JPH0479899A - ヒト及び動物における環状粒子及び悪性腫瘍の存在を検出する生体外の方法及びプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、癌検出そしてさらに特に癌細胞の存在を確か
に指示するための！！瘍ママ−カー存在を決める方法及
びプローブに関する。

（従来の技術） 癌は、コントロールされない細胞の生長及び異常な細胞
の拡がりを特徴とする大きな群の疾患である。もし拡が
りがコントロール又はチエツクされないならば、それは
死に至る。

しかし、多くの癌は、もし早く検出されそして直に治療
されるならば、治すことができる。癌の発病率は増加し
つつある。

１９８８年では、約９８５，０００人の人々が、米国だ
けで癌を有するものと新しく診断されるだろう。同し年
、米国で約４９４．０００人そして世界全体で４，００
０，０００人が、この疾患で死亡するだろう。

米国だけで約１７４，０００人が、早開診断、早い治療
及び適切なモニタリングにより助かったものと思われる
。癌の早期検出は、非常に治癒の可能性を増大する。局
所の癌の検出は、恐らく腫瘍の生長における早期の診断
により、さらに有効な治療法を使用させ、そして回復の
ためのチャンスを改善する。手術、化学療法又は放射線
療法による治療は、悪性な生長のすへての痕跡が排除さ
れたことを確かめるために治療後のモニタリングを必要
とする。

過去１５年にわたって、多数の腫瘍に会合した蛋白が見
い出され、それらのあるものはｌｌ！瘍マーカーとして
用いられることが考えられている。これらの腫瘍マーカ
ーの多くは、特定の腫瘍と特有的に会合する。その結果
、それらの存在は、信頼してこれらの腫瘍を検出するの
に用いることができる。

腫瘍マーカーは腫瘍それ自体よりもより容易に同定でき
るので、マーカーはより早いしかもより信頼しうる腫瘍
の検出を可能にする。より良く知られている腫瘍マーカ
ーのあるものは、（ａ）大腸、肺、胃及び膵臓の癌に関
する発癌抗原（ＣＥＡ）＋　　（ｂ）こう丸及び肝の癌
に関するアルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）；及び
（Ｃ）乳癌に関する最近認められた腫瘍マーカー（ＣＡ
−５４９）である。

一つの腫瘍マーカーが同定されており、それは、前述の
ものとは異なり、−船釣な腫瘍マーカーと思われる。電
子顕微鏡で見たとき超顕微鏡的な環状の粒子（ＲＳＰ）
の形のこの腫瘍マーカーは、癌細胞から回りのＭｉ織及
び体液から放出されるが、正常の細胞では検出できる量
で放出されない。プロシーム、プロテアシーム、ミニパ
ーティクル、ＬＡＭＰ、マクロベイン、ＲＮＡブロテオ
リビト及び環状のミニパーティクルとしても知られてい
るＲＳＰは、他の哺乳動物の腫瘍と同じくヒトの腫瘍の
最も広いスペクトルによりモして悪性腫瘍の細胞系によ
り放出されることが分かっている。生体外及び生体内の
研究は、悪性ｉｉの細胞によるＲＳＰの放出は、発癌の
過程の性質でありそして生物の種類、腫瘍のタイプ又は
腫瘍の位置に関係ないことを示している。その上、この
腫瘍マーカーは、腫瘍の程度に応じて放出され、そして
再発の診断が顕性の臨床上の徴候に基づいて可能になる
４〜１０月前に放出される。それ故、他のマーカーとは
異なり、ＲＳＰは一般的な腫瘍マーカーである。それ自
体、ＲＳＰは早い段階てとんな癌の存在を検出し、治癒
の見込みを顕著により確実にするのに用いることができ
る。ＲＳＰは又癌の患者の治療の有効性をモニターする
ことができる。血清中のＲＳＰのレベルの低下は、成功
した治療の指標として用いることができる。組織培養で
今迄テストされたすべての悪性腫瘍の細胞はＲＳＰを放
出しそして発癌物質による処理後組織培養中に悪性腫瘍
を作った細胞も又ＲＳＰを放出するのて、ＲＳＰは、又
発癌物質を同定するための短期のテストシステムの新し
い群の終点として用いることができる。

初期の研究は、ＲＳＰ中のＤＮＡ成分を検出する蛍光分
析システムをもたらした。この技術は、頸管癌について
女性をスクリーニングするための膣洗浄液について用い
て成功した。

米国特許第３７９８１３１号（Ｒｏｕｎｄｓら）では、
ＲＳＰのＤＮＡ成分へ蛍光染料を結合しモしてＲＳＰの
濃度の間接的な目標として増大した発光（蛍光の強度）
を読みとる技術を開示している。残念ながら、この技術
は、異なる体液中のＲＳＰを定量的に測定するために、
希釈及び可変の容量のような変化するものを考慮に入れ
るように変更されねばならない。

その上、蛍光分析はたとえ定性的な分析についても特殊
な装置を必要とし、それ故それ自体を開業医の使用まし
て家庭の使用、又は医者の使用のためのテストキットに
そう人することを容易に行わせない。

ＲＳＰ腫瘍マーカーは、先ず３種の異なるヒトの悪性腫
瘍細胞系（ＨｅＬａ、頸管癌から誘導；ＫＢ、鼻咽頭症
から誘導；そしてＣＭＰ、大腸からの腺癌から誘導）に
より調節された培地に見い出された生長調節因子として
Ｄｏｎａｌｄ　Ｒｏｕｎｄｓ博士により約１９７０年に
記述された。３種の細胞系は、生体外で正常のヒトの皮
膚線維芽細胞の生長を調節する共通の因子を分泌した。

低濃度で、それは細胞の分化を刺激した。

高濃度で、それは細胞の分化を抑制し、最高濃度で細胞
を死滅させた。抗原的には、因子はすべての３種の悪性
腫瘍細胞系から同一であることが分かった。

生体中のＲＳＰの機能については多くのことが未知のま
まであるが、因子の物理的及び生化学的な性質は同定さ
れている。超遠心分離及び電子顕微鏡の方法を用いて、
因子が環の構造を有する粒子よりなることが立証された
。電子顕微鏡写真は、環が６〜７個のサブユニットから
作られていることを示した。環は、単一であるか又はと
きには４個の環の集まりで見い出され、側面から見ると
き矩形の粒子として見えた。

環は、直径１０〜１２ナノメーターであり、そして蛋白
ＮＮ１００ｕ当り３〜５ｕｇのＤＮＡ及び８〜１５μｇ
のＲＮＡを含んだ。脂肪可溶性の染色による未発表の研
究は、又１種以上の脂質の存在を示唆しているが、これ
らは同定されていない。ＲＳＰの大きさ及びサブユニッ
トの形及び数は、細菌から酵母、植物、ウニ、昆虫、両
棲類、爬虫類、鳥及びヒトを含む哺乳動物に及ぶ現在迄
報告されたすべての生体で同一である。ＲＳＰは、多触
媒的プロティナーゼ活性を有する高分子量の核蛋白であ
る。それは約２Ｏ３の沈降係数、６５０〜７５０ｋＤａ
の分子量を有し、そして２１〜３１ｋＤａの分子量及び
３〜１００等電点を有する少なくとも１３種の同定され
ていないポリペプチドよりなる。それらは又約７０〜８
０個のヌクレオチドよりなるＲＮＡ及びそれより少ない
ＤＮＡ成分を有する。ＲＳＰは細胞の核及び細胞質中に
見い出され、そしてそれらは悪性腫瘍細胞により細胞外
に放出される。それらは、細胞内蛋白を分解してｍＲＮ
Ａ翻訳及びｔＲＮＡ前処理を調節しそしてアミノアシル
ｔＲＮＡシンテターゼ活性を有すると報告されている。

それらは、熱シヨツク蛋白及び特定の小さいＲＮＡと会
合すると報告されている。それ自体、これらの粒子は明
らかに種々の細胞内過程で重要な役割を行うものである
。

１９７０年中朋の初期の研究は、ＲＳＰが腫瘍組織によ
り選択的に放出される証拠を提供している。肺、大腸、
乳房、皮膚、腎及び眼からの細砕した腫瘍生検組織は、
体温での２４時間のインキュベーション後保存培地に顕
著な量のＲＳＰを放出し、一方正常な皮膚及び舌の筋肉
の同様な標本は検出可能なレベルのＲＳＰを放出しなか
った。病理学上正常のものから侵入病に及ぶ１４６個の
ヒトの皮膚標本からのインキュベートした生検組織によ
るＲＳＰ放出の二重盲検の研究は、２０個の正常な皮膚
の生検及び１０個の尋常性いぼ（普通のいぼ）の生検の
何れも顕著な量のＲＳＰを放出しないが、方良性腫瘍、
脂漏性いぼの３６個の標本中１２個（３３％）及び悪性
前腫瘍、化学線角化症の１３個の標本中５個（３８％）
が顕著なレベルのＲＳＰを放出したことを見い出した。

研究は、又５２個の基底細胞癌の１００％及び１５個の
扁平上皮癌の１００％が顕著な量のＲＳＰを放出したこ
とを見い出した。侵入扁平上皮癌のＲＳＰ値の範囲は、
非侵入基底細胞癌のＲＳＰ範囲より大きかった。

ヒト子宮頚管からの生検に関する同様な二重盲検の研究
において、異常な頚管の恐らく正常な領域からの１６／
２１（７６％）生検が、保存培地へ放出される検出可能
なＲＳＰを殆と又は全く示さないことを観察している。

残った５個の標本は、２４時間のインキュベーション期
間中に低いレベルのＲＳＰを放出した。プールした形成
異常及びコンジロームの標本は、１０／１Ｂ（５６％）
がとるに足らないレベルのＲＳＰを放出したが、８７１
８のこれらの標本は中程度のレベルのＲＳＰを放出した
。対照的に、１３／１４（９３％）上皮内癌及び１６／
１６（１００％）の侵入病の標本は顕著なレベルのＲＳ
Ｐを放出した。その上、ＲＳＰは頚管組織そのものによ
り膣のプールに放出されることが観察された。膣のａＩ
流液の分析は、２７６／２Ｂ４　（９７％）の正常な頚
管は全く又はとるに足らないレベルのＲＳＰを放出し、
モして１１５／１２４　（９３％）の種々の程度の形成
異常を有する女性がそうであったことを示している。上
皮内癌を有する女性からの標本は、１７／２９　（５８
％）がＲＳＰ放出の点て陰性であることを示している。

これらの中、１７／１９（８９，５％）は３８歳より若
く、その年令範囲では、未治療のままだと、デンマーク
で実施された二つの１５年間の研究で述べられているよ
うに、９０％のケースでは病変は正常に戻る。頚管癌の
場合、１０／１０（１００％）の膣潅流標本が大きなレ
ベルのＲＳＰを示した。

他の研究において、種々の癌細胞の核から抽出された核
様抗原は、外径１１．３％ｍ及び内径２．９％ｍの「ミ
ニパーティクル」よりなり、８個のサブユニットを含み
ざらにＲＳＰの全体の形態学上の外観を有することが分
かった。この抗原は膀胱、脳、大腸、食道、肝、肺、前
立腺、皮膚、胃及び甲状腺の癌、３種の肉腫、４種のリ
ンパ腫及び６種の悪性腫瘍の培養された細胞系に存在す
ることが分かった。抗原は、１７種の正常組織のタイプ
、４種の良性の腫瘍、７種のタイプの炎症疾患及び２種
の正常のものの培養した細胞系には存在しなかった。

ヒト腫瘍細胞からのＲＳＰ放出に関するこれらの観察は
、２１種の生体外の哺乳動物の細胞系による培地へのＲ
ＳＰ放出の初期の研究において立証された。１種以外の
すへての細胞系はある量のＲＳＰ　（電子顕微鏡により
検出可能）を放出することが分かった。それ故、ＲＳＰ
は唐花性の現象と考えられた。しかし、放出される量は
、細胞系のタイプ又は超厚に依存した。腫瘍超厚の細胞
（９／９）及ぶ腫瘍形成ウィルスにより感染した細胞（
３／３）のすへては、顕著な量のＲＳＰを放出し、一方
正常の起源の６／１０細胞系は非常に低いレベルのＲＳ
Ｐを放出した。

腫瘍組織により放出されるＲＳＰの相対的な量は、それ
らの悪性度に関しているように見える。これは、Ｃ３Ｈ
１０Ｔ１／２マウス細胞により行われた研究で十分に立
証された。このような細胞は、発癌物質を同定する広く
認められた生体外のアッセイに用いられる。発癌物質に
さらされたとき、これらの細胞は明らかに規定可能な形
態学上及び生理学上の変化を行い、それは、（ａ）変化
なしく正常の接触阻止）、（ｂ）辺縁の接触阻止を有す
るタイプｍコロニー　（Ｃ）低い接触阻止を有するタイ
プロコロニー及び（ｄ）接触阻止の事実のないタイプｍ
コロニーを含む、Ｃ３Ｈ１０Ｔ＋／２マウスに接種され
たとき、タイプ■及びタイプｍコロニーからの細胞のみ
が悪性腫瘍に生長するだろう。正常な細胞及びタイプｍ
コロニーからの細胞は、腫瘍を形成しないだろう。その
上、タイブ■コロニーからの細胞は、タイプ打コロニー
からのものより悪性である。それは、それらがタイプ打
コロニーからの細胞よりも宿主動物により多くのしかも
より大きな悪性腫瘍を形成するからである。タイプ■及
びｍコロニーからの細胞のみがＲＳＰを放出し、一方正
常な細胞及びタイプＩコロニーからのそれらはしないこ
とが立証された。さらに、ＲＳＰは、通常のアッセイ終
点に必要な普通の８週とは対照的に、発癌物質エチルメ
タンスルホネートによる処理後僅か３週でＣ３Ｈ１０Ｔ
＋／２細胞から培地で検出できることが立証された。

他の研究は、ビタミンＡ欠損ハムスターの気管上皮が、
臓器培養で扁平上支具形成及び過形成を生じさせるにも
かかわらず、ビタミンＡ欠損シリアンハムスターからの
気管がＲＳＰを放出しないことが立証されている。モデ
ルは、発癌の過程を厳密に真似をしそして発癌過程及び
ビタミン八類似体の抗新生細胞性を研究するのに用いら
れるが、シンジエネイック・ハムスターに移植されると
き病変は正常に戻り、それ故悪性腫瘍に転換しない。そ
れ故、ＲＳＰを放出しないことは、正確に組織の真の良
性の状態を反映した。

ＲＳＰの放出が、定量的に腫瘍の程度に定量的に関連し
、そのため予言できる値を有することの強い証拠がある
。マウス黒色腫細胞系からの細胞が８１６Ｆ１０マウス
に静脈内で注入されるとき、それらは体全体に小さい腫
瘍を形成する。

これらの腫瘍の着色した特徴は、宿主動物の腫瘍の程度
の指標として、肺組織の腫瘍の数の信頼できる評価を行
わせる。

黒色腫細胞を注入されたマウスからの細砕した肺Ｍ４織
が、同一の肺組織について記録された腫瘍の数に比例し
て培地中にＲＳＰを放出することが観察された。その上
、ＲＳＰの放出が肺が明らかに肉眼で見える腫瘍を形成
する前に検出てきることが観察された。ＲＳＰ放出が腫
瘍の程度に関連するという別の事実として、その腫瘍ｍ
織が根治的乳房切除により外科的に除去された８人の乳
癌患者の血清中のＲＳＰレヘルの研究が行われた。血清
ＲＳＰ含量は、手術の時間から検出不可能なレベルのＲ
ＳＰへ手術後１０日ロー急速に低下した。

血清ＲＳＰレベルは、手術後３２日迄く研究期間）これ
らの女性では陰性のままであった。

次の研究において、ＲＮＡ−プロテオリビドがＲＳＰで
あることを示唆する特徴を有するＲＮＡ−プロテオリビ
ト物質が、癌の患者の血清中と同じく悪性腫瘍細胞から
それらの回りの培地に放出されることが観察された。こ
の物質は、２３種の異なるタイプの癌を代表する９９人
の患者の血清中に検出された。比較として、癌に関連の
ない２１種の障害を有する７４人の患者の血清中には、
それは見い出されなかった。

悪性腫瘍起源の８種の細胞系は、それらの培地にがなり
の量のＲＮＡ−プロテオリピド物質を放出することが分
かった。

研究は、癌患者の血清中のＲＳＰ様ＲＮＡ−ブロテオリ
ビドの量が、存在する腫瘍の量と直接比例し、さらに腫
瘍の外科的除去が手術後８〜１０日の間に血清中のＲＮ
Ａ−プロテオリピドの完全な排除を生じさせ、根治的乳
房切除を行った乳癌患者に間する観察を確認したことを
報告している。その上、腫瘍の再発が観察されたとき、
血清ＲＮＡ−プロテオリビドのレベルは、腫瘍の臨床上
の出現に先立って１０個月以内に上昇して来た。

さらに、ＲＳＰ放出がハムスターの頬のうの腫瘍の誘発
と相間する研究が行われ、鉱油に溶解した５％ジメチル
ベンズアンスラセンを５週間にわたって１週当り３回塗
った。３回の塗布をうけた１Ｂ／１Ｂ試料と同じく、１
００％（３２／３２）正常の前処置した頬のうの生検は
、とるに足らないレベルのＲＳＰを生成した。第４回の
塗布後、第６回の塗布後採取した試料の９／１７（５３
％）と同じく、５／９　（５６％）は適度に上昇したＲ
ＳＰの生成を示した。このとき、生検の組織の断面は基
底細胞の成る過形成を示し、ケラチン化は増大したが、
悪性腫瘍細胞の事実はなかった。第７回の塗布（第３週
）そしてそれ以後、殆どすべての試料は顕著な量のＲＳ
Ｐを放出しく例えば第７回の塗布で１８／１Ｂ、第９回
の塗布で１５／１５、第１２回の塗布で８／８そして第
１５回の塗布で１２／１２）さらに放出するＲＳＰのレ
ベルは第９回の塗布後一定となった。組織学上、被処置
動物のすべてで、頬のう及び唇に十分に限定した癌を、
処置開始僅か１２週間後に発生させた。これらのデータ
は、化学的に変換された組織の生検によるＲＳＰの放出
が、少なくとも９週間悪性腫瘍の転換の組織学上の証明
に先立つことを示し、そしてＲＳＰ放出の測定が悪性腫
瘍前又は無症候の状態の人々を同定するのに臨床上有用
であろうことを示唆している。

腫瘍マーカーは先ず約１９７０年に記述され、そして環
状の粒子（ＲＳＰ）として特徴付けられたものが、多く
の研究室で悪性腫瘍の組織又は細胞系の標本に観察され
た。細菌の事実は、悪性腫瘍細胞からのＲＳＰが抗原的
に独特であり、そして正常細胞による放出が全くないか
又はとるに足らないこととは対照的に、体液に悪性腫瘍
細胞により多量に分汐・される点で、それらが正常細胞
と異なることを示唆している。

この後者の特徴は、体内にかくされている癌の事実につ
いてすべての体液をモニターさせる。その上、ＲＳＰが
再発する腫瘍の臨床上の出現数個列前に検出てきるとい
う観察は、無症候の腫瘍が、治療が高い可能性で治癒を
確実にするような発育の早い段階でヒトで検出てきるこ
とを示唆している。ＲＳＰ含量が腫瘍の程度と比例した
という観察は、又治療をうけている癌の患者は、治療の
有効性を評価するために容易にモニターできることを示
唆している。これらの目的を達成するために、ＲＳＰレ
ベルを検出且つ測定するためのコストの安い、簡単な、
早い、敏感なしかも信頼できる方法が必須となる。

（発明の概要） それ故、コストの安い、簡単な、使用の容易な、敏感な
しかも信頼しうる悪性腫瘍を検出する方法として、ＲＳ
　Ｐ　ｌ！瘍ママ−カー存在を検出する方法及びプロー
ブを提供するのが本発明の目的である。

生物学的流体から基質上にマーカーを捕捉し、次に基質
上のＲＳＰの存在を検出することにより生物学的流体中
のＲＳＰＩ！５１マーカーの存在を検出する方法及びプ
ローブを提供するのが本発明の他の目的である。

癌性細胞を含む生物学的流体からＲＳＰ腫瘍マーカーを
基質上に捕捉し、次に悪性腫瘍の存在の指標として基質
上のＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出することよりなる
、悪性腫瘍の存在を検出する方法及びプローブを提供す
るのが本発明の他の目的である。

モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニテ
ィ精製抗体及びこれらの混合物よりなる群から選ばれる
抗ＲＳＰ抗体により生物学的流体からＲＳＰＩ！ＩＩマ
ーカーを捕捉する方法及びプローブを提供するのが本発
明の他の目的である。

転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）プローブにより生物学的流体
からＲＳＰＩ！！マーカーを捕捉し、次にＲＳＰの存在
の指標としてプローブの存在を検出する方法及びプロー
ブを提供するのが本発明の他の目的である。

マーカー上のアミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ受容
性部位に特異的なｔＲＮＡにより基質上に生物学的流体
からＲ８Ｐ１１瘍マーカーを捕捉するのが本発明の他の
目的である。

ＲＳＰ腫瘍マーカーに対する色反応性分子の直接又は間
接の結合を含む発色技術を利用する、悪性腫瘍を有する
と思われる患者からの生物学的流体中のＲＳ　Ｐ　ｌ！
瘍ママ−カー存在を検出する方法を提供するのが本発明
の他の目的である。

前述の目的は、恐らく悪性腫瘍を有すると思われる患者
からの生物学的流体中のＲＳＰの存在を検出する方法を
提供することによる本発明に従って達成され、その方法
は、基質上に該流体中のＲＳＰを捕捉しそして基質上の
ＲＳＰの存在を検出することよりなる。その方法は、テ
ス）・されるべきヒト又は動物から体液のサンプルを入
手し、基質上に該流体中のＲＳＰを捕捉し、そして基質
上のＲＳＰの存在を検出することにより、ヒト又は動物
中の悪性の癌性細胞の存在を検出するために用いること
ができる。本発明の一つの形によれば、ＲＳＰは、モノ
クローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精
製抗体及びこれらの混合物よりなる群から選択される抗
ＲＳＰ抗体により体液サンプルから捕捉される。次に、
基質上のＲＳＰの存在は、例えば発色技術を用いること
により検出される。本発明の他の形によれば、ＲＳＰは
、ＲＳＰマーカー上のアミノアシル転移ＲＮＡシンテタ
ーゼ反応性部位にｔＲＮＡを付着するラヘルしたｔＲＮ
Ａプローブと体液サンプル中のＲＳＰとを接触させ、そ
してＲＳＰ上のシンテターゼ分子の存在を検出すること
により、体液サンプルから捕捉される。

本発明の好ましい形では、ＲＳＰの捕捉及び検出又は基
質上に既に捕捉されたＲＳＰの検出の何れかは、ＲＳＰ
上のアミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位に
特異的なｔＲＮＡよりなるＲＳＰプローブを用いて達成
される。望ましくは、プローブは、ｔＲＮＡ成分を経て
ＲＳＰ上のアミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性
部位（ジヌクレオチド折りたたみ）に結合しそして肉眼
で見える色を発する二次分子を含む結合した分子である
。一つの好ましいプローブは、結合した分子：ｔＲＮＡ
−ホトビオチンーストレブタビジンーアルカリ性ホスフ
ァターゼを含む。他の好ましいプローブは、ｔＲＮＡ−
ホトビオチン−アビジン−グルコースオキシダーゼを含
む。

本発明の他の形では、モノクローナル、ポリクローナル
及びアフィニティ精製抗体から選ばれる少なくとも１種
の抗ＲＳＰ抗体を含むＲＳＰブａ−ブが提供され、該抗
体はその存在がＲＳ　Ｐ　腫瘍マーカーの存在の指標と
して検出されるように適合されたプローブマーカーに結
合される。

本発明の他の目的及び利点は、下記の詳細な記述、図面
、実施例及び請求の範囲から当業者にとり明らかになる
だろう。

第１図は、概略的なやり方で、ＲＳＰアミノアシルｔＲ
ＮＡシンテターゼ受容体部位及びその部位に特異的なＲ
ＳＰブローブの一つの形を示す。

第２図は、概略的なやり方で、ＲＳＰ上の利用可能なア
ミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ受容体部位へのｔＲＮ
Ａプローブの付着直前のｔＲＮＡ前処理表面を経て反応
容器に結合したＲＳＰを示す。

第３図は、概略的なやり方で、その受容体部位てｔＲＮ
Ａプローブとの反応後の第２図のＲＳＰを示す。

本発明によれは、生物学的流体中のＲＳＰ腫瘍マーカー
の存在を決定しそしてヒト又は動物の悪性腫瘍の存在を
検出する方法が提供され、それは基質上に流体からＲＳ
Ｐマーカーを捕捉し、次に悪性腫瘍の存在の指標として
基質上のＲＳＰマーカーの存在を検出することを含む。

発明の一つの好ましい形は、基質上へ体液中のＲＳＰ腫
瘍マーカーを捕捉するための抗ＲＳＰ抗体（ｒ　５ｐＡ
ｂ）の使用を含む。これは、ＲＳＰ腫瘍マーカー（ｒｓ
ｐＡｂをしてＲＳ　Ｐ　Ｉｆ！瘍マーカーと結合させ、
それにより流体からＲＳＰの所望の捕捉を達成させる）
に対するｒｓｐＡｂのアフィニティにより可能である。

本発明の他の好ましい形は、ＲＳＰ上のその特定の部位
即ちアミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位と
結合するｔＲＮＡプローブの使用を含む。このようなプ
ローブは、基質上へ体液中のＲＳＰ腫瘍マーカーを捕捉
できるばかりでなく、検出を例えば肉眼で見える色を発
することにより容易にする適切な二次分子をプローブ上
に含むことにより、基質上のＲＳＰの存在を検出てきる
。ＲＳＰ腫瘍マーカーの捕捉及び検出が、ヒト又は動物
の悪性の癌性の細胞の存在を検出するための有効、正確
且つ信頼できる方法であるという評価は、ＲＳＰが癌性
の細胞により細胞外に放出され、それにより血清又は他
の体液中で検出できるという認識の直接的な結果である
。

抗ＲＳＰ抗体の、生物学的流体例えばヒト又は動物の体
液中のＲＳＰを認識ししかも同定しそしてこれらの流体
からＲＳＰを捕捉する能力並びにヒト又は動物の体液例
えば癌の血清中の悪性の癌性の細胞を検出するこの方法
の使用は、下記の実施例Ｉに明らかに説明されている。

実施例■の目的は、抗ＲＳＰ抗体（ｒ　５ｐＡｂ）が癌
の血清からＲＳＰを有効に捕捉できることを立証するこ
とにある。実施例Ｉは、最早Ｒ８Ｐを放出しないがまだ
抗ＲＳＰ抗体を有する以前に癌にかかった患者からのｒ
　ｓ　ｐＡｂをアフィニティ精製技術により回収するこ
とにより行われた。もしｒ　５ｐＡｂが有効ならば、捕
捉したＲＳＰは、発色技術例えばさらに十分に以下に開
示されたまうなｔＲＮＡプローブ検出システムにより検
出可能であろう。

（実施例） （ａ）シアノゲン・プロミド・セファロース４−Ｂ樹脂
をカラムに充填しモしてＲＳＰを樹脂に結合した。樹脂
の調製、カラムの充填及び抗原（ＲＳＰ）の結合は、周
知の標準的な方法である。

（ｂ）以前癌であった患者からの１ｍｌの血清を３ｍｌ
のｐＨ８゜５ボレートバツフアーと混合し、次に外界温
度及び圧力でカラムに通した。血清中のすべてのｒｓｐ
Ａｂは、カラム上てＲＳＰ抗原と反応しそして結合した
。非結合血清蛋白をｐＨ７，５ホスフエートバツフアー
塩水（ＰＢＳ）によりカラムから洗った。０．０吸収の
光学密度読みとり（０，Ｄ、）がＵＶ分光光度計で２８
０ｎｍで達成されたとき、洗浄を停止した。

（ｃ）結合したｒ　５ｐＡｂを、４．０Ｍ塩化マグネシ
ウム２ｍずつによりカラムから溶離した。溶離液のそれ
ぞれの部分の２８０ｎｍにおけるＯ、Ｄ、を分光光度計
で読みとり、下記の結果を得た。

雇跋並　　　　　女工」よ １　　　　　　０、０４ ２　　　　　　０、０２ ３　　　　　　０、０２ ４　　　　　　０．０１ （ｄ）蛋白（ｒ　５ｐＡｂ）の低下するレベルは、ｒｓ
ｐＡｂの大部分が初めの４つの溶離物にあることを示し
た。これらの４つの溶離物をプールし、１０．０００分
子量カットオフ透析管に入れそして最初の１８時間４℃
で０．８５％塩化ナトリウムに対し、次に最後の２．５
時間ｐＨ７，５ＰＢＳに対して透析して過剰の塩を除い
た。

（ｅ）得られた１５１容量の透析した物質をＰＭ−１０
膜を備えたＡＭＩＣＯＮｉ！［過セル中で遠心分離によ
り２．５ｍｌに濃縮した。

（ｆ）抗体濃縮の０．Ｄ、を蛋白標準曲線と比較し、０
．１ｍｇ／ｍｌ蛋白に等しいことが分かった。この物質
は、アフィニティ精製ｒ　５ｐＡｂを構成した。

２、　　　　　　　　　−　　　Ｓ　　−ム（ａ）ｒｓ
ｐＡｂをプラスチック棒上のニトロセルローズ膜（１）
に適用し、血清によりブロックしそして次に室温で１０
分間癌患者からの血清０．１ｍｌと反応させた。膜に吸
い取らせて乾燥した。次に、それを１５分間、下記に十
分に記述されるｔＲＮＡプローブ検出システムと反応さ
せた。工程毎の反応は次のように説明される。

ｒ　５ｐＡｂをニトロセルローズ膜上に置く：（＞］−
ｒｓｐＡｂ 膜をＲＳＰを含む癌患者の血清と反応させる：（＞　　
］−ｒｓｐＡｂ−ＲＳＰ 膜上のＲＳＰをｔＲＮＡプローブ混合と反応させる：０
　］−］ｒｓｐＡｂ−ＲＳＰ−ｔＲＮＡ＝ホルマザン反
は、抗ＲＳＰ抗体が膜に適用されたところのみ特徴的な
ホルマザン灰黒色のスポットを生じた。

この実施例は、ＲＳＰが、膜に固定されたｒ　ｓ　ｐＡ
ｂにより癌の血清から捕捉されたことを示す。それは、
又ｒｓｐＡｂが、癌患者からの血清の部分から悪性腫瘍
を検出するシステムにうまく形成されたことを示す。

尖胤例工 実施例Ｉに示されたのと正に同じ結果がポリクローナル
抗体を用いて得られる。下記は、ウサギからポリクロー
ナル抗体を得る説明的な方法を示す。

−に　　　　１　ロー　ル 抗ＲＳＰ抗体を、下記のプロトコールを用いて抗体に基
づく角検出システムをさらに開発するために作る。

乳癌愚者からの３００ｍ１の血清によるＩｇＧ及びＲＳ
Ｐを等容量の飽和硫酸アンモニウムと混合することによ
り血清から沈殿（ｐｐｔ）させた。

（ｂ）血　　７の　　　　ｔの ｐｐｔを「飽和バッファーＪ（５０ｍＭ）リス−ＨＣ１
、ｐＨ７，５，１ｍＭジチオスレイトール２０％Ｖ／Ｖ
クリセロール及び０，０２％Ｗ／Ｖナトリウムアジド）
に溶解した。

ＲＳＰ／ＩｇＧ成分を等容量の飽和硫酸アンモニウムに
より再沈殿させた。ｐｐｔを標準バッファーにより再溶
解し、そして再沈殿し再び再溶解した。

溶解したＲＳＰ／Ｉ　ｇＧ混合物を１８時間４℃で００
２％ナトリウムアジドを有するホスフェートバッファー
塩水（ｐＨ７，５）に対して１０．ＯＯＯＭＷカットオ
フ透析膜で透析した。

（ｃ）バ　　　−０．５ｍル 透析した（１０ｍｌ）ＲＳＰ混合物を濃縮しそしてバイ
オゲルＡ−０，５ｍ樹脂を充填した４×８（至）カラム
で分画した。

樹脂を使用前に標準バッファーにより調整した。１８離
した両分を下記に詳述するｔＲＮＡプローブシステムに
よりテストして、との両分がＲＳＰ成分が含むかを決め
た。

（ｄ）ヒ　ロ　パル　パ　　　　　ロマＲＳＰ含有画分
をプールしそして４℃で１８時間１ｍＭジチオスレイト
ール及び２０％グリセロールを含む２５ｍＭ燐酸カリウ
ム（ｐＨ６，ｅ）に対して透析した。透析したＲＳＰ混
合物を次に濃縮し、同じホスフェートバッファーにより
予め調整したヒドロキシルアパタイト２５ｍ１を充填し
たカラムで分画した。ＲＳＰを１００ｍ１の１００〜１
５０ｍＭホスフェートバッファーにより溶離した。溶離
物を前述のｔＲＮＡプローブシステムによりテストして
、どれがＲＳＰ成分を含むかを決めた。

（ｅ）　　　　　　　　−ルー・　ロマＲＳＰ含有画分
をプールし、次に４℃で１８時間標準バッファーに対し
て透析した。透析したＲＳＰ混合物を次に標準バッファ
ーにより平衝させられたＤＥＡＥ　　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
　　Ｂｌｕｅ　　２０ｍ１を充填したカラムで濃縮し分
画した。

カラムを５０ｍ１の標準バッファーにより洗い、次にＲ
ＳＰを０〜０．６Ｍ塩化カリウムの勾配の１００〜１３
０ｍ１により溶離した。ｔＲＮＡプローブ分析に基づく
活性画分をプールし、次に４℃で１８時間標準バッファ
ーに対して透析した。

透析したＲＳＰ成分をＰＭ−１０膜を備えたＡＭＩＣＯ
Ｎセル中の遠心分離により濃縮して、ＵＶ分光光度計の
２８０ｎｍでのＯ，Ｄ、に基づいて５ｍｇ／ｍｌの最終
の蛋白濃度とした。

（ｆ）　！変に皿工五基準 精製したＲＳＰを、非変性条件下でポリアクリルアミド
ゲル中の電気泳動により検査した。結果は、６００，０
００〜６７５．０００ｍＷ位置の特徴的な単一のバンド
であった。

ＲＳＰに対して特異的な抗血清は、Ｗｉｎｂｅｒｒｙ　
ａｎｄ　１ｌｏｌｔｅｎｒＲａｔいｖｅｒ　Ｇｌｕｃｏ
ｓｅ−６−Ｐ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　　Ｄｉ
ｅｔａｒｙＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａ
ｔｅ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＪ　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　ｖｏｌ、　２５２．　Ｎｏ、２１．　ｐｐ、７７
９６〜７８０１（１９７？）の方法の変法を用いて作ら
れる。

（ｂ）　　　　　ロ　コール 完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバントと等Ｖ／Ｖの１００
μｇの免疫原（ＲＳＰ）による−次免疫化。皮下（ＳＱ
）の複数部位の注射。

３週間の間隔。

不完全Ｆｒｅ＋川ｄのアジュバントと等Ｖ／Ｖの５０膜
ｇの免疫原による二次免疫化。ＳＱの複数部位の注射。

ν、　９〜１０日の間隔。

ν、血清のテストハツチからのｒ　ｓ　ｐＡｂレヘレベ
依存する採血又はテスト採血。

ｖｉ、　　１４〜１８日の間隔。

ｖｉｉ、　　等Ｖ／Ｖの不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバ
ント中の５０膜ｇの免疫原による第三の免疫化。ＳＱの
複数部位の注射。

ｖｉｉｉ、　９〜１１日の間ド閣。

Ｘ、採血。

（ｃ）ｒｓ　　ｂの　　　　、′ ＩｇＧを、蛋白Ａ−セファロース・アフィニティ・クロ
マトグラフィにより他の免疫グロブリンから分離する。

酸により溶離したＩｇＧを中和し、そして２８０μｍて
０．０１より大きいＯ，Ｄ、を有する画分をプールしさ
らにＰＭ−１０膜を備えたＡＭＩＣＯＮセル中で約１ｍ
ｇ蛋白／１に遠心分離により濃縮した。

得られた精製且つ濃縮したｒｓｐＡｂ試料を５℃で貯蔵
し、そして０．０２％Ｗ／Ｖナトリウムアジドとともに
保存した。この材料を本発明の癌（ＲＳＰ）検出システ
ムで用いる。

本発明の実施において、ｒ　５ｐＡｂは、任意の普通用
いられている基質例えばアクリルヒーズ、膜、ラテック
スヒーズ、金属（即ち鋼ビーズ、コロイド状金など）、
ガラス面、種々の重合体の表面などに付着されて、ヒト
又は動物の体澄から表面へＲＳＰを捕捉又はしっかり固
定する。このような体液の例は、血清、尿、涙、痰、唾
液、精液、乳腺液並びに接近しつる領域からの洗浄物例
えば肺、頚管、大腸の洗浄物又は細胞或いは組織の分解
物又は培地からの洗浄物なとである。

捕捉されたＲＳＰは、次に任意の普通用いられる検出シ
ステム例えば蛍光マーカー、ラジオアイソトープ、触媒
的酵素及びバイオ或いは化学ルミネセンス・タグ・シス
テムにより、又はプローブ例えばＲＳＰの核酸成分に対
して開発されたＲＮＡ又はＤＮＡプローブにより又はｔ
ＲＮＡプローブにより検出できる。例えば、ｒｓｐＡｂ
は、任意の普通用いられる検出システムと結合して、本
発明により用いられることが望ましいプローブを形成で
きる。従って、それは蛍光マーカー例えばフルオロセイ
ン、ローダミン、テキサス・レッド、エチジウム・プロ
ミド、アクリジン染料などと結合でき、そして蛍光分光
光度計、蛍光顕微鏡又はＵ■分光光度計により読みとら
れる。さらに、それはどんなアイソトープとも結合しそ
して用いたアイソトープ及びテストシステムの構造に応
してヘータ又はガンマカウンターにより又はオートラジ
オグラフィにより検出できる。抗ＲＳＰ抗体は、又ビオ
チン又はホトビオチンと結合でき、それ故アビジン、ス
トレプトアビジン、エキストラアビジンなとと結合しそ
して標準のＥＬＩＳＡ検出システムに用いられる任意の
酵素例えばグルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどに結合
できる。抗体に結合したこれらの酵素は、又色の終点を
増幅する任意のシステムとともに用いられ、例えはアル
カリ性ホスファターゼは、ホルマザン及びインディゴの
同時形成とともに二重の連続する接触反応を開始する。

プローブは、分子のタイプ相互の独特且つ特異的な親和
性に基づく。プローブとして普通に用いられる分子の例
は、次の通りである。抗原：抗体の親和性、ハイブリッ
ト化ＲＮＡ又はＤＮＡ：　ＤＮＡの親和性、アビジン：
ビオチンの親和性及び特定の免疫グロブリンに関するプ
ロティンＡ又はプロティンＧの親和性。従って、ｒ　５
ｐＡｂによるＲＳＰの捕捉は、抗原：抗体の親和性の例
である。他の高度に特異的な分子の親和性は、その基質
に関する酵素分子上の受容体部位のそれである。この親
和性は、プローブとして開発されてこなかった。それは
、（１）基質がしばしばそれ自体をマーカーによりラベ
ルさせない小さい分子であり、（２）基質が酵素により
生成物に急速に転化され、モして（３）生成物が速やか
に酵素分子から放出されるからである。しかし、プロー
ブが、これらの条件が適用されない成る酵素／基質の親
和性例えばＲＳＰとのそれについて開発されうろことが
現在分かった。

マグネシウムイオン又はアデノシントリホスフェート（
ＡＴＰ）の何れかの不存在下、ＲＳＰの酵素成分上の特
異的な受容体部位が、放出可能な生成物を形成すること
なく、それらの同種のアミノ酸とともに又はなして、特
定のｔＲＮＡのそれと結合できる。結合したｔＲＮＡは
、アルカリ性ホスファターゼ共役ストレプトアビジンと
のｔＲＮＡの容易な結合を行わせるホトビオチンにより
ラベルされる。このようなブロ−ブが選択的にＲＳＰ中
のその同種のシンテターゼ構造と結合した後に、その存
在は、アルカリ性ホスファターゼ／基貿反応による可視
的発色によって立証できる。この酵素に関する感知でき
る発色のやり方は、インジゴ及びホルマザンの同時の形
成である。

本方法によれば、ＲＳＰの存在は、個々の行われた検査
からの生物学的流体のサンプルを集めることにより決め
られる。

しかし、従来の方法とは異なり、それはＲＳＰの検出に
おいてとのタイプの癌が予想されるか又はとの生物学上
の流体が用いられるかには関係しない。生物学上の流体
が集められた後に、流体中のＲＳＰが、実施例■及び■
に記述され説明されたように、１種以上のモノクローナ
ル、ポリクローナル及びアフィニティ精製抗体から選ば
れる抗ＲＳＰ抗体を用いて、基質上に捕捉される。その
後、基質上のＲＳＰの存在は、好ましくは下記のｔＲＮ
Ａプローブを用いて検出される。別に、発明の他の好ま
しい形によれば、生物学上の流体中のＲＳＰは、基質上
に捕捉されそしてｔＲＮＡプローブを用いて検出される
。

第１図に概略的に説明したように、ｔＲＮＡプローブは
、ＲＳＰ腫瘍マーカー上のアミノアシル転移ＲＮ　Ａシ
ンテターゼ反応性部位に特異的なｔＲＮＡよりなる。望
ましくは、ｔＲＮＡはホトビオチンによるように次の検
出にラベルされている。ｔＲＮＡプローブは、ＲＳＰ上
のアミノアシル転移ＲＮＡ５ｅ反応部位に付着する。ｔ
ＲＮＡを付けたＲＳＰの検出は、ホトビオチンをラベル
したｔＲＮＡへのストレプトアビジンの結合及びストレ
プトアビジンへのアルカリ性ホスファターゼの結合によ
り促進される。最後に、発色剤例えば５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテ
トラゾリウム反応混合物が、ｔＲＮＡプローブ上のアル
カリ性ホスファターゼと反応して、生物学上の流体中の
癌性の細胞により放出されるＲＳＰの量に相関する強度
を有する明確な色を発する。特に、このヒオチンースト
しブトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ系における
青／紫色の形成は、ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在の指標で
あり、それ故悪性腫瘍のそれである。定量的な測定は、
生成した色の強度により達成される。それ故、成る非悪
性腫瘍の細胞により観察される無視しうる程少ないＲＳ
Ｐの生成は、悪性腫瘍細胞により観察されるＲＳＰの生
成よりも数次のオーダーで少なく、そして無視しろるＲ
ＳＰの生成と顕著なそれとの間を区別するのに、肉眼に
よる比色の強度の比較によって、殆と難しいことはない
。そこに説明されたプローブのｔＲＮＡ成分がｒｓｐＡ
ｂにより置換されることを除いて、ｒＳｐＡｂプローブ
がここに記載されたｔＲＮＡプローブを全く同しやり方
で形成されそして第１図におけるように概略的に説明で
きることは注目に値する。

望ましくは、ＲＳＰ腫瘍マーカーは、好ましくはｒｓｐ
Ａｂを用いて、生物学上の流体から捕捉され、そして第
１図に示されるように、ｔＲＮＡ−ホトビオチン−スト
レプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼプローブと
、発明の好ましい態様において、腫瘍マーカーとを反応
させることにより次に可視色を発色するために、適切な
二次分子によりラベルされ結合される。しかし、他の態
様では、ｔＲＮＡプローブは、腫瘍マーカーとｔＲＮＡ
−ホトビオチン−ストレプトアビジン−アルカリ性ホス
ファターゼプローブとを反応させることにより、ＲＳＰ
の検出並びに捕捉のためにｒｓｐＡｂの代わりに用いら
れる。ｒ　ｓ　ｐＡｂ又はｔＲＮＡが生物学上の流体か
らＲＳＰの捕捉のために用いられるにせよ、ｔＲＮＡプ
ローブが、Ｒ８Ｐの存在を検出するのに最も有効であり
そして好ましく利用される。従って、臨床上の環境にお
いて十分に病名の分かフた患者からの血清を含む盲検に
おいて、ｔＲＮＡプローブは、９７．３％の感度で７１
／７３癌血清を正確に同定し、そして８５．５％の特異
性で５３／６２非癌血清を正確に同定した。

基質上のＲＳＰの検出のためのｔＲＮＡプローブの使用
の一例は、ｔＲＮＡプローブが捕捉及び検出の両者に用
いられる発明の態様である。検査をうけている患者から
集められた血清サンプルを用いて、血清の一部を、ｔＲ
ＮＡによりその床及び／又は穴の表面に沿って被覆又は
予め処理された！Ｉ！Ｉ製されたミクロタイター穴内に
入れる。ｔＲＮＡとＲＳＰ上のアミノアシル転移ＲＮＡ
シンテターゼ反応性部位との間の親和性により、サンプ
ル中のすべてのＲＳＰは、穴のｔＲＮＡにより予備処理
された表面に付着するようになる。穴は、穴の表面に結
合したＲＳＰを除いて、穴からすへての血清サンプルを
洗うために、水又はホスフェートバッファー塩水（ＰＢ
Ｓ）ｐＨ７，４により数回洗浄される。第１図に示され
るようなｔＲＮＡ−ホトビオチン−ストレプトアビジン
−アルカリ性ホスタフアーゼの結合した分子よりなる、
本発明によるｔＲＮＡプローブを、成る量大に加え、穴
中でｔＲＮＡ分子は、穴中のＲＳＰ上の追加のアミノア
シル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位と反応し結合す
る。ｔＲＮＡプローブとＲＳＰとの間の反応直前及び直
後の穴の状態は、それぞれ第２及び３図に示される。第
２図は、ＲＳＰ反応性部位に付着直前の本発明による未
反応ｔＲＮＡプローブ及び穴の床上に予め被覆されたｔ
ＲＮＡへ結合したＲＳＰマーカーを示す。

第３図は、反応後のＲＳＰマーカーを説明しそしてＲＳ
Ｐ上の利用可能な反応部位に結合したｔＲＮＡプローブ
を示す。

ＲＳＰ受容体部位へのｔＲＮＡプローブの付着後、穴は
再び水又はＰＢＳにより洗浄されて穴から未反応プロー
ブを洗い去る。この際、それは、穴中に肉眼で指示しつ
る量のＲＳＰをもたらすためにのみ残る。これは、穴に
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＥＴ）
呈色反応混合物を加えることにより、ホトビオチン−ス
トレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ系で達成
される。穴内のＲＳＰの濃度に応して、呈色システムは
、無色く全くないか又は検出不可能な量のＲＳＰが生物
学的流体から捕捉されている）から非常に強い青／紫色
（顕著な量のＲＳＰが捕捉されている）までに及ぶ可視
の色の指標を生成するだろう。色の強度の定量的基準は
分光光度計により求められる。悪性腫瘍の存在を表わす
しきい値の色強度を明らかに示す数値をテスト実施者に
与えることにより、ＲＳＰ検出テストの結果を評価する
ことは比較的簡単である。

災胤拠■ 実験が行われて、（１）環状粒子がジヌクレオチド折り
たたみにより酵素を含む、即ちそれらが７ミノアシルｔ
ＲＮＡシンテターゼを含むことを確認し、モして（２）
基質、ｔＲＮＡが選択的にその受容体部位に結合してい
ることを確認した。　Ａｆｆｉｇｅｌ　Ｂｌｕｅ　（１
００〜２００メツシユ、Ｂ　１ｏＲａｄＬａｂｏｒａｔ
ｏｒ　ｉｅｓ、リッチモント、ＣＡ）を含む蛋白（基質
としてヌクレオチドを結合する酵素）中のジヌクレオチ
ド折りたたみに関するアフィニティカラムをＴｈｏｍｐ
ｓｏｎらの方法（Ｐｒｏｃｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　ＵＳＡ。

７２：６６９〜６７２．１９７５　）に従ってセットし
た。ＰＣ３、ヒト前立腺癌細胞の生長により調整されし
かもＲＳＰを含むことが知られている培地なカラムに通
し、そしてホスフェートバッファー塩水（ＰＢＳ）ｐＨ
７，２により溶離した。溶離流体の２ｍｌずつをＢｒａ
ｄｆｏｒｄ　（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、　？２：２４８゜１９７６）の方法を用い
て、それらの蛋白含量についてテストした。ジヌクレオ
チド折りたたみのないすべての蛋白を流れさせた後、１
　ｍｇ／ｗ＋ｌ　（４Ｘ　１０−２ｍＭ）のｔＲＮＡを
カラムに導入した。蛋白含量の顕著な増加が次の溶離画
分て記録され、それはｔＲＮＡがシンテターゼ分子中の
ジヌクレオチド折りたたみに優先して結合しそしてＡｆ
ｆｉｇｅｌ　ＢｌｕｅカラムからＲＳＰを解離させるこ
とを示した。この結果は、前述の両方の条件（ｔＲＮＡ
に関して親和性を示すジヌクレオチド折りたたみが存在
する）が存在しなければ、得られなかったであろう。

犬止例Ｎ 実験が行われて、Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ　（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ　Ｎｏｔｅｓ、　１９８８）　　の方法を用いて、
ホトビオチン及びストレプトアビジン−アルカリ性ホス
ファターゼによりラベルされたｔＲＮＡがミクロタイタ
ー穴の床に結合したＲＳＰと結合しそして大中の青／紫
色の変化として検出できることを立証した。

ｔＲＮＡにより穴の床の表面に沿って被覆された　１ｍ
ｍｕｌｏｎマイクロタイター穴（第２図参照）を、ＰＣ
３前立腺癌細胞により調整されしかもＡｍ１ｃｏｎ　ｃ
ｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　ｍ１ｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔ−
ｒａｔｏｒにより４倍に濃縮された培地１００ｍ１で満
たした。それ故、培地中のＲＳＰは、４倍に濃縮された
。３０分後、培地を除き、穴をホスフェートバッファー
塩水（ＰＢＳ）ｐ）１７．４により１０回洗浄した。ｔ
ＲＮＡとの反応によりＲＳＰはそれにより穴の床に付着
した。１０ミクロ１のホトビオチンをラベルしたｔＲＮ
Ａを処理穴に加え、一方ｔＲＮＡのないトリスバッファ
ーｐＨ７，４，１０ミクロｌをマイナスのコントロール
穴に加えた。室温で３０分後、穴をＰＢＳにより５回洗
った。この工程で、ｔＲＮＡはアミノアシル転移ＲＮＡ
５ｅ反応部位に付着しく第３図参照）、一方ｔＲＮＡな
してトリス処理穴では反応部位は未反応のままだった。

２５ミクロ１の０．１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンを
すべての穴に加えた。室温で３０分後、穴をＰＢＳによ
り１０回洗浄した。ストレプトアビジンはｔＲＮＡ上で
ホトビオチンと結合するが、ｔＲＮＡなしの穴からは流
された。

２５ミクロｌの０９１ｍｇ／ｍｌビオチン化アルカリ性
ホスファターゼをすべての穴に加えた。室温で３０分後
、穴をＰＢＳにより１０回洗浄した。この工程で、ビオ
チン−アルカリ性ホスファターゼ分子は、穴の床上てＲ
ＳＰに結合したホトビオチン化ｔＲＮＡ上のストレプト
アビジンに結合した。この工程はプローブを完成した（
第１図）。アルカリ性ホスファターゼは、ｔＲＮＡなし
の穴からは流された。

最後に、１００ミクロｌの５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート（ＢＣＩ　Ｐ）　／ニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）呈色反応混合物を各人に
加えた。色は４５〜６０分て発した。ｔＲＮＡにより処
理されたＲＳＰは強い青・紫色の反応を発したが、負の
コントロールは染色されないままであった。

この研究は、ＲＳＰがｔＲＮＡに関して特異的な反応性
部位を有し、さらに記述されたようにｔＲＮＡプローブ
がＲＳＰと結合しそれを正確に同定することを決定的に
立証している。それ自体、プローブは、ヒト及び動物の
悪性腫瘍を検出する独特な方法を提供する。

ＲＳＰを検出する他の望ましい方法は、前述したように
、ｒ　Ｓ　ｐＡｂを用いて体液からＲＳＰを捕捉するこ
とにより生ずる付着したＲＳＰ　：　ｒ　５ｐＡｂへ結
合した第二の抗ＲＳＰ抗体（ｒ　ｓ　ｐＡｂ２）の使用
による。この検出方法によれば、固体状の基質−ｒｓｐ
Ａｂ：ＲＳＰ：ｒｓｐＡｂ２サントウィッチが作られ、
そこてｒｓｐＡｂ２抗体はサンドウィッチされた分子を
凝集又は沈殿するのに用いられる。沈殿物はきれいなポ
リカーボネートフィルターにより濾去され、沈殿物の量
は、ＲＳＰをスパイクしたサンプルにより製作された標
準の色チャートに対する比較により測定されるか、又は
差反射分光計による測定によって定量される。有用な一
つの固体状基質は、血清中に存在するＲＳＰの量に応じ
て黒の色調の沈殿を生ずる着色した（黒）ラテックスビ
ーズである。この方法の実施の一つの例は、下記に示さ
れる。

ａ）　　ｒ　ｓ　ｐＡｂがカルボキシル化黒色ラテック
スビーズ（０）に結合する。例えは”Ｏ−ｒ　ｓ　ｐＡ
ｂ。

ｂ）Ｏ−ｒｓｐＡｂを一定時間ミクロ遠心分離管中でテ
スト血清と反応させ、次にビーズを血清から遠心分離に
より取り出す。ビーズを数回ＰＢＳ　（ホスフェートバ
ッファー塩水）により洗いそして各洗浄後ＰＢＳから遠
心分離する。得られた反応は次の通りである。

癌血清＝Ｏ−ｒ　ｓ　ｐＡｂ　：　ＲＳＰ非癌血清＝０
−ｒｓｐＡｂ Ｃ）　反応したビーズを次に一定時間ミクロ遠心分離管
て「５ｐＡｂ２と反応させ、次にビーズを反応混合物か
ら遠心分離し、未結合分子を前記のｂ）で記載したよう
に洗い流す。

生した反応は次の通りである。

癌血清＝０−ｒ　５ｐＡｂ：ＲＳＰ：ｒ　５ｐＡｂ２（
沈殿）非癌血清＝０−ｒｓｐＡｂ（沈殿なし）ｄ）　沈
殿をきれいなポリカーボネートフィルター膜により濾過
し、測定を行う。非沈殿ラテックスビーズは膜を流れ去
るが、沈殿したラテックスビーズ−抗体：　ＲＳＰ　：
抗体凝集物はそうてはない。それ故、ビーズは沈殿から
非常に容易に分離できる。

前述の方法及びシステムは着色したラテックスビーズを
利用するが、着色した沈殿、蛍光沈殿又は放射能沈殿も
、又適切な分子（例えば任意の強く着色した粒子例えば
ホルマザン、炭素など：蛍光分子例えばローダミン、テ
キサスレッド、エチジウムプロミド、フルオレシンなど
：そしてアイソトープ例えば１２５１．３）１．１４Ｃ
など）によりｒ　５ｐＡｂ２をラベルすることにより利
用できることは分かるだろう。前述の方法及びシステム
の他の変法では、ｒ　５ｐＡｂは固体状の基質に結合さ
れる必要はなく、ｒｓｐＡｂ：ＲＳＰ：ｒｓｐＡｂ２又
は単にｒ　５ｐＡｂ　：　ＲＳＰ反応分子は、抗ｒ　５
ｐＡｂ抗体により血清から沈殿する。前述の指標システ
ムは何れも抗体の任意の一つであってもよい。それら以
外は、洗浄、濾過及び定量法は前述と同じであろう。

ＲＳＰの生化学的性質のすべては、まだ解かれていない
が、ＲＳＰを構成しているセグメントのそれぞれが特異
的アミノｔＲＮＡニアミノ酸の鞘合わせについてアミノ
アシルｔＲＮＡｓｅ活性を有することが予憇される。そ
れ故、任意のｔＲＮＡ又はｔＲＮＡの任意の絹合わせか
、本発明のプローブに作られるのに用いられる。その上
、同−又は異なるｔＲＮＡがプローブ中そして反応容器
のｔＲＮＡ予備処理表面に用いられる。その上、プロー
ブがビオチン−ストレプトアビジン−アルカリ性ホスフ
ェート呈色システム以外の普通に用いられている検出シ
ステムにより容易に作られることは明らかである。例え
ば、ｔＲＮＡは、蛍光マーカー例えばフルオレセイン、
ローダミン、テキサスレッド、エチジウムプロミド、ア
クリジン染料などと結合し、蛍光分光光度計、蛍光顕微
鏡又は紫外線分光光度計により読みとられる。ｔＲＮＡ
は、又任意の放射性アイソトープと結合しそして用いた
アイソトープに応してベータ又はガンマカウンターによ
り又はオートラジオグラフィにより検出てきる。その上
、発色が反応容器の液相て生ずる記述したシステムが最
大の感度をもたらすが、ＲＳＰ−１ＲＮＡプローブ検出
システムは、又固体の基質構造例えば膜、ガラス、種々
の重合体表面、ラテックスビーズ及び赤血球（凝集テス
ト）さらに金属例えばコロイド状金又は他の酵素系例え
ば酸ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ及びウレアーゼに基づくシス
テムに適合できる。

工棗！〇応■立 本発明の方法及びプローブは、早期の癌検出のための広
範囲のスクリーニング、治療をうけている癌患者のため
の簡単なモニタリングシステム及び環境及び工業上の発
癌物質なスクリーニングする非常に改善された方法をも
たらすのに広く適用できる。恐らく、最も顕著なのは、
日常的な身体検査中又は照剖或いは化学療法後の癌患者
の治療中の人々の体液中のＲＳＰの検出のための早い、
敏感な、信頼てきしかも安価なシステムを医者に提供す
るテストキットにＲＳＰプローブを組立てるために方法
を利用する能力である。もし正のテスト結果が見掛は上
健康な人に存在するならば、テストの操返しがなされな
けれはならないたろう。第二のテストがＲＳＰの存在を
立証するならば、別のテスト（例えばＮＭＲイメージン
グ）が行われて体内の腫瘍の位置を調べ同定するだろう
。

この点て、治療のやり方が助言されて、悪性腫瘍１ｍを
除くか又は破壊しそしてＲＳＰは治療の成功をモニター
するのに用いられよう。

μ１者の体内のすへての場所における発癌活性の簡単な
、容易に用いられる生体内の診断テストの有用性は、癌
性の活性の早期の検出及び癌治療の正確なモニタリング
を可能にすることが予想される。年４回テストされねば
ならない癌の病歴を有する少なくとも５百万の人々が存
在しさらに毎年数百刃の新しく診断されしかも進行中の
患者が増えていることを考えると、早くしかも有効な診
断テストの必要性の大きさが明らかになってきている。

さらに、現在の不愉快なしかもしばしば苦痛をともなう
Ｉ’Ｐａｐ、、＋スメアテストの代わりの生物学的流体
テストの有用性は、少なくとも毎年のヘースてＲＳＰテ
ストを、現在いやがる女性にうけさせるようにすること
が可能に思われ、それは従ってこのようなテストの必要
性及び有用性をさらに立証している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、概略的なやり方で、ＲＳＰアミノアシルｔＲ
ＮＡシンテターゼ受容体部位及びその部位に特異的なＲ
ＳＰプローブの一つの形を示す。 第２図は、概略的なやり方で、ＲＳＰ上の利用可能なア
ミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ受容体部位へのｔＲＮ
Ａプローブの付着直前のｔＲＮＡ前処理表面を経て反応
容器に結合したＲＳＰを示す。 第３図は、概略的なやり方で、その受容体部位てｔＲＮ
Ａプローブとの反応後の第２図のＲＳＰを示す。 手 続 補 正 書 平成２年９月２６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物学的流体中の環状粒子（ＲＳＰ）腫瘍マーカ
   ーの存在を検出する方法において、 （ａ）該流体中のＲＳＰ腫瘍マーカーを基質に捕捉する
   工程；そして （ｂ）該基質上のＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出する
   工程よりなる方法。 （２）ヒト又は動物の悪性腫瘍の存在を検出する方法に
   おいて、（ａ）悪性腫瘍の存在について検査するために
   ヒト又は動物から体液のサンプルを得る工程； （ｂ）該流体中の環状粒子（ＲＳＰ）腫瘍マーカーを基
   質に捕捉する工程；そして （ｃ）該基質上のＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出する
   工程よりなる方法。 （３）該流体中のＲＳＰ腫瘍マーカーを捕捉する前記の
   工程が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ア
   フィニティ精製抗体及びこれらの混合物よりなる群から
   選ばれた抗ＲＳＰ抗体（ｒｓｐＡｂ）を該ＲＳＰに付着
   させることよりなる請求項１又は２記載の方法。 （４）該流体中のＲＳＰ腫瘍マーカーを捕捉する前記の
   工程が、少なくとも１種のマグネシウムイオン及びアデ
   ノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の不存在下、該マー
   カーのアミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位
   に特異的な転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）を付着することよ
   りなる請求項１又は２記載の方法。 （５）ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出する該工程が、
   ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在の指標として可視色を発色す
   ることよりなる請求項３又は４記載の方法。 （６）該可視色を発色するために、ＲＳＰ腫瘍マーカー
   に少なくとも１種の色反応性分子を直接又は間接に結合
   する工程を含む請求項５記載の方法。 （７）ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出する該工程が、
   少なくとも１種のマグネシウムイオン及びアデノシント
   リホスフェート（ＡＴＰ）の不存在下、該マーカーのア
   ミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位に特異的
   な転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）を付着し、そしてＲＳＰ腫
   瘍マーカーの存在の指標としてｔＲＮＡの存在を検出す
   ることよりなる請求項３記載の方法。 （８）該ｔＲＮＡが、ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在の指標
   として可視色を発色させるためにそれと会合した少なく
   とも１種の色反応性二次分子を有する請求項４又は７記
   載の方法。（９）ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を指示する
   特有の色を形成するための該色反応性二次分子と発色剤
   とを反応させる工程を含む請求項８記載の方法。 （１０）該ｔＲＮＡが、ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在の指
   標として可視色を発色するためにｔＲＮＡを含むｔＲＮ
   Ａプローブ及び少なくとも１種の反応性二次分子と該マ
   ーカーとを反応させることにより該マーカーに付着して
   いる請求項８記載の方法。 （１１）該ｔＲＮＡプローブが、結合した分子ｔＲＮＡ
   −ホトビオチン−ストレブタビジン−アルカリ性ホスフ
   ァターゼよりなる請求項１０記載の方法。 （１２）ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を指示する特有な青
   ／紫色を形成するための該ＲＳＰ付着ｔＲＮＡプローブ
   と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
   ト／ニトロブルーテトラゾリウム反応混合物とを反応さ
   せる工程を含む請求項１１記載の方法。 （１３）ＲＳＰ腫瘍マーカーの存在を検出する該工程が
   、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニ
   ティ精製抗体及びこれらの混合物よりなる群から選択さ
   れる第二の抗ＲＳＰ抗体（ｒｓｐＡｂ＾２）をＲＳＰ；
   ｒｓｐＡｂ分子に結合させることよりなる請求項３記載
   の方法。 （１４）ＲＳＰ腫瘍マーカーに選択的に結合して生物学
   上の流体中のその存在の検出を容易にし、該腫瘍マーカ
   ーと付着又は会合するように適合された第一のプローブ
   要素及び前記の第一のプローブ要素に結合したプローブ
   マーカーよりなり、該プローブマーカーの存在がＲＳＰ
   腫瘍マーカーの存在の指標として検出されるように適合
   されたプローブ。 （１５）前記の第一のプローブ要素が、モノクローナル
   抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体及び
   これらの混合物よりなる群から選択された抗ＲＳＰ抗体
   よりなる請求項１４記載のプローブ。 （１６）前記の第一のプローブ要素が、該マーカーのア
   ミノアシル転移ＲＮＡシンテターゼ反応性部位に特異的
   なｔＲＮＡよりなる請求項１４記載のプローブ。 （１７）前記の第一のプローブ要素が、ＲＳＰ腫瘍マー
   カーの存在の指標として可視色を発色するように適合さ
   れた少なくとも１種の色反応性二次分子に直接又は間接
   に結合する請求項１４、１５又は１６の何れか一つの項
   記載のプローブ。 （１８）該プローブマーカーが、結合した分子ｔＲＮＡ
   −ホトビオチン−ストレブタビジン−アルカリ性ホスフ
   ァターゼよりなる請求項１７記載のプローブ。 （１９）前記の第一のプローブ要素が、ＲＳＰ腫瘍マー
   カーの存在の指標として蛍光を発色するように適合され
   た二次分子に直接又は間接に結合する請求項１４、１５
   又は１６の何れか一つの項記載のプローブ。 （２０）前記の第一のプローブ要素が、ＲＳＰ腫瘍マー
   カーの存在を指示する放射性アイソトープと直接又は間
   接に結合する請求項１４、１５又は１６の何れか一つの
   項記載のプローブ。