JPH07503323A - 選択的なマーカーとしてアルストニンを用いる細胞診断方法及び前記のマーカーを含有する診断キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 選択的なマーカーとしてアルストニノを用いる細胞診断方法及び前記のマーカー を含有する診断キット本発明は細胞診断技術に関する。更に詳しく言えば不発明 は螢光による選択的な検出方法を用いて、特に腫瘍診断の確立のためにアルスト ニンによる腫瘍の検出及び染色体異常の検出に関する、 本明細誓の記載においては、用語”細胞診断”（ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ 　）は腫瘍疾病の診断と細胞遺伝学との両方を包含すると理解される。

アルストニンはローウオルフイア（Ｒａｕｗｏ　１　ｆ　ｉａ　）ｖｏｍｉｔｏ ｒｉａ、　Ｒａｕｗｏｌｆｉａ　ｏｂｓｃｕｒａ及びＶｉｎｃａ　ｒｏｓｅａ並 びに他のキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙａｎａｃｅａ　）から抽出したアルカロ イドである。アルストニンは第４級β−カルボリンの群に為する。このアルカロ イドの抽出方法はＭ、　Ｂｅ１ｊａｎｓｋｉ及びＪ、　Ｂｕｇｉｅｌによって文 献ＦＲ−Ａ−７８３０６６３及びＥＰ−Ａ−００５９８１７に記載されておシ、 その内容は本明細書の一部を成すものとして参照される。

このアルカロイドは、分光光度法での分析によるとそれぞれ２５２及び３０８ｎ ｍで２つの吸収最大値に対応するきわめて鮮明な淡青色の螢光を肩することがま た示され、これらの螢光はアルストニン及びその異性体であるセルば／チンの特 性である。

アルストニンはマウスＹＣ８１Ｊンパ＆［永住細胞、マイスにおけるアーリッヒ （Ｅｈｒｌｉｃｈ）　”腹水症”腫瘍細胞、型式ＫＢ、　ＨＥＬＡ、　ＨＥＰ　 Ｉ　Ｉ及びしガン細胞培養物及び腎臓芽腫、神経芽腫又は奇形種（その全てはヒ トの腫瘍である）から生ずる細胞について、今般十分に立証されている、抗ガン 特性を初代培養で有することが、特に前記の文献でまた示されており、アルスト ニンは初代培養を２４〜４８時間以内に完全に破壊することが見出された。比較 として、この点に関してアル２）二ンの作用の選択性をしつかシと確立するため に、アルストニンの同じ投与量（培養物の１−当り２００　ｍｃｇ　）をサルの 腎臓細胞の初代培養に又はＶｅｒｏ又はＣ１ｒｃ　−型の細胞系に施用した；こ れらの場合には８日以内には細胞の破壊は生じなかった。これはアルストニンと 腫瘍細胞のＤＮＡとの特異的な相互作用を証明しており、然るに正常な細胞のＤ ＮＡはこのアルカロイドによって影響を受けなかった。

然しなから、か＼るアルカロイドを用いて抗腫瘍処置を良好に調節すること及び ／又は手術前、手術中及び手術後の段階で患者の状態の信頼し得る診断を確立す ることは尚困難であった。

それ故ガン病巣の診断及び転移の診断を促進させ且つそれらの処置を向上させる ために腫瘍疾病を評価する手段が必要とされていた。

試験管内又は生体内への応用に適当であるように処方した組成物中に適当な濃度 で用いたアルストニンそれ自体は、その培養反応（インキュベーション）後にそ の生物発光を適当に検出することにより、腫瘍の所在位置とその大きさの推定と の両方に関して腫瘍疾病を選択的に診断し得ることが、今般予期せぬ程に見出さ れた。同様なアルストニン組成物は細胞遺伝学（ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　） にも有用であることも見出された。

実際上、アルストニンは４４６　ｎｍの波長で軸対称となる螢光スはクトルを有 することが見出され、然るにその螢光励起スはクトルと吸収スはクトルとの両方 はそれぞれ２５２　ｎｍ、３１０　ｎｍ及び３７５ｎｍの波長に対応する３つの 最大値を有した。

それ数本発明は先ず、約３７５ｎｍでの螢光を測定することにより腫瘍細胞及び ／又は染色体異常を検出するために腫瘍細胞及び／又は染色体異常の選択的マー カー（標識）として用いるアルストニン組成物に関する。

本発明はまた騰遥疾病及び／又は染色体異常の選択的な検出に意図した細胞診断 剤を製造するのにアルストニン組成物の使用に関する。

本発明は更に、適当な量のか＼る製梁組成物を選択的に固定し且つ培養反応した 後に、約３７５ｎｒｎで発光するウッドランプでの賦活化により検出される選択 的な螢光によりあるいは約３７５ｎｍでの螢光顕微鏡での検出により腫瘍細胞を 検出することからなる、腫瘍の評価方法及び／又は１瘍疾病及び染色体異常の診 断に有用な細胞遺伝方法に関する。

本発明の別の目的は適当な医薬形（ｇａｌｅｎｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　）でアルス トニンを含有する組成物を特に包含してなる、腫瘍疾病及び／又は染色体異常の 診断を容易とさせるキット（ｋｉｔ）である。

実際に、２６０　、３　ｔｏ及び３７５ｎｍの３糧の波長で励起されたアルスト ニノの５ＸＩＯ−’Ｍ浴溶液、１つの最大値を別の最大値と区別させる定量的な 収率（ｑｕａｎｔｕｍｙｉｅｌｄ　）で可視領域（４４６ｎｍ）で螢光を生ずる ことが確立された。最強の発光は３１０ｎｍで最大値に対応する。

ＵＶ吸収スはクトルはそれぞれ約２６０．３１０及び３２０ｎｍで３つの吸収バ ンドを示した。

発光した強度と励起強度との比率を測定する定量的な収率はこれらの効率に応じ てこれらの最大値を分類できる。最大の効率は３ｔＯｎｍでの励起で得られ；定 に的収率は低いが３７５ｎｍでも尚きわめて同様であり；対照的に２６０ｎｍで の放射ではきわめて低い。

然しなから光ファイバー（ｏｐｔｉｃａｌ　ｆｉｂｅｒ　）によって示された通 常の光奴収特性の故に、内視鏡と共に用いるのに２６０ｎｍで螢光の励起の利用 を想定することはできなかった。同様に、３１０ｎｍの波長使用を意図すること はできなかった。何故ならば、螢光検出装置で用いたガラスは３６０ｎｍを越え てのみ透明であるからである。それ故、螢光による検出のか＼る応用を意図し得 たのは３７５ｎｍでの有効な励起波長の存在を観察した後である。

更には、一定の励起強度では、螢光の強度とアルストニン濃度との間には直線的 な関係が存在することもｈｙされた。この関係はアルストニノの検出に十分なア ルストニン濃度範囲で但し健全な細胞に関してアルストニン生成物の毒性の危険 を最低とするように十分に低い濃度で特に真実であると見出された。

本発明を、添附図面を参照しながらより詳細に以下に記載する。

第り図はアルストニンの励起スズクトル及び発光スＲクトルを示す： 第２図はアルストニンの吸収スはクトルを示す；第３Ａ図はアルストニン濃度の 関数として螢光強度の変化を示し； 第３Ｂ図及び第３Ｃ図はこの変化が１０　〜【０　のアルストニン濃度ｍＦＢ３ で直線的であることを示す記入図である： 第４Ａ図〜第４Ｄ図は螢光画像分析器により行なった、２つの細胞分布ＳＫＯ及 びＳｒ１において化合物により培養反応したアルストニンの成る物理−化学パラ メーターの分析結果を示し； ４５Ａ図〜第５Ｃ図は、溶離液としてｌｏｍＭ　トＩＪス−ＨＣ１緩衝剤、ｐＨ ７，５を用いてセフアデンクスゲルクロマトグラフイーの結果を示す図表である 。

即ち、前述した如く、アルストニンの螢光スズクトルは４４６ｎｍの波長で軸対 称となり（第１図）、然るに螢光励起スはクトル（第１図）及び吸収スはクトル （第２図）はそれぞれ２５２　ｎｍ、　３１０　ｎｍ及び３７５ｎｍの波長に対 応する３つの最大値を示すことが見出された。

第３Ａ図〜第３Ｃ図に示した結果によシ示される如く、一定の励起強度では、ア ルストニンの螢光強度及びこのアルカロイドの濃度は分光螢光法で通常用いる装 置により検出するのに適当なアルストニノ濃度範囲で直線的な関係である。

更には、セファデックスゲルカラム上のクロマトグラフィーによって行なった研 究（第５Ａ図〜第５Ｃ図）が示す所によれば、正常な細胞から単離した二本鎖Ｄ ＮＡ又は一本ＱＤＮＡとアルストニンとの間には相互作用はない。これらの結果 は、アルストニンが腫瘍ＤＮＡとその相互作用により腫瘍細胞においてのみ蓄積 することを明記する、アルストニンについての文献と合致している〔この主題に ついては特にＭ、Ｂｅ１ｊａｎｓｋｉ及びＭ、Ｓ、Ｂｅ１ｊａｎｓｋｉのＥｘｐ 、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ　ＡＧ。

Ｂａ５ｅｌ、　Ｐｕｂ、　５０ニア　９−８７　（１９８２）及びＢｅｌ　ｊａ ｎｓｋｉ及びＭ、Ｓ、　Ｂｅ１ｊａｎｓｋｉ、　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、　Ｓ、　Ｋ ａｒｇｅｒ　ＡＧ、　Ｂａ５ｅｌ、　Ｐｕｂ。

４３：１９〜２３０　（１９８６）を参照されたい〕。

正常な細胞（Ｓｒ１）と膿瘍細胞（ＳＫＯ）との両方の生の細胞培養物について 行なったアルストニン蓄積研究に関して、該研究は、アルストニン生成物の存在 下に約２０分又はそれ以上培養反応した後にはサンバ（Ｓａｍｂａ）　２０００ 画像分析器で行なった螢光研究がＳＫＯ細胞でのみ大きな蓄積を検出することを 示す（＆４　Ａ図〜第４Ｄ図）。

本発明の手段及び方法を実施するには、試験管内の応用では２０−の水当り約０ ．２〜５グの濃度で即ち約１〜２５重量／容量チの濃度で水溶液中のアルストニ ンを用いるのが推奨される。

試験管内試験で主として使用し得る診断キットを製造するには、原料としてアル ストニンの精製済み飽和水溶液を使用し、且つ実際上約５〜【０重量／容量チの 範囲にある有用な濃度で分析するためにはこの水溶液の純水での希釈液を製造す るのが推奨される、生体内では、適当な慣用の製薬担体又は支持体及び場合によ っては賦形剤を含有してなる適当な医薬製剤でアルストニンを投与するのが実際 上推奨され、錠剤又はゼラチンカプセルの如き製剤は単位投薬当り約３〜５００ ■のアルストニンを含有するのが有利であり、投与は生体内の診断探求の１日前 に１日３回（ｔ、　ｔ、ｄ、）経口方式によって行なう。

培養反応（インキュベーション）は室温で約２０〜４０分の期間に亘って行なう のが有利である。

試験管内用途では、この培養反応段階が完了したからには、被検物（ｓｐｅｃｉ ｍｅｎ　）をアルコール好ましくはメタノールでゆすぎ、読み取りを螢光顕微鏡 で行なう。

特に手術前、手術中及び／又は手術後の診断では且つ別の検量の確認に皮膚病の 診断では、本発明の手段及び診断剤の臨床用途には、ウッドのランプの励起下で の螢光を検出するのが推奨される。ウッドのランプ下でのこの生物発光は、特に 内視鏡探求の場合に光ファイバーによって直接照明により又は伝達により何れか で利用される。

変更例として、本発明のアルストニノ組成物は、切断、修飾及び／又は組換えの 染色体レベルでの検出により特に異常な染色体同定の研究で、細胞遺伝学で有利 に使用し得る。実際上、遺伝病に特有な染色体異常のこの同定は、染色体異常に 伴ない耳つ本発明の技術によって検出される１つ又はそれ以上の染色体の特異的 な発光によって行なう。

【例として、本発明のアルストニン組成物に基づいた且つ適当な生物学的試験記 録誉によシ行なった診断固体腫瘍又は悪性の血友病との間の関連の細胞遺伝的な 確認が提供された。

女性の被検者の場合には、核型は次いで染色体Ｘの欠損だけ４５×０となる； 男性の被検者の場合には、核型は次いで染色体Ｙの欠損だけ４５×０となる。

これらの挙例を調節する細胞遺伝作用の機構はかくして示差的な着色及びリンパ 球培養物の研究によって定性的に且つ定量的に評価でき、これによって架橋及び 切断及び組み候えを証明することができる。

前記の記載及び次の実施例は特定のアルカロイドとしてアルストニンを記載する けれども、このアルカロイドは当該使用に何れかの均等な技術物によって特にそ の異性体セルズンチンによって完全に又は部分的に置換されるならば匹敵し得る 結果が得られることは当業者には容易に見られるであろう。

生物学的な被検物に基づいた診断に用いる実施例実施例１ 種々の生物学的被検物に、ｌ−当り約２００μ２のアルストニンを含有するアル ストニンの水溶液を含浸させ、これらの被検物（ｓｐｅｃｉｍｅｎ　）を２０〜 ４０分間培養反応させ次いでウッドランプ顕微鏡下での顕微鏡検量にかけた。

スライドガラス上の子宮頸管被検物の塗抹（ｓｍｅａｒ）をこの要領で処理且つ 検量し、細胞成分のガン性はウッドランプ顕微鏡下で見出された生物発光によっ て証明された。

実施例２ 実施例１に記載した方法を、スライドガラス上の骨髄塗抹に応用した。

ウッドランプ顕微鏡下で観察した生物発光は細胞成分のガン性を示した。

実施例３ 遠心分隨し且つ次いでスライドガラス上に延展した胃の被検物について実施例１ の如く処理すると、腫瘍細胞の存在は、本発明の選択的方法によって検出された スライドガラス上の塗抹の生物発光によって証明さスライドガラス上に延展した 膀胱の被検物について実施例」の如く処理すると、腫瘍細胞の存在は、本発明の 選択的方法によって検出されたスライドガラスの塗抹の生物発光によって証明さ れた。

本発明の手段及び方法はまた遺伝性疾病に関連した染色体異常の試験管内での細 胞遺伝検出に有用でアリ、この検出は切断、修飾又は組み換えに伴なう１つ又は それ以上の染色体の特異的な発光バンドの同定によって行なうものである。

臨床用途の実施例 実施例５ 診断探求する前日に、前述の如く調製した２５０■のアルストニンを含有する１ 個のゼラチンカプセルを、卵巣又は膀胱の腫瘍が研究され且つ鑑定されている患 者に、その日の間中多少とも等間隔で１日３回経０投与した。ウッドランプによ り発生したＵＶ励起放射を内視鏡に通して伝達しながら、カプセルの投与に続い ての日に行なった内視鏡検査によって、新生腫瘍の検出がこの方法により容易で ちることを確認し得た。ガン性腫瘍についての示差的な診断が生検及び病理解剖 検査により確認されたことも確立された。

実施例６ 実施例５に示した方法に応じて、ウエパー−クリスチャン（Ｗｅｂｅｒ−Ｃｈｒ ｉｓｔｉａｎ　）型の膵臓外脈管炎を発現しなから膵炎の診断を、１０年間休体 経過を示す患者Ｍｒ、Ａ、Ｇに行なった。この様にして、硬着（ｃｏｎｓｏｌｉ −ｄａｔｉｏｎ）が実際上これらの１０年後に生起したことを有意に証明した。

実施例７ 実施例５に示した方法に応じて、メルケル（Ｍｅｒｋｅｌ）腫瘍の診断を７４才 の女性で確認しだ：この診断はＡＰＵＤ型の神経内分泌ガン腫腫瘍を切除して組 織的分析によって確認された。

実施例８ 実施例５に示した方法に応じて、全身性急、晴癖が若いＳ、Ｌ、（８才）でＵＶ 下で検出された；この様にして低能なしに肥大した角化症の存在が認められた。

本発明の研究を次後に反復すると、顔面、下肢及び上肢の間化によって反映され る如く、処置から得られる改良が確認されたが、頭皮、腹部、胸及び背中には魚 鱗客が存続しているものでちる。

実施例９ 実施例５に記載された方法を用いて、右前頭基底細胞の形成に対して発現させな がら老人型顔面上皮腫症を、患者について分析し且つ定位させた。本発明の研究 を適当な間隔で反復すると、基底細胞生成及びその搬機化の充填まで、投与した 処置剤の効果を追跡した。

実施例」０ セサ！ｊ　（５ｅｓａｒｙ　）病の型式の皮膚リンパ腫を呈する患者Ｍｒ、Ｃ， Ｙに実施例５記載の方法を使用した。実施例１に示した条件下でアルストニンを 投与した後にＵＶ探求中に、この患者は部面症の顔面のリンパ様浸潤並びに真皮 炎の帯域及び顔面と口唇の白兵形成（１ｅｕｋｏｄｙｓｐｌａｓｉａ　）の偽斑 を呈した。

実施例【」 実施例５に記載したのと同じ方法を施した患者Ｍｒ。

Ｄ、Ｆ、においては、ＵＶ下でのアルストニノの標識作用は、ＵＶ下でのこの観 察を行なう５年前の時点でその処置に失敗した後には再発性線維肉腫の存在を示 した。

ＵＶ下にアルストニノでの処置を監視すると搬機の発光消失を示し、これは腫瘍 部位での正常組織の回復を証明した、 実施例１２ 実施例５に記載した方法を用いて、直腸Ｓ状結腸の腺ガンの存在は患者Ｍｒ、Ｋ においてアルストニノの螢光によって確認され且つ注視され、この患者における 診断Ｌ、特に段階Ｉの増殖性腺ガン病巣の存在を示す再発性、絨毛性病巣を切除 した解剖病理研究によって確認された。

実施例［３ 実施例５の方法を用いてしかも胃の小彎曲及び腹腔のリンパ節鎖での新生塊の存 在により患者Ｍｒ、Ａ、Ｊにおける全体の胃切除後に、外科被検物の生物発光に よって小竪型［ｓｉｃ］彎曲の新生潰瘍化の部位に対応する過発光バンドのトポ ロジーを確立することができた。

実施例１４ 実施例５に記載した如く処理して、超音波探求後に開腹術を次後に受けた患者Ｍ ｒｓ、Ｅ、Ｙ、は開屓後のアルストニンの生物発光に応じて、１つの卵巣に亘っ て強度の発光の存在を示し、且つ患者は実除上−次胸腫瘍の転移増殖を受けるこ とが証明された。

実施例」５ 実施例５の如く処理して、患者Ｍｒ、Ｇ、Ｍ、は鼻翼の有鯨細胞腫瘍について接 触コバルト治療によって処置された。アルストニンの生物発光によって対向部位 にお灯る異形酸鼻軌道変性の再発（リコシエー効果）を証明することができた。

主としてセルはンチンを用いて、同等の螢光特性を有する他のβ−カルボリンに ついて行なった匹敵しうる試験では、同様な結果を生成し、かくして本発明の範 囲内でアルストニンと同等な技術を栴成する。

本発明の手段はかくして１，１瘍疾病及び細胞遺伝学を評価することからなる、 細胞診断に顕著に有用である。生体内では、本発明の手段は、今まで決して達成 されなかった精確さ及び容易さで手術前の段階において腫瘍の所在をつきとめる ことができ；手術中の段階では螢光に応じてガン性の病巣及び転移を研究するこ とができ、手術後の段階では、慣用法を用いて抗ガン処理又は化学療法後に転移 が出現するか又は進行するかどうかを光フアイバー内視鏡で確認することができ る。

分光蛍光９１の１５号（ミリボルト） 波　長（ｎｍ） 表　面　標準偏差 表　面　ＩＦ平　均 ＩＦ＝蛍光の強度 ＦＩＧ、Ｉ＋ 手続補正書 平成６年４　Ｊｌ　６　ｒ、］

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．約３７５ｎｍでの螢光を測定することにより腫瘍細胞及び／又は染色体異常 を検出する際に腫瘍細胞及び／又は染色体異常の選択的なマーカーとして用いる アルストニン組成物。
2. ２．水２０ｍｌ当り約０．２〜５ｍｇの濃度で即ち約１〜２５重量／容量％の濃 度でアルストニンを水溶液中に含有してなることを特徴とする、請求の範囲１記 載の組成物。
3. ３．約５〜１０重量／容量％の範囲にある有用な濃度に使用時に希釈すべきアル ストニンの精製済み飽和水溶液よりなることを特徴とする、請求の範囲１記載の 組成物。
4. ４．単位投薬量当り約３〜５００ｍｇのアルストニン並びに慣用の製薬支持体又 は担体及び通常の賦形剤を好ましくは含有する錠剤又はゼラチンカプセルの形で あることを特徴とする、請求の範囲１記載の組成物。
5. ５．アルストニンを補完するか又はアルストニンの代りに用いるセルペチンを含 有することを特徴とする、請求の範囲１〜４の何れかに記載の組成物。
6. ６．腫瘍疾病の選択的な検出に意図した細胞診断剤を製造するために請求の範囲 １〜５の何れかに記載のアルストニン組成物の使用。
7. ７．遺伝性の疾病に関連する染色体異常を試験管内で検出するために請求の範囲 １〜５の何れかに記載のアルストニン組成物の使用。
8. ８．適当な量の請求の範囲２〜５の何れかに記載の製薬組成物を選択的に固定し 且つ培養反応した後に、約３７５ｎｍで発光するウッド（Ｗｏｏｄ）のランプで の賦活化により検出される選択的な螢光によりあるいは約３７５ｎｍでの螢光顕 微鏡での検出により腫瘍細胞を検出することからなることを特徴とする、腫瘍疾 病及び染色体異常の診断に有用な、腫瘍及び／又は細胞遺伝学の評価方法。
9. ９．試験管内での評価のため、試料に１ｍｌ当り約２００ｍｇのアルストニンを 含有する水溶液を含有させ且つ室温で２０〜４０分間培養反応することにあるこ とを特徴とする、請求の範囲８記載の方法。
10. １０．検出はウツドのランプ又は螢光顕微鏡により行なうことを特徴とする、請 求の範囲９記載の方法。
11. １１．請求の範囲１〜５の何れかに記載のアルストニン含有組成物よりなること を特徴とする、腫瘍疾病及び／又は染色体異常の診断を促進させるキツト。