CN1058099A - 一种体外检测人和动物中存在环状颗粒和恶性肿瘤的方法及探针 - Google Patents

一种体外检测人和动物中存在环状颗粒和恶性肿瘤的方法及探针 Download PDF

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Abstract

一种体外检测环状颗粒(RSP)肿瘤标志物的存 在和检测人与动物存在癌症的方法与探针包括从含 有癌细胞的生物体液中把这种标志物捕捉到一种基 质上以及检测基质中RSP肿瘤标志物的存在以此作 为癌症存在的指征。

Description

本发明涉及癌症检测，更具体地说涉及测定一种能够可靠地指示癌细胞存在的肿瘤标志物的方法及探针。
癌症是以细胞生长失控以及非正常细胞扩散为特征的一大类疾病。如果这种扩散没有被控制或阻止，它将导致死亡。然而，如能做到早期检测和及时治疗，许多癌症是可以治愈的。1988年仅在美国就有大约985，000人被诊断患有癌症。同一年中美国有大约494，000人，全世界约有4，000，000人将死于这种疾病。
仅在美国，由于较早的诊断、及时的治疗以及适当的监护，大约有174，000人得到了挽救。对癌症的早期检测极大地提高了治愈的可能性。对限于局部的癌进行检查，对生长过程中的肿瘤尽可能早地做出诊断，是使用更有效的治疗方法和提高治愈率的必要保证。外科手术、化学治疗和放射治疗都需要做治疗后的监控以确保全部残留的恶性生长物已被消除。
在过去的15年中，已发现了许多与肿瘤相关的蛋白，其中一些已被当做肿瘤标志物。许多这一类的标志物只是与特定的肿瘤相联系。因此，它们的存在可用以准确地检测与之相关的那些肿瘤。由于这类标志物比肿瘤本身更容易被鉴定，所以标志物使得更早、更可靠地检出肿瘤成为可能。一些已了解得比较清楚的肿瘤标志物有（a）用于结肠、肺、胃和胰（腺）癌的癌胚抗原（CEA）;（b）用于睪丸和肝癌的甲胎蛋白（AFP）;和（c）最近被认可的乳腺癌肿瘤标志物（CA-549）。
已鉴定出一种与上述那些肿瘤标志物不同的通用标志物。这种在电镜下呈亚显微环状颗粒（RSP）的标志物由癌细胞释放到周围组织或体液中，而正常细胞则不释出可测量的该标志物。RSP也被称为小体（Prosome）、蛋白小体（Proteasome）、微颗粒（miniparticles）、LAMP、大显像点（mareropain）、RNA蛋白脂质和环状微颗粒，已发现各种各样的人体肿瘤和其它哺乳动物肿瘤以及恶性细胞系都释出这种RSP。体外与体内研究证明，恶性细胞释放RSP是癌发生过程的一个特征，它与物种、肿瘤类型或肿瘤在机体中的位置无关。并且，这种标志物的释放与肿瘤负荷量成比例而且是在根据临床症状做出复发诊断之前4～6个月释出。因此，RSP是一种不同于其它肿瘤标志物的通用标志物。这样，可以将RSP用于在早期检查任何癌症的存在，这给治愈癌症的前景带来了极大的希望。用RSP还可以对癌症病人的治疗效果进行监测。血清中RSP水平的降低可以作为治疗成功的一个标志。由于迄今所试验过的恶性细胞在组织培养中都释出RSP，而且用致癌因子处理使组织培养的细胞恶性化后，恶变细胞也产生出RSP，因此，RSP也可用做为一组新的鉴定致癌因子的短期测试系统的终点。
早期研究得到了一种测定RSP中DNA组分的荧光检测法。这种技术被成功地应用于从阴道冲洗液中检查妇女宫颈癌。在美国专利3，798，131中，Rounds等人公开了这项技术，即将荧光染料与RSP中的DNA组分结合，然后通过测量增强的发射光（荧光强度）作为对RSP含量的间接测量。遗憾的是，如用这种方法定量测定各种不同体液中的RSP，则必须对这一技术加以调整以符合一些如稀释度和不同体积等变量。此外，即使仅用这种荧光检测法做定性测定，也需要专门的设备。所以它不适于现场使用、更不用说家庭使用，它也不能配置于试剂盒中供医生诊断所使用。
大约在1970年Donald  Rounds博士对RSP肿瘤标志物首次作为一种生长调节因子做了描述，它是在三种不同的人恶性细胞系（由宫颈癌衍生的HeLa;来自鼻咽癌的KB细胞系;以及源于结肠腺体癌的CMP）的条件培养液中发现的。这三种细胞系分泌一种相同的因子，它调节正常人体皮肤成纤维细胞的体外生长。在低浓度下，它刺激细胞分裂;在高浓度下，它抑制细胞分裂;在更高浓度时导致细胞死亡。这种来自三种恶性细胞系的因子，在抗原性方面是相同的。
虽然有关RSP在活机体中的功用还有很多方面是未知的，但该因子的物理与生化性质已得到鉴定。应用超离心与电镜技术已证明，该因子由呈环状表形的颗粒构成。电子显微照片显示，这些环状颗粒由6～7个亚单位组成，它们是单环的，偶然地也有四个环叠在一起的，从侧面看象一个长方形颗粒。环状颗粒的直径为10～12nm，每100μg蛋白中含有3～5μgDNA和8～15μgRNA。未发表的用脂溶性染料做的研究也提示了有脂类存在，但这一点还未经鉴定。在迄今所报道的所有生物体中，范围包括细菌、酵母、植物、海胆、昆虫、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类（包括人类），RSP的大小、形状以及亚基数目都是相同的。RSP是一种高分子量的核蛋白，具有多种催化性的蛋白酶活性。它的沉降系数是20S，分子量为650～750kDa，含有13个分子量为21～31kDa、等电点为3～10的不同的多肽。它们还有一个由70～80个核苷酸组成的RNA组分以及一个较小的DNA组分。细胞质与细胞核中都发现有RSP。它们被恶性细胞释放到胞外。有报道，RSP降解胞内蛋白，调节mRNA转译和tRNA前体的加工，并且具有氨酰tRNA合成酶活性。有报道，它们与热休克蛋白和特定的小RNA相联系。根据这些报道，显然这些颗粒在多种细胞内过程中起着某种重要的作用。
在70年代中期进行的一些早期研究曾证明RSP是由肿瘤组织选择性地释出的。把取自肺、结肠、乳房、皮肤、肾和眼的绞碎的活检组织置于维持培养基中在体温下经24小时温育，有大量RSP释出;而经同样处理的正常皮肤和舌肌肉组织则没有释出可测量的RSP。
在用病理范围从正常到侵袭性癌症的146例人皮肤活检组织所做的有关RSP从温育活检组织中释出的双育研究中发现，20例正常皮肤和10例寻常
Figure 90107618X_IMG1
中没有释出显著量的RSP，而12/36（33%）的良性肿瘤、皮脂溢性角化病和5/13（38%）的恶变前肿瘤、光化角化病释出显著量的RSP。这项研究中还发现52例基底细胞癌和15例鳞状细胞癌中100%都释出显著量的RSP。侵袭性鳞状细胞癌的RSP的数值范围比非侵袭性基底细胞癌的RSP数值范围要高。
在用人子宫颈活检组织所做的类似的双盲研究中观察到，在取自非正常宫颈假定的正常区域上的活检组织中16/21（76%）几乎没有或没有可测量的RSP释出到维持液中，其它5例组织试样在24h培养中释出较低量的RSP。收集在一起的发育异常和湿庞试样中10/18（56%）释出非显著水平的RSP，另8/18释出中等量的RSP。与此相对照，13/14（93%）原位癌和16/16（100%）侵袭性癌试样中释出大量的RSP。此外，曾观察到子宫颈向阴道中释出RSP。对阴道冲洗液的分析显示276/284（97%）正常宫颈不释出或释出非显著量的RSP，对于115/124（93%）例宫颈不同程度发育异常的妇女也如此。取自患有原位癌的妇女的试样显示17/29（58%）是RSP释出阴性的。在这中间17/19（89.5%）的妇女年龄在38岁以下，根据在丹麦进行的两个15年研究记录，在这个年龄组，这种原位癌变的损伤组织不加治疗，也有90%能够恢复到正常。对于子宫颈癌的情况，10/10（100%）的阴道冲洗液试样中出现大量的RSP。
在一项进一步的研究中发现，从各种癌细胞核中提取出的一种核抗原是由“微颗粒”组成的，这种微颗粒外经为11.3nm，内径为2.9nm，含有8个亚单位并且具有RSP的一般形态，发现该抗原存在于膀胱、脑、结肠、食管、肝、肺、前列腺、皮肤、胃和甲状腺癌，3种肉瘤和6种恶性来源的培养细胞系;在17种正常组织、4种良性肿瘤、7种炎症病和2种正常来源的培养细胞中没有该抗原。
这些有关人肿瘤细胞RSP释放的观测结果，在一项用21种离体哺乳动物细胞系进行的向培养基中释放RSP的研究中得到了印证。发现除了一个细胞系外，所有细胞系都释出了一些RSP（用显微镜检术可测定）。因此，RSP似乎是一种普遍存在的现象。然而，所释出的量依赖于细胞系的类型或来源。所有来源于肿瘤的细胞（9/9）和受致癌病毒感染的细胞（3/3）均释出大量的RSP而，6/10正常来源的细胞系释出很低量的RSP。
肿瘤组织释出RSP的相对量似乎与其恶性化程度相关。这一点在用C3H10T1/2小鼠细胞进行的实验中得到了很好的证明。在一项被广泛采用的离体测式方法中，此种细胞被用来鉴定致癌物。当它暴露于致癌物时，会出现可清楚地确定的形态与生理变化包括：（a）无变化（正常的接触抑制）;（b）Ⅰ型细胞群边缘性接触抑制;（c）Ⅱ型细胞群，低度接触抑制;和（d）Ⅲ型细胞群，不表现接触抑制。当把细胞植入C3H10T1/2小鼠时，只有源于Ⅱ型与Ⅲ型细胞群的细胞发展成为恶性肿瘤。正常细胞与Ⅰ型细胞群来源的细胞不会形成肿瘤。而且源于Ⅲ型细胞群的细胞此源于Ⅱ型细胞群的细胞更具恶性，因为Ⅲ型细胞在宿主鼠内形成更多，更大的恶性肿瘤。已经证明只有源于Ⅱ型与Ⅲ型细胞群的细胞释出RSP，而源于正常细胞和Ⅰ型细胞群的细胞则不产生RSP。此外，还证明，在用致癌物，甲基磺酸乙酯处理后仅三周可在C3H10T1/2细胞的培养基中测出RSP，而一般的检测终点为8周。
另外一项研究证明，虽然维生素A缺乏的仓鼠气管上皮在器官培养中出现鳞状细胞化生和生长过度，但取自维生素A缺乏的叙利亚仓鼠的气管上皮组织并不释出RSP。而这一模型很接近地模拟了癌发生过程并且已被用于研究癌发生过程和维生素A类似物的抗肿瘤特性。当把维生素A类似物注入同基因仓鼠中时病灶可转为正常从而不发生恶变。因此，没有RSP释出准确地反映了气管组织实际上是处于良性状态。
有充分的证据表明RSP释出量与肿瘤量有定量的关系，因此具有预测意义。把取自一种小鼠黑色素瘤细胞系的细胞通过静脉内注射注入B16F10小鼠后，细胞在鼠全身形成小肿瘤。这些肿瘤的色素沉着特征可以保证准确地计数肺组织中的肿瘤数目，以此作为宿主动物中肿瘤量的计量指标。取自注入了黑色素瘤细胞的小鼠的绞碎的肺组织向培养基释放的RSP与同一肺组织中所记录到的肿瘤数目成比例，再则，在肺形成明显可见的肿瘤前即已能测到RSP的释放。作为RSP释出与肿瘤量相关的进一步证明，对8位做了乳房根治术的乳腺癌患者血清中的RSP水平做了研究。从实施外科手术时起，血清中RSP含量迅速下降，到手术后第10天降到不可测出的水平。这些患者血清中RSP水平直到手术后第32天（本项试验的持续时间）一直保持阴性。
在随后的一项研究中，发现恶性细胞向其周围的培养基中释出一种RNA一蛋白脂类物质，它所具有的特征表明是RSP，癌症病人的血清中也发现存在这种物质。在99位代表23种癌症类型的患者血清中都检出了这种物质。作为对比，在74位分别患有21种非癌疾病的病人的血清中没有发现该物质。8种恶性来源的细胞系向其培养基中释放出大量的此种RNA蛋白脂。该项研究报道，这种RSP样的RNA一蛋白脂在癌症病人血清中的含量与其现有肿瘤数量成正比关系。并且在外科手术切除肿瘤8～10天内，RNA-蛋白脂完全消失。这一点证实了前述对做了乳房根治术的妇女所做的观察结果。另外，在出现肿瘤再生时，RNA一蛋白脂的水平在肿瘤临床表现前10个月就开始上升。
在另外进行的一项研究中RSP的释出与肿瘤诱导作用有关。用溶于矿物油中的5%二甲基苯并蒽涂抹仓鼠颊囊，每周3次连续5周，百分之百（32/32）处理前的正常颊囊活检组织不产生显著量的RSP，涂抹过3次的（18/18）的试样也是如此。在第四次涂抹后，5/9（56%）的试样表现出RSP产量中度上升。经过6次涂抹后收集的9/17（53%）的试样也是如此。这时活检组织表现出基底细胞有些生长过度、角质化增强，但没有恶变细胞的迹象。在第七次涂抹（第三周）时以及在此之后;实际上所有试样都释出大量的RSP（如第七次涂抹时的18/18;第九次时的15/15第十二次的8/8;以及第十五次的12/12），并且RSP的释出量在第九次涂抹后趋于平稳。所有经过处理的仓鼠的颊囊和唇上都发展出充分肯定的癌，而这是在开始处理12周后才出现的。这些材料表明经过化学性转化的活检组织释出RSP比组织学上出现恶变迹象至少提前9周，这提示可以在临床上利用RSP释放这个指标鉴定恶变前状态或无症状状态。
这种在1970年左右被首次描述并被鉴定为环状颗粒（RSP）的肿瘤标志物已被许多实验室在恶性组织或细胞系试样中观察到。最新的证据表明，恶性细胞产出RSP不同于正常细胞，恶性细胞产生的RSP在抗原性方面是特殊的并且是由恶性细胞大量地释放到体液中。与此相对照，正常细胞不释出或只释出非显著量的RSP。这后一特征使得能够对所有体液进行鉴查以找出体内隐藏的癌症。此外，RSP可以在肿瘤复发出现临床表现之前几个月被检出，这一观察结果表明，患者体内无症状表现的肿瘤能够在如此早的发育阶段被检出，这将使得医疗措施能够保证高的治愈率。RSP含量与肿瘤负荷量成比例这一观测结果也表明对正在接受治疗的癌症病人可以便利地进行监测以评估其治疗效果。为了达到这些目的必须找到一种成本低、简单、迅速、灵敏而可靠的检测与计量RSP水平的方法。
因而，本发明的一个目的就是提供一种检测RSP肿瘤标志物的方法和探针作为检测癌症的方法，这种方法成本低、简单、使用方便，灵敏而可靠。
本发明的另一个目的是提供一种检测生物体液中存在RSP肿瘤标志物的方法和探针。即通过把体液中的这种标志物捕捉到某种基质中，然后再从基质中检测RSP的存在。
本发明的再一个目的是提供一种检测癌症存在的方法和探针，即从带有恶性细胞的生物体液中把RSP肿瘤标志物捕捉到某种基质中然后从基质中检测RSP的存在，以此作为癌症存在的指征。
本发明的又一个目的是提供一种利用抗RSP抗体从生物体液中捕捉RSP肿瘤标志物的方法和探针。抗RSP抗体是从包括单隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体及其混合物的抗体组中选择出来的。
本发明的再一个目的是提供一种利用转移核糖核酸（tRNA）探针从生物体液中捕捉RSP到某种基质中，然后检测这种探针的存在，作为RSP存在的指征的方法和探针。
本发明的再一个目的是从一种生物体液中把RSP肿瘤标志物用对该标记物上氨酰转移RNA合成酶接受位点有专一性的tRNA捕捉到某种基质中。
本发明的再一个目的是提供一种从怀疑患有癌症病人的体液中检测RSP肿瘤标志物的方法和探针。该方法是利用有颜色反应的分子，使之与RSP肿瘤标志物直接或间接连接的显色技术。
根据本发明提供的从可能带有恶性肿瘤的病人体液中检测RSP存在的方法，上述目的都得以实现。这种方法包括从上述病人体液中捕捉RSP到一种基质上以及在这种基质中检测RSP的存在。只要取得被检的人或动物的体液，把其中的RSP捕捉到一种基质中并在该基质中检测RSP的存在，即可用这种方法检测人或动物中恶性癌细胞的存在。根据本发明的一种形式，RSP是用单克隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体或其混合物中选出的抗RSP抗体从体液中捕捉的，之后，通过例如显色技术检测基质中RSP的存在。根据本发明的另一种形式，RSP是通过用一个标记的tRNA探针与体液试样中的RSP接触，使这种tRNA结合到RSP标志物上的氨酰转移RNA合成酶反应位点上而被从体液中捕捉，然后检测这种在RSP上的合成酶分子。
在本发明的一种优选的形式中，对RSP的捕捉与检测或对基质中已被捕捉的RSP的检测都是用一种对RSP上氨酰转移RNA合成酶反应位点专一性的RSP探针完成的。这种探针最理想的是一种结合分子，它通过tRNA组分与RSP上的氨酰tRNA合成酶反应位点（二核苷酸折叠）连接，并带有能表现可见颜色的二级分子。一种较好的探针是由这种结合分子构成的：tRNA-光生物素-链菌亲合素（streptavidin）-碱性磷酸酶。另一种较好的探针的组成是：tRNA-光生物素-亲合素（avidin）-葡萄糖氧化酶。
在本发明的另一种形式中，提供了一种探针，由单克隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体中选出的一个或多个抗RSP抗体构成，该探针被连接上一个适于被检测的探针标记，以此作为RSP肿瘤标志物存在的指征。
本发明的其它目的以及本发明的优点对那些精通这种技术的人来说，将从下面的详细说明、图示、范例及附加的权利要求中得到清楚的了解。
附图1以草图形式说明了RSP的氨酰tRNA合成酶受体位点和一个对该位点专一性的RSP探针。
附图2以草图形式说明了RSP通过紧接在tRNA探针与RSP上现成的氨酰tRNA合成酶受体位点结合之前，经tRNA预处理的表面结合到反应容器上。
附图3以草图形式说明了图2中的RSP与tRNA探针在其受体位点反应后的状态。
本发明所提供的是测定生物体液中肿瘤标志物RSP存在的方法和检查人或动物中癌症存在的方法，这种方法就是把体液中的RSP肿瘤标志物从体液中捕捉到一种基质中随后检查基质中RSP标志物的存在以此作为癌症存在的指征。本发明的一种优选的形式是利用一种抗RSP抗体（rspAb）把体液中的RSP肿瘤标志物捕捉到基质中。使这种方法成为可能的是rspAb与RSP肿瘤标志物之间的亲和性，这种亲和性导致rspAb与RSP肿瘤标志物结合，从而实现从体液中捕捉出RSP。本发明的另一种优先选择的形式是利用一种tRNA探针，它与RSP上的一个非常专一性的位点（氨酰转移RNA合成酶反应位点）相结合。这种探针不仅能够把体液中的RSP肿瘤标志物捕捉到基质上，还可以通过在该探针上加上适当的便于检测的二级分子，如表现可见颜色的分子，以检测基质中RSP的存在。捕捉与检测RSP肿瘤标志物是检查人或动物体中存在恶性癌细胞的一种有效、准确而可靠的方法，这一判断的直接的认识根据是，RSP是由癌细胞向胞外分泌释出的，因而可在血清或其它体液中检测。
抗RSP抗体识别和鉴定生物体液（如人或动物体液）中的RSP并从中捕捉出RSP的能力，以及如何用这一方法检查人或动物体液，（如癌症病人血清）中恶性癌细胞，通过下面的例Ⅰ可以得到清楚的说明。实例Ⅰ的目的是证明抗RSP抗体（rspAb）能够有效地从癌患者血清中捕捉出RSP。实例Ⅰ的做法是，通过亲和层析纯化技术从一个已不再释出RSP但仍具有抗RSP抗体的过去的癌症患者体内分离出rspAb。如果这种rspAb能够起作用，则被捕捉到的RSP将可以用显色技术检测，如采用一种tRNA探针检测系统，这些在下文中将作充分的揭示。
实例Ⅰ
1.亲合层析纯化程序
a）在柱中装入溴化氰活化的Sepharose  4-B树脂，并将RSP联结到树脂上。该树脂的制备、装柱以及与抗原（RSP）的联结都按一般的标准程序进行。
b）取自一位过去的癌症患者的1ml血清与3ml  pH8.5的硼酸盐缓冲液混合后在环境温度下过柱。所有血清中的rspAb都与柱上的RSP抗原反应并与之结合。用pH7.5的磷酸缓冲盐水（PBS）将没有结合的血清蛋白从中洗脱。当紫外分光光度计280nm处的光吸收（O.D.）读数为0.0时，停止洗脱。
c）用若干份2ml的4.0M氯化钾溶液洗脱。每份洗脱液都在紫外分光光度计280nm处读数，结果如下：
洗脱液号  O.D
1  0.04
2  0.02
3  0.02
4  0.01
d）蛋白（rspAb）含量的逐渐下降说明rspAb的大部分是在头四部分洗脱液中。将这四部分洗脱液倒在一起，装入一个截留界限为10，000分子量的透析管中，在4℃下，先对0.85%的氯化钠透析18小时，之后对pH7.5的PBS进行最后2.5小时透析以除去过量的盐。
e）将所得的经透析的15ml液体放在一个带有PM-10膜的AMICON超滤管中通过离心浓缩到2.5ml。
f）将这种抗体浓缩物的O.D.与一个蛋白标准曲线相比较，发现其含量等于0.1g/ml蛋白质。这就是经过亲和层析纯化的rspAb。
2.利用抗RSP抗体的检测系统
a）将rspAb施加到一种放置在塑料棒上的硝酸纤维膜（1）上，用血清封闭，然后在室温下与取自癌症病人的0.1ml血清反应10分钟。将膜吸干。之后，与tRNA探针检测系统反应15分钟（该检测系统将在下文中充分描述）。这种分步反应过程可以表示如下：
ⅰ  将rspAb加于硝酸纤维膜上：
()/() Ⅰ-rspAb
ⅱ  膜与含RSP的癌症病人的血清反应：
()/() Ⅰ-rspAb-RSP
ⅲ膜上的RSP与tRNA探针混合物反应：
()/() Ⅰ-rspAb-RSP-tRNA＝甲
Figure 90107618X_IMG2
formazon）
这一反应过程产生出特征性的甲
Figure 90107618X_IMG3
灰-黑色斑点，仅在膜上施加有抗RSP抗体的地方才有。
此例说明，RSP被固定在膜上的rspAb从癌症病人的血清中捕捉出来。此例还说明rspAb被成功地结合到一种从癌症病人血清试样检测癌的系统中。
实例Ⅱ
用多克隆抗体可以得到与实例Ⅰ非常一致的结果。下面举例说明的是一种从兔中制取多克隆抗体的例证性的程序。
在兔子中产生多克隆抗RSP抗体
按下面的方案制备抗RSP抗体，以进一步开发出以抗体为基础的癌检测方法。
1.抗原（RSP）纯化程序
a）制取RSP粗提物
取自一位乳腺癌患者的300ml血清与等量的饱和硫酸铵混合，使其中的IgG与RSP沉淀出来。
b）从上述血清中制取RSP沉淀
ⅰ  将沉淀溶解于“标准缓冲液”（50mM  Tris-HCl，PH7.5，1mM二硫苏糖醇，20%V/V甘油以及0.02%W/V叠氮化钠）中。
ⅱ  将RSP/IgG组分用等体积的饱和硫酸铵重新沉淀。用标准缓冲液重新溶解沉淀然后再进行一次重沉淀和再溶解。
ⅲ将溶解的RSP/IgG混合物在截留界限为10，000分子量的透析袋中对含0.02%叠氮化钠的磷酸缓冲盐水（pH7.5）在4℃下透析18小时。
c）Biogel  A-0.5m凝胶过滤：
使经过透析的10ml  RSP混合物浓缩然后在充填有Biogel  A-0.5m树脂的4×8cm柱上分级分离。树脂在使用前要用标准缓冲液平衡处理。洗脱下来的级分用下文有充分描述的tRNA探针体系检测以确定哪一个级分中含有RSP组分。
d）羟基磷灰石色谱
将含有RSP的级分合并然后相对于含有1mM二硫苏糖醇和20%甘油的25mM的磷酸钾（pH6.8）在4℃下透析18小时。经透析的RSP混合物被浓缩后在填有25ml羟基磷灰石柱上进行分级分离，该柱预先用同样的磷酸缓冲液平衡。用100ml100～150mM的磷酸缓冲液洗脱RSP，用前文提到的tRNA探针体系检测洗脱液以确定哪个级分中含有RSP组分。
e）DEAE  Affi-Gel  Blue色谱
将含有RSP的级分收集在一起，然后相对于标准缓冲液在4℃下透析18小时。经透析的RSP混合物被浓缩后在装填有已用标准缓冲液平衡好的DEAE  Affi-Gel  Blue的柱上进行分级分离。用50ml标准缓冲液洗柱后，用100～130ml0～0.6M的氯化钾进行梯度洗脱。根据tRNA探针测定结果，将有活性的级分收集起来，然后相对于标准缓冲液，在4℃下透析18小时。使透析好的RSP在装有PM-10膜的一个AMICON管中离心浓缩，根据紫外分光光度计280nm处的O.D.读数，最终达到蛋白浓度为5mg/ml。
f）纯度标准
经过纯化的RSP在非变性条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。其结果是一条单一的特征区带，位于600，000～675，000分子量的位置。
2.兔子的免疫
a）多克隆RSP抗血清
用改进的Winberry与Holten法〔见“Rat  Liver  Glucose-6-p  Dehydrogenase  Dletary  Regulafion  of  the  Rate  of  Synthesis”The  Journal  of  Biological  Chemistry，Vol.252，No.21，pp  7796-7801（1977）〕制备RSP特异性抗血清。
b）免疫记录：
Ⅰ、用100μg免疫原（RSP）悬浮于同体积的完全弗氏佐剂中进行初次免疫。皮下多点注射。
Ⅱ、三周间隔
Ⅲ、用50μg免疫原悬浮于同体积的不完全弗氏佐剂进行第二次免疫。多点皮下注射。
Ⅳ、9～10天间隔
Ⅴ、依据血清试样中rspAb的含量进行试检性放血或生产性放血。
Ⅵ、14～18天间隔
Ⅶ、用50μg免疫原和等体积的不完全弗氏佐剂进行第三次免疫。
皮下多点注射。
Ⅷ、9～11天间隔
Ⅸ、生产性放血
c）rspAb的纯化与制备
Ⅰ、用蛋白A-琼脂糖亲和色谱法将IgG与其它免疫球蛋白分离开。
Ⅱ、将酸洗脱下来的IgG中和，把280nm处O.D.超过0.01的级分收集在一起，然后用一种装有PM-10膜的AMICON管经离心使之浓缩到大约1mg蛋白/ml。
Ⅲ、将经纯化和浓缩的rspAb制备物在5℃下贮存并加入0.02%W/V的叠氮化钠保存。这种抗体可用于本发明中的癌（RSP）检测体系。
在本发明的实践中，rspAb可被固定在任何通用的基质上，如丙烯酸珠、各类膜、乳胶珠、金属（如钢珠、胶体金等）、玻璃表面、各种聚合物表面以及类似物，用以从人或动物体液中将RSP捕捉或固定到某一表面上。这些体液的示例有，血清、尿、眼泪、痰、唾液、精液、乳汁还有从可进入部位如肺、宫颈、结肠等处得到的洗出液或源于细胞或组织的溶解产物或培养基，等等。被捕捉的RSP可以用任何通用的检测体系进行检测，如荧光标记物、放射性同位素、催化酶以及生物或化学发光标记体系，或采用探针如针对RSP的核酸组分研制出的RNA或DNA探针，或者用在申请者的共同待决申请中描述的tRNA探针。例如，依据本发明，可将rspAb联结到任何一种通用的检测体系中构成一种可按本发明的要求应用的探针。比如，它可以被连接上荧光标记，如荧光素、若丹明、得克萨斯红、溴化乙锭、吖啶染料、和同类物，而后用荧光分光计、荧光显微镜或紫外分光光度计读数。另外，还可以使之与任何一种同位素结合，根据所用的同位素和检测体系的构成可以用β或α计数器或通过放射自显影法加以检测。它还可以和生物素或光生物素连接因而能够用亲合素、链菌亲合素、外亲合素（extravldin）等与之相联，进而可与任何用于标准ELISA检测体系的酶连接，如葡糖氧化酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。这些与酶联抗体也可与任何终点颜色放大体系一起应用，如碱性磷酸酶启动的同时生成甲
Figure 90107618X_IMG4
和靛蓝的双序催化反应，等。
探针的基础是一种分子与另一种分子之间独特而专一的亲和性。通常用做探针的分子是，抗原∶抗体、杂交的RNA或DNA∶DNA、亲合素∶生物素以及A蛋白或G蛋白对特定免疫球蛋白的亲和性。例如rspAb捕捉RSP就是抗原∶抗体亲和性的一个例子。另一类高度专一性的分子亲和性是某一酶分子上的受体位点与其作用底物之间的亲和性。这种亲和性还从未被用来开发出一种探针，因为（1）酶底物一般都是小分子，不适于用标记物标记，（2）酶底物会很快地被酶转化成某种产物，（3）而该产物又很快地从酶分子上释放出来。但是，现在已经确知可以利用某些酶/底物亲和性，开发出某种探针，如用RSP，在这里不存在上面所列的三种情况。在没有镁离子或ATP存在条件下，RSP中酶组分上的专一性受体位点能够结合特定的带有或不带有关连氨基酸的tRNA，这种结合并不形成可释放的产物。被结合的tRNA可以用光生物素标记，光生物素使tRNA容易与结合有链菌亲合素的碱性磷酸酶结合。在这样的探针与RSP上的与其匹配的酶结构选择性结合之后，就可以利用碱性磷酸酶/底物反应所产生的可见的颜色证明RSP的存在。靛蓝与甲
Figure 90107618X_IMG5
的同步生成就是这种酶的灵敏的显色技术的实例。
在本方法中，RSP的存在是通过从接受检查的个体收集生物体液试样来确定的。但是，与已有的方法不同，用本方法检测RSP时，癌症属何类型及用何种体液都无关紧要。在取得生物体液后，将其中的RSP用一种从一个或多个单克隆抗体、多克隆抗体和亲和层析纯化抗体中选择出来的抗RSP抗体捕捉到某种基质中，如实例Ⅰ和Ⅱ所描述的那样。之后，基质中RSP的存在，最好用下文中介绍的tRNA探针加以检测。或者，按照本发明的另一种形式生物体液中的RSP既用tRNA探针捕捉到基质中也用tRNA探针检测。
正如图1图示说明的那样，tRNA探针是由一种对RSP肿瘤标志物上的氨酰转移RNA合成酶反应位点专一性的tRNA构成。为了以后检测的需要，该tRNA上已经做了标记，如用光生物素。该tRNA探针结合在RSP的氨酰转移RNA酶反应位点上。对这种由tRNA示踪的RSP的检测通过光生物素标记的tRNA上连接链菌亲合素并把碱性磷酸酶连接到链菌亲合素上而变得更为便利。最后，某种显色剂，如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑反应混合物，与tRNA探针上的碱性磷酸酶反应显出具有一定强度的特征性颜色，其强度与生物体液中由癌细胞释出的RSP的数量相关联。特别是，在这种生物素-链菌亲合素-碱性磷酸酶体系中出现的蓝/紫色是RSP肿瘤标志物存在的指征，因而也是癌存在的指征。通过所产生的颜色强度实现了定量测定。据此观察，一些非恶性细胞产生的可忽略的或小量的RSP比恶性细胞产生的RSP要小几个数量级，通过直观的颜色强度比较来区分可忽略的与显著的RSP产生是没有困难的。值得注意的是，按照与这里所介绍的tRNA探针非常一致的构成方式也可以构建一种rspAb探针，并且可以象图1那样图示说明，只是探针中tRNA组分将代之以一个rspAb。
在本发明的一种优选的具体形式中，优先利用rspAb把RSP肿瘤标志物从生物体液中捕捉出来，使标记并连接上适当的二级分子以便通过用tRNA-光生物素-链菌亲合素-碱性磷酸酶探针，如图1所示，与RSP的反应产生可见的颜色。而在另一种具体形式中，用这一tRNA探针代替rspAb完成RSP捕捉同时也用之检测RSP。不论是用rspAb还是用tRNA从体液中捕捉RSP，这一tRNA探针对于检测RSP的存在是最有效的因而都被优先选用。例如，在一项盲试（blind  study）研究中，使用的是经过充分鉴定的有某一临床背景的病人的血清，该tRNA探针准确地鉴定出了71/73的癌血清，灵敏度为97.3%，并且鉴定出53/62的非癌血清，特异性为85.5%。
用tRNA探针检测基质中RSP的实例，也即本发明的一个具体形式，其中tRNA探针既用于捕捉又用于检测RSP。利用从一个正在接受检查的病人收集到的血清试样，把血清加入到预先包被好的微量滴定板的孔穴中，孔穴的底部与四壁已用tRNA包被。由于tRNA与RSP上氨酰转移RNA合成酶反应位点之间的亲和性，试样中的任何RSP都会附着在孔穴表面上。用水或PH7.4的磷酸缓冲盐水（PBS）冲洗几次，冲掉孔穴上的血清试样只保留下结合到孔穴表面的RSP。根据本发明，由连接在一起的tRNA-光生物素-链菌亲合素构成tRNA探针，如图1所示。取一定量的tRNA探针加入到孔穴中，在那里tRNA分子与RSP上另外的氨酰转移RNA合成酶反应位点反应并与之结合。孔穴中tRNA与RSP之间反应前与刚经过反应的状态分别由图2与图3说明。图2显示，RSP连接到预先覆盖在孔穴底部上的tRNA上以及还未反应的本发明中的tRNA探针与RSP的反应位点连接之前的状态。图3说明RSP标志物反应后的状态并且显示tRNA探针已连接到RSP上现成的反应位点上。在tRNA探针连接到RSP受体位点以后，再用水或PBS冲洗掉未反应的tRNA探针。到这时，还需要做的只是提供一种能客观反映孔穴中RSP数量的显示方法。加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑颜色反应混合物即可完成这项工作。显色系统产生出直观的颜色，其强度范围依据孔穴中RSP的浓度可从无色（即此处没有或只有非可测量的RSP从生物体液中被捕捉出来）到很强的蓝/紫色（即此处有大量的RSP被捕捉）。用分光光度计可以定量测定颜色强度。由于给检测人员提供的数值可清楚地说明反映癌存在的颜色强度的阈值，这样评估RSP检测试验的结果就比较简单了。
实例Ⅲ
为了证明（1）这种环状颗粒含有第二核苷酸折叠的酶，即它们含有氨酰tRNA合成酶，和（2）其底物，tRNA，选择性地结合到受体位点上，进行了一项试验。按照Thompson等人的技术（Proceedings of National Academy of Science，USA，72：669-672，1975）制备了一种针对蛋白质（指那些以核苷酸为底物的酶）的二核苷酸折叠的亲和柱，其中含有Affigel Blue（100～200目，BioRad实验室，Richmond，加卅）。将曾生长人前列腺癌细胞PC3的培养基（已知含有RSP）通过这种亲和柱，然后用pH7.4的PBS洗脱。用Bradford法（Analytic Biochemistry 72：248，1976）检测2毫升洗脱液中的蛋白质含量。当所有不带二核苷酸的蛋白质都冲洗下来后，在柱上加入1mg/ml（4×10-2mM）的tRNA，在随后的洗脱级分中可记录到蛋白质含量的显著增加，这表明tRNA优先地结合到该合成酶分子的二核苷酸折叠上从而使RSP从AffigelBlue柱上解离下来。除非两个条件（存在一个二核苷酸折叠而它与tRNA具有亲和力）同时存在，否则不会得到这一结果。
实例Ⅳ
为了证明用光生物素和链菌亲合素-碱性磷酸酶标记的tRNA能够与结合在微量滴定板孔穴底部的RSP连接并可以通过孔穴中的蓝/紫颜色变化而被检测，用Mierendorf法（Promega  Notes，1988）进行了一项试验。
在底部表面包被了tRNA（见图2）的Immulon微量滴定板孔穴中加入100μl经Amicon  centricon30微浓缩器浓缩4倍的前列腺癌细胞PC3的条件培养基，培养基中的RSP也已相应浓缩了4倍。经过30分钟后，把孔穴中的培养基倒掉，用PH7.4的PBS冲洗10次。RSP经过与tRNA反应即被结合到孔穴底部。在处理孔穴中加入10μl光生物素标记的tRNA，而在阴性对照孔穴中加入10μl不含tRNA的Tris缓冲液，室温下反应30分钟，用PBS冲洗孔穴5次。在这一步骤中，tRNA结合到tRNA酶反应位点上（见图3）而在用不含tRNA的Tris处理的孔穴中，该反应位点仍未发生反应。把25μl  0.1mg/ml的链菌亲合素加到所有孔穴中，在室温下经过30分钟后，用PBS冲洗孔穴10次，链菌亲合素与tRNA上的光生物素结合而在没有tRNA的孔穴中则被洗掉。
在所有孔穴中加入25μl  0.1mg/ml生物素化的碱性磷酸酶。室温下，经过30分钟后，用PBS冲洗孔穴10次。在这一步中，生物素-碱性磷酸酶分子被连接到孔穴底部与RSP相连的光生物素标记的tRNA上的链菌亲合素上。这一步使探针完全构成（见图1）。在没有tRNA的孔穴中碱性磷酸酶被洗掉。
最后，在每个孔穴中加入100μl5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）/硝基蓝四唑（NBT）颜色反应混合物。在45～60分钟内显色。用tRNA处理过的RSP表观出强的蓝/紫色反应，而阴性对照不出现着色。
这项研究明确证实RSP具有一个tRNA专一性反应位点，并且上面介绍的这种tRNA探针会与RSP结合并准确地检出RSP。因此，这一探针为检测人与动物中的癌病提供了一种极好的方法。
另一种合乎需要的RSP检测方法是用一种第二抗RSP抗体（rspAb2），它与RSP：rspAb连接，后者是用rspAb捕捉体液中的RSP而形成，已如前述。在这一检测方法中，形成了一种固态基质-rspAb：RSP：rspAb2夹心结构，其中rspAb2的作用是使这种夹心分子串聚集或沉淀。将沉淀用干净的聚碳酸酯过滤器滤出，然后与标准色板相比较而测出沉淀的量，色板由外加RSP的样品制作而得，或者用一种差示反射分光计进行定量测定。一种可选用的固态基质是有色（黑色）乳胶珠，它依赖血清中RSP的量产生出浓淡不同的颜色。下面列举一个该方法的实例：
a）将rspAb连接到羰化的黑色乳胶珠（O）上
即＝O-rspAb
b）O-rspAb与被检血清在微量离心管中反应一段时间之后，从血清中离心出这些乳胶珠。用PBS冲洗几遍，每次冲洗后离心取出乳胶珠。所产生的反应是：
癌血清＝O-rspAb：RSP
非癌血清＝O-rspAb
c）经过反应的乳胶珠在微量离心管中与rspAb2反应一段时间后，从反应混合物中离心取出，没有结合的分子按如b）所述方法冲洗掉。
所产生的反应是：
癌血清＝O-rspAb：RSP：rspAb2（沉淀）
非癌血清＝O-rspAb  （无沉淀）
d）用一个干净的聚碳酸酯滤膜过滤并进行测定，没有沉淀物的乳胶珠穿过膜而有沉淀的乳胶珠-抗体：RSP：抗体聚合物则不能透过。因此，无沉淀的乳胶珠能够很容易地与沉淀分离开。
虽然上文介绍的方法中采用的是有色乳胶珠，但是应该意识到也可以利用有色的沉淀、荧光沉淀或放射性沉淀，在rspAb2上标记上适当的分子（如任何色泽深的粒子如甲
Figure 90107618X_IMG6
、碳等;荧光分子如若丹明、得克萨斯红、溴化乙锭、荧光素等;以及同位素如125I、3H、14C、等）。上述方法与体系的另一种变通形式是rspAb不必连到一个固态基质上，可以用一个抗rspAb抗体把rspAb：ASP：rspAb2或简单地，把rspAb：ASP反应的分子从血清中沉淀出来。本文前面所提到的任何一种指示体系都可以用于这类抗体中的任何一种。此外，冲洗、过滤以及定量方法均可与上文所述相同。
尽管对于RSP的生化性质尚未全部搞清，但是可以预料构成RSP的每一个区段都具有氨酰tRNA酶活性，催化某一特定的氨基tRNA：氨基酸结合。因此，任何tRNA与tRNA组合都可用于构建本发明中的探针。此外，用做探针和用于预处理反应容器表面的tRNA可以是相同的也可以是不同的tRNA。而且，除了生物素-链菌亲合素-碱性磷酸酶外显然也可以用其他常用的检测体系容易地构建探针。例如，tRNA可以连接到荧光素、若丹明、得克萨斯红、溴化乙锭和吖啶染料等荧光标记物上，然后用荧光分光光度计、荧光显微镜或紫外分光光度计测定。tRNA也可以连接上任何放射性同位素并根据所用的同位素种类采用β或γ计数器或放射自显影方法加以检测。此外，虽然在所介绍的体系中显色反应在容器的液相中进行可表现出最佳的灵敏度，但是RSP-tRNA探针检测体系也适用于固态基质，如各种膜、玻璃、各种多聚物表面、乳胶珠和红血细胞（在凝集试验中）以及金属如胶体金或其它酶体系如以酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和脲酶为基础的体系。
工业上的可应用性
本发明的方法与探针可广泛地用于普查早期癌症;为正在接受治疗的病人提供一种简单的监查体系;为查找环境与工业致癌物提供一种大大改进的方法。更为重要的，也许是有可能利用这一方法把RSP探针装进成套试剂盒里，为医生提供一种快速、灵敏、可靠而价廉的手段，在常规体检中或在化疗和放疗后癌症病人的治疗过程中检测个体体液中的RSP。如果在一个外表健康的个体中出现阳性检查结果，则应进行复查。如果第二次检查确证有RSP存在，就可以做深入的检查（如核磁共振成像）以对体内肿瘤定位和鉴定。这时将建议采用某种治疗程序除去或催毁恶变组织而RSP又可以用来监测治疗是否成功。
为了使早期检出癌活性和准确监控癌症治疗成为可能，人们盼望有一种简单、易于使用的体外诊断试验可以发现对患者体内任何地方的致癌活性。一旦认识到至少5百万有癌症病史的人每季度要接受检查，每年还有几百万新被诊断的和活动性癌症病例要检查，对一种快速、有效的诊断试验的需求程度就变得很明显了。另外，用生物体液检查取代目前所使用的令人不舒服的通常是很麻烦的巴氏涂片试验，将会鼓励现在勉强做检查的妇女们接受至少每年一次的RSP检查，这更证明了对这样一种检查方法的需要以及这种方法的实用性。

Claims (20)

1、一种检测生物体液中环状颗粒(RSP)存在的方法，它包括以下步骤：
a、从所述体液中把RSP肿瘤标志物捕捉到一种基质中；以及
b、检测所述基质中RSP肿瘤标志物的存在。
2、一种检测人与动物中癌症存在的方法，它包括以下步骤：
a、从被检人或动物身上取一份体液试样;
b、在所述体液试样中把环状颗粒（RSP）肿瘤标志物捕捉到一种基质上;以及
c、检测所述基质上RSP肿瘤标志物的存在。
3、一种如在权利要求1或2中所申述的方法，其中所说的在所述液体中捕捉RSP肿瘤标志物的步骤包括使所述RSP与一种抗RSP抗体（rspAb）连接，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体，及其混合物所组成的抗体组。
4、一种如权利要求1或2中所申述的方法，其中所说的在所述液体中捕捉RSP肿瘤标志物的步骤包括在至少不存在镁离子与ATP两者之一的条件下，使转移核糖核酸（tRNA）特异性地连接到所述标志物上的氨酰转移RNA合成酶反应位点上。
5、一种如权利要求3或4中所申述的方法，其中所说的检测RSP肿瘤标志物存在的步骤包括产生可见颜色作为这种RSP肿瘤标志物存在的一个指征。
6、一种如权利要求5所申明的方法，包括使至少一种显色反应分子与RSP肿瘤标志物直接或间接地连接以产生所说的可见颜色。
7、一种如权利要求3所申明的方法，其中所说的检测RSP肿瘤标志物存在的步骤包括，在至少没有镁离子和ATP两者之一存在的条件下，使转移核糖核酸（tRNA）特异性地连接到所述标志物上的氨酰转移RNA合成酶的反应位点上并通过检测tRNA的存在作为RSP肿瘤标志物存在的指征。
8、一种如权利要求4或7所申明的方法，其中所说的tRNA有至少一个有显色活性的二级分子与之相连接，以产生可见颜色指示RSP肿瘤标志物存在。
9、一种如权利要求8所申明的方法，它包括使有显色活性的二级分子与一种显色剂反应以形成一种可鉴别的颜色指示RSP肿瘤标志物存在的步骤。
10、一种如权利要求8所申明的方法，其中所述tRNA通过与所述标志物反应而连到所述标志物上，tRNA探针包括tRNA和至少一个有显色活性的二级分子以产生可见颜色作为RSP肿瘤标志物的指征。
11、一种如权利要求10所申明的方法，其中所述tRNA探针包括连接好的分子串tRNA-光生物素-链菌亲合素-碱性磷酸酶。
12、一种如权利要求11所申明的方法，包括使所述RSP-连接的tRNA探针与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑反应混合物反应，产生蓝/紫色指示RSP肿瘤标志物存在的步骤
13、一种如权利要求3所申明的方法，其中所说的检测RSP肿瘤标志物的步骤包括使一个第二抗RSP抗体（rspAb2）与RSP∶rspAb相连接，rspAb2选自由单克隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体及其混合物组成的抗体组。
14、一种与RSP选择性结合从而使其在生物体液中的存在易于检测的探针，它包括有一个适于与所述标志物连接的第一探针成分以及一个与所说的第一探针成分相连的探针标记，所说的探针标记的存在适于被检测作为RSP肿瘤标志物存在的指征。
15、一种如权利要求14所申明的探针，其中所述第一探针成分包含一个抗RSP抗体，所述抗RSP抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、亲和层析纯化抗体及其混合物组成的抗体组。
16、一种如权利要求14所申明的探针，其中所述第一探针成分包括对所说标志物上的氨酰转移RNA合成酶反应位点有专一性的tRNA。
17、一种如权利要求14、15或16所申明的探针，其中所述第一探针成分是直接或间接地与至少一个有显色活性的适于产生作为RSP肿瘤标志物存在指征的可见颜色的二级分子相连接。
18、一种如权利要求17所申明的探针，其中所述的探针标记包括连接的分子串tRNA-光生物素-链菌亲合素-碱性磷酸酶。
19、一种如权利要求14、15或16所申明的探针，其中所述第一探针成分与适于产生作为RSP肿瘤标志物存在指征的荧光二级分子直接或间接相连。
20、一种如权利要求14、15或16所申明的探针，其中所述第一探针成分与一个用于指示RSP肿瘤标志物的存在的放射性同位素直接或间接相连。
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