KR100475449B1 - 유방암 진단용 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암 환자의 혈액에 존재하는 유방암 특이적인 단백질성 마커 및 전기 마커를 이용한 유방암 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 유방암 진단키트는 성호르몬 결합 글로불린, S100A9, 카르복시펩티다제 N, 시스타틴 C 등 유방암 진단마커의 각 항체, 각 항체와 결합된 항원을 검출할 수 있는 검출수단 및 검출된 결과를 분석하는 결과분석 수단을 포함한다. 본 발명의 유방암 특이적인 단백질성 마커를 이용하면, 유방암의 발병여부를 간편하고, 정확하게 진단할 수 있으므로, 유방암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

유방암 진단용 마커{Marker for Diagnosis of Breast Cancer}

본 발명은 유방암 진단용 마커에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유방암 환자의 혈액에 존재하는 유방암 특이적인 단백질성 마커 및 전기 마커를 이용한 유방암 진단키트에 관한 것이다.

지금까지 대표적인 난치성 질환으로 알려진 암은 조기에 진단할 경우, 약 90%의 높은 치유율을 나타내고 있으며, 재발율도 5% 미만으로 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 그러나, 암의 발병초기에는 자각증상이 없기 때문에, 조기진단에 매우 어려움이 있는 실정이다. 이러한 암의 조기진단을 위하여, 정기적인 건강검진을 받기도 하지만, 가검물의 정밀분석이 없는 단순한 건강검진만으로는 암의 조기진단 가능성이 매우 낮아진다.

이러한 암의 조기진단을 가능케 하기 위하여, 여러가지 진단방법이 개발되었다. 특히, 유방암의 경우에는 조기진단이 비교적 용이하여, 유방암의 발병초기에 이를 검출할 확률이 높고, 다른 악성종양에 비하여 치료될 확률이 높다. 현재, 가장 일반적으로 사용되는 유방암의 조기진단 방법은 기계적인 검사를 통하여 유방에 존재하는 이질적인 조직을 검출하는 것인데, 이러한 기계적인 검사방법은 검사과정이 비교적 간단하다는 장점에도 불구하고, 진단성공율이 극히 희박하여 조직검사와 같은 2차적인 진단방법과 병행하여 수행되고 있다.

이러한 단점을 극복하기 위하여, 다각적으로 방법을 모색한 결과, 유방암이 진전되면서 수반되는 다양한 유전적 변화에 관심을 갖게 되었다. 이러한 변화들로는 성장인자와 이들의 수용체, 구조 단백질, 이차 메신저 단백질 및 전사 인자를 발현하는 유전자의 발현에 질적 및 양적인 변화를 들 수 있다. 아직까지는 이러한 유전자의 변화가 환자의 생검(biopsy) 검체내에 존재하는 유방암종의 발병요인에 정확히 어떠한 역할을 하는지는 잘 밝혀지지 않았으나, 유전자 발현에 있어서의 이러한 변화들은 잠재적으로 유방암 마커 개발에 적극적으로 활용될 수 있을 것으로 예측되고 있다.

전기 유방암 마커를 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화할 수 있을 것으로 기대되고 있어, 이를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 진단 또는 일반 개체군의 선별에 매우 적합한 정도로 충분히 민감하거나 종양특이적인 마커가 개발되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 환자에서 유방암의 출현 및 병으로의 진전을 특이적으로 진단할 수 있는 마커를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 환자에서 유방암의 출현 및 병으로의 진전을 특이적으로 진단할 수 있는 마커를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 유방암환자의 혈장에서 분리된 단백질이 정상인 및 다른 악성종양의 환자로부터 검출되지 않았으므로, 전기 단백질을 유방암의 마커로써 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 유방암 특이적으로 혈장에 존재하는 단백질 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 단백질 마커를 이용하여, 유방암을 진단하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 키트를 이용하여 유방암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 유방암 진단용 마커는 성호르몬 결합 글로불린(sex hormone-binding globulin), S100A9, 카르복시펩티다제 N(carboxypeptidase N) 및 시스타틴 C(cystatin C)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명자들은 유방암의 발병환자의 혈장시료내에 존재할 것으로 예측되는 단백질 마커를 찾아내기 위하여, 유방암 환자의 혈장시료와 정상인의 혈장시료에서 단백질들을 취하여 아이소일렉트릭포커싱(isoelectricfocusing, IEF)과 SDS 전기영동방법으로 단백질을 등전점과 질량에 따라 분리하였다. 이어, 분리된 단백질을 사이프로 루비(SYPRO Ruby)와 코마시 G-250(Coomassie G-250)으로 중복염색한 다음, 이들을 컴퓨터 프로그램으로 유방암 환자의 혈장시료와 정상인의 혈장시료를 비교분석한 결과, 정상인의 혈장시료에서는 나타나지 않는 다수의 단백질이 유방암 환자의 혈장시료에서 나타남을 알 수 있었으므로, 유방암 환자에서만 발견된 단백질을 선별하고, 이들을 동정하였다. 즉, 각 선별된 단백질을 트립신으로 처리하여 다수의 펩타이드 절편으로 분리한 다음, 각 절편의 질량을 측정하고, 컴퓨터 분석프로그램을 사용하여 데이터베이스를 검색함으로써, 각 절편의 질량분석 자료와 유사한 단백질을 검색하였다. 그 결과, 전기 선별된 단백질은 각각 성호르몬 결합 글로불린, S100A9, 카르복시펩티다제 N 및 시스타틴 C임을 알 수 있었다.

성호르몬 결합 글로불린은 포유동물의 성호르몬과 결합하는 단백질로서, 간에서 생산되고, 남성 또는 여성 호르몬과 결합하는데, 이들이 결합된 성호르몬은 정상적으로 수용체와 결합하지 못하거나 또는 정상적으로 그의 수용체와 결합하여도 활성이 나타나지 않는다고 알려져 있다.

S100A9은 사람과 같은 포유동물에 존재하는 칼슘 결합 단백질인 S100 단백질 그룹에 속하는데, S100 단백질은 10-12kDa의 적은 분자량을 가지고, 산성을 나타내며, 두개의 칼슘 결합부위가 존재하는데, 하나는 산성 헬릭스-루프-헬릭스 도메인이고, 다른 하나는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 도메인으로 비교적 칼슘과 결합친화력이 낮다는 특징이 있다. 전기 S100 단백질이 칼슘과 결합할 경우, 단백질의 구조적인 변화가 발생하고, 이러한 구조적인 변화는 세포내 신호전달(signal transduction)에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

카르복시펩티다제 N은 단백질 또는 펩타이드의 C-말단을 분해하는 단백질분해효소인 카르복시펩티다제의 일종으로서, 금속성 단백질가수분해효소(metallo-protease)이고, 4량체를 형성하며, 이들이 결핍될 경우, 일시적인 맥관부종(episodic angioedema) 등의 유전병이 발병되는 것으로 알려져 있다.

시스타틴 C는 시스테인 단백질 분해효소로서 세포의 리소좀에 다량으로 존재하며, 콜라겐의 분해, 단백질 전구체의 제거 등에 이용되고 있으며, 염증유발 반응, 신경성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기 단백질들은 유방암의 발병 및 진행과 직접적으로 연관된다고 알려져 있지 않았기 때문에, 지금까지 유방암의 진단마커로서 이용되지 못하고 있는 실정이었다. 본 발명에서는 이들이 정상인의 혈장에서는 거의 발견되지 않으나, 유방암 환자의 혈장에서는 다량으로 발견됨을 확인하였는 바, 이들을 유방암의 진단마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈액시료를 채취하고, 피검자의 혈액시료에 함유된 상기 유방암 진단마커 단백질을 검출함으로써, 유방암의 발병을 확인할 수 있다. 이때, 유방암 진단마커 단백질을 검출하는 방법이 특별히 제한되는 것은 아니나, 항원-항체반응 검출법, mRNA 검출법 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 항원-항체반응 검출법을 이용하여, 피검자의 유방암 발병여부를 신속하게 확인할 수 있다.

그러나, 상기 항원-항체반응 검출법을 이용할 경우, 반응의 오류가 발생할 가능성이 높기 때문에, 본 발명자들은 이러한 오류의 발생확률을 감소시키기 위하여 지속적으로 연구를 수행하였다. 즉, 상술한 각 마커들은 모든 유방암 환자에서 반드시 발견되거나 또는 모든 정상인에게서 반드시 발견되지 않는 것이 아니고, 유방암 환자에서 전기 다수의 마커 중 일부는 발견되고 일부는 발견되지 않을 수 있으며, 전기 다수의 마커 중 일부는 정상인에서도 극히 적은 비율로 나타날 수도 있기 때문에, 단순히 상술한 마커 중의 1종을 항원-항체 검출법에 의하여 검출하였다고 하여, 피검자가 반드시 유방암이 발병되었다고 결론지을 수 없으므로, 본 발명자들은 이러한 오류의 발생확률을 감소시키기 위하여, 지속적으로 연구하였다. 그 결과, 상기한 다수의 마커들을 전기 항원-항체 검출법을 이용하여 모두 검출하고, 검출 결과를 분석 알고리즘에 적용할 경우, 진단 정확도가 급격히 증가하여, 정확히 유방암 발병환자를 구별할 수 있음을 알게 되었다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명의 유방암 진단키트는 상기 유방암 진단마커의 각 항체, 각 항체와 결합된 항원을 검출할 수 있는 검출수단 및 검출된 결과를 분석하는 결과분석 수단을 포함한다. 좀 더 구체적으로, 본 발명의 유방암 진단키트는 성호르몬 결합 글로불린의 항체, S100A9의 항체, 카르복시펩티다제 N의 항체, 시스타틴 C의 항체, 2차 항체, 발색제 및 결과분석 알고리즘 대조표를 포함한다. 이때, 결과분석 알고리즘 대조표는 각 마커에 대한 항원-항체 검출법의 결과를 종합적으로 분석하는 대조표로서, 상기 4가지 마커에 대한 항원-항체 검출법의 결과가 4개의 양성반응으로 나타날 경우의 유방암 발병확률을 100%로 지정하고, 4개의 음성반응으로 나타날 경우의 유방암 발병확률을 0%로 지정하며, 각 양성반응의 수와 음성반응의 수의 비율로서 유방암 발병확률을 계산할 수 있도록 구성되어 있는데, 단순히 양성반응의 수와 음성반응의 수로만 계산하는 것이 아니라, 각 마커에 가중치를 부여하여 계산하도록 구성됨이 바람직하다.

예를 들어, 피검자 A는 S100A9 만이 양성으로 나타나고, 피검자 B는 시스타틴 C 만이 양성으로 나타날 경우, 두 피검자의 유방암 발병확률은 동일하지 않은데, 그 이유는 S100A9이 시스타틴 C에 비하여 유방암 환자에서 발견되는 확률이 낮기 때문에, 이 경우 피검자 B가 피검자 A에 비하여, 유방암 발병확률이 높다고 판단할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 마커를 이용하여 유방암 치료효과를 가지는 약물의 스크리닝에 이용할 수도 있다. 본 발명의 마커는 유방암 환자에게서만 발견되는 단백질이므로, 유방암이 치료된 환자에게서는 발견되지 않는다. 따라서, 유방암의 치료에 효과를 나타내는 약물을 개발할 때, 전기 약물의 치료효과를 종래의 어떠한 방법보다도 신속하고 정확하게 확인할 수 있으므로, 본 발명의 마커는 유방암 치료용 약물의 스크리닝에도 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유방암 환자의 혈장단백질 분석

유방암 환자의 수술 전의 혈액, 수술 후의 혈액 및 정상인의 혈액을 채취하고, 이로부터 각 혈장을 수득하였다. 전기 수득한 각 혈장 200㎕에 트리스 완충용액(100mM Tris, 1% SDS, pH 7.0) 200㎕와 50X 단백질 분해효소 저해제 8㎕ 을 혼합하고 100℃로 가열하였다. 이어, 희석완충용액(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT) 600㎕와 50X 단백질 분해효소 저해제 12㎕를 혼합하고, 1시간동안 진탕시킨 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 전기 상등액에 함유된 단백질 농도를 측정하고, 각 혈장시료에 함유된 단백질 량이 2mg이 되도록 분취한 후, 각 시료에 액상화 용액(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40mM Tris-HCl, 0.002% bromophenolblue, 2mM tributylphosphine)을 첨가하여 450㎕로 적정한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 각 상층액 400㎕를 고정화 pH구배 스트립 트레이(Immobiline pH gradient dry strip reswelling tray)에 넣고, pH 4.5-5.5 및 pH 6-9 pH구배 스트립(pH gradient dry strip)을 장착시킨 후, 16시간 동안 각각 재수화시켰다. 재수화된 각 스트립을 대상으로 하고, 100,000Vhr의 전기를 이용한 아이소일렉트릭포커싱(isoelectricfocusing, IEF)을 수행하여, 혈장내의 단백질을 자신의 등전점(pI value)에 해당하는 pH부분으로 이동시켰다. 이어, TBP평형화 완충용액(0.2mM tributylphosphine, 6M urea, 2% SDS, 20% glycerol, 2.5% acrylamide, 375mM Tris, pH 8.8)에 침지하여 평형화시켰다.

한편, 8 내지 16%의 농도구배 SDS 전기영동용 젤을 작제하고, 전기 평형화된 각 스트립을 위쪽에 장착시킨 후, 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 수행한 각 젤을 SYPRO Ruby와 Coomassie G-250으로 중복염색하였다(참조: 도 1, 도 2, 도 3, 도 4). 도 1은 유방암 환자의 시료를 pI 4.5-5.5의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이고, 도 2는 정상인의 시료를 pI 4.5-5.5의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이며, 도 3은 유방암 환자의 시료를 pI 6-9의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이고, 도 4는 정상인의 시료를 pI 6-9의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 정상인과 유방암환자의 전기영동 사진을 Melanie 3 프로그램을 이용하여 비교분석한 결과, 정상인에게서는 발견되지 않지만, 유방암환자에게서는 발견되는 약 80여개의 단백질들을 찾을 수 있었으며, 이들에게 각각의 명칭을 부여하였다.

이어, 여러명의 유방암환자 시료를 사용하여 동일한 방법으로 반복적인 실험을 수행한 결과, HB34라 명명된 44kDa의 단백질, HB47이라 명명된 13kDa의 단백질, BM1이라 명명된 52kDa의 단백질 및 SP16이라 명명된 13kDa의 단백질이 모든 유방암 환자에게서만 특이적으로 발견됨을 알 수 있었다(참조: 도 5, 도 6, 도 7, 도8). 도 5는 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 HB34 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이고, 도 6은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 HB47 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이며, 도 7은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 BM1 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이고, 도 8은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 SP16 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이다.

실시예 2: 특이 단백질의 분석

전기 실시예 1에서 검출된 각 단백질을 전기영동젤로부터 1mm X 1mm의 크기로 절취하고, 탈염용액(100mM Tris-HCl pH 8.5, 50% acetonitrile) 200㎕에 침지한후, 진탕하여 탈염시킨 후, 젤을 건조시켰다. 이어, 단백질 분해용액(0.02ug trypsin/ml, 25mM ammonium carbonate) 8㎕를 가하고, 37℃ 16시간 동안 재수화시켜 단백질을 펩타이드화하였다. 추출용매(50% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) 8㎕를 추가하고 10분간 초음파분쇄(sonication)를 수행하여, 젤속에 함유되었던 펩타이드를 추출하였다. 그런 다음, 각 시료로부터 1㎕를 취해 메트릭스(matrix) 용액(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid 10mg/ml in 50% v/v acetonitrile, 0.1% TFA) 1㎕와 혼합하여 MALDI 플레이트(Micromass사, UK)에 흡착시킨 후, 건조시켜서 MALDI-TOF(Micromass사, UK)로 시료를 분석하고, 분석결과를 이용하여 각 펩타이드들의 분자량을 측정하였다(참조: 도 9, 도 10, 도 11, 도 12).

도 9는 HB34 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프로서, HB34 단백질로부터 30개의 펩타이드가 분리되었으며, 각 펩타이드의 분자량은 927.4802, 946.3315, 948.4321, 960.542, 972.5417, 1015.43, 1019.538, 1042.713, 1051.686, 1077.175, 1125.534, 1149.554, 1211.767, 1226.579, 1229.776, 1231.779, 1284.535, 1296.657, 1441.818, 1467.803, 1475.702, 1514.646, 1559.72, 1639.804, 1649.747, 1791.684, 2045.049, 2163.02, 2273.118 및 2550.149임을 알 수 있었다.

도 10은 HB47 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프로서, HB47 단백질로부터 30개의 펩타이드가 분리되었으며, 각 펩타이드의 분자량은 968.5735, 982.6004, 1042.727, 1077.215, 1107.597, 1118.552, 1179.601, 1229.856, 1277.742, 1300.575, 1307.708, 1320.63, 1365.694, 1433.731, 1455.761, 1475.799, 1493.8, 1517.712, 1638.861, 1646.845, 1707.842, 1716.904, 1758.892, 1791.817, 1806.999, 1812.944, 2163.155, 2273.249, 2384.075 및 2550.342임을 알 수 있었다.

도 11은 BM1 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프로서, BM1 단백질로부터 31개의 펩타이드가 분리되었으며, 각 펩타이드의 분자량은 902.2609, 916.3277, 930.2899, 934.2758, 958.3269, 982.5957, 991.3221, 1077.235, 1085.662, 1175.619, 1196.689, 1268.721, 1286.729, 1296.748, 1372.684, 1433.747, 1520.816, 1536.792, 1548.887, 1677.898, 1744.972, 1753.064, 1793.968, 1873.119, 1874.092, 1922.069, 2163.21, 2185.236, 2193.183, 2273.333 및 2585.484임을 알 수 있었다.

도 12는 SP16 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프로서, SP16 단백질로부터 30개의 펩타이드가 분리되었으며, 각 펩타이드의 분자량은 900.1864, 902.2081, 908.2483, 912.2322, 928.2737, 938.2299, 940.2156, 1004.25, 1020.445, 1022.306, 1046.254, 1077.124, 1153.513, 1226.531, 1382.624, 1529.636, 1592.738, 1755.629, 1792.856, 1800.804, 1816.795, 1832.802, 1833.832, 1863.917, 1919.843, 1920.94, 2162.969, 2192.93, 2273.089 및 2289.077임을 알 수 있었다.

상기 얻어진 각 시료에 대한 펩타이드 분자량을 http://prowl.rockefeller.edu 에서 제공하는 단백질 데이터베이스 프로그램(Profound)에 입력하여, 이들과 유사한 특성을 가지는 단백질이 존재하는지 검색하였다. 그 결과, HB34는 성호르몬 결합 글로불린과 동일하고, HB47는 S100A9과 동일하며, BM1은 카르복시펩티다제 N과 동일하고, SP16는 시스타틴 C와 동일한 단백질임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 유방암 환자의 혈액에 존재하는 유방암 특이적인 단백질성 마커 및 전기 마커를 이용한 유방암 진단키트를 제공한다. 본 발명의 유방암 진단키트는 성호르몬 결합 글로불린, S100A9, 카르복시펩티다제 N, 시스타틴 C 등 유방암 진단마커의 각 항체, 각 항체와 결합된 항원을 검출할 수 있는 검출수단 및 검출된 결과를 분석하는 결과분석 수단을 포함한다. 본 발명의 유방암 특이적인 단백질성 마커를 이용하면, 유방암의 발병 및 치료여부를 간편하고, 정확하게 진단할 수 있으므로, 유방암의 조기진단 및 유방암 치료용 약물의 스크리닝에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 유방암 환자의 시료를 pI 4.5-5.5의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는 정상인의 시료를 pI 4.5-5.5의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은 유방암 환자의 시료를 pI 6-9의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 정상인의 시료를 pI 6-9의 조건으로 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 HB34 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이다.

도 6은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 HB47 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이다.

도 7은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 BM1 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이다.

도 8은 유방암 환자와 정상인의 시료에서 나타나는 SP16 단백질의 발현량의 차이를 나타내는 사진이다.

도 9는 HB34 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 HB47 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 BM1 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 SP16 단백질의 MALDI TOF분석 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (4)

1. 성호르몬 결합 글로불린(sex hormone-binding globulin), S100A9, 카르복시펩티다제 N(carboxypeptidase N) 및 시스타틴 C(cystatin C)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 유방암 특이적인 단백질성 마커.
2. 성호르몬 결합 글로불린의 항체, S100A9의 항체, 카르복시펩티다제 N의 항체, 시스타틴 C의 항체, 2차 항체, 발색제 및 결과분석 알고리즘 대조표를 포함하는 유방암 진단키트.
3. 제 2항에 있어서,

   결과분석 알고리즘 대조표는 각 마커에 대한 항원-항체 검출법의 결과 가 4개의 양성반응으로 나타날 경우의 유방암 발병확률을 100%로 지정 하고, 4개의 음성반응으로 나타날 경우의 유방암 발병확률을 0%로 지 정하며, 각 양성반응의 수와 음성반응의 수의 비율로서 유방암 발병확 률을 계산하여 분석하는 대조표인 것을 특징으로 하는

   유방암 진단키트.
4. 제 2항의 유방암 진단키트를 이용하고 다음의 단계를 포함하는, 사람을 제외한 포유동물의 유방암을 진단하는 방법:

   (ⅰ) 혈액시료를 채취하고, 혈액시료에 각각 성호르몬 결합 글로불린의 항체, S100A9의 항체, 카르복시펩티다제 N의 항체 및 시스타틴 C의 항체를 처리하는 단계;

   (ⅱ) 상기 항체 처리된 혈액시료에 각각 2차 항체를 처리하는 단계;

   (ⅲ) 상기 2차 항체가 처리된 혈액시료에 발색제를 처리하는 단계; 및,

   (ⅳ) 상기 발색제가 처리된 혈액시료로부터 발색결과를 결과분석 알고리즘 대조표를 통하여 분석하는 단계.