JP2000504114A

JP2000504114A - 膀胱癌の検出及び評価方法

Info

Publication number: JP2000504114A
Application number: JP9527660A
Authority: JP
Inventors: ロクシュワー，ビナタ，ビー．; ブロック，ノーマン，エル．; ファム，ヘンリー，ティ．
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2000-04-04
Also published as: WO1997028446A1; AU2242297A; KR19990082173A; EP0922222A1; CA2242856A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、膀胱癌を検出し、評価するための新規な方法に関する。本発明の方法は、ヒアルロン酸（ＨＡ）とヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）の標準化量が膀胱癌の検出、そのグレードの評価、その治療効力と腫瘍再発とのモニターリングのための診断マーカーであるという発見に基づく。

Description

【発明の詳細な説明】膀胱癌の検出及び評価方法発明の背景１．発明の分野本発明はヒアルロン酸（ＨＡ）とヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）とを用いて、膀胱癌を検出し、評価するための新規な方法に関する。２．関連技術の説明膀胱癌腫は、合衆国において毎年新たな症例５１，０００件と死亡１１，０００件の原因である、尿路の最も一般的な癌である。転移細胞癌腫（ＴＣＣ）は膀胱腫瘍の〜９０％の割合を占める。これらの腫瘍はそれらの進行能力において不均一である。例えば、ある種のＴＣＣは良性に挙動するが（低グレード、Ｇ１腫瘍）、他の腫瘍は中程度（Ｇ２腫瘍）から高度侵襲性（Ｇ３腫瘍と上皮内癌（ＣＩＳ））である。高グレード腫瘍は一般に迅速に転移し；実際に、臨床発現（例えば、血尿、排尿時剌激症候群(irritative voiding symptom)）時に、高グレード膀胱腫瘍を有する多くの患者では、侵襲性疾患が既に存在する。ＴＣＣの２つの最も重要な予後ファクターはグレードとステージ（侵襲の深さを意味する）である（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｉｎｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＣａｎｃｅｒ：「尿生殖器部位における癌のステージング」，ＭａｎｕａｌｆｏｒＳｔａｇｉｎｇＣａｎｃｅｒ，第３版，１９４〜１９５頁，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，フィラデルフィア，１９８８）。低グレード（Ｇ１）腫瘍は殆ど粘膜に限定され（ステージＴａ）、＜２％の進行見込み(chanc e of progression)を有する（Ｈｅｎｅｙ，「表在性膀胱癌の自然病歴」，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．，１９：４２９〜４３５頁，１９９２；ＨｅｎｅｙとＦｌａｎａｇａｎ，「表在性膀胱癌の進行と再発」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３０：１０８３〜１０８６，１９８３）。中程度グレード（Ｇ２）腫瘍は非侵襲性（Ｔａ）から侵襲性（ステージＴ１〜Ｔ４）までの範囲である。Ｇ２，Ｔａ腫瘍は〜１１％の進行見込みを有する（Ｈｅｎｅｙ，「表在性膀胱癌の自然病歴」，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．，１９：４２９〜４３５頁，１９９２）。上皮内癌（ＣＩＳ）を例外として、大抵の高グレード腫瘍は少なくともＴ１ステージ（固有層を侵襲する）で最初に検出されるので、侵襲性である。腫瘍による筋肉侵襲（ステージＴ２）は、これらの患者の５０％が根治的な手術にも拘わらず診断から２年間以内に遠位転移を発現し、これらの患者の６０％が治療されたにも拘わらず５年間以内に死亡するので、高危険性である（ＨｅｎｅｙとＦｌａｎａｇａｎ，「表在性膀胱癌の進行と再発」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３０：１０８３〜１０８６，１９８３；Ｆｒｉｅｄｅｌｌ等，「膀胱の上皮内癌腫に関する研究会の要約」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３６：１０４７〜１０４８，１９８６；Ｓｏｌｏｗａｙ，「侵襲性膀胱癌：主要療法の選択」，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：５５１〜５５４，１９９０）。高グレードＴＣＣの悪性の特質のために、筋肉侵襲の前に、それらを初期検出することは有利な予後のために重要である。したがって、腫瘍の存在を早期に検出することのみが重要であるのではなく、このような厳しい予後を伴って現れる高グレード腫瘍を同定することも重要である。腫瘍再発も膀胱癌の特徴である。それ故、原発腫瘍の根治にも拘わらず、治療効力と再発をモニターするために患者を厳密にフォローすべきである（Ｈｅｎｅｙ，「表在性膀胱癌の自然病歴」，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．，１９：４２９〜４３５頁，１９９２）。膀胱癌検出のための現在の方法は、膀胱鏡検査法、膀胱洗浄及びバイオプシーを含む。これらの方法は侵襲性であり、何らかの形の麻酔を必要とする。尿細胞学の適用も可能であるが、その主観的性質のためにその特異性は低い。例えばＤＮＡ倍数性(DNA ploidy)、ｐ５３突然変異、マイクロサテライトＤＮＡ、β−グルクロニダーゼ、塩基性ＦＧＦレベル、自己分泌運動性因子(autocrine motilit y factor)受容体等のような、若干の他のマーカーが膀胱癌に結合することが判明している（ＳｉｄｒａｎｓｋｙとＭｅｓｓｉｎｇ，「膀胱癌における分子遺伝学と生化学的機構」，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．，１９：６２９〜６３９，１９９２；Ｍａｏ等，「マイクロサテライトＤＮＡによる原発膀胱癌の分子検出」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：６５９〜６６２，１９９６；Ｎｇｕｙｅｎ等，「膀胱癌患者の尿中の血管新生ペプチド塩基性繊維芽細胞増殖因子のレベル上昇」，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８５：２４１〜２４２，１９９３；Ｅｓｒｉｇ等，「膀胱癌における核ｐ５３の蓄積と腫瘍進行」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１：１２５９〜１２６４，１９９４；Ｈｏ，「原発性尿路悪性疾患のスクリーニングとフォローアップとにおける尿β −グルクロニダーゼ」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：１３３５〜１３３８，１９９５；Ｋｏｒｍａｎ等．，「膀胱の転移細胞癌腫のための可能な尿マーカーとしての自己分泌運動性因子受容体」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：３４７〜３４９，１９９５）。しかし、これらの大部分は診断マーカーとして臨床的にまだ用いられていない。現在、膀胱癌に関する３種類の非侵襲性診断試験が合衆国において研究中である。血尿家庭スクリーニング試験は高い感度を有するが、疑陽性を誘発する、良性の尿生殖器（ＧＵ）状態（腎臓結石、良性前立腺肥大等）のために特異性は低い（Ｂｒｉｔｔｏｎ等，「微量に存在する尿出血の検出による膀胱癌スクリーニングについての共同体研究」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４８：７８８〜７９０，１９９２；Ｍｅｓｓｉｎｇ等，「血尿家庭スクリーニング：反復試験結果」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：５７〜６１，１９９５）。第２試験はＢａｒｄＢＴＡＬａｔｅｘ凝集反応分析である。膀胱腫瘍再発をモニターするために、合衆国において、この試験法に関するマルチセンター試験がおこなわれた。結果は、膀胱腫瘍、さらに重要には高グレードＴＣＣを検出するためのこの試験の感度が僅か〜４０〜５０％であることを示す（Ｓａｒｏｓｄｙ等，「再発性膀胱癌をモニターし、診断するためのＢＴＡ試験法を用いたマルチセンター試験の結果」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：３７９〜３８４，１９９５；米国特許第５，２６４，３７０号）。９０人の患者と第３試験とを含む他のマルチセンター研究において、Ｓｏｌｏｗａｙ等は、ＮＭＰ２２試験が膀胱腫瘍再発の検出に７０％の総合感度を有することを示している（Ｓｏｌｏｗａｙ等，「手術後の尿路潜在的(occult)又は迅速に再発する転移細胞癌腫の検出における新しい腫瘍マーカーＮＭＰ２２の使用」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５６：３６３〜３６７，１９９６）。したがって、現在まで、高い感度と特異性とによって膀胱腫瘍を検出し、及び／又はそのグレードを評価することができる非侵襲性試験は存在しない。当該技術分野における上記問題に留意して、本発明者は、膀胱癌患者の生物学的流体（例えば、尿標本）中に特異的に発現されるある種の“分子決定因子”のレベルを測定することによる、膀胱癌を検出するための非侵襲性方法を開発した。より詳しくは、本発明の方法は、生物学的流体（特に尿）のサンプル中のヒアルロン酸及びヒアルロニダーゼのレベルが膀胱癌の存在とグレードとに関係するという発明者の発見に基づく。ヒアルロン酸（当該技術分野ではヒアルロネート及びヒアルロナンとしても知られ、ＨＡと略記される）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸との交互単位を有する直鎖非分枝多糖鎖を含むグリコサミノグリカンである。ＨＡは、細菌と動物の両方を含めた、種々なタイプの生物学的物質中に偏在する。ヒトにおいて、ＨＡは臍帯、眼の硝子体液、軟骨及び滑膜流体中に高濃度で存在する。少量のＨＡはＣＳＦ、リンパ、血液、血清及び尿中に存在する。ＨＡのレベルは例えば慢性関節リウマチ、肝硬変及びＷｉｌｍｓ腫瘍のような疾患に関係する。ＨＡは一般に非特異的腫瘍に関係するが、その使用は今までは、特定の臨床的腫瘍の発見、治療及び管理に適用されていない。ＨＡは癌を含めた幾つかの病態生理学的状態に関係することが知られている。例えば、ＨＡレベルはある種の動物腫瘍モデルで上昇することが判明している［例えば、ウサギＶ２癌腫、Ｋｎｕｄｓｏｎ等，「腫瘍関連ヒアルロナンの役割と調節」，ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ編集），１５０〜１６９頁，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＷｉｌｅｙＣｈｉｃｈｉｓｔｅｒ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，１４３），１９８９）並びにヒト癌（例えば、肺、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、胸部等），Ｋｎｕｄｓｏｎ等，上記文献］。腫瘍組織中で、ＨＡは水和時に膨張して、腫瘍細胞移動のための間隙を開ける（Ｋｎｕｄｓｏｎ等，「腫瘍関連ヒアルロナンの役割と調節」，ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ編集），１５０〜１６９頁，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＷｉｌｅｙＣｈｉｃｈｉｓｔｅｒ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，１４３），１９８９）。さらに、腫瘍細胞はある種の細胞表面受容体を介して相互作用することによって、ＨＡマトリックス上を移動する（例えば、ＣＤ４４：Ｔｈｏｍａｓ等，「ヒアルロネート上のヒト黒色腫細胞の移動はＣＤ４４発現に関係する」，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１００：１１５〜１２０，１９９３）。ＨＡはまた、免疫監視機構から腫瘍細胞を保護する、腫瘍細胞周囲にハロ(halo)を形成する（Ｈｏｂａｒｔｈ等，「マイトマイシンＣとアジュバントヒアルロニダーゼとによる表在性膀胱癌の局所化学的予防法」，Ｅｕｒｏｐ．Ｕｒｏｌ．，２１：２０６〜２１０，１９９２）。さらに最近では、ＨＡの小フラグメント（〜３− ２５二糖単位）が血管新生を促進することが判明している（Ｗｅｓｔ等，「ヒアルロン酸の分解生成物によって誘導される血管新生」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３２４〜１３２６，１９８５；ＷｅｓｔとＫｕｍａｒ，「内皮細胞増殖と単層完全性とに対するヒアルロネートとそのオリゴ糖との効果」，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，１８３：１７９〜１９６，１９８９）。本発明者の１人による以前の研究は、１０〜１５二糖単位のＨＡフラグメント（Ｆ１フラグメント）がウシ大動脈内皮細胞の増殖を剌激することを示している。同様な大きさのフラグメントが内皮細胞移動(endothelial cell migration)と小管(tubule)形成とを促進することも判明している（ＢａｎａｒｊｅｅとＴｏｏｌｅ，「内皮細胞形態形成においてタンパク質と結合するヒアルロナン」，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１９：６４３〜６５２，１９９２）。本出願において、本発明者は、正常個人と膀胱癌患者との尿中のＨＡレベルと、正常な膀胱組織と腫瘍組織とから調製した抽出物中のＨＡレベルとを以下で考察するように測定する。同様に、以下で考察するように、本発明者は正常な個人、膀胱癌患者、及び他の尿生殖器（ＧＵ）状態を有する患者の尿中に存在するＨＡ種のプロフィルを検査する。さらに、かれらは、尿中に存在するＨＡ又はＨＡフラグメントがヒト内皮細胞の増殖に影響を与えるかどうかを評価する。本発明者は本出願において、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３腫瘍を有する膀胱癌患者の尿中ＨＡレベルが、正常な個人及び他の尿生殖器（ＧＵ）状態を有する患者の尿中ＨＡレベルに比べて、有意に上昇する（例えば、４〜９倍）（Ｐ＜０．００１）ことを開示する。以下で考察するように、本発明者は、治療前と治療後の尿中ＨＡレベルの比較を用いて、治療効力をモニターすることができることも発見した。例えば、治療後の尿中ＨＡレベルの上昇は持続的な膀胱癌と、後の時点における可能な再発(relapse)とを示唆する。尿中ＨＡレベルは、最初の治療後のフォローアップ通院中の膀胱癌再発をモニターするためにも有用である。ＨＡレベルは膀胱腫瘍組織中でも上昇する（例えば、３〜５倍）ので（Ｐ＜０．００１）、尿中ＨＡ濃度の上昇は腫瘍関連ＨＡレベルの上昇に直接相関する。正常な個人と膀胱癌患者との尿中ＨＡ種のプロフィルは異なる。中程度サイズのＨＡ種のみが正常及び低グレード膀胱腫瘍患者の尿中に存在するが、高グレード膀胱癌患者の尿は高分子量の血管新生ＨＡフラグメントと小さい血管新生ＨＡフラグメントの両方を含有する。本発明者は本出願において、これらの尿中ＨＡフラグメントが原発性ヒト微細血管(microvessel)内皮細胞においてマイトジェン反応(mitogenic reaction)を剌激する（例えば、２〜４倍）ことをも開示し、小さいＨＡフラグメントが内皮細胞機能を調節することによって、腫瘍血管新生を調整しうることを示唆する。本発明者は、高グレード膀胱癌患者の尿中の小さいＨＡフラグメントがこれらの患者の尿中にヒアルロニダーゼ活性が存在することを意味しうることを仮定した。ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）は、ＨＡ中のＮ−アセチルグルコサミン結合を加水分解することによってＨＡを分解するエンドグリコシド酵素(endoglycosi dic enzyme)である。ヒアルロニダーゼによるＨＡの制限された分解は、血管新生性である特定長さ（〜３−２５二糖単位）のＨＡフラグメントを発生させる（Ｗｅｓｔ等，「ヒアルロン酸の分解生成物によって誘導される血管新生」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３２４〜１３２６，１９８５）。脊椎動物では、ヒアルロニダーゼを２クラスに、即ち、中性ｐＨにおいて活性であるヒアルロニダーゼ（最適ｐＨ５．０）と酸性ｐＨ（ｐＨ３．５〜４．０）において活性であるヒアルロニダーゼとに類別することができる（Ｒｏｄｅｎ等，「ヒアルロナン異化作用の酵素による経路」，ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，（Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ編集），６０〜８６頁，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＷｉｌｅｙＣｈｉｃｈｉｓｔｅｒ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ１４３），１９８９；Ｗｅｓｔ等，上記文献；Ｇｏｌｄ，「ヒト肝臓からのヒアルロニダーゼの精製と性質」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０５：６９〜７４，１９８２；ＦｒａｓｅｒとＬａｕｒｅｎｔ，「ヒアルロナンのターンオーバーと代謝」，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｙａｌｕｒｏｎａｎ，（Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ編集），４１〜５９頁，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｗｉ１ｅｙＣｈｉｃｈｉｓｔｅｒ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ１４３），１９８９；Ｚｈｕ等，「哺乳動物ヒアルロニダーゼの分子クローニングはヘモペキシン、血清ヘム結合タンパク質によるアイデンティティを明らかにする」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２０９２〜３２０９７，１９９４；Ｌｉｎ等，「精子原形質膜タンパク質ＰＨ−２０のヒアルロニダーゼ活性は、卵子を囲む卵丘層(cumulus layer)を精子が透過するのを可能にする」，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２５：１１５７〜１１６３，１９９５）。例えば、睾丸ヒアルロニダーゼは中性型であるが、肝臓ヒアルロニダーゼは酸性の最適ｐＨを有する。ＨＡとヒアルロニダーゼの両方の協同作用(conce rted actions)は胚発達、脈管形成、脈管再構築、免疫監視機構及び腫瘍進行中に重要な役割を果たすことが知られる（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋとＺｅｔｔｅｒ，「血管新生と転移における接着性相互作用」，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５３：２３９〜２６０，１９９２；Ｈｏｂａｒｔｈ等，「マイトマイシンＣとアジュバントヒアルロニダーゼとによる表在性膀胱癌の局所化学的予防法」，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．，２１：２０６〜２１０，１９９２；Ｋｎｕｄｓｏｎ等，「腫瘍関連ヒアルロナンの役割と調節」，ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｊ．Ｗｈｅｌａｎ編集），１５０〜１６９頁，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＷｉｌｅｙＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ１４３），１９８９；Ｌｉｎ等，「尿中ヒアルロン酸はＷｉｌｍｓ腫瘍マーカーである」，Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．，３０：３０４〜３０８，１９９５；Ｓｔｅｒｎ等，「Ｗｉｌｍｓ腫瘍患者からの尿中のヒアルロニダーゼレベル」，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．，８３：１５６９〜１５７４，１９９１）。本発明者は、前立腺癌においてヒアルロニダーゼレベルが上昇し、この上昇が前立腺癌の攻撃性(aggressiveness)と相関することを示している（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関連」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６）。本発明者は本出願において、Ｇ２及びＧ３腫瘍を有する膀胱癌患者の尿中ＨＡアーゼレベルが、正常個人、Ｇ１腫瘍を有する患者及び他のＧＵ状態を有する患者の尿中ＨＡアーゼレベルに比べて、有意に上昇する（例えば、５〜８倍）（Ｐ＜０．００１）ことを開示する。以下で考察するように、本発明者は、治療前と治療後との尿中ヒアルロニダーゼレベルの比較を用いて、治療効力をモニターすることができることも発見した。例えば、治療後に上昇した尿中ヒアルロニダーゼレベルは持続性Ｇ２又はＧ３膀胱腫瘍と後の時点での可能な再発とを示す。尿中ヒアルロニダーゼレベルは、最初の治療後のフォローアップ通院中のＧ２又はＧ３膀胱癌再発をモニターするためにも有用である。Ｇ２／Ｇ３腫瘍組織中のヒアルロニダーゼレベルは正常膀胱及びＧ１腫瘍組織中のヒアルロニダーゼレベルよりも高い（例えば、約６〜７倍）（Ｐ＜０．００１）ので、尿中ヒアルロニダーゼレベルの上昇は尿中への腫瘍関連(tumor-associated)ヒアルロニダーゼの分泌のためである。膀胱腫瘍関連ヒアルロニダーゼ活性は他のヒアルロニダーゼとは異なり、この活性は４．３の最適ｐＨを有し、Ｍｒ６５ｋＤ（ｐ６５）と５５ｋＤ（ｐ５５）の２種類のタンパク質に帰せられる。本発明の前に、ＨＡもＨＡアーゼも膀胱癌に関連づけられていず、これらは膀胱癌の検出又は評価に用いられていない。しかし、本発明の分析方法を利用すると、ＨＡとＨＡアーゼとを膀胱癌を検出し、その特定のグレードを評価するための非侵襲性試験に用いることができる。ＨＡ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ様分析は既に開示されている。例えば、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等（米国特許第５，３７８，６３７号）は、固体サポートをＨＡで被覆して、軟骨プロテオグリカン（任意の生物学的物質中でＨＡを結合することが知られる）と共にサンプルをインキュベートし、次に、サンプルを被覆固体サポートに暴露させることによって、生物学的サンプル中のＨＡを測定することができることを述べている。固体ＨＡサポートに結合した軟骨プロテオグリカン量を抗ケラチン硫酸反応性抗体によって測定する。同様な方法がＦｏｓａｎｇ等によってブタの喉頭軟骨プロテオグリカンを用いて述べられている（Ｍａｔｒｉｘ，１０：３０６〜３１３，１９９０）。この論文はビオチニル化プロテオグリカンＧ１ドメイン（ＨＡ結合領域）を用いるヒアルロナンのＥＬＩＳＡプレートに基づく分析法を述べている。ＥＬＩＳＡ様分析法はＳｔｅｒｎとＳｔｅｒｎによって述べられている（Ｍａｔｒｉｘ，１２：３９７〜４０３，１９９２）。この参考文献は、ビオチニル化ＨＡ結合タンパク質、マウス抗ケラチン硫酸抗体、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ及びアビジン−ビオチン検出系を用いるヒアルロニダーゼ測定を述ベている。同じ分析法を用いて、Ｓｔｅｒｎ等はＷｉｌｍｓ腫瘍患者の尿中ヒアルロニダーゼレベルを測定している（Ｓｔｅｒｎ等，「Ｗｉｌｍｓ腫瘍患者の尿中ヒアルロニダーゼレベル」，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．，８３：１５６９〜１５７４，１９９１）。他のヒアルロン酸測定方法はＣｈｉｃｈｉｂｕによって（米国特許第５，０１９，４９８号）及びＢｒａｎｄｔ等によって（米国特許第４，８２６，７７６号）述べられている。発明の概要本発明の方法は、尿中のＨＡとＨＡアーゼのレベルが膀胱癌を検出し、そのグレードを評価し、その治療の効力をモニターするための診断マーカーであるという発見に基づく。本発明によると、ＨＡ及びＨＡアーゼのレベルの測定はＥＬＩＳＡ様分析法であるので、技術的に簡単である。両方の分析は、充分に確立された方法を用いて多量に精製されることができるＨＡ結合性タンパク質のみを必要とするにすぎない（Ｔｅｎｇｂｌａｄ，「固定化ヒアルロネートに対するアフィニティクロマトグラフィーと、軟骨からのヒアルロネート結合タンパク質の単離へのその適用」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８：２８１〜２８９，１９７９）。両方の分析は簡単、非侵襲性で、しかも高感度かつ高特異的な試験法であり、膀胱癌の検出のために臨床的に適用可能である。ＨＡ測定（ＨＡ試験）のためのＥＬＩＳＡ様分析法は、腫瘍のグレードに関係なく、膀胱癌を検出する。ＨＡアーゼ測定（ＨＡアーゼ試験）のためのＥＬＩＳＡ様分析法は中グレード（Ｇ２）から高グレード（Ｇ３）までの膀胱腫瘍を選択的に検出する。尿中ヒアルロニダーゼ測定はＣＩＳ（転移前(pre-invasive)Ｇ３膀胱腫瘍）並びにＧ２，Ｔａ腫瘍を検出するので、本発明は患者にとって不良な予後で存在するＧ２及びＧ３膀胱腫瘍を早期に検出するための良好な非侵襲性方法である。したがって、本発明の１実施態様では、膀胱癌を有すると疑われる患者から回収された生物学的流体のサンプル（例えば、尿標本）中のＨＡを定量的に測定することによって膀胱癌を検査する。ＨＡの存在を検出し、測定するために、ラジオアッセイ、サンドイッチアッセイ、阻害分析等を含めた、任意の慣用的な分析方法論を用いることができる。しかし、競合的結合分析によってＨＡを測定することが好ましい。より好ましくは、本発明の分析はＥＬＩＳＡ試験法と同じやり方で機能するが、抗体錯体形成機構(antibody complexing mechanism)を利用しない。例えば、下記工程：（ａ）固体サポート（好ましくは、マイクロタイター孔）をＨＡで被覆する工程と；（ｂ）ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を被覆固体サポートと、膀胱癌を有すると疑われる患者から回収された生物学的流体のサンプル（例えば、尿サンプル）の存在下で、ＨＡＢＰが固体サポート上を被覆するＨＡ及びサンプル中のＨＡ（存在する場合には）と結合することが許されるような条件下で、接触させ、同サポートと共にインキュベートする工程と；（ｃ）固体サポート上を被覆するＨＡと結合したＨＡＢＰ量を測定し、それからサンプル中に存在するＨＡ量を算出する工程とを含む分析方法で膀胱癌を検出することができる。この実施態様では、被覆ＨＡとサンプル中に含有されるＨＡとがＨＡＢＰとの結合を“完成する”。ＨＡがサンプル中に存在する場合には、例えば基準との比較によって判定して、少ないＨＡＢＰが被覆ＨＡと結合する。換言すると、被覆ＨＡと結合するＨＡＢＰが殆ど無いことは、サンプル中にＨＡが存在することを意味し、これは膀胱癌を暗示する。固体サポート上を被覆するＨＡと結合したＨＡＢＰ量を測定し、それからサンプル中に存在するＨＡ量を算出するための好ましい方法は、結合ＨＡＢＰに関連した又は結合ＨＡＢＰによって生じるシグナルを検出することである。例えば、マイクロタイタープレート読み取り機(reader)を用いて、固体サポートに結合したビオチニル化ＨＡＢＰの間接的尺度として着色生成物（アビジン− 酵素コンジュゲートと標識基質(labeled substrate)とを用いて、着色生成物を形成する）の吸光度を測定することができる。ＨＡ被覆孔を緩衝剤のみと、ＨＡ又はＨＡ含有サンプルの不存在下でインキュベートすることによって最大吸光度を得ることができる。次に、ＨＡのｎｇ／ｍｌに対して吸光度をプロットすることによって、標準グラフを作成することができる。この標準グラフを用いて、サンプルの各希釈物中のＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を算出することができる。幾つかのこのような測定から各サンプル中の平均ＨＡ濃度を算出することができる。例えば、自動化分析又はタンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によってサンプルのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定することができる。ＨＡ濃度をタンパク質含量に標準化して、ｎｇ／ｍｇタンパク質として表現することができる。例えば、尿中ＨＡレベルを算出するための計算は次のようにおこなうことができる：Ａｘ希釈係数 ÷ ｍｇ／ｍｌ尿中タンパク質、式中、Ａは標準グラフから補外されたＨＡ濃度のｎｇ／ｍｌである。ＨＡレベルは最終的にｎｇ／ｍｇタンパク質として表現される。低い吸光度読み取り値(reading)は尿サンプル中のＨＡの有意な量を暗示し、これ自体は患者の膀胱癌を示唆する。一般に、サンプル中の約１００ｎｇ／ｍｇより多いＨＡの算出は患者における膀胱癌を示唆する。ＨＡを用いて膀胱癌を検出するためのこの方法の感度は約８８％以上であることができ（及び１００％程度に高いことも可能である）、特異性は約８７％以上であることができる（及び１００％程度に高いことも可能である）。本発明のために、特異性は偽陽性(false positive)の測定であると理解され、この場合に１００％の特異性は偽陽性が存在しないことを意味する（即ち、患者が膀胱癌を実際に有さない場合には、膀胱癌の存在を示唆しない）。本発明のために、感度は偽陰性(false negative)の測定であると理解され、この場合に１００％の感度は偽陰性が存在しないことを意味する（即ち、患者が膀胱癌を実際に有する場合に、膀胱癌が存在しないことを示唆しない）。本発明の他の実施態様では、膀胱癌を有すると疑われる患者から回収された生物学的流体のサンプル（例えば、尿標本）中のＨＡアーゼを定量的に測定することによって、膀胱癌を検査し、そのグレードを評価する。ＨＡに関すると同様に、ラジオアッセイ、サンドイッチアッセイ、阻害分析等を含めた、慣用的な分析方法論を用いて、ＨＡアーゼの存在を検出して、測定することができる。しかし、競合的結合分析によってＨＡアーゼを測定することが好ましい。より好ましくは、本発明の分析はＥＬＩＳＡ試験法と同じやり方で機能するが、抗体錯体形成機構を利用しない。例えば、下記工程：（ａ）固体サポート（好ましくは、マイクロタイター孔）をＨＡで被覆する工程と；（ｂ）膀胱癌を有すると疑われる人から回収された生物学的流体のサンプルを被覆固体サポートと、サンプル中に存在するＨＡアーゼ（存在する場合に）が固体サポートを被覆するＨＡを分解することを許されるような条件下で接触させ、同サポートと共にインキュベートする工程と；（ｃ）ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を被覆固体サポートと、ＨＡＢＰが固体サポート上を被覆する非分解ＨＡと結合することが許されるような条件下で、接触させ、同サポートと共にインキュベートする工程と；（ｄ）固体サポート上を被覆するＨＡと結合したＨＡＢＰ量を測定し、それからサンプル中に存在するＨＡ量を算出する工程とを含む分析方法で膀胱癌を検出することができる。この実施態様では、ＨＡアーゼがサンプル中に存在する場合に、ＨＡアーゼは被覆ＨＡを分解し、例えば基準との比較によって判定して、少ないＨＡＢＰを被覆ＨＡと結合させる。この場合に、被覆ＨＡに結合したＨＡＢＰの低い測定値は、中グレード又は高グレードの膀胱癌を示唆する。固体サポート上を被覆するＨＡと結合したＨＡＢＰ量を測定し、それからサンプル中に存在するＨＡアーゼ量を算出するための好ましい方法は、結合ＨＡＢＰに関連した又は結合ＨＡＢＰによって生じるシグナルを検出することである。例えば、マイクロタイタープレート読み取り機を用いて、固体サポートに結合したビオチニル化ＨＡＢＰの間接的尺度として着色生成物（アビジン−酵素コンジュゲートと標識基質とを用いて、着色生成物を形成する）の吸光度を測定することができる。ＨＡ被覆孔を緩衝剤のみと、ＨＡアーゼ又はＨＡアーゼ含有サンプルの不存在下でインキュベートすることによって最大吸光度を得ることができる。次に、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＨＡアーゼのｍＵ／ｍｌに対して吸光度をプロットすることによって、標準グラフを作成することができる。この標準グラフを用いて、サンプルの各希釈物中のＨＡアーゼ濃度（ｍＵ／ｍｌ）を算出することができる。幾つかのこのような測定から各サンプル中の平均ＨＡアーゼ濃度を算出することができる。例えば、自動化分析又はタンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によってサンプルのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定することができる。ＨＡアーゼ濃度をタンパク質含量に標準化して、ｍＵ／ｍｇタンパク質として表現することができる。尿中ＨＡアーゼレベルを算出するための計算は次のようにおこなうことができる：Ａｘ希釈係数 ÷ ｍｇ／ｍｌ尿中タンパク質、式中、Ａは標準グラフから補外されたＨＡアーゼ濃度のｍＵ／ｍｌである。ＨＡアーゼレベルは最終的にｍＵ／ｍｇ総タンパク質として表現される。低い吸光度読み取り値は尿サンプル中に存在する多量のＨＡアーゼを暗示し、これ自体は患者の中グレード又は高グレード膀胱癌を示唆する。一般に、約１０ｍＵ／ｍｇより多いＨＡアーゼの算出は患者における中グレード又は高グレード膀胱癌を示唆する。中グレードから高グレードまでの膀胱癌を検出するためのこの方法の感度は約８５％以上であることができ（及び１００％程度に高いことも可能である）、特異性は約８８％以上であることができる（及び１００％程度に高いことも可能である）。低グレード膀胱癌を検出するためには、ＨＡ試験とＨＡアーゼ試験の組合せを用いることができる。約１０ｍＵ／ｍｇ未満のＨＡアーゼの算出（被覆ＨＡに結合した多量のＨＡＢＰに対応）は低グレード膀胱癌又は膀胱癌が全く存在しないことを示唆する。ＨＡアーゼ分析を用いる、本発明のこの実施態様は、低グレード膀胱癌の存在と膀胱癌が全く存在しないこととを区別しない。したがって、ＨＡ分析は低グレード膀胱腫瘍の存在さえも検出することができるが、特定のグレードを区別しないので、ＨＡアーゼ分析と共にＨＡ分析を用いて、患者を検査することが好ましい。したがって、低グレード膀胱腫瘍を検出し、診断するためには、ＨＡ分析とＨＡアーゼ分析の両方を実施するべきである。ＨＡ分析は陽性結果（即ち、約１００ｍｇ／ｍｇを越えるＨＡレベル、腫瘍の存在を示す）を与えると考えられるが、ＨＡアーゼ分析は陰性の結果（即ち、約１０ｍＵ／ｍｇ未満のＨＡアーゼレベルは、中グレード腫瘍も高グレード腫瘍も存在しないことを示す）を生じると考えられる。他の実施態様では、本発明は膀胱癌を検査し、評価するための診断キットに関する。このキットはＨＡ及び／又はＨＡアーゼ、ＨＡＢＰとマーカー、又はマーカーにコンジュゲートしたＨＡＢＰ、並びに生物学的サンプル中のＨＡ及び／又はＨＡアーゼの存在の検出に用いるために適した補助試薬を含む。本発明によって考えられる診断キットの例は慣用的なディップスティック試験デバイスである。本発明の上記及び他の実施態様は以下でさらに詳細に説明する。図面の簡単な説明図１：手術前と手術後の尿中ＨＡレベルを測定することによる、膀胱癌の治療効力の評価。尿中ＨＡレベルはｎｇ／ｍｇタンパク質（平均値±ＳＥＭ）として表現する。ＲＣ：根治的膀胱切除；ＰＣ：膀胱部分切除；ＴＵＲＢＴ：膀胱腫瘍の経尿道的切除；ＩＣ：膀胱内化学療法。ＲＣ後に、患者Ｎｏ．２とＮｏ．９は、それぞれ、新しい膀胱と回腸導管を受容した。回腸導管と新しい膀胱とを作製するために用いた腸粘膜が、腸粘膜はＨＡを含むグリコサミノグリカンを多く含有するので、この増加を生じたと考えられる。しかし、これらの２患者のＨＡアーゼレベルは〜５分の１の低下を示した（図２：患者Ｎｏ．１と７を参照）。それ故、２方法の組合せが治療効力をモニターするためにより大きく有用である。図２：手術前と手術後の尿中ＨＡアーゼレベルを測定することによる、高グレード膀胱癌の治療効力の評価。尿中ＨＡアーゼレベルはｍＵ／ｍｇタンパク質（平均値±ＳＥＭ）として表現する。用いる略号は図１の記号一覧に記載したものと同じである。図３：ＨＡＥＬＩＳＡ様分析の典型的な標準グラフの例。グラフの直線状範囲の吸光度の読み取り値を生じる尿標本の希釈度を計算のために選択する。標準グラフの作成に用いたＨＡはヒト臍帯からのものである。図４：ＨＡアーゼＥＬＩＳＡ様分析の典型的な標準グラフの例。グラフの直線状範囲の吸光度の読み取り値を生じる尿標本の希釈度を計算のために選択する。標準グラフの作成に用いたＨＡアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種からのものである。図５ＡとＢ：ＥＬＩＳＡ様分析による尿中ＨＡレベルの測定。異なる個人群からの尿中ＨＡレベルを以下の実施例２に述べるように測定した。Ａ：個人のＨＡレベルの散布図。各カテゴリーにおいて、小点は各個人の尿中ＨＡレベルを表し、“ｎ”は試験した個人数を表し、ＧＵは例えばＢＰＨ（ｎ＝８）、前立腺癌（ｎ＝７）、腎結石（ｎ＝５）、膀胱炎（ｎ＝１２）、尿路感染症（ｎ＝８）、前立腺炎（ｎ＝２）、副睾丸炎（ｎ＝１）及び腎臓外傷（ｎ＝２のような尿生殖器症状を有する患者のカテゴリーを表す。Ｇ３カテゴリーはＧ３腫瘍（ステージＴ１〜Ｔ４）を有する３４人の患者と、９人のＣＩＳ患者とを含む。ダッシュ線は１００ｎｇ／ｍｇのＨＡ濃度の最低カットオフ限界を表す。Ｂ：種々なカテゴリー間の平均尿中ＨＡレベルの比較。これらの平均レベルは “Ａ”に表示した個人のＨＡレベルから算出したものである。結果は平均ＨＡレベルｎｇ／ｍｇタンパク質±ＳＥＭを表す。図６ＡとＢ：膀胱組織抽出物中のＨＡレベルの測定。組織抽出物中のＨＡ濃度は以下の実施例２に述べるようにＥＬＩＳＡ様分析によって測定した。Ａ：個人のＨＡレベルの散布図。本明細書において、Ｇ１腫瘍とＧ２＋Ｇ３腫瘍は、それぞれ、低グレードＴＣＣと高グレードＴＣＣと呼ばれる。Ｂ：正常膀胱とＴＣＣ組織抽出物のＨＡ濃度（平均値±ＳＥＭ）。図７：正常個人と膀胱癌患者の尿中ＨＡプロフィルの検査。正常個人（ｎ＝４）と低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍、ｎ＝４）又は高グレードＴＣＣ（ｎ＝５、Ｇ２、ｎ＝２とＧ３、ｎ＝５）を有する患者の尿中に存在するＨＡ種のサイズを、以下の実施例２で述べるように、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＣＬ−Ｂカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって測定した。カラムを高分子量ＨＡ（Ｍｒ２ｘ１０⁶ ダルトン）とＨＡフラグメント、Ｆ１（１０〜１５二糖単位）、Ｆ２（２〜３二糖単位）及びＦ３（〜２二糖単位）を用いて標準化した。Ｉ〜Ｖは高グレードＴＣＣ患者の尿中に存在するＨＡピークを表す。図８ＡとＢ：ＨＭＶＥＣ−Ｌ有糸分裂誘発反応(mitogenic response)に対するＨＡ及びＨＡフラグメントの影響。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞をＨＡ及びＨＡフラグメントと共に“内皮細胞基礎培地”中で３７℃において１８時間インキュベートした後に、以下の実施例２に述べるように、［³Ｈ］−チミジンと共に２時間インキュベートした。Ａ：ＨＭＶＥＣ−Ｌ有糸分裂誘発反応に対するｉｎｖｉｔｒｏで生じたＨＡ又はＨＡフラグメントの影響。対照は添加ＨＡ又はＨＡフラグメントの不存在下でのＤＮＡ中の［³Ｈ］−チミジンの取り込みを表す。対照サンプル中に取り込まれた［³Ｈ］−チミジン（ｄｐｍ１０３１±８７）を１００％と指定する。結果は３通りの測定の平均値である。Ｂ：ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の有糸分裂誘発反応に対する高グレードＴＣＣ患者の尿（図７）から単離されたＨＡ及びＨＡフラグメントの影響（ピークＩ〜Ｖ）。種々なピーク中に存在するＨＡの単一濃度（２μｇ／ｍｌ）を用いて、有糸分裂誘発反応を検査した。対照は添加ＨＡの不存在下での［³Ｈ］−チミジンの取り込みを表す。対照サンプル中に取り込まれた、ｄｐｍ８３８±４９を１００％と指定する。結果は３通りの測定の平均値±ｓ．ｄ．である。図９：基質（ＨＡ）−ゲル分析による尿中ヒアルロニダーゼ活性の検出。尿標本（〜２０μｇタンパク質）を非変性条件下で７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質（ＨＡ）−ゲル上で電気泳動させた。電気泳動後に、以下の実施例３に述べるように、ゲルを分析緩衝剤(assay buffer)中でインキュベートさせ、ＨＡ消化させ、染色し、脱色させた。レーン１と２：別々の正常対象；レーン３と４：Ｇ１腫瘍を有する個別の患者；レーン５と６：Ｇ３腫瘍を有する個別の患者。図１０ＡとＢ：ＥＬＩＳＡ様分析による尿中ヒアルロニダーゼ活性の定量測定。ヒアルロニダーゼ活性は以下の実施例３に述べるように測定した。Ａ：個人のヒアルロニダーゼ活性の散布図。各カテゴリーにおいて、小点は各個人の尿中ヒアルロニダーゼ活性を表し、“ｎ”は試験した個人数を表す。ＧＵ：このカテゴリーは例えば進行した前立腺癌（ｎ＝１０）、ＢＰＨ（ｎ＝８）、腎結石（ｎ＝５）、膀胱炎（ｎ＝１２）、尿路感染症（ｎ＝８）、前立腺炎（ｎ＝２）、副睾丸炎（ｎ＝１）及び腎臓外傷（ｎ＝２）のような尿生殖器症状を有する患者を包含する。Ｇ３：このカテゴリーはＧ３腫瘍（ｎ＝３４、ステージＴ１〜Ｔ４）及びＣＩＳ（ｎ＝６）を有する患者を含む。Ｂ：種々なカテゴリー間の平均ヒアルロニダーゼ活性の比較。この平均活性は “Ａ”に表示した個人のヒアルロニダーゼ活性から算出した。結果は平均ヒアルロニダーゼ活性ｍＵ／ｍｇタンパク質±ＳＥＭを表す。図１１ＡとＢ：膀胱組織抽出物中のヒアルロニダーゼ活性の測定。組織抽出物中のヒアルロニダーゼ活性を以下の実施例３に述べるようなＥＬＩＳＡ様分析によって測定した。Ａ：個人のヒアルロニダーゼ活性の散布図。Ｂ：正常組織抽出物と膀胱ＴＣＣ組織抽出物とのヒアルロニダーゼ活性（平均値±ＳＥＭ）。図１２：膀胱腫瘍関連ヒアルロニダーゼのｐＨ活性プロフィルの測定。高グレード膀胱腫瘍を有する患者から得られた、尿標本と腫瘍組織抽出物とを異なるｐＨにおいてＨＡ被覆孔上でインキュベートした。インキュベーション後に、孔上に残留するＨＡを以下の実施例３に述べるように見積もった。結果は以下の実施例３に述べるように算出する。図１３Ａ、Ｂ及びＣ：膀胱腫瘍誘導ヒアルロニダーゼの、基質（ＨＡ）ＳＤＳ −ＰＡＧＥによる分子量算出。Ａ：尿標本の基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。尿標本（〜４０μｇタンパク質）を、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で、ＢｉｏＲａｄ広範囲予備染色済み(prestained)分子量マーカーと共に分離させた。電気泳動後に、ゲルを以下の実施例３に述べるように処理した。レーン１：Ｇ１腫瘍を有する患者からの尿標本；レーン２：Ｇ２腫瘍を有する患者からの尿標本；レーン３：Ｇ３腫瘍を有する患者からの尿標本；レーン４：正常な個人からの尿標本。Ｂ：総尿タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｇ３腫瘍を有する患者からの尿標本（〜２０μｇタンパク質）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＢｉｏＲａｄ予備染色済み広範囲分子量マーカーと共に分離させた。電気泳動後に、ゲルを銀染色した。Ｃ：組織抽出物の基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｇ３腫瘍膀胱組織標本と正常膀胱組織標本とから調製した抽出物（４０μｇタンパク質）を、１２％基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ＢｉｏＲａｄ予備染色済み広範囲分子量マーカーと共に分離させた。電気泳動後に、ゲルを以下の実施例３に述べるように処理した。左レーン：Ｇ３腫瘍組織抽出物；右レーン：正常膀胱組織抽出物。本発明の詳細な説明本発明の前に、膀胱癌を検出し、そのグレードを評価するための非侵襲性、高選択性かつ高特異性の方法は知られていない。尿中ＨＡレベルを膀胱癌検出をおこなうためのマーカーとして用いることができること、及び尿中ヒアルロニダーゼレベルが膀胱腫瘍のグレードの診断インジケーターであることは、今までに知られていない。尿中のＨＡレベルとヒアルロニダーゼレベルとが共に侵潤性(inv asive)癌腫の検出の診断に役立ちうることは今までに示唆されていない。さらに、ビオチニル化ＨＡ結合タンパク質の使用（但し、抗体を用いない）と以下に述べるような特異的方法とを述べるＥＬＩＳＡ様分析は、尿中ＨＡレベルとヒアルロニダーゼレベルとを測定するために今までに用いられていない。ヒアルロン酸（ＨＡ）測定（ＨＡ試験）以下の実施例に示すように、本発明のＨＡ分析は、約１００ｎｇ／ｍｇにおいて、膀胱腫瘍を検出するために約８８％以上（１００％程度に高い可能性もあるが）の感度と、約８７％以上の特異性（１００％程度に高い可能性もあるが）を示す。これは、膀胱癌を検出するための現在公知の方法を越えた利点と改良を表す。当然、当業者によって理解されるように、ＨＡ濃度のカットオフ限界は変化する可能性があり、集団の広がり(population spread)を考慮しなければならない。膀胱癌状態の適当な判定に到達するためのＨＡ濃度のカットオフ限界を設定することは、例えば年齢、飲食物(diet)、サンプル中のタンパク質の濃度、環境影響、遺伝的背景、水分補給状態(hydration status)、病歴(medical history)、身体的状態、性別、体重等のようなファクターを考慮することを含む。ＨＡ分析を用いて低グレード及び低ステージ膀胱腫瘍（即ち、Ｇ１及びＴａ腫瘍）をも検出する能力は、本発明のこの実施態様のもう一つの重要な特徴を表す。上述した３種類の公知の非侵襲性尿試験−−即ち、血尿家庭スクリーニング試験、ＢａｒｄＢＴＡ試験及びＮＭＰ２２試験−−は、これらの腫瘍を高感度で検出しない。このような腫瘍はまた、臨床発現が無いために長期間検出されないで進行する。しかし、以下で考察するように、尿中ＨＡレベルは低グレードで低ステージの腫瘍（８８〜９０％）をも、高グレードで高ステージ腫瘍（８８〜９６％）と同様に、同じ高い感度で検出する。上述したように、生物学的流体サンプル中のＨＡレベルを測定することができるかぎり、任意の慣用的分析系を本発明によって膀胱癌の検出に用いることができる。ＨＡとＨＡアーゼの両方の本発明の分析は、尿に限定されず、例えば血液、血清、血漿、腹水(ascitic fluid)、腹腔浸出液(peritoneal fluid)、胆汁、精液及び脳脊髄液のような生物学的流体の試験にも適用することができる。ＨＡ分析の好ましい実施態様では、本発明の方法は固相の表面にＨＡを吸着させることによって開始する。ＨＡは例えばヒトの臍帯のような便利な供給源から得ることができる。固相はニトロセルロース等を含めた、任意の慣用的な固相であることができるが、好ましくはマイクロタイター孔である。ＨＡを固相に吸着させた後に、固相の表面を好ましくは慣用的な緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄する。固相はその表面上に、ＨＡ又は他の分子と結合する(coupling)ことができる部位をまだ残しているので、サンプルを添加する前に、ＨＡがまだ吸着されていない固相の部分をカバーするようにブロッキング物質(blocking substance)を加えることが好ましい。適当なブロッキング物質の例はウシ又は他の動物から得られるγ−グロブリン及びアルブミンを包含する。ウシの血清アルブミンが好ましい。固相の遊離部位をブロックした後に、固相の表面を慣用的な緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄することが好ましい。次に、ＨＡが問題の分析物であるので、膀胱癌を有すると疑われるヒトから回収された生物学的流体のサンプルの存在下で、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を被覆固体サポートに加えて、ＨＡＢＰが固体サポートを被覆するＨＡと尿中ＨＡ（存在する場合に）に結合することが許されるような条件下でインキュベートする。インキュベーション時間と条件は広い範囲内で変化することができるが、約４時間〜約１６時間のインキュベーション時間と約４℃〜約３７℃のインキュベーション温度とで充分である。これより長い又は短いインキュベーション時間とこれより高い又は低いインキュベーション温度も、当業者によって理解されるように、可能である。本発明の分析に用いるために適したＨＡＢＰは、例えばウシの鼻軟骨（Ｔｅｎｇｂｌａｄ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８：２８１〜２８９，１９７９）、ブタ喉頭軟骨（Ｆｏｓａｎｇ等，Ｍａｔｒｉｘ，１０：３０６〜３１３，１９９０）のような、多くの供給源から容易に精製することができる。ＨＡＢＰが被覆ＨＡ及び／又はサンプルＨＡに結合した後に、固相表面を慣用的な緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄することが好ましい。次に、固体サポートを被覆するＨＡに結合したＨＡＢＰ量を測定する。好ましくは、ＨＡＢＰをビオチニル化し、結合したＨＡＢＰをアビジン−酵素コンジュゲート及び、着色生成物を形成する酵素の基質とのインキュベーション後に可視化する。このような検出系はラベルとして放射能を用いず、多重マーカー（即ち、酵素分子）を固体サポートに結合したＨＡＢＰ毎に固定して、シグナル（即ち、着色生成物）を酵素のターンオーバー(turnover)を介して増幅させる。しかし、慣用的なマーカー系をＨＡＢＰと共に用いることができる。適当なマーカー系の例は酵素、蛍光、化学発光、酵素−基質、アイソトープマーカー、放射性ラベル等を包含する。好ましくは、固体サポートを被覆するＨＡに結合したＨＡＢＰ量の測定をアビジン−ビオチン検出系を介しておこなう。他の有用なマーカー系はケラチン硫酸とケラチン硫酸−反応性抗体とを用いる。尿中ＨＡレベルをマイクロタイタープレ−ト読み取り機を用いて有効に測定して、標準グラフから補外することができる。次に、被覆ＨＡと結合したＨＡＢＰ量を、生物学的流体のサンプルを回収された患者の膀胱癌の存在と相関させることができる。ＨＡ分析に関して、精製ヒアルロン酸を基準として用いることが好ましい。ヒアルロニダーゼ（ＨＡアーゼ）測定（ＨＡアーゼ試験）本発明では、ＨＡアーゼが問題の分析である場合に、ＨＡ分析に関して上述したやり方と同じやり方で、ＨＡを固相の表面に吸着させる。生物学的流体サンプル中のＨＡアーゼレベルを測定することができるかぎり、任意の慣用的分析系を本発明によって膀胱癌の検出に用いることができる。固相上にＨＡを吸着させた後に、固相の表面を好ましくは慣用的な緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄する。次に、膀胱癌を有すると疑われる人から回収した生物学的流体（例えば、尿）のサンプルを被覆固体サポートに加えて、サンプル中に存在するＨＡアーゼ（存在する場合に）が固体サポートを被覆するＨＡを分解することが許されるような条件下でインキュベートする。インキュベーション後に、分解したＨＡを慣用的緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄することによって除去することが好ましい。次に、ＨＡＢＰを添加する前に、ＨＡ分析に関して上述したように、ＨＡが吸着されていない固相の部分をカバーするように、ブロッキング物質（例えば、血清アルブミン）を加えることが好ましい。固相の遊離部位をブロッキングした後に、固相の表面を慣用的緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄することが好ましい。次に、ＨＡＢＰが固相上を被覆する非分解ＨＡと結合することが許されるような条件下で、固相をＨＡＢＰに暴露させる。ＨＡ分析に関すると同様に、インキュベーション時間と条件は広い範囲内で変化することができるが、約３０分間〜約１時間のインキュベーション時間と約３７℃のインキュベーション温度とで充分である。これより長い又は短いインキュベーション時間とこれより高い又は低いインキュベーション温度も、当業者によって理解されるように、可能である。ＨＡＢＰが被覆ＨＡと結合した後に、固相の表面を慣用的緩衝剤（単数又は複数種類）を用いて洗浄することが好ましい。次に、固体サポート上を被覆するＨＡに結合したＨＡＢＰ量を測定する。好ましくは、ＨＡＢＰをビオチニル化し、結合したＨＡＢＰをアビジン−酵素コンジュゲート及び、着色生成物を形成する酵素の基質とのインキュベーション後に可視化する。このような検出系はラベルとして放射能を用いず、多重マーカー（即ち、酵素分子）を固体サポートに結合したＨＡＢＰ毎に固定して、シグナル（即ち、着色生成物）を酵素のターンオーバー(turnover)を介して増幅させる。しかし、慣用的なマーカー系をＨＡＢＰと共に用いることができる。適当なマーカー系の例は酵素、蛍光、化学発光、酵素−基質、アイソトープマーカー、放射性ラベル等を包含する。好ましくは、固体サポート上を被覆するＨＡに結合したＨＡＢＰ量の測定をアビジン−ビオチン検出系を介しておこなう。他の有用なマーカー系はケラチン硫酸とケラチン硫酸−反応性抗体とを用いる。尿中ＨＡレベルをマイクロタイタープレート読み取り機を用いて有効に測定して、標準グラフから補外することができる。次に、被覆ＨＡと結合したＨＡＢＰ量を、生物学的流体のサンプルを回収された患者の膀胱癌の存在及び癌のグレードと相関させることができる。約１０ｍＵ／ｍｇより多い算出は中グレード又は高グレード膀胱癌を示唆する。当然、当業者によって理解されるように、ＨＡアーゼ濃度のカットオフ限界は変化する可能性があり、集団の広がりを考慮しなければならない。膀胱癌状態の適当な判定に達するためのＨＡアーゼ濃度のカットオフ限界の設定は、例えば年齢、飲食物、環境影響、水分補給、身体的状態、性別、体重等のようなファクターを考慮することを含みうる。ＨＡアーゼ分析に関して、精製ヒアルロニダーゼが基準として好ましく用いられる。以下で実施例において述べるように、中グレード〜高グレードＴＣＣを検出するためのＨＡアーゼ法の感度は約８５％以上（１００％程度に高い可能性もあるが）であり、特異性は約８８％以上（１００％程度に高い可能性もあるが）である。したがって、本発明のＨＡアーゼ分析は中グレード及び高グレード膀胱腫瘍の検出とそれらのグレードの評価との両方に有用である。本発明のＨＡ分析とＨＡアーゼ分析は別々に、又は好ましくは相互と組み合わせて用いることができる。ＨＡアーゼのみでは低グレード膀胱癌（即ち、約１０ｍＵ／ｍｇ未満の算出）を有効に検出及び／又は評価しない。しかし、上述したように、患者の生物学的流体サンプルを試験するためにＨＡ分析とＨＡアーゼ分析の両方を用いる場合には、低グレード膀胱癌を検出することができる。予備の安定性研究は、ＨＡとＨＡアーゼの両方が室温におけるインキュベーション後に＞８時間（約１６時間まで）安定であることを示す。発明者はスポット尿標本を分析して、その結果、例えば最初の朝の排尿(void)のような特定の条件が必要でないことが確認されている。本発明の試験はサンプル中のＨＡ（ｎｇ／ｍｌ）レベル及びＨＡアーゼ（ｍＵ／ｍｌ）レベルのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対する標準化を含むので、患者の水分補給状態は結果に影響を与えない。総クレアチニンに対するのではなく総タンパク質に対する標準化は、血尿、膀胱癌患者に一般に見られる症状によってあまり影響されないので、好ましい。上記使用の他に、本発明のＨＡ及びＨＡアーゼの分析は無数の用途を有する。例えば、上述したように、本発明は膀胱癌を検出して、そのグレードを評価するための個人のスクリーニング方法をカバーする。これはとりわけ高い危険状態にある人々（例えば、喫煙者と、ペイント、染料及び皮革工業の労働者）の膀胱癌の発現を早期に検出するために特に有用である。本発明はまた、膀胱癌に対する治療効力を評価する方法（即ち、治療前と治療後の患者を検査することによって）をも考慮する。同様に、本発明は、腫瘍再発をモニターするための膀胱癌患者の長期間フォローアップ方法として有用である。さらに、本発明の分析は、腫瘍が尿と接触する、あらゆる他の泌尿器悪性腫瘍（即ち、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、前立腺腫瘍、腎臓癌、尿管癌、尿道癌、腎臓−骨盤(r enal-pelvic)癌等）をスクリーニングし、治療効力を評価し、フォローアップするために有用である。これらの分析は、腫瘍中に注入されて(squirted)ＨＡ及びＨＡアーゼを可溶化することができる、任意の体液又は通常の生理的食塩水と腫瘍が接触する場合に、他の腫瘍をスクリーニングするのに有用である。この場合に、ＨＡ及び／又はＨＡアーゼを分析することができる。本発明は、膀胱癌及び／又は他の泌尿器癌を検出し、それらのグレードを評価するためにＨＡ及び／又はＨＡアーゼを用いるディップスティック検査用途を考慮する。例えば、慣用的な方法論を利用して、ディップスティック形状の固相を用いて、上述したように、ＨＡ又はＨＡアーゼを分析することができる。例えば、当業者が気づくであろうように、ディックスティックをＨＡで被覆するか又はディップスティックにＨＡを含浸させることができる。当然、このディックスティックを用いて、非限定的に尿を含めた、任意の生物学的流体を検査することができる。本明細書に引用された全ての本、論文及び特許はそれらの全体において本明細書に援用される。特に、本発明は１９９６年２月１日出願の米国仮出願第６０／０１０，９７６号に開示されたものであり、この仮出願の全内容は本明細書に援用される。下記実施例と比較例によって本発明をさらに詳述する。しかし、これらは本明細書の範囲と請求の範囲とを限定することを意図しない。実施例実施例１．ＨＡ及びＨＡアーゼの初期研究ＴＣＣ患者、他のＧＵ症状(conditions)を有する患者及び正常な個人の間で、尿中ＨＡレベルとＨＡアーゼレベルを比較した。治療効力を判定するためのＨＡレベルとＨＡアーゼレベル測定の有用性をも評価した。ビオチニル化ウシ鼻軟骨のＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）の使用を含む２種類の非常に類似したＥＬＩＳＡ様分析を用いて、尿中ＨＡレベルとＨＡアーゼレベルを測定した。尿中ＨＡレベルとＨＡアーゼレベルを尿中タンパク質レベルに標準化して、それぞれ、ｎｇ／ｍｇタンパク質及びｍＵ／ｍｇタンパク質として表現する。既知分析（例えば、Ｓｔｅｒｎ等）とは異なって、この分析では、尿中ＨＡレベルとＨＡアーゼレベルが尿中タンパク質濃度に標準化されて、尿中ＨＡ／ＨＡアーゼレベルと膀胱癌／中グレード〜高グレード膀胱癌との間の相関関係に影響を与える重要なファクターである、患者の水分補給状態に関して修正される。この理由は、水分補給状態が尿中の化学物質レベル(chemical level)に影響を与えることが知られているからである。したがって、クレアチニンにではなくタンパク質に尿中ＨＡ／ＨＡアーゼを標準化することは、膀胱癌の一般的な所見(findi ng)である血尿（尿中の血液）によってタンパク質の方が影響されることが少ないので、好ましいと考えられた。標本回収：排尿された尿サンプル（清浄−キャッチ）を全ての対象(subject)から採取して、分析するまで−２０℃に保存した。分析時に、サンプルを解凍して、４℃において１０分間２，０００ｒｐｍで遠心分離して、沈降物を除去した。尿中ＨＡ測定のための分析：９６孔マイクロタイターの孔（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ９．２）中に溶解したヒト臍帯ＨＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；２５μｇ／ｍｌ）で被覆した。この被覆は４℃において〜１６時間（一晩）おこなった。（この反応は３７℃における４時間でも全く上首尾におこなわれた）。ＨＡ被覆孔をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した。これらの孔を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ）中に調製された１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中で３７℃において１時間インキュベートすることによって、孔の非特異的部位をブロックした。インキュベーション後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄してから、ビオチニル化ウシ鼻軟骨ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ；１μｇ／ｍｌ）と数種類の濃度の尿標本（０．５〜１０μｌ）又はヒト臍帯ＨＡ（０．１〜６０ｎｇ／ｍｌ）とを含有するＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２００μｌ（最終量）（当業者によって理解されるように、異なる量も使用可能であるが）と共に室温において１６時間（一晩）インキュベートした。ＨＡＢＰをＴｅｎｇｂｌａｄによって述べられた方法（Ｔｅｎｇｂｌａｄ，「固定ヒアルロネート上でのアフィニティクロマトグラフィーと、軟骨からヒアルロネート結合タンパク質を単離するためのその応用」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８：２８１〜２８９，１９７９）に従って精製した。ＨＡＢＰと共にインキュベーションした後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄してから、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と、ＥｌｉｔｅＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣｋｉｔ^TM（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）からの試薬ＡとＢと共に（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１０ｍｌにつき４滴の試薬ＡとＢ）、製造者の指示に従って、室温（〜２３℃）において３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、製造者の指示にしたがって、１０ｍｌの蒸留水中で各４滴の緩衝剤（ｐＨ５．３）とＡＢＴＳと過酸化水素溶液とを混合することによって調製された、ＡＢＴＳ（２，２’アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６− スルホン酸）基質（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）溶液と共にインキュベートした。マイクロタイタープレートを室温において暗所で色（緑色）が発色するまでインキュベートした。着色生成物の吸光度を４０５ｎｍにおいてマイクロタイタープレート読み取り機を用いて測定した。各分析において、ＨＡ被覆孔をＨＡ又はＨＡ含有尿標本の不存在下で緩衝剤のみと共にインキュベートすることによって、最大吸光度（Ａ_max ）_405nm を得た。非被覆孔上でＨＡをインキュベートすることによって（Ａ_min ）_405nm を得た。分析に用いたＨＡ（ｎｇ／ｍｌ）の既知濃度に対して吸光度（４０５ｎｍ）をプロットすることによって、標準グラフを作成した。このＥＬＩＳＡ様分析の標準グラフの例を図３に示す。この標準グラフを用いて、尿標本の各希釈度のＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を算出した。幾つかのこのような測定から、各標本の平均ＨＡ濃度を測定した。自動化分析又はタンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって、尿中タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。ＨＡ濃度をタンパク質含量に標準化して、ｎｇ／ｍｇタンパク質として表現した。尿中ＨＡレベルを測定するための計算は次のようにおこなった：Ａｘ希釈係数÷ｍｇ／ｍｌ尿中タンパク質、式中、Ａは標準グラフから補外されたＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。ヒト臍帯ＨＡを用いて得られた標準グラフの例を図３に示す。尿中ＨＡ測定：全体で１３９人の患者において尿中ＨＡレベルを測定した。これらは正常個人（ｎ＝２５）、ＧＵ症状（例えば、膀胱炎、腎結石、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、尿路感染症、前立腺炎、腎臓外傷；ｎ＝４０）を有する患者、及び膀胱ＴＣＣ患者（ｎ＝７４；Ｇ１，ｎ＝１７；Ｇ２，ｎ＝１４；Ｇ３＋ＣＩＳ，ｎ＝４３）を包含した。表１に示すように、全てのＴＣＣ患者の平均尿中ＨＡレベルは正常個人及び種々なＧＵ症状を有する患者における平均尿中ＨＡレベルよりも４〜７倍高い（Ｐ＜０．００１）。低グレード及び低ステージ（Ｇ１、Ｔａ）膀胱腫瘍を有する患者においても尿中ＨＡレベルが統計的に有意に上昇することに注目することは重要である。治療効力をモニターするための尿中ＨＡレベル測定の有用性を評価するために、１４人の患者において治療前と治療後の尿中ＨＡレベルを測定した。治療後レベルは治療後１〜３週間に測定した。図１に示すように、手術前に上昇したＨＡレベルは治療後の患者の大部分において低下を示し、このことは尿中ＨＡレベル測定が治療効力のモニターにおいても有用であることを示唆する。表１：ＥＬＩＳＡ様分析による種々な個人群における尿中ＨＡレベルの測定。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、“ｎ”は各カテゴリーにおける個人数を表す。尿中ＨＡアーゼ測定のための分析：９６孔マイクロタイターの孔（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ９．２）中に溶解したヒト臍帯ＨＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；２００μｇ／ｍｌ）で被覆した。この被覆は４℃において〜１６時間（一晩）おこなった。（この反応は３７℃における４時間でも全く上首尾におこなわれた）。ＨＡ被覆孔をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、数種類の濃度の尿標本（０．５〜１０μｌ）又は、ＨＡアーゼ−ＥＬＩＳＡ緩衝剤（０．１Ｍギ酸ナトリウム、０．１〜０．１５ＭＮａＣｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ４．３）１００μｌ（当業者によって理解されるように、異なる量を用いることもできるが）中の精製Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓヒアルロニダーゼ（０．０２〜４０ｍＵ／ｍｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に、３７℃において〜１６時間（一晩）インキュベートした。インキュベーション後に、孔をＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有する溶液（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ）中で洗浄することによって、孔上の分解したＨＡを除去した。孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中に調製された１％ＢＳＡ溶液中で３７℃ において１時間インキュベートすることによって、孔上の非特異的部位をブロックした。インキュベーション後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄し、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎと、０．１％ＢＳＡと、５μｇ／ｍｌのビオチニル化ウシ鼻軟骨ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）とを含有する溶液中で、３７℃において１時間インキュベートした。ＨＡＢＰを、Ｔｅｎｇｂｌａｄによって述べられた方法（Ｔｅｎｇｂｌａｄ，「固定ヒアルロネート上でのアフィニティクロマトグラフィーと、軟骨からヒアルロネート結合タンパク質を単離するためのその応用」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８：２８１〜２８９，１９７９）に従って精製した。ＨＡＢＰと共にインキュベーションした後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄してから、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と、ＥｌｉｔｅＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣｋｉｔ^TM（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）からの試薬ＡとＢと共に（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１０ｍｌにつき４滴の試薬ＡとＢ）、製造者の指示に従って、室温（〜２３℃）において３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｎｎ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、製造者の指示にしたがって、１０ｍｌの蒸留水中で各４滴の緩衝剤（ｐＨ５．３）とＡＢＴＳと過酸化水素溶液とを混合することによって調製された、ＡＢＴＳ（２，２’アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６− スルホン酸）基質（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）溶液と共にインキュベートした。マイクロタイタープレートを室温において暗所で色（緑色）が発色するまでインキュベートした。着色生成物の吸光度を４０５ｎｍにおいてマイクロタイタープレート読み取り機で測定した。各分析において、ＨＡ被覆孔をＨＡアーゼ又はＨＡアーゼ含有尿標本の不存在下で緩衝剤のみと共にインキュベートすることによって、最大吸光度（Ａ_max ）_405nm を得た。非被覆孔上でＨＡアーゼをインキュベートすることによって（Ａ_min ）_405nm を得た。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＨＡアーゼ（ｍＵ／ｍｌ）の既知濃度に対して吸光度（４０５ｎｍ）をプロットすることによって、標準グラフを作成した。このＥＬＩＳＡ様分析の標準グラフの例を図４に示す。この標準グラフを用いて、尿標本の各希釈度のＨＡアーゼ濃度（ｍＵ／ｍｌ）を算出した。幾つかのこのような測定から、各尿標本の平均ＨＡアーゼ濃度を測定した。自動化分析又はタンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって、尿中タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。ＨＡアーゼ濃度をタンパク質含量に標準化して、ｍＵ／ｍｇタンパク質として表現した。尿中ＨＡアーゼレベルを測定するための計算は次のようにおこなった：Ａｘ希釈係数÷ｍｇ／ｍｌ尿中タンパク質、式中、Ａは標準グラフから補外されたＨＡアーゼ濃度（ｍＵ／ｍｌ）である。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＨＡアーゼを用いて得られた標準グラフの例を図４に示す。尿中ＨＡアーゼ測定：全体で１３１人の患者において尿中ＨＡレベルを検査した。これらは正常個人（ｎ＝１６）、ＧＵ症状（ｎ＝４５；上記良性症状を有する患者（ｎ＝３５）、進行した前立腺癌を有する患者，ｎ＝１０）を有する患者、及び膀胱ＴＣＣ患者（ｎ＝７０；Ｇ１，２２；Ｇ２，９；及びＧ３＋ＣＩＳ，３９）を包含した。表２に示すように、Ｇ２又はＧ３＋ＣＩＳ腫瘍を有する患者の尿中ＨＡアーゼレベルはＧ１腫瘍を有する患者、ＧＵ症状を有する患者及び正常個人における平均尿中ＨＡアーゼレベルよりも５〜８倍高い（Ｐ＜０．００１）。１０ｍＵ／ｍｇカットオフ限界におけるＥＬＩＳＡ様分析は、中グレード〜高グレードＴＣＣを検出するために１００％の感度と８８％の特異性を有する。治療効力をモニターするためのＨＡアーゼレベルの有用性を評価するために、高グレードＴＣＣ（Ｇ３腫瘍又はＣＩＳ）を有する１７人の患者において治療前と治療後のＨＡアーゼレベルを測定した。図２に示すように、手術前の尿中ヒアルロニダーゼレベルは治療後の患者の大部分において低下を示し、このことは尿中ＨＡアーゼレベル測定が治療効力のモニターにおいて有用であることを示唆する。表２：ＥＬＩＳＡ様分析による種々な患者群における尿中ＨＡアーゼレベルの測定。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、“ｎ”は各カテゴリーにおける個人数を表す。実施例２．実施例１の更新研究(updated studies)とデータ：ヒアルロン酸測定尿標本：Ｍｉａｍｉ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄによって認可されたプロトコール下で、１４４人の個人から排尿された（清浄−キャッチ）尿標本を回収した。サンプルを３グループに分割した。グループ1：正常（健康）年齢が似通った（３０〜７０歳）個人（ｎ＝２５）。グループ２：他の尿生殖器症状を有する患者（ｎ＝４５）、例えば良性前立腺肥大（ＢＰＨ；ｎ＝８）、前立腺癌（ｎ＝７）、腎結石（ｎ＝５）、膀胱炎（ｎ＝１２）、尿路感染症（ｎ＝８）、前立腺炎（ｎ＝２）、副睾丸炎（ｎ＝１）及び腎臓外傷（ｎ＝２）。グループ３：Ｇ１（ｎ＝１７、ステージＴａ）、Ｇ２（ｎ＝１４、ステージＴａ〜Ｔ２）又はＧ３（ｎ＝４３）腫瘍を有する膀胱癌患者。膀胱癌患者のＧ３サブカテゴリーは３４人のＧ３腫瘍（ステージＴ１〜Ｔ４）を有する個人と、９人の上皮内癌腫（ＣＩＳ）を有する個人を包含した。ＣＩＳは偏平で表在的である高グレード膀胱腫瘍（尿路上皮に限定）のサブクラスである。全ての標本は回収してから、分析するまで−２０℃に保存した。腫瘍標本：関連する州と連邦の規定に従って器官ドナーから、成人（２１〜５０歳）からの正常な膀胱組織を入手した。膀胱腫瘍の膀胱切除又は経尿道摘出を受けた患者（４１〜７２歳）から腫瘍性(neoplastic)膀胱組織を入手した。グループ１：正常な成人膀胱組織（ｎ＝６）。グループ２：低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍；ｎ＝６）。グループ３：高グレードＴＣＣ（Ｇ２ｎ＝２と、Ｇ３，ｎ＝６、腫瘍）。グレードを評価するために、各腫瘍標本を分割して、鏡像セグメントをホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、切片化し、組織学的に分析した。組織抽出物：組織標本（〜０．５−１ｇ）を１ｍＭベンズアミジン−ＨＣｌを含有する５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．２）中でホモジナイズした。ホモジネートを４０，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって清澄化し、透明な抽出物を分析した。ＨＡレベル測定のためのＥＬＩＳＡ様分析：尿標本及び組織抽出物中のＨＡ濃度をＦｏｓａｎｇ等が述べているＥＬＩＳＡ様分析（「ビオチニル化プロテオグリカンＧ１ドメイン（ＨＡ結合）領域を用いたヒアルロナンのＥＬＩＳＡプレートに基づく分析」，Ｍａｔｒｉｘ，１０：３０６−３１３，１９９０）に下記修正を加えて測定した：ヒト臍帯ＨＡ（２５μｇ／ｍｌ）によって被覆した９６孔マイクロタイタープレートを、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ）中の、尿標本、組織抽出物又はヒト臍帯ＨＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の連続希釈物及びビオチニル化ウシ鼻軟骨ＨＡ結合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。室温における１６時間のインキュベーション後に、孔をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した。これらの孔に結合したＨＡ結合タンパク質をアビジン−ビオチン検出系とＡＢＴＳ（２，２’アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）基質（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とを用いて定量した。ヒト臍帯ＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対して吸光度（４０５ｎｍ）をプロットすることによって、標準グラフを作成した。このグラフを用いて、尿標本又は組織抽出物の各希釈物中のＨＡ濃度を算出した。幾つかのこのような測定から、サンプルが尿又は組織抽出物でありうる場合に、各サンプル中の平均ＨＡ濃度を算出し、サンプル中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）に標準化した。各臨床サンプル中の総タンパク質濃度をタンパク質検出キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて測定した。ＨＡフラグメントの調製：ヒト臍帯ＨＡ（〜５００ｍｇ）を２０，０００単位の睾丸ヒアルロニダーゼ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって３７℃において種々な時間間隔にわたって消化させた。生じたＨＡフラグメントをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（１．５ｘ１２０ｃｍ）上で分離させた。１０ｍｌ画分を回収し、ウロン酸含量に関して分析した（ＢｉｔｔｅｒとＭｕｅｉｒ，「修正ウロン酸カルバゾール反応」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４：３３０〜３３４，１９６２）。画分を組み合わせて、３調製物（Ｆ１、Ｆ２及びＦ３）を得た。各画分中の還元性端部(reducing ends)数をＤｙｇｅｒｔ分析（Ｄｙｇｅｒｔ等，「改良された正確さでの還元糖の測定」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：３６７〜３７４，１９６５）によって測定した。ＨＡ又はそのフラグメントの各線状多糖は単一の還元性端部を含有するので、各フラグメントの鎖長をウロン酸の１モル当たりの還元性端部数から算出した。各画分中のオリゴ糖のサイズ範囲を、ＨＡ消化中に³Ｈ−標識ＨＡ（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロン酸仲介接着機能の発現のためには、ＣＤ４４（ＧＰ８５）のアンキリン結合ドメインが必要である」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２６：１０９９〜１１０９，１９９４）を組み入れて、このフラグメントをゲル電気泳動とフルログラフィー(flurography)によって分析することによっても測定した。患者の尿からのＨＡ及びＨＡフラグメントの単離：正常対象（ｎ＝４）と低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍、ｎ＝４）又は高グレードＴＣＣ（Ｇ２，ｎ＝２と、Ｇ３，ｎ＝３、腫瘍）を有する患者からの尿標本を１０倍に濃縮し、ＰＢＳに対して大規模に(extensively)透析した。約２ｍｌの各透析済み標本（〜２０ｍｇタンパク質）を、ＰＢＳと平衡させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＣＬ−Ｂカラム（１．５ｘ２０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供給した。このカラムを７ｍｌ／時でＰＢＳ中でランして、３．５ｍｌ画分を回収した。これらの画分を上述したようなＥＬＩＳＡ様分析によってＨＡに関して分析した。標準球状タンパク質マーカーと、例えばＨＡとＨＡフラグメントのような線状多糖とは異なる形状を有するので、カラムをヒト臍静脈ＨＡ（Ｍｒ〜２ｘ１０⁶Ｄ）とＨＡフラグメント、Ｆ１，Ｆ２及びＦ３を用いてキャリブレートした。或いは、内皮細胞増殖に対する尿から単離したＨＡ及びＨＡフラグメントの効果を検査するために、標本をトリクロロ酢酸（５％ｖ／ｖ）によって４℃において４時間沈降させた。尿中に存在するタンパク質増殖因子（例えば、塩基性−ＦＧＦ）を変性させ、除去するために、この沈降工程を含めた。トリクロロ酢酸処理済み尿標本を遠心分離した；上澄み液を水に対して透析し、凍結乾燥させ、ＰＢＳ中に再懸濁させ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＣＬ−Ｂカラム上でクロマトグラフィーした。分裂誘発分析：ヒト肺微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）の増殖性初代培養物をそれらの第２回又は第３回継代においてＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から得て、４８孔培養プレート上の“内皮細胞増殖培地”（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中で増殖させた。８０％集密において、培養物を無血清で、添加剤（ウシ下垂体抽出物、ＥＧＦとヒドロコルチゾン）を含まない基本培地（ＥＢＭ）中で３７℃において１２時間プレインキュベートした。プレインキュベーション後に、細胞をＨＡ又は既知長さのＨＡフラグメント又は患者尿から単離したピークＨＡ画分（Ｉ〜Ｖ）を含有する新鮮なＥＢＭ中で１８時間インキュベートした。インキュベーション後に、［³ Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）をこれらの培養物に加えて、前述したように２時間のインキュベーション後に分析を終了した（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「プロタミンは細胞表面ＥＧＦ受容体数を増加させることによってＥＧＦ刺激性分裂誘発を誘導する：潜在的ＥＧＦ受容体の存在の暗示」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１９３１８〜１９３２６，１９８９）。表示した結果は３通りの測定からの平均値±ｓ．ｄ．である。統計分析：データは、個々の患者の平均ＨＡ濃度又は各患者グループの平均値±ＳＥＭとして表示した。種々なグループ間の平均ＨＡ濃度の差は、グループ間の平均ＨＡ濃度はノン−パラメトリック分布(non-parametric distribution)を示したので、Ｄｕｎｎ多重比較(multiple comparison)試験によって評価した。尿標本中のＨＡ濃度の測定：ビオチニル化ＨＡ結合タンパク質の使用を含むＥＬＩＳＡ様分析を用いて、尿標本中のＨＡ濃度を測定した。尿中ＨＡレベル（ｎｇ）は水分補給状態及び尿排出量によって影響されることが判明しているので、これらのレベルを尿中タンパク質含量（ｍｇ）に標準化した。タンパク質への標準化は膀胱癌患者に通常認められる症状である血尿によってあまり影響されないことが判明したので、尿中ＨＡレベルをクレアチニンにではなく総タンパク質に標準化した（Ｓｏｌｏｗａｙ，「表在的膀胱癌の治療」，Ｃａｎｃｅｒ，４５：１８５６〜１８６５，１９８０）。本発明者は正常個人（ｎ＝２５）と膀胱癌を有する個人（例えば，Ｇ１、Ｇ２及びＧ３（ＣＩＳを含む）、ｎ＝７４）との尿中ＨＡレベルを比較した。対照として、膀胱癌以外のＧＵ症状（例えば、ＢＰＨ、前立腺癌、腎結石、細菌感染症、膀胱炎、前立腺炎、腎臓外傷及び副睾丸炎、（ｎ＝４５））を有する患者の酵素レベルもこの試験では測定した。図５Ａに示すように、正常個人と他のＧＵ症状を有する患者との間の尿中ＨＡレベルの分布は非常に類似しており、これらの２グループに含まれる個人の大部分のＨＡレベルは、＜１００ｎｇ／ｍｇである。しかし、尿中ＨＡレベルは膀胱癌患者では、腫瘍のグレード（例えば、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３）に関係なく、一様に高く、大抵の患者では、これらのレベルは＞１００ｎｇ／ｍｇである（図５Ａ）。種々なグループ間の平均尿中ＨＡレベルの比較を図５Ｂに示す。正常個人（４４．７±６．２ｎｇ／ｍｇ）と他のＧＵ症状を有する個人（６９．５±６．８ｎｇ／ｍｇ）との間の平均尿中ＨＡレベルは有意に異ならない。Ｄｕｎｎ多重比較試験によるこれらのデータの統計分析は、正常個人と他のＧＵ症状を有する患者との間の平均尿中ＨＡレベルに認められる差が統計的に有意でない（Ｐ＞０．０５、表３）ことを示す。しかし、Ｇ１（２５５±４１．７ｎｇ／ｍｇ）、Ｇ２（２９１．８±６８．３ｎｇ／ｍｇ）又はＧ３（４２８．４±６７ｎｇ／ｍｇ）膀胱癌を有する患者間では尿中ＨＡレベルが有意に高かった（４〜９倍）。Ｄｕｎｎ多重比較試験は、膀胱癌患者の平均尿中ＨＡレベルと正常個人又は他のＧＵ患者の平均尿中ＨＡレベルとの差が統計的に有意である（Ｐ＜０．００１、表３）ことを示す。それにも拘わらず、膀胱腫瘍の種々なグレード（例えば、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３）を有する患者の平均尿中ＨＡ濃度に認められる差は統計的に有意ではない（Ｐ＞０．０５、表３）。これらの結果は、尿中ＨＡレベルの増加が膀胱腫瘍を示唆することを実証する：しかし、これは腫瘍グレードのプレディクター(predictor)ではない。表３：正常個人、他のＧＵ症状を有する患者又は膀胱癌を有する患者の間の平均尿中ＨＡレベルを比較するためのＤｕｎｎ多重比較試験。図５に示したデータはＤｕｎｎ多重比較試験を用いて分析した。尿中ＨＡレベルに関するデータをさらに分析して、膀胱癌の検出に関するＥＬＩＳＡ様分析の特異性と感度とを判定した。表４に示すように、最低カットオフ限界として１００ｎｇ／ｍｇを用いたこの分析の総特異性は９２．８％であった。同じカットオフ限界において、膀胱癌を検出するためのこの分析の感度は９１．９％であった。分析は、この分析からの偽陽性結果と偽陰性結果とがそれぞれ７．２％と８．１％であったことを示す。表４：膀胱癌の検出に関するＥＬＩＳＡ様分析の特異性と感度の判定。図５Ａに示した個人の尿中ＨＡレベルに関するデータを最低カットオフ限界として１００ｎｇ／ｍｇＨＡ濃度を用いた感度と特異性算出に関して分析した。サンプルは７４人の膀胱癌患者と、疾患を有さない個人（ｎ＝２５）又は他のＧＵ症状（例えば、膀胱炎、ＢＰＨ、前立腺癌、細菌感染症、腎結石等、ｎ＝４５）を有する個人とを包含した。感度＝実際の陽性結果／膀胱癌患者の総数。特異性＝実際の陰性結果／膀胱癌を有さない患者の総数。偽陽性率＝偽陽性結果／膀胱癌を有さない個人の総数。偽陰性率＝偽陰性結果／疾患を有する個人の総数。ａ：例えば、正常者と他のＧＵ症状を有する患者のような、各個人グループの特異性は、それぞれ、９６％と９１．１％である。ｂ．低グレード（Ｇ１）及び低ステージ（Ｔａ）腫瘍を検出するためのＥＬＩＳＡ様分析の感度は８８．７％であった。高グレード（≧Ｇ２）及び高ステージ（ ≧Ｔ１）腫瘍を検出するためのこの分析の感度は９２．７％であった。膀胱組織中のＨＡ濃度の比較：尿中ＨＡレベルの上昇が腫瘍関連ＨＡの尿中への分泌によるのかどうかを知るために、発明者は正常膀胱、低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍）及び高グレードＴＣＣ（Ｇ２＋Ｇ３腫瘍）から調製した組織抽出物中のＨＡレベルをＥＬＩＳＡ様分析を用いて検査した。図６Ａに示すように、正常膀胱組織中のＨＡレベルに比ベて、膀胱腫瘍組織中のＨＡレベルは腫瘍グレードに関係なく高い。低グレードＴＣＣ組織（５．８±２．１μｇ／ｍｇ）と高グレードＴＣＣ組織（９．３±３．３μｇ／ｍｇ）とは、正常膀胱組織中に存在するＨＡレベル（１．８±０．４μ ｇ／ｍｇ）よりも、それぞれ、３倍と５倍高い。表５に示すように、正常膀胱標本と膀胱腫瘍（低グレード又は高グレードＴＣＣ）間の組織ＨＡレベルの差は統計的に有意である（Ｐ＜０．００１）。しかし、低グレードＴＣＣ組織と高グレードＴＣＣ組織中の存在するＨＡレベルの差は、統計的に有意ではない（Ｐ＞０．０５、表５）。これらの結果は、尿中ＨＡレベル上昇と腫瘍関連ＨＡ増加との間に直接の相関関係が存在することを示す。表５：正常組織と膀胱腫瘍組織との間の平均ＨＡレベルを比較するためのＤｕｎｎ多重比較試験。図６に示したデータはＤｕｎｎ多重比較試験を用いて分析した。低グレードＴＣＣと高グレードＴＣＣとは、それぞれ、Ｇ１又はＧ２＋Ｇ３腫瘍を有する個人グループを意味する。尿中ＨＡプロフィルの測定：ＨＡのヒアルロニダーゼ消化によって生じたＨＡの小フラグメント（３〜２５二糖単位）はｉｎｖｉｖｏで血管形成性であることが判明している（Ｗｅｓｔ等，「ヒアルロン酸の分解生成物によって誘導される血管形成」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３２４〜１３２６，１９８５）。このようなＨＡフラグメントが尿中に存在するかどうか知るために、発明者は、正常個人と低グレード又は高グレードＴＣＣを有する患者との尿中に存在するＨＡ種のプロフィルをゲル−濾過クロマトグラフィーを用いて検査した。尿中ＨＡ種のサイズを、高分子量ＨＡ（Ｍｒ〜２ｘ１０⁶ダルトン）と既知長さのＨＡフラグメント（Ｆ１（１０〜１５二糖単位）、Ｆ２（２〜３二糖単位）及びＦ３（〜２二糖単位））とを用いてカラムをキャリブレートすることによって測定した。Ｆ１フラグメントはウシ大動脈内皮細胞の種々な機能を調節することが判明している（ＢａｎａｒｊｅｅとＴｏｏｌｅ，「内皮細胞形態形成におけるヒアルロナン結合タンパク質」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９：６４３〜６５２，１９９２）。図７に示すように、正常個人の尿は少量のＨＡを含有し、その大きさは高分子量ＨＡとＦ１フラグメントとの中間であった。低グレードＴＣＣ患者の尿は少量の高分子量ＨＡと中サイズＨＡの幅広い第２ピークとを含有する（図７）。第２ピークは若干量のＦ１フラグメントを含有するように思われる（図７）。高グレードＴＣＣ患者の尿のＨＡプロフィルは複雑なパターンを示す。このプロフィルは、高分子量ＨＡとＦ１フラグメントとに相当する、２つの大きいピークから成る。これらの２ピークは中サイズＨＡのピークによって分離されている（図７）。さらに、高グレードＴＣＣ患者の尿は、Ｆ２とＦ３ＨＡフラグメントにほぼ相当する、２つの小ＨＡピークを含有する（図７）。これらの結果は、全ての膀胱癌患者ではＨＡ濃度が上昇したが、ＨＡプロフィルは低グレードＴＣＣ患者と高グレードＴＣＣ患者とでは異なったことを示す。ヒト微細血管内皮細胞の増殖に対するＨＡ及びＨＡフラグメントの効果：［³Ｈ］−チミジン組み入れ分析を用いて、発明者は、ｉｎｖｉｔｒｏで発生された、又は高グレードＴＣＣ患者の尿から単離された、高分子量ＨＡとＨＡフラグメント（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３）の、ヒト肺微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ −Ｌ）の初代培養物の増殖に対する効果を検査した。図８Ａに示すように、高分子量ＨＡとＦ１フラグメントとはＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞の分裂誘発反応を用量依存的に誘導し、２μｇ／ｍｌ濃度において、それぞれ、１．５倍と２．３倍の最大増加を生じる。Ｆ２とＦ３フラグメントはこれらの細胞に対して分裂誘発性ではない（図８Ａ）。高グレードＴＣＣ患者の尿から単離されたＨＡ種の中では、ピークＩ（高分子量ＨＡ）とピークＩＩ（中サイズＨＡ）はＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞において軽度の分裂誘発反応（１．２〜１．３倍）を誘導する。しかし、Ｆ１フラグメントに相当する、ピークＩＩＩ中に存在するＨＡ種はＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞において〜２．４倍の分裂誘発反応を誘導する（図８）。Ｆ２とＦ３フラグメントに相当する、非常に小さいＨＡフラグメント（ピークＩＶとＶ）は分裂誘発性ではない。これらの結果は、内皮細胞機能（例えば、増殖）を剌激するＨＡフラグメントが高グレードＴＣＣ患者の尿中に存在することを示唆する。要約すると、尿中ＨＡレベルは全ての膀胱癌患者において有意に上昇し（４〜９倍；図５）、尿中ＨＡレベルが膀胱癌のマーカーとして有用であることを実証する。膀胱癌患者の尿中ＨＡレベルの上昇は腫瘍関連ＨＡの尿中への直接の分泌によると考えられる（図６）。正常者、低グレードＴＣＣ患者及び高グレードＴＣＣ患者の尿プロフィルの差異は、尿中ＨＡのサイズ測定が膀胱癌の予後の別のインジケーターになりうることを意味する。膀胱癌におけるＨＡ種のプロフィルが腎臓癌を有する小児の尿又は血清中に存在するものとは異なることも注目すべきである（Ｌｉｎ等，「尿中ヒアルロン酸はＷｉｌｍ腫瘍のマーカーである」，Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．，３０：３０４〜３０８，１９９５；Ｋｕｍａｒ等，「腎臓腫瘍を有する小児の血清は低分子量ヒアルロン酸を含有する」，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：４４５〜４４８，１９８９）。それ故、ＨＡ種のサイズとそれらの分布のパターンは異なる起源並びにグレードの腫瘍においては異なる。実施例３．実施例１の更新研究とデータ：ヒアルロニダーゼ測定尿標本：Ｍｉａｍｉ大学のＩｎｓｔｉｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄによって認可されたプロトコール下で、１３９人の個人から排尿された（清浄−キャッチ）尿標本を回収した。これらの個人を３グループに分割した。グループ１：正常（健康）年齢が似通った（３０〜７０歳）個人（ｎ＝２０）。グループ２：他の尿生殖器（ＧＵ）症状を有する患者（ｎ＝４８）、例えば進行した前立腺癌（ｎ＝１０）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ；ｎ＝８）、腎結石（ｎ＝５）、膀胱炎（ｎ＝１２）、尿路感染症（ｎ＝８）、前立腺炎（ｎ＝２）、副睾丸炎（ｎ＝１）及び腎臓外傷（ｎ＝２）。グループ３：Ｇ１（ｎ＝２２、ステージＴａ）、Ｇ２（ｎ＝９、ステージＴａ〜Ｔ２）又はＧ３（ｎ＝４０）膀胱腫瘍を有する患者。Ｇ３サブカテゴリーは、３４人のＧ３腫瘍（ステージＴ１〜Ｔ４）を有する個人と、６人の上皮内癌腫（ＣＩＳ）を有する個人を包含した。ＣＩＳは偏平で表在的である高グレード腫瘍（尿路上皮に限定）のサブクラスである。全ての標本は回収してから、分析するまで−２０℃に保存した。組織標本：成人（２１〜５０歳）からの正常な膀胱組織を器官ドナーから入手した。組織調達は関連する州と連邦の規定に従っておこなった。膀胱腫瘍組織は、腫瘍の膀胱切除又は経尿道摘出を受けた患者（４１〜７２歳）から入手した。３グループの患者において、組織ヒアルロニダーゼレベルを分析した。グループ１：正常な膀胱（ｎ＝６）。グループ２：低グレードＴＣＣ（Ｇ１，ｎ＝６）。グループ３：高グレードＴＣＣ（Ｇ２ｎ＝２と、Ｇ３，ｎ＝６）。グレードを評価するために、各腫瘍標本を分割して、鏡像セグメントをホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋して、組織学的に分析した。組織抽出物：組織標本（〜０．５−１ｇ）を、５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）と１ｍＭベンズアミジン−ＨＣｌとを含有する緩衝剤中でホモジナイズした。ホモジネートを４０，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって清澄化し、透明な抽出物を分析した。基質（ＨＡ）−ゲル分析：尿サンプル（〜２０μｇタンパク質）を７．５％ポリアクリルアミドゲル上での非変性条件下又は０．１７ｍｇ／ｍｌヒト臍帯ＨＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での変性条件下で電気泳動した。電気泳動後に、ゲルをヒアルロニダーゼ分析緩衝剤（０．１Ｍギ酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．３）中で酵素消化のために３７℃において１６〜１８時間インキュベートした。変性ゲル上で電気泳動したタンパク質をヒアルロニダーゼ分析緩衝剤中でのインキュベーション前に３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液中でゲルをインキュベートすることによって、再生した。インキュベーション後に、ゲルを０．５％Ａｌｃｉａｎブルーと０．１５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー溶液によって連続的に染色し、１０％メタノール／１０％酢酸溶液によって脱色した。ヒアルロニダーゼの存在はゲル中の非染色（透明な）部分（単数又は複数）から記述されているように推測された（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ，Ｖ．Ｂ．，Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｈａｍ．Ｈ．Ｔ．及びＢｌｏｃｋ，Ｎ．Ｌ．，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；Ｇｕｅｔｅｎｈｏｎｅｒ等，「ヒアルロニダーゼ活性の基質ゲル分析」，Ｍａｔｒｉｘ，１２：３８８〜３９６，１９９２）。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と銀染色：尿標本（〜２０ｐｇタンパク質）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、次に銀染色して、総尿中タンパク質プロフィルを明らかにした。ヒアルロニダーゼ活性測定のためのＥＬＩＳＡ様分析：２００ｐｇ／ｍｌのＨＡによって被覆した９６孔マイクロタイタープレートを、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するヒアルロニダーゼ分析緩衝剤中の、尿標本、組織抽出物又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓヒアルロニダーゼ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の連続希釈物と共に、３７℃において１６〜１８時間インキュベートした。インキュベーション後に、分解したＨＡを洗い流し、これらの孔に残留するＨＡをビオチニル化軟骨ＨＡ結合タンパク質（Ｔｅｎｇｂｌａｄ，「固定ヒアルロネート上でのアフィニティクロマトグラフィーと、軟骨からヒアルロネート結合タンパク質を単離するためのその用途」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７８：２８１〜２８９，１９７９）と、アビジン−ビオチン検出系と、ＡＢＴＳ基質キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とを用いて、既述したように定量した（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；ＳｔｅｒｎとＳｔｅｒｎ，「ヒアルロニダーゼとヒアルロニダーゼ阻害剤とに関するＥＬＩＳＡ様分析」，Ｍａｔｒｉｘ，１２：３９７〜４０３，１９９２）。マイクロタイタープレート読み取り機において４０５ｎｍで吸光度を読み取った。各分析において、最大吸光度（Ａ_max ）_405nm はＨＡ被覆孔を緩衝剤のみと、ヒアルロニダーゼの不存在下でインキュベートすることによって得た。（Ａ_min ）_405nm は非被覆孔中でヒアルロニダーゼをインキュベートすることによって得た。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓヒアルロニダーゼ活性（ｍＵ／ｍｌ）に対して吸光度（４０５ｎｍ）をプロットすることによって、標準グラフを作成した。このグラフを用いて、尿又は組織抽出物の各希釈物中のヒアルロニダーゼ濃度を算出した。７種類の別々の希釈物中の活性を測定することによって、各サンプル中の平均ヒアルロニダーゼ活性を算出した。全ての活性測定（ｍＵ／ｍｌ）はタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）に標準化した。膀胱腫瘍由来ヒアルロニダーゼのｐＨ活性プロフィルを測定するために、ＨＡ被覆孔を種々なｐＨ（２．０〜７．０）におけるホルメート−ＮａＣｌ緩衝剤中の尿又は組織抽出物のアリコートと共にインキュベートした。結果は（Ａ_max−Ａ_sample）_405nm ｘ１００として表現する。最大差を１００％と指定し、データを最大値の％として表す。統計分析：データを個々の患者の平均ヒアルロニダーゼ活性又は各患者グループの平均値 ±ＳＥＭとして表示する。種々なグループ間の差は、平均ヒアルロニダーゼレベルがパラメトリック分布(parametric distribution)を示したので、Ｔｕｋｅｙ −Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験によって評価した。尿中ヒアルロニダーゼ活性の検出：（ａ）基質ゲル分析：尿サンプル中のヒアルロニダーゼ活性を感受性基質（ＨＡ）−ゲル方法を用いて検出した（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；Ｇｕｅｔｅｎｈｏｎｅｒ等，「ヒアルロニダーゼ活性の基質ゲル分析」，Ｍａｔｒｉｘ，１２：３８８〜３９６，１９９２）。図９に示すように、正常個人（レーン１と２）及び低グレードＴＣＣ患者（レーン３と４）の尿標本を含むレーンでは、ＨＡ消化が殆ど又は全く観察されなかった。しかし、高グレードＴＣＣ患者（レーン５と６）からの標本では、ＨＡ消化の幅広い帯が観察され、これはこれらのサンプルが有意な量のヒアルロニダーゼ活性を含有することを示唆する。（ｂ）ＥＬＩＳＡ様分析による尿中ヒアルロニダーゼ活性の定量測定：尿サンプル（ｎ＝１３９）中のヒアルロニダーゼレベルの正確な定量が、ＥＬＩＳＡ様分析によって達成された（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６）。個人の水分補給状態と尿排出量の変化は、ヒアルロニダーゼレベル（ｍＵ）を尿中タンパク質濃度（ｍｇ）に標準化することによって修正した。タンパク質への標準化は膀胱癌患者に通常認められる症状である血尿によってあまり影響されないことが判明したので、ヒアルロニダーゼレベルをクレアチニンにではなく尿中タンパク質濃度に標準化した（Ｓｏｌｏｗａｙ，「表在的膀胱癌の治療」，Ｃａｎｃｅｒ，４５：１８５６〜１８６５，１９８０）。本発明者は正常個人（ｎ＝２０）と膀胱癌を有する個人（例えば，Ｇ１、Ｇ２及びＧ３腫瘍とＣＩＳ、ｎ＝７１）との尿中ヒアルロニダーゼレベルを比較した。対照として、ＴＣＣ以外のＧＵ症状（例えば、ＢＰＨ、前立腺癌、腎結石、細菌感染症と膀胱炎、腎臓外傷、前立腺炎及び副皐丸炎、ｎ＝４８）を有する患者の酵素レベルもこの研究に含めた。図１０Ａに示すように、正常個人と、低グレード（Ｇ１）膀胱腫瘍又は他のＧＵ症状を有する患者との間の尿中ヒアルロニダーゼレベルの分布は非常に類似している。これらの３グループに含まれる個人の大部分のヒアルロニダーゼレベルは、＜１０ｍＵ／ｍｇである。しかし、ヒアルロニダーゼレベルは中グレード（Ｇ２）〜高グレード（Ｇ３）膀胱腫瘍を有する全ての患者間では高く、＞１０ｍＵ／ｍｇである（図１０Ａ）。種々なグループ間の平均尿中ヒアルロニダーゼレベルの比較を図１０Ｂに示す。正常な個人（４．２±１．２ｍＵ／ｍｇ）、他のＧＵ症状を有する個人（７．４±１．４ｍＵ／ｍｇ）、又はＧ１腫瘍を有する個人（６．５±１．７ｍＵ／ｍｇ）の間の平均尿中ヒアルロニダーゼレベルは有意に変化しない。しかし、このレベルはＧ２腫瘍（３２±６．１ｍＵ／ｍｇ）又はＧ３腫瘍（３４．３±３．１ｍＵ／ｍｇ）を有する患者では有意に上昇する。Ｇ２又はＧ３腫瘍を有する患者を一緒にした全ての患者の平均尿中ヒアルロニダーゼレベル（３３．４±４．５ｍＵ／ｍｇ）は正常個人と他のＧＵ症状又はＧ１膀胱腫瘍を有する患者における平均尿中ヒアルロニダーゼレベルよりも５〜９倍高い。ＣＩＳ（表在的で偏平である高グレード膀胱ＴＣＣのサブクラス）を有する全ての患者では尿中ヒアルロニダーゼレベルが６〜１１倍上昇する（４６±５．９ｍＵ／ｍｇ）ことに注目することは重要である。これらの結果は、ここで検査した全ての高グレード膀胱癌患者が侵潤性疾患の発生の前に高い尿中ヒアルロニダーゼレベルを有することを示す。患者の種々なカテゴリー間の平均ヒアルロニダーゼレベルに観察された差の統計的有意性をＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験を用いて評価した。表６に示すように、正常個人と、Ｇ１膀胱腫瘍又は他のＧＵ症状を有する個人との間の平均尿中ヒアルロニダーゼレベルの差は統計的に有意ではない（Ｐ＞０．０５；表６）。しかし、正常個人／他のＧＵ患者とＧ２又はＧ３腫瘍を有する患者との間のこのような差は統計的に有意である（Ｐ＜０．００１，表６）。Ｇ１腫瘍を有する患者とＧ２又はＧ３腫瘍を有する患者との間の平均ヒアルロニダーゼレべルの差も統計的に有意である（Ｐ＜０．００１、表６）。それにも拘わらず、Ｇ２又はＧ３腫瘍を有する患者間の平均酵素レベルの差は統計的に有意ではない（Ｐ＞０．０５）。それ故、これらの結果は、全ての中グレード〜高グレード癌患者では尿中ヒアルロニダーゼレベルが上昇することを示す。表６：正常個人と膀胱癌患者との平均尿中ヒアルロニダーゼレベルを比較するＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験。図１０に示したデータはＴｕｋｅｙ− Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験を用いて統計的に分析した。ｑ値が３．９１６より大きい場合には、Ｐ値は０．０５未満である。尿中ヒアルロニダーゼレベルに関するデータをさらに分析して、高グレードＴＣＣの検出に関するＥＬＩＳＡ様分析の特異性と感度とを判定した。表７に示すように、最低カットオフ限界として１０ｍＵ／ｍｇを用いた、このＥＬＩＳＡ様分析の総特異性は８８．８％であった。同じカットオフ限界において、高グレードＴＣＣを検出するためのこの分析の感度は１００％であった（すなわち、単一の高グレード腫瘍も見のがさなかった）。分析は、この分析からの偽陽性結果と偽陰性結果とがそれぞれ１１．２％と０％であったことを示す。表７：高グレード膀胱癌の検出に関するＥＬＩＳＡ様分析の特異性と感度の判定。図１０に示した尿中ヒアルロニダーゼレベルに関するデータを酵素レベルの最低カットオフ限界として１０ｍＵ／ｍｇを用いた感度と特異性算出に関して分析した。サンプルは４９人の高グレードＴＣＣ（Ｇ２とＧ３腫瘍）患者と、９０人の、疾患を有さない（ｎ＝２０）又は他のＧＵ症状（例えば、膀胱炎、細菌感染症、ＢＰＨ、腎結石、前立腺癌等、ｎ＝４８）又は低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍、ｎ＝２２）を有する個人とを包含した。感度＝実際の陽性結果／高グレードＴＣＣ患者の総数。特異性＝実際の陰性結果／高グレードＴＣＣを有さない患者の総数。偽陰性率＝偽陰性結果／高グレードＴＣＣを有する患者の総数。偽陽性率＝偽陽性結果／高グレードＴＣＣを有さない患者の総数。ａ：例えば、正常者、他のＧＵ症状を有する患者及び低グレードＴＣＣ患者のような、各個人グループの特異性は、それぞれ、９３．７％、８４．５％及び９０．９％である。膀胱組織抽出物中のヒアルロニダーゼ活性の検査：これらの研究は尿中ヒアルロニダーゼレベルが高グレード膀胱癌患者では上昇することを示したので、発明者は、この上昇が腫瘍由来ヒアルロニダーゼ（単数又は複数種類）の尿中への分泌の結果であると仮定した。したがって、発明者は、正常膀胱、低グレードＴＣＣ（Ｇ１腫瘍）及び高グレードＴＣＣ（Ｇ２＋Ｇ３腫瘍）から調製した組織抽出物中のヒアルロニダーゼ活性の存在をＥＬＩＳＡ様分析を用いて検査した。図１１Ａに示すように、正常膀胱中とＧ１腫瘍組織中とのヒアルロニダーゼレベルは非常に類似する。しかし、Ｇ２とＧ３腫瘍組織抽出物は有意に高いヒアルロニダーゼレベルを示す（図１１Ａ）。Ｇ２とＧ３腫瘍組織中に存在する平均ヒアルロニダーゼレベル（１３．２±１．２ｍＵ／ｍｇ）は、正常膀胱組織に存在するヒアルロニダーゼレベル（１．９±０．３５ｍＵ／ｍｇ）及びＧ１腫瘍組織に存在するヒアルロニダーゼレベル（２．７±０．６１ｍＵ／ｍｇ）よりも実際に６〜７倍高い（図１１Ｂ）。これらのデータのＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験による統計分析は、正常組織とＧ２とＧ３腫瘍組織との間の平均ヒアルロニダーゼ活性に認められた差が統計的に有意であるが（ｐ＜０．００１）、正常膀胱組織とＧ１腫瘍組織との間のこのような差は統計的に有意ではない（Ｐ＞０．０５）ことを示す（表８）。さらに、Ｇ１腫瘍とＧ２又はＧ３腫瘍との間の平均酵素レベルの差は統計的に有意である（Ｐ＜０．００１、表８）。したがって、尿中ヒアルロニダーゼレベルと組織中ヒアルロニダーゼレベルの両方の上昇は、膀胱の中グレード〜高グレードＴＣＣに関連する。表８：正常個人と膀胱癌患者とにおける平均組織ヒアルロニダーゼレベルを比較するためのＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験。図１１に表示したデータをＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験を用いて統計的に分析した。ｑ値が２．６５５より大きい場合には、Ｐ値は０．０５未満である。膀胱腫瘍関連ヒアルロニダーゼ活性の特徴付け：膀胱腫瘍関連ヒアルロニダーゼ活性のｐＨ活性プロフィルをＥＬＩＳＡ様分析を用いて測定した。図１２に示すように、高グレードＴＣＣ患者の尿及び腫瘍（Ｇ３）組織中に存在するヒアルロニダーゼ活性はＨＡ分解に関して明確なｐＨ最適値（４．３）を有する。膀胱腫瘍関連ヒアルロニダーゼ活性のｐＨ最適値は、例えば血清、肝臓、腎臓、睾丸及び前立腺のような、他の供給源からのヒアルロニダーゼに関して報告されたものとは異なる（Ｇｏｌｄ，「ヒト肝臓からのヒアルロニダーゼの精製と特性」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０５：６９〜７４，１９８２；Ｓｔｅｒｎ等，「Ｗｉｌｍｓ腫瘍患者からの尿中のヒアルロニダーゼレベル」，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．，８３：１５６９〜１５７４，１９９１；Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；Ａｆｉｆｙ等，「ヒト血清ヒアルロニダーゼの精製と特徴付け」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０５：４３４〜４４１，１９９３；Ｓａｌｅｑｕｉ等，「血清と睾丸のヒアルロニダーゼの比較」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１２１：５４８〜５５４，１９６７）。次に、基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法を用いて、膀胱腫瘍由来ヒアルロニダーゼの相対的分子量を測定した（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；Ｇｕｅｔｅｎｈｏｎｅｒ等，「ヒアルロニダーゼ活性の基質ゲル分析」，Ｍａｔｒｉｘ，１２：３８８〜３９６，１９９２）。正常個人と膀胱癌患者の両方からの尿標本（４０μｇタンパク質）を基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図１３Ａに示すように、Ｇ２（レーン２）、Ｇ３（レーン３）腫瘍を有する患者の尿中には、相対的Ｍｒ６５ｋＤ（ｐ６５）と５５ｋＤ（ｐ５５）の２種類のヒアルロニダーゼタンパク質が存在する。しかし、Ｇ１腫瘍患者（レーン１）又は正常個人（レーン４）の尿中には、同じ総尿中タンパク質濃度において、ヒアルロニダーゼ帯が検出されない。ｐ６５とｐ５５とが高グレード膀胱癌患者の尿中の主要なタンパク質種であるかどうかを検査するために、Ｇ３膀胱癌患者からの尿標本をＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色とによって分析して、総タンパク質プロフィルを明らかにした。図１３Ｂに示すように、高グレード膀胱癌患者の尿は数種類のタンパク質を含有する。しかし、ｐ６５とｐ５５は尿中の主要タンパク質ではなく、他のタンパク質中で同定されることができない。ＥＬＩＳＡ様分析と基質ゲル分析の両方はタンパク質ではなく活性を検出するのであり、両分析とも高度に敏感であるので、このことは意外ではない。さらに、高グレード膀胱癌患者と正常個人との尿中タンパク質プロフィルには差異が認められない（データ示さず）。ｐ５５とｐ６５とがＧ３腫瘍及び正常膀胱に発現されるかどうかを検査するために、これらの供給源から調製した組織抽出物（〜４０μｇタンパク質）を基質（ＨＡ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図１３に示すように、ｐ６５とｐ５５の両方がＧ３腫瘍組織抽出物中に存在するが（左レーン）、正常な膀胱組織中には、予想通りに存在しない（右レーン）。他の組織では単独のヒアルロニダーゼタンパク質のみが発現することが認められることは興味深い（Ｓｔｅｒｎ等，「Ｗｉｌｍ腫瘍患者からの尿中のヒアルロニダーゼレベル」，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．，８３：１５６９〜１５７４，１９９１；Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６；Ａｆｉｆｙ等，「ヒト血清ヒアルロニダーゼの精製と特徴付け」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０５：４３４〜４４１，１９９３；Ｓａｌｅｑｕｉ等，「血清と睾丸のヒアルロニダーゼの比較」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１２１：５４８〜５５４，１９６７）。これらのデータは、高グレード（Ｇ２とＧ３腫瘍）膀胱ＴＣＣ患者では尿中ヒアルロニダーゼレベルが有意に高い（例えば、約５〜９倍）ことを示し、ヒアルロニダーゼが高グレード膀胱腫瘍を検出するための有用な尿マーカーであることができることを実証する。尿中と組織中の両方のヒアルロニダーゼレベルの上昇は、腫瘍由来ヒアルロニダーゼ（単数又は複数種類）が尿中へ分泌されることを示唆する。初期のデータは、ヒアルロニダーゼ（単数又は複数種類）が膀胱腫瘍上皮細胞によって分泌されることを示す（未発表結果）（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ等，「ヒアルロニダーゼ、マトリックス分解酵素と前立腺癌進行との関係」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：６５１〜６５７，１９９６をも参照のこと）。他のヒアルロニダーゼとは異なるｐＨ最適値を有する２種類のヒアルロニダーゼタンパク質（ｐ６５とｐ５５）の同定は、膀胱腫瘍由来ヒアルロニダーゼがこの成長するファミリー(growing family)の新しいメンバーでありうることを示唆する。実施例４．実施例１の更新研究とデータ：さらなるヒアルロン酸とヒアルロニダーゼ測定２つの別々の研究（研究Ａと研究Ｂ）において、発明者は実施例１、２及び３に述べた方法と実質的に同じ方法を用いて、３５６人の尿中ＨＡとＨＡアーゼとを検査した。研究Ａ：１９１人を含む研究Ａでは、ｎｇ／ｍｇタンパク質として表現した尿中ＨＡレベル（ＨＡ試験）が腫瘍のグレードに拘わらず、全ての膀胱癌患者（２９７．７ ±４４．２，ｎ＝１２１）では、正常者（４４．７±３．１）ｎ＝２５）と他の尿生殖器（ＧＵ）患者（７４．２±７．８、ｎ＝４５）の尿中ＨＡレベルに比ベて、４〜７倍に上昇することが判明した（Ｐ＜０．００１）。ＧＵ患者は良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、腎結石、尿路感染症、膀胱炎、前立腺癌、前立腺炎、副睾丸炎又は性交不能を有する患者を包含した。膀胱癌患者を検出するためのこの試験の感度と特異性は、最低カットオフ限界として１００ｎｇＨＡ／ｍｇタンパク質を用いて算出した（表９）。同じ研究において、ｍＵ／ｍｇタンパク質として表現した尿中ＨＡアーゼレベル（ＨＡアーゼ試験）はＧ２とＧ３膀胱癌患者（３１．４±３．６）では、Ｇ１膀胱癌患者（６．３±１．１）、他のＧＵ患者（７．４±１．４）及び正常者（４．４±０．８）の尿中ＨＡアーゼレベルに比べて４〜７倍に上昇することが判明した（Ｐ＜０．００１）。ＨＡアーゼ試験の感度と特異性は、最低カットオフ限界として１０ｍＵ／ｍｇタンパク質を用いて算出した（表９）。表９：研究ＡにおけるＨＡ−ＨＡアーゼ試験の感度、特異性、偽陽性率、偽陰性率及び精度の測定。データは全体で１９１人を検査した研究Ａから得た。ＨＡ試験は全ての膀胱癌患者を検出するが、ＨＡアーゼ試験は高グレード（グレードＧ２、Ｇ３及び上皮内癌腫（ＣＩＳ））膀胱癌患者を検出する。研究Ｂ：ＨＡ−ＨＡアーゼ尿試験の感度と特異性とを評価するために、発明者は１６５人を含む盲検(blinded study)をおこなった。対象は５１人の膀胱癌患者と、１０人の正常者と、１１４人の他のＧＵ症状患者とを包含した。患者の膀胱癌カテゴリーは、この疾患を有する患者４１人と、膀胱癌の病歴を有するが試験の時点では疾患を有さない個人１０人とを包含した。データは表１０に示す。表１０：研究ＢにおけるＨＡ−ＨＡアーゼ試験の感度、特異性、偽陽性率、偽陰性率及び精度の測定。これは１６５人を含む盲検であった。両方の試験は一緒にしたときに、９５．１％の総感度で４１人の膀胱癌患者のうちの２人のみを当てそこなったことが認められる。結果は、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験の組合せ感度がいずれかの試験単独よりも高いことを示した。この理由は、場合によっては、高グレード、高ステージ膀胱癌患者がＨＡ試験では偽陰性結果を与えたが、ＨＡアーゼ試験は実際の陽性であるからであり；恐らく、高いヒアルロニダーゼ活性が尿中に存在するヒアルロン酸を分解して、カットオフ限界より低い見かけのＨＡレベルを生じたからと思われる。これらの研究は、ＨＡ−ＨＡアーゼ尿試験が膀胱癌を検出し、そのグレードを評価するための簡単な、非侵襲性の高感度かつ高特異性方法であることを示す。腫瘍グレードとステージによる、ＨＡ試験とＨＡアーゼ試験の感度の分析。（ａ）ＨＡ試験：感度測定のために、ＨＡレベルに関して１００ｎｇ／ｍｇタンパク質を最低カットオフ限界として設定した。膀胱癌患者はそれぞれ研究Ａと研究Ｂとからの１２１人と３６人のＴＣＣ患者を包含する。表１１：腫瘍グレードによるＨＡ試験の感度。膀胱癌患者（ＢＣａ）のＧ１カテゴリーはＧ１〜２を有する６人の患者を包含する。Ｇ３カテゴリーは２５人のＣＩＳ患者を包含する。表１２：腫瘍ステージによるＨＡ試験の感度。種々な病理学的ステージにおける腫瘍のグレードは次のようであった：Ｇ１Ｔａ（ｎ＝４１）、Ｇ２Ｔａ（ｎ＝１５）、Ｇ３Ｔａ（ｎ＝５）、Ｇ１Ｔ１（ｎ＝１）、Ｇ２／Ｇ３Ｔ１（ｎ＝１６）、Ｇ２／Ｇ３Ｔ２＋（ｎ＝５５）及びＧ３ＣＩＳ（ｎ＝２５）。表１１と１２に示すように、ＨＡ試験は同じような感度でＧ１、Ｇ２及びＧ３膀胱腫瘍を検出した、即ち、９０％（Ｇ１）、９６％（Ｇ２）及び８８％（Ｇ３）。種々なステージの膀胱腫瘍を検出するためのＨＡ試験の感度値も非常に類似している。例えば、ＨＡ試験はステージＴａ、Ｔ１、Ｔ２＋及びＣＩＳの腫瘍をそれぞれ９０％、８８％、９２％及び９６％の感度値で検出した。これらの結果は、ＨＡ試験が膀胱癌患者を腫瘍のグレード又はステージに拘わらず、検出することを実証する。（ｂ）ＨＡアーゼ試験：感度測定のために、ＨＡアーゼレベルに関して１０ｍＵ／ｍｇタンパク質を最低カットオフ限界として設定した。膀胱癌患者はそれぞれ研究Ａと研究Ｂとからの１２１人と３６人のＴＣＣ患者を包含する。表１３：腫瘍グレードによるＨＡアーゼ試験の感度。５人のＧ１膀胱癌（ＢＣａ）患者はＨＡアーゼレベル＞１０ｍＵ／ｍｇを有した。これらの患者は偽陽性と考えられ、特異性測定に含めた。さらに、２人のＧ１Ｔａ患者はカットオフ限界（１０ｍＵ／ｍｇタンパク質）と同じ尿中ＨＡアーゼ値を有した。患者のＧ１カテゴリーは４０人のＧ１Ｔａ患者と、１人のＧ１Ｔ１患者とを包含した。表１４：腫瘍ステージによるＨＡアーゼ試験の感度。Ｇ３腫瘍のサブクラスであるＣＩＳを除いた高グレード腫瘍（Ｇ２＋Ｇ３）に関して、感度値を算出する。表１３に示すように、ＨＡアーゼ試験はＧ１、Ｇ２及びＧ３膀胱腫瘍を１２．１％、８８％及び９１．３％の感度値で検出した。これは、ＨＡアーゼ試験が選択的に中グレード〜高グレード膀胱腫瘍（≧Ｇ２）を検出したことを示唆した。しかし、表１４に示した結果は、ＨＡアーゼ試験が全てのステージの高グレード膀胱腫瘍を非常に類似した感度で検出することを示す。例えば、ＨＡアーゼ試験はステージＴａ、Ｔ１、Ｔ２＋及びＣＩＳの高グレード膀胱腫瘍をそれぞれ８５％、８７．６％、９１％及び８８％の感度で検出した。このことは、ＨＡアーゼ試験が高グレード腫瘍を侵潤（ステージＴａ又はＴ１）の前に高い感度で検出することができ、ＨＡアーゼ試験をこれらのクラスの膀胱腫瘍の早期検出に用いることができることを示唆する。これらの結果は、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験をスクリーニング試験として用いて、膀胱癌患者を検出して、そのグレードを評価することができることを実証する。ＨＡ試験は膀胱癌患者を腫瘍のグレードに拘わらず、検出する；ＨＡアーゼ試験は高グレード膀胱癌患者を選択的に検出する。膀胱癌患者の生残率(survival)を改良するためのキーは、高グレード膀胱癌患者を侵潤の前に早期に検出することである。現在の検出形式によると、低ステージ（Ｔａ）であるＧ３腫瘍を検出する確率は非常に低い。しかし、ＨＡアーゼ試験は高グレード、低ステージ腫瘍と高グレード、高ステージ腫瘍の両方を検出するために同じように敏感である。さらに、ＨＡアーゼ試験はＣＩＳ（前侵潤性(pre-invasive)であるが、高度に攻撃的である、Ｇ３腫瘍のサブクラス）をも高感度で検出する。したがって、スクリーニング試験としてＨＡアーゼ試験を用いると、侵潤性疾患の発生の前に、高グレード膀胱癌患者を早期に検出することができる。それ故、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験を組合せて用いることは、膀胱癌患者のスクリーニングと、高グレード腫瘍の早期検出とを簡単で、安価な、非侵襲性方法で可能にする。それ故、このようなスクリーニングは一般に膀胱癌患者、特に高グレード膀胱癌患者の予後を改良することができる。この研究に含まれる膀胱癌患者の大部分が膀胱のＴＣＣを有するが、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験が盲検（研究Ｂ）に含まれた腺癌（ｎ＝３）と偏平上皮癌（ｎ＝１）患者の全てをも検出したことに注目することが重要である。したがって、ＨＡ −ＨＡアーゼ試験は膀胱の他の稀な悪性腫瘍を検出することにも有用でありうる。特異性試験：ＨＡ−ＨＡアーゼ試験の特異性を評価するために、発明者は正常で健康な被験者(volunteer)と、他のＧＵ症状を有する患者の両方を検査した。研究Ａでは、特異性試験に７０人を含めた。これらの７０人は２２人の正常者と、４８人の膀胱癌以外のＧＵ症状を有する患者とを包含した。ＧＵカテゴリーは前立腺癌（ｎ＝１０）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ、ｎ＝８）、腎結石（ｎ＝５）、膀胱炎（ｎ＝１２）、尿路感染症（ｎ＝８）、前立腺炎（ｎ＝２）、副睾丸炎（ｎ＝１）及び腎臓外傷（ｎ＝２）を有する患者を包含した。上述したように、ＨＡ試験とＨＡアーゼ試験の特異性はそれぞれ８８．６％と８８．７％とであった。ＨＡアーゼ試験の特異性を評価するためには、Ｇ１疾患を有する患者（ｎ＝３５）を計算に含めた。盲検であった研究Ｂでは、特異性試験は１２４人（正常者１５人、膀胱癌以外のＧＵ症状を有する患者９９人、膀胱癌の病歴を有するが試験の時点ではこの疾患の膀胱鏡検査による証拠を有さない患者１０人）を包含した。ＧＵカテゴリーは前立腺癌（ｎ＝３７）、根治的前立腺切除後（ｎ＝１２）、腎臓／尿管／尿道癌（ｎ＝６）、ＢＰＨ（ｎ＝１７）、尿管／腎臓／膀胱結石（ｎ＝５）、睾丸癌（ｎ＝２）、尿路感染症（ｎ＝５）、血尿（ｎ＝２）、膀胱炎（ｎ＝３）、性交不能（ｎ＝２）、尿閉症（ｎ＝１）、失禁（ｎ＝１）、腎痛痛（ｎ＝１）、尿道狭窄（ｎ＝１）、精のう炎(seminal vesiculitis)／前立腺炎／副睾丸炎（ｎ＝３）、膀胱頚部攣縮(bladder neck contraction)（ｎ＝１）、陰のう血腫（ｎ＝１）及び精管切除（ｎ＝１）を有する患者を包含した。上述したように、研究Ｂでは、ＨＡ試験とＨＡアーゼ試験との特異性は、それぞれ、９１．１％と９１．２％であった。ＨＡアーゼ試験の特異性を評価するために、Ｇ１疾患を有する患者（ｎ＝６）を計算に含めた。要約すると、ＨＡ試験は膀胱癌を腫瘍のグレードに関係なく検出する。しかし、ＨＡアーゼ試験は高グレード膀胱癌を選択的に検出する。したがって、両分析を同時におこなうことによって、膀胱癌をスクリーニングして、そのグレードを判断することができる。さらに、盲検（即ち、研究Ｂ）では、ＨＡ試験とＨＡアーゼ試験の両方は、一緒にしたときに、４１人の膀胱癌患者のうちの２人のみを当てそこなっただけであった。したがって、一緒にしたＨＡ−ＨＡアーゼ試験の総感度（９５％）は個々のＨＡ試験（９２．５％）とＨＡアーゼ試験（９２．５％）それぞれよりもやや良好であった。ＨＡ−ＨＡアーゼ試験とＢＡＲＤＢＴＡ及びＮＭＰ２２^TMとの比較：同じような複数の評論科学ジャーナルに発表されたレポートによると、ＢＴＡ試験とＮＭＰ２２^TM試験の両方は、膀胱癌の再発を検出するための膀胱癌患者のフォローアップに用いられている。これらの試験はスクリーニング試験としては用いられていない。上述したように、マルチセンター試験(multi-center trial) において、Ｓａｒｏｓｄｙ等は、腫瘍のグレードに拘わらず、膀胱癌を検出するためのＢＴＡ試験の総感度は〜４０％であったと報告している。膀胱癌の病歴を有する９０人の患者の研究では、ＮＭＰ２２^TMは３３件の膀胱癌再発のうち２３件を検出した（総感度７０％）。さらに、ＮＭＰ２２^TMは侵潤性疾患を有する全ての膀胱癌患者を検出した。ＢＴＡ及びＮＭＰ２２^TMとのＨＡ−ＨＡアーゼ試験の比較を表１５と１６に示す。表１５と１６に示すように、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は膀胱癌の検出における感度、特異性及び罹患率関連パラメーター(prevalence related parameter)に関してＢＴＡ又はＮＭＰ２２^TM試験のいずれよりも良好である。表１５：感度と特異性とに関する、ＢＴＡ、ＮＭＰ２２^TM及びＨＡ−ＨＡアーゼ試験の比較。ＢＴＡ研究“ａ”は４９９人の患者を含み、研究“ｂ”は６０人の患者を包含した。ＮＭＰ２２^TM研究は９０人の患者を含み、ＨＡ−ＨＡアーゼ研究は３５６人の患者を包含した。^a Ｓａｒｏｓｄｙ等，「再発膀胱癌をモニターし、診断するためにＢＴＡ試験を用いたマルチセンター試験の結果」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：３７９〜３８４，１９９５。^b Ｄ’ＨａｌｌｅｗｉｎとＢａｅｒｔ，「表在的膀胱癌における膀胱腫瘍抗原試験の初期評価」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５５：４７５〜４７６，１９９５。^c Ｓｏｌｏｗａｙ等，「手術治療後の尿路の潜在性又は迅速再発性移行上皮癌の検出における新規な腫瘍マーカーＮＭＰ２２の使用」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５６：３６３〜３６７，１９９６。表１６：罹患率関連パラメーターに関する、ＢＴＡ、ＮＭＰ２２^TM及びＨＡ− ＨＡアーゼ試験の比較。ＢＴＡ研究は４９９人の患者を含み、ＮＭＰ２２^TM研究は９０人の患者を含み、ＨＡ−ＨＡアーゼ研究は３５６人の患者を包含した。ＰＰＶ：陽性予測値(positive predictive value)；ＮＰＶ：陰性予測値 (negative predictive value)。^a Ｓａｒｏｓｄｙ等，「再発膀胱癌をモニターし、診断するためにＢＴＡ試験を用いたマルチセンター試験の結果」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５４：３７９〜３８４，１９９５。^b Ｓｏｌｏｗａｙ等，「手術治療後の尿路の潜在性又は迅速再発性移行上皮癌の検出における新規な腫瘍マーカーＮＭＰ２２の使用」，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５６：３６３〜３６７，１９９６。発明者が膀胱癌の病歴を有する１０人の患者を再発をモニターするために１年間フォローした研究において、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験はこの研究における６件の再発を全て検出した（総感度１００％）。実際に、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は、腫瘍の膀胱鏡検出の３〜６か月前に４件の再発を検出した。したがって、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は、スクリーニング試験であるばかりでなく、腫瘍再発をモニターするために用いることができる。ＴＣＣ以外の膀胱癌の分析：周知であるように、ＴＣＣは膀胱腫瘍の大部分（９０〜９５％）を成す。偏平上皮癌と腺癌とが残りの膀胱腫瘍を占める。発明者は腺癌からの３サンプルと偏平上皮癌患者からの１サンプルとを分析した。これらの腫瘍の全てはＨＡ−ＨＡアーゼ試験によって検出された。これは、本発明のＨＡ−ＨＡアーゼ試験があらゆるタイプの膀胱腫瘍を検出することができることを意味する。実施例５．ＨＡ−ＨＡアーゼ尿試験による、膀胱癌の治療効力と再発とのモニターリング研究＃１では、発明者は、２５人の膀胱癌患者の治療前と治療後との尿中ＨＡレベル及びＨＡアーゼレベルを比較した。これらの結果を膀胱鏡検査及び細胞学と比較した。根治的膀胱切除を受けた患者（ｎ＝１３）に関して、ＨＡ（３９５．６±１０６）とＨＡアーゼ（３３±５．４）の両方の手術前の高いレベルは、８人では正常値に戻った（Ｐ＜０．００２５）。残りの５人の患者のうちの４人では、高い尿中ＨＡレベル及びＨＡアーゼレベルは１／２〜１／５に低下した。膀胱スペアリング療法(bladder sparing treatment)を受けた患者（ｎ＝１２）では、高い治療前ＨＡレベルとＨＡアーゼレベルは、それぞれ、２８１±１００と３３．５±４．５であった。これらのレベルは、部分的膀胱切除を受けた３人の患者のうちの２人では正常値に戻り、そのレベルが低下しなかった１人の患者は６か月目に再発を示した。ＴＵＲＢＴ＋膀胱内治療を受けた７人の患者では、尿中ＨＡレベル及びＨＡアーゼレベルが３人の患者において正常値に戻り、これらの患者のうちの２人は１年目に腫瘍を有さない。７人の患者のうちの４人では、尿中ＨＡレベル及びＨＡアーゼレベルが正常値に戻らず、これらのうちの３人は３〜９か月目に再発を示し、４人目の患者は固執的な腫瘍を有した。２人の患者はＴＵＲＢＴのみを受けた；１人の患者の高いＨＡレベル及びＨＡアーゼレベルは低下せず、腫瘍が６か月目に再発した。他方の患者は正常化し、１年目には腫瘍を有さない。発明者は膀胱癌の病歴を有する１０人の患者をもモニターして、再発のモニターリングにおけるＨＡ−ＨＡアーゼ試験の有用性を評価した。ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は、膀胱癌再発を有した６人の患者の全てを同定した。ＨＡ −ＨＡアーゼ試験は、腫瘍の膀胱鏡検査による検出の３〜６か月前に４人の患者における癌の再発を検出した。研究＃２では、膀胱癌再発を検出するためのＨＡ−ＨＡアーゼ試験の効力を二重盲検方法で評価した。膀胱癌の既知病歴を有する６０人の患者から回収された７１連続尿サンプルをＨＡ−ＨＡアーゼ試験によって検査し、結果を膀胱鏡検査、膀胱腫瘍の経尿道切除（ＴＵＲＢＴ）又は膀胱切除からの同時所見(concurren t findings)と比較した。再発の臨床証拠を示した５０人の患者のうち、４４人はＨＡ−ＨＡアーゼ試験によって、８８％の総感度（偽陰性率１２％）と８４．５％の精度で検出された。初期膀胱スペアリング療法後の３か月間〜１年間１８人の膀胱癌患者をモニターすることによって、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験の精度をさらに評価した。この患者グループでは、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は４２件の再発エピソードのうちの３９件を９２．９％の総感度（偽陰性率７．１％）で検出した。５人の偽陽性者のうち、結局、再発は３例において３〜６か月後に確認された。これらの研究は、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験が治療効力と腫瘍再発とをモニターするために有用であることを示す。結論として、ＨＡ−ＨＡアーゼ試験は膀胱癌発生と再発の両方をモニターするために高感度で、高特異性の非侵襲性方法である。本発明をその実施態様に関して、詳細に説明したが、上述し、特許請求した本発明の要旨及び範囲から逸脱せずに種々な変化及び変更がなされうることは、当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブロック，ノーマン，エル. アメリカ合衆国33156 フロリダ州マイアミ，エス．ダブリュ．セブンティセカンドアベニュー 11900 (72)発明者ファム，ヘンリー，ティ. アメリカ合衆国33180 フロリダ州マイアミ，エヌ．イー．ワンハンドレッドアンドナインテイスストリート 3060

Claims

【特許請求の範囲】１．膀胱癌をスクリーニングする方法であって、次の工程：（ａ）膀胱癌を有すると疑われるヒトからサンプルを得る工程と；（ｂ）サンプル中のヒアルロン酸量を定量し、標準化する工程と；（ｃ）ヒアルロン酸の標準化量を、膀胱癌の存在に関するヒアルロン酸のカットオフ限界と比較することによって、ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界よりも大きいときに、前記ヒトを膀胱癌の大きい危険性を有すると同定する工程とを含む上記方法。２．サンプルが胆汁、血液、血漿、血清、組織抽出物、尿及び組織洗浄流体から成る群から選択される、請求項１記載の方法。３．膀胱癌を治療されたヒトからサンプルが得られ、ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界より大きいことが、該ヒトが膀胱癌の再発の大きな危険状態にあることを示す、請求項１記載の方法。４．サンプル中のヒアルロン酸が酵素分析、イムノアッセイ、ラジオアッセイ、及び競合的結合分析から成る群から選択される分析によって定量される、請求項１記載の方法。５．サンプル中のヒアルロン酸が次の工程：（１）ヒアルロン酸によってサポートを被覆する工程と；（２）ヒアルロン酸結合性タンパク質をサンプルの存在下でサポートと接触させて、サポートを被覆するヒアルロン酸とサンプル中のヒアルロン酸とをヒアルロン酸結合性タンパク質への結合に関して競合させる工程と；（３）サポートに結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量の測定に基づいて、サンプル中のヒアルロン酸量を算出する工程とを含む分析によって定量される、請求項１記載の方法。６．結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量が酵素結合分析によって測定される、請求項５記載の方法。７．ヒアルロン酸量がヒトの水分補給状態に基づいて標準化される、請求項１記載の方法。８．ヒアルロン酸量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項１記載の方法。９．ヒアルロン酸のカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロン酸約１００ｎｇである、請求項８記載の方法。１０．膀胱癌が移行上皮癌、偏平癌及び腺癌から成る群から選択される、請求項１記載の方法。１１．次の工程：（ｄ）サンプル中のヒアルロニダーゼ量を定量し、標準化する工程と；（ｅ）ヒアルロニダーゼの標準化量を、膀胱癌の存在に関するヒアルロニダーゼのカットオフ限界と比較することによって、ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界よりも大きく、かつヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界よりも小さいときに、ヒトを低グレード膀胱癌を有すると同定する工程とをさらに含む、請求項１記載の方法。１２．ヒアルロニダーゼ量がヒトの水分補給状態に基づいて標準化される、請求項１１記載の方法。１３．ヒアルロニダーゼ量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項１１記載の方法。１４．ヒアルロニダーゼのカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロニダーゼ約１０ｍＵである、請求項１３記載の方法。１５．次の工程：（ｄ）サンプル中のヒアルロニダーゼ量を定量し、標準化する工程と；（ｅ）ヒアルロニダーゼの標準化量を、膀胱癌の存在に関するヒアルロニダーゼのカットオフ限界と比較することによって、ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界よりも大きく、かつヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界よりも大きいときに、ヒトを中グレード又は高グレード膀胱癌を有すると同定する工程とをさらに含む、請求項１記載の方法。１６．ヒアルロニダーゼ量がヒトの水分補給状態に基づいて標準化される、請求項１５記載の方法。１７．ヒアルロニダーゼ量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項１５記載の方法。１８．ヒアルロニダーゼのカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロニダーゼ約１０ｍＵである、請求項１５記載の方法。１９．膀胱癌のスクリーニング方法であって、次の工程：（ａ）膀胱癌を有すると疑われるヒトからサンプルを得る工程と；（ｂ）サンプル中のヒアルロニダーゼ量を定量し、標準化する工程と；（ｃ）ヒアルロニダーゼの標準化量を、膀胱癌の存在に関するヒアルロニダーゼのカットオフ限界と比較することによって、ヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界よりも大きいときに、前記ヒトを膀胱癌の大きい危険性を有すると同定する工程とを含む上記方法。２０．サンプルが胆汁、血液、血漿、血清、組織抽出物、尿及び組織洗浄流体から成る群から選択される、請求項１９記載の方法。２１．膀胱癌を治療されたヒトからサンプルが得られ、ヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界より大きいことが、該ヒトが膀胱癌の再発の大きな危険状態にあることを示す、請求項１９記載の方法。２２．サンプル中のヒアルロニダーゼが酵素分析、イムノアッセイ、ラジオアッセイ、及び競合的結合分析から成る群から選択される分析によって定量される、請求項１９記載の方法。２３．サンプル中のヒアルロニダーゼが次の工程：（１）ヒアルロン酸によってサポートを被覆する工程と；（２）サンプル中のヒアルロニダーゼがサポートを被覆するヒアルロン酸の少なくとも一部を分解する条件下で、サンプルをサポートと接触させる工程と；（３）ヒアルロン酸結合性タンパク質をサポート上の残留ヒアルロン酸に結合させる工程と；（４）固体サポートに結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量の測定に基づいて、サンプル中のヒアルロニダーゼ量を算出する工程と、を含む分析によって定量される、請求項１９記載の方法。２４．結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量が酵素結合分析によって測定される、請求項２３記載の方法。２５．ヒアルロニダーゼ量がヒトの水分補給状態に基づいて標準化される、請求項１９記載の方法。２６．ヒアルロニダーゼ量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項１９記載の方法。２７．ヒアルロニダーゼのカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロニダーゼ約１０ｍＵである、請求項２６記載の方法。２８．膀胱癌が移行上皮癌、偏平癌及び腺癌から成る群から選択される、請求項１９記載の方法。２９．次の工程：（ｄ）サンプル中のヒアルロン酸量を定量し、標準化する工程と；（ｅ）ヒアルロン酸の標準化量を、膀胱癌の存在に関するヒアルロン酸のカットオフ限界と比較することによって、ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界よりも小さいときに、ヒトを中グレード又は高グレード膀胱癌を有すると同定する工程とをさらに含む、請求項１９記載の方法。３０．ヒアルロン酸量がヒトの水分補給状態に基づいて標準化される、請求項２９記載の方法。３１．ヒアルロン酸量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項２９記載の方法。３２．ヒアルロン酸のカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロン酸約１００ｎｇである、請求項３１記載の方法。３３．膀胱癌をグレードによって識別する方法であって、次の工程：（ａ）膀胱癌を有すると疑われるヒトからサンプルを得る工程と；（ｂ）サンプル中のヒアルロン酸量を定量し、標準化する工程と；（ｃ）サンプル中のヒアルロニダーゼ量を定量し、標準化する工程と；（ｄ）ヒアルロン酸の標準化量を膀胱癌の存在に関するヒアルロン酸のカットオフ限界と比較する工程と；（ｅ）ヒアルロニダーゼの標準化量を膀胱癌の存在に関するヒアルロニダーゼのカットオフ限界と比較する工程と；（ｆ）ヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界よりも大きく、かつヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界よりも小さいときに、該ヒトを低グレード膀胱癌を有すると同定する、又はヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界よりも大きいときに、該ヒトを中グレード又は高グレード膀胱癌を有すると同定する工程とを含む上記方法。３４．膀胱癌を治療されたヒトからサンプルが得られ、サンプル中のヒアルロン酸の標準化量がヒアルロン酸のカットオフ限界より大きいことが、該ヒトが膀胱癌の再発の大きな危険状態にあることを示す、請求項３３記載の方法。３５．膀胱癌を治療されたヒトからサンプルが得られ、サンプル中のヒアルロニダーゼの標準化量がヒアルロニダーゼのカットオフ限界より大きいことが、該ヒトが膀胱癌の再発の大きな危険状態にあることを示す、請求項３３記載の方法。３６．標準化がヒトの水分補給状態又はサンプルのタンパク質濃度に基づいておこなわれる、請求項３３記載の方法。３７．ヒアルロン酸のカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロン酸約１００ｎｇである、請求項３３記載の方法。３８．ヒアルロニダーゼのカットオフ限界がサンプル中のタンパク質１ｍｇにつきヒアルロニダーゼ約１０ｍＵである、請求項３３記載の方法。３９．ヒアルロン酸又はヒアルロニダーゼの量を標準化する方法であって、下記工程：（ａ）サンプルを得る工程と；（ｂ）サンプル中のヒアルロン酸又はヒアルロニダーゼの量を定量する工程と；（ｃ）サンプル中のヒアルロン酸又はヒアルロニダーゼの量を標準化する工程とを含む上記方法。４０．流体サンプルが腹水、胆汁、血液、脳脊髄液、リンパ液、腹腔浸出液、血漿、精液、血清、滑液、組織抽出物、尿、硝子体液、及び組織洗浄流体から成る群から選択される、請求項３９記載の方法。４１．ヒアルロン酸又はヒアルロニダーゼの量がサンプルのタンパク質濃度に基づいて標準化される、請求項３９記載の方法。４２．膀胱癌を検出するための診断キットであって、（ａ）ヒアルロン酸、（ｂ）ヒアルロン酸結合性タンパク質、及び（ｃ）生物学的流体のサンプル中のヒアルロン酸及び／又はヒアルロニダーゼを定量するために適した補助試薬を含み、構成要素（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が別々の容器に入って備えられる上記キット。４３．ディップスティック試験デバイスの形状である、請求項４２記載の診断キット。４４．ＥＬＩＳＡ様試験デバイスの形状である、請求項４２記載の診断キット。４５．ヒアルロニダーゼｐ６５又はｐ５５の富化画分を含む組成物。４６．請求項４５記載のヒアルロニダーゼｐ６５又はｐ５５によって生じたヒアルロン酸フラグメントを含む組成物。４７．請求項４５記載のヒアルロニダーゼｐ６５又はｐ５５に対する抗体を含む組成物。４８．膀胱癌のスクリーニング方法であって、次の工程：（ａ）膀胱癌を有すると疑われるヒトからサンプルを得る工程と、（ｂ）サンプル中のヒアルロン酸及び／又はヒアルロニダーゼを分離して、サイズプロフィルを得る工程と、（ｃ）サイズプロフィルに基づいて該ヒトを膀胱癌の大きい危険性を有すると同定する工程とを含む上記方法。４９．膀胱癌を有するヒトの尿から得られたヒアルロン酸の富化画分を含む組成物。５０．次の工程：（ａ）細胞培養物を得る工程と、（ｂ）細胞の増殖を誘導する条件下で該培養物に請求項４９記載のヒアルロン酸を加える工程とを含む細胞増殖分析。５１．請求項５０記載の細胞増殖を薬物によって阻害する工程を含む薬物スクリーニング分析。５２．膀胱癌のスクリーニング方法であって、次の工程：（ａ）膀胱癌を有すると疑われるヒトからサンプルを得る工程と、（ｂ）細胞培養物に該サンプルを加える工程と、（ｃ）細胞培養物の増殖によって、該ヒトを膀胱癌の大きい危険性を有すると同定する工程とを有する上記方法。