KR20210054280A

KR20210054280A - 이중 인식 이광자 형광 프로브 및 이의 용도

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Publication number: KR20210054280A
Application number: KR1020190140221A
Authority: KR
Inventors: 김환명; 이효원
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2021-05-13
Also published as: KR102273736B1

Abstract

본 발명은 종양 특이적 이중 인식 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 D-글루코사민 및 β-D-갈락토피라노사이드를 이중 인식 부위로 결합시킨 이광자 형광 프로브는 암세포에 과발현된 포도당 수용체를 통하여 암세포에 선택적으로 흡수될 수 있으며, 암세포 내에 비정상적으로 상향조절된 β-갈락토시다아제(β-gal) 가수분해 효소활성을 통하여 형광 발색 및 색 변화를 나타내고, 상기 이광자 형광 프로브의 색 변화 비율 및 발색 강도를 통하여 암질환의 진단 및 암질환의 진행단계의 확인이 가능함에 따라, 본 발명의 이중 인식 이광자 형광 프로브는 암질환 치료에 있어서 정확하고 효과적인 암질환 진단 정보를 제공할 수 있다.

Description

이중 인식 이광자 형광 프로브 및 이의 용도{Dual recognition two-photon fluorescent probe and uses thereof}

본 발명은 종양 특이적 이중 인식 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단 방법에 관한 것이다.

대장암은 병리학적으로 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높으며, 최근에는 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발병률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있다.

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사, 분변 잠혈검사 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용가능한 가장 조기 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정이 수행되고 있다.

그러나, 분변혈이 검출되기 전까지 전형적으로는 상당한 종양 크기가 존재해야한다. 잠혈 기준의 분변 검사의 감수성은 26%로 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않은 채로 있게 됨을 의미한다. 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있는 문제점이 있다. 또한, 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다.

암세포는 일반적으로 포도당 수송체(glucose transporters, GLUTs)의 상향 조절로 인해 포도당 섭취속도가 높아져 높은 당분해 속도를 나타내며 더 많은 에너지를 생산한다. 이러한 암세포의 포도당 흡수를 모니터링하기 위해 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로글루코오스(¹⁸F-FDG)와 같은 방사선 추적 물질을 이용한 양전자 방출 단층촬영(PET)이 수행되고 있나 이러한 방법들은 해상도 측면에서 공간적 및 시간적 제약이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 대안으로 단일세포 및 실시간 관찰용 형광성 추적자로서 2-데옥시-2-[(7-니트로-2,1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]-D-글루코오스 (2-NBDG)의 발견 이래로 포도당 흡수를 확인하기 위한 다양한 소분자가 개발되었다.

이러한 프로브의 대부분은 빠른 속도의 GLUT-특이적 흡수를 통하여 형광강도를 증가시켜 암세포를 검출하기 위해 D-글루코오스 유사체인 D-글루코사민 유닛을 함유한다. 그러나 이들의 적용은 정상세포 내 수동 확산과 레이저 출력 및 프로브 농도 변화와 같은 실험적 인위성에 의한 부정확도 때문에 제한되었다.

대한민국 공개특허 제10-2017-0052399호 (2017.05.12. 공개)

본 발명은 암세포에 과발현된 포도당 수용체 및 세포 내 β-갈락토시다아제 반응을 이용하여 암세포를 선택적으로 이중 인식하는 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se 이며,

R은 하기 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4 및 화학식 5로 이루어진 군에서 선택됨.

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서, Y는 O 또는 NH임.

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 4 및 5에 있어서, Y는 O 또는 NH이며, n은 1 내지 50의 정수임.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하며, 상기 화합물은 포도당 수용체(Glucose transporters; GLUT) 특이적 인식 부위, 이광자 형광 프로브 및 β-갈락토시다아제 반응 부위로 이루어지는 이중 인식 이광자 형광 프로브를 제공한다.

본 발명은 상기 이중 인식 이광자 형광 프로브를 인간으로부터 분리된 시료에 처리하는 단계; 상기 이중 인식 이광자 형광 프로브가 처리된 시료에 여기광을 조사하는 단계; 상기 여기광이 조사된 시료에서 형광 프로브로부터 발생하는 색의 강도 및 색 변화 비율의 증가 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 이중 인식 이광자 형광 프로브와 광감작제를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 광역학치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 이중 인식 이광자 형광 프로브와 항암제를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 암세포 타겟을 위해 D-글루코사민 및 β-D-갈락토피라노사이드를 이중 인식 부위로 결합시킨 이광자 형광 프로브는 암세포에 과발현된 포도당 수용체를 통하여 암세포에 선택적으로 흡수될 수 있으며, 암세포 내에 비정상적으로 상향조절된 β-갈락토시다아제(β-gal) 가수분해 효소활성을 통하여 형광 발색 및 색 변화를 나타내고, 상기 이광자 형광 프로브의 색 변화 비율 및 발색 강도를 통하여 암질환의 진단 및 암질환의 진행단계의 확인이 가능함에 따라, 본 발명의 이중 인식 이광자 형광 프로브는 암질환 치료에 있어서 정확하고 효과적인 암질환 진단 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 이중 인식 이광자 형광 프로브(SGG)와 β-갈락토시다아제(β-gal)의 효소반응을 확인한 결과로, 도 1(a)는 β-gal (1 unit/mL) 첨가에 따른 SGG의 일광자 방출 스펙트럼 변화를 확인한 결과이며, 도 1(b)는 363 nm 여기광 조사시 다양한 생물학적 종이 포함된 완충액 내에서 SGG의 형광 반응을 확인한 결과로, 바는 각 생물학적 종을 1 내지 6시간 처리 후 F₅₂₅/F₄₅₃ 형광 비율을 나타낸 것이다(n = 10).
도 2는 55 mM 농도의 L-글루코오스 (L-Glc) 또는 D-글루코오스 (D-Glc)가 처리되거나 처리되지 않은 대장암 세포 (HT-29 및 HCT 116) 및 정상세포 (CCD-18Co)를 확인한 결과로, 도 2(a)는 이광자 현미경 (TPM) 이미지이며, 도 2(b)는 이광자 여기 형광 (two-photon-excited fluorescence; TPEF) 강도를 확인한 결과이다.
도 3(a) 및 도 3(b)는 SGG 표지된 lacZ-음성 HCT 116 및 lacZ-양성 HCT 116의 TPM 형광 비율 이미지를 확인한 결과이며, 도 3(c)는 SGG 표지된 lacZ-음성 HCT 116, lacZ-양성 HCT 116 및 GS 표지된 HCT 116의 F_green/F_blue 비율을 나타낸 결과이다.
도 4는 세포 내 SGG 흡수 수준을 확인한 결과로, 도 4(a) 및 도 4(b)는 대장 정상세포 (CCD-18Co) 및 대장암 세포 (HT-29)에서 SGG (5 μM)의 실시간 흡수를 확인한 TPM 이미지이며, 도 4(c)는 2초 간격으로 세포 내 프로브의 상대적 TPEF 강도를 확인한 결과이다 (n = 10).
도 5는 대장암 세포 (HT-29, RKO 및 HCT 116) 및 정상세포 (CCD-18Co) 내 SGG의 TPM 이미지를 확인한 결과로, 도 5(a)는 중심 채널 (400-600 nm)에서 얻은 TPM 이미지 결과이며, 도 5(b)는 TPM 형광 비율 이미지를 확인한 결과이며, 도 5(c)는 표준화된 TPEF 강도의 박스 플롯을 나타낸 결과이며, 도 5(d)는 표준화된 F_green/F_blue 비율을 나타낸 결과이며, 도 5(e)는 강도 대 비율의 플롯을 나타낸 결과이다.
도 6(a) 내지 도 6(c)는 전체 채널 (400-600 nm)에서 확인된 TPM 이미지이며, 도 6(d) 내지 도 6(f)는 TPM 형광 비율 이미지 (F_green/F_blue)를 확인한 결과로, a 내지 d는 사람 대장 정상 조직 (a 및 d), 선종 (b 및 e) 및 암종 (c 및 f) 조직을 SGG (10 μM)와 40분간 인큐베이션 후 확인한 결과이며, 도 6(g)는 표준화된 TPEF 강도를 나타내며, 도 6(h)는 표준화된 F_green/F_blue비율을 확인한 결과이며, 도 6(i)는 각 조직의 강도 대 비율 플롯을 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se 이며,

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서, Y는 O 또는 NH이다.

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 4 및 5에 있어서, Y는 O 또는 NH이며, n은 1 내지 50의 정수이다.

보다 상세하게 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 및 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 6]

상기 화학식 1에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se 이다.

[화학식 7]

상기 화학식 7에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se이고, Y는 O 또는 NH 이다.

[화학식 8]

[화학식 9]

상기 화학식 8 및 9에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se이고, Y는 O 또는 NH이며, n은 1 내지 50의 정수이다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하며, 상기 화합물은 포도당 수용체(Glucose transporters; GLUTs) 특이적 인식 부위, 이광자 형광 프로브 및 β-갈락토시다아제 반응 부위로 이루어지는 이중 인식 이광자 형광 프로브를 제공할 수 있다.

보다 바람직하게는 하기 화학식 10으로 표시되는 이중 인식 이광자 형광 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 10]

상기 포도당 수용체(GLUTs) 특이적 인식 부위는 이광자 형광 프로브의 카르복실기와 결합하는 것일 수 있으며, D-글루코사민 및 D-글루코피라노사이드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 β-갈락토시다아제 반응 부위는 이광자 형광 프로브의 아민기와 결합하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 β-D-갈락토피라노사이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 프로브는 포도당 수송체(Glucose transporters; GLUTs)를 통하여 선택적으로 종양 세포 내로 흡수되는 것일 수 있다.

상기 프로브는 종양 세포 내 β-갈락토시다아제 (β-gal)의 가수분해 효소반응에 의해 색 변화를 나타내는 것일 수 있다.

상기 여기광은 400 내지 600 nm 범위의 파장을 갖는 것일 수 있다.

상기 색 변화 비율은 시료 내 β-갈락토시다아제의 가수분해 효소 반응에 의해 이광자 형광 프로브의 방출색이 파랑색에서 녹색으로 변화하는 비율을 확인하는 것일 수 있다.

상기 암질환은 대장암, 유방암, 간암, 폐암, 자궁암, 췌장암, 신장암, 위암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 본 발명은 상기 이중 인식 이광자 형광 프로브와 광감작제를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 광역학치료제를 제공한다.

상기 광역학치료제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로 이루어진 이중 인식 이광자 형광 프로브에 광감작제가 결합된 형태일 수 있다.

상기 광감각제는 포르피린계 및 클로린계로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물로 이루어진 이중 인식 이광자 형광 프로브에 광감작제가 결합된 형태일 수 있다.

상기 항암제는 종래 항암치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 항암제와 상기 프로브간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유결합, 가료 등을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 암질환 진단 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 부형제, 희석제 등이 있으며, 당해 기술분야에 잘 알려져있다. 담체의 선택은 제조하고자 하는 구체적인 제형 및 그 조성물의 구체적인 투여방법에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 암질환 진단 또는 치료용 조성물은 매우 다양한 형태의 제제로서 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 암질환 진단 또는 치료용 조성물은 그 용도 또는 활성 성분의 종류에 따라 적절한 투여방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 암질환 진단 또는 치료용 조성물의 투여량은 진단 또는 치료하고자하는 질병의 종류, 질병의 정도, 진단하고자 하는 대상 조직 또는 기관 및 진단장치의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 또한 상기 투여량은 투여 대상의 나이, 성별, 체중, 인종 등에 따라 증감할 수 있다.

본 발명의 암질환 진단 또는 치료용 조성물의 바람직한 투여방법은 비경구적, 예를 들어 볼루스 주입, 정맥내 주사, 동맥내 주입, 또는 폐가 조영되어야 하는 경우 스프레이, 예를 들어 연무제 분사가 있고, 경구 또는 직장 투여도 이용할 수 있으나, 공지된 조영제 투여방법으로도 가능하다. 비경구적 투여 제제는 무균이어야 하고, 생리학적으로 허용되지 않는 물질 및 상자성, 초상자성, 강자성, 또는 준강자성 오염물질이 없어야 하며, 방부제, 항균제, 비경구적 용액에 통상적으로 사용되는 완충액 및 항산화제, 부형제를 함유할 수 있으며, 분자영상에 방해가 되지 않는 다른 임의의 첨가제를 더 함유할 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<참고예>

질소 대기하에서 flame-dried round-bottom flasks와 마그네틱 교반기에서 반응을 수행하였다. 모든 화합물은 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, 용매는 사용전 증류하였다. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 유리 pates (TLC Silica gel 60 F254, 1.05715.0001, Merck)는 반응 과정을 모니터하기 위해 사용되었다.

최종 생성물은 일반 범용 또는 역상 C-18 컬럼 카트리지를 이용한 중압 액체 크로마토그래피 (medium-pressure liquid chromatograph; AI-580S, YAMAZEN)로 정제하였다.

600 MHz NMR spectrometer (JNM-ECZ 600R, JEOL)를 이용하여NMR 스펙트럼을 얻었다. 경기도 경제과학진흥원 (Gyeonggido Business & Science Accelerator)의 HR-MS system (Accela UPLC/LTQ-Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 고분별능 질량 분석을 수행하였다.

<합성예> 화합물 SGG 합성

화합물 1, 2 및 4는 앞서 보고된 방법(C. S. Lim, et. al., Chem. Soc. 2011, 133, 11132-11135; J. A. Carmona, et. al., Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 2993-3005; H. W. Lee, et. al., Anal. Chem. 2014, 86, 10001-10005.)으로 준비되었으며, 다른 화합물은 하기 반응식과 같이 합성되었다.

[반응식 1]

1. 화합물 GS 합성

화합물 1 (14.8 mg, 0.044 mmol, 1.0 eq.) 및 N,N,N′,N′-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우라늄 헥사플루오로포스페이트 [N,N,N′,N′-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate; HBTU, 25.2 mg, 0.066 mmol, 1.5 eq.]를 DMF (0.4 mL)에 용해시킨 용액에 DIPEA (15 μL, 0.09 mmol, 2 eq.)를 처리하고, 상기 반응 혼합액을 1시간 동안 25℃에서 교반한 후 D-(+)-글루코사민 하이드로클로라이드 [D-(+)-glucosamine hydrochloride; 10.4 mg, 0.048 mmol, 1.1 eq.] 처리하고 25℃에서 3시간 동안 추가 교반하였다.

반응 혼합물에 포화된 수용성 NaHCO₃을 처리하여 반응을 종료시키고 EtOAc로 희석하였다. 층을 분리한 후 수용성 층을 예비혼합된 용액(CHCl₃:i-PrOH = 3:1)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고, 과량의 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하에서 농축하였다. 정제되지 않은 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (10 to 20% MeOH in DCM)로 정제하여 노란색 반고체 형태의 GS 화합물 (25.3 mg, 71%)을 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz): δ (ppm) 8.68 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.20 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.05-8.01 (m, 3H), 7.83 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.48 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.43 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.86-3.76 (m, 2H), 3.66 (m, 2H), 3.55-3.42 (m, 1H), 3.23-3.20 (m, 1H), 2.82 (d, J = 4.1 Hz, 3H); HRMS (ESI⁺): m/z calculated for [C₂₅H₂₆O₆N₃S]⁺: 496.1537, found: 496.1545.

2. 화합물 3 합성

화합물 1 (432 mg, 1.29 mmol, 1.0 eq.), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride; EDCI, 297 mg, 1.55 mmol, 1.2 eq.] 및 1- 하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 [1-hydroxybenzotriazole hydrate; HOBt, 209 mg, 1.55 mmol, 1.2 eq.]을 DMF (6.4 mL)에 용해시킨 용액에 DIPEA (1.12 mL, 6.47 mmol, 5.0 eq.)를 처리하고 25℃에서 30분간 교반하였다.

상기 반응 혼합물에 화합물 2 (981 mg, 1.55 mmol, 1.2 eq.)를 첨가하고, 25℃에서 추가로 17시간 교반한 후 포화된 수용성 NaHCO₃으로 상기 반응 혼합물의 반응을 종료시키고, EtOAc로 희석 및 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고, 과량의 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하에서 농축하였다.

잔사를 컬럼 크로마토그래피 (2% MeOH in DCM)로 정제하여 녹색 반고체 형태의 화합물 3 (948 mg, 80%)를 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ (ppm) 8.29 (s, 1H), 8.14-8.12 (m, 3H), 8.06-8.05 (m, 2H), 7.97-7.92 (m, 5H), 7.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.67-7.63 (m, 2H), 7.59-7.53 (m, 3H), 7.50-7.40 (m, 7H), 7.36-7.30 (m, 4H), 6.88 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.78-6.75 (m, 2H), 6.29 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.96-5.87 (m, 2H), 5.13 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.67 (dd, J = 12.3, 2.7 Hz, 1H), 4.54 (q, J = 5.5 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 2.96 (s, 3H) ; HRMS (ESI⁺): m/z calculated for [C₅₃H₄₂O₁₀N₃S]⁺: 912.2585, found: 912.2562.

3. 화합물 SGG 합성

i 단계: DCM (4.1 mL) 용해시키고 냉각된 화합물 3 (740 mg, 0.811 mmol, 1.0 eq.) 용액에 피리딘 (0.2 mL, 2.44 mmol, 3.0 eq.)을 처리하고, 동일한 온도에서 30분간 교반하였다. 상기 혼합용액에 DCM (25 mL)에 용해시킨 클로로포름산염 4 (637 mg, 1.23 mmol, 1.5 eq.)를 첨가하고 0℃에서 1시간 동안 교반하였다.

이후 포화된 수용성 NaHCO₃으로 상기 반응 혼합물의 반응을 종료시키고, DCM으로 희석 및 추출하였다.

결합된 유기층을 소금물로 세척하고, 과량의 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하에서 농축시켰다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (2 to 3% MeOH in DCM)로 정제하여 노란색 반고체 상태의 중간체(719 mg, 64%)를 얻었다.

ii 단계: 중간체(121 mg, 0.094 mmol, 1.0 eq.)를 MeOH:H₂O (5:1)에 용해시키고, TEA를 첨가한 후 100℃에서 8.5 시간 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압하에서 농축하였다.

잔사를 준비시킨 C18 컬럼 (2 × 25 cm, 25 % distilled water/0.1% TFA in MeOH)으로 정제하여 노란색 고체 상태의 SGG TFA 염(40.1 mg) 을 얻었다.

상기 SGG TFA 염(40.1 mg)을 MeOH (30 mL) 용해시킨 용액을 교반하고 기본 레진 (Amberlite® IRA-67 free base, 200 mg, 500 wt% of SGG TFA salt)을 첨가하여 생성된 혼합물을 25℃에서 30분간 교반하였다.

상기 혼합물을 셀라이트 패드에 통과시켜 여과하고 진공상태에서 농축하여 반고체 상태의 화합물 SGG (23.7 mg, 34%)를 얻었다. ¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz): δ (ppm) 8.82 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.17-8.14 (m, 3H), 8.11 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.13 (m, 2H), 5.10 (s, 2H), 4.99 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.82 (m, 3H), 4.63 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.69 (m, 2H), 3.57-3.47 (m, 10H), 3.38 (s, 3H), 3.08 (m, 2H); HRMS (ESI⁺): m/z calculated for [C₃₉H₄₂O₁₄N₃S]⁺: 808.2382, found: 808.2408.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 분광학 분석

FluoroMate FS-2 (SCINCO, Korea) 분광기와 온도 조절계(-10 ~ 80℃)를 이용하여 일광자(One-photon; OP) 형광 방출 실험을 수행하였으며, 일광자 흡수 실험은 S-3100 (SCINCO, Korea) UV-Vis 분광기를 이용하여 수행하였다. 분광기를 이용한 조사 실험은 1.0 cm 석영 큐벳 (HE.111.650QG, Hellma Analytics)에 준비하여 수행되었다.

선택성 실험, 효소반응속도 분석 및 pH 의존성 실험을 위해, a multi-detection microplate reader (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific)와 96 웰 microplate for fluorescence (164588, Thermo Fisher Scientific)가 사용되었다.

상대적인 양자 수득률 (Φ)은 9,10-디페닐안트라센 (9,10-diphenylanthracene; Φ = 0.93 in cyclohexane)을 이용하여 앞서 보고된 방법(A. M. Brouwer, Pure Appl. Chem. 2011, 83, 2213-2228.)으로 확인하였다.

2. 물에 대한 용해도 확인

SGG 및 GS의 DMSO 용액 (10 mM)을 준비하고, 0.05-10.0 μM로 희석하여 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4) 2.0 mL이 포함된 1.0 cm 석영 큐벳 (HE.111.650QG, Hellma Analytics)에 마이크로 주사기를 이용하여 첨가하였다.

모든 시료는 버퍼 내 DMSO의 최종농도를 0.1%로 유지시켰다.

각 화합물의 형광 강도 대 농도 플랏에서 선형 영역의 최대 농도가 용해도로 선택되었다. linear function (OriginPro 8.0, OriginLab)을 이용하여 선형 피팅이 수행되었으며, 버퍼 내에서 SGG 및 GS의 용해도는 각각 약 5.0 μM 및 3.0 μM 이었다.

3. 이광자 형광 효율 (Two-Photon Cross Section) 확인

이광자(TP) 흡수 효율(δ)는 일반적인 방법에 따라 확인되었다 (S. K. Lee et al., Org. Lett. 2005, 7, 323-326.). SGG 및 GS (1.0 μM)를 버퍼(10 mM PBS, pH 7.4)에 용해시키고 기준 화합물로 TP 특성이 잘 확립되어 있는 로다민(Rhodamine) 6G를 이용하여 이광자 여기 방출을 확인하였다.

각 시료 및 로다민 6G의 TPEF 강도는 시료 여기 파장(720 to 880 nm)을 통하여 확인되었다. 또한 이광자 흡수 효율은 δ = δ_r(S_sФ_r Ф _rC_r)/(S_rФ_s Ф _sC_s)를 이용하여 결정되었다. 상기 r 및 s는 각각 기준 및 시료를 나타내며, δ_r은 로다민 G6의 TP 흡수 효율; S는 CCD system (Monora 320i monochromator with DV401A-BV detector, DONGWOO OPTRON, Korea)을 이용하여 TPEF 신호를 수집한 것이며; Ф는 형광 양자 수득율을 나타내며, Ф는 실험 시스템의 전체 형광 수집 효율을 나타내며, C는 각 시료의 농도이다.

4. HPLC 분석

HPLC system (Alliance 2796, Waters)을 이용하여 고속 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하였다.

5. 선택성 실험

다양한 생물학적 종이 포함된 버퍼 내에서 SGG (1.0 μM)의 일광자 형광 비율을 multi-detection microplate reader를 이용하여 363 nm 여기상태에서 확인하였으며, 사용된 시약은 다음과 같다.

1) 효소 (1 unit/mL): β-갈락토시다아제 (β-galactosidase; G5636, Sigma-Aldrich), hNQO1 (DT Diaphorase, D1315, Sigma-Aldrich), ALP (alkaline phosphatase, P4252, Sigma-Aldrich), NTR (nitroreductase, N9284, Sigma-Aldrich), Ami (amidase, A6691, Sigma-Aldrich), MAO-B (monoamine oxidase B, M7441, Sigma-Aldrich), hCE1 (human carboxylesterase 1, E0287, Sigma-Aldrich), hCE2 (human carboxylesterase 2, C4749, Sigma-Aldrich), AChE (acetylcholinesterase, C1682, Sigma-Aldrich), BChE (butyrylcholinesterase, B4186, Sigma-Aldrich) 및 β-글루코시다아제 (β-glucosidase; G0395, Sigma-Aldrich).

2) 활성종 (Reactive species, 200 μM): H₂O₂ (hydrogen peroxide), OCl^- (hypochlorite from NaOCl), ·OH (hydroxyl radical from Fe²⁺ + H₂O₂), O₂ ^- (superoxide from KO₂) 및 GSH (glutathione, G4251, Sigma-Aldrich).

3) 아미노산 (1 mM): Ala (L-alanine, A7627, Sigma-Aldrich), Glu (L-glutamic acid, G1251, Sigma-Aldrich), Gly (glycine, G8898, Sigma-Aldrich), Leu (L-leucine, L8000, Sigma-Aldrich) 및 Asp (L-aspartic acid, A9256, Sigma-Aldrich)

4) 금속이온 (Metal ions, 1 mM): Mg²⁺, Na⁺, Ca²⁺ 및 K⁺ (from the corresponding metal chlorides).

6. 효소 억제 분석 및 검출한계 확인

D-갈락토오스 (0, 10, 50 및 100 mM) 및 과량의 D-글루코오스 (100 mM) 존재하에서 효소 억제 활성을 확인하였다. 버퍼 (10 mM PBS, pH 7.4, 37℃) 내 SGG의 OP 형광 비율을 363 nm 여기(excitation) 상태에서 확인하였다.

7. 효소 반응속도 및 pH 영향 확인

multi-detection microplate reader를 이용하여 효소 반응속도 분석을 수행하였다. 버퍼(10 mM PBS, pH 7.4, 37℃)로 다양한 농도의 SGG 용액 (0 내지 40 μM)을 준비하였으며, 최종농도 2.0 mg/L의 β-gal을 사용하였으며, 형광 강도를 525 nm에서 1분 간격으로 0 내지 60분간 기록하였다.

강도의 변화를 속도로 변환하고 쌍곡선함수 기능(OriginPro 8.0, OriginLab)을 통하여 비선형 이음으로 플로팅하여 Michaelis-Menten 반응속도의 파라미터를 얻었다.

8. 세포 배양

이미지를 얻기 2일 전에 모든 세포를 유리바닥 접시(Wuxi NEST Biotechnology)에 배양하고, 5/95 (v/v) CO₂ 가습 조건 및 37℃의 CO₂ 배양기(Water Jacketed 3010, Thermo Fisher Scientific)에서 유지시켰다.

라벨링을 위해, 성장배지를 제거하고 글루코오즈가 없는 배지로 교체하였다. 세포를 5 μM SGG 또는 GS와 함께 추가로 30분간 인큐베이션하고, PBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific)로 두번 세척한 후 이미지를 얻었다.

각 세포의 성장배지는 다음과 같다.

HT-29 (human colorectal adenocarcinoma cell line, HTB-38, American Type Culture Collection) 세포: 10% FBS (WelGene, Korea), 페니실린 (100 units/mL), 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 포함된 RPMI (WelGene, Korea) 배지.

RKO (human colon carcinoma cell line, CRL-2577, American Type Culture Collection), SW-837 (human rectum adenocarcinoma cell line, CCL-235, American Type Culture Collection), 및 CCD-18Co (human colon normal cell line, CRL-1459, American Type Culture Collection) 세포: 10% FBS (WelGene, Korea), 페니실린 (100 units/mL), 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 포함된 DMEM (WelGene, Korea) 배지.

HeLa (human cervical adenocarcinoma cell line, CCL-2, American Type Culture Collection) 세포: 10% FBS (WelGene, Korea), 페니실린 (100 units/mL) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 포함된 MEM (WelGene, Korea) 배지.

9. 세포 생존도 확인

CCK-8 kit (Cell Counting kit-8, Dojindo)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라, SGG가 HT-29 및 HCT 116 세포의 생존도에 미치는 영향을 확인하였다.

10. 이광자 현미경 (TPM) 분석

ultrafast Ti:sapphire laser (Mai Tai HP, Spectra-Physics)와 multiphoton microscope (TCS SP8 MP with DMI6000B, Leica Microsystems)를 이용하여 여기된 SGG 또는 GS로 라벨링된 세포 및 조직의 TPM 이미징 실험을 수행하였다.

TP 여기 파장은 2478 mW의 평균 출력으로 740 nm였으며 상기 파장은 초점면에서 대략 4.10 × 10⁸ mW cm^-2에 해당한다.

TPM 형광 신호는 whole channel (400-600 nm) 및 ratio channels (Ch_blue: 400-450 nm, Ch_green: 500-600 nm)에서 얻었다. 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 (MetaMorph NX, Molecular Devices)를 이용하여 비율계량 결과 프로세싱 및 분석을 수행하였다.

TPM 실험 동안, 세포 배양기 시스템 (Chamlide IC, Live Cell Instrument)은 장기 이미징을 위해 적합한 조건(온도, 습도, CO₂ 및 O₂)을 유지시키고 살아있는 세포의 안정성을 위해 사용하였다.

11. 광안정성 (Photostability) 확인

SGG의 광안정성을 편향됨 없이 선택된 SGG 표지된 (5 μM) HT-29 세포의 시간 경과에 따른 TPEF 강도 변화를 모니터링하여 확인하였다.

세포를 5 μM SGG와 30분간 (충분한 β-gal 반응기간) 인큐베이션하고, PBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific)로 두번 세척한 후 이미지를 얻었다.

평균 TPEF 강도는 1 시간 동안 F_blue (400-450 nm) 및 F_green (500-600 nm)이 거의 일정하였으며, SGG가 광안정성이 매우 높다는 것을 나타낸다.

12. 글루코오스 경쟁적 분석

글루코사민 유도체 (glucosamine-derived moiety; GS)의 세포내 흡수 과정에 있어서, D-글루코오스가 관여하는지 여부를 확인하기 위해, 글루코오스 경쟁적 실험을 수행하였다.

경쟁적 세포내 흡수를 관찰하기 위해, 0 또는 55 mM D-글루코오스 포함된 배지에서 다양한 암 세포주 (SW837, HCT 116, RKO, HeLa)를 GS (5 μM)와 30분간 인큐베이션하였다.

세포 내 영역에서 전체 채널 (400-600 nm)의 TPEF 강도를 비교하였다.

또한, 유사한 과정으로 대장암 세포 및 정상세포 주에서 SGG (5 μM)에 글루코오스 경쟁적 분석을 수행하였다.

13. lacZ 실험

HCT 116 사람 대장암 세포 (CCL-247, American Type Culture Collection)를 10% FBS (WelGene, Korea), 페니실린 (100 units/mL) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 포함된 MEM (WelGene, Korea) 배지에서 배양하였다.

이미징 2일 전에 세포를 유리 바닥 접시 (Wuxi NEST Biotechnology)에 도말하였다. 이미징 1일 전 세포에 lacZ-5BoxB가 삽입된 pcDNA3.1⁺ (lacZ-positive cells, Plasmid #29729, Addgene)와 BoxB가 삽입된 pcDNA3 (lacZ-negative cells, Plasmid #29727, Addgene)를 형질도입하였다.

라벨링을 위해, 글루코오스가 없는 배지에서 세포와 SGG (5 μM)를 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS (PBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific)로 세척하고 이미지를 얻었다.

14. TPM 이미지 분석

아주대학교 의학 센터에서 7명의 다른 환자로부터 사람 대장 조직을 얻었다.

아주대학교 병원의 기관 생명윤리위원회(IRB)의 지침 (AJIRB-BMR-SMP-17-372)에 따라, 생체 검사 표집을 수행하였다.

세개의 다른 타입의 조직 (normal, adenoma 및 carcinoma)을 이용하여 암의 진행과정을 평가하는 실험을 수행하고, 병리학자로부터 변병 단계를 확인받았다.

이미지 전에 조직 절편을 SGG (10 μM)로 40분간 염색하고, 정밀한 분석을 위해, z-방향으로 80-180 μm 깊이의 50개의 부분을 분석하였으며, 각 조직 절편 당 7,500 비율계량적 TPM 이미지를 얻었다.

비율계량적 TPM 이미지는 F_blue (400-450 nm) 및 F_green (500-600 nm)로 부터 40× 배율로 얻었다.

<실시예 1> 이중 인식 이광자 형광프로브 제작

사람 대장암 조직에서 암세포를 검출하고 다양한 단계의 대장암(정상, 선종 및 종양)을 구별하기 위한 이중 인식 이광자(TP) 형광 프로브(SGG)를 합성하였다.

작은 분자에 비율계량적 측정 시스템을 보유한 이중 인식 단위가 암세포 분석에 민감한 도구가 될 것으로 예상하고, 암세포 타겟을 위해 D-글루코사민 및 β-D-갈락토피라노사이드를 이중 인식 단위로 선택하였다. 상기 사람 β-갈락토시다아제(β-gal)는 가수분해 효소(EC 3.2.1.23)로 다양한 암세포에서 과발현되며, 대장암 세포에서 비정상적으로 상향조절된 활성을 나타내는 것으로 보고되었다.

[반응식 2]

이에 따라, 상기 반응식 2와 같이 SGG는 TP 형광프로브 (1), GLUT-특이적 흡수 모이어티인 D-글루코사민 단위 (2) 및 β-gal 반응 부위인 β-D-갈락토피라노사이드 단위 (4)로 구성되었으며, 두 가지 인식 부분이 암 검출에 있어 프로브의 식별 능력을 향상시킬 것으로 기대하였다.

첫 번째, SGG의 세포 로딩 능력은 GLUT 매개 세포내 흡수로 인하여, 정상세포보다 암세포에서 높을 수 있으며, 이는 형광 강도 증가에 의해 프로브가 정상세포와 암세포를 구별하는 것을 용이하게 할 수 있다. 다음으로 높은 β-gal 효소 활성으로 인한 색 변화 및 방출 비율에 의해 암세포의 추가 스크리닝이 가능하다.

한편, 반응식 2와 같이 인식 부위는 양극성 염료 (1)의 반대쪽에 위치하여 유닛 사이의 상호작용을 최소화한다. 반응식 2a와 같이 아미노기의 전자 공여능은 카바메이트 링커에 의해 감소되고 이에 따라, 효소에 의해 가수분해 절단 후 회복된 공여 효율은 적색-이동 방출 변화로 나타난 것과 같이 내부 전하 이동을 향상시킨다. 따라서, 반응식 2b와 같이 암세포는 방출 강도 및 색 변화를 기반으로 한 이중 인식 프로브에 의해 구별될 수 있다.

1-1. SGG 및 글루코사민 유도 모이어티(GS)의 합성 및 특징 확인

간략하게, SGG는 반응식 2과 같이 3 단계 방법으로 합성되었다.

먼저, EDCI 처리에 의해 화합물 1과 O-아실 아민 하이드로클로라이드 2의 커플링 반응이 원활하게 진행되어 아미드 3 (80%)이 수득되었다.

상기 화합물 3과 클로로포르메이트 4의 후속 커플링 반응은 상응하는 카바메이트를 64% 수율로 제공하였으며, 이어서 메탄올화를 통해 성공적으로 전체 탈아실화를 거쳐 SGG를 생성하였으며, SGG와 효소, GS의 반응 생성물은 대조군으로 사용하였다.

완충액 (10 mM PBS, pH 7.4)에서 SGG 및 GS의 물에 대한 용해도는 각각 약 5 및 3 μM로 확인되었다. SGG 및 GS는 각각 332 nm (molar extinction coefficient, ε = 2.10 × 10⁴ M^-1 cm^-1) 및 373nm (ε = 1.87 × 10⁴ M^-1 cm^-1)에서 최대 흡수율을 나타내었으며, 453 nm (fluorescence quantum yield, Φ = 1.00) 및 540 nm (Φ = 0.10) 각각 최대 방출율을 나타내었다.

GS의 더 큰 스트로크 이동 (GS의 경우 163nm 및 SGG의 경우 121nm)은 더 강한 전자 공여 메틸아민에 의한 것으로 전하 이동 여기 상태를 더 안정적으로 만든다. 완충액에서 SGG 및 GS의 TP 형광 효율 (Φδ_max)은 각각 730 및 740 nm에서 약 12 및 15 GM (1 GM = 10^-50 cm⁴ photon-1)으로 확인되었으며, 상기 값은 이광자 현미경(TPM)을 통하여 생생한 이미지를 제공할 수 있다.

HPLC (high-performance liquid chromatography)와 도 1a와 같은 단광자 방출 스펙트럼으로부터 β-gal과 SGG의 주요 효소 반응 생성물이 GS인 것이 확인되었다. 완충액에 β-gal (1 unit/mL) 첨가 후 SGG (1 μM)의 방출 스펙트럼은 525 nm에서 피크 강도 증가와 함께 453 nm에서 피크 강도의 점진적 감소가 나타났으며, F₅₂₅/F₄₅₃ 비율이 45배 증가하였다.

시간 경과에 따른 형광 변화는 SGG가 30분 이내에 β-gal과 반응함을 확인시켜주었다. SGG의 효소 가수분해는 β-gal 억제제로 알려진 D-갈락토오즈에 의해 용량의존적으로 억제되었으며, SGG의 형광 비율 증가를 통하여 β-gal 효소에 특이적으로 의존하는 것이 확인되었다.

또한, F₅₂₅/F₄₅₃ 비율 대 효소 농도 플롯은 선형 관계를 나타내었으며, β-gal에 대한 SGG의 검출한계는 0.04 nM 정도로 낮게 계산되었다.

미하엘리스-멘텐의 식 (Michaelis-Menten equation)을 이용하여 효소 반응속도를 표시하고, 촉매 효율 상수 (k_cat/K_m)를 계산한 결과, 0.10 ± 0.03 μM^-1 s^-1로 확인되었으며, 상기 K_m은 011.7 ± 2.7 μM이다.

도 1b를 참고하면, 다른 효소, 활성산소, 아미노산 및 금속 이온과 같은 다양한 생물학적 종의 존재하에서 6시간에 걸친 SGG의 F₅₂₅/F₄₅₃ 비율은 무시해도 될 정도의 변화가 나타났으나, β-gal의 존재하에서는 45배 증가되었다.

또한, SGG 및 GS는 생물학적으로 관련된 pH 범위에서 pH에 따른 영향을 받지 않았으며, 세포 생존도 및 광안정성 실험 결과, SGG 및 낮은 독성과 높은 광안정성이 확인되었다.

상기 결과로부터 SGG는 탁월한 민감성, 선택성 및 안정성을 통하여 β-gal 효소 활성을 시각화 할 수 있음이 확인되었다.

<실시예 2> 세포 환경에서 SGG의 유용성 확인

글루코오스 경쟁적 분석을 수행하여 프로브의 세포내 흡수가 GLUT 매개 신호과정과 연관성이 있는 지 확인하였다.

먼저, D-글루코사민 단위만을 가진 GS를 확인하기 위해, D-글루코오스가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 30분간 SW837, HCT 116, RKO 및 HeLa 암 세포 주와 GS를 인큐베이션한 후 TPM 이미징을 수행하였다.

그 결과, D-글루코오스의 존재하에서 GS의 상대적 세포내 흡수는 SW837, HCT 116, RKO 및 HeLa 세포에서 각각 50%, 44%, 47% 및 54% 감소하였으며, 도 2와 같이 SGG에서도 유사한 결과가 확인되었다. 도 2를 참고하면, 글루코오스가 없는 조건에서 대장 세포 주를 SGG와 배양한 경우, CCD-18Co 정상 세포와 비교하여 HT-29 및 HCT 116 대장암 세포에서 밝은 이미지를 얻을 수 있었다. 또한, D-글루코오스가 존재하는 경우, Glc (100%)의 부재와 비교하여 SGG의 흡수가 HT-29 세포에서는 30%, HCT 116 세포에서는 45% 감소한 반면, L-글루코오스가 존재할 경우 어떠한 변화도 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 SGG는 GLUT 매개 세포 내 글루코오스 흡수를 확인하는 데 유용한 것이 확인되었다.

또한, SGG가 살아있는 세포에서 β-gal의 효소 활성을 확인하기 위해, 도 3a 및 도 3b와 같이 β-gal 효소 발현을 암호화하는 lac 오페론 유전자인 lacZ가 형질도입 (lacZ-양성) 또는 형질도입되지 않은 (lacZ-음성) HCT 116 세포를 SGG (5 μM)로 표지하고 비율계량적 TPM 이미징 연구를 수행하였다.

그 결과, 도 3C와 같이 lacZ-음성 HCT 116 세포에서 SGG의 평균 TPM 비율[F_green/F_blue, 상기 F_blue 및 F_green은 Ch1 (400-450 nm) 및 Ch2 (500-600 nm)로부터 이광자 여기 형광 강도를 통합한 것임]은 1.0인 반면, lacZ-양성 HCT 116은 1.7로 유의미하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 반응 생성물로 표지된 HCT 116 세포는 3.0의 평균 비율을 나타내었다.

상기 결과로부터 SGG의 TPM 비율은 실제로 살아있는 세포에서 β-gal 효소 활성을 나타내는 것이 확인되었다.

한편, 프로브가 암 세포와 정상 세포를 구별할 수 있는지를 확인하기 위해, 세 종류의 대장암 세포 주 (HT-29, HCT 116 및 RKO)와 정상 대장 세포 (CCD-18Co)를 선택하고, 도 4a 및 도 4b와 같이 CCD-18Co 및 HT-29 세포에서 SGG의 세포내 흡수 효율을 모니터링하고 실시간 TPM 이미징 분석을 수행하여 비교하였다.

그 결과, 도 4C 와 같이 2초 간격으로 상대적인 TPEF 강도를 나타내는 플롯들은 SGG의 세포내 흡수가 정상세포보다 암세포에서 더 빠르게 흡수되는 것을 나타내며, 시료의 형광 강도 관찰을 통하여 프로브가 정상 세포와 암세포를 식별할 수있음이 확인되었다.

다음으로, 대장암 세포에서 β-gal 활성을 확인하였다.

도 5a 및 5c를 참고하면, SGG의 전체 검출 채널(400-600 nm)에서 평균 TPEF 강도로부터 확인되는 바와 같이, 다양한 암세포는 정상세포와 비교하여 매우 밝은 신호를 나타내었다. 상기 결과는 경쟁적 및 실시간 세포 이미징 결과와 일치하였다.

또한, 도 5b 및 도 5d와 같이 동일한 시간에서 정상세포보다 암세포에서 현저한 F_green/F_blue 비율 증가가 확인되었으며, 이러한 결과는 증가된 β-gal 활성 때문일 수 있다.

강도와 비율 증가를 통하여 SGG가 정상세포로부터 대장암 세포를 구별할 수 있지만, 강도 및 비율의 조합 해석이 적용되었으며, 그 결과 도 5e와 같이 강도 대 비율의 플롯은 정상세포에서 암세포뿐만 아니라, 암세포 주의 다른 타입을 명확하게 구별할 수 있음이 확인되었다.

<실시예 3> SGG를 이용한 대장 조직에서 대장암 세포 검출

아주대학교 병원에서 외과적 수술을 받은 환자들로부터 대장 조직의 생체 검사 시료를 얻었다. 암 진행에 따라, 정상, 선종 (종양 전 단계) 및 암종 (악성종양 또는 암)의 순서로 3개의 다른 암 단계의 대장 종양 샘플을 이용하였으며, 상기 샘플들은 종래의 헤마톡실린 & 에오신 염색을 통하여 확인된 동일한 병변에서 얻었다. SGG의 흡수를 관찰하기 위해, 글루코오스가 없는 배지에서 조직을 SGG (10 μM)와 인큐베이션하고 즉시 740 nm 여기(excitation)에서 5초 간격으로 이미지를 얻었다.

그 결과, 시간 경과에 따른 TPEF 강도를 통하여 암종, 선종 및 정상 조직 순으로 빠른 프로브의 흡수율이 나타나는 것이 확인되었으며, 이러한 결과는 세포 실험 결과와 일치하였다.

한편, 도 6a 내지 6c를 참고하면, 정상 및 선종보다 암종의 평균 TPEF 강도가 현저하게 높게 나타난 반면, 도 6g와 같이 선종에서는 정상 조직보다 2배 증가된 TPEF 강도가 나타났다.

상기 결과로부터 병변에서 암종은 TPEF 강도를 통하여 현저하게 구별될 수 있으나, 정상 조직으로부터 선종을 구별하는 것은 쉽지 않은 것이 확인되었다.

다음으로, 도 6d 내지 6f와 같은 정상 장 조직, 선종 및 암종의 TPM 이미지에서 F_green/F_blue 비율을 분석하였다. 그 결과, 도 6h와 같이 정상조직에서 선종 및 암종으로 진행될수록 평균 형광 비율이 증가하는 것이 확인되었으며, 상기 비율을 통하여 정상조직으로부터 선종을 명확하게 구별해낼 수 있었으며, 도 6i를 참고하면, 강도 대 비율의 플롯을 통하여 정상, 선종 및 암종의 단계가 각 영역에서 명확하게 구별되었음이 확인되었다.

상기 결과들로부터 이중 인식 프로브인 SGG는 사람 대장 조직 내 다양한 단계의 대장암들을 명확하게 구별해 낼 수 있음이 확인되었다.

이러한 방법은 관찰자 간 변동성, 시간 소모가 큰 과정 및 얻어진 조직 위치에 따른 진단 차이와 같은 조직학적 실험의 한계를 극복할 수 있다.

또한, 조직학적 실험과 비교하여 SGG는 수술 또는 내시경적 치료와 같은 대장암 치료 방법을 결정하는데 더 정확한 진단정보를 제공할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se 이며,
R은 하기 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4 및 화학식 5로 이루어진 군에서 선택됨.
[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서, Y는 O 또는 NH임.
[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 4 및 5에 있어서, Y는 O 또는 NH이며, n은 1 내지 50의 정수임.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하며, 상기 화합물은 포도당 수용체(Glucose transporters; GLUT) 특이적 인식 부위, 이광자 형광 프로브 및 β-갈락토시다아제 반응 부위로 이루어지는 이중 인식 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]

상기 화학식 1에 있어서, X는 O, NH, S 또는 Se 이며,
R은 하기 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4 및 화학식 5로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택됨.
[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서, Y는 O 또는 NH임.
[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 4 및 5에 있어서, Y는 O 또는 NH이며, n은 1 내지 50의 정수임.
청구항 2에 있어서, 상기 포도당 수용체(GLUT) 특이적 인식 부위는 이광자 형광 프로브의 카르복실기와 결합하는 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 포도당 수용체(GLUT) 특이적 인식 부위는 D-글루코사민 및 D-글루코피라노사이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 β-갈락토시다아제 반응 부위는 이광자 형광 프로브의 아민기와 결합하는 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 β-갈락토시다아제 반응 부위는 β-D-갈락토피라노사이드인 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 프로브는 포도당 수송체(Glucose transporters; GLUTs)를 통하여 선택적으로 종양 세포 내로 흡수되는 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 프로브는 종양 세포 내 β-갈락토시다아제 (β-gal)의 가수분해 효소반응에 의해 색 변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 이중 인식 이광자 형광 프로브.
청구항 2의 이중 인식 이광자 형광 프로브를 인간으로부터 분리된 시료에 처리하는 단계;
상기 이중 인식 이광자 형광 프로브가 처리된 시료에 여기광을 조사하는 단계;
상기 여기광이 조사된 시료에서 형광 프로브로부터 발생하는 색의 강도 및 색 변화 비율의 증가 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 여기광은 400 내지 600 nm 범위의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 색 변화 비율은 시료 내 β-갈락토시다아제의 가수분해 효소 반응에 의해 이광자 형광 프로브의 방출색이 파랑색에서 녹색으로 변화하는 비율을 확인하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 암질환은 대장암, 유방암, 간암, 폐암, 자궁암, 췌장암, 신장암, 위암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
청구항 2의 이중 인식 이광자 형광 프로브와 광감작제를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 광역학치료제.
청구항 2의 이중 인식 이광자 형광 프로브와 항암제를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물.