CN1295668A - 用于肝细胞癌诊断的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于肝细胞癌筛选、诊断、预后、和用于监测肝细胞癌治疗效果和药物开发的方法和组合物。描述了可以使用双向电泳分析血清或血浆来测定的肝细胞癌诊断特征(HF)。本发明进一步提供了在血清或血浆中可检出的肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)、包含已分离的HPI的制剂、针对HPI的免疫特异性抗体,以及包含前述的试剂盒。
Description
1．简介
本发明涉及与肝细胞癌(hepatoma)相关的蛋白质和蛋白质同种型(isoform)的鉴定，以及它们在筛选、诊断、预后、治疗和药物开发方面的用途。
2．发明背景
肝细胞癌是一种发病率不断上升的癌症，世界范围内有几十万患者。此病的治疗方法还相对缺乏，获得更有效治疗的主要希望在于能够更早和更准确的诊断。
血清甲胎蛋白(AFP)的测定广泛应用于肝细胞癌的诊断。当AFP水平显著上升时，它是一个有用的标志物，但是当AFP在较低水平时，它对于肝细胞癌很差的特异性和阳性检出率(PPV)严重的限制了其临床应用。Johnson等人，1997，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，75：236-240。某些凝集素与肝细胞癌血清中的AFP的结合显示出不同于与良性状况下的AFP的结合。Aoyagi等人，1985，生物化学生物物理通报(Biochim.Biophys.Acta)，830：217-223；Aoyagi等人，1993，英国癌症杂志，67：486-492。但是这些研究还未被临床广泛的接受。Johnson等人，同上。最近，等电聚焦已经用于AFP同种型的检查，这些同种型表现出对肝细胞癌相对特异性。Johnson等人，同上。这些报道说明在肝细胞癌的诊断中越来越需要鉴定血清中的标志物。
3．发明概述
本发明提供了用于肝细胞癌的筛选、诊断和预后、用于监测肝细胞癌治疗有效性和用于药物开发的方法和组合物。
发明的第一方面提供了用于肝细胞癌诊断的方法，包括通过双向电(two-dimentional electrophoresis)对血浆或血清样品进行分析，以检测至少一种肝细胞癌诊断特征(HF)的水平，例如选自此处所公开的HF中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。
发明的第二方面提供了用于肝细胞癌诊断的方法，包括检测血浆或血清样品中至少一种肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)的水平，例如选自此处所公开的HPI组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。
发明的第三方面是提供了能够与一种HPI，例如此处公开的一种HPI，免疫特异性结合的单克隆和多克隆抗体
发明的第四方面是提供了一种制品，该制品包含一种已分离的HPI，即一种不含与HPI有明显不同表观分子量或等电点的蛋白质或蛋白质同种型的HPI。
4．附图简述
图1是由正常人血清的双向电泳得到的图像，图像显示鉴定出了14个界点特征，标记为PL1-PL12和PL15-PL16。
5．发明详述
以下详细叙述的发明包括用于哺乳动物受试者中肝细胞癌筛选、诊断、预后的方法和组合物，以及用于肝细胞癌治疗效果监测的方法和用于药物开发的方法。优选地，受试者是人，更优选地，受试者是成年人。
为了公开清楚而不以任何方式限制，本发明将以血清样品的分析为例进行描述。但是，作为一个本领域的技术人员应当理解，此处所述的鉴定和技术可以应用于其它类型的病人样品，包括体液(例如：血浆、尿液、胆汁、腹水)、怀疑含有来源于肝细胞癌物质的组织样品(例如：肝脏活检或可疑肿块活检的活检样品)或其匀浆。
5．1．肝细胞癌诊断特征(HF)
在本发明的一个方面中，双向电泳用于分析受试者血清以测量一个或多个肝细胞癌诊断特征(HF)的丰度，可用于肝细胞癌的筛选和诊断、决定肝细胞癌患者的预后、监测肝细胞癌治疗的效果或者用于药物的开发。此处所用的双向电泳是指一项包括等电聚焦和随后的变性电泳在内的技术。它可以产生包含多个已分离的蛋白质的双向胶(2D-gel)。优选地，，变性电泳步骤使用十二烷基磺酸钠存在下的聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。特别优选的是美国申请第08/980，574和WO 98/23950中所描述的高度准确和自动化的方法及设备(“优选技术”)，此处完整引述作为参考。简要的说，优选的技术提供了足够的、计算机辅助的方法和设备以用于生物样品中生物分子的鉴定、选择和特征描述。根据生物分子的电泳迁移率和等电点在双向胶中分离它们，可以得到一个双向图谱(array)。由此图谱可以产生一个计算机形成的数字图形，代表双向图谱中检测的多种生物分子的特性、表观分子量、等电点和相对丰度，因而能够允许将来自多个生物样品的图形进行计算机辅助的比较，以及计算机辅助的已分离目标蛋白质的切割。
此处所用的术语“肝细胞瘤诊断特征(HF)”指的是在生物样品经双向电泳后可检出的特征(例如双向胶中的一个点)，它以不同的方式表现在一个样品和另外的与其相关样品中，例如在一个患有肝细胞癌的受试者血清中与在一个没有患有肝细胞癌的受试者血清中。当用于检测特征(或蛋白质同种型)的方法(例如：双向电泳或免疫分析方法)显示所检测特征(或蛋白质同种型)在第一个样品中与在第二个样品中的相对丰度不同时，则此处所用的术语特征(或蛋白质同种型)相对于第二个样品而言，“不同的存在于”第一个样品中。如果所测量的特征在第一个样品中的丰度高于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“升高”的；相反的，如果所测量的特征在第一个样品中的丰度低于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“降低”的。
优选的，特征在两个样品中的相对丰度是通过两个步骤来确定的。首先，参照一个适当的背景参数将依赖于样品中所发现特征而得到的信号进行标准化，例如，参照分析样品中的总蛋白质(例如上样到胶上的总蛋白质)，参照一个稳定的特征，也就是已知的在所比较的样品中含量相似的一个特征，例如一个或多个“表达参考特征”(ERF)，例如下面公开的“表达参考特征”，或者参照来源于样品中所有蛋白质的能检测到的总信号。
其次，一个或一组样品中已标准化的特征的信号与另外一个或一组样品中同一特征的已标准化的信号相比较，用以鉴定那些相对于第二个样品(或样品组)“不同的存在于”第一个样品(或样品组)中的特征。
通过优选技术部分中的方法和设备，已鉴定出两组HF。第一组包括相对于无肝细胞癌受试者血清(例如患有肝硬化的受试者)在患有肝细胞癌的受试者血清中降低的HF。这些HF可以用表观分子量(MW)和等电点(PI)表述如下：
表Ⅰ在肝细胞癌血清中降低的HF
| 名称 | MCI | 减少倍数 | pI | MW(kd) | p |
| HF-1 | 7537 | 11.7 | 8.12 | 44，093 | 0.0003 |
| HF-2 | 7341 | 4.9 | 6.02 | 62，370 | 0.0239 |
| HF-3 | 7232 | 4.6 | 7.60 | 103，154 | 0.0094 |
| HF-4 | 7534 | 3.1 | 7.41 | 44，764 | 0.0278 |
| HF-5 | 7763 | 2.7 | 6.93 | 67，555 | 0.0362 |
| HF-6 | 7945 | 2.7 | 5.73 | 57，295 | 0.0377 |
| HF-7 | 7760 | 2.5 | 6.37 | 69，194 | 0.0109 |
| HF-8 | 7179 | 2.5 | 5.82 | 166，395 | 0.0138 |
| HF-9 | 8031 | 2.1 | 6.15 | 24，467 | 0.0258 |
| HF-10 | 7831 | 2.0 | 7.39 | 37，863 | 0.0025 |
| HF-11 | 7910 | 2.0 | 7.79 | 93，302 | 0.1078 |
| HF-12 | 7562 | 2.0 | 5.37 | 40，672 | 0.0166 |
| HF-13 | 7762 | 2.0 | 6.41 | 67，826 | 0.1015 |
| HF-14 | 7641 | 2.0 | 6.80 | 28，169 | 0.0364 |
第二组包括相对于无肝细胞癌受试者血清(例如，患有肝硬化的受试者)在患有肝细胞癌的受试者血清中升高的HF。这些HF可以用表观分子量(MW)和等电点(PI)表述如下：
表Ⅱ在肝细胞癌血清中升高的HF
| 名称 | MCI | 减少倍数 | pI | MW(kd) | p |
| HF-15 | 7308 | 3.9 | 5.55 | 67，555 | 0.0013 |
| HF-16 | 7463 | 3.8 | 7.84 | 50，625 | 0.0055 |
| HF-17 | 7629 | 3.1 | 7.27 | 31，244 | 0.0000 |
| HF-18 | 7366 | 3.0 | 4.60 | 59，928 | 0.0000 |
| HF-19 | 7759 | 3.0 | 5.40 | 69，194 | 0.0021 |
| HF-20 | 7581 | 3.0 | 4.94 | 38，465 | 0.0000 |
| HF-21 | 7320 | 2.9 | 7.63 | 66，485 | 0.0009 |
| HF-22 | 7690 | 2.9 | 5.72 | 16，707 | 0.0136 |
| HF-23 | 7241 | 2.8 | 5.27 | 96，988 | 0.0000 |
| HF-24 | 7242 | 2.7 | 5.31 | 96，988 | 0.0000 |
| HF-25 | 7240 | 2.6 | 5.14 | 97，732 | 0.0000 |
| HF-26 | 7734 | 2.6 | 6.0 4 | 108，311 | 0.0011 |
| HF-27 | 7469 | 2.6 | 8.12 | 50，134 | 0.0344 |
| HF-28 | 7431 | 2.6 | 5.34 | 52，432 | 0.0009 |
| HF-29 | 7553 | 2.5 | 4.84 | 41，288 | 0.0000 |
| HF-30 | 7457 | 2.5 | 7.61 | 50，822 | 0.0255 |
| HF-31 | 7330 | 2.4 | 7.44 | 63，882 | 0.0003 |
| HF-32 | 7460 | 2.4 | 7.25 | 50，625 | 0.0085 |
| HF-33 | 7237 | 2.4 | 5.10 | 97，732 | 0.0000 |
| HF-34 | 7243 | 2.4 | 5.21 | 96，988 | 0.0000 |
| HF-35 | 7368 | 2.3 | 4.57 | 60168 | 0.0168 |
| HF-36 | 7730 | 2.3 | 5.10 | 136，409 | 0.0007 |
| HF-37 | 7288 | 2.3 | 6.79 | 71，726 | 0.0035 |
| HF-38 | 7568 | 2.3 | 5.34 | 39，869 | 0.0034 |
| HF-39 | 7238 | 2.3 | 5.04 | 97，732 | 0.0000 |
| HF-40 | 7691 | 2.3 | 5.40 | 16，551 | 0.0049 |
| HF-41 | 7317 | 2.2 | 6.06 | 66，220 | 0.0974 |
| HF-42 | 7465 | 2.2 | 7.44 | 50，329 | 0.0097 |
| HF-43 | 7380 | 2.2 | 6.01 | 58，044 | 0.0144 |
| HF-44 | 7239 | 2.2 | 5.07 | 97，732 | 0.0000 |
| HF-45 | 7692 | 2.2 | 6.10 | 16，447 | 0.0412 |
| HF-46 | 7379 | 2.2 | 4.66 | 57，582 | 0.0040 |
| HF-47 | 7180 | 2.2 | 5.36 | 164，341 | 0.0059 |
表Ⅱ(续)
| 名称 | MCI | 减少倍数 | pI | MW(kd) | p |
| HF-48 | 7633 | 2.2 | 7.26 | 30，638 | 0.0016 |
| HF-49 | 7392 | 2.1 | 5.10 | 56，444 | 0.0014 |
| HF-50 | 7572 | 2.1 | 5.71 | 39，239 | 0.0227 |
| HF-51 | 7190 | 2.0 | 5.26 | 161，308 | 0.0001 |
| HF-52 | 7186 | 2.0 | 5.32 | 163，324 | 0.0008 |
| HF-53 | 7556 | 2.0 | 5.15 | 40，753 | 0.0020 |
| HF-54 | 7540 | 2.0 | 5.29 | 43，541 | 0.0004 |
| HF-55 | 7185 | 2.0 | 5.22 | 163，324 | 0.0000 |
| HF-56 | 7822 | 2.0 | 5.12 | 42，416 | 0.0030 |
对于任何指定的HF来说，将分析患有肝细胞癌的受试者血清时观察到的标准化信号与相对于分析无肝细胞癌的受试者血清时观察到的标准化信号加以比较，所得到的比率依赖于所用的特定分析规程和检测技术。因而，本发明构思了作为诊断领域的传统做法，每一个实验室应当根据所使用的分析规程和检测技术建立针对无肝细胞癌受试者血清中每一个HF的参考范围。优选的，分析测试样品时每一批次中应当包括至少一个来自已知患有肝细胞癌的受试者的阳性对照血清样品，和至少一个来自已知无肝细胞癌的受试者的阴性对照血清样品(更优选的是至少一个阳性和至少一个阴性对照样品)。
作为熟练的技术人员应当容易理解，一个给定特征或蛋白质同种型的测量分子量和等电点会根据双向电泳和区带匹配的每一步骤所用的具体规程而在一定范围内变动。此处所用的术语“分子量”和“等电点”分别定义为：准确依照在下文第六节列出的实验规程(“参考实验规程”)测定的特征或蛋白质同种型的表观分子量和等电点。当按照参考规程，样品以双份平行或更多数目平行测定时，测得的HF或HPI的平均等电点的偏差小于±1％；测得的HF或HPI的平均分子量的偏差小于±5％。在熟练技术人员希望背离参考实验规程的地方，应当进行标准实验，用以比较使用(a)参考实验规程和(b)背离实验规程检测到的每一个HF或蛋白质同种型的分子量和等电点。
HF可用于肝细胞癌的发现、预后、诊断和监测或是药物开发。在本发明的一个实施方案中，受试者血清通过双向电泳分析，以定量检测选自HF-1到HF-14和HF-57到HF-59HF中的一个或多个HF，其中一个HF在受试者血清的含量相对于在无肝细胞癌的受试者(或一组受试者)(例如对照样品或前面定义的参考范围)血清中的含量的下降，提示肝细胞癌的存在；优选地，一个或多个HF选自HF-1和HF-59。在本发明的另一个实施方案中，受试者血清通过双向电泳分析，以定量检测选自HF-15到HF-56和HF-60到HF-61中的一个或多个HF，其中一个HF在受试者血清的丰度相对于在无肝细胞癌的受试者(或一组受试者)(例如对照样品或前面定义的参考范围)血清中的含量的上升，提示肝细胞癌的存在；优选地，所指的一个或多个HF选自HF-17、HF-18、HF-20、HF-21、HF-23、HF-24、HF-25、HF-28、HF-29、HF-31、HF-33、HF-34、HF-36、HF-39、HF-44、HF-51、HF-52、HF-54、和HF-55；更优选地，，所指的一个或多个HF选自HF-17、HF-18、HF-20、HF-23、HF-24、HF-25、HF-29、HF-33、HF-34、HF-39、HF-44和HF-55。5、2、肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)
本发明的另一方面是分析受试者血清，以定量检测一个或多个肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)，这些HPI可以用于肝细胞癌的筛选或诊断、决定肝细胞癌患者的预后、监测肝细胞癌治疗的效果或药物开发。此处所用的术语“肝细胞癌诊断蛋白质同种型”是指不同的存在于患有肝细胞癌的受试者血清和无肝细胞癌受试者血清中的蛋白质同种型。本领域公知，单基因的蛋白质产物可能表达成变构体(同种型)(a)这种不同是不同的翻译后修饰的结果(例如：糖基化、磷酸化和乙酰化)，以至于具有相同氨基酸序列的蛋白质可以有不同的等电点、分子量或两者皆不同；和/或(b)这种不同源于它们的氨基酸组成不同(例如：另外的mRNA剪接或有限的蛋白质降解的结果)。因此蛋白质同种型的不同的存在并不需要编码该目的蛋白质的基因的不同表达。
使用优选技术部分中的方法和设备，通过部分氨基酸测序，已鉴定出了两组HPI。第一组包括相对于无肝细胞癌受试者血清，在患有肝细胞癌受试者血清中下降的HPI，这种不同具有十分显著的统计学意义。(P≤0.001)。这些HPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅲ，如下：
表Ⅲ、在肝细胞癌血清中降低的HPI
| HF# | HPI | 已知的同源蛋白质 | 部分氨基酸序列 | 等电点 | 分子量(kd) |
| 1 | HPI-1 | 免疫球蛋白G-H1、H2、H3 | REPQVYTLPPSR | 8.12 | 44，093 |
第二组包括相对于无肝细胞癌受试者血清，在患有肝细胞癌受试者血清中上升的HPI，这种不同具有十分显著的统计学意义。(P≤0.001)。这些HPI的分子量、等电点和部分氨基酸序列列于表Ⅳ，如下：
表Ⅳ、在肝细胞癌血清中上升的HPI
| HF# | HPI | 已知的同源蛋白质 | 部分氨基酸序列 | 等电点 | 分子量(kd) |
| 17 | HPI-2 | 补体因子4 | RGLQDEDGYR | 7.27 | 31244 |
| 18 | HPI-3 | α1-抗胰凝乳蛋白酶 | KITLLSALVETR | 4.60 | 59928 |
| 20 | HPI-4 | 补体因子3 | KGYTQQLAFR | 4.94 | 38465 |
| 21 | HPI-5 | 补体因子3 | RIPIEDGSGEVVLSR | 7.63 | 66485 |
| 23 | HPI-6 | 补体因子4 | RTYNVLDMK | 5.27 | 96988 |
| 25 | HPI-8 | 补体因子4 | KAEMADQASAWLTR | 5.14 | 97732 |
| 28 | HPI-9 | 维生素D结合蛋白 | KHLSLLTTLSNR | 5.34 | 52432 |
| 29 | HPI-10 | 结合珠蛋白-1 | RVGYVSGWGR | 4.84 | 41288 |
| 29 | HPI-11 | 结合珠蛋白-2 | KYVMLPVADQDQCIR | 4.84 | 41288 |
| 31 | HPI-12 | 补体因子3 | KTIYTPGSTVLYR | 7.44 | 63822 |
表Ⅳ(续)
| HF# | HPI | 已知的同源蛋白质 | 部分氨基酸序列 | 等电点 | 分子量(kd) |
| 31 | HPI-13 | 新型 | AETTDF | 7.44 | 63822 |
| 33 | HPI-14 | 补体因子4 | RQGSFQGGFR | 5.10 | 97732 |
| 34 | HPI-15 | 补体因子4 | RQGSFQGGFR | 5.21 | 96988 |
| 36 | HPI-16 | 间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白质 | RFAHTVVTSR | 5.10 | 136409 |
| 39 | HPI-17 | 补体因子4 | RQGSFQGGFR | 5.04 | 97732 |
| 44 | HPI-18 | 补体因子4 | RTYNVLDMK | 5.07 | 97732 |
| 51 | HPI-19 | 血浆铜蓝蛋白 | KGAYPLSIEPIGVR | 5.26 | 161308 |
| 52 | HPI-20 | 血浆铜蓝蛋白 | KALYLQYTDETFR | 5.32 | 163324 |
| 54 | HPI-21 | 新型 | [I/L]W[I/L]GTTR | 5.29 | 43541 |
| 55 | HPI-22 | 血浆铜蓝蛋白 | RQSEDSTFYLGER | 5.22 | 163324 |
在本发明的一个实施方案中，分析受试者血清，以定量检测选自HPI-1和HPI-23中的一个或多个HPI，其中一个或多个HPI相对于无肝细胞癌受试者(或一组受试者)的血清(例如：对照样品或前面定义过的参考范围)中的量，在受试者血清中的量的降低，表明肝细胞癌的存在。在本发明的另一个实施方案中，用双向电泳分析受试者血清，以定量检测选自HPI-2到HPI-22和HPI-24中的一个或多个HPI，其中一个或多个IHPI相对于无肝细胞癌受试者(或一组受试者)的血清(例如：对照样品或前面定义过的参考范围)中的量，在受试者血清中的量的上升，表明肝细胞癌的存在。
如上所示，此处所述的HPI包括以前未知的蛋白质和已知蛋白质的同种型，以前并不知道这些同种型与肝细胞癌有关。对于每一个HPI，本发明另外提供了包括分离的HPI或其片段的制品，以及进一步提供了能结合所述HPI或所述片段的抗体，或能与所述HPI及所述片段结合的抗体。此处所述“分离的”HPI是指一个HPI，如双向电泳鉴定出的它不包含与HPI的那些同种型有显著不同分子量和等电点的蛋白质或蛋白质同种型。此处所述“显著不同的”等电点或分子量是指按照参考实验规程操作，在双向电泳中能够和HPI分离开的污染的蛋白质同种型之等电点或分子量。
在一个实施方案中，提供了一种分离的蛋白质，所述蛋白质包括具有在表Ⅲ或表Ⅳ鉴定出的针对HPI氨基酸序列的肽，所述蛋白质的等电点和分子量在表Ⅲ和表Ⅳ鉴定出的相应HPI分子量和等电点的10％变化范围以内(优选地，是在5％变化范围以内，更优选地，是在1％变化范围以内)。
本发明的HPI可以用本领域技术人员知晓的任何方法加以分析。在一个实施方案中，HPI由于其分子量和等电点而在双向胶中得到分离，通过对胶染色而显现出来。
另外，HPI可以用分析方法测定，例如免疫分析方法，而用于肝细胞癌的发现、预后、诊断、监测或用于药物开发。在一个实施方案中，在能够产生免疫特异性结合的条件下，将来自要检测的受试者的样品与一种抗-HPI抗体接触，然后检测或测量所有被抗体免疫特异性结合的量。优选的，抗-HPI抗体优先结合HPI，而不是同一蛋白质的其它同种型。在一个优选的实施方案中，抗-HPI抗体与HPI的亲和力和与同一蛋白质的其它同种型的亲和力相比，至少高出2倍；更优选的，至少高出5倍；最优选的，至少高出10倍。
在一个实施方案中，组织切片中的抗体结合可用于检测异常的HPI定位或HPI的异常水平(例如：高、中、低、缺失)。在一个特定的实施方案中，针对HPI的抗体可用于分析患者组织(例如：肝脏活检)或血清样品中HPI的存在情况，其中异常的HPI水平可以提示肝细胞癌的存在、此处所用的“异常水平”是指相对于来源于身体一部分或无肝细胞癌受试者的类似样品中的HPI水平或标准水平，HPI的水平的上升或下降。
可以使用的免疫分析方法包括但不限于竞争和非竞争分析系统，使用的技术例如：Western印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、夹心式免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体固定分析、免疫放射量度分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等等，此处仅指出其中的一些。
如果可能，HPI可以用一种两步法的夹心分析进行测定。此处，HPI代表蛋白质的一种特定糖基化形式。第一步，可用一种抗-HPI抗体(该抗体任选地固定于固相)捕捉HPI；第二步，可用一种直接或间接标记的凝集素检测捕捉到的HPI，任何优先结合HPI而不是与下列蛋白质结合的凝集素都可以用于此目的：(a)、具有与HPI相同核心蛋白质的其它糖基化形式(glycoform)；或是(b)、具有共同的抗体识别的抗原决定簇的其它同种型。在一个优选的实施方案中，选用的凝集素与HPI的亲和力和与具有与HPI相同核心蛋白质的其它糖基化形式的亲和力相比，或者和与具有共同抗体识别的抗原决定簇之其它同种型的亲和力相比，至少高出2倍，更优选的，至少高出5倍；仍然更优选的，至少高出10倍。适用于测定给定HPI的凝集素可以用本领域熟知的方法进行鉴定，例如检测列于下列参考文献第158-174页表Ⅰ列举的一个或多个凝集素：Sumar等，凝集素可作为疾病相关的糖基化形式的指示剂，摘自：GabiusH-J & Gabius S(编)，1993，凝集素与糖生物学，第158-174页。(此处全文引入作为参考文献)
如果需要，将应用编码HPI基因、相关基因和相关的核苷酸序列及亚序列(包括互补序列)进行杂交分析。编码HPI的核苷酸或含有大约至少8个核苷酸的亚序列(或其互补序列)可以用作杂交探针。杂交方法可用于尤其是经过手术或其它方式治疗的肝细胞癌或复发性肝细胞癌中伴随的HPI基因表达的异常改变之检测、预后、诊断，或用于监测病情和病况。在一特定的实施方案中，这种杂交方法能够在杂交可发生的条件下，将含有病人核酸的样品与核酸探针混合，所述探针能与编码HPI的DNA或RNA杂交，并检测或测定任何产生的杂交结果。
本发明也提供了包含置于一个或多个容器中的抗体的诊断试剂盒。此外，这样的试剂盒可任选的包含以下一种或多种内容：(1)、用于诊断、预后、治疗监测、药物开发或这些应用任一组合应用的抗-HPI抗体的使用说明；(2)、许可证书。也就是一种管理药品或生物制品生产、使用和销售的政府部门认可形式的通知，它表明了与用于人类测试或管理的生产、使用或销售有关的部门的认可。(3)、标记的针对抗体的结合配基。(4)、固相(例如：试剂纸条)，其上固定有抗-HPI抗体。如果没有提供抗体的标记结合配基，那么抗-HPI抗体本身可以用一示踪标记物标记，例如：化学发光的、酶的、荧光的或放射性的基团。
本发明也提供了一种试剂盒，包含分装于一个或多个容器中的能与编码不同HPI的RNA杂交的核酸探针。在一个特定的实施方案中，试剂盒包含分装于一个或多个容器中的一对引物(例如：每个的长度为6-30个核苷酸，更优选的，为10-20个核苷酸)，这些引物在适当的反应条件下能引发编码一种HPI的核酸(至少是其中一部分)的扩增，例如通过聚合酶链式反应(例如参见：Innis等，1990，PCR操作规程(PCRProtocol)，学院出版公司，圣地亚哥，加利福尼亚)、使用Qβ复制酶的连接酶链式反应(参见EP320，308)、环式探针反应或本领域已知的其他方法。
本发明同样提供了允许用于多个HPI或各自编码一种HPI的多个核酸检测的试剂盒。试剂盒可进一步任选的包含预先定量过的一种分离的HPI蛋白质或编码HPI的核酸，例如用作标准或对照。5.3．在临床研究中的应用
本发明的诊断方法和组合物可以有助于指导或监测临床研究，例如，测试用于肝细胞癌治疗的药物。在一个实施方案中，可以测试候选分子恢复肝细胞癌患者HF或HPI水平至非肝细胞癌受试者水平的能力，或在治疗过的患者中(例如手术治疗后)保持HF或HPI水平达到或接近非肝细胞癌患者水平的能力。可以分析一个或多个HF或HPI的水平。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于临床研究筛选候选者中肝细胞癌个体的鉴定，随后，这些个体可以包括于或排除于研究中或单独用于治疗或分析。如果需要，这些候选个体可同时进行筛选，以鉴定患有B型和/或C型肝炎的个体。用于这些筛选的方法都是本领域熟知的，包括例如：检测针对一种或多种B型肝炎抗原或C型肝炎抗原的抗体的血清学研究，以及鉴定一个或多个来源于B型或C型肝炎基因组的寡核苷酸序列的PCR研究。5.4．HPI的纯化
在某些特定方面，本发明提供了已分离的HPI，优选的，人类HPI及其片段和衍生物，其包含抗原决定簇(也就是能被抗体识别)或者说是具有功能活性的，以及编码前述的核酸。此处所用的“具有功能活性的”HPI是指那些表现出具有一个或多个已知的与全长HPI(野生型)相关的功能活性的材料，例如：与HPI底物或结合配基结合、抗原性(与抗靶抗体结合)、免疫原性等。
在一个特定实施方案中，本发明提供了一种HPI的片段，包含至少6个氨基酸、10个氨基酸、50个氨基酸或至少75个氨基酸。也提供了片段或包含片段的缺失HPI某些或全部区域的蛋白质，还提供了编码前述物质的核酸。
一旦鉴定出表达HPI基因序列的重组核酸，就可以对其基因产物进行分析。这可以通过建立于产物物理或功能性质之上的分析来完成，包括产物放射性标记后的凝胶电泳分析、免疫分析等。
一旦鉴定出HPI，它就可以用标准方法进行分离和纯化，包括层析(例如：离子交换层析、亲和层析和分子筛柱层析)、离心、溶解度差异或其它用于蛋白质纯化的标准技术。
另外，一旦鉴定出由重组核酸产生的HPI，那么HPI的整个氨基酸序列就能从重组体中包含的嵌合基因的核苷酸序列推导出来，因此，相应蛋白质可以用本领域已知的标准的化学方法进行合成(例如参见Hunkapiller等，1984，自然(Nature)，310：105-111)
在另一个实施方案中，天然HPI可以从天然来源用前述的标准方法纯化(例如：免疫亲和纯化)。
在一个优选的实施方案中，HPI用美国申请第08/980，574和WO98/23950优选技术所述的方法进行分离，在此引入作为参考。进行“制备级”操作时，根据Westermeier，1993，实践中的电泳技术(VCH，Weinheim，德国)，第197-209页(此处全文引入以作参考)描述的方法，等电聚焦步骤中优选“窄范围”的“聚集胶”，其pH范围为2个pH单位或更少。这种方法上的修改允许在胶上加载更大量的目标蛋白质，因而可以增加可从胶上回收的分离HPI的量。当以此方式进行制备级操作时，优选的技术在一次操作一般可提供近100ng及可高达1000ng分离的HPI。本领域技术人员应当理解聚集胶可用于使用凝胶等电聚焦的任何分离策略。
在本发明的一个特定实施方案中，重组DNA技术或化学合成方法或天然蛋白质纯化方法得到的HPI包括(但不局限于)，那些一级氨基酸序列上含有HPI全部或部分氨基酸序列的成分，以及其片段、其它衍生物、和类似物、包括其同源蛋白质。5.5．针对HPI的抗体的生产
依照发明，HPI及其片段、其它衍生物或类似物可以用作免疫，用以生产可免疫特异性结合这种免疫原的抗体。这些蛋白质、片段、衍生物或类似物可用任何传统的方法加以分离，包括本申请前一部分叙述的方法。产生的抗体包括但不局限于多克隆、单克隆、嵌合的、单链的、Fab片段以及Fab表达文库。在一特定的实施方案中，生产了针对人HPI的抗体。在另一个实施方案中，生产了针对HPI的结构域的抗体。在一个特定的实施方案中，HPI的亲水片段用作免疫原，用于抗体的生产。
本领域已知的多种方法可用于针对HPI或其衍生物、类似物的多克隆抗体生产。在一个特定的实施方案中，可以获得针对HPI的一个表位或其亚序列的多克隆抗体。多种宿主动物可以通过注射天然的HPI或合成的HPI或其衍生物(例如片段)来免疫，从而生产抗体。这些宿主动物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、马、山羊、鸡等。多种佐剂可以用于增强免疫反应，这依赖于宿主动物的物种，这些佐剂包括但不局限于完全或不完全福氏佐剂、矿物胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，例如：溶血卵磷脂、多聚醇类(Pluronic Polyols)、多聚阴离子类、肽类、油乳剂类、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在的有用的人类佐剂，如BCG(卡芥苗)以及小棒状杆菌(Corynebaeterium parvum)。
为了制备针对HPI序列或其类似物的单克隆抗体，可以采用任何能够用连续培养的细胞系来产生抗体分子的技术。例如：最初由Kohler和Milstein发展起来的杂交瘤技术(1975，自然，256：495-497)以及三方杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫(Immunology Today)，4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cote等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer therapy)，Alan R Liss公司，第77-96页)(此处以上文献引入用作参考)。在发明的另外一个实施方案中，单克隆抗体可以在PCT/US90/02545(此处引入用作参考)中描述的无菌动物中产生。根据发明，可使用人抗体或可由人杂交瘤获得(Cote等，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sei.USA)，80：2026-2030)，或体外用EBV病毒转化人类B细胞获得(Cole等，1985，摘自：单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss公司，第77-96页)。实际上，根据发明，可以使用通过将特异识别HPI的鼠抗体分子的基因与具有合适生物活性的人抗体基因剪接，形成嵌合抗体(Morrison等，1984，美国国家科学院院报，81：6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312：604-608；Takeda等，1985，自然，314：452-454)的技术，这种抗体也在此发明范围之内。(此处引入以上每一个文献作为参考)。
根据发明，用于生产单链抗体的技术(美国专利4946，778，此处引入用作参考)可以经调整以用于生产HPI特异性单链抗体。在本发明的另一个实施方案中，使用用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，科学(Science)，246：1275-1281)以快速方便的鉴定对HPI、衍生物或类似物具有理想特异性的单克隆Fab片段。
可以使用已知的技术生产含有分子独特型的抗体片段。例如：这些片段包括但不局限于：抗体分子经胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段；F(ab’)2片段还原二硫键后产生的Fab’片段、抗体分子经木瓜蛋白酶和还原剂处理产生的Fab片段，以及Fv片段。
在抗体的生产过程中，目标抗体的筛选可以用本领域已知的技术来完成，例如：ELISA(酶联免疫吸附分析)。例如，为了选择能够识别HPI特定结构域的抗体，我们可以分析产生的杂交瘤，其产物能够与包含这样的结构域的HPI片段结合。为了选择能够特异性结合第一个HPI同系物而不特异性结合不同的HPI同系物的抗体，我们可以在第一个HPI同系物结合呈阳性而缺乏与第二个HPI同系物结合能力的基础上来进行筛选。类似的，为了选择能够特异性结合HPI而不特异性结合同一蛋白质的不同同种型(例如，与HPI具有相同核心肽的不同糖基化形式)的抗体，我们可以在HPI结合阳性而缺乏与不同同种型(例如糖基化形式)结合能力的基础上来进行筛选。
同样提供了对HPI的一个结构域为特异的抗体。
前述抗体可以用于本领域已知的与本发明HPI的定位和活性相关的方法，例如：这些蛋白质的显像、在适当生理样品中HPI水平的测定和在诊断方法中等等。5.6．编码HPI的DNA的分离
下面将以实施例的方式，不加任何限制的阐述用于HPI基因克隆的特定的实施方案。
本发明的核苷酸序列(包括DNA和RNA)包含编码HPI或其片段、其类似物的序列，可以用本领域已知的方法合成，例如使用传统的化学合成方法和重叠寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)扩增。这些序列同样也可用作来自任何物种的HPI基因的克隆和鉴定，例如用于筛选cDNA文库、基因组文库或表达文库。
包含本发明中HPI编码序列的核苷酸序列可用于与其它蛋白质基因的互补序列选择性形成二聚体分子。依赖于不同的应用，多种不同的序列可以通过多种杂交条件来实现。
为了获得高度的选择性，可以使用相对苛刻的条件来形成二聚体，例如低盐或高温条件。此处所用的“高度严格条件”是指与滤膜上结合的DNA进行的杂交是在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA、65℃；在0.1×SSC/0.1％SDS、68℃下清洗。(Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程(Current Protocols in Molecular Biology)，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley& sons公司，纽约，第2.10.3页；此处完整引入作为参考)。对于某些应用，需要不甚严格的杂交条件。此处所用的“中度严格的条件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS、42℃条件下清洗(Ausubel等，同上)。杂交条件也可以通过增加甲酰胺的量以使杂交二聚体去稳定而变得严格。因而特定的杂交条件可以容易的操纵，一般应当根据所预期的结果来选择。例如，传统的杂交温度在50％甲酰胺存在下是：对于与HPI基因片段有95-100％同源性的探针为42℃；90-95％同源性的为37℃；70-90％同源性的为32℃。
在基因组文库的制备中可以产生DNA片段，其中有些编码HPI的一部分或全部。DNA可能用多种限制性内切酶在特定位点切开。另外，可以在锰存在下使用DNA酶将DNA打碎，或者用物理方法将DNA剪切，例如用超声波。随后DNA片段可以根据大小用标准的方法进行分离，包括但不局限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析和蔗糖梯度离心。然后DNA片段可插入到适当的载体，包括但不局限于质粒、粘粒、λ或T4噬茵体和酵母人工染色体(YAC)(参见，例如，Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；GloverD.M.(编)，1985，DNA克隆实验方法(DNA Cloning：A PracticalApproach)，MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷；Ausubel F.M.等编，1989，分子生物学通用操作规程，第一卷，Green出版联合公司和John Wiley& sons公司，纽约。)基因组文库可以通过将核酸与标记的探针进行杂交来筛选(Benton和Davis，1979，科学，196：180；Grunstein和Hogness，1975，美国国家科学院院报，72：3961)。
基因组文库可以用相应于HPI的任一多肤的氨基酸序列之标记的简并性寡核苷酸探针，使用本领域熟知的最适方法进行筛选。所用的探针优选的至少10个核苷酸(更优选的，15个核苷酸，仍旧更优选的，20个核苷酸)。
如前述表Ⅲ、表Ⅳ所示，此处公开的一些HPI对应于先前已鉴定的一些蛋白质，其编码基因的序列也已公开。要筛选这样的基因，可以使用任何与这些基因和其互补序列互补的探针，优选的，探针长度为10核苷酸或更长，更优选的，15核苷酸或更长。使用国家生物技术信息中心(NCBI)的检索数据库(其网址为：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，对于HPI-16，NCBI没有提供丰富的数据)可以通过下述检索号获得这些HPI的基因序列，此处引入每个基因的序列以作参考。
表ⅤHPI相关蛋白质的基因序列
对于HPI-13和HPI-21，其对应的一组简并性探针列于下面：
a)HPI-21的探针
文库中，含有编码HPI或其片段的目的DNA插入序列之克隆可以和一个或多个简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交。这种寡核苷酸探针与基因组文库的杂交可以使用本领域已知的方法进行。例如：与前面介绍的系列简并性寡核苷酸探针(或其互补序列)杂交(或与这样的系列中的任何成员或其互补序列杂交)。这种杂交可以在前面所述的高度严格或中度严格的条件下进行，或可在2×SSC，1.0％SDS，50℃的反应和清洗条件下进行。
另一方面，编码HPI部分或全部核苷酸序列或HPI衍生多肽的核苷酸序列之克隆可以通过筛选表达文库获得。例如：适当来源的DNA分离后，制备随机片段，然后连接入一个表达载体(例如：噬菌体、质粒、噬茵粒和粘粒)以致于载体进入宿主细胞后而使载体中的插入片段能被宿主表达。多种筛选分析可用于选择表达的HPI或HPI衍生多肽。在一个实施方案中，本发明的多种抗HPI抗体通过本领域已知的方法可用于鉴定目标克隆，参见，例如：Harlow和Lane，1998，抗体实验手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约，附录Ⅳ。将文库中的克隆或噬茵斑与这些抗体结合从而鉴定的结合的克隆。
在一个实施方案中，根据Olsvick等，第二十九届ICAAC，休斯顿，得克萨斯，1989的文献(此处引入用作参考)，含有编码HPI或HPI衍生多肽的序列之克隆或噬茵斑可以用DYNA珠来鉴定。抗HPI抗体偶联于甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，这些抗体包被珠可用于吸附至表达HPI和HPI衍生多肽的克隆或噬茵斑。表达HPI或HPI衍生多肽的克隆或噬茵斑可通过这种结合而得到鉴定。
另外，抗HPI抗体可以非特异性的固定化于适当的支持物上，例如：硅质或硅藻土(CelsiteTM)基质。这些材料可用于吸附表达HPI或HPI衍生多肽的细菌克隆。
另一方面，PCR扩增可用于产生编码部分和全部来源于基因组DNA中的HPI的基本上纯的DNA。简并的或其它的对应于已知HPI序列的寡核苷酸引物可用作引物。
PCR可以使用Perkin-Elmer Cetus的PCR扩增仪和热稳定的DNA聚合酶，例如：水生栖热茵(Thermus aquaticus)DNA聚合酶(Gene AMPTM或AMPliTaq DNA聚合酶)来进行。可以选择合成数个不同的简并性引物用于PCR反应。也可以改变引发PCR杂交反应的杂交条件的严格程度，以适应简并性引物和DNA序列中相应序列的更高的或更低的核苷酸序列相似性。成功地扩增编码HPI的序列的一个片段后，这一片段可以进行分子克隆和测序，并用作探针分离完整的基因组克隆。进而允许鉴定基因的完整核苷酸序列，及对其表达进行分析，生产用于如下所述的用于功能研究的蛋白质产物。
HPI基因也可以通过核酸杂交后体外翻译来筛选mRNA的方法进行鉴定。在此方法中，片段用于通过杂交分离互补的mRNA。这样的DNA片段可能代表着另一物种可用的纯化的HPI DNA(例如：鼠或人)。对分离的mRNA之分离产物的体外翻译产物进行免疫沉淀分析或功能分析(例如：体外聚集能力、受体结合能力)可以鉴定目标mRNA，因而可鉴定包含目标序列的互补DNA片段。另外，特异性mRNA可能通过从细胞分离出的多核糖体与固定化特异性针对HPI的抗体之吸附来选择。使用选择的mRNA(来自吸附的多核糖体)作为模板可以合成放射性标记的HPI的cDNA片段。放射性标记的mRNA或cDNA能用作探针，鉴定来自其它基因组DNA片段的HPI的DNA片段。
分离HPI基因组DNA的替代方法包括但不局限于，从一已知的序列化学合成基因序列本身，或制造针对编码HPI的mRNA的cDNA。例如：用于HPI基因cDNA克隆的RNA可以从表达HPI的细胞中分离出来。其他方法也是可能的并也在本发明的范围之内。
任何真核细胞潜在的可以作为HPI基因分子克隆的来源。编码HPI的核酸序列可以从以下材料分离：脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、狗、以及其它灵长类动物来源、昆虫、植物等等。DNA可以通过本领域已知的标准方法从克隆的DNA(例如DNA文库)获得，可以通过化学合成、cDNA克隆或基因组DNA或其片段克隆，或纯化自目标细胞。(参见，例如：Sambrook等，1989，分子克隆实验手册)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；Glover D.M.(编)，1985，DNA克隆实验方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，MRL出版有限公司，牛津，英国，第Ⅰ、Ⅱ卷)。来源于基因组DNA的克隆除了包含编码区域以外，还可能包含调节序列和内含子DNA序列。来源于cDNA的克隆可能只包含外显子序列。不管来源如何，HPI基因应当通过分子克隆插入到一个适当的载体中以便进行扩增。
已分离的和已鉴定的基因或cDNA可随后插入到一个合适的克隆载体中。本领域大量的已知的载体宿主系统可用于此目的。可能的载体包括但不局限于，质粒或修饰的病毒，但是，载体系统必须和使用的宿主细胞相适应。这样的载体包括但不局限于，噬菌体例如λ噬菌体衍生物，或质粒例如PBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。可以通过将DNA片段连接入含互补粘性末端的克隆载体来完成这种插入过程。但是，如果克隆载体中不含用于切开DNA的互补限制性位点，那么DNA分子末端可被酶促修饰。另外，任何目的位点可以通过向DNA末端连入核苷酸序列(连接子)产生。这些连接子可包含编码限制性内切酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一个替代方法中，切开的载体和HPI基因可能通过同源多聚尾来修饰。重组分子可通过转化、转染、感染、电转化等手段引入宿主细胞，以使基因序列产生许多拷贝。
在一个特定的实施方案中，用掺入分离的HPI基因、cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，可以产生基因的多个拷贝。因而通过培养转化体，从其中分离重组DNA分子，可以获得大量的基因，需要时，可以从分离的重组DNA中回收插入基因。
本发明提供的HPI序列包含那些编码与天然HPI中发现的氨基酸序列基本上相同的核苷酸序列，以及那些编码具有同等功能氨基酸的序列和编码其他目标衍生物或类似物的序列。5.7．编码HPI的DNA的表达
编码HPI或具有活性功能类似物、片段或其它衍生物的核苷酸序列可以插入一个适当的载体，即含有插入蛋白质编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。这些必需转录和翻译信号可以由天然HPI基因提供，或者由HPI基因两侧区域提供。表达编码蛋白质序列可以选择多种宿主载体的表达系统。这些系统包括但不局限于，用病毒感染哺乳动物细胞的系统(如，痘病毒、腺病毒等等)；病毒感染的昆虫细胞表达系统(如杆状病毒)；微生物如带有酵母载体的酵母、噬菌体转化的细菌、DNA、质粒DNA或粘粒DNA。载体的表达元件的特异性和强度各不相同。依赖于所使用的宿主载体系统，可以使用若干适当的转录和翻译元件中的任何一个。在一个特定的实施方案中，表达了人的HPI基因或编码人HPI功能活性区的序列。在另外一个实施方案中，表达了包含HPI结构域的目标片段。
前面所述的用于将DNA片段插入到载体的任何方法可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，这一嵌合基因包含适当的转录和翻译调节信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组(遗传重组)。编码HPI或肽片段的核酸序列的表达可能受到第二核酸序列的调节，因此HPI或肽在用重组的DNA分子转化的宿主细胞中表达。例如，HPI基因的表达可以由本领域已知的任何启动子或增强子元件调节。可以用于调节HPI基因表达的启动子包括但不局限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，自然，290：304-310)，包含与鲁斯氏肉瘤病毒3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞，22：787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院院报，78：1441-1445)，金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等人，1982，自然，296：39-42)；原核表达载体，例如β-半乳糖苷酶启动子(Villa Kmaroff等人，1978，美国国家科学院院报，75：3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报，86：21-25)；亦参见“重组细菌中的有用蛋白质”，科学美国人(Scientific American)1980，242：74-94)；植物表达载体，包括胭脂碱合成酶启动子区域(HerrerraEstrella等人，自然，303：209-213)；花椰菜花叶病毒35S的RNA启动子(Gardner等人，1981，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，9：2871)，光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrerra Estrella等人，1984，自然，310：115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如：Gal4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子以及下述动物的转录调控区域，它们表现出组织特异性并已应用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶Ⅰ基因调控区；(Swift等人，1984，细胞(Cell)，38：639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港症状定量生物学(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)，50：399-409；MacDonald，1987，肝病学(Hepatology)，7：425-515)；在胰腺β-细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan，1985，自然，315：115-122)，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等人，1984，细胞，38：647-658；Adames等人，1985，自然，318：533-538；Alexander等人，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，7：1436-1444)，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等人，1986，细胞，45：485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等人，1987，基因与进展(Genes and Devel.)，1：268-276)，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf等人，1985，分子细胞生物学，5：1639-1648；Hammer等人，1987，科学，235：53-58)；在肝脏中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等人，1987，基因与进展，1：161-171)，在脊髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区(Mogram等人，1985，自然，315：338-340；Kollias等人，1986，细胞，46：89-94)；在脑少突细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调控区(Readhead等人，1987，细胞，48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因的调控区(Sani，1985，自然，314：283-286)以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因调控区(Mason等人，1986，科学，234：1372-1378)。
在一个特定的实施方案中，所用的载体包含与HPI编码核酸有效连接的启动子、一个和多个复制起点、以及任选地包含一个或多个选择标志(例如抗生素抗性基因)。
在一个特定的实施方案中，通过将HPI编码基因亚克隆入三个pGEX载体(谷胱甘肽S-转移酶表达载体；Smith和Johnson，1988，基因(Gene)，7：31-40)的每一个载体的EcoRⅠ限制性位点中，构建表达构建体，这可以允许从正确阅读框架的亚克隆来表达HPI产物。
包含HPI基因插入物的表达载体可以通过三种通用方法验证：(a)核酸杂交，(b)有或无“标志”基因功能，以及(c)插入序列的表达。第一种方法中，我们可以利用核酸杂交检测表达载体中HPI基因插入物的存在，所用的探针包含与插入的HPI基因同源的序列。第二种方法中，可以利用载体中HPI基因插入造成某一特定“标志”基因功能的存在或缺失，对重组载体/宿主系统进行鉴定和筛选(例如：胸苷激酶活性，抗生素抗性，转化表型，杆状病毒包含体形成等等。)。例如：如果HPI基因插入点位于载体的标志基因序列内，那么通过标志基因功能缺失可判定重组子中包含HPI基因插入序列。第三种方法中，可以通过检测重组体表达的HPI基因产物来验证重组表达载体。例如此分析可在HPI基因产物在体外分析系统中的物理或功能特性(例如与抗HPI抗体结合)的基础上进行。
一旦鉴定并且分离出某一特定重组DNA分子，就可利用本领域已知的多种方法进行扩增。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可对重组表达载体进行扩增和大量制备。如前所述，可用的表达载体包括但不局限于如下的载体或其衍生物：人类或动物病毒如痘病毒和腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬茵体载体(如λ)；质粒和粘粒DNA载体等等。
另外，可以选择调节插入序列表达，或以特定的理想方式修饰、加工基因产物的宿主细胞株。从一定启动子开始的表达在某些诱导剂存在下可以提高，因而可以控制遗传工程化的HPI的表达。进一步讲，不同的宿主细胞具有不同的特征性、特异性的用于翻译和翻译后加工和修饰机制(例如：蛋白质的糖基化和磷酸化)。可以选择合适的细胞系或宿主系统来保证表达的外源蛋白质进行所希望的加工与修饰。例如：在细菌系统中的表达可用于生产非糖基化的核心蛋白质产物。在酵母中的表达可产生糖基化产物；在哺乳动物细胞中的表达可以用于保证外源蛋白质的“天然”糖基化。此外，不同的载体/宿主表达系统可能影响加工反应的程度。
为了长期高产量生产重组蛋白质，应当优选稳定的表达。例如可以构建能稳定表达不同表达能力或途径的基因蛋白质的细胞系。不是使用含有病毒复制起始位点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达调控元件控制的DNA(例如：启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等)以及选择标志进行转化。引入外源DNA后，工程化细胞可在加富培养基中生长1-2天，然后转移至一种选择性培养基中。重组质粒中的选择标志可产生对选择压力的抗性，因而可使细胞稳定的将质粒整合入宿主染色体，而生长形成菌落，菌落进而可以进行克隆和增殖成细胞系。这种方法在形成表达不同表达的或途径基因蛋白质的工程细胞系方面具有许多优点。这种工程化细胞系在筛选和评价那些能影响不同表达能力的或途径基因蛋白质内源活性的化合物上特别有用。
许多选择系统可以使用，包括但不局限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞，11：223)，次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美国国家科学院院报，48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，细胞，22：817)基因可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用。抗代谢物抗性也可以用作选择下列基因的基础：dhfr，赋予氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，1980，美国国家科学院院报，77：3567；O’Hore等人，1981，美国国家科学院院报，78：1527)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligun和Berg，1981，美国国家科学院院报，78：2072)；neo，赋予对氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物学杂志(J.Mol.boil.)，150：1)以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因，30：149)。
在另一个实施方案中，HPI、片段、类似物或衍生物可表达为一个融合的、嵌合的蛋白质产物(包含通过肽键与外源蛋白质序列(不同的蛋白质)相连的蛋白质、片段、类似物、衍生物)。可通过将一编码目标氨基酸序列的适当核酸序列用本领域已知的方法以正确的编码框架相互连接起来，得到这种嵌合产物，然后用本领域公知的方法对嵌合产物进行表达。另外，这种嵌合产物可以用蛋白质合成技术生产，例如使用多肽合成仪。
cDNA和基因组序列都能进行克隆和表达。6．实施例患有肝细胞癌和未患有肝细胞癌病人血清中的蛋白质
使用下面的参考实验规程，从33例患有肝细胞癌的患者和19位患有肝硬化的患者的血清中，用等电聚焦和随后的SDS-PAGE进行分析，每个样品重复一次。6.1．样品制备
一收到血清样品即进行蛋白质分析(使用Pierce BCA Cat#23225)。将相当于总蛋白为300μg的血清按体积分为若干等份，每一份加入相同体积的10％(W/V)SDS(Fluka 71729)、2.3％(W/V)二硫苏糖醇(BDH443852A)。样品在95℃加热5分钟，然后冷却至20℃，然后向样品中加入125μl下述缓冲液：
8M尿素(BDH 452043w)
4％CHAPS(Sigma C3023)
65mM二硫苏糖醇(DTT)
2％(V/V)Resolytes 3.5-10(BDH 44338 2×)
此混合液旋涡混合后，在15℃、13000转/分钟条件下离心5分钟，上清液用等电聚焦分析。6.2．等电聚焦
等电聚焦(IEF)是使用ImmobilineDrystrip试剂盒(PharmaciaBioTech)，遵照产品的使用手册所述的方法进行的，参见ImmobilineDrystrip试剂盒的说明书，Pharmacia，#18-1038-63，版本AB(此处完整引入用作参考)。固定化的pH梯度(IPG)条(18cm，pH3-10非线性条带，Pharmacia Cat，#17-1235-01)在含有8M尿素、2％(W/V)CHAPS、10mM DTT、2％(V/V)Resolytes 3.5-10的溶液(ImmobilineDrystrip试剂盒的使用手册所述)中20℃再水化过夜。进行IEF时，将500μl上清液(上述方法制备)上样至碱性末段放置上样杯的条带上。上样胶用矿物油(Pharmacia 17-3335-01))覆盖，根据下述条件使用Pharmacia EPS3500XL电源(Cat 19-3500-01)立即向条带提供电压：
起始电压：300V 2小时
线性梯度：300V-3500V 3小时
稳定在3500V 19小时
对于所有的方法，电流限制为12个条带10mA，功率的限制为5W。温度始终保持在20℃。6.3．胶的平衡与SDS-PAGE
在最后的19小时步骤后，立即将条带切下来，并在组成为下述的第一溶液中20℃浸泡10分钟：6M尿素、2％(W/V)DTT、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fluka，49767)、0.05M Tris/HCl，pH 6.8(Sigma，Cat：T-1503)。条带从第一溶液中移出，然后在组成为下述的第二溶液中20℃浸泡10分钟：6M尿素、2％(W/V)碘乙酰胺(Sigma，I-6125)、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fluka，49767)、0.05M Tris/HCl，pH6.8．从第二溶液中将条带移出，然后将条带加到支持胶上面，依据Hochstrasser等人，1988，分析生物化学(Analyticai Biochemistry)，173：412-423(此处完整引入用作参考)所述的方法进行SDS-PAGE，并作下述修改。6.4．支持胶的制备
凝胶在两块如下尺寸大小的玻璃平板间形成：后板23cm宽，24cm长，前板23cm宽，24cm长，在中央有一19cm长2cm深的刻痕。为了提高SDS-PAGE凝胶的共价联结，后板用0.4％的γ-异丁烯酰基-氧丙基三甲氧硅烷的乙醇溶液(BindSilaneTM(Pharmacia Cat#17-1330-01)处理。前板用RepelsilaneTM(Pharmacia Cat#17-1332-01)处理，以减少凝胶的粘附。多余的试剂用水清洗除去，将平板放干。在此时，将一粘性条形码贴于后板上一适当的位置(不至于与凝胶基质接触)作为区分凝胶和平板衬层的标志。
已干的平板装入容量为13个凝胶夹槽的装胶盒上，每一夹槽的上下平板用2.5cm宽、1mm后的垫片隔开，夹槽相互之间用醋酸纸隔开，以利于凝胶聚合后夹槽的分离。然后按照Hochstrasser等人前述文献所用方法制备模具。
使用Angelique梯度凝胶灌注系统(大规模生物学)，灌注9％-16％的线性聚丙烯酰胺凝胶梯度，直至前板刻痕下方2cm处。所用储备液如下：丙烯酰胺(40％水溶液)(Serva，Cat#10677)，交联剂为PDA(BioRad161-0202)，浓度为总起始单体总量的2.6％(W/V)。凝胶缓冲液为0.375MTris/HCl，pH 8.8，聚合催化剂为0.05％(V/V)TEMED(BioRad 161-0801)，引发剂为0.1％(W/V)的APS(BioRad 161-0700)。凝胶中不含SDS，不使用层积胶。灌制好的凝胶可以在20℃过夜聚合，然后在密闭的聚乙烯袋中在6ml凝胶缓冲液中4℃保存，并在4周内使用。6.5．SDS-PAGE
在电泳缓冲液(0.025M Tris、0.198M甘氨酸(Fluka 50050)、1％(W/V)SDS，加入少量的溴酚蓝)中配制0.5％(w/v)的琼脂糖(FlukaCat 05075)溶液。琼脂糖混悬液在搅拌的情况下加热到70℃，直至琼脂糖溶解。在双向支持胶的上方灌入琼脂糖溶液，然后将平衡条带放入琼脂糖中，用平面刀将凝胶轻轻敲打直到与双向胶刚好接触。按照Amess等人，1985，电泳(Electrophoresis)，16：1255-1267)(此处完整引入用作参考文献)所述方法将凝胶放入双向电泳槽中。电泳槽中充有上述电泳缓冲液，液面刚好高于包含聚丙烯酰胺凝胶的双向胶的顶端，这样可以使活性凝胶区域得到充分的冷却。将电泳缓冲液加入到由凝胶形成的顶部缓冲液池，然后使用Consort E-833电源立即向凝胶加上电压。凝胶在20mA/凝胶的条件下电泳1小时。功率限制设定为：每一个含6个凝胶的电泳槽150W；电压限制设定为：600V。1小时后，凝胶在同上的功率和电压限制下，40mA/凝胶的条件下电泳，直至溴酚蓝线距凝胶底端0.5cm处。在整个电泳过程中缓冲液温度应保持在10℃。6.6．染色
电泳完成后，立即将凝胶从电泳槽中移出进行固定。仔细地将凝胶盒上方的顶端平板取出，使凝胶粘在底端平板上。把粘有凝胶的平板放入染色器皿中，每个这样的器皿可以放12个凝胶。将凝胶完全浸泡于固定溶液中：40％(V/V)乙醇(BDH 28719)、10％(V/V)乙酸(BDH 100016X)、50％(V/V)水(MilliQ-Miliipore)，固定过程中使固定液始终绕凝胶流动。固定过夜后，从固定器皿中去除固定液，将凝胶浸泡于7.5％(V/V)乙酸、0.05％(W/V)SDS、92.5％(V/V)水中清洗30分钟。从预染溶液取出后，将凝胶完全浸泡于染色溶液中4小时。荧光染料溶液是根据SyproRed(分子探针，Eugene公司，俄勒岗)的使用说明将其稀释，然后用0.4μm滤膜在抽真空条件下将其滤过制备的。6.7．凝胶成像
使用Storm扫描仪(分子动力学，Sunnyvale，加利福尼亚)按照其使用说明(见Storm用户手册，1995，4.0版本，零件号：149-355，此处完整引入用作参考)对经荧光染色的凝胶进行成像，可以得到一个计算机可读的结果，方法作了如下的修改：凝胶从染液取出后，轻轻用水清洗，然后于Storm扫描仪上成像，成像条件：PMT1000V红色荧光模式，分辨率为200μm。既然凝胶刚性的结合于玻璃板上，因而在成像过程中凝胶就可以和扫描仪床体接触。为了避免凝胶和扫描仪床体之间的不一致的接触造成的干扰，可以在凝胶下面加水膜，并小心不要产生气泡。而且，凝胶应当放于由两个荧光按钮形成的框架中，这两个按钮与凝胶一起成像，可以提供用于鉴定在凝胶中发现的其它特征的X、Y参考点。在机械切胶器上提供有一个匹配框架，可以用于对凝胶进行正确的排列比较。成像完成后，将凝胶密封于含有少量染色溶液的聚乙烯袋中，4℃保存。6.8．数据的数字化分析
使用美国申请第08/980574，5.4、5.5节(此处引入用作参考)所述方法对数据进行处理。下面进行更详细地描述。6.8.1检测结果的计算机分析
扫描仪的结果首先使用MELANIEⅡ2D PAGE分析软件(版本2.2，1997，伯乐实验室，大力神，加利福尼亚，Cat.#170-7566)进行处理，以自动发现参考点：M1和M2，自动修剪图像(也就是去除凝胶边界以外的扫描区产生的图像，例如参考图框)；根据污染去除人为假象；发现特征并对其进行定量；以GIF文件格式产生图像文件。使用以下参数检测特征：
平滑度=2
调和量算子阈：50
部分阈：1
饱和度=100
峰态峭度=0
最小周长=106.9 PI和MW的测定
图像要进行评定以判断是否可以舍弃，舍弃标准是图像存在明显的异常、或有过高或过低的上样量或总体图像强度、或分辨率很低、或平行样品十分不同。如果平行样品中有一个图像需要舍弃，那么另一个也必须舍弃，不管其图像质量如何。舍弃的样品要安排进行重新分析。
使用界点鉴定来测定在凝胶中发现的特征的等电点和分子量。这些方法包括在任何给定的生物样品中都预计可见的特定蛋白质的鉴定。由于这些共同蛋白质在不同的样品中表现出相同的等电点和分子量，因而它们可以用作标准；这一方法同样适用于任何可能的凝胶变化或异常。
由正常血清凝胶的数据集，我们可以人为选出一个凝胶作为第一原版胶。然后通过比较此第一原版胶中发现的特征与先前正常人血清双向电泳鉴定出的特征的差异，可以对界点特征进行鉴定(参见：Bjellqvist等人，1993，电泳，14：1357-1365，此处完整引入用作参考)。
在第一原版胶中鉴定出十四个界点特征，标记为PL1-PL12和PL15-PL16。这些界点特征鉴定显示于图1，其pI和/或MW值列于表Ⅴ。表Ⅴ本研究中使用的界点特征
| 名称 | pI | MW(kd) | 名称 | pI | MW(kd) |
| PL1 | 无 | 186，073 | PL8 | 6.47 | 47，195 |
| PL2 | 6.20 | 100，000 | PL9 | 5.29 | 43，541 |
| PL3 | 4.73 | 93，708 | PL10 | 5.22 | 23，000 |
| PL4 | 5.13 | 73，465 | PL11 | 4.47 | 25，183 |
| PL5 | 4.97 | 52，739 | PL12 | 5.52 | 13，800 |
| PL6 | 4.10 | 无 | PL15 | 7.80 | 36，962 |
| PL7 | 4.80 | 40，997 | PL16 | 8.58 | 无 |
在数据集中的每一个凝胶中鉴定尽可能多的这些界点特征。
根据最靠近的两条已经分配pI值的界点，使用内插法/外推法(使用MELANIE Ⅱ软件)为原版胶中所有特征分配一个pI值；根据最靠近的两条已经分配MW值的界点，使用内插法/外推法(使用MELANIEⅡ软件)为原版胶中所有特征分配一个MW值。每一个特征使用成为其分子簇序号(MCI)的唯一数字作为标记。
第二原版胶选择硬化胶和HCC胶。使用MELANEⅡ软件提供的运算法则(MELAMEⅡ2D PAGE(版本2.2)使用说明(Melanie集团，日内瓦，瑞士)中A节第8-10页，对这些凝胶中的特征与原版胶中的共同特征进行配对。能够配对的特征就可以与相应的MCI联系起来，因而可以获得相应的pI和MW值。这些第二原版胶中不能配对的特征可以通过使用MelanieⅡ软件参考界点的pI和MW，由线性内插/外推法为其分配pI和MW。然后为这些特征分配一个MCI入口值。6.9.1图形的构建
数据集中所有的凝胶现在都和第一和第二原版胶相匹配，配对的特征都在分子簇索引(MCI)中与相应的入口值联系起来。
通过界点和匹配方法将多份胶排列比较，以找到平行凝胶中成对的相同点。它可以提高分析的准确度，以保证随后的pI和MW测量的准确，因为配对的斑点显示分离的重复性，同时可以去除人为假象。
测定每一个蛋白质斑点的强度并保存。每一个蛋白质斑点被分配一个鉴定码并与原版胶中的斑点匹配。
产生了对于代表一个血清样品的每一个平行组分析这一方面的最终结果。对于每一个鉴定斑点的数字化图形包含：1)唯一的一个给定鉴定码；2)X，Y值；3)等电点；4)分子量；5)信号值；6)每一个前述测定的标准偏差；以及7)与该斑点匹配的原版胶上斑点的MCI的指针。借助实验室信息管理系统(LIMS)的能力，这种图形可以回溯到产生该图的实际储存的凝胶上，因此，由计算机分析凝胶图形数据库所鉴定的蛋白质是可以检索的。同时，LIMS可以允许将图形回溯到原始样品或患者。6.9.2样品间的交叉配合
一旦形成了图形，分析就指向目标蛋白质的选择。图形中的每一个有意义的特征都被赋予一个索引，“分子簇索引”，它能够鉴定所有凝胶中的特征，并且可作为前述特征的(1)-(7)参数的指针。对于每一种样品类型(也就是肝细胞癌血清和肝硬化血清)，可以由原版胶产生一个分子簇表。相同类型的所有其它样品的凝胶都可以和相关的第一和第二原版胶进行匹配。然后，每一个样品的数字化图形通过增加(已匹配的特征)分配给在原版胶中的特征相应的MCI来加以注释。6.9.3图形的差别分析
在每一个样品组中(肝细胞癌血清或肝硬化血清)，分析图形以鉴定和选择在至少50％以上的图形中存在的那些特征。然后将这些选择的特征组成一个肝细胞癌血清特征组和一个肝硬化血清特征组。然后比较每一个特征组中的匹配特征，来鉴定在肝细胞癌血清和肝硬化血清间平均强度至少有2倍差异的那些特征。不同存在的这些特征可以鉴定为肝细胞癌诊断特征(HF)。6.9.4 HF的统计学分析
对于每一个HF，使用学生t检验比较33例肝细胞癌患者血清图形和19例肝硬化患者血清图形中的HF的信号强度的分布，进行统计学分析。对于每一个HF可以得到一个P值。6.10所选蛋白质的回收与分析
使用美国申请第08/980，574(此处完整引入用作参考)所述的优选技术，HF中的蛋白质可以被机械切除，并被加工形成胰蛋白酶切肽。这些肽的部分氨基酸序列可以通过质谱分析使用从头测序加以测定。6.11结果
与肝硬化血清进行比较，这些初始实验鉴定出在肝细胞癌血清中降低的17个特征和升高的44个特征。这些HF的详细资料和相应的P值列于表Ⅰ和表Ⅱ中。每一个HF在肝细胞癌血清中以不同于在非肝细胞癌血清中的方式存在(p＜0.1)。对于某些优选的HF(HF-1、HF-3、HF-10、HF-15、HF-16、HF-17、HF-18、HF-19、HF-20、HF-21、HF-23、HF-24、HF-25、HF-26、HF-28、HF-29、HF-31、HF-32、HF-33、HF-34、HF-36、HF-37、HF-38、HF-39、HF-40、HF-42、HF-44、HF-46、HF-47、HF-48、HF-49、HF-51、HF-52、HF-53、HF-54、HF-55、HF-56、HF-59和HF-60)，差异更显著一些(p≤0.01)；对于一些高度优选的HF(HF-1、HF-17、HF-18、HF-20、HF-21、HF-23、HF-24、HF-25、HF-28、HF-29、HF-31、HF-33、HF-34、HF-36、HF-39、HF-44、HF-51、HF-52、HF-54、HF-55、HF-59和HF-60)，差异甚至更显著一些(p≤0.001)。这些HF中不同存在的HPI的部分氨基酸序列已鉴定出。这些HPI的详细资料列于表Ⅲ和表Ⅳ。公用数据库的计算机检索发现，至少有两个HPI的部分氨基酸序列和编码其肽序列的寡核苷酸在所检数据库中没有记录。表Ⅳ所示几个HPI为同一蛋白质的同种型。例如：HPI-2、HPI-6、HPI-8、HPI-14、HPI-15、HPI-17和HPI-18是补体因子4的同种型；HPI-4、HPI-5和HPI-12是补体因子3的同种型；HPI-19、HPI-20和HPI-21是血浆铜蓝蛋白的同种型。这些同种型据信来源于翻译后加工过程(例如：糖基化、磷酸化、乙酰化和最小蛋白质水解)。
本发明不局限于特定的列举的实施方案，这些实施方案意在将发明的单一方面表述清楚。实际上，根据前面描述对本发明进行除此处所列出的以外的修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改都落在所附带的权利要求书的范围内。
此处所引用的出版物都以完整形式引入用作参考。
序列表<110>PAREKH,Rajesh Bhikhu
PATEL,Thakorbhai Parshotambhai
TOWNSEND,Robert Reid
MOYSES,Christopher
JOHNSON,Philip J
Oxford GlycoSciences(UK)Ltd.<120>用于肝细胞癌诊断的方法和组合物<130>Oxford Glyco<140>PCT/GB99/00458<141>1999-02-15<150>GB 9803138.8<150>1998-02-13<150>GB 9803269.1<151>1998-02-16<160>38<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>12<212>PRT<213>人<400>1Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>人<400>2Arg Gly Leu Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Arg1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>人<400>3Lys Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>人<400>4Lys Gly Tyr Thr Gln G1n Leu Ala Phe Arg1 5 10<210>5<211>15<212>PRT<213>人<400>5Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg1 5 10 15<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Arg Thr Tyr Asn Val Leu Asp Met Lys1 5<210>7<211>14<212>PRT<213>人<400>7Lys Ala Glu Met Ala Asp Gln Ala Ser Ala Trp Leu Thr Arg1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人<400>8Lys His Leu Ser Leu Leu Thr Thr Leu Ser Asn Arg1 5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人<400>9Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg1 5 10<210>10<211>15<212>PRT<213>人<400>10Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg1 5 10 15<210>11<211>13<212>PRT<213>人<400>11Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg1 5 10<210>12<211>6<212>PRT<213>人<400>12Ala Glu Thr Thr Asp Phe1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Arg Gln Gly Ser Phe Gln Gly Gly Phe Arg1 5 10<210>14<211>10<212>PRT<213>人<400>14Arg Phe Ala His Thr Val Val Thr Ser Arg1 5 10<210>15<211>9<212>PRT<213>人<400>15Arg Thr Tyr Asn Val Leu Asp Met Lys1 5<210>16<211>14<212>PRT<213>人<400>16Lys Gly Ala Tyr Pro Leu Ser Ile Glu Pro Ile Gly Val Arg1 5 10<210>17<211>13<212>PRT<213>人<400>17Lys Ala Leu Tyr Leu Gln Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Arg1 5 10<210>18<211>7<212>PRT<213>人<220><223>Xaa是Ile或Leu<400>18Xaa Trp Xaa Gly Thr Thr Arg1 5<210>19<211>13<212>PRT<213>人<400>19Arg Gln Ser Glu Asp Ser Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Arg1 5 10<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>20athtggathggnacnacnagr 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>21athtggathggnacnacncgn 21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>22athtggttrggnacnacnagr 21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>23athtggttrggnacnacncgn 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>24athtggctnggnacnacnagr 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>25athtggctnggnacnacncgn 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>26ttrtggathggnacnacnagr 21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>27ttrtggathggnacnacncgn 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>28ttrtggttrggnacnacnagr 21<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>29ttrtggttagggnacnacncgn 22<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>30ttrtggctnggnacnacnagr 21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>31ttrtggctnggnacnacncgn 21<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>32ctntggathggnacnacnagr 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>33ctntggathggnacnacncgn 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>34ctntggttrggnacnacnagr 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>35ctntggttrggnacnacncgn 21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>36ctntggctnggnacnacnagr 21<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>37ctntggctnggnacnacncgn 21<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：探针<400>38gcngaracnacngaytty 18
Claims (34)
1．一种用于人类受试者中肝细胞癌的筛选、诊断或预后，或者用于监测向人类受试者施用的抗肝细胞癌药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；
(b)对于强度与肝细胞癌的存在与否相关的至少两个所选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的强度与在一个或多个无肝细胞癌的受试者血清或血浆中所选特征的强度相比较，
其中，样品中所选特征的强度表明受试者存在或不存在肝细胞癌。
2．权利要求1的方法，其中所选特征不包括甲胎蛋白(AFP)。
3．权利要求l的方法，其中甲胎蛋白(AFP)是一个所选特征。
4．一种用于人类受试者中肝细胞癌的筛选、诊断或预后，或者用于监测向人类受试者施用的抗肝细胞癌药物或治疗的效果的方法，包括：
(a)用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，根据等电点和电泳迁移率分离多种蛋白质；
(b)定量检测至少一种下列肝细胞癌诊断特征(HF)：HF-1，HF-2，HF-3，HF-4，HF-5，HF-6，HF-7，HF-8，HF-9，HF-10，HF-11，HF-12，HF-13，HF-14，HF-15，HF-16，HF-17，HF-18，HF-19，HF-20，HF-21，HF-22，HF-23，HF-24，HF-25，HF-26，HF-27，HF-28，HF-29，HF-30，HF-31，HF-32，HF-33，HF-34，HF-35，HF-36，HF-37，HF-38，HF-39，HF-40，HF-41，HF-42，HF-43，HF-44，HF-45，HF-46，HF-47，HF-48，HF-49，HF-50，HF-51，HF-52，HF-53，HF-54，HF-55和HF-56。
5．权利要求4的方法，其中(b)步骤包括定量检测至少一种下列HF：HF-17，HF-18，HF-20，HF-21，HF-23，HF-24，HF-25，HF-28，HF-29，HF-31，HF-33，HF-34，HF-36，HF-39，HF-44，HF-51，HF-52，HF-54和HF-55。
6．权利要求5的方法，其中(b)步骤包括定量检测至少一种下列HF：HF-17，HF-18，HF-20，HF-23，HF-24，HF-25，HF-29，HF-33，HF-34，HF-39，HF-44和HF-55。
7．权利要求4、5或6的方法，其中(a)步骤包括等电聚焦后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
8．一种用于人类受试者中肝细胞癌的筛选、诊断或预后，或用于监测向人类受试者施用的抗肝细胞癌药物或治疗的效果的方法，包括：(a)在受试者血清或血浆样品中，定量检测至少一种下列肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)：HPI-1，HPI-2，HPI-3，HPI-4，HPI-5，HPI-6，HPI-8，HPI-9，HPI-10，HPI-11，HPI-12，HPI-13，HPI-14，HPI-15，HPI-16，HPI-17，HPI-18，HPI-19，HPI-20，HPI-21和HPI-22。
9．权利要求8的方法，其中定量检测的步骤包括检测至少一个样品等份，所述检测步骤包括：
(a)将针对预选HPI的免疫特异性抗体与样品等份接触；且
(b)检测是否样品等份中至少一种成分与抗体之间发生结合。
10．权利要求9的方法，其中抗体为单克隆抗体。
11．权利要求9的方法，其中定量检测步骤包括用多重抗体检测多个样品等份。
12．权利要求11的方法，其中抗体为单克隆抗体。
13．一种包括下列已分离的肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)之一的制品：HPI-1，HPI-2，HPI-3，HPI-4，HPI-5，HPI-6，HPI-8，HPI-9，HPI-10，HPI-11，HPI-12，HPI-13，HPI-14，HPI-15，HPI-16，HPI-17，HPI-18，HPI-19，HPI-20，HPI-21和HPI-22。
14．一种包含权利要求13的制品的试剂盒。
15．一种包含多种权利要求13的制品的试剂盒。
16．一种包含已分离的人类蛋白质的制品，所述蛋白质包含具有AETTDF序列的肽。
17．权利要求16的制品，其中蛋白质的等电点(pI)约为7.44，表观分子量(MW)约为63，882。
18．权利要求17的制品，其中pI在7.44的10％变动范围以内，分子量在63，882的10％变动范围以内。
19．权利要求18的制品，其中pI在7.44的5％变动范围以内，MW在63，882的5％变动范围以内。
20．权利要求19的制品，其中pI在7.44的l％变动范围以内，MW在63，882的1％变动范围以内。
21．一种包含已分离的人类蛋白质的制品，所述蛋白质包含带有下列序列中的一个的肽：IWIGTTR、IWLGTTR、LWIGTTR或LWLGTTR。
22．权利要求21的制品，其中蛋白质的等电点(pI)约为5.29，表观分子量(MW)约为43，541。
23．权利要求22的制品，其中pI在5.29的10％变动范围以内，MW在43，541的10％变动范围以内。
24．权利要求23的制品，其中pI在5.29的5％变动范围以内，MW在43，541的5％变动范围以内。
25．权利要求24的制品，其中pI在5.29的1％变动范围以内，MW在43，541的1％变动范围以内。
26．一种能够免疫特异性结合下列肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)中的一种的抗体：HPI-1、HPI-2、HPI-3、HPI-4、HPI-5、HPI-6、HPI-8、HPI-9、HPI-10、HPI-11、HPI-12、HPI-13、HPI-14，HPI-15、HPI-16、HPI-17、HPI-18、HPI-19、HPI-20、HPI-21和HPI-22。
27．一种包含权利要求26的抗体的试剂盒。
28．一种包含多种权利要求26的抗体的试剂盒。
29．权利要求4定义的一个或多个HF在人类受试者中的肝细胞癌之筛选、诊断或预后中的用途，或用于监测抗肝细胞癌药物的作用中的用途。
30．权利要求8定义的一个或多个HPI在人类受试者中的肝细胞癌之筛选、诊断或预后中的用途，或用于监测抗肝细胞癌药物的作用中的用途。
31．权利要求16-25中任一项定义的蛋白质在人类受试者中的肝细胞癌之筛选、诊断或预后中的用途，或用于监测抗肝细胞癌药物的作用中的用途。
32．免疫特异性针对权利要求8定义的一个或多个HPI的一种或多种抗体在人类受试者中的肝细胞癌之筛选、诊断或预后中的用途，或用于监测抗肝细胞癌药物的作用中的用途。
33．权利要求32的用途，其中一种或多种抗体如权利要求26所定义。
34．权利要求29-33中任一项的用途，其用于与针对B型肝炎和/或C型肝炎的分析或评估联合应用。
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