PT95076A - Processo para a preparacao de composicoes para a deteccao in vitro de particulas com a forma anelar e tumores malignos em seres humanos e animais - Google Patents

Description

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Campo da Invenção A presente invenção refere-se à detecção do cancro e, mais particularmente, a processos e amostras para determinar a presença de um marcador de tumores para assinalar com segurança a presença de células cancerosas.

Enquadramento da Invenção 0 cancro é um largo grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento celular incontrolado e expansão de células anormais.

Se a expansão não é controlada ou verificada, resulta na morte. No entanto, várias formas de cancro podem ser curadas se forem detectadas num estado precoce e se forem prontamente tratadas. A incidência do cancro está a aumentar. Em 1988 serão diagnosticados cerca de 985.000 novos casos de cancro em pessoas dos Estados Unidos, apenas. Durante o mesmo ano cerca de 494.000 pessoas nos Estados Unidos e 4.000.000 no mundo inteiro, morrerão desta doença.

Calcula-se que sá nos Estados Unidos 174.000 pessoas tenham sido salvas por diagnóstico precoce, tratamento pronto e monitorização adequada. A detecção precoce do cancro aumenta grandemente o potencial de cura. A detecção do cancro numa área localizada, possível com um diagnostico precoce no crescimento do tumor, permite o uso de terapias mais eficazes, e melhora a chance de recuperação. 0 tratamento por meio de cirurgia, quimioterapia ou radiações requer a monitorização post-trata-mento para assegurar que todos os vestígios do crescimento maligno foram eliminados.

Ao longo destes últimos 15 anos, foram descobertas numerosas 4

proteínas associadas com tumores, algumas das quais foram consideradas para uso como marcadores de tumores. Muitos destes marcadores de tumores estão unicamente associados com tumores específicos. Como resultado, a sua presença pode ser usada para detectar com segurança estes tumores. Porque o marcador de tumores pode ser mais fácilmente identificado do que o tumor por si só, o marcador torna possível a detecção precoce mais segura do tumor. Alguns dos marcadores de tumores mais conhecidos são: a) antigene carcinoembridnico (CEA) para cancros do cólon, pulmão, estômago e pâncreas; (b) alfa-fetoproteína (AFP) para cancro do fígado e dos testículos; e (c) um marcador de tumores recentemente aprovado para cancros do peito (CA-549).

Foi identificado um marcador de tumores que, ao contrário dos acima mencionados, parece ser um marcador universal. Este marcador de tumores, sob a forma de partículas submicroscdpicas de forma anelar (RSP), quando observado ao microscópio elec-trdnico, é libertado pelas células cancerosas para os tecidos e fluidos corporais circundantes mas não é libertado pelas células normais em quantidades detectáveis. A Requerente descobriu que as RSP, também conhecidas como prossoma, proteas-soma, minipartículas, LAMP, macropain, ARN de protiolípido e micropartículas de forma anelar, são libertadas pelo espectro mais vasto de tumores humanos bem como pelos tumores de outras espécies de mamíferos e por linhas de células malignas.

Os estudos in vivo e in vitro indicaram que a libertação de RSP por parte de células malignas é uma propriedade do processo de carcinogénese e é independente da espécie, do tipo ou da localização do tumor no organismo. Além disso, este marcador de tumores é libertado em proporção com o peso do tumor e isso acontece 4 a 10 meses antes de ser possível o diagnóstico recidiva com base nos sintomas clínicos manifes- 5

tos. Consequentemente, ao contrário de outros marcadores, as RSP constituem um marcador de tumores universal. Como tal, as RSP podem ser usadas para detectar a presença de qualquer tipo de cancro num estado precoce, tornando as perspectivas de cura significativamente mais promissoras. As RSP são também capazes de controlar a eficácia do tratamento em doentes cancerosos. A redução do nível de RSP no soro pode ser usada como um indicador de tratamento bem sucedido. Como todas as células malignas ensaiadas até aqui em culturas de tecidos libertam RSP, e as células tornadas malignas em culturas de tecidos após o tratamento com agentes carcinogénicos também libertam RSP, estas podem ser usadas como ponto terminal para uma nova família de sistemas de ensaio a curto prazo para identificar também carcinogénios. A pesquisa precoce resultou num sistema de ensaio de fluorescência para detectar a componente ADN nas RSP. Esta técnica foi usada com sucesso com fluídos de irrigação vaginal para detecção do cancro cervical em mulheres. Na Memória Descritiva da Patente Norte Americana ΝΞ 3.798.131 - Rounds et al. referiram a técnica para ligação de um corante fluorescente ao ADN componente da RSP e a leitura da emissão luminosa aumen tada (intensidade de fluorescência) serve como uma medida indi recta da concentração de RSP. Infelizmente, esta técnica tem de ser modificada para medir quantitativamente as RSP em diferentes fluídos corporais para entrar em linha de conta com variáveis tais como diluições e volumes variáveis. Além disso os ensaios de fluorescência requerem equipamento especializado nesmo para análise qualitativa e, consequentemente, não se crestam facilmente a utilização local e muito menos deméstica du para incorporação em estojos de ensaio para aplicação nos consultórios médicos. 6

0 marcador de tumores RSP foi primeiramente descrito por volta de 1970 pelo Dr. Donald Rounds como um factor que modifica o crescimento encontrolado num meio de cultura condicionado por três linhas de células humanas malignas diferentes (HeLa, derivada do carcinoma cervical, KB, derivada do carcinoma da nasofaringe; e CMP derivada de um adenocarcinoma do cólon).

As três linhas de células excretaram um factor comum que modifica o crescimento de fibroblastos de pele humana in vitro. A baixas concentrações estimulou a divisão celular. A concentrações mais elevadas, impediu a divisão celular, a concentrações muito mais elevadas, causou a morte das células. Antigé-nicamente descobriu-se que o factor era o mesmo nas três linhas de células malignas.

Apesar de muito se desconhecer acerca da função da RSP sobre os organismos vivos, as propriedades físicas e bioquímicas do factor foram caracterizadas. Por meio de técnicas de ultra-centrifugação e usando o microscópio electrónico demonstrou-se que o factor consistia em partículas com uma configuração anelar. As micrografias electrónicas revelaram que os anéis eram constituídos por 6 a 7 subunidades. Os anéis foram encontrados isolados ou ocasionalmente em aglomerados de 4 anéis, com o aspecto de uma partícula rectangular quando observados de lado. Os anéis possuiam um diâmetro compreendido no intervalo entre 10 a 12 nanómetros e continham 3 a 5 ug de ADN e 8 a 15 ug de ARN por 100 ug de proteína. Estudos não publicados com manchas solúveis em gorduras sugeriram também a presença de lipidos mas estes não foram caracterizados. 0 tamanho, a forma e o número de sub-unidades do RSP são idênticos em todos os organismos vivos indicados até esta data desde as bactérias, aos fermentos, plantas, ouriços do mar, insectos, animais anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos incluindo seres humanos. As RSP são uma nucleoproteína de elevado peso - 7

molecular com actividade de proteinase multicatalítica, apresenta um coeficiente de sedimentação igual a cerca de 20S, uma massa molecular compreendida no intervalo de 650 KDa a 750 KDa e consiste em pelo menos 13 polipéptidos não idênticos com os pesos moleculares compreendidos no intervalo entre 21 kDa a 31 kDa e e pontos isoeléctricos de 3 a 10. 0 RSP possui também uma componente de ARN formada por cerca de 70 a 80 nucledtidos e uma componente ADN menor. 0 RSP foi encontrado no citoplasma bem como no núcleo das células e é libertado para o exterior da célula por células malignas. Sabe-se que o RSP rompe proteínas intracelulares, regula a translacção do ARNm e o processamento do pré-ARNt e possui actividade de aminoacil tRNA de transferência sintetase. 0 RSP tem sido registado como estando associado a proteínas de choque térmico e com espécies de ARN de pequenas dimensões específicas. Como tal, estas partículas desempenham claramente um papel importante em vários processos intracelulares.

Estudos realizados em meados da década de 1970 desenvolveram a evidência de que RSP foi libertado selectivamente por tecidos de tumores. Tecidos cortados de biópsias de tumores do pulmão, do cólon, da mama, pele, rim e olhos libertaram quantidades significativas de RSP no meio de manutenção após 24 horas de incubação à temperatura corporal, enquanto preparações similares de pele e músculo da língua normais não libertaram níveis detectáveis de RSP. Estudos duplamente cegos de libertação de RSP por tecidos de biópsia incubados obtidos a partir de 146 amostras de pele humana variando em termos patológicos desde peles normais a peles com cancro invasivo mostraram que nenhuma das 20 biópsias de pele normal e nenhuma das 10 biópsias de verrugas vulgares (verruga comum) libertou quantidades significativas de RSP, enquanto 12 das 36 (33%) amostras de tumores benignos, verruga saborreica, e 5 de 13 (38%) de amostras de tumor pré-maligno, queratose

RSP. Nos estude células basais s libertaram lo dos valores de invasivos foi basais não-inva- actínica, libertaram níveis consideráveis de dos descubriu-se que 100% dos 52 carcinomas e 100% dos 15 carcinomas de células escamosa quantidades significativas de RSP. 0 interva RSP para os carcinomas de células escamosas superior ao do RSP de carcinomas de células sivas .

Em estudos semelhantes duplamente cegos com biópsias do colo uterino humano observou-se que 16/21 (76%) das biópsias de regiões presumivelmente normais de colos anormais apresentaram uma pequena ou nula libertação de RSP detectável para o meio de manutenção. As restantes cinco amostras de tecidos libertaram baixos níveis de RSP durante um período de incubação de 24 horas. Amostras de condilomas e displasias associadas apresentaram na proporção de 10/18 (56%) uma libertação de níveis significativas de RSP enquanto 8/18 destas espécies (58%) libertaram níveis moderados de RSP. Pelo contrário 13/14 (93%) amostras de carcinoma iri situ e 16/16 (100%) amostras de carcinoma invasivo libertaram níveis significativos de RSP. Além disso, observou-se que o RSP foi libertado para o reservatório vaginal pelos tecidos cervicais iji situ As análises dos fluídos de irrigação vaginal indicaram que 276/284 (97%) dos colos uterinos normais não libertaram nenhum ou um nível insignificante de RSP, como aconteceu com 115/124 (93%) de mulheres com vários graus de displasias. As amostras de mulheres com carcinoma in situ apresentaram 17/29 (58%) eram negativos em termos de libertação de RSP. Destas, 17/19 (89,5%) tinham menos de 38 anos, classe etária em que quando não tratadas, as lesões voltam ao normal em 90% dos casos como documentado em 2 estudos realizados durante 15 anos na Dinamarca. Neste caso de carcinoma cervical, 10/10 (100%) de amostras de irrigação vaginal apresentaram níveis elevados de RSP. . 7 //.

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Num estudo posterior, observou-se que um antigene nucleolar extraído a partir de nucléolos de uma variedade de células cancerosas era constituído por "minipartículas" que possuem um diâmetro exterior de 11,3 nm e um diâmetro interior de 2,9 nm, compreendendo 8 subunidades e possuindo o aspecto mor foldgico global de RSP. Este antigene foi encontrado em carcinomas da bexiga, do cérebro, do cólon, do esófago, do fígado, do pulmão, da próstata, de pele, estômago e tiróide, 3 tipos de sarcomas, 4 tipos de linfomas e 6 linhas de células cultivadas de origem maligna. 0 antigene estava ausente em 17 tipos de tecidos normais, 4 tumores benignos, 7 tipos de doenças inflamatórias e 2 linhas de células de origem normal cultivadas.

Estas observações relativamente à libertação de RSP a partir de células de tumores humanos foram demonstradas em estudos anteriores da libertação de RSP em meios de culturas de 21 linhas de células de mamíferos in vitro.Descobriu-se que todas as linhas de células libertaram algum RSP (detectável com o microscópio electrónico). Consequentemente, a formação de RSP pareceu ser um fenómeno ubíquo. No entanto, a quantidade libertada dependeu do tipo ou da origem da linha de células. Todas as células de origem tumoral (9/9) e todas as células infectadas com vírus oncogénicos (3/3) libertaram quantidades significativas de RSP, enquanto 6/10 de linhas de células de origem normal libertaram níveis muito baixos de RSP. A quantidade relativa de RSP libertado por tecidos de tumores parece estar relacionada com o seu grau de malignidade. Tal foi demonstrado em estudos conduzido com células de rato ^Η10Τ1/2. Essas células são usadas num ensaio in vitro amplamente aceite para identificação de cercinogenes. Quando ex postas a carcinogenes , estas células sofrem alterações físi- 4 10

cas e morfológicas claramente definíveis: (a) nenhuma alteraçãp (inibição de contacto normal), (b) colónias Tipo I com inibição de contacto marginal, (c) colónias do Tipo II com inibição de contacto marginal e (d) colónias do Tipo III com nenhuma evidência de inibição de contacto. Quando implantadas em ratos C3H10Tl/2, apenas células das colónias Tipo II e do Tipo III se desenvolveram dando origem a tumores malignos.

As células normais e as células das colónias do Tipo I não originam tumores. Além disso, as células das colónias de Tipo III são mais virulentas do que as colónias do Tipo II pois originam mais tumores malignos e maiores em animais hospedeiros do que as células de colónias do Tipo II. Demonstrou-se que apenas células de colónias dos Tipos II e III libertam RSP enquanto que as células normais e as células das colónias do Tipo I não libertaram. Em adição demonstrou-se que RSP pode ser detectado no meio de crescimento de células de C3H10Tl/2 depois de apenas 3 semanas de tratamento com o carcinogénio, metanossulfonato de etilo, em contraste comas 8 semanas usualmente requeridas para o ponto final do ensaio normal.

Um outro estudo demonstrou que, apesar de o epitélio da traqueia de cricetos defecientes em vitamina A originar metapla-sia e hiperplasia de células escamosas em cultura de orgãos as traqueias de cricetos da Síria defecientes em vitamina A não libertam RSP. Enquanto o modelo imita de forma muito fiel o processo de carcinogénese e é usado para estudar o processo de carcinogenese e as propriadades antineoplásticas de análogos de vitamina A, as lesões voltam para normais quando são implantadas em cricetos singeneicos e não são consequentemente transformadas em tumores malignos. Assim, a ausência de libertação de RSP reflecte rigorosamente a verdadeira condição benigna dos tecidos. 11

Existe uma forte evidência de que a libertação de RSP está quantitativamente ligada com o tamanho do tumor e possui portanto um valor de previsão. Quando células de uma linha de células de melanoma do rato são administradas por via intravenosa a ratos B16F10, formam pequenos tumores através do corpo. 0 aspecto pigmentado destes tumores permite registar com segurança o número de tumores presentes no tecido pulmonar, como um indicador do volume do tumor nos animais hospedeiros. Observou-se que o tecido pulmonar esmagado dos ratos a que se administrou a referida linha de células com células de melanoma libertou RSP para o meio de cultura em proporção com o número de tumores registados para o mesmo tecido pulmonar.

Além disso, observou-se que a libertação de RSP pode ser de-tectada antes de o pulmão ter formado tumores obviamente visíveis. Como outra evidência de que a libertação de RSP está relacionada com o volume do tumor realizou-se um estudo sobre níveis de RSP no soro de 8 pacientes com cancro da mama cujo tecido tumoral foi removido cirurgicamente por mastectomia radical. 0 teor de RSP do soro decaiu rapidamente desde o momento da cirurgia para níveis não detectáveis de RSP no 102 dia depois da cirurgia. Os níveis de RSP no soro mantiveram-se negativos nestas mulheres até 32 dias após a cirurgia (a duração do estudo).

Num estudo subsequente, um material de ARN-proteolípido, possuindo caracteristicas que sugeriam que o ARN-proteolípido era RSP, observou-se que ele foi libertado por células malignas para o seu meio de cultura circundante bem como para o soro de pacientes com cancro. Este material foi detectado no soro de 99 pacientes representando 23 tipos diferentes de cancro. Em comparação, não foi detectado no soro de 74 pacientes com 21 perturbações não relacionadas com o cancro. Oito linhas de células de origem maligna foram descobertas como libertando quantidades significativas de material de ARN-proteolípido - 12 -

para o respectivo meio de cultura. 0 estudo indicou que a quan tidade ARN-proteolipido semelhante a RSP no soro de pacientes com cancro era directamente proporcional à quantidade de tumor presente e que a remoção cirúrgica do tumor provocou uma diminuição completa do ARN-proteolípido no soro durante um período de 8 a 10 dias post-cirurgia, confirmando as observações relativamente a pacientes cdm cancro de mama submetidas a mastectomia radical. Além disso, quando se observou a recorren cia do tumor, os nveis de ARN-proteolípido no soro tornou-se elevado 10 meses antes de se revelar o aspecto clínico do tumor.

Em adição, realizou-se um estudo em que a libertação de RSP foi relecionada com a indução de tumor em quistos no focinho de cricetos pintados 3 vezes por semana, durante 5 semanas, com dimetilbenzantraceno a 5% dissolvido em óleo mineral. Cem por cento (32/32) normal, biópsias de quistos da face produziram níveis insignificantes de RSP, bem como aconteceu com 18/18 espécies a quem se efectuaram 3 pinturas. Após a 4^ pintura, 5/9 (56%) apresentaram uma produção de RSP moderadamente elevada, bem como 9/17 (53%) das espécies colhidas após a 6^ pintura. Nesta altura, as secções de tecidos de biópsias apresentaram alguma hiperplasia de células basais, com queratiniza ção aumentada, mas não havia evidência de células malignas.

Na 7§ pintura (3§ semana) e posteriormente, virtualmente todas as espécies libertaram níveis significativos de RSP (por exemplo 18/18 7^ pintura, 15/15 9§ pintura, 8/8 12§ pintura e 12/12 15- pintura) e o nível de RSP libertado maximizou estabilizando após a 9ã pintura. Histologicamente, todos os animais tratados desenvolveram carcinomas bem definidos no focinho e lábios apenas 12 semanas depois do inicio do tratamento. Estes dados indicaram que a libertação de RSP de biópsias de tecidos transformados quimicamente precedem a evidência histológica de 13 ·; /) transformação maligna em pelo menos 3 semanas e sugerem que a medição da libertação de RSP pode ser clínicamente útil na identificação de indivíduos com condições assimtomáticas ou pré-malignas. 0 primeiro marcador de tumores descrito por volta de 1970 e caracterizado como partículas de forma anelar (RSP) foi observado em preparações de tecidos malignos ou linhas de células malignas em vários laboratórios. As evidências correntes sugerem que o RSP de células malignas diferem do das células normais pelo facto de serem únicas antigénicamente e serem excretadas em quantidades maciças pelas células malignas para dentro dos fluídos corporais, em contraste com a não libertação ou com a libertação não significativa por parte das células normais. Esta última caracteristica permite monitorizar todos os fluídos corporais para indicação de cancro incoberto no organismo. Além disso, a observação do facto de que o RSP podes ser detectado vários meses antes do aparecimento clínico de tumores recorrentes sugere que tumores assimtomáticos podem ser detectados em seres humanos num estado tão precoce de desenvolvimento, que o tratamento pode assegurar uma elevada probabilidade de cura. A observação do facto de que o teor de RSP era proporcional ao volume do tumor sugere também que os pacientes com cancro submetidos a tratamento podem ser prontamente monitorizados para acesso à eficácia do tratamento. Para alcançar estes objecti-vos é essencial um processo simples, barato, rápido, sensível e confiável para detectar e medir os níveis de RSP.

SUMARIO DA INVENÇÃO presente invenção é o de para detectar a presença processo para a detecção de baixo custo e de fácil

Consequentemente, um objectivo da desenvolver um processo e amostra do marcador de tumor RSP, como um de malignidade, o qual é simples, uso, sensível e seguro. - 14 -

Um outro objectivo da invenção consiste em desenvolver um processo e amostra para detecção de presença de marcadores de tumor RSP em fluídos biológicos pela captura do marcador a partir dos fluídos para um substracto e, subsequentemente, detec-tar a presença de RSP no substracto.

Um outro obejectivo da invenção é ainda o de desenvolver um processo e amostra para detectar a presença de malignidade compreendendo a captura do marcador de tumor RSP de um fluído biológico contendo células cancerosas para um substracto e subsequente detecção da presença do marcador de tumor RSP sobre o substracto como um indicador de presença de malignidade.

Outro objectivo da invenção é ainda o de obter um processo e amostra para capturar o marcador de tumores RSP a partir de um fluído biológico com anti-corpos anti-RSP escolhidos do grupo formado por anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de afinidade purificada e suas misturas.

Um outro objectivo da presente invenção consiste em desenvolver um processo e amostra para capturar o marcador de tumores RSP a partir de um fluído biológico com uma amostra de ácido ribonucleico de transferência (ARNt) e subsequentemente detectar a presença da amostra com um indicador de presença de RSP.

Um outro objectivo da presente invenção é o de capturar o marcador de tumores RSP a partir de um fluído biológico num substracto com o ARNt específico para uma zona receptiva do amino-acil ARNt de transferência síntese no marcador.

Outro objectivo da invenção é o de desenvolver um processo para detectar a presença do marcador de tumores RSP em fluídos biológicos de pacientes com suspeitas de malignidade que uti- 15 n a ff 4 liza técnicas de desenvolvimento da côr envolvendo ligação di recta ou indirecta de moléculas reactivas de côr ao marcador de tumores RSP.

Os objectivos anteriormente descritos são alcançados de acordo com a presente invenção através do desenvolvimento dum processo para detectar a presença de RSP em fluídos biológicos de pacientes que possivelmente têm tumores malignos; tal processo compreende a capturação do RSP no referido fluído, para um substracto e a detecção da presença do RSP no substracto. 0 processo pode ser usado para detectar a presença de células cancerosas malignas em seres humanos ou animais, pela obtenção duma amostra do fluído corporal dum ser humano ou animal a ensaiar, capturando o RSP no referido fluído, inserindo-o num substracto e detectando a presença de RSP no substracto.

De acordo com uma forma da presente invenção, o RSP é capturado a partir da amostra do fluído corporal com anticorpos anti-RSP, escolhidos do grupo formado por anticorpos monoclo-nais, anticorpos policlonais, anticorpos de afinidade purificada e suas misturas. A partir daqui a presença de RSP no subs tracto é detectada, por exemplo, usando técnicas de desenvolvimento de côr. De acordo com uma outra forma da presente invenção, o RSP é capturado da amostra de fluído corporal fazendo contactar o RSP na amostra do referido fluído com uma amostra de ARNt marcada para ligar o ARNt à zona reactiva do aminoacil-ARNde transferência-sintetase no marcador RSP e detectar a presença de moléculas sintetase no RSP.

Numa forma preferida da invenção, tanto a captura como a detecção do RSP ou detecção do RSP já capturado no substracto são levadas a cabo usando uma amostra de RSP compreendendo ARNt específico para a zona reactiva do aminoacil-ARN de transferência-sintetase no RSP. Desejavelmente, a amostra é uma molécula ligada que, através da componente ARNt, se liga '/ /

0

16 è zona reactiva do aminoacil-ARN de transferência sintetase (dobra do dinucleotídeo) no RSP e inclui moléculas secundárias para desenvolvimento de côr visível. Uma amostra preferida compreende as moléculas ligadas: ARNt-fotobiotina-estrep-tavidina-alcalina fosfatase. Uma outra amostra preferida compreende ARNt-fotobiotina-avidina-glucose oxidase.

Numa outra forma da inven que compreende pelo menos lhidos do grupo formado p pos policlonais e anticor os referidos anticorpos 1 cuja presença é adaptada de presença do marcador d ção é desenvolvida uma amostra RSP um ou mais anticorpos anti-RSP esco-or: anticorpos monoclonais, anticorpos de afinidade purificada, estando igados a um marcador de amostras, para ser detectada com um indicador e RSP de tumor.

Outros objectivos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes aos peritos na técnica a partir da descrição deta lhada que se segue, desenhos, exemplos e reivindicações anexadas .

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra, em forma de diagrama, a zona receptora do RSP aminoacil-ARNt sintetase e uma forma duma amostra RSP específica para essa zona. A Figura 2 ilustra, sob a forma de diagrama, a ligação RSP ao vaso reaccional via superfícies pré tratadas, mesmo antes da ligação das amostras ARN^ às zonas receptivas do aminoacil-ARNt sintetase no RSP. A Figura 3 ilustra, sob a forma de diagrama, o RSP da Figura 2

, - Ί li as zonas receptoras após reacção com as amostras ARNt nas su

Melhor Forma de Realização da Invenção

De acordo com a presente invenção obtém-se um processo para determinação da presença de marcadores de RSP de tumor em fluídos biológicos e para detecção da presença de malignidade em seres humanos ou animais, que envolve a captura do marcador de RSP do fluído sobre um substracto e, subsequentemente, detecção da presença de marcadores de RSP no substracto como um indicador de presença de malignidade. Uma realização preferida da presente invenção envolve o uso dum anticorpo anti-RSP (rspAb) para capturar o marcador de RSP de tumor no fluído corporal sobre um substracto. Isto é possível devido à afinidade do rspAB ao marcador de RSP de tumor que origina a ligação entre estes dois últimos e, consequentemente, alcança-se a captura desejada de RSP no fluído. Uma outra realização preferida da invenção envolve o uso duma amostra ARNt que se liga a uma zona muito específica, à zona reactiva de aminoacil-ARNt de transferência-sintetase, no RSP. Uma tal amostra não é apenas capaz de capturar o marcador de RSP de tumores dentro dum fluído corporal sobre um substracto, mas também pode detectar a presença de RSP no substracto incluindo na amostra apropriada moléculas secundárias que facilitam a detecção, por exemplo, desenvolvendo coloração visível. A apreciação de que a captura e detecção do marcador de RSP de tumor é um processo eficaz, rigoroso e seguro para detectar a presença de células cancerosas malignas em seres humanos ou animais é um resultado direc-to do reconhecimento de que o RSP é libertado extracelularmento pelas células cancerosas, e são, consequentemente, detectáveis em soro ou outros fluídos corporais. 18 - A capacidade dos anticorpos anti-RSP para reconhecerem e identificarem o RSP em fluídos corporais ,' tais como fluídos corporais de seres humanos ou animais, e capturarem o RSP desses fluídos, e o uso deste processo para detectar células cancerosas malignas em fluídos corporais de seres humanos ou animai^, tal como soro canceroso, está claramente ilustrada no Exemplo I. 0 objectivo do Exemplo I é o de demonstrar que um anticorpo anti-RSP (rspAB) pode capturar de forma eficaz o RSP a partir de soro do cancro. 0 Exemplo I foi conduzido recuperando rspAB por meio de técnicas de purificação de afinidade, a partir de um cancro dum paciente que já não libertava RSP, mas que ainda possuia anticorpos anti-RSP. Se o rspAB for efectivo, o RSP capturado será detectado por meio de técnicas de desenvolvimento de coloração, tal como um sistema de detecção da amostra ARNt, como é desvendado mais promenorizadamente a seguir.

Exemplo I 1. Técnicas de Purificação de Afinidade a) Resina 4-B Shefarose brometo de cianogénio foi carregado numa coluna e o RSP foi ligado à resina. A preparação da resina, o carregamento da coluna e a ligação do antigene (RSP) são técnicas padrão bem conhecidas. b) do ualt 1 ml de soro dum paciente com cancro foi misturado com 3 ml dum tampão de borato com pH 8,5 e foi então passa através da coluna a temperatura e pressão ambientes. Q quer rspAB no soro reagiu com, e ligou-se ao, antigene 19

RSP na coluna. As proteínas do soro não ligadas foram lavadas a partir da coluna com uma solução salina de fosfato tamponada (PBS) . Imterrompeu-se a lavagem quando se obteve uma leitura de densidade óptica (O.D.) de observância a 280 nm num espectro fotdmetro UV. A ligação rspAb foi eluída a partir da coluna com aliquo-tas de 2 ml de cloreto de magnésio 4,0 Μ. A O.D. a 280 nm de cada aliquota de eluente foi lida no espectrofoto-metro com a obtenção dos seguintes resultados: eluição o.D. 1 2 3 4 0,04 0,02 0,02 0, ol A diminuição do nível de proteína (rspAb) indicou que o volume de rspAb se encontrava nas primeiras quatro eluições. Estas quatro eluições foram removidas, colocadas num tubo de diálise para um peso molecular de 10.000 e dialisadas contra uma solução de cloreto de sódio a 85% a 4°C, durante 18 horas iniciais, e posterior-mente por um período final de 2,5 horas, sobre PBS de pH 7,5 para remoção do excesso de sal. 0 volume de 15 ml resultante do material dializado foi concentrado a 2,5 ml com centrifugação numa célula de ultrafiltração AMICON com uma membrana PM-10. A O.D. do concentrado do anticorpo foi comparada a uma curva padrão de proteínas e observou-se ser equivalente a 0,1 mg/ml de proteínas. Este material constituiu o rspAIJ purificado de afinidade.

2. Sistema de Ensaio com o anticorpo anti-RSP a) 0 rspAB foi aplicado a uma membrana de nitrocelulose (J ) numa vareta de plástico, foi transformado num bloco com soro e fez-se então reagir com 0,1 ml de soro dum paciente com cancro, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. A membrana foi manchada a seco. Posteriormente, fez-se reagir durante 15 minutos com o sistema de detec-ção da amostra ARNt, que será a partir daqui descrito em detalhe. As reacções por fases cuidadosas são ilustradas como se segue:

i. rspAB é colocado numa membrana de nitrocelulose -rspAB ii faz-se reagir a membrana com soro de um paciente com cancro que compreende RSP:

=>J -rspAB-RSP iii o RSP da membrana reage com a mistura amostra ARNt =} ^ -rspAB-RSP-ARNt=formazano

As reacções resultaram na formação duma mancha cinzenta muito escura, quase negra, caracteristica do formazano, onde o anticorpo anti-RSP foi aplicado à membrana.

Este exemplo ilustra que o RSP foi capturado do soro de cancro pelo rspAB afixado na membrana. Ilustra ainda que o rspAB foi configurado com sucesso num sistema para detecção de mali gnidade, a partir duma aliquota do soro dum paciente com cancro .

Exemplo II

Usando anticorpos policlonais podem ser obtidos os resultados exactamente iguais aos apresentados no Exemplo I. A descrição que se segue apresenta uma técnica ilustrativa para obtenção de anticorpos policlonais a partir de coelhos.

Produção de anticorpos policlonais anti-RSP em coelhos

Os anticorpos anti-RSP têm sido produzidos para desenvolver posteriormente anticorpos baseados no sistema de detecção usando para tal os protocolos que se seguem: 1. Técnicas de purificação do antigene (RSP) a) Preparação do extracto RSP crude A IgG e o RSP de 300 ml de soro duma paciente com cancro da mama foram precipitados (ppt) a partir do soro, misturando igual volume de sulfato de amónia saturado. b) Preparação do RSP ppt a partir de soro i. - 0 ppt foi dissolvido num "tampão padrão" (Tris-HC1 50 mM, pH 7,5, ditiotreitol 1 mM, glicerol a 20% v/v e azeto de sódio 0,02% p/v). ii. - 0 componente RSP/IgG foi re-precipitado com um volume igual de sulfato de amónia saturado. 0 ppt foi redissol vido com uma solução tampão e reprecipitado e novamente redissolvido. i·'· β 22

iii. - A mistura RSP/IgG dissolvida foi dializada numa membrana de diálise de 10.000MW sobre uma solução salina de fosfato tamponada (pH 7,5) com azeto de sódio a 0,02% a 4 °C, durante 18 horas.

Filtração a gel em Resina Biogel A-0,5m A mistura RSP (lQml) dializada foi concentrada e fraccio-nada numa coluna de 4x8 cm revestida com resina Biogel A-0,5. A resina foi condicionada com um tampão padrão antes de ser usada. As fracções eluídas foram testadas com o sistema amostra ARNt, descrito em mais promenor a partir daqui, para determinar que fracções compreendiam o componente RSP.

Cromatografia com Hidroxilapatite

As fracções que compreendem o RSP foram recuperadas e dializadas então sobre fosfato de potássio 25mM (pH 6,8) compreendendo ditiotreitol 1 mH θ glicerol a 20% durante 18 horas, a 4°C. A mistura RSP dializada foi então concentrada e fraccionada numa coluna revestida com 25 ml de hidroxilapatite, pré-condicionada com o mesmo tampão fosfato. 0 RSP foi eluído com 100 ml de um tampão fosfato de concentração compreendida no intervalo entre lOOmM a 150mM. As eluições foram ensaiadas com o sistema amostra ARNt acima mencionado, para determinar qual delas compreendia o componente RSP.

Cromatografia DEAE Affi-Gel Azul

As fracções que compreendem RSP foram removidas e depois dializadas sobre um tampão padrão durante 18 horas a 4°C A mistura RSP dializada foi então concentrada e fraccio- nada numa coluna revestida com 20 ml DEAE Affi-Gel Azul equilibrada com o tampão padrão. A coluna foi lavada com 50 ml do tampão padrão após o que o RSP foi eluído com 100 ml a 130 ml de um gradiente de cloreto de potássio a uma concentração compreendida no intervalo entre 0M a 0,6 M. As fracções activas, com base na análise de amos tra de ARNt, foram removidas e foram então dializadas sobre o tampão padrão, durante 18 horas, a 4°C. 0 componente RSP então dializado foi concentrado por centrifugação numa célula AMIC0N com uma membrana PM-10, para se obter uma concentração final de proteínas de 5 mg/ml numa O.D. a 280 nm num espectrofotómetro de U.V.

Critério de Pureza 0 RSP purificado foi examinado por electroforese em gel poliacrilamida sob condições não-desnaturantes. 0 resultado foi uma banda simples caracteristica na posição 600.000 - 675.000 mw.

Imunização de Coelhos

Antisoro RSP policlonal 0 antisoro específico para RSP é produzido usando uma modificação ao processo de Winberry e Holten, "Rat Liver Glucose-6-Ρ Dehydrogenase". Dietary Regulation of the Rate of Synthesis". The Journal of Biological Chemistry, volume 252, N° 21, Páginas 7796 - 7801 (1977).

Protocolo de imunização í. - Imunização primária com 100 ug do imunogene(RSP)

em igual v/v com o adjuvante de Freund completo. Injecções subcutâneas (SQ) em múltiplos sítios. ii - Intervalo de três semanas. iii - Imunização secundária com 50 ug do imunogene em igual v/v com o adjuvante de Freund incompleto. Injecções subcutâneas (SQ) em múltiplas zonas. iv - Intervalo de nove a dez dias. v - Ensaio de hemorragia ou produção de hemorragia em função do nível de rspAB a partir do ensaio do lote de soro. vi.- Quatorze a dezoito dias de intervalo vii.- Terceira imunização com 50 ug de imunogene em igual v/v de adjuvante de Freund incompleto. Injecções SQ em múltiplas zonas. viii.- Nove a onze dias de intervalo. ix.- Produção sanguínea.

c) Purificação e preparação de rspAB i.- A IgG é separada das outras imunoglobulinas por meio de cromatografia de afinidade em A-Sepha-rose. ii.- 0 ácido eluído e IgG são neutralizados e as frac ções que possuem uma densidade dptica superior a 0,01 a 280 nm são removidas e concentradas por - 25 - iy αλ J yf centrifugação para aproximadamente 1 mg de proteína por ml numa célula AMICON com uma membrana PM--10. iii.- A preparação rspAB concentrada e purificada resultante é armazenada a 5°C e conservada com azeto de sódio a 0,02%. Este material pode ser usado no processo de detecção do cancro (RSP) da presente invenção.

Na prática da presente invenção o rspAB pode ser fixado a qual quer substracto comummente usado, tais como: massas acrílicas, membranas, massas latex, metais (isto é, massas de aço, ouro coloidal, etc.) superfícies de vidro, superfícies de vários polímeros, e semelhantes, para capturar ou reter o RSP numa superfície para fluídos corporais de sres humanos ou animais. Exemplos de tais fluídos corporais são: soro, urina, lágrimas, expectoração, saliva, semen, fluídos das glandulas mamárias, bem como lavagem de áreas acessíveis como pulmonares, cervicais, lavagem colónica ou a partir de células ou de lisatos de tecidos ou meios de cultura e semelhantes. 0 RSP capturado pode ser detectado a partir de qualquer um dos métodos de detecção comummente usados, tais como marcadores de fluorescência, rádioisótopos, enzimas de catálise e sistemas de marcação bio-ou quimio-luminiscentes, ou com amostras, tais como as de ARN e ADN desenvolvidas contra o componente ácido nucleico do RSP ou com a amostra ARNt descrita no Pedido de Depósito copendente do mesmo requerente. Por exemplo, o rspAB pode ser ligado com qualquer um dos sistemas de detecção comummente usados, para formar uma amostra vantajosa para uso de acordo com a presente invenção. Logo, pode ser ligado a marcadores de fluorescência tais como de fluoresceína, rodamina, vermelho Texas, brometo de etídio, corantes acridino, e semelhantes, e pode ser lido com um espectrofotometro, microscópio de fluo- rescência ou espectrofotdmetro U.V.. Além disso, ele pode ser ligado com qualquer dos isótopos e ser detectado com um contador beta ou gama, ou com autoradiografia, dependendo do isótopo usado e da configuração do processo de ensaio. 0 anticorpo anti-RSP pode também ser ligado a biotina ou fotobiotina e, consequentemente, pode ser ligado com avidina, estreptavi-dina, extravidina, etc. e ligado a qualquer uma das enzimas usadas no processo de detecção ELISA, por exemplo glucose oxi-dase, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano picante etc.. Estes anticorpos ligados a enzimas podem também ser usados com qualquer processo para amplificação de pontos terminais coloridos, por exemplo, a fosfatase alcalina iniciou reacções catalíticas em sequências duplas com a formação simultânea de formazano e indigo, etc..

As amostras são baseadas em afinidades específicas e únicas de um tipo de molécula para outro. Exemplos de moléculas co-mumente usadas como amostras são: afinidades antigene : anticorpo, afinidades ARN ou ADN hibridizado : ADN, afinidades avidina : biotina e afinidade de Proteína A ou Proteína G para imunoglobulinas específicas. Logo, a captura de RSP pelo rspAB é um exemplo de uma afinidade antigene : anticorpo. Uma outra afinidade altamente específica é a da zona receptora numa molécula enzima para o seu substrato. Esta afinidade nunca foi explorada como amostra, porque (1) o substrato é frequentemento uma molécula pequena que não conduz por si só à marcação com um marcador, (2) o substrato é rapidamente convertido pelo enzima num produto, e (3) o produto é rapidamente libertado da molécula enzima. No entanto, foi agora determinado que uma amostra pode ser desenvolvida para certas afinidades enzima/ /substrato, tal como com o RSP, em que estas condições não se aplicam. Na ausência tanto de iões de magnésio, como de trifosfato de adenosina (ATP), as zonas receptoras específicas no componente enzima do RSP podem ligar os ARNt específicos, 27 -

com ου sem ο seu aminoácido cognato, sem que se forme um produto libertável. A ligação ARNt com a fosfatase alcalina empregada com estreptavidina, após o que uma amostra liga selec-tivamente com a sua estrutura sintetase cognata no RSP, a sua presença pode ser demonstrada através de desenvolvimento de coloração visível por meio de uma reacção substracto/fosfata-se alcalina. Exemplo de técnicas de desenvolvimento de coloração sensível para esta enzima são a formação simultânea de indigo e formazano.

De acordo com o presente processo, determina-se a presença de RSP através da remoção de uma amostra de fluído biológico de um indivíduo submetido a um exame. Ao contrário dos processos anteriores, no entanto, na detecção de RSP, não importa qual o tipo de cancro suspeitado ou qual o fluído biológico usado. Após ter sido colhido o fluído biológico é capturado o RSP do fluído sobre um substracto usando para tal um anticorpo anti-RSP escolhido num ou mais anticorpos monoclonais, policlonais ou de afinidade purificada, como descrito e ilustrado nos Exemplos I e II. Consequentemente, a presença de RSP no substracto é, de preferência, detectada usando a amostra ARNt descrita a seguir. Em alternativa, de acordo com uma outra realização preferida da invenção o RSP no fluído biológico, tanto é capturado no substracto, como detectado usando a amostra de ARNt.

Tal como é ilustrado por meio de um diagrama na Figura 1, a amostra ARNt compreende um ARNt específico para a zona reac-tiva de um aminoacil-ARN de transferência-sintetase no marcador de RSP de tumor. Desejavelmente, o ARNt tem sido marcado para subsequente detecção, como com fotobiotina. A amostra RNt liga-se à zona reactiva do aminoacil-ARNt sintetase no no RSP. A detecção do RSP marcado ARNt é facilitada ligando- 28

se estreptavidina à fotobiotina marcada com ARNt e fosfatase alcalina à estreptavidina. Finalmente, um agente de desenvolvimento de coloração tal como a mistura reaccional fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/azul de nitro-tetrazólio reage com a fosfatase alcalina na amostra ARNt para desenvolver uma coloração distinta possuindo uma intensidade correlecionada à quantidade de RSP libertada por parte das células cancerosas no fluído biológico. Em particular a formação de coloração azul/violeta neste sistema biotina-estreptavidina-fosfata-se alcalina é indicativa de presença do marcador de RSP de tumor e, consequentemente, de uma malignidade. A determinação quantitativa é alcançada pela intensidade da côr produzida. Assim, o nigligível para pequena produção de RSP observado com células não malignas é frequentemente directiva de magnitude mais pequena do que a produção de RSP observada com células malignas e existe pequena dificuldade na distinção entre o negligível e a produção significativa de RSP via comparação visual de intensidade colorimétrica. E, pois, digno de nota que a amostra rspAB pode ser formada da mesma forma que a amostra ARNt aqui descrita e pode ser quimicamente ilustrada, como na Figura 1, excepto que a componente ARNt da amostra ali ilustrada deverá ser substituída por um rspAB.

Desejavelmente, o marcador de RSP de tumor é capturado do fluí do biológico, de preferência usando rspAB, e é marcado e ligado com moléculas secundárias apropriadas, para subsequente“-mente desenvolverem côr visível ao reagirem com o marcador de tumor, numa realização preferida da invenção, com uma amostra ARNt-fotobiotina-estreptavidina-fosfatase alcalina, como mostra a Figura 1. No entanto, numa outra realização preferida, é usada a amostra ARNt em vez de rspAB para capturar, bem como para detectar, o RSP, fazendo reagir o marcador de tumor com a amostra ARNt-fotobiotina-estreptavidina-fosfatase alcalina. Quer seja utilizado o rspAB ou o ARNt para capturar RSP de um fluído biológico, a amostra ARNt é mais eficaz e é usa- 29

da preferencialmente para detectar a presença de RSP. Logo, num estado cego envolvendo soro de sangue de pacientes bem caracterizados num diagnóstico clínico, a amostra ARNt identi ficou correctamente 71/73 soros cancerosos para uma sensibili dade de 97,3% e 53/62 soros não cancerosos para uma especificidade de 85,5%.

Um exemplo do uso da amostra ARNt para detecção de RSP num substracto é a realização da invenção, em que a amostra ARNt é usada tanto para capturar, como para detectar. Usando uma amostra de soro de sangue colhida dum paciente submetido a exame, coloca-se uma aliquota de soro dentro duma placa de microtítulo preparada, que é revestida ou pré-tratada ao longo da sua base e ou paredes com ARNt. Devido à afinidade entre o ARNt e as zonas receptoras do aminoacil-ARN de transfe-rência-sintetase no RSP, qualquer RSP nas amostras liga-se às superfícies das paredes pré-tratadas com ARNt. A placa é lavada várias vezes com água ou uma solução fosfato tamponada (PBS), pH 7,4, para lavagem de todas as amostras de soro de sangue da placa, excepto para a ligação do RSP às superfícies da parede. Uma quantidade da amostra ARNt, de acordo com a presente invenção, compreendendo moléculas ligadas de ARNt--fotobiotina-estreptavidina-fosfatase alcalina, como mostra a Figura 1, é adicionada à placa em que a molécula de ARNt reage com e liga-se às zonas reactivas do aminoacil-ARN de transferência-sintetase adicional no RSP na placa. A condição na placa mesmo antes de, e logo depois de, a reacção entre a amostra ARNt e o RSP está ilustrada, respectivamente, nas Figuras 2 e 3. A Figura 2 mostra que os marcadores de RSP se ligam ao ARNt pré-revestido na base da placa e às amostras de ARNt que não reagiram de acordo com a presente invenção imediatamente antes de se ligar à zona reactiva do RSP. A Figura 3 ilustra os marcadores de RSP após a reacção e represen ta as amostras ARNt ligadas às zonas reactivas disponíveis 30

no RSP. Após as ligações das amostras de ARNt às zonas recep-toras do RSP, a placa é novamente lavada com água ou PBS, para remover da placa as amostras que não reagiram. Nesta junção resta apenas desenvolver uma indicação visual da quantidade de RSP na placa. Tal é alcançado no sistema de fotobiotina--estreptavidina -fosfatase alcalina adicionando à placa fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIp/azul de nitro tetrazd-lio (NBT) mistura de reacçãp de coloração.Dependendo da concentração de RSP dentro da placa, o sistema de coloração produzirá uma indicação de côr visual variando desde incolor, onde não foram capturadas nenhumas quantidades ou foram capturadas quantidades não detectáveis de RSP no fluído biológico, até uma côr azul/violeta muito forte, onde foram capturadas quantidades significativas de RSP. Uma medição quantitativa da intensidade da côr pode ser determinada com um espectrofotdmetro. Desenvolvendo o administrador teste com valores numéricos que indica claramente a intensidade da côr limiar representando a presença de malignidade, é relativamente simples avaliar os resultados do ensaio para detecção de RSP.

Exemplo III

Foi realizada uma experiência para (1) confirmar que as partículas de forma anelar compreendiam enzimas com dobras dinu-cleotídeos, isto é, que compreendiam aminoacil-ARNt-sintetase, e (2) confirmar que um substracto, ARNt, se liga selectivamen-te a essa zona receptora. Uma coluna de afinidade para a dobra dinucleotídeo em proteínas (as enzimas que ligam nucleo-tídeos como substractos), compreendendo Affigel Blue (malha 100-200, Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) foi estabelecida de acordo com as técnicas de Thompson, et al., (Proceedings of the National Academy of Science, USA, 72:669-672, 1975).

0 meio de cultura condicionado pelo crescimento de PC3, células do carcinoma da próstata de seres humanos que, como se sabe compreende RSP, foi passado através de coluna e eluído com uma solução salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4. Aliquotas de 2 ml do fluído de eluição foram ensaiadas em relação ao seu teor em proteínas, usando o método de Bradford (Analytical Biochemistry, 72:248, 1976). Após terem sido removidas todas as espécies de proteínas isentas de dobras de di- -2 nucleotideos, introduziu-se na coluna lmg/ml de ARNt (4x10 mM) Foi registado uma aumento significativo no teor de proteínas nas fracções de eluição subsequentes, indicando que o ARNt se liga preferencialmente às dobras dinucleotídeo nas molécula?; sintetase e dissociam o RSP de coluna Affigel Blue. Este resultado não poderia ter sido obtido a não ser que estivessem presentes as condições acima descritas estava presente uma dobra de dinucleotideo que revelou existir afinidade para ARNt.

Exemplo IV

Foi realizada uma experiência para demonstrar que o ARNt marca do com fotobiotina e estreptavidina-fosfatase alcalina, usando o método de Mierendorf, (Promega Notes, 1988), ligaria com a ligação RSP à base das placas de microtítulo e poderiam ser detectadas como uma alteração de cor azul/violeta na placa.

As placas de microtítulo Immulon revestidas ao longo da superfície base da placa com ARNt (ver Figura 2) foram enchidas com 100 ul do meio condicionado por células de carcinoma pros-tático PCg e concentradas 4 vezes com um microconcentrador Amicon centricon 30. 0 RSP no meio foi, consequentemente, concentrado quatro vezes. Trinta minutos depois o meio foi removi do e as placas foram lavadas 10 vezes com uma solução salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7,4. 0 RSP, por reacção com o 32

ARNt, foi consequentemente ligado ao fundo das placas. Dez microlitros de ARNt marcado com fotobiotina foram adicionados às placas de tratamento, enquanto 10 microlitros do tampão Tris, pH 7,4 isento de ARNt, foi adicionado às placas de controlo. Trinta minutos depois as placas foram lavadas à temperatura ambiente, cinco vezes com PBS. Nesta fase, o ARNt ligou se à zona de reacção do aminoacil-ARN de transferência sinte-tase (ver a Figura 3) enquanto, nas placas tratadas com Tris isentas de ARNt, a zona reaccional manteve-se intacta, não reagiu.

Vinte e cinco microlitros de 0,1 mg/ml de estreptavidina foram adicionados a todas as placas. Trinta minutos depois, à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 10 vezes com PBS. A estreptavidina ligou-se com a fotobiotina no ARNt, mas lavou-se para remoção das placas sem o ARNt.

Vinte e cinco microlitros de fosfatase alcalina biotinilatada 0,1 mg/ml foram adicionados a todas as placas. Trinta minutos depois, à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 10 vezes com PBS. Nesta fase, as moléculas de fosfatase alcalina--biotina estavam ligadas à estreptavidina no ARNt fotobioti-nizado ligado ao RSP no fundo das placas. Esta fase completou a amostra (Figura 1). A fosfatase alcalina foi removida por lavagem das placas isentas de ARNt.

Finalmente, adicionaram-se a cada placa 100 microlitros de mistura reaccional de coloração 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/Azul de nitro tetrazólio (NBT). A coloração desenvolveu em 45 a 60 minutos. 0 RSP tratado com ARNt desenvolveu uma côr reaccional azul-violeta forte enquanto que o controlo negativo se manteve sem mancha. 33

Este estudo demonstrou conclusivamente que RSP possui uma zona reactiva específica para ARNt, e que a amostra ARNt, como descrita, ligar-se-à com o RSP rigorosamente identificado. Como tal, a amostra proporciona um processo único para detectar malignidade em seres humanos e animais.

Um outro método desejável para se detectar o RSP é o uso de 2 um segundo anticorpo anti-RSP (rspAB ) que está ligado ao RSP: rspAB resultante a partir da captura do RSP de um fluído corporal usando um rspAB, como aqui foi descrito. De acordo com este processo de detecção é preparado um agrupamento substrac-

2 2 to-rspAB no estado sólido, em que é usado o anticorpo rspAB para aglutinar ou precipitar as moléculas agrupadas. Remove-se o precipitado por filtração com filtros policarbonados límpidos e a quantidade do precipitado é então medida por comparação com um mapa de cores padrão, desenvolvido com várias amostras de RSP, ou é quantificada pela medição com um espec-trdmetro de reflexão diferencial. Um substracto no estado sólido que que é útil é um leito de latex (negro) colorido, que produz um precipitado em lâminas de negro, dependendo da quantidade do RSP presente no soro. Um exemplo da prática deste método é abaixo apresentado. a) rspAB estão ligados aos leitos de latex negro carboxila-tado (0), por exemplo = 0 - rspAB. b) 0 Ο-rspAB reage com o soro teste em tubos de microcentri-fugação durante um período de tempo após o qual os leitos são removidos por centrifugação do soro. Os leitos são lavados várias vezes com PBS (solução salina tampo-nada de fosfato) e removidos por centrifugação do PBS após cada lavagem.

As reacções resultantes são: * 34

soro de cancro = 0-rspAB : RSP

soro não canceroso = 0-rspAB 2 c) Os leitos, que reagirem, reagem agora com rspAB nos tubos de microcentrifugação, durante um certo período de tempo, após o qual os leitos são removidos por centrifugação de mistura reaccional e as moléculas não ligadas são removidas por lavagem, como acima se descreveu em b) .

As reacções resultantes são: 2 soro de cancro: = 0-rspAB:RSP:rspAB (precipitado) soros não cancerosos: = 0-rspAB (não precipitado) d) 0 precipitado é filtrado através de uma membrana filtro de policarbonato límpida e faz-se uma medição. 0 leito de latex não precipitado flui através da membrana mas o agregado leito de latex precipitado-anticorpo: RSP: anticorpo não flui. Consequentemente, os leitos podem ser separados muito fácilmente a partir do precipitado.

Enquanto o processo e o sistema aqui descritos utilizam leitos de latex coloridos, apreciar-se-à que o precipitado colorido, o precipitado fluorescente ou o precipitado radioactivo podem 2 também ser utilizados para marcar o rspAB com as moléculas apropriadas (por exemplo, qualquer partícula intensamente colorida, tal como furmazano, carbono, etc.; moléculas fluorescentes tais como rodamina, vermelho Texas, brometo de etídio, 125 3 14 fluorescina, etc.; e, isótopos tais como I, H, C, etc.).

Dutras variações do processo e sistema acima ilustrados, o rspAB não necessita de ser ligado a um substracto no estado 2 sólido e o rspAB:RSP:rspAB ou, simplesmente, e as moléculas que reagirem com rspAB:RSP podem ser removidas por precipita-

ção , a partir do soro um dos sistemas indic ser um qualquer dos a filtrai; jão e técn icas , com um anticorpo anti-rspAB. Qualquer adores préviamente aqui descritos pode nticorpos. Por outro lado, a lavagem, de quantificação serão as acima descritas.

Enquanto todas as propriedades bioquímicas do RSP não foram ainda decifradas, é antecipado que cada um dos segmentos que formam o RSP possui actividade aminoacil-ARNase para uma combinação específica amino ARNt:aminoácido. Consequentemente, qualquer um dos ARNt ou qualquer combinação de ARNt poderia ser usada para introdução na amostra da presente invenção.

Além disso, tanto os ARNt semelhantes, como os ARNt diferentes, podem ser usados na amostra e ao longo das superfícies pré-tratadas de ARNt do vaso reaccional. Além disso, é evidente que a amostra poderia fácilmente ser produzida por meio dos sistemas de detecção comummente usados diferentes do sistema côr-biotina-estreptavidina-fosfatase alcalina. Por exemplo, o ARNt pode ser ligado aos marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína, rodamina, vermelho de Texas, brometo de etídio, corantes de acridina, etc. e ser lido com um espectrofotémetro, microscópio fluorescente ou espectrofotdmetro de luz ultra violeta. Q ARN poderia também ser ligado com qualquer dos isótc pos radioactivos e ser detectado com um contador beta ou gama, ou com autoradiografia dependendo dos isotopos usados. Além disso, enquanto o sistema descrito em que ocorre o desenvolvimento de coloração na fase líquida do vaso reaccional oferece maior sensibilidade, o sistema de detecção amostra RSP-ARNt pode também ser adaptado para configuração substracto sólidas tais como membranas, vidro, superfícies de polímeros vários, leitos de latex e células de sangue vermelho (nos ensaios de aglutinação), e metais, tais como ouro coloidal, ou outros sistemas enzimá.ticos, tais como fosfatase, peroxidase horse radish, glucose oxidase e sistemas baseados em urease.

Aplicabilidade Industrial

Os processos e amostras da presente invenção são vastamente aplicáveis para providenciar uma vasta visualisação a fim de detectar precocemente o cancro, um sistema de monitorização simples para pacientes cancerosos submetidos a tratamento e um grandioso melhoramento do processo de visualisação para carcinogenes industriais e ambientais. Mais significativo talvez seja a capacidade de utilizar os processos para juntar as amostras de RSP num conjunto para ensaio que oferece aos físicos um sistema rápido, sensível, seguro e não onoroso, para detectar RSP em fluídos corporais de indivíduos durante exames físicos de rotina ou durante o tratamento de pacientes com cancro submetidos a radiações ou quimioterapia. Se se obtiver um resultado de ensaio positivo em indivíduos aparentemente saudáveis, será seguro repetir o ensaio. Se o segundo teste confirmar a presença de RSP, outros testes podem ser levados a cabo (por exemplo, Imagem RMN) para localizar e identificar o tumor no organismo. Neste ponto um curso de terapia será recomendado, para remoção ou destruição do tecido maligno e o RSP pode ser usado para monitorizar o sucesso da terapia. A disponibilidade dum teste diagnóstico in vitro, simples e de fácil manuseamento, para actividade carcinogénica em zona corporal do paciente é a esperança de tornar possível a detec-ção precoce de actividade cancerosa e de monitorizar com segurança o tratamento do cancro. Quando se toma consciência de que existem, pelo menos, cinco milhões de pessoas com uma história de cancro que devem ser examinadas periodicamente e uma quantidade adicional de alguns milhões diagnosticados com novos cancros e casos activos cada ano, a magnitude da necessidade de um teste diagnóstico rápido e eficaz torna-se aparente. Adicionalmente, a disponibilidade de um teste de fluídos biológicos em vez do actual teste de mancha "Pap", incómodo e ferquentemente embaraçante, será fácil encorajar t 37 - / , ’ΰ mulheres correntemente relutantes a realizar o teste RSP, pelo menos uma vez por ano, logo evidenciando em seguida a necessidade e utilidade de tal teste.

Claims (4)

1. BA s

   REIVINDICAÇÕES 1§ - Processo para a preparação de uma composição para a detec·· ção de partículas com a forma de anel (RSP) mediante ligação selectiva com o marcador de tumores com RSP a fim de facilitar a detecção da sua presença num fluído biológico, caracterizado pelo facto de compreender associar-se um primeiro constituinte adaptado para se ligar ou se associar com o citado marcador de tumor com um marcador do tumor ligado ao referido primeiro constituinte da amostra, de forma que a presença do citado marcador seria apropriada para ser facilmente detectada como um sinal indicador da existência do marcador RSP de tumores.
2. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citado primeiro constituinte da composição compreender um anticorpo anti-RSP escolhido do grupo.formado por anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de afinidade purificados e suas misturas. 3ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido primeiro constituinte da composição compreender ácido ribonucleíco de transferência (tARN) específico da zona reactiva da aminoacil-tARN-síntetase do mencionado marcador. 4§ _ Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o citado primeiro constituinte da compo-· sição ser ligado directa ou indirectamente a pelo menos uma molécula secundária reactiva com um corante, adequado para desenvolver uma cor visível como indicação da presença do marcador de um tumor com RSP. 39 'Φ

   J 5ã - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido marcador da composição compreender as moléculas ligadas de tARN-fotobiotina-estreptavidina -fos-fatase alcalina. 6§ - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o citado primeiro constituinte da composição ser ligado, directa ou indirectamente, a moléculas secundárias adequadas para desenvolverem fluorescência e indicarem a presença do marcador de RSP de um tumor. 7§ - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o primeiro constituinte da composição ser ligado, directa ou indirectamente, a um isótopo radio-activo para indicar a presença do marcador de RSP de um tumor. - Processo para detectar a presença do marcador de partículas com a forma anelar (RSP) de tumores em fluídos biológicos, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em a) se capturar o marcador de RSP de tumor presente no referido fluído sobre um substracto; e b) se detectar a presença do marcador de RSP do tumor no mencionado substracto, mediante a utilização duma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7. 9ã - Processo para detectar a presença de um tumor maligno em seres humanos ou animais, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em a) se obter uma amostra do fluído corporal de um ser huma·· i 4 40 t i.

   no ou de um animal para ser examinada quanto è presença de um tumor maligno; b) se capturar o marcador de partículas anelares (RSP) do tumor no citado fluído, sobre um substracto; e c) se detectar a presença do marcador de RSP de tumor sobre o referido substracto. 10- - Processo de acordo com terizado pelo facto de a men marcador de RSP de tumor no ção às referidas RSP, do tum escolhido do grupo formado p corpos policlonais, anticorp misturas. as reivindicações 8 ou 9, carac-cionada operação de captura do citado fluído compreender a liga-or de um anticorpo anti-RSP (rspAB) or anticorpos monoclonais, anti-os de afinidade purificados e suas 11® - Proce terizado pe dor de RSP na ausência de adenosin (tARN) espe transferênc 12® - Proce terizado pe aresença do vimento de cador RSP d sso de acordo com as reivindicações 8 ou 9, carac-lo facto de a citada operação de captura do marca-de tumor no referido fluído compreender a ligação de, pelo menos, um dos iões magnésio e trifosfato a (ATP), do ácido ribonucleíco de transferência cífico para a zona reactiva da aminoacil-ARN de ia-sintetase sobre o citado marcador. sso de acordo com as reivindicações 10 ou 11, carac-lo facto de a mencionada operação de detecção da marcador de RSP de tumor compreender o desenvol-uma cor visível como indicação da presença do mar-e tumor. caracteriza-em ligar, 13® - Processo de acordo com a reivindicação 12, do pelo facto de incluir a operação que consiste I ~ directa ου indirectamente, pelo menos uma molécula que reage com o corante, ao marcador de RSP tumor a fim de desenvolver a mencionada cor visível. 14§ _ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteriza-do pelo facto de a referida operação de detecção da presença do marcador de RSP de tumor compreender a ligação, na ausência de pelo menos um dos iões magnésio e trifosfato de adenosina (ATP), do ácido ribonucleíco de transferência específico da zona reactiva da aminoacil-ARN de transferência-sintetase, ao citado marcador e a detecção da presença de tARN como indicação da presença do marcador de RSP de tumor. 15§ - Processo de acordo com as reivindicações 11 ou 14, carac terizado pelo facto de 0 referido tARN ter pelo menos uma molécula secundária que reage com 0 corante, associada com 0 citado ácido, para desenvolver uma cor visível indicativa da presença do marcador de RSP de tumor.
3. 163 - Processo de acordo com a reividicação 15, caracteriza-do pelo facto de incluir a operação que consiste em se fazer reagir a citada molécula secundária que reage com 0 corante, com um agente desenvolvedor de cor para originar uma cor distintiva, reveladora da presença do marcador de RSP de tumor.
4. 173 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-do pelo facto de se ligar 0 mencionado tARN ao referido marcador fazendo reagir com 0 citado marcador uma amostra de tARN que inclui tARN e pelo menos uma molécula secundária reac tiva com 0 agente corante, para desenvolver uma cor visível, indicador da presença do marcador de RSP do tumor. 183 _ Processo de acordo com a reivindicação 17, caracteri-zado pelo facto de a composição de tARN compreender as molé-

   cuias ligadas de tARN-fotobiotina-esteptavidina-fosfatase alcalina . 19§ - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-do pelo facto de compreender a operação que consiste em se fazer reagir a citada amostra de tARN ligado ao RSP com uma mistura reaccional de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/ /azul de nitrotetrazdlio, para formar uma cor azul/violeta ca-racteristica indicando a presença do marcador de RSP de tumor. 20^ _ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo facto de a referida operação de detecção da presença do marcador de RSP de tumor compreender a ligação à molé 2 cula de RSPrrspAb de um segundo anticorpo anti-RSP (rspAB ) escolhido do grupo formado por anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de afinidade purificados e suas misturas. Lisboa, 22/8/90 0 Agente Oficial da Propriedade Industrial

   Agenío Gíicia! í: TiCjkisditli :adiria n.CriSÍíiíiflj&Gi-c- cAvoj LúíjOá Telek Ó5 1339-654613