el uso de sueros derivados del paciente para la identificación de los antígenos de proteínas celulares usando electroforesis de gel bidimensional seguida por análisis de Western Blot. La identificación de tales antígenos de proteínas proporciona nuevos marcadores que se pueden utilizar para apantallamiento, para diagnosis y pronóstico de la enfermedad. La invención prevé también el uso de los antígenos de proteínas identificados en inmunoensayos diseñados para detectar la presencia de anticuerpos de suero a la proteína específica diseñada para detectar la presencia de anticuerpos de suero a los antígenos de proteínas específicos en sueros a partir de individuos que pueden albergar tales anticuerpos. La invención se refiere además al uso de los antígenos identificados como inmunogenes para estimulación de una respuesta inmune en pacientes que expresan tales antígenos de proteínas. La invención se demuestra, a modo de ejemplo, en que niveles elevados de anticuerpos circulantes reactivos contra un antígeno específico de tumor se identificaron en sueros derivados de un paciente con cáncer de pulmón. Además, se detectaron niveles elevados de anticuerpos circulantes reactivos contra varias isoformas específicas de {be}-tubulina en los sueros de pacientes con neuroblastoma.

Description

Método para la identificación de antígenos tumorales con autoanticuerpos en suero.

La presente invención se refiere a un método para la identificación de antígenos proteicos celulares, contra los que los pacientes con cáncer o pacientes con riesgo de cáncer, pueden desarrollar autoanticuerpos. El método de la invención implica el uso de sueros derivados de pacientes para la identificación de los antígenos proteicos celulares utilizando electroforesis en gel bidimensional seguido del análisis Western blot (inmunotransferencia). La identificación de dichos antígenos proteicos proporciona marcadores novedosos que se pueden utilizar para la detección, el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. La invención también proporciona el uso de antígenos proteicos identificados en inmunoensayos diseñados para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra antígenos proteicos específicos en sueros de individuos que pueden portar tales anticuerpos. La invención también se relaciona con el uso de los antígenos identificados como inmunógenos para la estimulación de una respuesta inmunitaria en pacientes que expresan dichos antígenos proteicos. La invención se ha demostrado, por ejemplo, al haberse identificado niveles elevados de autoanticuerpos circulantes reactivos frente a un antígeno específico tumoral en sueros de un paciente con cáncer de pulmón. Además, se han detectado niveles elevados de autoanticuerpos circulantes reactivos frente a varias isoformas específicas de la \beta-tubulina en los sueros de los pacientes con neuroblastoma.

Se sabe que en pacientes con determinadas enfermedades, como enfermedades autoinmunes y trastornos cardiovasculares, se producen autoanticuerpos contra proteínas celulares normales o anómalas, en algunos casos incluso antes de que se hayan manifestado los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, este tipo de autoanticuerpos raramente se han observado, si acaso, en individuos con cáncer. Tales anticuerpos contra proteínas tisulares, por ejemplo, p53, pueden servir como marcadores iniciales de diferentes tipos de cáncer o de otras enfermedades. Su detección o la detección de sus correspondientes antígenos en suero o en otros tejidos y fluidos corporales pueden tener utilidad como indicadores de riesgo de tipos concretos de cáncer o de otras enfermedades, como marcadores diagnósticos o como indicadores pronósticos.

La detección de autoanticuerpos contra antígenos celulares y la identificación de las proteínas que han provocado autoanticuerpos se han llevado a cabo usando varios enfoques. Por ejemplo, el Antígeno Nuclear de Células Proliferantes (PCNA) se describió por primera vez como un antígeno nuclear que se une a los anticuerpos de algunos pacientes con lupus eritematoso (Miyachi, K., Fritzler, M.J., y Tan, E.M., 1978, J. Immunol 121:2228-2234). Posteriormente se observó que los linfocitos en reposo no reaccionaron con el anticuerpo, a diferencia de los linfocitos estimulados por mitógenos que mostraban tinción nuclear. En última instancia, esto llevó a la identificación de la proteína denominada PCNA, que es reconocida por este autoanticuerpo en el lupus (Tan E.M., Ogata, K., y Takasaki, Y. 1987, J. Rheumatol., 13:89-96). En algunos otros casos, las proteínas candidatas se individualizan y se investigan con respecto a su capacidad para inducir anticuerpos en pacientes, tal como se investigó para p53 (Crawford, L.V., Firm, D.C., Bulbrook, R.D., 1984, Int J Cancer 30:403-408). Además, una técnica denominada SEREX se basa en el análisis serológico de las librerías de expresión de ADNc recombinante para la identificación de antígenos tumorales (Old, L. et al., 1998, J. Exp. Med. 187:1163-1167).

Asimismo, los documentos WO-A-92/18535 y WO-A-94/28021 describen un método para la detección de antígenos y los correspondientes autoanticuerpos asociados a la endometriosis en un sujeto. Aunque Bachvaroff (1980, PNAS USA, 77, 4979-4983 describe la aparición de elementos del citoesqueleto, tales como la tubulina, en células leucémicas. Por lo tanto, se han seguido muchos enfoques para buscar proteínas contra las que se podrían producir autoanticuerpos.

Para separar proteínas de mezclas complejas, tales como tejidos o fluidos corporales, se ha utilizado habitualmente la combinación de dos métodos de electroforesis diferentes (la denominada electroforesis "bidimensional" o electroforesis "2D"). El primer paso de electroforesis separa generalmente proteínas según su carga. El segundo paso de electroforesis separa generalmente proteínas según su peso molecular. El uso de la electroforesis bidimensional de alta resolución permite la separación simultánea de hasta varios miles de proteínas individuales, ofreciendo así un mapa de proteínas global de la mezcla de proteína analizada. Las proteínas separadas se pueden visualizar en el gel mediante tinción con varios compuestos colorantes, como el azul de Coomassie o la plata. Alternativamente, las mezclas que contienen proteínas marcadas isotópicamente, tales como la ^{25}S-metionina pueden visualizarse mediante autorradiografía.

Se han desarrollado métodos para la identificación de proteína(s) que reacciona(n) con un anticuerpo específico entre un número elevado de proteínas separadas por electroforesis bidimensional. La técnica Western blotting puede revelar fácilmente la proteína con la que reacciona el anticuerpo si la proteína es suficientemente abundante y el anticuerpo es suficientemente específico y tiene un título suficientemente elevado, es decir, si tiene una afinidad y avidez elevadas. No se ha descrito el uso de sueros totales que puedan contener anticuerpos desconocidos contra antígenos proteicos desconocidos presentes en tumores o en lesiones precancerosas en el Western blotting de geles bidimensionales. Esta técnica podría complicarse teóricamente debido a la gran proporción de reactividad no específica, dificultando así la interpretación de los resultados. Por lo tanto, los métodos de la presente invención que utilizan Western blotting con electroforesis en gel bidimensional de mezclas de proteínas complejas para la identificación de antígenos novedosos para los que existen autoanticuerpos en sueros de pacientes con tumores o con lesiones precancerosas, son novedosos.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para la identificación de antígenos proteicos celulares y para la detección de anticuerpos contra antígenos proteicos celulares específicos en el suero de pacientes con cáncer o con lesiones precancerosas. La identificación de tales antígenos proteicos proporciona marcadores novedosos que se pueden usar para la detección, el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad.

La invención comprende separar mezclas de proteínas que contienen antígenos mediante electroforesis en gel bidimensional seguido por la transferencia de las proteínas separadas en una membrana. Los antígenos específicos de la mezcla de proteínas se detectan mediante el tratamiento de la membrana con sueros de paciente seguido por la detección de los anticuerpos unidos específicamente utilizando un segundo anticuerpo marcado que se une específicamente al primer anticuerpo. Los antígenos proteicos separados se consideran antígenos específicos de la enfermedad si se detectan en presencia de sueros sospechosos de portar autoanticuerpos en comparación con los sueros control. La fuente de proteínas para el análisis bidimensional incluye tumores no fraccionados, células cancerígenas aisladas o células de tumores infiltrantes o líneas celulares cultivadas o fracciones de proteínas subcelulares, tales como proteínas secretadas, proteínas de membrana, proteínas citosólicas o nucleares.

La presente invención también se refiere al uso de los antígenos proteicos de \beta-tubulina identificados en inmunoensayos diseñados para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra los antígenos proteicos específicos. Estos inmunoensayos se pueden utilizar para la detección, el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. De acuerdo con la invención, la medición de los niveles de anticuerpos en una muestra de paciente se puede usar para el diagnóstico precoz de enfermedades como el cáncer. Además, la monitorización de niveles de anticuerpos séricos se puede usar como pronóstico para determinar la progresión de la enfermedad.

En una realización específica de la invención descrita en el presente documento, se detectaron autoanticuerpos circulantes reactivos frente a isoformas específicas de la \beta-tubulina y sus productos de escisión en sueros de pacientes con neuroblastoma. El hallazgo de que las isoformas de la \beta-tubulina son inmunogénicas en pacientes con neuroblastoma proporciona la base para el desarrollo de métodos diagnósticos del neuroblastoma y otros cánceres en los que se expresan estas isoformas de la \beta-tubulina, así como un medio para la monitorización de pronóstico de varios tratamientos terapéuticos de la enfermedad. Además, el descubrimiento de que isoformas específicas de la \beta-tubulina se expresan en células tumorales, proporciona un método para el uso de isoformas específicas de la \beta-tubulina como inmunógenos para la estimulación de una respuesta inmunitaria contra las células tumorales.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Western blots de un adenocarcinoma de pulmón tratado con un suero de un paciente con adenocarcinoma de pulmón.

Figura 1B. Un pulmón normal tratado con suero de un paciente con adenocarcinoma de pulmón.

Figura 2. Western blot de una separación en gel bidimensional de un lisado de un neuroblastoma primario SY5Y tratado con el suero de un paciente recién diagnosticado de neuroblastoma. Se solubilizó una alícuota de proteínas SY5Y en un cóctel de urea y se cargaron 40 microgramos de proteína solubilizada en un gel en tubo con base portadora anfolito (pH 3,8) y se separaron en la primera dimensión durante 12.000 voltios-horas. Después de un paso de equilibrado, el gel en tubo de la primera dimensión se cargó en un cartucho (cassette) que contenía el gel de la segunda dimensión. La electroforesis en la segunda dimensión no se realizó hasta que el colorante indicador presente en el tampón de equilibrado alcanzó el extremo opuesto del gel de la segunda dimensión, respecto al gel de la primera dimensión. Tras la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se incubó previamente con un tampón de bloqueo y posteriormente se incubó con suero obtenido del mismo paciente con neuroblastoma, cuyo tumor se había analizado. El suero se utilizó en una dilución de 1:100, durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con una solución tampón, la membrana se incubó durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgG humano de conejo. Las proteínas reactivas se revelaron con luminol. En un grupo de proteínas coalescentes, marcadas como LP1, se identificó la presencia de isoformas de la \beta-tubulina contra las que existía un anticuerpo en el suero del paciente. Este grupo no se detectó en una inmunotransferencia similar que se había incubado con el suero de pacientes con otros tipos de cáncer o con el suero de individuos
normales.

Figura 3. Western blot de la separación en gel bidimensional de un lisado de proteína de neuroblastoma tratado con el suero de un paciente recientemente diagnosticado de tumor de Wilms. Las condiciones del Western blot se describen en la figura 2. Existe una falta de reactividad en la región de LP1.

Figura 4. Western blot de la separación en gel bidimensional de un lisado de proteína SY5Y tratado con el suero de un paciente recién diagnosticado de neuroblastoma. Las condiciones del Western blot se describen en la figura 2, con la salvedad de que las membranas se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgM humano de conejo. Las proteínas reactivas se revelaron con luminol. En un grupo de proteínas de peso molecular más bajo, marcadas como T1, T2 y T3 se identificó la presencia de isoformas de la \beta-tubulina. Este grupo no se detectó en una transferencia similar que se había incubado con los sueros control.

Figura 5. Western blot de proteínas SY5Y tratadas con un anticuerpo monoclonal que reacciona con \beta-tubulina BI y BII. Las manchas reactivas se identifican como LP1 y T1-T3.

Figura 6. Western blot de proteínas SY5Y tratadas con un anticuerpo monoclonal que reacciona con tubulina BIII. Las marcas reactivas se identifican como LP1 y T1-T3.

Figura 7. Inmunotransferencia de proteínas SY5Y teñidas con azul de Coomassie. Se utilizaron inmunotransferencias similares para escindir las manchas de LP1 para la secuenciación de aminoácidos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención consigue un objetivo muy deseado, concretamente la identificación de nuevos antígenos proteicos, responsables de que los individuos con o con riesgo de padecer diferentes tipos de cáncer, sean portadores de autoanticuerpos contra los antígenos proteicos celulares tumorales. Tales antígenos proteicos pueden a su vez purificarse y utilizarse para detectar en el suero de un paciente la presencia de anticuerpos circulantes contra dichos antígenos, mediante ensayos inmunoabsorbentes sensibles y rápidos o mediante otros procedimientos. La invención también se refiere al uso de nuevos antígenos proteicos para inmunizar pacientes que padecen enfermedades caracterizadas por la expresión de los antígenos proteicos identificados. Se pretende que la estimulación de una respuesta inmunitaria contra dichos antígenos provoque un ataque más eficaz de las células tumorales, tales como entre otras, la inhibición del crecimiento de las células tumorales o la facilitación de la destrucción de las células tumorales.

Específicamente, el método para la identificación de antígenos proteicos celulares tiene las características señaladas en la reivindicación 1 de las reivindicaciones adjuntas.

La invención también se refiere a un método para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer según se define en la reivindicación 6.

Mediante electroforesis bidimensional se pueden preparar y separar en proteínas individuales una gran variedad de mezclas de proteínas que pueden contener antígenos contra los que existen autoanticuerpos en el suero. Se pueden analizar extractos de células completas o fluidos corporales para detectar la presencia de proteínas responsables de la producción de autoanticuerpos. Alternativamente, se pueden someter subgrupos de proteínas, tales como proteínas secretadas, proteínas nucleares o proteínas de membrana a electroforesis bidimensional y analizarlas separadamente de las proteínas que han provocado la producción de autoanticuerpos de manera que en la mezcla aumente la abundancia de estas proteínas. Para aumentar la cantidad de proteínas que han provocado la producción de autoanticuerpos también pueden aplicarse a geles electroforéticos cargas preparativas que consisten en varios miligramos de proteínas de una mezcla.

La ventaja particular de la presente invención es que no se requiere un conocimiento previo relativo a la naturaleza del antígeno. Los autoanticuerpos contra antígenos múltiples se pueden detectar simultáneamente mediante el uso de un procedimiento de separación bidimensional. Adicionalmente, el patrón de reactividad de un suero con un grupo particular de proteínas en los patrones de geles bidimensionales puede ser diagnóstico de un cáncer en concreto o indicativo de riesgo de un cáncer concreto.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que el suero de un individuo que contiene autoanticuerpos, como es el caso de un paciente con cáncer de pulmón o neuroblastoma, se puede usar para identificar antígenos proteicos expresados en células de un tejido particular, como por ejemplo, las células de un tumor o en un tipo celular representativo, contra las cuales el paciente tiene autoanticuerpos. Tal y como se describe en el presente documento, el suero de pacientes con neuroblastoma contenía anticuerpos que eran inmunoespecíficos para las isoformas de la \beta-tubulina.

Identificación de antígenos proteicos asociados a una enfermedad

La presente invención prevé un método para la identificación de antígenos proteicos celulares contra los que los pacientes con cáncer pueden desarrollar autoanticuerpos. El método está validado por el uso de suero de individuos con cáncer y de controles sin cáncer. De un paciente que se sabe que tiene un cáncer concreto se obtiene un fluido corporal susceptible de contener autoanticuerpos como es el suero. De un sujeto control que no tiene cáncer se obtiene un fluido corporal similar que contiene anticuerpos. Adicional o alternativamente, se pueden utilizar tejidos tumorales de otros pacientes con la misma enfermedad. No es necesario utilizar tejidos primarios; el crecimiento celular en cultivo podría ofrecer substitutos adecuados para los tejidos tumorales o controles. Además, se pueden preparar en cultivo subgrupos de proteínas de estos tejidos o de estas células. Tales subgrupos pueden incluir proteínas secretadas, proteínas nucleares, proteínas de membrana u otras fracciones subcelulares.

Se utiliza la electroforesis en gel bidimensional para separar proteínas en mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en la primera dimensión separa por lo general las proteínas en función de su carga, mientras que la electroforesis en la segunda dimensión, conocida como SDS PAGE, separa las proteínas en función de su tamaño.

Antes de realizar la electroforesis en gel bidimensional, se solubilizan alícuotas de tejidos completos o células utilizando cualquiera de una variedad de cócteles de solubilización conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el tejido se puede solubilizar por adición de tampón de lisis que consiste en (por litro) urea 8 M, 20 ml de tensioactivo Nonidet P-40, 20 ml de anfolitos (pH 3,5 - 10), 20 ml de 2-mercaptoetanol y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM en agua desionizada destilada.

Debido a que el isoelectroenfoque es sensible a la modificación de la carga, es importante minimizar las alteraciones de las proteínas (por ejemplo, proteolisis, desamidación de glutamina y asparagina, oxidación de cistina en ácido cístico, carbamilación) que pueden producirse por una preparación inadecuada de la muestra. Así, una vez solubilizadas, las muestras deberán conservarse congeladas a -80ºC durante cortos períodos (< 1 mes) para limitar una modificación significativa de la proteína.

Se pueden cargar en geles individuales alícuotas de aproximadamente 30 \mul que contienen 70 \mug de proteína. Las muestras de proteínas preparadas se cargan en geles electroforéticos para la separación por isoelectroenfoque en la primera dimensión, la cual separa las proteínas en función de su carga. Se pueden utilizar varias preparaciones de gel de la primera dimensión, incluyendo los geles en tubo para las separaciones a base de anfolito portador o tiras de gel para las separaciones con gradiente inmovilizado. Una vez realizada la separación en la primera dimensión, las proteínas se transfieren al gel de la segunda dimensión, tras un procedimiento de equilibrado y se separan utilizando SDS PAGE, que separa las proteínas en función de su peso molecular. Se pueden preparar múltiples geles a partir de muestras individuales.

Los expertos en la técnica conocen los métodos de electroforesis bidimensional. Por ejemplo, la electroforesis en gel bidimensional con un portador anfolito se puede realizar como ya se ha descrito previamente (Strahier et al., Journal of Clinical Investigation, 85:200-207, 1990). En la mayoría de los casos, las alícuotas se aplican inmediatamente a los geles de isoelectroenfoque (IEF). Los geles de la primera dimensión contienen 50 ml de anfolitos por litro (pH 3,5 - 10). Generalmente, el isoelectroenfoque se realiza a 1.200 V durante 10 h y 1.500 V durante las últimas 2 h. Generalmente se corren simultáneamente 20 geles. Para la separación en la segunda dimensión por SDS PAGE, se puede utilizar un gradiente de acrilamida de 11,4 - 14,0 g/ml. Si se desea, las manchas de las proteínas en los geles se pueden visualizar mediante la técnica de tinción con plata de Merril et al. (Merril et al, Science, 211:1437-1438, 1961).

Alternativamente, pueden utilizarse geles bidimensionales en gradiente de pH inmovilizado (IPG) (Hanash S.M., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:5709-5713). Las muestras se preparan utilizando un tampón de lisis, tal como el descrito anteriormente. Para la separación en la primera dimensión, se usa un gradiente de pH inmovilizado que abarca el intervalo de separación de pH 4 - 10. La segunda dimensión es la misma que la de los geles con portador anfolito descritos más arriba. Los geles IPG se preparan utilizando derivados de acrilamida que tienen grupos carboxilo o grupos amino terciarios con valores de pK específicos. Un gradiente de pH lineal se prepara a partir de una solución densa, ácida y una solución clara, básica utilizando un generador de microgradiente bicameral. El gradiente de pH se estabiliza durante la polimerización de la matriz de acrilamida-bisacrilamida Immobiline mediante un gradiente colineal de glicerol. Se han publicado formulaciones de mezclas tamponadoras Immobiline con titulación Immobiline para las soluciones de pH limitado, para el caso de gradientes restringidos de pH (1 unidad de pH) o para gradientes de pH más amplios (> 1 unidad de pH, hasta 6 unidades de pH (Gianazza et al, Electrophoresis 6:113 (1985) y LKB application Note 324 (1984)).

La segunda dimensión separa proteínas en función de su peso molecular en gel de SDS. Un gradiente de acrilamida (2,6% reticulado) al 11,5% - 14% ofrece una separación eficaz de las proteínas que tienen una masa desde 10.000 hasta 100.000 Da. Las proteínas fuera de este intervalo podrían resolverse menos. Las proteínas con un peso molecular inferior a 10.000 Da. quedan retenidas cerca del frente del colorante y se resuelven menos.

Tras la separación, las proteínas se transfieren desde los geles bidimensionales a las membranas utilizadas habitualmente para el Western blotting. Las técnicas de Western blotting y la posterior visualización de las proteínas también se conocen en el estado de la técnica (Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" 2ª Edición, Volumen 3, 1989, Cold Spring Harbor). Se pueden utilizar los procedimientos estándar o bien se pueden modificar los procedimientos, tal y como se conocen en la técnica para la identificación de proteínas de tipos concretos, como las proteínas altamente básicas o ácidas o liposolubles, etc. (Véase por ejemplo, Ausubel et al., 1989, Current Protocols en Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Los sueros del paciente y control se diluyen hasta obtener varias concentraciones, por ejemplo, un volumen de suero en 100 volúmenes de tampón, antes de utilizarlos en una etapa de incubación, como en el procedimiento del análisis Western blot. La unión no específica se puede minimizar clarificando previamente el suero antes de la etapa de incubación. En el procedimiento Western blot se utiliza un segundo anticuerpo específico del primer anticuerpo para visualizar las proteínas que reaccionan con el primer anticuerpo.

Se espera que algunas proteínas se visualicen como manchas como consecuencia de la reactividad no específica con los anticuerpos del suero. Las manchas correspondientes a las proteínas que han provocado la producción de autoanticuerpos específicos se distinguen de las manchas no específicas en función de su presencia en los Western Blots preparados con los sueros de los pacientes en comparación con los sueros control.

Las manchas de las proteínas en los geles bidimensionales de la misma fuente de proteínas usada para los Western Blots se visualizan usando un procedimiento de tinción o mediante autorradiografía. Las manchas de los geles que coinciden con las manchas de interés en los Western blots se identifican mediante un procedimiento de superposición o de coincidencia entre los geles y las transferencias. Una vez identificadas las manchas que contienen proteínas susceptibles de haber provocado el desarrollo de autoanticuerpos en los geles bidimensionales, la proteína se puede extraer en geles bidimensionales y utilizarse para la caracterización estructural y/o para preparar anticuerpos contra tal proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína se puede obtener por secuenciación directa en un secuenciador de aminoácidos automático.

Una vez identificada la proteína de interés, ésta se puede aislar y purificar mediante métodos estándar, como la cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía en columna de exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier técnica estándar para la purificación de proteínas. Dicha proteína purificada se puede utilizar en inmunoensayos diseñados para detectar la presencia de autoanticuerpos en el suero de un sujeto, o bien dichas preparaciones de proteínas se pueden usar para la inmunización, tal y como se describe más adelante.

La presente invención se demuestra, por ejemplo, mediante la detección de elevados niveles de autoanticuerpos circulantes reactivos frente a varias isoformas específicas de la \beta-tubulina y sus productos de escisión en sueros de pacientes con neuroblastoma. La detección y/o medición cuantitativa de las isoformas de la \beta-tubulina y sus productos de escisión en el suero o en otros fluidos corporales se puede usar en la detección de sujetos con riesgo de neuroblastoma u otros trastornos en los cuales se expresan isoformas de la \beta-tubulina. Adicionalmente, en los sueros de pacientes en tratamiento o en remisión de la enfermedad, no se detectaron autoanticuerpos contra las isoformas específicas de la \beta-tubulina, lo que indica que la medición de autoanticuerpos se puede usar como pronóstico para determinar el estado de progresión de la enfermedad. Por tanto, los subtipos específicos de los autoanticuerpos antitubulina podrían tener importancia diagnóstica, pronóstica o terapéutica.

Inmunoensayos

De acuerdo con la invención, la medición de autoanticuerpos reactivos contra un antígeno proteico identificado específico de un tumor, se puede usar para el diagnóstico precoz de enfermedades tales como el cáncer. Además, el control de las concentraciones de autoanticuerpos se puede usar como pronóstico para determinar la progresión de la enfermedad. La detección de autoanticuerpos en una muestra de un paciente se puede realizar mediante varios métodos. Estos métodos pueden ser los inmunoensayos, que incluyen pero que no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas como Western blots, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar sólo unos pocos.

Un inmunoensayo de este tipo se lleva a cabo mediante un método que comprende poner en contacto una muestra de suero procedente de un sujeto con una muestra que contiene el antígeno proteico en condiciones, de forma que se pueda producir la unión específica antígeno-anticuerpo y detectar o medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En un aspecto específico, se puede usar esta unión de autoanticuerpos por secciones tisulares, por ejemplo, para detectar la presencia de autoanticuerpos, donde la detección de autoanticuerpos es una indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de autoanticuerpos en una muestra se comparan con los niveles presentes en una muestra análoga de una parte del organismo o de un sujeto que no presenta el trastorno.

Los inmunoensayos de la invención no se limitan a aquellos diseñados para la detección de autoanticuerpos en el suero de un sujeto, sino que también incluyen inmunoensayos para detectar la expresión de antígenos proteicos identificados en la muestra de un sujeto. Con este fin, se puede usar un antígeno proteico purificado para producir anticuerpos que se pueden usar de acuerdo con la invención. Por ejemplo, los antígenos proteicos identificados mediante el método de la invención se pueden preparar en geles preparativos, eluirse en los geles y utilizarse como inmunógenos para la producción de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente, como un inmunógeno. Los anticuerpos se preparan mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Este tipo de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab y una librería de expresión Fab.

Los anticuerpos se pueden usar en ensayos, como los inmunoensayos enumerados más arriba, para la detección, el pronóstico, el diagnóstico o la monitorización del cáncer en un individuo o para monitorizar el tratamiento del mismo. En particular, un inmunoensayo de este tipo se lleva a cabo mediante un método que comprende poner en contacto una muestra procedente de un sujeto con un anticuerpo en condiciones tales que se puede producir la unión inmunoespecífica y detectar o medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica por el anticuerpo. Además, en los ensayos realizados para detectar la expresión de isoformas de la \beta-tubulina se pueden usar reactivos que no sean anticuerpos, como por ejemplo, moléculas de ácido nucleico, polipéptidos o compuestos químicos que se unen específicamente a las isoformas de la \beta-tubulina.

En un aspecto específico, dicha unión del anticuerpo a secciones tisulares, se puede usar para detectar la expresión de la proteína, donde la expresión de la proteína es una indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de proteínas expresadas se comparan con los niveles presentes en una muestra análoga de una parte del organismo o de un sujeto que no tiene la enfermedad.

Inmunización

La identificación de autoanticuerpos contra antígenos proteicos nuevos asociados a cánceres concretos proporciona una base para la inmunoterapia de la enfermedad. El paciente se puede inmunizar con los antígenos proteicos para provocar una respuesta inmunitaria, lo que facilita la destrucción de las células tumorales o la inhibición del crecimiento celular tumoral. Los antígenos proteicos se pueden preparar usando los métodos descritos más arriba para la purificación de proteínas.

En una realización de la invención, para provocar una respuesta inmunitaria se usa un inmunógeno que comprende un antígeno proteico purificado contra el cual un paciente con cáncer ha desarrollado autoanticuerpos. Para la administración, el antígeno de proteína se puede formular con un adyuvante adecuado con el fin de reforzar la respuesta inmunitaria contra el antígeno proteico. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio, tensioactivos, como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas y adyuvantes humanos potencialmente útiles, como BCG (bacilli Calmett-Guerin) y (Corynebacterium parvum). Se pueden usar muchos métodos para introducir las formulaciones descritas anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a la vía oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea.

Los resultados presentados en los ejemplos que se presentan posteriormente se describen más adelante. En concreto, los datos presentados en la sección 7 demuestran que las isoformas específicas de la \beta-tubulina se expresan en los tumores de sujetos que tienen neuroblastoma. El conocimiento de la naturaleza antigénica de las isoformas de la \beta-tubulina en el cáncer se puede usar para diseñar estrategias terapéuticas en la forma de inmunoterapia dirigida contra el cáncer usando isoformas de la \beta-tubulina o péptidos como una diana intermedia para estimular una respuesta inmunitaria contra el tumor o en forma de terapia génica utilizando genes que codifican todas o parte de las isoformas de la \beta-tubulina como una diana terapéutica. Adicionalmente, la \beta-tubulina III difiere de otras formas de tubulina en una secuencia corta en el extremo C terminal. Por lo tanto, se pueden utilizar péptidos que incluyan esta secuencia como inmunógeno que provoque el desarrollo de anticuerpos específicamente reactivos frente a tumores que expresan la \beta-tubulina III.

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Ejemplo de referencia Detección de un antígeno específico de un tumor usando suero aislado de un paciente con cáncer

El método de la presente invención se aplicó a pacientes con cáncer de pulmón para la identificación de antígenos específicos del tumor. A continuación se describe un experimento de este tipo. Se solubilizó una alícuota de un adenocarcinoma de pulmón en un cóctel de urea, como se ha descrito anteriormente y se cargaron 40 microgramos de proteína solubilizada en un gel en tubo con anfolito portador (pH 3-8) y se sometió a isoelectroenfoque en la primera dimensión durante 12.000 voltios-horas (700 V x 16 h y 1000 V x 2 h). Después de un paso de equilibrado, el gel en tubo de la primera dimensión se cargó en un cartucho que contenía el gel de la segunda dimensión. La electroforesis en la segunda dimensión utilizando SDS PAGE no se hizo hasta que el colorante indicador presente en el tampón de equilibrado alcanzó el extremo opuesto del gel de la segunda dimensión, respecto al gel de la primera dimensión. Tras la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó previamente con un tampón de bloqueo y posteriormente se incubó con suero obtenido de un paciente con adenocarcinoma en una dilución de 1:100 (diluido en solución salina con tampón Tris (TBS); Tween 20 al 0,01%; 1,8 g/100 ml de leche en polvo desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con una solución tampón, la membrana se incubó durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgG humano de oveja (Amersham). Las proteínas reactivas se revelaron con luminol.

En la figura 1A se presenta una proteína del tumor candidata contra la cual existía un anticuerpo en el suero del paciente. Tal y como se indica en la figura 1B, la mancha de proteína no se detectaba en una transferencia de proteínas de pulmón normales que se habían incubado con el suero del paciente.

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Ejemplo Detección de autoanticuerpos específicos de las isoformas de la \beta-tubulina en los sueros de sujetos con neuroblastoma

Utilizando el método de la presente invención, se hizo un cribado de sueros de sujetos con neuroblastoma para detectar la reactividad contra las proteínas tumorales. Las muestras de suero de los pacientes con neuroblastoma fueron reactivas contra un grupo de proteínas específicas del neuroblastoma, identificadas como isoformas de la \beta-tubulina y sus productos de escisión.

Materiales y métodos

Se obtuvieron sueros de pacientes con neuroblastoma y de pacientes con otros tipos de tumores, como cáncer de pulmón, de esófago, sarcomas y tumores de Wilms. Se prepararon diferentes Western blots usando los diferentes tumores o línea celular de neuroblastoma SY5Y como fuentes de proteínas solubilizadas. Se solubilizó una alícuota de proteínas SY5Y en un cóctel de urea como se ha descrito anteriormente y se cargaron 40 microgramos de proteína solubilizada en un gel en tubo con anfolito portador (pH 3,8) y se sometió a isoelectroenfoque en la primera dimensión durante 12.000 voltios-horas (700 V x 16 h seguido de 1000 V x 2 h). Después de un paso de equilibrado, el gel en tubo de la primera dimensión se cargó en un cartucho que contenía el gel de la segunda dimensión. La electroforesis en la segunda dimensión utilizando SDS PAGE no se hizo hasta que el colorante indicador presente en el tampón de equilibrado alcanzó el extremo opuesto del gel de la segunda dimensión, respecto al gel de la primera dimensión.

Tras la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). La membrana se incubó previamente con un tampón de bloqueo y posteriormente se incubó con suero obtenido del mismo paciente con neuroblastoma, cuyo tumor se había analizado. El suero, que se había diluido 1:100 en la solución tampón (solución salina con tampón Tris que contiene Tween 20 al 0,01% y 1,8 g/100 ml de leche en polvo desnatada), se incubó con el filtro durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con la solución tampón, la membrana se incubó durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgG humano de conejo (Amersham). Las proteínas reactivas se revelaron con luminol. En un grupo de proteínas coalescentes, marcadas como LP1, se identificó la presencia de isoformas de la \beta-tubulina contra las cuales existía un anticuerpo en el suero del paciente.

En los Western blots de los sueros de pacientes con neuroblastoma se observaron varias manchas inmunorreactivas. Estas manchas no aparecían en los Western blots de otros tumores ni en los Western blots de tumores neuroblastoma que se habían tratado con sueros control (figuras 2 y 3). En las separaciones bidimensionales de los mismos extractos tumorales se detectó el grupo de proteínas inmunorreactivas adyacentes, denominadas LP1, observadas en las transferencias en las que el segundo anticuerpo iba dirigido contra IgG o IgM (figuras 2 y 3, respectivamente), donde las proteínas totales se visualizaron por tinción con plata o azul de Coomassie en función de su punto isoeléctrico (pI) y PM tras determinar la coincidencia (figura 5). En esta constelación de proteínas se identificó la presencia de isoformas de la \beta-tubulina de los tipos I, II y III, como se determinó por secuenciación de aminoácidos y reactividad con anticuerpos conocidos contra estas isoformas de la \beta-tubulina.

Para la secuenciación de aminoácidos, se prepararon varias proteínas de tumor neuroblastoma y se tiñeron con azul de Coomassie. Las manchas coalescentes, denominadas LP1, que se habían producido en la posición de la constelación inmunorreactiva de manchas se escindieron de cuatro áreas contiguas de transferencias de neuroblastoma teñidas con azul de Coomassie y se determinó la secuencia del aminoácido N terminal para cada mancha de proteína escindida. Las secuencias de los aminoácidos N terminal se compararon con las secuencias N terminal conocidas de las isoformas de la \beta-tubulina.

Las secuencias N terminal obtenidas para las isoformas de la \beta-tubulina son las siguientes:

		PM	PI
TBB1	MREIVHIQAGQCGNQI	49759	4,75	(SEC ID Nº: 1)
TBB3	MREIVHIQAGQCGNQI	50517	4,86	(SEC ID Nº: 1)
TBB2	MREIVHLQAGQCGNQI	49831	4,79	(SEC ID Nº: 2)
TBB5	MREIVHLQAGQCGNQI	49631	4,81	(SEC ID Nº: 2)
TBA1	MRECISIHVGQAGVQI	50157	5,02	(SEC ID Nº: 3)
TBA4	MRECISVHVGQAGVQM	49924	4,95	(SEC ID Nº: 4)

Se escindieron las manchas denominadas LP1 a LP1d en la figura 7 y se determinó la secuencia amino terminal de cada proteína. La secuencia de aminoácidos fue la siguiente:

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I. LP1a

mayoritaria- MREIVHIQAGQCGNQI	(SEC ID Nº: 1)
minoritaria- EEGCVSLQVGQAGVQI	(SEC ID Nº: 5)

La secuencia mayoritaria de LP1 es la de la isoforma de la tubulina TBB1 o TBB3, la minoritaria es TBB2 o TBB5. TBB1 y TBB3 tienen el mismo extremo N terminal, pero difieren en el extremo C terminal. Existían también algunas señales menores en algunos ciclos. TBB2 y TBB5 tienen L en lugar de I en la posición 7. Se habían observado algunas L en este ciclo. Sin embargo, podrían proceder de una secuencia no relacionada junto con otros residuos menores.

II. LP1b

mayoritaria- MRECISIHVGQAGVQI	(SEC ID Nº: 3)
minoritario- MRLIVHAHAGQAGNQI	(SEC ID Nº: 6)
minoritario- MRLIVDAHAGQAGNQI	(SEC ID Nº: 7)

La secuencia mayoritaria de LP1b es la de la isoforma de la tubulina TBA1 y la secuencia minoritaria es la de la isoforma de la tubulina TBB1 y/o TBB3.

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III. LP1c

mayoritaria- MREIVHIQAGQCGNQI	(SEC ID Nº: 1)
minoritaria- MREIVHLQAGQCGNQI	(SEC ID Nº: 2)

La secuencia mayoritaria de LP1c es la de la isoforma de la tubulina TBB1 y/o TBB3, estando posiblemente presentes algunas isoformas de la tubulina TBB5 y/o TBB2 (Línea nº 7).

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IV. LP1d

mayoritaria- MREIVSIHVGQA	(SEC ID Nº: 8)
minoritaria- MREXaaIHIXaaAGQXaa	(SEC ID Nº: 9)

en la que el primer Xaa se refiere a la presencia de un residuo C o T; el segundo Xaa se refiere a la presencia de un residuo Q o P y el tercer Xaa se refiere a la presencia de un residuo C. La secuencia mayoritaria de LP1d es la isoforma de la tubulina TBB1 y/o TBB3, detectándose una cantidad menor de isoforma de tubulina TBA1.

Se observó que las isoformas de la \beta-tubulina de tipos I, II y III se expresaban en un alto nivel en tumores neuroblastoma y en SY5Y según el análisis de Western blot de las proteínas tumorales del neuroblastoma separadas por electroforesis en gel bidimensional, usando anticuerpos específicos contra la isoforma de la \beta-tubulina (figuras 5, 6).

Se identificó otro grupo de proteínas inmunorreactivas observadas en los Western blots de los tumores neuroblastoma y de la línea celular SY5Y, en los cuales el segundo anticuerpo estaba dirigido contra IgM, como productos de escisión de las isoformas de la \beta-tubulina en función de su reactividad con los anticuerpos específicos contra la isoforma de \beta-tubulina (figura 4). Este grupo de proteínas adyacentes también se identificó en las separaciones bidimensionales de los mismos extractos tumorales, en las cuales las proteínas se visualizaron por tinción con plata o azul de Coomassie, en función de su punto isoeléctrico (pI) y su peso molecular (PM) tras determinar la coincidencia (figura 7).

Se observó que los productos de escisión de las isoformas de la \beta-tubulina de tipos I, II y III se expresaban en un alto nivel en tumores del tipo neuroblastoma según el análisis de Western blot del tumor neuroblastoma y en las proteínas SY5Y separadas por electroforesis en gel bidimensional, usando anticuerpos específicos contra la isoforma de la \beta-tubulina (figuras 4, 5 y 6).

Resultados

Para la identificación de los antígenos proteicos de neuroblastoma y la presencia de autoanticuerpos séricos contra las proteínas tumorales del neuroblastoma, se utilizaron los sueros de pacientes con neuroblastoma para detectar la reactividad contra las proteínas tumorales separadas mediante la técnica de la electroforesis bidimensional de alta resolución. Las proteínas tumorales se transfirieron tras su separación bidimensional a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y se incubaron con suero de pacientes recién diagnosticados de neuroblastoma usando la técnica de Western blotting (figuras 2 y 4). Los sueros de pacientes con otros tipos de cáncer y de individuos normales se utilizaron de manera similar como controles (figura 3).

Las proteínas que reaccionaron con los anticuerpos presentes en el suero se detectaron en función de la visualización de una mancha tras la incubación con un segundo anticuerpo dirigido contra el primer anticuerpo. La especificidad del anticuerpo se determinó mediante comparaciones de Western blots de diferentes tipos de tumores que habían reaccionado con diferentes sueros de pacientes con neuroblastoma, con Western blots que habían reaccionado con sueros control.

Varias de las de las manchas inmunorreactivas que se habían observado en los Western blots de los tumores neuroblastoma y en una línea celular de neuroblastoma que se habían incubado con sueros de pacientes con neuroblastoma, estaban ausentes en los Western blots de otros tumores o en los Western blots de neuroblastoma que se habían tratado con sueros control. Se localizó un grupo de proteínas inmunorreactivas de neuroblastoma en las separaciones bidimensionales de proteínas de neuroblastoma, en las cuales las proteínas se habían revelado por tinción con plata o azul de Coomassie. La localización se basó en la coincidencia teniendo en cuenta el punto isoeléctrico (pI) y el peso molecular de la proteína. Tras la elución de la membrana, el grupo de antígenos proteicos inmunorreactivas se identificaron como isoformas de la \beta-tubulina, según se determinó mediante secuenciación de aminoácidos, espectrometría de masas y reactividad con anticuerpos conocidos contra las isoformas de la \beta-tubulina. Se observó que las isoformas de la \beta-tubulina se expresaban en un alto nivel en tumores neuroblastoma según el análisis de Western blot de las proteínas tumorales del neuroblastoma separadas por electroforesis en gel bidimensional, que habían reaccionado con los anticuerpos específicos contra la isoforma de la \beta-tubulina. Se identificó otro grupo de proteínas inmunorreactivas como productos de escisión de las isoformas de la \beta-tubulina. Por lo tanto, los pacientes con neuroblastoma parecen producir autoanticuerpos contra las isoformas de la \beta-tubulina o contra sus productos de escisión. En interesante señalar que el suero extraído de pacientes con neuroblastoma, en remisión o tratados para esta enfermedad, no presentaban autoanticuerpos reactivos contra las \beta-tubulinas. La identificación de las isoformas de la \beta-tubulina como inmunogénicas en el cáncer, proporciona una base para el desarrollo de pruebas diagnósticas y de detección de cánceres en las que se expresan estas isoformas y para el desarrollo de nuevas estrategias basadas en la tubulina para el tratamiento del cáncer.

Una vez identificadas las proteínas que han provocado el desarrollo de autoanticuerpos, es posible producirlas en grandes cantidades mediante la tecnología del ADN recombinante o mediante otros procedimientos de enriquecimiento o purificación. Se pueden producir anticuerpos específicos y antisueros contra estas proteínas o contra péptidos sintéticos que coincidan con la secuencia derivada de la proteína(s) de interés.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Universidad de Michigan

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS PROTEICOS CELULARES Y PRESENCIA DE AUTOANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS CELULARES ESPECÍFICOS EN SUERO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: Baker & Botts, L.L.P.

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(B)

CALLE: 30 Rockefeller Plaza

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(C)

CIUDAD: New York

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(D)

ESTADO: NY

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 10112

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(v)

FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

SOFTWARE: FastSEQ Versión 2.0

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-JUN-1998

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Seide, Rochelle K

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.300

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ORDEN: 31755-PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 212-705-5000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 212-705-5020

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX:

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Glu Ile Val His Ile Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Glu Ile Val His Leu Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Glu Cys Ile Ser Ile His Val Gly Gln Ala Gly Val Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Glu Cys Ile Ser Val His Val Gly Gln Ala Gly Val Gln}

\sac{Met}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

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\sa{Glu Glu Gly Cys Val Ser Leu Gln Val Gly Gln Ala Gly Val Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

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\sa{Met Arg Leu Ile Val His Ala His Ala Gly Gln Ala Gly Asn Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

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\sa{Met Arg Leu Ile Val Asp Ala His Ala Gly Gln Ala Gly Asn Gln}

\sac{Ile}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Glu Ile Val Ser Ile His Val Gly Gln Ala}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Ninguna

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9

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\sa{Met Arg Glu Xaa Ile His Ile Xaa Ala Gly Gln Xaa}

Claims (8)

1. Método para la identificación de antígenos proteicos celulares, contra los cuales produce autoanticuerpos un sujeto con cáncer, consistiendo dicho método en:

a)

proporcionar una muestra de células de un sujeto que tiene cáncer;

b)

separar las de la muestra de a);

c)

separar las proteínas extraídas mediante electroforesis bidimensional;

d)

transferir las proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional a una membrana para su análisis por Western Blot;

e)

incubar la membrana con antisuero de un sujeto que se sabe que tiene cáncer;

f)

detectar las proteínas a las que se han unido autoanticuerpos en el suero del sujeto;

g)

comparar proteínas a las que se unen los anticuerpos en el suero del sujeto con proteínas a las que se unen anticuerpos de una muestra de suero control de un sujeto sin cáncer;

en el que aquellas proteínas unidas por los anticuerpos en el suero del sujeto, pero no por los del suero control, se identifican como antígenos proteicos contra los que el sujeto con el cáncer produce autoanticuerpos.

2. Método según la reivindicación 1 en el que la muestra de células procede del tumor del sujeto.

3. Método según la reivindicación 1 en el que la muestra de células procede de una línea celular continua representativa del tumor del sujeto.

4. Método según la reivindicación 1 en el que la etapa de detección de las proteínas a las que se han unido autoanticuerpos de la muestra de suero del sujeto comprende el uso de un componente generador de señal unido a un anticuerpo que es específico de los anticuerpos de la muestra del sujeto.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína es una isoforma de la \beta-tubulina.

6. Método para el diagnóstico y el pronóstico de cáncer en un sujeto que comprende la detección de la presencia de autoanticuerpos específicos de una proteína identificada usando el método de la reivindicación 1, en una muestra de suero obtenido de un sujeto, en el que la presencia de autoanticuerpos indica la presencia de cáncer y en el que dicha proteína es una isoforma de la \beta-tubulina.

7. Método según la reivindicación 6 en el que el sujeto es un paciente con neuroblastoma.

8. Método según la reivindicación 6 en el que la presencia de autoanticuerpos en la muestra se mide mediante un inmunoensayo que comprende:

(a)

inmovilizar la proteína identificada usando el método de la reivindicación 1 en una membrana o substrato;

(b)

poner en contacto la membrana o substrato con una muestra de suero de un sujeto; y

(c)

detectar la presencia de autoanticuerpos específicos de la proteína en la muestra de suero del sujeto,

en el que la presencia de autoanticuerpos indica la presencia de cáncer.