KR19990082173A

KR19990082173A - 방광암의 검출 및 평가 방법

Info

Publication number: KR19990082173A
Application number: KR1019980705898A
Authority: KR
Inventors: 바이나타 비. 로케쉬워; 노만 엘. 블럭; 헨리 티. 팜
Original assignee: 피쉬 앨런; 유니버시티 오브 마이애미
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 1999-11-25
Also published as: AU2242297A; EP0922222A1; CA2242856A1; JP2000504114A; WO1997028446A1

Abstract

본 발명은 신규한 방광암 평가 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 표준량의 히알루론산(HA) 및 히알루로니다아제(HAase)가 방광암의 검출, 등급 평가, 치료 효능 및 종양 재발의 모니터링에 있어서 진단 마커임을 발견한 것에 기초한다.

Description

방광암의 검출 및 평가 방법

방광암종은 미국에서만 연간 51,000건의 새로운 증례가 보고되며, 11,000명이 사망하는 것으로 추산되는, 요도의 가장 흔한 암이다. 약 90%의 방광 종양이 전이 세포암종(Transitional cell carcinoma, TCC)이다. 이러한 종양들은 그 진행 능에 있어서 이질적(heterogeneous)이다. 예를 들어, 몇몇 TCC는 양성(저-등급, G1 종양)인 반면, 다른 것들은 중간(G2 종양) 내지 고도의 공격적(G3 종양 및 상피내암(CIS))으로 나타난다. 고-등급 종양은 일반적으로 빠르게 전이한다; 실제로, 임상적 표시(예를 들어, 혈뇨, 과민성 배설 증상 등)가 나타날 때는, 고-등급 방광 종양을 가진 많은 환자에서 이미 침습성 질환이 존재한다.

TCC의 두가지 가장 중요한 예후 인자는 등급(grade)과 단계(stage)(침습 정도를 나타낸다)이다[American Joint Committee on Cancer:Staging of cancer at genito-urinary sites. In: Manual for Staging Cancer, 3rd edition, pp194-195, J.B.Lippincott Co., Philadelphia, 1988]. 저-등급(G1) 종양은 대부분 점막(Ta 단계)으로 제한되며, 2% 이하의 진행가능성을 가진다[Heney, Natural history of superficial bladder cancer. Urol. Clin. North Am., 19:429-435, 1992; Heney and Flanagan, Superficial bladder cancer progression and recurrence. J. Urol., 130: 1083-1086, 1983].

중간-등급(G2) 종양은 비침습성(Ta) 내지 침습성(T1-T4 단계)에 걸친 범위이다. G2, Ta 종양은 약 11%의 진행가능성을 가진다[Heney, Natural history of superficial bladder cancer. Urol. Clin. North Am., 19:429-435, 1992]. 상피내암(CIS)을 제외하고는, 대부분의 고-등급 종양은 처음에 적어도 T1 단계(고유판 침입)에 검출되므로, 침습성이다. 종양에 의한 근육 침습(T2 단계)은, 근치외과적 수술을 하더라도, 이러한 환자의 50%에서 진단 2년 내에 종양이 멀리 전이되며, 치료되더라도 이중 60%가 5년내 사망하게 되므로 좋지 않다[Heney and Flanagan, Superficial bladder cancer progression and recurrence. J. Urol., 130: 1083-1086, 1983; Friedell et al., Summary of workshop on carcinoma-in-situ of the bladder. J. Urol., 136: 1047-1048, 1986; Soloway, Invasive bladder cancer: Selection of primary treatment. Semin. Oncol., 17:551-554, 1990]. 고-등급 TCC의 악성 성질 때문에, 근육침습 이전에 이들을 미리 검출하는 것이 유리한 예후를 위해 중요하다.

그러므로, 종양의 존재를 미리 검출하는 것 뿐아니라, 불길한 예후를 제공하는 고-등급 종양을 동정하는 것이 또한 중요하다. 종양 재발이 또한 방광 암종의 특징이다. 그러므로, 원래 종양이 완전히 제거되었다해도, 환자는 치료효능 및 재발에 대해 면밀히 모니터링되어야 한다[Heney, Natural history of superficial bladder cancer. Urol. Clin. North Am., 19: 429-435, 1992].

현재 방광암 검출을 위한 방법은 방광경 검사법, 방광 세척법 및 생검법이다. 이러한 방법들은 침입성이며, 소정형태의 마취를 필요로 한다. 요세포진단법을 사용할 수 있으나, 주관적이므로 특이성이 낮다. DNA 배수성(ploidy), p53 돌연변이, 미세위성 DNA(mocrosatellite DNA), β-글루쿠로니다아제, 염기성-FGF 수준, 오토크린 이동성 벡터 수용체(autocrine mobility factor receptor) 등 몇가지 다른 마커가 방광암과 관련된 것으로 알려져 있다[Sidransky and Messing, Molecular genetics and biochemical mechainisms in bladder cancer. Urol. Clin. North Am., 19: 629-639, 1992; Mao et al., Molecular detection of primary bladder cancer by microsatellite DNA. Science, 271: 659-662, 1996; Nguyen et al., Elevated levels of the angiogenic peptide basic fibroblast growth factor in urin of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst., 85: 241-242, 1993; Esrig et al., Accumulation of nuclear p53 and tumor progression in bladder cancer. N. Engl. J. Med., 331: 1259-1264, 1994; Ho, Urinary β-glucuronidase in screening and follow up of primary urinary tract malignancy. J. Urol., 154: 1335-1338, 1995; Korman et al., Autocrine motility factor receptor as a possible urine marker for transitional cell carcinoma of the bladder. J. Urol., 154: 347-349, 1995]. 그러나, 이중 대부분이 아직 임상에서는 진단 마커로 사용되고 있지 않다.

최근, 미국에서는 방광암에 대한 3개의 비침입성 진단 테스트가 연구중에 있다. 혈뇨 홈 스크리닝 테스트는 감도가 높으나, 허위 양성반응을 일으킬 수 있는 광범위한 양성 비뇨생식기(GU) 조건(신장결석, 양성 전립선 과형성 등)으로 인하여 특이성이 낮다[Britton et al., A community study of bladder cancer screening by the detection of occult urinary bleeding. J. Urol, 148: 788-790, 1992; Messing et al., Hematuria home screening: Repeat testing results. J. Urol., 154: 57-61, 1995]. 두 번째 테스트는 바르드 BTA 라텍스 응집 어세이(Bard BTA Latex agglutination assay)이다. 미국에서 이 테스트의 멀티센터 시험이 방광 종양 재발을 모니터하기 위해 실시되었다. 그 결과 방광 종양 및 더 중요하게는 고-등급 TCC에 대한 이 테스트의 검출 감도가 단지 약 40-50%로 나타났다(Sarosdy et al., Results of a multicenter trial using the BTA test to monitor for and diagnose recurrent bladder cancer, J. Urol., 154: 379-384, 1995; U.S. Pat. No. 5,264,370). 90명의 환자에 대한 세 번째 테스트의 다른 멀티센터 연구에서, Soloway 등은 NMP22 테스트가 방광암 재발 검출에서 70%의 전체 감도를 가진다는 것을 알아내었다(Soloway et al., Use of a new tumor marker NMP22 in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract followingsugical treatment. J. Urol., 156: 363-367, 1996). 그러므로, 고감도 및 고특이도로 방광 종양을 검출하거나 및/또는 그 등급을 평가할 수 있는 비침입성 테스트는 아직까지 없다.

본 기술분야의 상기한 문제들을 염두하고, 본 발명자들은 특히 방광암 환자들의 생물학적 체액(소변 검체 등)에서 발현되는 어떤 "분자 결정인자"의 수준을 측정하여 방광암을 검출하는 비침입성 방법을 개발하였다. 더욱 상세하게, 본 발명의 방법은 생물학적 체액, 특히 소변 중의 히알루론산 및 히알루로니다아제가 방광암의 존재여부 및 등급과 관련이 있다는 발명자들의 발견에 기초한다.

히알루론산(HA로 약칭하며, 본 기술분야에서는 히알루론산염 및 히알루로난으로 또한 공지되어 있다.)은 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산 단위체를 교대로 가지는 직쇄 비측쇄 다당류 사슬을 포함하는 글리코사미노글리칸이다. HA는 박테리아 및 동물을 포함하여, 다양한 형태의 생물학적 물질에 흔하게 존재한다. 사람에 있어서, HA는 탯줄, 초자체액, 연골 및 활액에서 고농도로 발견된다. HA의 수준은 류마티스성 관절염, 간경변 및 빌름스 종양 등의 질환과 관련이 있다. HA는 일반적으로 비특이적 종양과 관련되나, 지금까지 HA를 특정의 임상 종양의 발견, 치료 및 처방에 사용한 경우는 없었다.

HA는 암을 포함하는 몇가지 병태생리학적 조건에서 작용하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, HA 수준은 어떤 동물 종양 모델(예를 들어, 토끼 V2 암종, Kundson et al., The role and regulation of tumor asscociated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan(J. Whelan, ed.), pp. 150-169, New York, Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposium 143), 1989) 및 사람의 암(예를 들어, 폐암, 빌름스 종양, 유방암 등, Knudson et al., ibid.)에서 증가되는 것이 알려져 있다.

종양 조직에서, HA는 종양 세포 이동을 위하여 수화 개방 공간에 퍼진다(Kundson et al., The role and regulation of tumor associated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan(J. Whelan, ed.), pp. 150-169, New York, Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposium 143), 1989). 또한, 어떤 세포 표면 수용체를 통하여 상호작용함으로써 HA 매트릭스 상에서 종양세포가 이동한다(예를 들어, CD44; Tomas et al., Migration of human melanoma cells on hyaluronate is related to CD44 expression. J. Invest. Dermatol., 100: 115-120, 1993). HA는 또한 면역학적 경계(immune surveillance)로부터 종양세포를 보호하는 훈륜(halo)을 종양 세포 주변에 형성한다(Hobarth et al., Topical chemoprophylaxis of superficial bladder cancer by mitomycin c and adjuvant hyaluronidase. Europ. Urol., 21:206-210, 1992). 더욱 최근에는, 작은 단편의 HA(∼3-25 이당류 단위체)가 혈관형성을 촉진한다는 것이 밝혀졌다(West et al., Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science, 228: 1324-1326, 1985; west and Kumar, The effect of hyaluronate and its oligosaccarides on endothelial cell proliferation and monolayer integrity. Exp. Cell Res,. 183:179-196, 1989). 본 발명자 중 한 명의 초기 연구는 10-15 이당류 단위체의 HA 단편(F1 단편)이 소의 대동맥 내피 세포의 증식을 자극한다는 것을 보여준다. 유사한 크기의 단편이 또한 내피세포 이동 및 세관 형성을 촉진한다는 것을 나타낸다(Banarjee and Toole, hyaluronan binding protein in endothelial cell morphogenesis. J. Cell Biol., 119: 643-652, 1992).

본 출원에서, 본 발명자들은 정상인 및 방광암 환자의 소변과, 하기한 바와 같이 정상 방광 및 종양 조직으로부터 제조된 추출물 중의 HA 수준을 측정하였다. 또한, 하기한 바와 같이, 본 발명자들은 정상인, 방광암 환자 및 다른 비뇨생식기(GU) 조건을 가지는 환자의 소변에 존재하는 HA 종의 프로파일을 검사하였다. 또한, 본 발명자들은 소변 중에 존재하는 HA 또는 HA 단편이 사람 내피 세포의 증식에 영향을 미치는지를 결정하였다.

본 발명자들은 G1, G2, G3 종양을 가지는 방광암 환자 소변 HA 수준이, 정상인 및 다른 비뇨생식기(GU) 조건의 환자에서보다 상당히 증가됨(예를 들어, 4-9배 증가)을 본 출원에 개시하였다(p<0.001). 하기한 바와 같이, 본 발명자들은 또한, 치료전 및 치료후 소변 HA 수준을 비교함으로써 치료효율을 모니터할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 치료후 소변 HA 수준이 증가하는 것은 방광암이 그대로이거나 이후에 재발할 가능성이 있음을 나타낸다. 소변 HA 수준은 또한 초기 치료에 이어지는 추적 조사동안 방광암 재발을 모니터하는 데 유용하다. 또한, HA 수준은 방광 종양 조직에서 증가되므로(예를 들어, 3-5배), 소변 HA 농도의 증가는 종양-관련 HA 수준 증가와 직접적인 관련이 있다(p<0.001). 정상인과 방광암 환자에서는, 소변 HA 종의 프로파일이 서로 다르다. 중간 크기의 HA 종은 정상인과 저-등급 방광 종양환자의 소변에서만 관찰되며, 고-등급 방광암 환자의 소변은 고분자량 및 소형 혈관형성성 HA 단편이 모두 발견된다.

본 발명자들은 또한 본 출원에, 이러한 소변 HA 단편이 주된 사람 미소혈관 내피세포에서 유사분열촉진 반응(예를 들어, 2-4배)을 자극함을 개시하고, 내피세포 기능을 조정함으로써 소형 HA 단편이 종양 혈관형성을 조절할 수 있음을 제안하였다. 본 발명자들은 고-등급 방광암 환자의 소변 중의 소형 HA 단편이, 이러한 환자의 소변 중에 히알루로니다아제 활성이 존재함을 나타낼 수 있다는 가설을 세웠다.

히알루로니다아제(HAase)는 N-아세틸글루코사민 결합을 가수분해하여 HA를 분해하는 엔도글리코시딕 효소(endoglycosidic enzyme)이다. 히알루로니다아제에 의한 HA의 분해는 제한적이므로, 혈관 형성성인 특정 길이의 HA 단편(약 3-25이당류 단위체)이 생성된다(West et al., Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science, 228:1324-1326, 1985). 척추 동물에 있어서, 히알루로니다아제는 중성 pH(최적 pH 5.0)에서 활성인 것과 산성 pH (pH 3.5-4.0에서 활성인 것의 2가지 클래스로 분류될 수 있다(Roden et al., Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism. In: The Biology of hyaluronan,(J. Whelan, ed.), pp. 60-86, New York, Wiley Chichister (Ciba foundation symposium 143), 1989; West et al., ibid.; Gold, Purification and properties of hyaluronidase from human liver. Biochem. J., 205:69-74, 1982; Fraser and Laurent, Turnover and metabolism of hyaluronan. In: Biology of Hyaluronan,(J. Whelan, ed.),pp. 41-59, New York, Whiley Chichister (Ciba foundation symposium 143), 1989; Zhu et al, molecular cloning of a mammalian hyaluronidase reveals identity with hemopexin, a serum heme-binding protein. J. Biol. Chem., 269: 2092-32097, 1994; Lin et al., A hyaluronidase activity of the serum plasma membrane protein PH-20 enables sperm to penetrate the cumulus layer surrounding the egg. J. Cell Biol., 125:1157-1163, 1995). 예를 들어, 간의 히알루로니다아제는 산성 pH에서 최적인 반면에, 고환의 히알루로니다아제는 중성에서 최적이다. HA와 히알루로니다아제의 협동 작용은 태아의 발달, 혈관 형성, 혈관 리모델링, 면역학적 경계 및 종양 진행 동안에 중요한 역할을 한다는 것을 알아내었다(McCormick and Zetter, Adhesive interactions in angiogenesis and metastasis pharmacol. Ther., 53:239-260, 1992; Hobarth et al., Topical chemo-prophylaxis of superficial bladder cancer by mitomycin C and adjuvant hyaluronidase, Eur. Urol., 21: 206-210, 1992; Kundson et al., The role and regulation of tumor associated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan(J. Whelan, ed.), pp. 150-169, New York, Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposium 143), 1989; Lin et al., Urinary hyaluronic acid is a Wilms' tumor marker. J. Ped. Surg., 30: 304-308, 1995; Stern et al., Hyaluronidase levels in urine from Wilms' tumor patents. J. Natl. Canc. Inst., 83:1569-1574, 1991). 본 발명자들은 전립선암에서 히알루로니다아제 수준이 상승하며, 이러한 증가는 전립선 암의 공격성과 서로 관련이 있다는 것을 알아내었다(Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56:651-657, 1996).

본 발명자들은 본 출원에, G2 및 G3 종양을 가지는 방광암 환자의 소변 HAase 수준이 정상인, G1 종양을 가지는 환자 및 다른 GU 조건의 환자에 비해서 상당히(예를 들어, 5-8배) 증가한다는 것을 개시하였다(p<0.001). 하기한 바와 같이, 본 발명자들은 또한 치료전 및 치료후 소변 히알루로니다아제 수준을 비교함으로써 치료 효율을 모니터할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 치료후 소변 히알루로니다아제 수준의 증가가 나타나면 G2 또는 G3 방광 종양이 그대로이거나 이후에 재발할 가능성이 있음을 나타낸다. 소변 히알루로니다아제 수준은 또한 초기 치료에 이어지는 추적 조사동안 G2 도는 G3 방광 종양 재발을 모니터하는 데 유용하다. 소변 히알루로니다아제 수준의 증가는 종양-관련 히알루로니다아제의 분비에 의한 것으로, G2/G3 종양 조직의 히알루로니다아제 수준은 정상 방광 및 G1 종양 조직보다 높다(예를 들어 약 6-7배, p<0.001). 방광 종양-관련 히알루로니다아제 활성은 다른 히알루로니다아제와는 구별되며, 최적 pH 4.3이고, Mr 65kD(p65)와 55 kD(p55)의 두가지 단백질이 있는 것으로 생각된다.

본 발명 이전에는, HA 또는 HAase가 방광암과 관련되어 있다는 보고가 없었으며, 이를 방광암의 검출 또는 평가에 사용한 경우도 없다. 그러나, 본 발명의 어세이 방법을 사용하면, 방광암을 검출하고, 이의 특정 등급을 평가하는 비침입성 시험에 HA 및 HAase를 사용할 수 있다.

HA 농도를 결정하는 ELISA-유사 어세이는 이미 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, Goldberg 등은 HA로 고체 지지체를 도포하고, 시료를 연골 프로테오글리칸(어떤 생물학적 물질 중의 HA와도 결합하는 것으로 알려져 있음)과 배양한 후, 시료를 도포된 고체 지지체에 노출시킴으로써, 생물학적 시료 중의 HA를 측정할 수 있음을 개시하였다(U.S. Pat. No. 5,378,637). 고체 HA 지지체에 결합한 연골 프로테오글리칸의 양은 항-케라틴 설페이트-반응성 항체에 의해 결정된다.

돼지 후두 연골 프로테로글리칸을 사용하는 유사한 방법이 Fosang 등에 의해 개시되어 있다(Matrix, 10:306-313, 1990). 이 문헌에는 바이오티닐화된 프로테오글리칸 G1 도메인(HA-결합 부위)를 사용하는, 히알루로난의 ELISA 플레이트계 어세이가 기재되어 있다.

ELAISA-유사 어세이는 Stern and Stern에 의해 개시되어 있다(Matrix, 12:397-403,1992). 이 문헌에는 비오티닐화된 HA 결합 단백질, 마우스 항-케라틴 설페이트 항체, 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG 및 아비딘-비오틴 검출 시스템을 사용하는 히알루로니다아제의 결정방법이 기재되어 있다. 동일한 어세이를 사용하여, Stern 등은 빌름스 종양 환자의 소변에서 히알루로니다아제 수준을 측정하였다(Stern et al., Hyalurinidase levels in urine from Wilms' tumor patients. J. Natl. Canc. Inst., 83:1569-1574, 1991).

다른 히알루론산 결정방법들이 ChiChibu(U.S. Pat. No. 5,019,498) 및 Brandt 등(U.S. Pat. No. 4,826,776)에 의해 개시되어 있다.

본 발명은 히알루론산(HA) 및 히알루로니다아제(HAase)를 이용하여 방광암을 검출 및 평가하는 신규 방법에 관한 것이다.

도 1: 수술 전후 소변 HA 수준의 결정에 의한 방광암 치료 효율의 결정. 소변 HA 수준은 ng/mg 단백질(평균±SEM)으로 표현된다. RC : 라디칼 방광절제; PC : 부분 방광절제; TURBT: 방광 종양의 경요도 절제; IC: 방광내 화학요법. RC 이후, 환자번호 2 및 환자번호 9는 각각 새로운 방광 및 회장도관을 수여하였다. 장점막은 HA를 포함하여 글리코사미노글리칸이 풍부하므로, 회장 도관 및 새로운 방광을 위해 사용된 장점막이 이러한 증가를 야기시켰다. 그러나, 이들 두 환자의 HAase 수준은 약 5배 감소(도 2 참조: 환자 번호 1 및 7)하였다. 그러므로, 치료효율을 모니터하기 위해서는 두 가지 방법을 조합하여 사용하는 것이 더욱 유용하다.

도 2: 수술 전후 소변 HAase 수준의 결정에 의한 고-등급 방광암의 치료효율 결정. 소변 HAase 수준은 mU/mg 단백질로서 표현된다(평균±SEM). 약자들은 도 1의 범례에서 설명한 바와 같다.

도 3: HA ELISA-유사 어세이에 대한 전형적인 표준 그래프의 예. 그래프의 선형 범위에서 흡광도가 판독된 소변 검체 희석액을 계산에 사용하였다. 표준 그래프를 작성하기 위해 사용한 HA는 사람 탯줄로부터 얻었다.

도 4: HAase ELISA-유사 어세이에 대한 전형적인 표준 그래프의 예. 그래프의 선형 범위에서 흡광도가 판독된 소변 검체 희석액을 계산에 사용하였다. 표준 그래프를 작성하기 위해 사용한 HAase는 스트렙토마이시즈 sp.로부터 얻었다.

도 5A 및 5B: ELISA-유사 어세이에 의한 소변 HA 수준의 측정. 하기 실시예 2에 설명한 바와 같이, 여러 개인 그룹에서 소변 HA 수준을 측정하였다.

A: 개인 HA 수준의 산포도. 이러한 카테고리에서, 도트는 각 개인의 소변 HA 수준을 나타내고, "n"은 시험된 개인의 수를 나타낸다. GU는 BPH(n=8), 전립선암(n=7), 신장결석(n=5), 방광염(n=12), 요도감염(n=8), 전립선염(n=2), 부고환염(n=1) 및 신장 외상(n=2) 등의 비뇨생식기 조건을 가지는 환자의 카테고리를 나타낸다. G3 카테고리는 G3 종양(T1-T4 단계)을 가지는 34명의 환자 및 9명의 CIS 환자를 포함한다. 점선은 100ng/mg HA 농도의 최소 컷오프 한계를 나타낸다.

B: 다양한 카테고리의 평균 소변 HA 수준의 비교. "A"에서 제공된 각 개인의 HA 수준으로부터 평균 수준을 계산하였다. 그 결과를 mg 단백질 당 ng 평균 HA 수준±SEM로 나타내었다.

도 6A 및 B: 방광 조직 추출물 중의 HA 수준의 결정. 조직 추출물 중의 HA의 농도를 하기 실시예 2에 설명한 바와 같이, ELISA-유사 어세이로 결정하였다.

A: 개인 HA 수준의 산포도. 여기서, G1과 G2+G3 종양은 각각 저-등급 및 고-등급 TCC를 나타낸다.

B: 정상 방광 및 TCC 조직 추출물 중의 HA 농도(평균±SEM).

도 7: 정상인 및 방광암 환자의 소변 HA 프로파일 조사. 정상인(n=4) 및 저-등급 TCC(G1 종양, n=4) 또는 고-등급 TCC(n=5, G2, n=2 및 G=3, n=5)를 가진 환자 소변 중의 HA 종의 크기를 하기의 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 세파로즈 6 CL-B 칼럼상의 겔-여과 크로마토그래피로 결정하였다. 칼럼은 고분자량 HA(Mr 2 x 10⁶달톤) 및 HA 단편, F1(10-15 이당류 단위체), F2(2-3 이당류 단위체), F3(∼2 이당류 단위체)를 사용하여 표준화하였다. I-V는 고-등급 TCC 환자의 요에서 나타나는 HA 피크를 나타낸다.

도 8A 및 B: HMVEC-L 유사분열촉진 반응에 대한 HA 및 HA 단편의 효과. 하기 실시예 2에 설명한 바와 같이, HMVEC-L 세포를 37℃에서 8시간 "내피세포 기본 배지" 중에서 HA 또는 HA 단편과 배양한 후, [³H]-티미딘으로 2시간 배양하였다.

A: in vitro로 생성된 HA 또는 HA 단편의 HMVEC-L 유사분열촉진 반응에 대한 효과. 대조구는 어떤 HA 또는 HA 단편도 첨가하지 않고, DNA 중에 [³H]-티미딘을 결합하는 것을 나타낸다. 대조 시료 중에 결합된 [³H]-티미딘(dpm 1031±87)을 100%로 정하였다. 결과는 3회 측정한 평균이다.

B: 고등급 TCC 환자의 소변(도 7)에서 분리된 HA 및 HA 단편(피크 I-V)의 HMVEC-L 세포의 유사분열촉진 반응에 대한 효과. 다양한 피크에 존재하는 단일 농도(2㎍/ml)의 HA를 사용하여, 유사분열촉진 반응 시험에 사용하였다. 대조구는 어떤 HA도 첨가하지 않은 [³H]-티미딘 결합을 나타낸다. 대조 시료 중에 결합된 dpm 838±49를 100%로 정하였다. 결과는 3회 측정한 평균±s.d.이다.

도 9: 기질 (HA)-겔 어세이에 의한 소변 히알루로니다아제 활성의 검출. 하기 실시예 3에 설명한 바와 같이, 소변 검체(= 약 20㎍ 단백질)를 비변성 조건하에 7.5% SDS-PAGE 기질 (HA)-겔 상에서 전기영동하였다. 전기영동에 이어, HA 소화가 이루어지도록 겔을 어세이 완충액 중에서 배양하고, 염색하고, 디스테인하였다. 레인 1 및 2: 개별적인 정상 대상자; 레인 3 및 4: G1 종양을 가진 환자 개인; 래인 5 및 6: G3 종양을 가진 환자 개인.

도 10A 및 B: ELISA-유사 어세이에 의한 소변 히알루로니다아제 활성의 정량결정. 실시예 3에 나타낸 바와 같이 히알루로니다아제 활성을 측정하였다.

A: 개인 히알루로니다아제 활성의 산포도. 각 카테고리에서, 도트는 각 개인의 소변 히알루로니다아제 활성을 나타내며, "n"은 시험된 개인의 수이다. GU: 이카테고리는 경과된 전립선암(n=10), BPH(n=8), 신장결석(n=5), 방광염(n=12), 요도감염(n=8), 전립선염(n=2), 부고환염(n=1) 및 신장 외상(n=2) 등의 비뇨생식기 조건을 가지는 환자를 포함한다. G3: 이 카테고리는 G3 종양(n=34, T1-T4 단계) 및CIS(n-6)를 가지는 환자를 포함한다.

B: 다양한 카테고리에서의 평균 히알루로니다아제 활성 비교. "A"에서 얻은 개인 히알루로니다아제 활성으로부터 평균 활성을 계산하였다. 그 결과를 mg 단백질±SEM 당 mU 평균 히알루로니다아제 활성으로 나타내었다.

도 11A 및 B: 방광 조직 추출물 중의 히알루로니다아제 활성의 결정. 하기 실시예 3에 설명한 바와 같이, ELISA-유사 어세이로 조직 추출물 중의 히알루로니다아제 활성을 결정하였다.

A: 개인 히알루로니다아제 활성의 산포도.

B: 정상 및 방광 TCC 조직 추출물 중의 히알루로니다아제 활성(평균±SEM).

도 12: 방광 종양-관련 히알루로니다아제의 pH 활성 프로파일 결정. 고등급 방광 종양을 가진 환자로부터 얻은 소변 검체 및 종양 조직 추출물을 HA-도포된 웰 상에서 상이한 pH로 배양하였다. 배양후에, 웰에 남아 있는 HA를 하기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 추정하였다. 그 결과를 하기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 계산하였다.

도 13A, B, C: 기질 (HA) SDS-PAGE에 의한 히알루로니다아제로부터 유도된 방광-종양의 분자량 결정.

A: 소변 검체의 기질 (HA) SDS-PAGE 분석. 소변 검체(∼40㎍ 단백질)을 9% SDS-PAGE 미니겔 상에서 BIoRad 광범위 전염색 분자량 마커와 함께 분리시켰다. 전기영동 후에, 겔을 하기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 처리하였다. 레인 1: G1 종양을 가진 환자로부터의 소변 검체; 레인 2: G2 종양을 가진 환자로부터의 소변 검체; 레인 3: G3 종양을 가진 환자로부터의 소변 검체; 레인 4: 정상인으로부터의 소변 검체.

B: 총 요단백질의 SDS-PAGE 분석. G3 종양을 가진 환자로부터 얻은 소변 검체(~20㎍ 단백질)를 BIoRad 광범위 전염색 분자량 마커와 함께 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 전기영동 후에, 겔을 은 염색하였다.

C: 조직 추출물의 기질 (HA)SDS-PAGE 분석. G3 종양 및 정상 방광 조직검체로부터 제조한 추출물(40㎍ 단백질)을 BIoRad 광범위 전염색 분자량 마커와 함께 12% 기질 (HA)SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 전기영동 후에, 겔을 하기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 처리하였다. 좌측 레인:G3 종양 조직 추출물; 우측 레인: 정상 방광 조직 추출물.

본 발명의 방법은 소변 중의 HA 및 HAase 수준이 방광암을 검출, 이의 등급을 평가, 이의 치료 효율을 모니터링하는 진단 마커라는 발견에 기초한다.

본 발명에서, HA 및 HAase 수준의 측정은 ELISA-유사 어세이이므로, 기술적으로 간단하다. 두 어세이 모두, 잘 알려진 방법(Tengblad, A. Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding proteins from cartilage. Biochim. Biophys. Acta, 578:281-289, 1979)으로 대량 정제할 수 있는 HA-결합 단백질만을 필요로 한다. 두 어세이 모두 간단하며, 비침입성이면서도 감도와 특이도가 높은 시험법으로, 방광암 검출을 위해 임상적으로 사용할 수 있다. HA 측정용 ELISA-유사 어세이(HA 시험)는 종양 등급에 관계 없이 방광암을 검출한다. HAase 측정용 ELISA-유사 에세이(HAase 시험)는 중간-등급(G2) 내지 고-등급(G3) 방광 종양을 차별적으로 검출한다.

소변 히알루로니다아제 측정은 G2, Ta 종양뿐아니라 CIS(전-침습성 G3 방광 종양)를 검출하기 때문에, 본 발명은 환자에게 좋지 않은 예후를 제공하는 G2 및 G3 방광 종양의 초기 검출을 위해서는 더욱 우수한 비침입성 방법이다.

따라서, 본 발명의 일 실시형태에서는, 방광암이 의심되는 환자로부터 수집한 생물학적 체액 시료(예를 들어, 소변 검체 등) 중의 HA를 정량적으로 측정하여 방광암을 시험한다. HA의 존재여부를 결정하고, 측정하기 위해서는, 방사능분석, 샌드위치 어세이, 억제 어세이등을 포함하는 어떠한 종래의 어세이 방법도 사용할 수 있으나, HA는 경쟁적 결합 어세이로 측정하는 것이 바람직하다. ELISA 시험과 동일하되, 항체 복합체 메카니즘을 사용하지 않는 방법으로 본 발명을 실시하는 것이 더욱 바람직하다.

예를 들어, (a) 고체 지지체(미세역가 웰이 바람직하다)에 HA를 도포하는 단계;

(b) HABP가 고체 지지체에 도포된 HA 및 시료 중의 HA(존재한다면)에 결합할 수 있는 조건에서, 방광암으로 의심되는 환자로부터 수집한 생물학적 체액(소변 시료 등)의 시료 존재하에, HA 결합 단백질(HABP)을 도포한 고체 지지체와 접촉, 배양하는 단계;

(c) HA 도포된 고체 지지체에 결합된 HABP의 양을 결정하고, 이로부터 시료에 존재하는 HA의 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 어세이 방법으로 방광암을 검출할 수 있다.

이러한 실시형태에서는, 도포된 HA와 시료 중에 포함된 HA가 HABP와 결합하려고 "경쟁한다". 시료 내에 HA가 존재하는 경우, 예를 들어, 표준량과의 비교에 의해 결정되는 것과 같이, 도포된 HA에 더 적은 량의 HABP가 결합하게 된다. 다시 말해, 도포된 HA에 결합된 HABP가 적다는 것은 방광암의 시료 내에 HA가 존재한다는 것을 의미하며, 이는 방광암일 수 있다는 것을 나타낸다.

고체 지지체에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양을 결정하고, 이로부터 시료 내에 존재하는 HA의 양을 결정하는 바람직한 방법은 결합된 HABP에 의해 제공되는 또는 이와 관련된 신호를 검출하는 것이다.

예를 들어, 고체 지지체에 결합된, 비오티닐화된 HABP의 간접측정으로서, 착색 생성물의 흡광도를 측정하기 위해 미세역가 플레이트 판독기를 사용할 수 있다(착색 생성물을 생성하기 위해서는 아비딘-효소 컨쥬게이트 및 표지된 기질을 사용한다). HA-도포된 웰을 어떤 HA 또는 HA-함유 시료도 없는 완충액 만으로 배양하면 최대 흡광도를 얻을 수 있다. 흡광도 대 ng/ml HA를 플롯하여 표준 그래프를 작성할 수 있다. 이 표준 그래프를 이용하여, 각각의 시료 희석액 중의 HA 농도(ng/ml)를 계산할 수 있다. 수개의 이러한 결정으로부터, 각 시료의 평균 HA 농도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 자동화 분석법에 의해서, 또는 단백질 어세이 키트(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 시료의 단백질 농도(mg/ml)를 결정할 수 있다. HA 농도는 단백질 함량으로 표준화할 수 있으며, ng/mg 단백질로 나타낼 수 있다.

예를 들어, 소변 HA 수준을 결정하기 위한 계산법은 하기와 같다.: A x 희석 벡터 ÷ mg/ml 요단백질, 여기서, A는 표준 그래프로부터 외삽된 ng/ml HA 농도이다. HA 수준은 최종적으로 ng/mg 총 단백질로서 표현된다. 판독된 흡광도가 낮은 것은 소변 시료에 상당량의 HA가 존재함을 나타내며, 이는 그 자체로 환자에게 방광암이 있다는 것을 나타낸다.

일반적으로, 계산결과 시료 중의 HA가 약 100ng/mg 이상이면, 환자가 방광암이 있음을 나타낸다.

HA를 이용하여 방광암을 검출하는 본 방법의 감도는 약 88% 이상(100%일 수 있다)일 수 있으며, 특이도는 약 87% 이상(100%일 수 있다)일 수 있다. 이러한 발명에서, 특이도는 허위 양성을 측정하는 것으로 이해되며, 100%의 특이도는 허위 양성이 없음을 의미한다(즉, 환자가 실제로 방광암이 없는 경우에, 방광암이 존재한다고 제안되지 않는다). 감도는 허위 음성을 측정하는 것으로 이해되며, 100%의 감도는 허위 음성이 없음을 의미한다(즉, 환자가 실제로 방광암이 있는 경우에, 방광암이 없다고 제안되지 않는다).

본 발명의 다른 실시형태에서, 방광암으로 의심되는 환자로부터 수집한 생물학적 체액(소변 검체 등) 시료 중의 HAase를 정량적으로 측정하여 방광암의 등급을 평가하기 위해 방광암을 시험할 수 있다. HA에서와 같이, HAase의 존재여부를 결정하고, 측정하기 위해서는, 방사능분석, 샌드위치 어세이, 억제 어세이 등을 포함하는 어떠한 종래의 어세이 방법도 사용할 수 있으나, HAase는 경쟁적 결합 어세이로 측정하는 것이 바람직하다. ELISA 시험과 동일하되, 항체 복합체 메카니즘을 사용하지 않는 방법으로 본 발명을 실시하는 것이 더욱 바람직하다.

(b) 시료 중의 HAase(존재한다면)가 고체 지지체 상에 도포된 HA를 분해할 수 있는 조건하에서, 방광암으로 의심되는 사람으로부터 수집한 생물학적 시료를 도포된 고체 지지체와 접촉, 배양하는 단계;

(c) HA 결합 단백질(HABP)이 고체 지지체에 도포된 미분해 HA 모두에 결합하는 조건하에서, 도포된 고체 지지체와 HABP을 접촉, 배양하는 단계;

(d) 고체 지지체에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양을 결정하고, 이로부터 시료에 존재하는 HA의 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 어세이 방법으로 방광암을 검출할 수 있다.

이러한 실시형태에서, HAase가 시료 중에 존재하는 경우, HAase가 도포된 HA를 분해하여, 예를 들어, 표준량과의 비교에 의해 결정되는 것과 같이, 도포된 HA에 더 적은 양의 HABP가 결합하게 된다. 도포된 HA에 결합된 HABP의 측정량이 적다는 거은 중간 또는 고-등급 방광암임을 나타낸다.

고체 지지체에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양을 결정하고, 이로부터 시료 내에 존재하는 HAase의 양을 결정하는 바람직한 방법은 결합된 HABP에 의해 제공되는 또는 이와 관련된 신호를 검출하는 것이다.

예를 들어, 고체 지지체에 결합된, 비오티닐화된 HABP의 간접측정으로서, 착색 생성물의 흡광도를 측정하기 위해 미세역가 플레이트 판독기를 사용할 수 있다(착색 생성물을 생성하기 위해서는 아비딘-효소 컨쥬게이트 및 표지된 기질을 사용한다). HA-도포된 웰을 어떤 HAase 또는 HAase-함유 시료도 없는 완충액 만으로 배양하면 최대 흡광도를 얻을 수 있다. 흡광도 대 mU/ml 스트렙토마이시즈 HAase를 플롯하여 표준 그래프를 작성할 수 있다. 이 표준 그래프를 이용하여, 각각의 시료 희석액 중의 HAase 농도(mU/ml)를 계산할 수 있다. 수개의 이러한 결정으로부터, 각 시료의 평균 HAase 농도를 결정할 수 있다. 자동화 분석법에 의해서, 또는 단백질 어세이 키트(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 시료의 단백질 농도(mg/ml)를 결정할 수 있다. HAase 농도는 단백질 함량으로 표준화할 수 있으며, mU/mg 단백질로 나타낼 수 있다.

소변 HA 수준을 결정하기 위한 계산법은 하기와 같다.: A x 희석 벡터 ÷ mg/ml 요단백질, 여기서, A는 표준 그래프로부터 외삽된 mU/ml HAase 농도이다. HAase 수준은 최종적으로 mU/mg 총 단백질로서 표현된다. 판독된 흡광도가 낮은 것은 소변 시료에 다량의 HAase가 존재함을 나타내며, 이는 그 자체로 환자에게 중간 내지 고-등급의 방광암이 있다는 것을 나타낸다.

일반적으로, 계산결과 시료 중의 HAase가 약 10mU/mg 이상이면, 환자에게 중간- 또는 고-등급 방광암이 있음을 나타낸다.

중간- 내지 고-등급 방광암을 검출하는 본 방법의 감도는 약 85% 이상(100%일 수 있다)일 수 있으며, 특이도는 약 88% 이상(100%일 수 있다)일 수 있다.

저-등급 방광암을 검출하기 위해서는, HA 및 HAase 시험을 조합하여 사용할 수 있다. 계산결과 HAase가 약 10 mU/mg 이하(도포된 HA에 더 많은 양의 HABP가 결합)이면, 저-등급 방광암이거나, 방광암이 전혀 없음을 나타낸다. HAase 어세이를 사용하는 본 발명의 이러한 실시형태로는 저-등급 방광암인지 방광암이 전혀 없는지 구별하지 못한다. 따라서, HA 어세이는 특정 등급을 구별할 수는 없으나, 저-등급 방광 종양의 존제를 검출할 수 있기 때문에, 환자를 시험할 때는 HA 어세이와 HAase 어세이를 함께 사용하는 것이 바람직하다. 그러므로, 저-등급 방광 종양을 검출 및 진단하기 위해서는 HA 및 HAase 어세이를 모두 실시한다. HA 어세이는 양성 반응(즉, HA 수준이 약 100mg/mg을 넘어, 종양이 존재하는 것으로 나타남)을 나타내고, HAase가 음성 반응(즉, HAase 수준이 약 10mU/mg 이하로, 중간- 내지 고-등급 종양이 존재하지 않는 것으로 나타남)을 나타낸다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 방광암을 시험 및 평가하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 이 키트는 HA 및/또는 HAase, HABP 및 표지 또는 표지에 컨쥬게이트된 HABP, 및 생물학적 시료 중의 HA 및/또는 HAase의 존재를 검출하는 데 사용하기에 적합한 보조제를 포함하여 이루어진다. 본 발명에서 고려되는 진단 키트의 예로는 종래의 딥스틱 시험 기구를 들 수 있다.

본 발명의 이러한 또는 다른 실시형태를 하기에 더욱 상세히 설명한다.

비침입성이고, 감도와 특이도가 높으며, 방광암 검출 및 방광암 등급 평가 방법은 본 발명 이전에는 알려져 있지 않았다. 소변 HA 수준을 방광암 검출용 마커로서 사용할 수 있으며, 소변 히알루로니다아제 수준을 방광 종양 등급의 진단 표지로 사용할 수 있다는 것은 이전에는 공지되어 있지 않았다. 소변 중의 HA 및 히알루로니다아제 수준이 침습성 암종을 검출하는 데 진단적으로 사용될 수 있다는 것은 제안된 적이 없었다. 또한, 비오티닐화된 HA 결합 단백질을 사용하는(항체를 사용하지 않고) ELISA-유사 어세이 및 하기에 설명된 특정 기술은 소변 HA 및 히알루로니다아제 수준을 결정하는 데 사용된 적이 없다.

히알루론산(HA) 측정 (HA 시험)

하기 실시예 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HA 어세이(약 100ng/mg에서)는 방광 종양의 검출에 있어서, 약 88% 이상(100%일 수 있다)의 감도 및 약 87% 이상(100%일 수 있다)의 특이도를 나타낸다. 이는 현재 방광암 검출 방법으로 알려진 방법에 비해 월등하며, 개선된 것이다.

물론, 본 기술 분야의 숙련자라면 누구나 인정하듯이, HA 농도의 컷오프 한계는 변화될 수 있으므로, 모집단분포(population spread)를 고려해야 한다. 방광암 상태가 적절히 측정되도록 HA 농도의 컷오프 한계를 설정할 때, 예를 들어, 나이, 식이, 시료 중의 단백질 농도, 환경적 영향, 유전적 배경, 수분공급 상태, 병력, 신체 조건, 성별, 체중 등의 인자를 고려할 수 있다.

HA 어세이를 사용하여 저-등급 및 저-단계 방광 종양(즉, G1 및 Ta)까지 검출하는 성능은 본 발명의 본 실시형태의 또 다른 중요한 특징이다. 상기한 3가지의 공지된 비침입성 요시험-즉, 혈뇨 홈 스크리닝 테스트, 바르드 BTA 시험 및 NMP22 시험-은 이러한 종양을 고감도로 검출하지 못한다. 이러한 종양은 또한 어떤 임상적 증상도 나타나지 않으므로, 장기간 동안 검출할 수 없었다. 그러나, 하기한 바와 같이, 소변 HA 수준은 고-등급 및 고-단계 종양을 검출(88-96%)할 뿐아니라 비슷한 고감도로 저-등급 및 저-단계 종양도 검출(88-90%)한다.

HA 어세이의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 HA를 고체상의 표면에 흡착시키는 것으로부터 시작한다. HA는 사람 탯줄 등의 사용하기 좋은 공급원으로부터 얻을 수 있다. 고체상은 니트로셀룰로오즈 등, 통상의 어떤 고체상도 사용할 수 있으며, 미세역가 웰이 바람직하다. HA를 고체상에 흡착시킨 후, 고체상의 표면을 통상의 완충액(들)으로 세척하는 것이 바람직하다.

고체상 표면에는 여전히 HA 또는 다른 분자들과 결합할 수 있는 부위가 남아있으므로, 시료를 첨가하기 전에 차단 물질을 첨가하여, 고체상에서 HA가 흡착되지 않은 부분을 커버하는 것이 바람직하다. 적합한 차단물질의 예로는 암소 또는 다른 동물로부터 얻은 γ-글로불린 및 알부민이 포함된다. 소 혈청 알부민이 바람직하다. 고체상의 흡착되지 않은 부위를 차단한 후에는, 고체상의 표면을 통상의 완충액으로 세척하는 것이 바람직하다.

다음으로, HA를 분석하고자 하는 것이므로, 방광암으로 의심되는 사람으로부터 수집한 생물학적 체액의 존재하에, 도포된 고체 지지체에 HA 결합 단백질(HABP)을 첨가하고, HABP가 고체 지지체 상에 도포된 HA 및 소변의 HA(존재한다면)에 결합할 수 있는 조건으로 배양하였다. 배양시간 및 조건은 광범위하게 변경할 수 있으나, 배양시간은 약 4 내지 약 16시간, 배양온도는 약 4℃ 내지 37℃가 바람직하다. 본 기술 분야에서 보통의 기술자에게 이해될 수 있을 만큼, 배양시간이 더 길거나, 더 짧고, 배양온도가 더 높거나, 더 낮을 수 있다.

본 발명의 어세이에 사용하기에 적합한 HABP는 소의 코 연골(Tengblad, Biochim. Biophys. Acta, 578:281-289, 1979), 돼지 후두 연골(Fosang et al., Matrix, 10: 306-313, 1990)등의 많은 공급원으로부터 쉽게 정제할 수 있다.

도포된 HA 및/또는 시료 HA에 HABP를 결합시킨 후에는, 고체상의 표면을 통상의 완충액(들)으로 세척하는 것이 바람직하다.

다음으로, 고체 지지체 상에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양을 결정한다. HABP는 비오티닐화시키고, 결합된 HABP는 배양 후에 아비딘-효소 컨쥬게이트 및 착색 생성물을 생성하는 효소의 기질과 함께 배양하여 가시화하는 것이 바람직하다. 이러한 검출 시스템은 표지로서 방사능을 사용하지 않으며, 다중 마커(즉, 효소 분자)를 고체 지지체에 결합된 모든 HABP에 고정시키고, 효소의 교체(turnover)를 통하여 신호(즉, 착색 생성물)를 증폭시킨다. 적합한 마커 시스템의 예로는 효소, 형광, 화학발광, 효소-기질, 동위원소 마커, 방사성 표지 등이 포함된다. 고체 지지체상에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양은 아비딘-비오틴 검출 시스템을 통하여 결정하는 것이 바람직하다. 다른 유용한 마커 시스템으로는 케라틴 설페이트와 케라틴 설페이트-반응성 항체가 있다. 소변 HA 수준은 미세역가 플레이트 판독기를 사용하여 유용하게 결정될 수 있으며, 표준 그래프로부터 외삽될 수 있다. 도포된 HA와 결합한 HABP의 양은 생물학적 체액 시료를 제공한 환자에게 방광암이 존재하는 지의 여부와 서로 관련이 있다.

HA 어세이를 위해서는, 정제된 히알루론산을 표준으로 사용하는 것이 바람직하다.

히알루로니다아제(HAase) 측정(HAase 시험)

본 발명에서, HAase를 분석하고자 하는 경우에는, HA 어세이에서와 동일한 방법으로 HA를 고체상 표면에 흡착시킨다. 생물학적 체액 중의 HAase를 측정하는 것이라면, 방광암을 검출하는 본 발명과 함께 어떤 통상의 어세이도 사용할 수 있다.

고체상 표면에 HA를 흡착시킨 후에는, 고체상의 표면을 통상의 완충액(들)으로 세척하는 것이 바람직하다.

다음으로, 도포된 고체 지지체에 방광암이 의심되는 사람으로부터 수집한 생물학적 체액(예를 들어, 소변)을 가하고, 시료에 존재하는 HAase(존재한다면)가 고체 지지체에 도포된 HA를 분해할 수 있도록 하는 조건하에서 배양한다.

배양한 후에는, 분해된 HA를 통상의 완충액(들)으로 세척하여 제거하는 것이 바람직하다.

다음으로, HABP를 가하기 전에, 상기 HA 어세이에서와 같이, 차단물질(예를 들어, 혈청 알부민)을 가하여, 고체상에서 HA가 흡착되지 않은 부분을 커버하는 것이 바람직하다. 고체상의 흡착되지 않은 부위를 차단한 후에는 고체상의 표면을 통상의 완충액(들)으로 세척하는 것이 바람직하다.

그리고 나서, HABP가 고체 지지체 상에 도포된 미분해 HA에 결합할 수 있는 조건하에, 고체상을 HABP에 노출시켰다. HA 어세이에서와 같이, 배양시간 및 조건은 광범위하게 변화될 수 있으나, 약 30분 내지 약 1시간의 배양시간 및 약 37℃의 배양온도가 바람직하다. 본 기술 분야에서 보통의 기술자에게 이해될 수 있을 만큼, 배양시간이 더 길거나, 더 짧고, 배양온도가 더 높거나, 더 낮을 수 있다.

도포된 HA에 HABP를 결합시킨 후에는 고체상의 표면을 통상의 완충액(들)으로 세척하는 것이 바람직하다.

다음으로, 고체 지지체에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양을 결정한다.

HABP는 비오티닐화시키고, 결합된 HABP는 배양 후에 아비딘-효소 컨쥬게이트 및 착색 생성물을 생성하는 효소의 기질과 함께 배양하여 가시화하는 것이 바람직하다. 이러한 검출 시스템은 표지로서 방사능을 사용하지 않으며, 다중 마커(즉, 효소 분자)를 고체 지지체에 결합된 모든 HABP에 고정시키고, 효소의 교체(turnover)를 통하여 신호(즉, 착색 생성물)를 증폭시킨다. 적합한 마커 시스템의 예로는 효소, 형광, 화학발광, 효소-기질, 동위원소 마커, 방사성 표지 등이 포함된다. 고체 지지체상에 도포된 HA에 결합된 HABP의 양은 아비딘-비오틴 검출 시스템을 통하여 결정하는 것이 바람직하다. 다른 유용한 마커 시스템으로는 케라틴 설페이트와 케라틴 설페이트-반응성 항체가 있다. 소변 HA 수준은 미세역가 플레이트 판독기를 사용하여 유용하게 결정될 수 있으며, 표준 그래프로부터 외삽될 수 있다. 도포된 와 결합한 HABP의 양은 생물학적 체액 시료를 제공한 환자에서 방광암이 존재하는 지의 여부 및 암의 등급과 서로 관련이 있다. 계산 결과가 약 10mU/mg 이상이면 중간 또는 고등급 방광암임을 나타낸다.

물론, 본 기술 분야의 숙련자라면 누구나 인정하듯이 HA 농도의 컷오프 한계는 변화될 수 있으므로, 모집단분포(population spread)를 고려해야 한다. 방광암 상태가 적절히 측정되도록 HA 농도의 컷오프 한계를 설정할 때, 예를 들어, 나이, 식이, 환경적 영향, 수분공급 상태, 신체 조건, 성별, 체중 등의 인자를 고려할 수 있다.

HAase 어세이를 위해서는, 정제된 히알루로니다아제를 표준으로 사용하는 것이 바람직하다.

하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 중간- 내지 고-등급 TCC를 검출하는 HAase법의 감도는 약 85% 이상(100%일 수 있다)이고, 특이도는 88% 이상(100%일 수 있다)이다. 따라서, 본 발명의 HAase 어세이는 중간 및 고등급 방광 종양을 검출하고 방광 종양의 등급을 평가하는 데 모두 유용하다.

발명의 HA 및 HAase어세이는 개별적으로 사용될 수 있으나, 서로 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. HAase 어세이 단독으로는 저등급 방광암(즉, 계산결과가 약 10mU/mg이하)을 양성적으로 검출 및/또는 평가할 수 없다. 그러나, 상기한 바와 같이, HA 및 HAase를 함께 사용하여 환자의 생물학적 체액 시료를 시험하면 저등급 방광암을 검출할 수 있다.

예비 안정성 연구는 실온에서 8시간 이상(약 16시간 이하) 배양한 후에도 HA 및 HAase가 안정하다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 스폿 소변 검체를 분석하여, 결과적으로, 아침 최초 배설(first morning void) 등의 특별한 조건이 필요없다는 것을 알아내었다. 본 발명의 시험은 시료 중의 HA(ng/ml) 및 HAase(mU/ml) 수준을 단백질 농도(mg/ml)로 표준화(normalization)하는 것을 포함하기 때문에, 환자의 수분 공급 상태가 결과에 영향을 주지 않는다. 총 단백질은 방광암 환자에게서 보통 발견되는 조건인 혈뇨에 의한 영향이 적으므로, 총 크레아티닌 대신에 총 단백질로 표준화하는 것이 바람직하다.

상기한 용도 외에도, 본 발명의 HA 및 HAase용 어세이는 다양하게 응용할 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이, 본 발명은 방광암을 검출하고, 이의 등급을 평가하는 선별 검사 방법을 포함한다. 이는 특히 방광암의 발병을 초기에, 특히 매우 위험한 상태에 있는 사람(예를 들어, 흡연자, 페인트, 염료 및 가죽 산업 종사자)에서 검출하기에 유용하다.

본 발명은 또한 방광암의 치료 효율을 평가하는 방법을 고려한다(즉, 치료 전후에 환자를 시험함으로써). 유사하게, 본 발명은 방광암의 장기간 추적하여 종양 재발을 모니터 하기 위한 방법으로서 유용하다.

또한, 본 발명의 어세이는 선별검사, 치료효율 평가 및 소변이 종양과 접촉되는 경우, 다른 모든 비뇨기과적 악성종양(즉, 빌름스 종양, 전립선 종양, 신장암, 수뇨관암, 요도암, 신장-골반암 등)의 추적에 유용하다.

본 어세이는 HA 및 HAase를 안정화시키기 위하여 종양에 분출될 수 있는 체액이나, 표준 식염수가 종양과 접촉하는 경우, 다른 종양을 선별검사하는 데 유용하다. HA 및/또는 HAase를 어세이할 수 있다.

본 발명은 HA 및/또는 HAase를 사용하여 방광 및/또는 다른 비뇨기 암을 검출하고, 이의 등급을 평가하는 딥스틱 시험에의 응용을 고려한다. 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여, 상기한 바와 같이 딥스틱 형태의 고체상을 HA 또는 HAase을 어세이하는 데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 기술분야의 숙련자에게는 공지되어 있듯이, 딥스틱은 HA가 도포되어 있거나, 스며들어 있을 수 있다. 물론, 딥스틱은 소변을 포함하여(이에 제한되지는 않음) 모든 생물학적 체액을 시험하는 데 사용할 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 서적, 기사 및 특허의 전문을 본 명세서에 참고문헌으로 첨부한다. 특히, 본 발명의 전체 내용이 1996년 2월 1일 출원된 미합중국 가출원 제60/010,976호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서가 근거하고 있는 참고문헌으로 첨부한다.

하기 설명예 및 비교예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들은 상세한 설명 및 청구범위의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1 -- HA 및 HAase의 초기 연구

TCCs 환자, 다른 GU 상태의 환자 및 정상인에 대하여 소변의 HA 및 HAase 수준을 비교하였다. 처리 효과를 평가하기 위한 HA 및 HAase 수준 측정의 유용성도 평가하였다. 비오티닐화된 소의 코 연골 HA 결합 단백질(HABP)을 사용하여 소변의 HA 및 HAase 수준을 측정하였다. 소변의 HA 및 HAase 수준을 소변 단백질 수준으로 표준화(normalize)하고, ng/mg 단백질 및 mU/mg 단백질로 각각 나타내었다.

공지된 어세이(Stern et al. 등)와 달리, 이 어세이에서는 소변 HA 및 HAase 수준을 소변 단백질 농도로 표준화하여, 소변의 HA/HAase 수준 및 방광암/중간 내지 고-등급 방광암간의 상관관계에 영향을 미치는 중요 인자인 환자의 수분공급 상태에 대하여 보정하였다. 이것은 수분공급 상태가 소변의 화학물질 수준에 영향을 주는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서, 단백질은 방광암인 경우에 공통적으로 발견되는 혈뇨(소변 중 혈액)에 의하여 영향을 덜 받기 때문에, 소변 HA/HAase를 크레아티닌이 아닌 단백질로 표준화하는 것이 바람직하다.

검체 수집:

모든 대상으로부터 배설된 소변 시료(clean-catch)를 수집하고, 어세이할 때까지 -20℃로 저장하였다. 어세이시에, 시료를 녹이고, 4℃에서 10분간 2,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

소변의 HA 측정 어세이

96-웰 미세역가 웰(Corning, Corning, NY)을, 0.1M 중탄산나트륨 용액(pH 9.2) 중에 용해된 인간 탯줄 HA(human umbilical cord HA)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; 25㎍/ml)로 도포하였다. 4℃에서 약 16시간(밤새)동안 도포하였다. (또한, 이 반응은 37℃에서 4시간동안 다소 효과적으로 실시되었다.)

HA-도포 웰을 인산염 완충 식염수(PBS)로 3번 세척하였다. 웰을 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS(PBS+Tween)로 제조한 1% 소혈청 알부민(BSA) 용액 중에 37℃로 1시간 동안 배양하여, 웰의 비-특이 부위를 차단하였다.

배양 후, 웰을 PBS+Tween로 3회 세척하고, 이어서 비오티닐화 소의 코 연골 HA-결합 단백질(HABP;1㎍/ml), 여러 농도의 소변 검체(0.5-10㎕) 또는 인간 탯줄 HA(0.1-60ng/ml)을 함유하는 PBS+Tween 200㎕(최종 용적)(당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 다른 용적을 사용할 수 있다.)에서 16시간(밤새)동안 실온으로 배양하였다. 문헌(Tengblad, Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding proteins from cartilage, Biochim, Biophys. Acta, 578: 218-289, 1979)에 기재된 방법에 따라 HABP를 정제하였다.

웰을 HABP로 배양한 후 PBS+Tween로 5회 세척하고, PBS와 0.1% Tween 20, 및 Elite Vectastain ABC kit^TM(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로부터의 시약 A 및 B를 사용하여(PBS와 0.1% Tween 20용액 10ml당 시약 A 및 B를 4방울) 실온(약 23℃)에서 30분간 제조사의 지시 사항에 따라 배양하였다.

배양 후, 웰을 PBS+Tween으로 3회, PBS로 2회 세척하고, pH 5.3 완충액, ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산)) 및 과산화수소 용액을 증류수 10ml중에 각각 4방울씩 혼합하여 제조한 기질(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 용액으로 제조사의 지시 사항에 따라 배양하였다. 미세역가 플레이트를 어둠 속에 실온으로 발색(녹색)될 때까지 배양하였다.

발색 생성물의 흡광도를 미세역가 플레이트 판독기(microtiter plate reader)로 405nm에서 측정하였다. 각 어세이의 경우, 어떤 HA 또는 HA-함유 소변 검체 없이 완충액만을 갖는 HA-도포 웰을 배양하여 최대 흡광도(A_max)_405nm를 얻었다. 비도포 웰 상에 HA를 배양하여 (A_min)_405nm를 얻었다. 어세이에 사용되는 HA(ng/ml)의 알려진 농도에 대한 흡광도(405nm)를 플롯하여 표준 그래프를 만들었다. 이러한 ELISA-유사 어세이를 위한 표준 그래프의 예를 도 3에 도시하였다. 이러한 표준 그래프를 사용하여, 각 소변 검체 희석액 중 HA 농도(ng/ml)를 계산하였다. 이러한 측정을 수회 행하여, 각 검체의 평균 HA 농도를 측정하였다. 자동 분석하거나 단백질 어세이 키트(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 소변 단백질 농도(mg/ml)를 결정하였다. HA 농도를 단백질 함량으로 표준화하고, ng/mg 단백질로 나타내었다. 소변 HA 수준을 결정하기 위하여 다음과 같이 계산하였다.:

A x 희석 인자 ÷ mg/ml 소변 단백질

(단, 상기 식에서, A는 표준 그래프로부터 외삽된 HA 농도, ng/ml이다.) 인간 탯줄 HA를 사용하여 얻어진 표준 그래프의 예를 도 3에 도시한다.

소변 HA 측정

전체 139명의 환자를 대상으로 소변 HA 수준을 측정하였다. 이들에는 정상인(n=25), GU 상태의 환자(예를 들면, 방광염, 신장결석, 양성 전립선 과형성(BPH), 요로감염, 전립선염, 및 신장 외상; n=40) 및 방광 TCCs 환자(n=74; Gl, n=17; G2, n=14 및 G3 + CIS, n=43)가 포함되었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 모든 TCC 환자의 평균 소변 HA 수준은 정상인 및 여러 다른 GU 상태의 환자보다 4 내지 7배가 높다(P < 0.001).

저-등급 및 저-단계(G1, Ta)의 방광염 환자에 있어서, 소변의 HA 수준도 통계적으로 매우 높다는 것을 주목해야 한다.

처리 효과를 모니터하기 위한 HA 수준 측정의 유용성을 평가하기 위하여, 14명의 환자에 대하여 전- 및 후-처리 요소 HA 수준을 측정하였다. 처리 1 내지 3 주 후, 후-처리 수준을 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대다수 환자들은 수술 전의 높은 HA 수준이 처리 후에는 감소하여, 소변의 HA 수준 측정도 처리 효과의 모니터에 유용하다는 것을 알 수 있다.

ELISA-유사 어세이를 통한 여러 개인 그룹의 소변 HA 수준 측정. 결과는 평균±SEM 으로 나타내고, "n"은 각 카테고리에 속한 사람수를 나타낸다.

카테고리	n	HA 수준(ng/mg)
정상	25	48.9±6.5
GU 환자	40	78.5±7.4
G1 TCCs	17	253.2±42.1
G2 TCCs	14	291.3±68.4
G3 + CIS	43	428.3±67.1

소변 HAase 측정을 위한 어세이

96-웰 미세역가 웰(Corning, Corning, NY)을, 0.1M 중탄산 나트륨 용액(pH 9.2)에 용해시킨 인간 탯줄 HA(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO; 200㎍/ml)로 도포하였다. 4℃에서 약 16시간(밤새)동안 도포하였다. (이 반응은 37℃에서 4시간동안 다소 성공적으로 실시되었다.)

HA-도포 웰을 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고, 여러 농도의 소변 검체(0.5-10㎕) 또는 정제된 스트렙토마이시즈 히알루로니다아제(0.02-40mU/ml)(Calbiochem, San Diego, CA)와 함께, 100㎕(당업자에게 명백한 바와 같이, 다른 체적을 사용할 수 있다.)의 HAase-ELISA 완충액[0.1M 포름산나트륨, 0.1-0.15M NaCl 및 0.2mg/ml 소혈청 알부민(BSA), pH 4.3] 중에서 37℃에서 약 16시간(밤새)동안 배양하였다.

배양 후, 웰 상의 분해된 HA를 PBS 및 0.05% Tween 20(PBS + Tween)을 함유하는 용액으로 세척하여 제거하였다. 웰을 PBS+Tween으로 제조한 1% BSA 용액에서 37℃로 1시간동안 배양하여, 웰 상의 비-특이 부위를 차단하였다.

배양 후, 웰을 PBS+Tween에서 3회 세척하고, PBS+Tween, 0.1% BSA 및 비오티닐화 소의 코연골 HA-결합 단백질(HABP) 5㎍/ml를 함유하는 용액 중에 37℃로 1시간동안 배양하였다. HABP를 문헌(Tenglad, Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding proteins from cartilage, Biochim, Biophys. Acta, 578: 218-289, 1979)에 기재된 방법에 따라 HABP를 정제하였다.

배양 후, 웰을 PBS+Tween으로 3회, PBS로 2회 세척하고, pH 5.3 완충액, ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산)) 및 과산화수소 용액을 증류수 10ml중에 각각 4방울씩 혼합하여 제조한 기질(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 용액으로 제조사의 지시 사항에 따라 배양하였다. 미세역가 플레이트를 어둠 속에 실온으로 발색(녹색)될 때까지 배양하였다. 발색 생성물의 흡광도를 미세역가 플레이트 판독기(microtiter plate reader)로 405nm에서 측정하였다.

각 어세이의 경우, 어떤 HAase 또는 HA-ase 함유 소변 검체 없이 완충액만을 갖는 HA-도포 웰을 배양하여 최대 흡광도(A_max)_405nm를 얻었다. 비도포 웰 상에 HAase를 배양하여 (A_min)_405nm를 얻었다. 스트렙토마이시즈 HAase(mU/ml)의 알려진 농도에 대한 흡광도(405nm)를 플롯하여 표준 그래프를 만들었다. 이러한 ELISA-유사 어세이를 위한 표준 그래프의 예를 도 4에 도시하였다. 이러한 표준 그래프를 사용하여, 각 소변 검체 희석액 중 HAase 농도(mU/ml)를 계산하였다. 이러한 측정을 수회 행하여, 각 검체의 평균 HAase 농도를 측정하였다. 자동 분석하거나 단백질 어세이 키트(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 소변 단백질 농도(mg/ml)를 측정하였다. HAase 농도를 단백질 함량으로 표준화하고, mU/mg 단백질로 나타내었다.

소변 HAase 수준을 결정하기 위하여 하기와 같이 계산하였다.:

A x 희석 인자 ÷ mg/ml 소변 단백질

(단, 상기 식에서, A는 표준 그래프로부터 외삽된 HAase 농도, mU/ml이다.) 스트렙토마이시즈 HAase를 사용하여 얻어진 표준 그래프의 예를 도 4에 도시한다.

소변 HA 측정

전체 131명의 환자를 대상으로 소변 HAase 수준을 측정하였다. 이들에는 정상인(n=16), GU 상태의 환자(n=45; 상기의 양성 상태 환자 n=35 및 경과된 전립선암 환자 n=10) 및 방광 TCC 환자(n=70; G1, n=22; G2, n=9 및 G3 + CIS, n=39)가 포함되었다.

표 2에 나타난 바와 같이, G2 또는 G3+CIS 종양 환자의 소변 HAase 수준은 G1 종양 환자, GU 상태의 환자 및 정상인보다 5 내지 8배가 높다(P < 0.001). 저-등급 및 저-단계(G1, Ta)의 방광염 환자에 있어서, 소변의 HA 수준도 통계적으로 매우 높다는 것을 주목하는 것이 중요하다. ELISA-유사 어세이는, 10mU/mg 컷-오프 한계(cut-off limit)에서, 중간- 내지 고-등급 TCCs를 검출하기 위하여 100% 감도, 88% 특이성을 갖는다.

처리 효과를 모니터하기 위한 HAase 수준 측정의 유용성을 평가하기 위하여, 17명의 고-등급 TCCs(G3 종양 또는 CIS) 환자에 대하여 전- 및 후-처리 소변 HAase 수준을 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 대다수 환자들은 수술 전 히알루로니다아제 수준이 처리 후에는 감소하여, 소변의 HAase 수준 측정도 처리 효과의 모니터에 유용하다는 것을 알 수 있다.

ELISA-유사 어세이를 통한 여러 환자 그룹의 소변 HAase 수준 측정. 결과는 평균±SEM 으로 나타내고, "n"은 각 카테고리에 속한 사람수를 나타낸다.

카테고리	n	HA 수준(mU/mg)
정상	16	4.3±1.2
GU 환자	45	7.4±1.4
G1 TCCs	22	6.5±1.7
G2 TCCs	9	32±6.1
G3 + CIS	39	34.3±3.1

실시예 2 -- 실시예 1의 연구 및 데이터 갱신-- 히알루론산 측정

검체 수집:

마이애미 대학의 검토 위원회(Institutional Review Board)에 승인된 프로토콜 하에 배설된 소변 시료(클린-캣취)를 144명으로부터 수집하였다. 시료를 세 그룹으로 나누었다. 그룹 1: 연령을 제한(30 내지 70세)한 정상인(건강한 사람)(n=25). 그룹 2: 양성 전립선 과형성(BPH;n=8), 전립선 암(n=7); 신장 결석(n=5), 방광염(n=12), 요도 감염(n=8), 전립선염(n=2), 부고환(n=1) 및 신장 외상(n=2)과 같은 비뇨-생식기 상태가 이와 다른 환자(n=45). 그룹 3: G1(n=17, Ta 단계), G2(n=14, Ta-T2 단계) 또는 G3(n=43)인 방광암 환자. G3 하위 카테고리 방광암 환자에는 G3 종양(T1-T4 단계) 환자 34명 및 상피내암(CIS) 환자 9명이 포함된다. CIS 는 얕은 표층(요로 상피로 정의) 고-등급 방광 종양의 서브-클래스이다. 모든 검체를 수집하여 어세이할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

조직 검체:

해당 주 및 연방 규정에 따라 장기 기증자로부터 성인(21 내지 50세)의 정상적인 방광 조직을 얻었다. 방광 종양을 방광 절제 또는 경요도 절제한 환자(41 내지 72세)로부터 신생 방광 조직(Neoplastic)을 얻었다. 그룹 1: 정상적인 성인의 방광 조직(n=7). 그룹 2: 저-등급 TCC(G1 종양; n=6), 그룹 3: 고-등급 TCC(G2 n=2 및 G3, n=6, 종양). 등급을 평가하기 위하여, 각 종양 검체를 나누어(split), 거울상 단편을 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 넣어, 절단(section)하여 조직학적으로 분석하였다.

조직 추출물:

조직 검체(약 0.5 내지 1g)를 1mM 벤즈아미딘-HCl을 함유하는 5mM HEPES 완충액(pH7.2)에 균질화하였다. 균등액을 40,000xg에서 30분간 원심분리하여 맑게 하고, 맑은 추출물을 어세이하였다.

HA 수준 결정을 위한 ELISA-유사 어세이:

문헌[Fosang et al., An ELISA plate based assay for hyaluronan using biotinylated proteoglycan G1 domain(HA-binding) region, Matrix, 10:306-313, 1990]에 기재된 ELISA-유사 어세이를 다음과 같이 변형하여, 소변 검체 및 조직 추출물의 HA 농도를 결정하였다.

인간 탯줄 HA(25㎍/ml)로 도포된 96-웰 미세역가 플레이트를, 인산염 완충 식염수(PBS)+0.05% Tween 20(PBS+Tween) 중의 일련의 소변 검체, 조직 추출물 또는 인간 탯줄 HA 희석액(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 및 비오티닐화 소의 코 연골 HA-결합 단백질(1㎍/ml)을 사용하여 배양하였다. 실온에서 16시간동안 배양한 후, 웰을 PBS+Tween으로 세척하였다. 이러한 웰에 결합된 HA-결합 단백질을, 아비딘-비오틴 검출 시스템 및 ABTS(2,2' 아지노-비스(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산))기질(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 정량하였다. 흡광도(405nm) vs 인간 탯줄 HA농도(ng/ml)를 플롯하여 표준 그래프를 만들었다. 이러한 그래프를 사용하여, 각 소변 검체 또는 조직 추출물의 희석액 중 HA 농도를 계산하였다. 이러한 측정을 수회 행하여, 각 시료의 평균 HA 농도를 측정한 후, 소변 또는 조직 추출물인 시료 중 단백질 농도(mg/ml)로 표준화하였다. 각 임상 시료의 전체 단백질 농도를 단백질 어세이 키트(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 측정하였다.

HA 단편 제조:

인간 탯줄 HA(~500mg)을, 20,000 유닛의 고환 히알루로니다아제(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 사용하여, 시간 간격을 달리하여 37℃에서 소화시켰다. 생성된 HA 단편을 Sephadex G-50 칼럼 (1.5x120cm) 상에서 분리하였다. 10ml분획을 수집하고 우론산(uronic acid) 함량을 어세이하였다(Bitter and Muir, A modified uronic acid carbazole reaction, Anal. Biochem, 4:330-334, 1962). 분획을 결합하여 F1, F2 및 F3를 만들었다. Dygert 어세이(Dygert et al., Determination of reducing sugars with improved precision, Anal. Biochem., 13: 367-374, 1965)를 통하여 각 분획의 환원 말단 수를 결정하였다. HA의 선형 폴리사카라이드 또는 이의 단편은 각각 단일 환원 말단을 갖기 때문에, 우론산 몰 당 환원 말단의 수로부터 각 단편의 사슬 길이를 계산하였다. HA 소화 동안³H-표지된 HA(Lokeshwar et al.에 기재된 바와 같이 제조한다. 히알루론산-매개 부착 기능의 발현을 위하여 CD44(GP85)의 Ankyrin 결합 도메인이 필요하다. J.Cell Biol., 126: 1099-1109, 1994)를 섞고 겔 전기영동 및 플루로그라피(flurography)로 단편을 분석하여, 각 분획의 올리고사카라이드 크기 범위도 결정하였다.

환자의 소변으로부터 HA 및 HA 단편의 분리:

정상인(n=4) 및 저-등급 TCC(G1 종양, n=4) 또는 고-등급 TCC(G2, n=2 및 G3, n=3, 종양) 환자로부터의 소변 검체를 10배 농축하고, PBS에 대하여 광범위하게 투석하였다. 투석된 각 검체 약 2ml(~20mg 단백질)를, PBS을 사용하여 평형으로 만든 Sepharose 6 CL-B 칼럼(1.5x120cm)(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 적용하였다. 칼럼에 PBS를 7ml/hr로 전개하고, 분획 3.5ml를 수집하였다. 분획을 상기와 같은 ELISA-유사 어세이를 통하여, HA에 대하여 어세이하였다. 표준 구형 단백질 마커 및 HA 및 HA 단편과 같은 선형 폴리사카라이드는 다른 형태를 가지므로, 인간 탯줄 기질(vein) HA(Mr ~2x10⁶D) 및 HA 단편, F1, F2 및 F3을 사용하여 칼럼을 보정하였다. 이와 달리, 소변으로부터 분리된 HA 및 HA 단편이 내피 세포 증식에 미치는 효과를 시험하기 위하여, 검체를 4℃에서 4시간동안 트리클로로아세트산(5% v/v)를 사용하여 침전시켰다. 소변 안에 존재하는 어떤 단백질 성장 인자(예를 들면, 염기성-FGF)를 변성시켜 제거하기 위하여, 침전 단계를 포함시켰다.

트리클로로아세트산 처리된 소변 검체를 원심분리하였다. 상청액을 물에 대하여 투석하고, 동결 건조하고, PBS 중에 재현탁한 후, Sepharose 6 CL-B 칼럼상에 크로마토그래피하였다.

유사분열촉진 어세이:

Clonetics Corp.사(San Diego, CA)로부터, 제 2 및 제 3 통로(passage)로 인간의 폐미소혈관 내피 세포(HMVEC-L)를 얻은 1차 성장 배양액을, "내피 세포 성장 배지"의 48-웰 배양 플레이트 상에서 성장시켰다(Clonetics Corp., San Diego, CA). 80% 컨플루언스(confluence)에서, 혈청이 없으며 첨가제(소 뇌하수체 추출물, EGF 및 하이드로 코르티손)가 없는 기본 배지(EBM)에 배양액을 12시간동안 37℃에서 전-배양하였다. 전-배양 후, 길이가 공지되어 있는 HA 또는 HA 단편을 함유하는 신선한 EBM 또는 환자의 소변에서 분리한 피크 HA 분획(I-V)에서 세포를 18시간동안 배양하였다. 배양 후, [³H]-티미딘(1μCi/ml)을 이 배양액에 편입하고, 앞에 기재된 바와 같이(Lokeshwar et al., Protamine induces EGF-stimulated mitogenesis by increasing cell surface EGF receptor number: Implications for the existence of cryptic EGF recetor. J.Biol. Chem., 264: 19318-19326, 1989] 2시간동안 배양한 다음, 어세이를 끝냈다. 결과는 세 번 측정하여 평균±s.d.로 나타낸다.

통계적 분석:

데이터는 각 환자의 평균 HA 농도 또는 각 환자 그룹의 평균±SEM로 나타내었다. 평균 HA 농도는 그룹 간에 비모수적(non-parametric) 분포를 나타내므로, Dunn의 다중 비교 시험(Dunn's multiple comparison test)을 통하여 여러 다른 그룹 간의 평균 HA 농도 차를 평가하였다.

소변 검체에서 HA 농도의 결정:

비오티닐화 HA 결합 단백질을 사용하는 ELISA-유사 어세이를 통하여, 소변 검체 중 HA 농도를 결정하였다. 소변 HA 수준(ng)은 수분공급 상태 및 소변 배설에 의하여 영향을 덜 받는 것으로 알려져 있으므로, 소변 HA 수준은 소변 단백질 함량(mg)으로 표준화하였다. 단백질로 표준화하면, 방광암 환자에게서 공통적으로 발견되는 상태인 혈뇨에 의한 영향이 적은 것으로 밝혀졌으므로, 소변 HA 수준은 크레아티닌보다는 전체 단백질에 대하여 표준화하였다(Soloway, The management of superficial bladder cancer, 45: 1856-1865, 1980). 본 발명의 발명자는 정상인(n=25) 및 방광암 환자(예를 들면, G1, G2 및 G3(CIS 포함), n=74)의 소변 HA 수준을 비교하였다. 본 연구에서는 또한, 대조구로서, 방광암이 아닌 다른 GU 상태(예를 들면, BPH, 전립선암, 신장 결석, 박테리아 감염, 방광염, 전립선염, 신장 외상 및 부고환염(n=45)) 환자의 효소 수준을 측정하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 소변 HA 수준 분포는 정상인 및 다른 GU 상태의 환자 간에 매우 유사하고, 이 두 그룹에 포함되어 있는 개인 대부분은 HA 수준이 < 100 ng/mg이다. 그러나, 방광암 환자에게서는 종양 등급(예를 들면, G1, G2 및 G3)에 상관없이 HA 수준이 균일하게 높고, 환자 대부분의 HA 수준은 > 100ng/mg이다(도 5A).

여러 다른 그룹간의 평균 소변 HA 수준을 도 5B에 비교하여 도시하였다. 평균 소변 HA 수준은 정상인(44.7±6.2ng/mg)과 다른 GU 상태 환자(69.5±6.8ng/mg)간에 크게 다르지 않았다. Dunn 다중 비교 시험을 통하여 이러한 데이터를 통계적으로 분석하면, 평균 소변 HA 수준은 통계적으로 정상인과 다른 GU 상태 환자 간에 크게 다르지 않은 것으로 나타난다(P>0.05, 표 3). 그러나, G1(255±41.7ng/mg), G2(291.8±68.3ng/mg) 또는 G3(428.4±67ng/mg) 방광 종양 환자에게서는 소변 HA 수준이 매우 높다(4-9배). Dunn 다중 비교 시험에 따르면, 방광암 환자 및 정상인 또는 다른 GU 환자의 평균 소변 HA 수준은 통계적으로 매우 다르다(P<0.001, 표 3). 그러나, 등급이 다른(G1, G2 및 G3) 방광 종양 환자의 평균 소변 HA 농도는 통계적으로 크게 다르지 않다(P>0.05, 표 3). 이러한 결과를 통하여, 소변 HA 수준이 증가하면 방광 종양을 의심해 볼 수 있다. 그러나, 종양 등급을 예상할 수는 없다.

정상인, 다른 GU 상태 환자 또는 방광암 환자 간에 평균 소변 HA 수준을 비교하는 Dunn 다중 비교 시험. 도 5의 데이터는 Dunn 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다.

비교	평균 차	P 값
정상인 vs GU	-15.027	P > 0.05
정상인 vs G1	-70.248	P < 0.001
정상인 vs G2	-74.839	P < 0.001
정상인 vs G3	-76.672	P < 0.001
GU vs G1	-55.222	P < 0.001
GU vs G2	-59.812	P < 0.001
GU vs G3	-61.645	P < 0.001
G1 vs G2	-4.590	P > 0.05
G1 vs G3	-6.423	P > 0.05
G2 vs G3	-1.833	P > 0.05

소변 HA 수준에 관한 데이터를 추가로 분석하여, 방광암을 검출하기 위한 ELISA-유사 어세이의 특이도 및 감도를 결정하였다. 표 4에 도시된 바와 같이, 100ng/mg을 최소 컷-오프 한계로 하는 이러한 어세이의 전체 특이도는 92.8%였다. 동일한 컷-오프 한계에서, 방광암을 검출하기 위한 이러한 어세이의 감도는 91.9%였다. 분석에 따르면, 이러한 어세이로부터의 허위 양성 및 허위 음성은 각각 7.2% 및 8.1%였다.

표 4: 방광암을 검출하기 위한 ELISA-유사 어세이 감도 및 특이도 결정. 감도 및 특이도를 계산하기 위하여, 최소 컷-오프 한계로서 100ng/mg HA 농도를 사용하여, 도 5A에 도시된 개인의 소변 HA 수준에 관한 데이터를 분석하였다. 시료에는 74명의 방광암 환자 및 질환이 없거나(n=25) 다른 GU 상태(예를 들면, 방광염, BPH, 전립선암, 박테리아 감염, 신장 결석 등, n=45)인 사람의 것이 포함되었다. 감도 = 실제 양성(true positive) 결과 / 전체 방광암 환자수. 특이도 = 실제 음성 결과 / 전체 방광암이 아닌 환자수. 허위-양성율 = 허위-양성 결과 / 전체 방광암이 아닌 환자수. 허위 음성율 = 허위-음성 결과 / 전체 질환자 수

a: 정상인 및 다른 GU 상태의 환자와 같은 각 개인 그룹의 특이도는 각각 96% 및 91.1%이다.

b: 저-등급(G1) 및 저-단계(Ta)종양을 검출하기 위한 ELISA-유사 어세이의 감도는 88.7%였다. 고-등급(≥G2) 및 고-단계(≥T1)를 검출하기 위한 어세이 감도는 92.7%였다.

결과	소변 HA 수준
감도	^a91.9%(68/74)
특이도	^b92.8%(65/70)
허위-양성율	7.2%(5/70)
허위-음성율	8.1%(6/74)

방광 조직에서 HA 농도의 비교:

종양-관련 HA가 소변에 분비되어 소변 HA 수준이 증가하는지를 알아보기 위하여, 본 발명의 발명자들은 ELISA-유사 어세이를 사용하여 정상 방광, 저-등급 TCCs(G1 종양) 및 고-등급 TCCs(G2+G3 종양)으로부터 제조한 조직 추출물 중 HA 수준을 측정하였다. 도 6A에 도시한 바와 같이, 방광 종양 조직의 HA 수준은, 정상 방광 조직의 HA 수준과 비교하여, 종양 등급에 상관없이 높다. 저-등급 TCC 조직(5.8±2.1㎍/mg) 및 고-등급 TCC 조직(9.3±3.3㎍/mg)의 평균 HA 수준은 정상 방광 조직의 평균 HA 수준(1.8±0.4㎍/mg)보다 각각 3- 및 5-배 높다. 도 5에 도시된 바와 같이, 정상 방광 검체 및 방광 종양(저-등급 또는 고-등급 TCC) 간의 조직 HA 수준은 통계적으로 크게 상이하다(P<0.001). 그러나, 저-등급 및 고-등급 TCCs 조직의 HA 수준은 통계적으로 크게 상이하지 않다(P>0.05, 표 5). 이러한 결과에 따르면, 소변 HA 수준 상승과 종양-관련 HA 증가 간에는 직접적인 상관 관계가 있다.

표 5: 정상 및 방광 종양 조직 간의 평균 HA 수준을 비교하기 위한 Dunn 다중 비교 시험. Dunn 다중 비교 시험을 통하여 도 6의 데이터를 분석하였다. 저-등급 및 고-등급 TCCs 는 각각 G1 또는 G2+G3 종양 환자 그룹을 나타낸다.

비교	평균 차	P 값
정상 vs 저-등급 TCCs	-7.000	P<0.001
정상 vs 고-등급 TCCs	-11.833	P<0.001
저-등급 vs 고-등급 TCCs	-4.833	P>0.05

소변 HA 프로파일 결정:

HA를 히알루로니다아제로 소화시켜 만든 작은 HA 단편(3-25 디사카라이드 단위)은 in vivo에서 맥관 형성성(angiogenic)이다(West et al., Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid, Science, 228: 1324-1326, 1985). 소변에 이러한 HA 단편이 존재하는지를 알아보기 위하여, 본 발명의 발명자는 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여, 정상인 및 저-등급 또는 고-등급 TCC 환자의 소변에 존재하는 HA 검체 프로파일을 조사하였다. 칼럼을 고분자량 HA(Mr ~2x10⁶달톤) 및 길이가 알려진 HA 단편[F1(10-15 디사카라이드 단위), F2(2-3 디사카라이드 단위), 및 F3(~2 디사카라이드 단위)]으로 보정하여, 소변 HA 검체의 크기를 결정하였다. F1 단편은 소의 대동맥 내피 세포의 여러 다른 기능을 조절하는 것으로 보인다(Banarjee and Toole, Hyaluronan binding protein in endothelial cell morphogenesis. J.Cell Biol., 119:643-652, 1992). 도 7에 도시한 바와 같이, 정상인의 소변은 소량의 HA를 함유하며, 그 크기는 고분자량 HA 및 F1 단편의 사이에 해당하는 크기이다. 저-등급 TCC 환자의 소변은 소량의 고분자량 HA를 가지며, 사이에 해당하는 크기의 넓은 두번째 HA 피크를 갖는다(도 7). 두 번째 피크는 F1 단편을 소량 함유하는 것으로 보인다(도 7). 고-등급 TCC환자 소변의 HA 프로파일은 복잡한 패턴이다. 프로파일은 고-분자량 HA 및 F1 단편에 해당하는 두 개의 큰 피크로 구성된다. 이와 같은 두 피크는 크기가 이들 사이의 HA 피크에 의하여 분리된다(도 7). 또한, 고-등급 TCC 환자 소변은 대략 F2 및 F3 HA 단편에 해당하는 두 개의 작은 HA 피크를 갖는다(도 7). 이러한 결과를 통하여, HA 농도는 모든 방광암 환자에게서 증가하지만, HA 플로파일은 저-등급 및 고-등급 TCC 환자간에 상이하다는 것을 알 수 있다.

HA 및 HA 단편이 인간 미소혈관 내피 세포 증식에 미치는 효과

본 발명의 발명자들은, [³H]-티미딘 편입 어세이를 사용하여, in vitro에서 생성된 고-분자량 HA 및 HA 단편(F1, F2 및 F3) 또는 고-등급 TCC 환자의 소변으로부터 분리한 것들이 인간 폐 미소혈관 내피 세포(HMVEC-L)의 1차 배양액의 증식에 미치는 효과를 조사하였다. 도 8A에 도시된 바와 같이, 고-분자량 HA 및 F1 단편은 투여량 의존 방식으로 HMVEC-L 세포에서 유사분열촉진 반응을 유발하며, 2㎍/ml의 농도에서 각각 최대 1.5-배 및 2.3-배까지 증가시킨다. F2 및 F3 단편은 이러한 세포에 유사분열을 촉진하지 않는다(도 8A). 고-등급 TCC 환자의 소변으로부터 분리한 HA 검체 가운데, 피크 I(고-분자량 HA) 및 피크 II(중간 크기의 HA)는 HMVEC-L 세포에서 적당한 유사분열 촉진 반응(1.2-1.3배)을 유발한다. 그러나, F1 단편에 해당하는, 피크 III의 HA 검체는 HMVEC-L 세포에서 ~2.4배의 유사분열촉진 반응을 유발한다(도 8). F2 및 F3 단편에 해당하는 매우 작은 HA 단편(피크 IV 및 V)은 유사분열을 촉진하지 않는다. 이러한 결과는, 고-등급 TCC 환자의 소변에는 내피 세포의 기능(예를 들면, 증식)을 자극하는 HA 단편이 존재한다는 것을 제시한다.

요약하면, 소변 HA 수준은 모든 방광암 환자에게 있어서 매우 높아(4-9배: 도 5), 방광암에 대한 마커로서 유용한 것으로 보인다. 종양-관련 HA가 소변에 직접 분비되기 때문에, 방광암 환자의 소변 HA 수준은 증가될 수 있다(도 6).

정상, 저-등급 TCC 및 고-등급 TCC 환자의 소변 프로파일이 상이하다는 것은, 소변 HA의 크기 결정이 방광암을 예측하는 또다른 표지가 될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 방광암의 HA 검체의 프로파일이 신장암인 어린이의 소변 또는 혈청에서 발견되는 것과 상이하다는 것을 주목해야 한다[Lin et al., Urinary hyaluronic acid is a Wilms' tumor marker. J.Ped. Surg., 30: 304-308, 1995; Kumar et al., 신장 종양인 어린이의 혈청은 저분자량의 히알루론산을 함유한다 (Sera of children with renal tumors contain low molecular mass hyaluronic acid) Int. J. Cancer, 44: 445-448, 1989]. 따라서, HA 검체의 크기 및 이들의 분포 패턴은 등급에 따라 다를 뿐 아니라 상이한 기관의 종양에서 다를 수 있다.

실시예 3 -- 실시예 1의 연구 및 데이터 갱신-히알루로니다아제 측정

소변 검체:

마이애미 대학의 검토 위원회(Institutional Review Board)에 승인된 프로토콜 하에 배설된 소변 시료(클린-캣취)를 139명으로부터 수집하였다. 사람은 세 그룹으로 나누었다. 그룹 1: 연령을 제한한(30 내지 70세) 정상인(건강한 사람)(n=20). 그룹 2: 진전된 전립선암(n=10), 양성 전립선 과형성(BPH;n=8), 신장 결석(n=5), 방광염(n=12), 요도 감염(n=8), 전립선염(n=2), 부고환(n=1) 및 신장 외상(n=2)과 같은 비뇨-생식기(GU) 상태가 다른 환자(n=48). 그룹 3: G1(n=22, Ta 단계), G2(n=9, Ta-T2 단계) 또는 G3(n=40)인 방광 종양 환자. G3 하위 카테고리 방광암 환자에는 G3 종양(T1-T4 단계) 환자 34명 및 상피내암(CIS) 환자 6명이 포함된다. CIS 는 얕은 표층(요로 상피로 정의) 고-등급 종양의 서브-클래스이다. 모든 검체를 수집하여 어세이할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

조직 검체:

장기 기증자로부터 성인(21 내지 50세)의 정상적인 방광 조직을 얻었다. 해당 주 및 연방 규정에 따라 조직을 얻었다. 종양을 방광 절제 또는 경요도 절제하는 환자(41 내지 72세)로부터 방광 종양 조직을 얻었다. 그룹 1: 정상적인 방광 (n=6). 그룹 2: 저-등급 TCCs(G1; n=6), 그룹 3: 고-등급 TCCs(G2 n=2; G3, n=6). 등급을 평가하기 위하여, 각 종양 검체를 나누어(split), 거울상 단편을 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 넣어, 조직학적으로 분석하였다.

조직 추출물:

조직 검체(약 0.5 - 1g)를 5mM HEPES(pH7.2) 및 1mM 벤즈아미딘-HCl을 함유하는 완충액에 균질화하였다. 균등액을 40,000xg에서 30분간 원심분리하여 맑게 하고, 맑은 추출물을 어세이하였다.

기질 (HA)-겔 어세이:

0.17mg/ml 인간 탯줄 HA을 함유하는 소변 시료(약 20㎍ 단백질)를, 7.5% 폴리아크릴아민 겔 상에서 비-변성 조건하 또는 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 변성 조건하에 전기영동하였다(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). 전기 영동 후에, 겔을 히알루로니다아제 어세이 완충액(0.1M 포름산 나트륨, 0.15 M NaCl, pH 4.3) 중에서 효소 소화를 위하여 37℃로 16-18시간동안 배양하였다. 변성 겔 상에서 전기 영동한 단백질을, 히알루로나다아제 어세이 완충액에서 배양하기 전에 3% Triton X-100 용액 중 겔에서 배양함으로써 탈변성하였다. 배양 후, 겔을 0.5% Alcian 블루 및 0.15% Coomassie 블루 용액으로 연이어 염색하고, 10% 메탄올/10% 아세트산 용액으로 디스테인(destain)하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Lokeshwar , V.B., Lokeshwar, B.L., Pham, H.T., 및 Block, N.L. Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer procgression. Cancer Res., 56: 651-657, 1996; Gutenhoner et al., Substrate gel assay for hyaluronidase activity, Matrix, 12: 388-396, 1992), 겔의 염색되지 않은(투명한) 영역(들)으로부터 히알루로니다아제가 존재한다는 것을 추측할 수 있다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) alc 은 염색:

소변 검체(~20㎍ 단백질)를 12% SDS-PAGE로 분석한 후, 전체 소변 단백질 프로파일을 나타내도록 염색하였다.

히알루로니다아제 활성을 위한 ELISA-유사 어세이:

200 ㎍/ml HA로 도포된 96-웰 미세역가 플레이트를, 0.2mg/ml BSA 함유 히알루로니다아제 어세이 완충액 중의 일련의 소변 검체, 조직 추출물 또는 스트렙토마이시즈 히알루로니다아제(CalBiochem, San Diego, CA)를 사용하여, 37℃에서 16-18시간동안 배양하였다. 배양 후, 분해된 HA를 세척하고, 이전에 언급한 바와 같이(Lokeshwar et al., . Cancer Res., 56: 651-657, 1996; Stern and Stern, ELISA-like assay for hyaluronidase and hyaluronidase inhibitor, Matrix, 12: 397-403, 1992), 비오티닐화된 연골 HA-결합 단백질(Tengblad, Affinity chromatography on immobilized hyaluronate and its application to the isolation of hyaluronate binding proteins from cartilage, Biochim, Biophys. Acta, 578: 218-289, 1979), 아비딘-비오틴 검출 시스템 및 ABTS 기질 킷트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 웰에 잔류한 HA를 정량하였다. 미세역가 플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 읽었다. 각 어세이의 경우, 어떤 히알루로니다아제 없이 완충액만을 갖는 HA-도포 웰을 배양하여 최대 흡광도(A_max)_405nm를 얻었다. 비도포 웰에 히알루로니다아제를 배양하여 (A_min)_405nm를 얻었다. 흡광도(405nm) vs 스트렙토마이시즈 히알루로니다아제 활성(mU/ml)을 플롯하여 표준 그래프를 만들었다. 이러한 그래프를 사용하여, 각 소변 또는 조직 추출물 희석액 중 히알루로니다아제 농도를 계산하였다. 7개의 개별 희석액 중 활성을 측정하여, 각 시료의 평균 히알루로니다아제 활성을 계산하였다. 모든 활성 측정값(mU/ml)을 단백질 농도(mg/ml)로 표준화하였다. 방광 종양-유래의 히알루로니다아제의 pH 활성 프로파일을 결정하기 위하여, 다양한 pH(2.0-7.0)에서 포름산염-NaCl 완충액 중에 소변 또는 조직 추출물 분취액을 사용하여 HA-도포 웰을 배양하였다. 그 결과를 (A_max- A_sample)_405nmx 100으로 나타낸다. 최대 차를 100%로 하여, 데이터를 최대에 대한 %로 나타낸다.

통계 분석:

데이터는 각 환자의 평균 히알루로니다아제 활성 또는 각 환자 그룹의 평균±SEM로 나타낸다. 평균 히알루로니다아제 수준은 모수적(parametric) 분포를 나타내므로, Tukey-Kramer 다중 비교 시험(Trkey-Kramer multiple comparison test)을 통하여 그룹 간의 차이를 평가하였다.

소변 히알루로니다아제 활성 측정.

(a) 기질 겔 어세이:

소변 시료의 히알루로니다아제 활성을, 감성 기질(HA)-겔 기술(sensitive substrate(HA)-gel technique), (Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression, Cancer Res., 56:651-657, 1996; Gutenhoner et al., Substrate gel assay for hyaluronidase activity. Matrix, 12:388-396, 1992)을 사용하여 검출하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 정상인(레인 1 및 2) 및 저-등급 TCC(레인 3 및 4) 환자의 소변 검체를 함유하는 레인에는 HA 소화가 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, 고-등급 TCC 환자(레인 5 및 6)의 검체에서는 광범위한 HA 소화 밴드가 관찰되어, 이러한 시료는 히알루로니다아제 활성이 크다는 것을 제시하였다.

(b) ELISA-유사 어세이에 의한 소변 히알루로니다아제 활성의 정량적 측정.

ELISA-유사 어세이를 통하여, 소변 시료(n=139) 중 히알루로니다아제의 수준을 정확히 정량하였다(Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading emzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56:651-657, 1996). 히알루로니다아제 수준(mU)을 소변 단백질 농도(mg)으로 표준화하여, 수분공급 상태 및 소변 배설에 따른 편차를 보정하였다. 단백질로 표준화하면, 방광암 환자에게서 공통적으로 발견되는 상태인 혈뇨에 의한 영향이 적은 것으로 밝혀졌으므로, 히알루로니다아제 수준(mU)은 크레아티닌보다는 소변 단백질 농도에 대하여 표준화하였다(Soloway, The management of superficial bladder cancer. Cancer, 45: 1856-1865, 1980). 본 발명의 발명자는 정상인(n=20) 및 방광암 환자(예를 들면, G1, G2 및 G3 종양 및 CIS, n=71)의 소변 히알루로니다아제 수준을 비교하였다. 본 연구에서는 또한, 대조구로서, TCC가 아닌 GU 상태(예를 들면, BPH, 전립선암, 신장 결석, 박테리아 감염 및 방광염, 신장 외상, 전립선염 및 부고환염, n=48) 환자의 효소 수준을 측정하였다. 도 10A에 도시된 바와 같이, 소변 히알루로니다아제 수준 분포는 정상인 및 저-등급(G1) 방광암 또는 다른 GU 상태의 환자 간에 매우 유사하다. 또한, 이 세 그룹에 포함되어 있는 개인 대부분은 효소 수준이 < 100 mU/mg이다. 그러나, 중간(G2) 내지 고-등급(G3) 방광 종양의 모든 환자에게서는 히알루로니다아제 수준이 높고, > 1mU/mg이다(도 10A).

여러 다른 그룹간의 평균 소변 히알루로니다아제 수준을 도 10B에 비교하여 도시하였다. 평균 소변 히알루로니다아제 수준은 정상인(4.2±1.2mU/mg), 다른 GU 상태(7.4±1.4mU/mg) 또는 G1 종양(6.5±1.7mU/mg) 환자간에 크게 다르지 않다. 그러나, 이의 수준은 G2 종양(32±6.1mU/mg) 또는 G3 종양(34.3±3.1mU/mg) 환자 에 있어 매우 높다. 모든 G2 또는 G3 종양 환자의 평균 소변 히알루로니다아제 수준을 결합하면(33.4±4.5mU/mg), 정상인 및 다른 GU 상태 또는 G1 방광 종양 환자보다 5-9배가 높다. 소변 히알루로니다아제 수준은 모든 CIS(얕은 표층 고-등급 방광 TCCs의 서브클래스) 환자에게 있어 6-11배(46±5.9mU/mg) 높다는 것을 특히 주목해야 한다. 이러한 결과로부터, 조사한 모든 고-등급 방광암 환자는 침습성 질환의 발생 전에 높은 소변 히알루로니다아제 수준을 갖는다는 것을 알 수 있다.

Tukey-Kramer 다중 비교 시험를 통하여, 다양한 카테고리의 환자들에게서 관찰되는 평균 히알루로니다아제 차에 대하여 통계적 중요성을 평가하였다. 표 6에서와 같이, 정상인 및 G1 방광 종양 또는 다른 GU 상태의 환자의 평균 히알루로니다아제 수준 차는 통계적으로 크지 않다(P>0.05; 표 6). 그러나, 정상인/다른 GU 환자 및 G2 또는 G3 종양 환자 간의 차이는 통계적으로 크다(P<0.001, 표 6). G1 종양 및 G2 또는 G3 종양 환자간의 평균 히알루로니다아제 차는 통계적으로 크다(P<0.001, 표 5). 그러나, G2 또는 G3 종양 환자간의 평균 효소 수준 차는 통계적으로 크지 않다(P>0.05). 따라서, 이러한 결과는, 모든 중간 내지 고-등급 암환자에게서 소변 히알루로니다아제 수준이 높다는 것을 나타낸다.

표 6: 정상인 및 방광암 환자의 평균 소변 히알루로니다아제 수준을 비교하기 위한 Tukey-Kramer 다중 비교 시험. 도 10의 데이터를 Tukey-Kramer 다중 비교 시험을 통하여 분석하였다. q값이 3.916보다 크면, P 값은 0.05보다 작다.

비교	평균 차	q	p값
정상 vs GU	-3.142	1.156	P>0.05
정상 vs G1	-2.175	0.709	P>0.05
정상 vs G2	-27.725	7.126	P<0.001
정상 vs G3	-30,033	10.834	P<0.001
GU vs G1	0.967	0.398	P>0.05
GU vs G2	-24.583	7.210	P<0.001
GU vs G3	-26.891	13.163	P<0.001
G1 vs G2	-25.550	6.915	P<0.001
G1 vs G3	-27.858	11.189	P<0.001
G2 vs G3	-2.308	0.668	P>0.05

소변 히알루로니다아제 수준에 관한 데이터를 추가로 분석하여, 고-등급 TCCs를 검출하기 위한 ELISA-유사 어세이의 특이도 및 감도를 결정하였다. 표 7에 도시한 바와 같이, 이와 같은 ELISA-유사 어세이의 전체 특이도는, 최소 컷-오프 한계로 10mU/mg을 사용하여 88.8%였다. 동일한 컷-오프 한계에서, 고-등급 TCCs를 검출하기 위한 이러한 어세이의 감도는 100%(즉, 고-등급 종양을 하나도 놓치지 않았다)였다. 분석을 통하여, 이러한 어세이의 허위 양성 및 허위 음성 결과는 각각 11.2% 및 0%임을 알게 되었다.

표 7: ELISA-유사 어세이의 고-등급 방광암을 검출하기 위한 감도 및 특이도 결정. 감도 및 특이도를 계산하기 위하여, 효소 수준의 최소 컷-오프 한계로서 10mU/mg를 사용하여, 도 10에 도시된 히알루로니다아제의 수준을 분석하였다. 시료에는 49명의 고-등급 TCC(G2 및 G3 종양) 환자, 및 질환이 없거나(n=20) 다른 GU 상태(예를 들면, 방광염, 박테리아 감염, BPH, 신장 결석, 전립선암 등, n=48)이거나 저-등급 TCCs(G1 종양, n=22)인 사람의 것이 포함되었다. 감도 = 실제 양성 결과 / 전체 고-등급 TCC 환자수. 특이도 = 실제 음성 결과 / 전체 고-등급 TCC가 아닌 환자수. 허위-음성율 = 허위-음성 결과 / 전체 고-등급 TCCs 환자수. 허위 양성율 = 허위-양성 결과 / 전체 고-등급 TCCs가 아닌 사람수.

a: 정상인, 다른 GU 상태 환자 및 저-등급 TCCs 환자와 같은 각 개인 그룹의 특이도는 각각 93.7%, 84.5% 및 90.9%이다.

결과	소변 히알루로니다아제 수준
감도	100%(49/49)
특이도	^a88.8%(80/90)
허위-양성	11.6%(10/90)
허위-음성	0%(0/49)

방광 조직 추출물 중 히알루로니다아제의 활성 결정:

이러한 연구를 통하여, 고-등급 방광 종양 환자는 소변 히알루로니다아제 수준이 높다는 것을 알 수 있으므로, 본 발명의 발명자는 이와 같은 증가가 종양-유래 히알루로니다아제(들)가 소변 중에 분비된 결과라고 가정하였다. 따라서, ELISA-유사 어세이를 사용하여, 정상 방광, 저-등급 TCCs(G1 종양) 및 고-등급 TCCs(G2 및 G3 종양)로부터 제조한 조직 추출물에 히알루로니다아제의 활성이 있는지 시험하였다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 정상 방광 및 G1 종양 조직의 히알루로니다아제 수준은 매우 유사하다. 그러나, G2 및 G3 종양 조직 추출물은 히알루로니다아제 수준이 매우 높은 것으로 보인다(도 11A). G2 및 G3 종양 조직의 평균 히알루로니다아제 수준(13.2±1.2mU/mg)은 정상 방광(1.9±0.35mU/mg) 및 G1 종양(2.7±0.61mU/mg)조직의 히알루로니다아제 수준보다 6-7배 높다(도 11B). Tukey-Kramer 다중 비교 시험을 통하여 이러한 데이터를 통계분석하면, 통계적으로, 정상 방광 및 G1 종양 조직 간의 평균 히알루로니다아제 활성 차(P>0.05)가 큰 것이 아니라, 정상 및 G2와 G3 종양 조직 간의 평균 히알루로니다아제 활성 차(P<0.001)가 크다는 것을 알 수 있다(표 8). 또한, G1 종양 및 G2 또는 G3 종양 간의 평균 효소 수준 차가 통계적으로 크다(P<0.001, 표 8). 따라서, 소변 및 조직 히알루로니다아제 수준의 상승은, 방광의 중간 내지 고-등급 TCCs와 관련 있다.

표 8: 정상인 및 방광암 환자의 평균 조직 히알루로니다아제 수준을 비교하기 위한 Tukey Kramer 다중 비교 시험. 도 11의 데이터는 Tukey Kramer 다중 비교 시험을 사용하여 통계적으로 분석하였다. q값이 2.655 보다 크면, P값은 0.05보다 작다.

비교	평균차	q	P값
정상 vs 저-등급 TCCs	-0.0800	0.7946	P>0.05
정상 vs 고-등급 TCCs	-11.371	12.074	P<0.001
저-등급 TCCs vs 고-등급 TCCs	-10.571	11.225	P<0.001

방광 종양-관련 히알루로니다아제 활성의 특성 부여:

방광 종양-관련 히알루로니다아제 활성의 pH 활성 프로파일을 ELISA-유사 어세이를 사용하여 결정하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, HA를 분해하기 위한 고-등급 TCC 환자의 소변 및 종양(G3) 조직에 존재하는 히알루로니다아제의 활성은, 최적 pH가 명확히 4.3이다. 방광 종양-관련 히알루로니다아제 활성을 위한 최적 pH는, 혈청, 간, 신장, 고환 및 전립선과 같은 다른 공급원으로부터의 히알루로니다아제에서 최적으로 알려진 pH와 상이하다(Gold, Purification and properties of hyaluronidase from human liver. Biochem. J., 205:69-74, 1982; Stern et al., Hyaluronidase levels in urine from Wilm's tumor patients. J. Natl. Canc. Inst., 83: 1569-1574, 1991; Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56: 651-657, 1996; Afify et al., Purification and characterization of human serum hyaluronidase. Arch. Biochem. Biophys., 305:434-441, 1993; Salegui et al., A comparison of serum and testicular hyaluronidase. Arch. Biochem. Biophys., 121:548-554, 1967).

이어서, 기질(HA) SDS-PAGE 기술을 사용하여, 방광 종양-유래 히알루로니다아제의 상대 분자량을 결정하였다(Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56: 651-657, 1996; Gutenhoner et al., Substrate gel assay for hyaluronidase activity. Matrix, 12: 388-396, 1992). 기질(HA) SDS-PAGE를 사용하여, 정상인 및 방광암 환자의 소변 검체(40㎍ 단백질)를 분석했다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 상대적 Mr 65kD(p65) 및 55kD(p55)인 두 가지 히알루로니다아제 단백질이 G2(레인 2), G3(레인 3) 종양 환자의 소변에 존재한다. 그러나, 동일한 전체 소변 단백질 농도에서, G1 종양 환자(레인 1) 또는 정상인(레인 4) 의 소변 중에는 히알루로니다아제 밴드가 검출되지 않는다. 고-등급 방광암 환자의 소변에서 주종을 이루는 단백질이 p65 및 p55인지를 알아보기 위하여, G3 방광암 환자의 소변 검체를 SDS-PAGE 및 은염색으로 분석하여, 전체 단백질 프로파일을 밝혀냈다. 도 13B에 도시된 바와 같이, 고-등급 방광암 환자의 소변에는 여러 단백질이 함유되어 있다. 그러나, p65 및 p55는소변의 주된 단백질이 아니며, 다른 단백질 중에서 확인이 불가능하다. ELISA-유사 어세이 및 기질 겔 어세이는 단백질보다는 활성을 검출할 수 있으며 감도가 높기 때문에, 상기된 바가 의외는 아니다. 또한, 고-등급 방광암 환자 및 정상인의 소변 단백질 프로파일을 관찰하면 차이가 없었다(데이터는 도시하지 않음). G3 종양 및 정상 방광에서 p55 및 p65가 발현되는지를 알아보기 위하여, 이러한 공급원으로 제조한 조직 추출물(~40㎍ 단백질)을 기질(HA) SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, p65 및 p55는 모두 G3 종양 조직 추출물(왼쪽 레인)에 존재한다. 그러나, 뜻밖에도, 정상 방광 조직(오른쪽 레인)에는 존재하지 않는다. 흥미롭게도, 다른 조직에서는 단일 히알루로니다아제 단백질만이 발현된다는 것을 주목할 수 있다(Stern et al., Hyaluronidase levels in urine from Wilms' tumor patients; J. Natl. Canc. Inst., 83: 1569-1574, 1991; Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56:651-657, 1996; Afify et al., Purification and characterization of human serum hyaluronidase. Arch. Biochem. Biophys., 305:434-441, 1993; Salegui et al., A comparison of serum and testicular hyaluronidase. Arch. Biochem. Biophys., 121: 548-554, 1967).

이러한 데이터에 따르면, 고-등급(G2 및 G3 종양) 방광 TCC 환자는 소변 히알루로니다아제 수준이 매우 높아, 히알루로니다아제가 고-등급 방광 종양의 검출에 유용한 소변 마커가 될 수 있다는 것을 알 수 있다.

소변 및 조직 히알루로니다아제 수준의 증가는, 종양-유래 히알루로니다아제(들)가 소변으로 분비 가능하다는 것을 제시한다. 예비 데이터는, 히알루로니다아제(들)가 방광 종양 내피 세포(공개되지 않은 결과)에 의해 분비된다는 것을 나타낸다(참조: Lokeshwar et al., Association of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme with prostate cancer progression. Cancer Res., 56: 651-657, 1996). 다른 히알루로니다아제로부터 최적 pH가 다른 두 가지 히알루로니다아제 단백질(p65 및 p55)을 확인함으로써, 방광 종양-유래 히알루로니다아제는 이러한 성장 패밀리의 새로운 일원이 될 수 있다는 것이 제시된다.

실시예 4 -- 실시예 1의 연구 및 데이터 갱신: 히알루론산 및 히알루로니다아제 측정

두가지 별도의 연구(연구 A 및 연구 B)에서, 본 발명자들은 실질적으로 실시예 1,2 및 3에 기재한 것과 동일한 방법을 사용하여 356명의 소변 HA 및 HAase를 시험하였다.

연구 A:

191명에 대한 연구 A에서, ng/mg 단백질로 나타낸 소변 HA 수준(HA 시험)은, 정상인(44.7±3.1, n=25) 및 다른 비뇨생식기(GU) 환자(74.2±7.8, n=45)와 비교할 때, 종양 등급에 관계 없이 전체 방광암 환자(297.7±44.2, n=121)에서 4-7배 증가하는 것을 알 수 있었다(p<0.001). GU 환자는 양성 전립선 과형성(BPH), 신장결석, 요도 감염, 방광염, 전립선암, 전립선염, 부고환염, 발기부전 환자를 포함한다. 방광암 환자 검출의 감도 및 특이도는 최소 컷오프 한계로서 100ng HA/mg 단백질을 사용하여 계산하였다(표 9). 동일한 연구에서, mU/mg로 나타낸 단백질 소변 HAase 수준(HAase 시험)은, G1 방광암 환자(6.3±1.1), 다른 GU 환자(7.4±1.4) 및 정상인 (4.4±0.8)과 비교할 때, G2 및 G3 방광암 환자(31.4±3.6)에서 4-7배 증가하는 것을 알 수 있었다(p<0.001). HAase 시험의 감도 및 특이도는 최소 컷오프 한계로서 10mU/mg 단백질을 사용하여 계산하였다(표 9).

표 9: 연구 A에 있어서, 감도, 특이도, 허위-양성율 및 허위-음성율 및 HA-HAase 시험의 정확도 측정. 데이터는 전체 191명을 시험한 연구 A로부터 얻었다. HA 시험은 모든 방광암 환자를 검출하나, HAase 시험은 고-등급(G2, G3 및 상피내암(CIS) 등급) 방광암 환자를 검출한다.

카테고리	HA 시험	HAase 시험
감도	88.9%	92.9%
특이도	88.6%	88.7%
허위-음성율	11.1%	7.1%
허위-양성율	11.4%	11.3%
정확도	88%	90%

연구 B:

HA-HAase 소변시험의 감도 및 특이도를 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 165명에 대한 블라인드 연구(blinded study)를 실시하였다. 대상자에는 51명의 방광암 환자, 10명의 정상인과 114명의 다른 GU 조건의 환자가 포함된다. 환자의 방광암 카테고리는 질환이 있는 41명의 환자, 방광암 병력이 있으나, 시험 당시에는 질환이 없는 10명을 포함하였다. 데이터를 표 10에 나타내었다.

표 10:연구 B에 있어서, 감도, 특이도, 허위-양성율 및 허위-음성율 및 HA-HAase 시험의 정확도 측정. 165명에 대한 블라인드 연구이었다. 두 가지 시험을 조합하여 실시한 경우, 전체 감도는 95.1%로, 41명의 방광암 환자 중 단지 2명만을 검출해내지 못했다.

카테고리	HA 시험	HAase 시험
감도	92.5%	90.4%
특이도	91.1%	91.2%
허위-음성율	7.5%	9.6%
허위-양성율	8.9%	8.8%
정확도	92%	88%

결과는 HA-HAase 시험을 조합해서 실시한 경우의 감도가 각 시험을 따로 실시했을 때보다 높다는 것을 나타낸다. 이는 몇가지 경우에, 고-등급, 고-단계 방광암 환자가 HA 시험에서 허위 음성 결과를 갖더라고, HAase 시험에서는 실제 양성 결과를 나타내기 때문이며; 아마도, 히알루로니다아제의 높은 활성이 소변에 존재하는 히알루론산을 분해하여 HA 수준을 컷오프 한계 이하로 감소시키기 때문일 것이다.

이러한 연구는 HA-HAase 소변 시험이 간단하며, 비침입성이고, 고감도 및 고 특이도를 가지는 방광암 검출 및 이의 단계 평가 방법이라는 것을 보여준다.

종양 등급 및 단계에 따른 HA 및 HAase 시험의 감도를 분석하였다.

(a) HA 시험:

감도 측정을 위하여, 최소 컷오프 한계로서 HA 수준을 100ng/mg 단백질로 설정하였다. 방광암 환자는 각각 연구 A 및 연구 B의 TCC환자 121명 및 36명이었다.

표 11: 종양 등급에 따른 HA 시험의 감도. 방광암(BCa) 환자의 G1 카테고리는 G1-2 환자 6명을 포함한다. G3 카테고리는 25명의 CIS 환자를 포함한다.

표 12: 종양 단계에 따른 HA 시험의 감도. 다양한 병리학적 단계에서의 종양의 등급은 다음과 같다: G1Ta(n=41), G2Ta(n=15), G3Ta(n=5), G1T1(n=1), G2/G3T1(n=16), G2/G3 T2+(n=55) 및 G3CIS(n=25).

등급	BCa 환자 수	실제 양성의 수	감도
G1	41	37	90%
G2	24	23	96%
G3	92	81	88%

단계	BCa 환자 수	실제 양성의 수	감도
Ta	60	54	90%
T1	17	15	88%
T2+	55	50	92%
CIS	25	24	96%

표 11 및 12에 나타낸 바와 같이, HA 시험은 G1, G2 및 G3 방광 종양을 비슷한 감도, 즉 90%(G1), 96%(G2) 및 88%(G3)로 검출한다. 다양한 단계의 방광 종양을 검출하는 HA 시험의 감도가 또한 매우 유사하다. 예를 들어, HA 시험은 Ta, T1, T2+ 및 CIS 단계의 종양을 각각 감도 90%, 88%, 92% 및 965로 검출하였다. 이러한 결과는 HA 시험이 종양 등급 또는 단계에 관계 없이 방광암 환자를 검출한다는 것을 입증한다.

(b) HAase 시험:

감도 측정을 위하여, 최소 컷오프 한계로서 HAase 수준을 10mU/mg 단백질로 설정하였다. 방광암 환자는 각각 연구 A 및 연구 B의 TCC환자 121명 및 36명이었다.

표 13: 종양 등급에 따른 HAase 시험의 감도. 5명의 G1 방광암(BCa) 환자의 HAase 수준이 10mU/mg 이상이었다. 이러한 환자는 허위 양성으로 여겨지며, 특이도 측정에 참여시켰다. 또한, 2명의 G1Ta 환자는 소변 HAase 값이 컷오프 한계(10mU/mg 단백질)과 동일하였다. 환자의 G1 카테고리는 40명의 G1Ta 환자 및 한명의 G1T1 환자를 포함하였다.

표 14: 종양 단계에 따른 HAase 시험의 감도. 감도는 G3 종양의 서브-클래스인 CIS를 제외한 고-등급 종양(G2+G3)에 대하여 계산하였다.

등급	환자수	실제 양성의 수	감도
G1	41	5	12.1%
G2	24	21	88%
G3	92	84	91.3%

단계	환자수	실제 양성의 수	감도
Ta	20	17	85%
T1	16	14	87.6%
T2+	55	50	91%
CIS	25	22	88%

표 13에 나타낸 바와 같이, HAase 시험은 G1, G2 및 G3 방광 종양을 각각 12.1%, 88% 및 91.3%의 감도로 검출하였다. HAase 시험은 중간- 내지 고-등급 방광 종양(≥G2)을 선택적으로 검출하였다. 그러나, 표 14에 나타낸 결과는 HAase 시험이 모든 단계의 고-등급 방광 종양을 비슷한 감도로 검출한다는 것을 보여준다. 예를 들어, HAase 시험은 Ta, T1, T2+ 및 CIS 단계의 고-등급 방광 종양을 각각 85%, 87.6%, 91% 및 88%로 검출하였다. 이는 또한, HAase 시험이 침습전에(Ta 도는 T1 단계) 고감도로 고-등급 종양을 검출할 수 있어, 이러한 클래스의 방광 종양을 초기에 검출하는 데 사용할 수 있다는 것을 제안한다.

이러한 결과는 방광암 환자를 검출하고, 이의 등급을 평가하는 선별검사에 HA-HAase 시험을 사용할 수 있다는 것을 나타낸다. HA 시험은 종양 등급에 관계 없이 방광암 환자를 검출한다; HAase 시험은 고-등급 방광암 환자를 선택적으로 검출한다. 방광암 환자의 생존율을 향상시키는 열쇠는 침습 전에 고-등급 방광암 환자를 초기에 검출하는 것이다. 현재 수준의 검출방법으로는, 저-단계(Ta)의 G3 종양을 검출할 가능성이 매우 적다. 그러나, HAase 시험은 고-등급 저-단계 및 고-등급 고-단계 동양을 모두 동일한 감도로 검출한다. 또한, HAase 시험은 전-침습성이나 매우 공격적인 G3 종양의 서브클래스 CIS를 고감도로 검출한다. 따라서, HAase 시험을 선별검사로서 사용하여, 침습성 질환이 발병하기 전에, 고-등급 방광암 환자를 초기에 검출할 수 있다. 그러므로, HA-HAase 시험를 조함하여 사용하면, 간단하고 저가인 비침입성 방법으로, 방광암 환자의 선별검사 및 고-등급 종양을 초기에 검출하는 것이 가능하다. 이러한 선별검사는 일반적으로 방광암, 특히 고-등급 방광암 환자의 예후를 향상시킬 수 있다.

이러한 연구에 참여한 대부분의 방광암 환자가 방광의 TCC를 가지고 있음에도 불구하고, HA-HAase 시험은 또한 블라인드 시험(연구 B)에 참여한 선암(n=3) 및 편평상피세포암(n=1)환자도 검출하였다. 그러므로, HA-HAase 시험은 방광의 다른 희귀 악성종양을 검출하는 데도 유용하다.

특이도 시험:

HA-HAase 시험에 대한 특이도를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 건강한 정상 지원자와 다른 GU 조건의 환자를 모두 시험하였다. 연구 A에서, 70명이 특이도 시험에 참여하였다. 이들 70명에는 22명의 정상인 및 48명의 방광암이 아닌 다른 GU 조건의 환자가 포함된다. GU 카테고리는 전립선암(n=10); 양성 전립선 과형성(BPH,n=8); 신장 결석(n=5), 방광염(n=12), 요도감염(n=8), 전립선염(n=2), 부고환염(n=1) 및 신장외상(n=2) 환자를 포함한다. 상기한 바와 같이, HA 및 HAase 시험의 특이도는 각가 88.6% 및 88.7%이다. HAase 시험의 특이도를 결정하기 위하여, G1 질환(n=35) 환자가 계산에 포함되었다.

블라인드 연구인, 연구 B에 있어서, 특이도 시험에 124명이 참가하였다(정상인 15명, 방광암 이외의 다른 GU 조건 환자 99명 및 방광암 병력이 있으나, 시험 당시에는 질환의 방광경적 증거가 없는 환자 10명). GU 카테고리는 전립선암(n=37), 후-근치적 전립선 절제(n=12), 신장/수뇨관/요도 암(n=6), BPH(n=17), 수뇨관/신장/방광 결석(n=5), 고환암(n=2), 요도감염(n=5), 혈뇨(n=2), 방광염(n=3), 발기부전(n=2), 소변 잔류(n=1), 요실금(n=1), 신산통(n=1), 요도 협착(n=1), 정낭염/전립선염/부고환염(n=3), 방광 경부 수축(n=1), 음낭 혈종(n=1), 정관절제(n=1) 환자를 포함한다. 상기한 바와 같이, 연구 B에서, HA 및 HAase 시험의 특이도는 각각 91.1% 및 91.2%이었다. HAase 시험의 특이도를 결정하기 위하여, G1 질환(n=6)의 환자를 계산에 포함하였다.

요약하면, HA 시험은 종양 등급에 관계 없이 방광암을 검출한다. 그러나, HAase 시험은 고-등급 방광암을 선택적으로 검출한다. 따라서, 두가지 어세이를 동시에 실시함으로써, 방광암을 선별검사하면서, 이의 등급도 알 수 있다. 블라인드 시험(즉, 연구 B)에서, HA 및 HAase 시험을 조합하여 실시한 결과, 41명의 방광암 환자 중 단지 2명만을 검출해내지 못하였다. 그러므로, 조합된 HA-HAase 시험의 전체 감도(95%)는 별도로 실시한 HA(92.5%) 및 HAase(92.5%) 각각의 감도보다 약간 더 우수하다.

HA-HAase 시험과 BARD BTA 및 NMP22^TM의 비교:

과학 저널에 간행된 보고서에 따르면, 방광암의 재발을 검출하기 위해서 BTA 및 NMP22^TM시험이 방광암 환자의 추적검사에 사용되어 왔다. 이러한 시험은 선별검사로 사용된 바가 없다. 상기한 바와 같이, 멀티센터 시험에서, Sarosdy 등은 방광염 검출에 대한 BTA의 전체 감도가, 종양 등급에 관계없이, ~40%라고 보고하였다.

방광암 병력이 있는 90명의 환자에 대한 연구에서, NMP22^TM는 33건의 방광암 재발 중 23건을 검출하였다(전체 감도 70%). 또한, NMP22^TM는 침습성 질환이 있는 방광암 환자를 모두 검출하였다.

HA-HAase 시험과 BTA 및 NMP22^TM의 비교를 표 15 및 16에 나타내었다. 표 15 및 16에 나타낸 바와 같이, HA-HAase 시험은 방광암을 검출하는 데 있어서, 감도, 특이도 및 유병력(prevalence) 관련 파라미터에 있어서, BTA 또는 NMP22^TM시험 어느 것보다 우수하다.

표 15:

감도 및 특이도에 대한 BTA, NMP22^TM및 HA-HAase 시험의 비교. BTA 연구 "a"에는 499명의 환자가, 연구 "b"에는 60명의 환자가 참여하였다. NMP22^TM연구에는 90명의 환자가, HA-HAase 연구에는 356명의 환자가 참여하였다.

^aSarosdy et al., Results of a multicenter trial using the BTA test to monitor for and diagnose recurrent bladder cancer, J. Urol., 154: 379-384, 1995.

^bD'Hallewin and Baert, Initial evaluation of the bladder tumor antigen test in superficial bladder cancer. J. Urol., 155: 475-476, 1995.

^cSoloway et al., Use of a new tumor marker NMP22 in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract followingsugical treatment. J. Urol., 156: 363-367, 1996.

표 16:

유병력 관련 파라미터에 대한 BTA, NMP22^TM및 HA-HAase 시험의 비교. BTA 연구에는 499명의 환자가, NMP22^TM연구에는 90명의 환자가, HA-HAase 연구에는 356명의 환자가 참여하였다. PPV: 양성 예상값; NPV: 음성 예상값.

^bSoloway et al., Use of a new tumor marker NMP22 in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract followingsugical treatment. J. Urol., 156: 363-367, 1996.

카테고리	BTA	NMP22^TM	HA-HAase
감도	^a40%^b65%	^c70%	92.3%
특이도	^a81-95%	^c79%	87.9%

카테고리	BTA	NMP22^TM	HA-HAase
유병력	a 30%	b 29.5%	24.8%
PPV	71%	58%	80%
NPV	87%	86%	96.6%

본 발명자들은 방광암 병력이 있는 10명의 환자에 대해 1년 동안 재발에 대해 모니터하였다; 이 연구에서 HA-HAase 시험은 모두 6건의 재발(전체 감도 100%)을 검출해내었다. 사실, HA-HAase 시험은 종양이 방광경 검출되기 전 3-6개월에 4건의 재발을 검출하였다. 그러므로, HA-HAase 시험은 선별검사뿐아니라, 종양 재발의 모니터에도 사용할 수 있다.

TCC 이외의 방광암의 분석:

공지된 바와 같이, TCC는 방광 종양의 대부분(90-95%)을 차지하며, 편평상피암 및 선암이 나머지 방광 종양을 이룬다. 본 발명자들은 선암으로부터 얻은 세 개의 시료 및 편평상피세포암 환자로부터 얻은 한 개의 시료를 분석하였다. 이들 종양이 모두 HA-HAase 시험에 의해 검출되었다. 이는 본 발명의 HA-HAase 시험이 모든 형태의 방광 종양을 검출할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5 -- HA-HAase 소변 시험을 통한 처리 효율 및 방광암 재발 모니터링

본 발명의 발명자는 연구 #1에서 25명의 방광암 환자에 대하여 전- 및 후-처리 소변 HA 및 HAase 수준을 비교하였다. 결과를 방광경 검사법 및 세포학으로 비교하였다. 근치 방광 절제술을 실시한 환자(n=13) 중 8명은 수술 전의 높은 HA(395.6±106) 및 HAase(33±5.4) 수준이 정상으로 돌아갔다(P<0.0025). 나머지 5명 중 4명은 높은 소변 HA 및 HAase 수준이 2-5배 감소하였다. 방광 스페어링 처리(bladder sparing treatment)(n=12)를 실시한 환자는, 높은 전처리 HA 및 HAase 수준이 각각 281±100 및 33.5±4.5였다. 방광 일부 절제술을 실시한 세 명의 환자 중 두 명은 이러한 수준이 정상으로 돌아갔으며, 수준이 감소하지 않은 한 명은 6개월 후에 재발되었다. TURBT + 방광 치료를 실시한 일곱 명의 환자 중 세 명은 소변 HA 및 HAase 수준이 정상으로 돌아갔으며, 이 중 두 명은 1년 후에 종양이 사라졌다. 일곱 환자 중 네 명은 소변 HA 및 HAase 수준이 정상으로 돌아가지 않았다.; 이들 중 세 명은 3-9 개월 후에 재발되었으며, 나머지 한 명은 치료가 어려운 종양(persistent tumor)을 가졌다. 두 명의 환자는 TURBT 만을 실시하였다; 한 명의 환자는 높은 HA 및 HAase 수준이 감소하지 않았고, 6개월 후에 종양이 재발하였다. 다른 환자는 정상이 되었고, 1년 후에 종양이 사라졌다. 본 발명자는 또는 방광암 병력이 있는 열명의 환자를 모니터하여, 재발 모니터링에 대한 HA-HAase 시험의 유용성을 평가하였다. HA-HAase 시험을 통하여 방광암이 재발한 여섯명의 환자를 모두 확인하였다. HA-HAase 시험을 통하여, 종양의 방광경 검사 검출 3-6개월 전에 네명의 환자에게서 암의 재발을 검출하였다.

연구 #2에서, 2중-블라인드 방식으로 HA-HAase 시험을 평가하였다. 방광암 병력이 알려져 있는 60명의 환자로부터 수집한 71 연속 소변 시료를 HA-HAase 시험을 통하여 검사하고, 그 결과를 방광경 검사법, 방광암 경요도 절제(TURBT) 또는 방광절제술에 의한 동시 조사 결과와 비교하였다. 재발의 임상적 증거가 나타난 50명의 환자 중, 전체 감도 88%(허위 음성율 12%) 및 정확도 84.5%인 HA-HAase 시험을 통하여 44명을 검출하였다. HA-HAase 시험의 정확도는 또한, 초기 방광 스페어링 처리 후 3달 내지 1년동안 18명의 방광암 환자를 모니터하여 평가하였다. 이러한 환자 그룹에서, HA-HAase 시험은 42건의 재발 에피소드 중 39건을 검출하여, 전체 감도 92.9%(허위 음성율 7.1%)였다. 5건의 허위 양성 중, 3-6개월 후에 3건이 결국 재발되었다.

이러한 연구를 통하여, HA-HAase 시험은 처리 효율 및 종양 재발을 모니터하기에 유용하다는 것을 알게 된다. 결과적으로, HA-HAase 시험은 방광암의 발생 및 재발을 모두 모니터할 수 있는 감도가 높고 특이적인 비-침입성 방법이다.

본 발명은 특정 실시형태를 참조하여 상세히 설명하였으나, 당업자는 설명 및 청구되어 있는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변경할 수 있다.

Claims

(a) 방광암이 의심되는 사람으로부터 시료를 얻는 단계;

(b) 시료 중의 히알루론산의 양을 정량 및 표준화하는 단계;

(c) 히알루론산의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루론산의 컷오프 한계와 비교하여, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 큰 경우에, 상기 사람에게 방광암의 위험이 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 방광암의 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

상기 시료가 담즙, 혈액, 혈장, 혈청, 조직 추출물, 소변 및 조직 세척액 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

상기 시료를 방광암 치료를 받은 사람으로부터 얻어, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 크면, 상기 사람에게 방광암의 재발 위험 증가를 나타내는 것으로 하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

상기 시료 중의 히알루론산을 효소 어세이, 면역어세이, 방사어세이 및 경쟁적 결합 어세이 중에서 선택된 어세이로 정량하는 것을 특징으로하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

상기 시료 중의 히알루론산을

(1) 히알루론산을 지지체에 도포하는 단계;

(2) 상기 시료의 존재하에 히알루론산 결합 단백질과 상기 지지체를 접촉시켜, 상기 지지체에 도포된 히알루론산과 시료 중의 히알루론산이 히알루론산 결합 단백질에 결합하기 위해 경쟁하는 단계;

(3) 상기 지지체에 결합된 히알루론산 결합 단백질의 양의 결정에 근거하여, 상기 시료 중의 히알루론산의 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 어세이로 정량하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 5 항에 있어서,

결합된 히알루론산 결합 단백질의 양을 효소-결합 어세이(enzyme-linked assay)로 결정하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

히알루론산의 양을 사람의 수분공급 상태에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

히알루론산의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 8 항에 있어서,

상기 히알루론산의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 100 ng 히알루론산임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

상기 방광암이 전이세포암종(transitional cell carcinoma), 편평상피암 및 선암 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

(d) 시료 중의 히알루로니다아제의 양을 정량하고 표준화하는 단계;

(e) 히알루로니다아제의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루로니다아제의 컷오프 한계와 비교하여, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 크고, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 작은 경우에, 상기 사람에게 저-등급 방광암이 있음을 확인하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 11 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 양을 사람의 수분공급 상태에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 11 항에 있어서,

히알루로니다아제의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 13 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 10 mU 히알루로니다아제임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 1 항에 있어서,

(d) 시료 중의 히알루로니다아제의 양을 정량하고 표준화하는 단계;

(e) 히알루로니다아제의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루로니다아제의 컷오프 한계와 비교하여, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 크고, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 큰 경우에, 상기 사람에게 중간-등급 내지 고-등급 방광암이 있음을 확인하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 15 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 양을 사람의 수분공급 상태에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 15 항에 있어서,

히알루로니다아제의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 15 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 10 mU 히알루로니다아제임을 특징으로 하는 선별검사법.
(a) 방광암이 의심되는 사람으로부터 시료를 얻는 단계;

(b) 시료 중의 히알루로니다아제의 양을 정량 및 표준화하는 단계;

(c) 히알루로니다아제의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루로니다아제의 컷오프 한계와 비교하여, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 큰 경우에, 상기 사람에게 방광암의 위험이 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 방광암의 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 시료가 담즙, 혈액, 혈장, 혈청, 조직 추출물, 소변 및 조직 세척액 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 시료를 방광암 치료를 받은 사람으로부터 얻어, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 크면, 상기 사람에게 방광암의 재발 위험 증가를 나타내는 것으로 하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 시료 중의 히알루로니다아제를 효소 어세이, 면역어세이, 방사어세이 및 경쟁적 결합 어세이 중에서 선택된 어세이로 정량하는 것을 특징으로하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 시료 중의 히알루로니다아제를

(1) 히알루론산을 지지체에 도포하는 단계;

(2) 상기 시료 중의 히알루로니다아제가 적어도 지지체에 도포된 히알루론산의 일부를 분해할 수 있는 조건하에, 상기 시료를 상기 지지체와 접촉시키는 단계;

(3) 히알루론산 결합 단백질을 상기 지지체에 남아있는 히알루론산에 결합시키는 단계;

(4) 상기 지지체에 결합된 히알루론산 결합 단백질의 양의 결정에 근거하여, 상기 시료 중의 히알루로니다아제의 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 어세이로 정량하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 23 항에 있어서,

결합된 히알루론산 결합 단백질의 양을 효소-결합 어세이(enzyme-linked assay)로 결정하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 양을 사람의 수분공급 상태에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

히알루로니다아제의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 26 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 10 mU 히알루로니다아제임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

상기 방광암이 전이세포암종(transitional cell carcinoma), 편평상피암 및 선암 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 선별검사법.
제 19 항에 있어서,

(d) 시료 중의 히알루론산의 양을 정량하고 표준화하는 단계;

(e) 히알루론산의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루론산의 컷오프 한계와 비교하여, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 작은 경우에, 상기 사람에게 중간-등급 내지 고-등급 방광암이 있음을 확인하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 29 항에 있어서,

상기 히알루론산의 양을 사람의 수분공급 상태에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 29 항에 있어서,

히알루론산의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 선별검사법.
제 31 항에 있어서,

상기 히알루론산의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 100 ng 히알루론산임을 특징으로 하는 선별검사법.
(a) 방광암이 의심되는 사람으로부터 시료를 얻는 단계;

(b) 시료 중의 히알루론산의 양을 정량 및 표준화하는 단계;

(c) 시료 중의 히알루로니다아제의 양을 정량 및 표준화하는 단계;

(d) 히알루론산의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루론산의 컷오프 한계와 비교하는 단계;

(e) 히알루로니다아제의 표준화된 양을 방광암에 대한 히알루로니다아제의 컷오프 한계와 비교하는 단계;

(f) 히알루론산의 표준화된 양이 히알루론산의 컷오프 한계보다 크고, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 작은 경우에, 상기 사람에게 저-등급 방광암이 있음을 확인하고, 또는 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 큰 경우에, 상기 사람에게 중간-등급 내지 고-등급 방광암이 있음을 확인하는 단계를 포함하여 이루어지는 등급별 방광암 구분방법.
제 33 항에 있어서,

상기 시료를 방광암 치료를 받은 사람으로부터 얻어, 히알루론산의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 크면, 상기 사람에게 방광암의 재발 위험 증가를 나타내는 것으로 하는 것을 특징으로 하는 구분방법.
제 33 항에 있어서,

상기 시료를 방광암 치료를 받은 사람으로부터 얻어, 히알루로니다아제의 표준화된 양이 히알루로니다아제의 컷오프 한계보다 크면, 상기 사람에게 방광암의 재발 위험 증가를 나타내는 것으로 하는 것을 특징으로 하는 구분방법.
제 33 항에 있어서,

상기 사람의 수분공급 상태 또는 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 구분방법.
제 33 항에 있어서,

상기 히알루론산의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 100 ng 히알루론산임을 특징으로 하는 구분방법.
제 33 항에 있어서,

상기 히알루로니다아제의 컷오프 한계가 시료중의 단백질 mg당 약 10 mU 히알루로니다아제임을 특징으로 하는 구분방법.
(a) 시료를 얻는 단계;

(b) 상기 시료 중의 히알루론산 또는 히알루로니다아제의 양을 정량하는 단계;

(c) 상기 시료 중의 히알루론산 또는 히알루로니다아제의 양을 표준화하는 단계를 포함하여 이루어지는 히알루론산 또는 히알루로니다아제 양의 표준화 방법.
제 39 항에 있어서,

상기 시료가 복수액, 담즙, 혈액, 뇌척수액, 림프액, 복막액, 혈장, 정액, 혈청, 활액, 조직 추출물, 소변, 초자체액 및 조직 세척액 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 표준화 방법.
제 39 항에 있어서,

상기 히알루론산 또는 히알루로니다아제의 양을 시료의 단백질 농도에 기초하여 표준화하는 것을 특징으로 하는 표준화 방법.
(a) 히알루론산,

(b) 히알루론산 결합 단백질, 및

(c) 생물학적 체액 시료 중의 히알루론산 및/또는 히알루로니다아제를 정량하기에 적합한 보조제를 포함하여 이루어지며, (a), (b) 및 (c) 성분이 별도의 용기에 제공되는 방광암 검출용 진단키트.
제 42 항에 있어서,

딥스틱(dipstick) 시험 기구의 형태인 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 42 항에 있어서,

ELISA-유사 시험 기구의 형태인 것을 특징으로 하는 진단키트.
히알루로니다아제 p65 또는 p55가 풍부한 분획을 포함하여 이루어지는 조성물.
제45항의 히알루로니다아제 p65 또는 p55에 의해 생성된 히알루론산 단편을 포함하여 이루어지는 조성물.
제45항의 히알루로니다아제 p65 또는 p55에 대한 항체를 포함하여 이루어지는 조성물.
(a) 방광암이 의심되는 사람으로부터 시료를 얻는 단계;

(b) 상기 시료 중의 히알루론산 및/또는 히알루로니다아제를 분리하여, 크기 프로파일을 얻는 단계;

(c) 상기 크기 프로파일에 기초하여, 상기 사람에게 방광암의 위험이 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 방광암의 선별검사법.
방광암이 있는 사람의 소변으로부터 얻은 히알루론산이 풍부한 분획을 포함하여 이루어지는 조성물.
(a) 세포 배양액을 얻는 단계; 및

(b) 세포 증식을 유도하는 조건하에서 제49항의 히알루론산을 상기 배양액에 가하는 단계를 포함하여 이루어지는 세포 증식 어세이.
제50항의 세포 증식을 약물로 억제하는 단계를 포함하여 이루어지는 약물 섬별검사 어세이.
(a) 방광암이 의심되는 사람으로부터 시료를 얻는 단계,

(b) 상기 시료에 세포 배양액을 가하는 단계, 및

(c) 상기 세포 배양액의 증식에 의해, 상기 사람에게 방광암의 위험이 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 방광암의 선별검사법.