JP2010281799A - 癌の悪性度の検知方法及び癌の悪性度の診断剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】癌組織の細胞質内に存在するヘパラン硫酸糖鎖分子中のGlcA−GlcNH3 +構造の存在の程度を検出するステップを含む、癌の悪性度の検知方法。
【選択図】図4
Description
また、染色体やDNAを指標に癌の悪性度を判別する方法も知られているが(特許文献1、特許文献2)、ハイブリダイゼーション等の操作が必要であり、迅速性・簡便性等の面で改善の余地がある。
また、特定のN型糖鎖を指標として膀胱癌の悪性度を診断する方法(特許文献3)や、ヘパラン硫酸プロテオグリカン遺伝子を包含する多種類の遺伝子群のなかから選択された少なくとも8種類の遺伝子の発現量を評価することによる胃癌の悪性度の評価方法(特許文献4)も知られているが、ヘパラン硫酸糖鎖自体を指標とするものではない。
(ただし、前記構造におけるGlcAはD−グルクロン酸残基を、GlcNH3 +はD−グルコサミン残基を、−はグリコシド結合をそれぞれ示す。以下同じ。)
この検出は、免疫組織染色法により行われることが好ましい。またその場合、ヘパラン硫酸糖鎖分子中のGlcA−GlcNH3 +構造の検出は、当該GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体を用いて行われることが好ましい。また、このような抗体はJM403抗体であることが好ましい。
また、検知の対象となる癌組織は、乳癌組織であることが好ましく、乳管癌組織であることがより好ましい。
また、本発明は、GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体を含む癌の悪性度の診断剤(以下、「本発明診断剤」という。)を提供する。ここで、GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体はJM403抗体であることが好ましく、癌は乳癌であることが好ましい。
本発明方法は、癌組織の細胞質内に存在するヘパラン硫酸糖鎖分子中のGlcA−GlcNH3 +構造の存在の程度を検出するステップを含む、癌の悪性度の検知方法である。
検知の対象となる癌組織は、特に限定はされないが、乳癌組織であることが好ましく、なかでも乳管癌組織であることが好ましい。
モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは特に制限されないが、IgMであることが好ましく、IgM, κ-chainであることがより好ましい。
モノクローナル抗体を得るための第一段階としては、抗体を産生する単クローンハイブリドーマを確立することが挙げられる。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細は実施例で示すが、簡単には次の3工程からなる。
1.免疫
2.細胞融合
3. ハイブリドーマの選択と単クローン化
免疫の工程で用いる抗原は、タンパク質とGlcA−GlcNH3 +そのもの、あるいはその繰り返し構造(GlcA−GlcNH3 +)n (ここでいうnは1以上の自然数)よりなる糖鎖、あるいはGlcA−GlcNH3 +そのもの、あるいはその繰り返し構造(GlcA−GlcNH3 +)n (ここでいうnは1以上の自然数)よりなる糖鎖を含む糖鎖とを化学的に結合させてなる物質が好ましい。上記タンパク質は、ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」という。)又はヘモシアニン(以下、「KLH」という。)であることが好ましい。
例えば、GlcA−GlcNH3 +またはその繰り返し構造とN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(以下、「SPDP」という)を反応させて、2−ピリジルジチオプロピニルGlcA−GlcNH3 +を得る。これをジチオスレイトール等の還元剤で還元し、チオール化GlcA−GlcNH3 +を得る。同様に、タンパク質とSPDPを反応させ、2−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質を得る。次に、チオール化GlcA−GlcNH3 +溶液と2−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質溶液を混合することによって、GlcA−GlcNH3 +とタンパク質間にSS結合を生成させ、GlcA−GlcNH3 +−SS−タンパク質を得る(以下、「GlcA−GlcNH3 +抗原」という)。
免疫される動物は豚、牛、マウス、ラット等の哺乳動物であることが好ましく、抗体産生細胞の相手となるミエローマ細胞がマウス由来のものであることが好ましいため、特にマウスが好ましい。例えば上記方法により調製したGlcA−GlcNH3 +抗原を哺乳動物に皮下注射することにより免疫を行うことができる。注射方法はこれに限らず、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバンとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有ればよいが、特に、TiterMAX Gold(シグマ社製)が良い。
最終免疫後にリンパ節或は脾臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供する。細胞融合に使用される腫瘍細胞株としてはミエローマ細胞が好ましく、通常、マウスのBALB/c
由来のP3 -NS-1/1-Ag4-1、P3 -X63-Ag8-U1(P3 U1)、P3 -X63-Ag8-653、SP2/0-Ag14 等を用いることができる。
ハイブリドーマの選択と単クローン化は下記に例示される方法により行うことができる。すなわち、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清を種々の分析法(例えばRIA法 、プラーク法、凝集反応法、ELISA法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法 等)でヘパラン硫酸糖鎖分子中のGlcA−GlcNH3 +に反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次に、得られたハイブリドーマについてクローニングを行う。クローニングの方法としてはFACS(Fluorescent Activated Cell Sorter )もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では96ウェルプレートの1ウェルあたり細胞が1個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは2回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。
このJM403抗体は生化学バイオビジネス株式会社から市販されており、その市販品をそのまま本発明方法に用いることもできる。
JM403抗体を用いる場合には、本発明方法は、「癌組織の細胞質内に存在する、JM403抗体に結合する抗原の存在の程度を検出するステップを含む、癌の悪性度の検知方法」と換言して理解することもできる。
++:癌細胞の50%以上が染色されている
+: 癌細胞の10%以上50%未満が染色されている
−: 染色されている癌細胞が10%未満である
本発明診断剤は、GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体を有効成分とする、癌の悪性度の診断剤である。
本発明診断剤の有効成分である、「GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体」についての説明は、前記<1>と同様である。すなわち、本発明検知方法において用いることができる抗体を、そのまま本発明診断剤の有効成分として用いることができる。当該抗体に標識物質が直接結合していてもよいことはいうまでもない。
本発明診断剤は、「GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体」を有効成分として含有している限りにおいて、さらに他の成分を含有してもよい。このような他の成分の一例としては、例えば試薬的に許容される安定化剤、保存剤、賦形剤等を例示することができる。
本発明診断剤は、「GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体」をそのまま、又は必要に応じてさらに前記のような他の成分を添加して、通常の試薬・製剤等の調製方法にしたがって製造することができる。
また本発明診断剤は、前記<1>における本発明検知方法に記載の方法にしたがって使用することができる。
さらに、他の構成成分として、例えば洗浄液、酵素反応停止液等を含んでもよい。また、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール(QCコントロール)を含有させることもできる。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。
悪性度の検知の対象として、60名の乳癌患者から外科手術により切除した乳管癌組織を用いた。この60名の年齢は27〜87歳(平均54.6歳)であり、その他の各種指標の内訳は以下のとおりであった。
(1)浸潤/非浸潤の別 非浸潤癌:5例、浸潤癌:55例
(2)T分類 T1:40例、T2:13例、T3:2例
(3)腋窩リンパ節転移 陽性17例、陰性38例
(4)ホルモンレセプター ER陽性:37例、PgR陽性:23例
(5)HER2過剰発現 あり:10例、なし:50例
(6)浸潤性癌の核グレード グレード1:22、同2:22例、同3:11例
核グレードは、日本乳癌学会編「乳癌取扱い規約 第16版」(金原出版株式会社)に記載された基準にしたがって判定した。
上記の乳管癌組織について、フォルマリン・パラフィン切片を作成した。免疫組織染色は、抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体であるJM403、10E4及びNAH46(いずれも生化学バイオビジネス株式会社販売)、並びに抗Ki−67抗体(MIB-1, Abcam社, Cambridge, UK))を用い、ABC法(Avidin-Biotin Complex法)によって行った。具体的には、以下のとおり行った。
次いで、この切片を0.1%のカゼインを含有するPBSで0.5から5マイクログラム/mlに希釈した一次抗体(JM403、10E4、NAH46又は抗Ki−67抗体)中でインキュベートした。インキュベートは、摂氏4度で一晩行った。その後、切片を0.05%のカゼインを含有するPBSで洗浄した。
次いでこの切片を、ビオチン標識化されたマウス免疫グロブリンに対するヤギのF(ab')
(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 中で30分間、室温でインキュベートした。その後、この切片を0.05%のカゼインを含有するPBSで洗浄した。
次いで、この切片をhorseradish peroxidase-streptavidin (Vectastain Elite ABC kit PK6100, Vector Laboratories Inc.)と反応させた。その後、この切片を0.05%のカゼインを含有するPBSで洗浄し、3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma)で染色して、さらにメチールグリーン溶液でカウンター染色を行った。
JM403:GlcA−GlcNH3 +構造
10E4:GlcA−GlcNS構造(GlcNSは、N−硫酸グルコサミン残基を示す)
NAH46:GlcA−GlcNAc構造(GlcNAcは、N−アセチルグルコサミン残基を示す)
(1)細胞質における免疫染色の程度
免疫組織染色後の切片標本を光学顕微鏡で観察し、細胞質が免疫染色された細胞の数をカウントし、以下のとおり免疫染色の程度を評価した。
++:乳癌細胞の50%以上が染色されている
+:乳癌細胞の10%以上50%未満が染色されている
−:染色されている乳癌細胞が10%未満である
乳管癌組織の切片標本をJM403、10E4又はNAH46で免疫組織染色した場合における、細胞質内の染色程度の分布(%)を表1に示す。表1から、JM403について陽性を示したもの(前記の「+」と「++」を合わせたもの)は、症例の約6割近くに及んだ。
なお、10E4で免疫組織染色したものについては、ほとんどが細胞膜のみ染色された。そこで、10E4で染色したものについては、細胞膜のみが染色されたものも含めてカウントした。
(3−1)浸潤性乳管癌について、上記の免疫染色の程度と、核異型度、核分裂指数、核グレード及び腋窩リンパ節転移の状況との関係をグラフ化した。
JM403で染色した場合の結果を図4に、10E4で染色した場合の結果を図5に、NAH46で染色した場合の結果を図6にそれぞれ示す。
またNAH46で染色した場合には、免疫染色の程度と腋窩リンパ節転移との間において有意な正の相関は認められなかった。
その結果、JM403で染色した場合のみ、細胞質の染色の程度と公知の悪性度の指標であるKi−67ラベリング・インデックスとの間に有意に強い正の相関が認められた。
なお以上のデータ解析において、独立性の検定にはカイ二乗検定を、平均値の差の検定にはウィルコクソン(Wilcoxon)の順位和検定を用いた。
Claims (8)
- 癌組織の細胞質内に存在するヘパラン硫酸糖鎖分子中のGlcA−GlcNH3 +構造の存在の程度を検出するステップを含む、癌の悪性度の検知方法。
(ただし、前記構造におけるGlcAはD−グルクロン酸残基を、GlcNH3 +はD−グルコサミン残基を、−はグリコシド結合をそれぞれ示す。) - 前記の検出が、免疫組織染色法により行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記の検出が、前記GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体を用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体が、JM403抗体である、請求項3に記載の方法。
- 癌組織が、乳癌組織である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体を含む、癌の悪性度の診断剤。
- 前記GlcA−GlcNH3 +構造に結合する抗体が、JM403抗体である、請求項6に記載の診断剤。
- 癌が乳癌である、請求項6または7に記載の診断剤。
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