BR112020023265A2 - uso para prevenir e tratar doenças relacionadas a células supressoras derivadas de mieloide - Google Patents
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Abstract
USO PARA PREVENIR E TRATAR DOENÇAS
RELACIONADAS A CÉLULAS SUPRESSORAS DERIVADAS DE MIELOIDE.
A presente invenção se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação ao
antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c o qual é expresso
em células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) e um uso do mesmo,
e, especificamente, a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno
do mesmo que se liga especificamente a CD66c, uma composição
farmacêutica ou uma composição de diagnóstico incluindo o mesmo. O
anticorpo anti-CD66c da presente invenção pode ser usado com utilização
para o tratamento de várias doenças, por alvejar MDSC, o qual pode
induzir a imunossupressão.
Description
SUPRESSORAS DERIVADAS DE MIELOIDE Campo da invenção
[001] A presente invenção se refere a um agente de aumento imunológico compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c, o qual é expresso em células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) e um uso de prevenção, melhoria ou tratamento para doenças relacionadas a MDSC usando o agente de aumento imunológico. Especificamente, a presente invenção fornece um uso de prevenção, melhoria ou tratamento, ou um uso de diagnóstico para doenças relacionadas com MDSC, regulando a produção, morte ou atividade com um anticorpo monoclonal, de modo a reduzir uma atividade imunossupressora de MDSC. Antecedentes da Invenção
[002] Os estudos de imunoterapia com anticorpos ou vacinas de células imunes têm sido recentemente realizados ativamente no tratamento do câncer. No entanto, a evasão imunológica e a ação de supressão das células cancerosas inibem os efeitos terapêuticos. As células cancerosas reduzem a atividade de várias células imunes com o objetivo de prevenir uma resposta imune a si mesmas e induzem células com funções de supressão imune, como células dendríticas inativas, células T reguladoras (Treg) e macrófagos associados a tumor (TAM). Como uma das células imunossupressoras, o papel das células supressoras derivadas do mieloide (MDSCs) tem recebido recentemente grande atenção.
[003] MDSC é definida como uma coleção de células da medula óssea imaturas derivadas da medula óssea com função imunossupressora. É relatado que elas são acumuladas no sangue periférico, órgãos linfáticos, baço e tecidos cancerosos em condições patológicas, como infecções crônicas / agudas e câncer, embora o número de MDSC seja limitado em indivíduos saudáveis.
[004] MDSC também pode promover o crescimento de células cancerosas e induzir metástases remotas de células cancerosas, inibindo a resposta imune de células T e células NK e induzindo a geração de células Treg que são células imunossupressoras.
[005] Os mecanismos de imunossupressão do MDSC conhecidos até agora podem ser divididos em quatro tipos principais. O primeiro é ser deficiente em nutrientes exigidos pelos linfócitos. A segunda é gerar estresse oxidativo, que inibe várias etapas, como a proliferação para função das células T, produzindo oxigênio ativo ou nitrogênio ativo. A terceira é afetar o tráfico e a sobrevivência dos linfócitos. Especificamente, os mecanismos como inibir o processo de recirculação das células T para os nódulos linfáticos, impedir o movimento das células T para o centro de um tumor e induzir a morte das células T são conhecidos. Em quarto lugar, é conhecido por proliferar células Treg naturais específicas do antígeno e promover o processo de conversão de células T CD4 + virgens em Tregs.
[006] Uma das maiores características do MDSC é sua diversidade em forma, fenótipo e função. Como os marcadores para MDSC, Lineage (-), HLA-DRLOW / (-), CD11b (+) e CD33
(+) são conhecidos. Uma vez que esses marcadores são comumente expressos em vários tipos diferentes de células mieloides, como células dendríticas, macrófagos e células precursoras de leucócitos granulares, o MDSC foi definido como um grupo de células derivadas de mieloides com funções de supressão imunológica. Essa diversidade de MDSC levou a diferentes análises no estudo das origens e características dos MDSCs, causando grande confusão no estudo. Assim, um estudo foi conduzido para esclarecer os subgrupos de MDSC, para descobrir atualmente que MDSC consiste em 80% de MDSCs granulocíticos e 20% de MDSC monocíticos. Esses dois tipos de células diferem não apenas na forma e no fenótipo, mas também no mecanismo de supressão da imunidade. O MDSC granulocítico induz imunossupressão antígeno-específica por meio do contato entre as células T via oxigênio ativo. O MDSC monocítico exibe função imunossupressora principalmente pelo uso de alta expressão de arginase e várias citocinas imunossupressoras.
[007] Estudos recentes relataram que o acúmulo de MDSC está envolvido no ambiente imunossupressor ocorrido em pacientes com câncer, o que é comum em quase todos os tipos de câncer. Muitos estudos afirmam que o grau de aumento do MDSC se torna maior à medida que o estágio do câncer progride. Assim, estudos para usar o grau de aumento de MDSC como um marcador de prognóstico para a baixa taxa de sobrevivência e taxa de resposta ao tratamento de pacientes com câncer estão em andamento. Parece claro que o MDSC desempenha um papel importante na fisiopatologia do câncer.
Problema técnico
[008] Uma concretização da presente invenção é um agente de aumento imunológico e agente de ativação imunológico ou uma composição para reduzir ou eliminar uma atividade imunossupressora de MDSC, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em célula supressora derivada de mieloide (MDSC).
[009] Uma concretização da presente invenção é uma composição farmacêutica ou um uso para prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas a MDSC compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em MDSC.
[0010] Uma concretização da presente invenção é um método para aumentar ou ativar uma resposta imune de um sujeito, compreendendo a administração de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em MDSC, ao sujeito em necessidade.
[0011] Uma concretização adicional da presente invenção é um método de inibir uma atividade de MDSC, compreendendo o contato de MDSC com um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em MDSC.
[0012] Além disso, uma concretização da presente invenção é um método de prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas a MDSC, compreendendo a administração de um agente de aumento imunológico, ou agente de ativação imunológica, a um sujeito com doença relacionada a MDSC.
[0013] Além disso, uma concretização da presente invenção é um método de prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas a MDSC, compreendendo a administração de um agente de aumento imunológico ou agente de ativação imunológica compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em células supressoras derivadas de mieloide, para um sujeito com doenças relacionadas a MDSC.
[0014] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em células supressoras derivadas de mieloide de acordo com a presente invenção, elimina ou reduz uma atividade imunossupressora de MDSC, diminui o número de MDSC, regula uma atividade, produção ou célula morte de MDSC, ou induz a morte celular. Solução técnica
[0015] A presente invenção se refere ao uso de intensificador imunológico, ativação imunológica ou redução ou eliminação de uma atividade imunossupressora de MDSC, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em MDSC.
[0016] Uma outra concretização da presente invenção se refere a um uso de prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas a MDSC, por exemplo, cânceres, doenças infecciosas e semelhantes, compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em MDSC.
[0017] Especificamente, a presente invenção se refere ao uso de prevenção, tratamento ou diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC, por indução da redução da atividade imunossupressora de MDSC.
[0018] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e pode ser um anticorpo de camundongo, anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado.
[0019] Outra concretização fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-CD66c ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0020] Outra concretização fornece um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico. O vetor recombinante pode ser usado como um vetor de expressão para expressar a molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[0021] Outra concretização fornece uma célula recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico ou o vetor recombinante. A célula recombinante pode ser obtida transformando a molécula de ácido nucleico ou o vetor recombinante em uma célula hospedeira.
[0022] Outra concretização fornece um método de preparação do anticorpo anti-CD66c ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O método de preparação pode incluir uma etapa de expressão da molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira. A etapa de expressão pode incluir a cultura das células recombinantes e, opcionalmente, pode ainda incluir a separação e / ou purificação do anticorpo da cultura de células obtida. O método pode incluir as seguintes etapas: (a) preparar uma célula recombinante transformada com a molécula de ácido nucleico ou o vetor recombinante; (b) cultivar a célula recombinante sob condições e / ou um período para expressão suficiente da molécula de ácido nucleico; e (c) separar e / ou purificar o anticorpo anti-CD66c ou seu fragmento de ligação ao antígeno da cultura obtida na etapa (c). Descrição Detalhada Da Invenção
[0023] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes.
[0024] Em uma concretização, o método de preparação se refere a uma composição para reduzir ou eliminar uma capacidade de supressão imunológica de MDSC, um agente de aumento imunológico ou um agente de ativação imunológica, incluindo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à CD66c expresso em MDSC.
[0025] MDSC é definida como uma coleção de células imaturas da medula óssea derivadas da medula óssea com função imunossupressora e é relatada como sendo acumulada no sangue periférico, órgãos linfáticos, baço, tecidos cancerígenos, etc., em condições patológicas, tal como infecções crônicas/agudas e câncer.
[0026] O MDSC promove o crescimento de células cancerosas, e, também, pode induzir metástases remotas de células cancerosas, inibindo a resposta imune de células T e células NK, e induzindo a geração de células Treg, que são células imunossupressoras. Os mecanismos de imunossupressão de MDSC conhecidos até agora são para esgotar os nutrientes exigidos pelos linfócitos, para afetar o tráfego e a sobrevivência dos linfócitos, para gerar estresse oxidativo, que inibe várias etapas, por exemplo a partir da proliferação para função das células T, produzindo oxigênio ativo ou nitrogênio ativo, para inibir a recirculação das células T para o gânglio linfático, ou para bloquear o movimento da célula T para o centro do tecido cancerígeno, e para induzir a morte celular de células T. Além disso, o MDSC é conhecido por proliferar células Treg naturais específicas do antígeno e promover o processo de conversão de células T CD4 + virgens em Tregs.
[0027] MDSC é definida como uma coleção de células da medula óssea imaturas derivadas da medula óssea com função imunossupressora. Embora o número seja limitado em indivíduos saudáveis, ela é acumulada no sangue periférico, órgãos linfáticos, baço e tecidos cancerígenos em condições patológicas como infecções crônicas / agudas e câncer. O acúmulo de MDSC e a função imunossupressora no carcinoma foram relatados em câncer de cólon, fibrossarcoma, timoma, câncer de pulmão, mesotelioma, linfoma, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, melanoma e semelhantes (Gabrilovich DI, et al., Coordinated regulation of myeloid cells by tumors, Nat Rev Immunol. 12(4):253-68 (2012)). Além dos cânceres, o acúmulo de MDSC é conhecido por induzir imunossupressão em infecções como Trypanosoma cruzi, Listeria monocytogenes, Leishmania major, helmintos, Candida albicans, Porphyromonas gingivalis e semelhantes, ou doenças de toxoplasmose e sepse polimicrobiana (Garbrilovich DI, et al. al., Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune systems. Nat Rev Immunol. 9(3):162-74 (2009)).
[0028] Na presente divulgação, MDSC que é um fenótipo de um HLA-DRLow / (-), CD11b + e CD33 + não linfático e expressa CD66c, pode ser um alvo do anticorpo anti-CD66c ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção. Particularmente, a presente invenção pode ter como alvo o acúmulo de MDSCs positivos para CD66c entre os MDSCs que é um fenótipo de um HLA-DRLow / (-), CD11b + e CD33 + não linfático e, assim, apresentar um plano para melhoria ou tratamento da deficiência de imunidade, diminuição da imunidade, dano à imunidade causado por MDSC. Por exemplo, MDSC pode ser designado designando região monocítica e regiões granulocíticas em referência ao tamanho da célula no gráfico de pontos, exceto linfócitos, selecionando grupos de nenhum ou menor nível de expressão de HLA-DR e selecionando grupos de CD11b e CD33 positivos.
[0029] A presente invenção pode fornecer uma composição farmacêutica ou um uso da mesma para prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas a MDSC, pelo uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c expresso em MDSC de acordo com a presente invenção.
[0030] O efeito de lise de MDSC pelo anticorpo anti- CD66c de acordo com a presente invenção pode induzir um número diminuído de células MDSC ou apoptose em células CEACAM6-positivas em sangue total e PMBC. De preferência, o anticorpo anti-CD66c pode induzir um número reduzido ou morte celular de uma maneira ADCC. No sangue total, os neutrófilos positivos para o antígeno alvo CEACAM6 e MDSC são misturados e, portanto, é difícil dizer que apenas os MDSCs são seletivamente lisados. No entanto, é possível realizar a lise seletiva de MDSC, utilizando o anticorpo anti-CD66c, em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas após a remoção do neutrófilo.
[0031] A doença relacionada ao MDSC é uma doença que exibe atividade imunossupressora pelo MDSC, e é uma doença em que o nível de MDSC positivo para CD66c está aumentado em comparação com o das células normais, que é um critério utilizado para determinar a doença. Por exemplo, o número ou a atividade de MDSCs CD66c-positivos em um sujeito com uma doença específica é de cerca de 200% ou mais, cerca de 300% ou mais, cerca de 500% ou mais, cerca de 700% ou mais, cerca de 1.000% ou mais , ou cerca de 1.500% ou mais, por exemplo, cerca de 200 a 5.000%, ou 200% a 3.000%, 200 a 1.500% e semelhantes, com base em 100% do número ou atividade de MDSCs CD66c-positivos por unidade de volume da amostra de sujeito normal correspondente. Por exemplo, o aumento no número de MDSCs pode ser determinado tomando amostras, como sangue de um sujeito suspeito de ter doenças relacionadas com MDSC e um sujeito normal, analisando o número de MSDCs na amostra com um citômetro de fluxo e comparando o número de MDSCs do sujeito suspeito de ter doenças relacionadas com MDSC, com aquele de sujeito normal. Especificamente, no sujeito com doenças relacionadas a MDSC, o número de MSDCs por unidade de volume de uma amostra (por exemplo, sangue) pode ser aumentado em comparação com o de um sujeito normal e, por exemplo, pode ser cerca de 200% ou mais, cerca de 300% ou mais, cerca de 500% ou mais, cerca de 700% ou mais, cerca de
1.000% ou mais, cerca de 1.500% ou mais, por exemplo, cerca de 200 a 5.000%, ou 200% a 3.000%, 200 a 1.500%, e semelhantes, com base em 100% do número ou atividade de MDSCs por unidade de volume da amostra do sujeito normal correspondente.
[0032] Especificamente, as doenças relacionadas a MDSC são, por exemplo, doenças em que MDSCs expressando CD66c entre as MDSCs mostrando o fenótipo de HLA-DRLow / (-), CD11b + e CD33 + não linfático estão aumentadas ou acumuladas ou doenças em que o número de MDSCs está aumentado em comparação ao das células normais. Os exemplos de doenças relacionadas com MDSC incluem infecções crônicas / agudas, cânceres e semelhantes, especificamente infecções crônicas / agudas, cânceres e semelhantes que mostram a atividade imunossupressora de MDSC. Por exemplo, as doenças podem ser infecções crônicas / agudas, cânceres e semelhantes em que MDSC positivo para CD66c entre os MDSCs que mostram o fenótipo de HLA-DRLow / (-) não linfático, CD11b + e CD33 + são acumulados.
[0033] As doenças infecciosas relacionadas ao MDSC podem ser infecções como Trypanosoma cruzi, Listeria monocytogenes, Leishmania major, helmintos, Candida albicans ou Porphyromonas gingivalis, ou doenças de toxoplasmose ou sepse polimicrobiana.
[0034] Por exemplo, o câncer relacionado a MDSC pode ser um câncer com aumento de MDSC positivo para CD66c e inclui câncer sólido e câncer hematológico. Os exemplos do câncer sólido incluem câncer de cólon, fibrossarcoma, timoma, câncer de pulmão, mesotelioma, linfoma, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de estômago, câncer de fígado ou câncer de mama, ou de preferência câncer de cólon, câncer de estômago ou câncer de fígado. O uso de prevenção, inibição ou tratamento de câncer e metástases de câncer pode, por exemplo, inibir o crescimento de células cancerosas. Exemplo de malignidade hematopoiética inclui leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin.
[0035] A presente invenção se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a CD66c expresso em MDSC. CD66c (Cluster de Diferenciação 66c) também é conhecido como CEACAM 6 (molécula de adesão celular 6 relacionada ao antígeno carcinoembriônico) ou NCA (antígeno de glicoproteína de reação cruzada não específica). É conhecida como uma proteína importante associada à adesão celular. CD66c pode ser preferencialmente representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (Genbank Protein No. AAH05008), mas não está limitado a ela.
[0036] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" significa uma substância produzida por estimulação de um antígeno no sistema imunológico e o tipo do mesmo não é particularmente limitado. O anticorpo pode ser gerado de uma maneira não natural, por exemplo, gerado de forma recombinante ou sintética. O anticorpo pode ser um anticorpo animal (por exemplo, anticorpo de camundongo, etc.), um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo hunamoo. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
[0037] O anticorpo anti-CD66c ou fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo específico de CD66c descrito acima e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos animais (por exemplo, anticorpos de camundongo), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno disso. O anticorpo animal pode ser derivado de uma espécie animal diferente da hunamoa, por exemplo, rato, camundongo, cabra, porquinho-da-índia, burro, coelho, cavalo, lama, camelo, pássaro (por exemplo, galinha, pato, etc.), mas não limitado a isso. As técnicas para a produção de anticorpos quiméricos e / ou anticorpos humanizados a partir de tais anticorpos animais são bem conhecidos no estado da técnica. O anticorpo humanizado pode ser qualquer isotipo adequado, como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE ou qualquer subclasse, de preferência isotipo IgG1 ou IgG2, ou mais preferencialmente isotipo IgG1 ou IgG2 desfucosilado.
[0038] Além disso, aqui, um anticorpo pode ser entendido como incluindo um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo com capacidade de ligação ao antígeno, a menos que especificado de outra forma. No presente relatório descritivo, o termo "regiões determinantes de complementaridade (CDR)" se refere a uma região do anticorpo que transmite a especificidade de ligação do anticorpo a um antígeno entre as regiões variáveis do anticorpo. O fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo descrito acima pode ser um fragmento de anticorpo compreendendo pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade. O termo "CDR (região determinante de complementaridade)" significa uma sequência de aminoácidos da região hipervariável da cadeia leve de areia da cadeia pesada de uma imunoglobulina. Cada uma da cadeia pesada e cadeia leve pode compreender três CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL1, CDRL2, CDRL3). Os CDRs podem fornecer resíduos de contato chave para o anticorpo se ligar a um antígeno ou epítopo. Por outro lado, na presente divulgação, os termos "ligar especificamente" ou "reconhecer especificamente" significa o mesmo que aqueles comumente conhecidos pelos versados na técnica.
[0039] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a um fragmento do mesmo para toda a estrutura de uma imunoglobulina e refere-se a uma porção de um polipeptídeo incluindo uma porção à qual um antígeno pode se ligar. Por exemplo, os fragmentos podem ser scFv, (scFv) 2, scFv-Fc, Fab, Fab' ou F(ab')2, mas não limitado aos mesmos.
[0040] O anticorpo anti-CD66c, de acordo com a presente invenção, reconhece e / ou liga-se especificamente a CD66c, e o anticorpo inclui um anticorpo de camundongo, anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado. O anticorpo quimérico na presente invenção é um anticorpo em que a sequência da região variável é derivada de uma espécie e a sequência da região constante é derivada de outras espécies, por exemplo, que a região variável é derivada de camundongo e a região constante é derivado de hunamoo. O anticorpo humanizado na presente invenção é um anticorpo que possui uma baixa imunogenicidade em hunamoos e uma atividade de anticorpo não hunamoo. Por exemplo, pode ser preparado mantendo a região CDR não hunamoa e substituindo o resto da região por homólogos hunamoos. Por exemplo, a literatura é referenciada: Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:
6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994).
[0041] O fragmento de anticorpo na presente invenção não é limitado, desde que reconheça especificamente o epítopo CD66c e inclua a região variável de uma cadeia leve (VL) e a região variável de uma cadeia pesada (VH). Pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv e CDR. Especialmente, scFv é um fragmento de anticorpo preparado como uma única cadeia conectando a região variável de uma cadeia pesada (VH) e a região variável de uma cadeia leve (VL) com um polipeptídeo ligante.
[0042] O termo "região de dobradiça" é uma região incluída na cadeia pesada de um anticorpo, existe entre as regiões CH1 e CH2 e refere-se a uma região para fornecer flexibilidade do local de ligação ao antígeno no anticorpo. Por exemplo, a dobradiça pode ser derivada de um anticorpo hunamoo e, especificamente, pode ser derivada de IgA, IgE ou IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0043] O anticorpo anti-CD66c pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal, como um anticorpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, ele pode ser fabricado usando uma técnica de exibição de fago.
[0044] Ao contrário dos anticorpos de camundongo ou anticorpos quiméricos, os anticorpos humanizados mostraram uma estabilidade 10 vezes maior do que os anticorpos 8F5 quiméricos em termos de estabilidade, além da característica diferente que reduz significativamente a causa da imunogenicidade quando administrados a humanos. Especificamente, a uma temperatura elevada, por exemplo, 62 ° C, o anticorpo tem uma estabilidade elevada porque a variabilidade da fluorescência contra o reagente ANS foi inferior a 200%.
[0045] Em condições severas específicas, devido a variações nas propriedades dos anticorpos, os anticorpos 8F5 quiméricos mostraram 1.406% de alteração de reatividade de ANS, enquanto os anticorpos humanizados mostraram alterações relativamente insignificantes de cerca de 114% e 133%, indicando que eram proteínas significativamente estabilizadas.
[0046] O anticorpo 8F5 quimérico e o humanizado aumentam a ativação das células T, o que também é mostrado no aumento da atividade das células T causado pelo ativador das células T e condições de atividade das células T devido à mistura de células dendríticas alogênicas e células T de diferentes pessoas. Esta indução de ativação de células T induz a morte de células cancerosas quando co-cultivadas com células cancerosas e ativação de células T sob condições de co-cultura com várias células cancerosas.
[0047] O anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção tem uma atividade de regressão tumoral e um efeito inibidor direto em linhas de células tumorais. Na presente divulgação, a regressão do tumor inclui induzir ou promover uma diminuição no tamanho de um tumor e / ou inibir, parar ou reduzir o crescimento de células tumorais. Por exemplo, a redução no tamanho do tumor significa que o tamanho do tumor obtido pela administração da composição que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo é 97% ou menos, 95% ou menos, 90% ou menos, 85% ou menos, 80% ou menos, e 75% ou menos, com base em 100% antes do tratamento da composição que compreende o anticorpo ou seu fragmento da presente invenção.
[0048] O anticorpo de acordo com a presente invenção tem citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e, de preferência, características de ADCC.
[0049] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode melhorar ou tratar doenças relacionadas a MDSC usando uma combinação de células assassinas naturais ou terapia de células derivadas de células NK.
[0050] Especificamente, o anticorpo anti-CD66c de acordo com a presente invenção aumenta a capacidade de matar células cancerosas por combinação com células assassinas naturais e, portanto, tem um excelente efeito de células NK ou agentes terapêuticos de células NK para a remoção eficaz não apenas de células cancerosas CEACAM6-positivas, mas também MDSCs CEACAM6-positivos.
[0051] Em um experimento específico, como resultado da medição da viabilidade celular usando o kit de viabilidade celular EZ-cytox (Daeil Lab), foi confirmado que o efeito de apoptose pela combinação com células natural killer foi maior em dois tipos de linhagens de células cancerígenas comparadas para o caso de tratamento único (Figs. 12a e 12b). De acordo com o resultado da lise seletiva de MDSC causado pelo anticorpo anti-CD66c da presente invenção, e o efeito da terapia de combinação do anticorpo anti-CD66c e células NK ou terapêutica de células NK, o anticorpo poderia remover alvos, incluindo células cancerígenas CEACAM6-positivas e MDSC CEACAM6-positivos.
[0052] O anticorpo anti-CD66c de acordo com a presente invenção mostra ADCC contra diferentes células alvo, como MDSC e células cancerosas, respectivamente. No caso de pacientes com câncer em que dois tipos de células são realmente aumentados juntos, o anticorpo anti-CD66c da presente invenção pode remover os dois tipos de alvos juntos e mostra maior eficácia de remoção simultânea de células cancerosas e alvos MDSC, em combinação com terapêutica de células NK.
[0053] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode remover parcial ou completamente a fucose como um resíduo de açúcar ligado ao anticorpo. O anticorpo de remoção de fucose da presente invenção tem uma atividade de apoptose de MDSC e, em uma concretização, o anticorpo da presente invenção tem uma atividade de apoptose de MDSC como uma forma de baixa fucose ou forma de fucose em comparação com uma forma de fucose de anticorpo, então quanto a ter alto aumento de imunidade. Tal como aqui utilizado, "fucose normal" ou "teor de fucose normal" refere-se a um anticorpo com um teor de fucose de pelo menos 90% tipicamente. A forma de baixa fucose ou afucose do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo com um teor de fucose de cerca de 10% ou menos, cerca de 7% ou menos, ou cerca de 5% ou menos, por exemplo, 0 a cerca de 10% , 0 a cerca de 7% ou 0 a cerca de 5%.
[0054] Especificamente, o anticorpo da presente invenção pode compreender as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs):
[0055] CDR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9,
[0056] CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10,
[0057] CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3,
[0058] CDR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12,
[0059] CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e
[0060] CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 13.
[0061] A região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na sequência estrutural (V-FR1) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, sequência estrutural (V-FR2) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, sequência de framework (V-FR3) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42, 43, 44, 45 , 46 ou 47, e sequência de framework (V-FR4) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.
[0062] A região variável da cadeia leve do anticorpo compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na sequência estrutural (L-FR1) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 29, 30 ou 31, sequência estrutural (L-FR2) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 38, 39, 40 ou 41, sequência de framework (L-FR3) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 48, 49, 50 ou 51, e sequência de framework (L- FR1) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 58, 59, 60 ou 61.
[0063] O anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 14, 15, 16, 17 ou 18, e uma região variável de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8, 19, 20 ou 21.
[0064] Um exemplo de um anticorpo de camundongo ou um anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo incluindo pelo menos um selecionado do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos de VH CDR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 a 3 e uma sequência de aminoácidos de VL CDR compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 a 6. Os CDRs e as regiões variáveis de um exemplo do anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico estão resumidos na Tabela 1 abaixo.
[0065] Especificamente, um exemplo do anticorpo da presente invenção pode incluir SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) como VH CDR e / ou SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3) como VL CDR.
[0066] O anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico pode compreender uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região VL incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0067] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, um kit ou um método de prevenção ou tratamento de uma doença relacionada a MDSC e um sintoma da mesma, compreendendo um anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico como ingrediente ativo.
[0068] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada a MDSC e um sintoma da mesma, compreendendo um anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico como um ingrediente ativo, por exemplo, um anticorpo anti-CD66c ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do anticorpo produzido por uma célula de hibridoma depositada como um número de acesso de KCLRF-BP-00230. A célula de hibridoma foi depositada na Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF) como '8F5' em 22 de fevereiro de 2010 e recebeu um número de acesso de KCLRF-BP-00230, que foi descrito em detalhes em KR 10-1214177.
[0069] A presente invenção pode preparar um anticorpo humanizado usando a sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD66c 8F5 no anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico e as sequências estruturais de humanos. Com base no grau de expressão, agregação e grau de ligação celular, os anticorpos humanizados que são expressos normalmente, são menos agregados devido à instabilidade da própria proteína e têm capacidade para se ligar a células-
alvo positivas para o antígeno semelhantes ao anticorpo quimérico. Especificamente, o perfil de ligação celular é semelhante ao do anticorpo quimérico e é obtido pela multiplicação da taxa positiva de positividade do anticorpo (% delimitada) pela fluorescência média (média), e em seguida, comparando com o anticorpo quimérico para selecionar os anticorpos candidatos dentro do faixa de ± 20% (Exemplo 2). Portanto, quando as sequências da região CDR do anticorpo de camundongo são inseridas na região estrutural do anticorpo hunamoo no momento da preparação do anticorpo humanizado, a capacidade de ligação do anticorpo preparado é rapidamente diminuída devido à alteração da estrutura da proteína original. Em consideração à diminuição da capacidade de ligação do anticorpo preparado, os anticorpos humanizados selecionados da presente invenção são anticorpos muito excelentes.
[0070] De preferência, cinco tipos de anticorpos humanizados recombinantes exibindo uma alta afinidade de ligação com base na capacidade de ligação celular em comparação com o anticorpo quimérico são selecionados e submetidos a ensaio de ligação para o antígeno CD66c e antígeno semelhante ao antígeno CD66 por ELISA.
[0071] Além disso, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção exibe excelente estabilidade em comparação com o anticorpo quimérico, por exemplo, um anticorpo com estabilidade que é refletida como variação de reatividade ANS de menos de 200%. A variação da reatividade ANS de menos de 200% é considerada uma variação muito pequena e o valor de variação superior a 200% pode ser interpretado como observação da reatividade ANS devido à mudança estrutural significativa da proteína. Consequentemente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem atividade de ligação ao antígeno e capacidade de ligação celular semelhantes ao anticorpo quimérico e a estabilidade física aumentada da própria proteína do anticorpo, que pode ser muito excelente em termos de drogabilidade do anticorpo terapêutico.
[0072] A variação de fluorescência do anticorpo contra o reagente ANS pode ser medida dividindo a diferença entre o valor de fluorescência medido em condição de baixa temperatura (por exemplo, 4 °C) e o valor de fluorescência medido em condição de alta temperatura (por exemplo, 62 °C), com o valor de fluorescência medido em condições de baixa temperatura.
[0073] Equação Matemática
[0074] Variação de fluorescência = (valor de fluorescência medido em condição de alta temperatura - valor de fluorescência medido em condição de baixa temperatura) / (valor de fluorescência medido em condição de baixa temperatura)
[0075] Como método de obtenção de uma variação de fluorescência específica do anticorpo, a reatividade do reagente ANS foi medida por um leitor fluorescente após ser deixado por 4 horas em uma condição de refrigeração (4 °C) e uma temperatura de 62 °C, e expressa como um valor de fluorescência e a variação de fluorescência podem ser obtidos usando a equação.
[0076] Exemplos do anticorpo humanizado, de acordo com a presente invenção, podem incluir uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que determinam as CDRs da região variável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 9 a 13. Os exemplos de anticorpo de camundongo e o anticorpo quimérico ma incluem uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que determinam as CDRs da região variável da cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 a 3 ou região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 a 6.
[0077] Especificamente, um exemplo de um anticorpo humanizado inclui uma sequência de aminoácidos determinando o CDR1 da região VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 9, uma sequência de aminoácidos determinando o CDR2 da região VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 10, e o CDR3 da região VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
[0078] Exemplos dos anticorpos humanizados incluem uma sequência de aminoácidos determinando o CDR1 da região VL incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 11 ou 12, uma sequência de aminoácidos determinando o CDR2 da região VL incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma sequência de aminoácidos determinando o CDR3 da região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 13.
[0079] Exemplos do anticorpo humanizado incluem uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NOs: 14 a 18 e uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste no aminoácido sequência de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 19-21, mas não inclui o anticorpo compreendendo SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.
[0080] As sequências CDR e sequências da região variável de acordo com um exemplo do anticorpo humanizado estão resumidas na Tabela 1 abaixo. [Tabela 1]. Nome SEQUÊNCIA SEQ ID NO 8F5-quimérico VH- ASGYSFTDYTMN 1 CDR1 8F5-quimérico VH- LINPFHGGTVSNQRFKV 2 CDR2 8F5-quimérico VH- VRGDPVRHYYALAY 3 CDR3 8F5-quimérico VL- GASENVYGTLN 4 CDR1 8F5-quimérico VL- GATNLAD 5 CDR2 8F5-quimérico VL- VATYYCQNVLSAPYT 6 CDR3 8F5-quimérico VH EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSF 7
VTVSS 8F5-quimérico VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENV 8
CQNVLSAPYTFGGGTKLEII 8F5-hunamo VH- ASGYSFTDYTMN 1 CDR1 8F5-hunamo VH- ASGYSFTDYTMH 9 CDR1 8F5-hunamo VH- INPFHGGTVSNQRFKV 2 CDR2
8F5-hunamo VH- LINPFGGSTSYAQKFKG 10 CDR2 8F5-hunamo VH- VRGDPVRHYYALAY 3 CDR3 8F5-hunamo VL- GASENVYGTLN 4 CDR1 8F5-hunamo VL- GASENVYGTLA 11 CDR1 8F5-hunamo VL- RASENVYGTLN 12 CDR1 8F5-hunamo VL- GATNLAD 5 CDR2 8F5-hunamo VL- VATYYCQNVLSAPYT 6 CDR3 8F5-hunamo VL- FATYYCQNVLSAPYT 13 CDR3 8F5-hunamo-VH5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSF 14
VTVSS 8F5-hunamo-VH6 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSF 15
VTVSS 8F5-hunamo-VH7 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSF 16
VTVSS 8F5-hunamo-VH10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSF 17
VTVSS 8F5-hunamo-VH11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSF 18
VTVSS 8F5-hunamo-VK5 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENV 19
8F5-hunamo-VK7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENV 20
CQNVLSAPYTFGGGTKLEIK 8F5-hunamo-VK8 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASENV 21
[0081] As sequências estruturais de um exemplo de um anticorpo humanizado, de acordo com a presente invenção são mostradas nas Tabelas 2 e 3 abaixo, em que o referido anticorpo pode incluir pelo menos um selecionado do grupo que consiste nas estruturas 1 a 4 da região variável da cadeia pesada e estruturas 1 a 4 da região variável da cadeia leve E pode ser um anticorpo compreendendo uma ou mais estruturas.
[0082] Especificamente, a sequência de aminoácidos da estrutura 1 da região variável da cadeia pesada pode compreender SEQ ID NOS: 23 a 27, a sequência de aminoácidos da estrutura 2 pode compreender SEQ ID NOS: 32 a 37 e a sequência de aminoácidos da estrutura 3 43 a 47, e a sequência de aminoácidos da Estrutura 4 pode incluir SEQ ID NOS: 53 a 57.
[0083] Na região variável da cadeia leve, a sequência de aminoácidos da Estrutura 1 pode compreender SEQ ID Nos: 29 a 31, a sequência de aminoácidos da Estrutura 2 pode compreender SEQ ID NOs: 39 a 41, e a sequência de aminoácidos da Estrutura 3 pode correspondem à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 49-51, e a sequência de aminoácidos da Estrutura 4 pode compreender as SEQ ID NOs: 59 a 61. As sequências da estrutura de acordo com exemplos do anticorpo humanizado são mostradas na tabela a seguir.
Tabela 2 Nome FR1 SEQ ID NO FR2 SEQ ID NO VH- EVQLQQSGPELVKPGAS 22 WVKQSHGKNLE 32 Quimérico MKISCK WIG VH5 QVQLVQSGAEVKKPGAS 23 WVRQAHGQNLE 33
VKISCK WIG VH6 QVQLVQSGAEVKKPGAS 24 WVKQAPGQNLE 34
MKISCK WIG VH7 QVQLVQSGAEVKKPGAS 25 WVRQAPGQGLE 35
MKISCK WIG VH10 QVQLVQSGAEVKKPGAS 26 WVKQAPGQNLE 36
VKVSCK WIG VH11 QVQLVQSGAEVKKPGAS 27 WVKQAPGQNLE 37
VKISCK WIG VL- DIQMTQSPASLSASVGE 28 WYQRKQGKSPQ 38 Quimérico TVTITC LLIY VK5 DIQMTQSPSTLSASVGD 29 WYQRKPGKAPK 39
RVTITC LLIY VK7 DIQMTQSPSTLSASVGD 30 WYQRKPGKAPK 40
RVTITC LLIY VK8 DIQMTQSPSTLSASVGD 31 WYQRKPGKAPK 41
RVTITC LLIY Tabela 3 Nome FR1 SEQ ID NO FR2 SEQ ID NO VH- NQRFKVKATLTVDVSSN 42 WGQGTSVTVSS 52 Quimérico TAYMELLSLTSDDSAVY
YCVR VH5 NQRFKVKATLTVDVSTN 43 WGQGTLVTVSS 23
YCVR VH6 NQRFKVKATLTVDVSTN 44 WGQGTLVTVSS 24
YCVR VH7 NQRFKVKATLTVDVSTN 45 WGQGTLVTVSS 55
YCVR VH10 NQRFKVKATMTVDVSTN 46 WGQGTLVTVSS 56
YCVR VH11 AQKFKGRVTMTRDTSTN 47 WGQGTLVTVSS 57
VL- GMSSRFSGSGSGRQYSL 48 FGGGTKLEII 58 Quimérico KISSLHPDD VK5 GVPSRFSGSGSGRQYSL 49 FGGGTKLEIK 59
KISSLHPDD VK7 GVPSRFSGSGSGTEYTL 50 FGGGTKLEIK 60
TISSLQPDD VK8 GMPSRFSGSGSGTEYTL 51 FGGGTKLEIK 61
[0084] O anticorpo humanizado pode compreender uma região VH selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 14 a 18 e uma região VL selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 19 a 21. Especificamente , os exemplos do anticorpo humanizado incluem um anticorpo (Vk8 + VH6) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, um anticorpo (Vk8 + VH11) compreendendo uma região VH incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, um anticorpo (Vk5 + VH7) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, um anticorpo (Vk7 + VH6) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, um anticorpo (Vk7 + VH10) comprisina ga região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, um anticorpo (Vk7 + VH7) compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 20, um anticorpo (Vk7 + VH5) compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, e um anticorpo (Vk8 + VH7) compreendendo uma região VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21. Combinações específicas e aminoácidos as sequências de ácido dos anticorpos são mostradas na Tabela 6 abaixo. Os exemplos preferidos de anticorpo incluem um anticorpo (Vk8 + VH6) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, um anticorpo (Vk8 + VH11) compreendendo uma região VH incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, um anticorpo (Vk5 + VH7) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, um anticorpo (Vk7 + VH6) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região VL compreendendo o amino sequência de ácido de SEQ ID NO: 20, e um anticorpo (Vk7 + VH10) compreendendo uma região VH incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[0085] O anticorpo anti-CD66c ou fragmento do mesmo pode ser acoplado a vários agentes de marcação, toxinas ou drogas antitumorais. Será evidente para os especialistas na técnica que o anticorpo da invenção pode ser acoplado a um agente de marcação, uma toxina ou um fármaco antitumoral por um método bem conhecido na técnica. Tal acoplamento pode ser conduzido quimicamente no local de fixação após a expressão do anticorpo ou antígeno. Alternativamente, o produto de acoplamento pode ser modificado no anticorpo ou antígeno da invenção ao nível do DNA. Subsequentemente, o produto pode ser expresso em um sistema hospedeiro adequado, conforme descrito aqui abaixo, e as proteínas expressas são coletadas e, se necessário, renaturadas. O acoplamento pode ser realizado por meio de um ligante que é conhecido no estado da técnica. Em particular, vários ligantes que liberam uma toxina ou um fármaco antitumoral sob condições ácidas ou redutivas ou mediante exposição a proteases específicas podem ser usados com esta tecnologia. Em algumas concretizaçãos, pode ser desejável que o ligante seja anexado ao agente de marcação, toxina ou droga antitumoral por meio de braços espaçadores em vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[0086] Um anticorpo para uma região determinante de antígeno de CD66c ou um fragmento do mesmo pode ser produzido usando um método típico com uma proteína CD66c, uma região determinante de antígeno de CD66c, uma porção de CD66c contendo uma região determinante de antígeno de CD66c, ou um célula que expressa uma região determinante de antígeno de CD66c servindo como um antígeno. Por exemplo, um método para a produção de um anticorpo anti-CD66c pode ser alcançado através de um método para a produção de uma linhagem celular que produz um anticorpo anti-CD66c, compreendendo (a)
injetar e imunizar um animal com uma proteína CD66c, uma região determinante de antígeno de CD66c, uma porção de CD66c contendo uma região determinante de antígeno de CD66c, ou uma célula que expressa uma região determinante de antígeno de CD66c, (b) obter esplenócitos que produzem um anticorpo específico para CD66c e (c) fundir os esplenócitos com células de mieloma para dar células de hibridoma e selecionar uma célula de hibridoma que produza um anticorpo para CD66c. O anticorpo pode ser isolado cultivando a linha celular in vitro ou introduzindo a linha celular in vivo. Por exemplo, a linhagem celular pode ser injetada intraperitonealmente em camundongos, seguido pelo isolamento e purificação do anticorpo da ascite. O isolamento e a purificação de anticorpos monoclonais podem ser conseguidos submetendo o sobrenadante da cultura e ascite a cromatografia de troca iônica (DEAE ou DE52) ou cromatografia de afinidade usando uma coluna anti-imunoglobulina ou coluna de proteína A.
[0087] A região determinante do antígeno à qual o anticorpo da presente invenção se liga exibe expressão específica de MDSC. Portanto, o anticorpo anti-CD66c pode não apenas ser usado de forma eficaz para detectar MDSC, mas também pode exercer citotoxicidade apenas em células tumorais quando carrega uma substância tóxica.
[0088] Outra concretização fornece um uso do anticorpo anti-CD66c de acordo com a presente invenção como um marcador para detecção de MDSC, ou especificamente um uso de detecção de MDSC, diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC ou fornecimento de informações sobre diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC, usando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contra CD66c.
[0089] Por exemplo, ele fornece uma composição para detecção de MDSC contendo uma substância que interage com a região determinante de antígeno do anticorpo usando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contra CD66c. A substância que interage inclui todas as substâncias sendo capazes de interagir com a região determinante de antígeno CD66c e pode ser pelo menos um selecionado a partir de pequenos produtos químicos moleculares, anticorpos, fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, aptâmeros e semelhantes.
[0090] A composição de diagnóstico da presente invenção é útil na detecção de expressão indesejada ou superexpressão de CD66c em várias células, tecidos ou outra amostra adequada, por contato de uma amostra com um anticorpo da presente invenção e determinação da presença de um CD66c em a amostra. Consequentemente, a composição de diagnóstico da invenção pode estar disponível para avaliar o início ou estado da doença, conforme definido aqui abaixo. Em particular, MDSC sendo capaz de expressar CD66c pode ser direcionado com o anticorpo da presente invenção, ou um fragmento ou derivado deste. As células que se ligaram ao anticorpo da presente invenção podem ser atacadas por funções do sistema imunológico, como o sistema do complemento ou por citotoxicidade mediada por células e, assim, reduz o número de ou erradica completamente as células que mostram expressão indesejada ou superexpressão de CD66c.
[0091] Como um exemplo específico, é fornecido um método ou uma composição para o diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC usando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno para CD66c de acordo com a presente invenção.
[0092] No caso de diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC, por exemplo, câncer, o anticorpo contra CD66c ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, pode ser usado para diagnóstico e tratamento direcionando MDSC infiltrado em torno de tecidos de câncer, independentemente da expressão de CEACAM 6 antígeno em tecidos cancerosos ou células cancerosas. O anticorpo contra CD66c de acordo com a presente invenção não se liga apenas ao CD66c expresso em células cancerosas sólidas, mas também se liga ao CD66c expresso em MDSC e, assim, pode detectar o câncer ao direcionar o estado aumentado de MDSC causado pelo câncer, mesmo em cânceres que não expressam CD66c em células cancerosas sólidas. Especificamente, em tecidos cancerosos de adenocarcinoma de pulmão que é CEACAM6 positivo em células cancerosas e carcinoma de células escamosas de pulmão, câncer de bexiga urinária e malignidade de melanoma que são CEACAM6 negativos em células cancerosas, o resultado da coloração do tecido canceroso confirmou que CEACAM 6-positivo MDSC estavam no local não tumoral do tecido canceroso (FIG. 13).
[0093] Por conseguinte, os pacientes com câncer mostram o nível aumentado de MDSCs, independentemente da positividade CEACAM 6 na superfície das células cancerosas e, assim, como mostrado no resultado do Exemplo 8, MDSC infiltrado no microambiente do câncer pode ser detectado e confirmado. Quando considerado em conjunto com os resultados do Exemplo 5.2 mostrando que o MDSC pode ser dissolvido seletivamente, isso indica que o MDSC pode ser usado como um alvo para fins de diagnóstico e tratamento, independentemente da positividade CEACAM6 em células cancerosas. Embora a presença ou ausência de expressão de CEACAM6 na superfície das células cancerosas possa variar dependendo do tipo de câncer, os MDSCs estão aumentados na maioria dos tipos de câncer, independentemente da expressão de CEACAM6. Assim, o anticorpo anti-CD66c de acordo com a presente invenção pode ter como alvo MDSC e pode ser usado para fins diagnósticos e terapêuticos em várias aplicações.
[0094] Em outra concretização, o anticorpo da presente invenção, ou um fragmento ou derivado do mesmo, é acoplado a um agente de marcação. Esses anticorpos são particularmente adequados para aplicações de diagnóstico.
[0095] A composição da invenção pode ser administrada como um agente ativo sozinho ou em combinação com outros agentes.
[0096] Uma outra concretização da presente invenção se refere a um método para detectar MDSC, que compreende (a) reagir o anticorpo anti-CD66c com uma amostra incluindo MDSC, e (b) determinar que a amostra é MDSC se a amostra for positiva para o anticorpo. A amostra pode incluir, mas não está limitada a, fluido linfóide, medula óssea, sangue e corpúsculos sanguíneos. Quando usado para a triagem de MDSC, o anticorpo anti-CD66c pode ser conjugado com um marcador capaz de indicar reatividade antígeno-anticorpo. O marcador útil para este propósito pode incluir um radioisótopo, um fluorescente, um luminescente, um cromógeno e um corante.
[0097] Além disso, o anticorpo anti-CD66c da presente invenção pode ser fornecido para um kit para diagnosticar doenças relacionadas a MDSC. O kit de diagnóstico pode compreender um meio para detectar uma reação antígeno-anticorpo além do anticorpo anti-CD66c. O meio de detecção pode ser um agente útil para realizar uma técnica selecionada do grupo que consiste em citometria de fluxo, coloração imunohistoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio de fluorescência (FIA), e imunoensaio de luminescência (LIA).
[0098] O efeito terapêutico do câncer sólido são os efeitos de suprimir a exacerbação do câncer, incluindo não apenas a inibição do crescimento (redução quantitativa) e o efeito de apoptose das células cancerosas (especialmente células-tronco cancerosas) ou tecidos cancerosos incluindo as mesmas, bem como migração, invasão , metástase, etc. A fim de maximizar o efeito do anticorpo de acordo com a presente invenção, o anticorpo pode ser tratado em combinação com agonista de STING ou 5-Fu, que pode ser esperado para obter um efeito superior no tratamento de combinação.
[0099] Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" ou "paciente" refere-se a um mamífero, incluindo um primata, como um ser hunamoo, um macaco, etc., e um roedor, como um camundongo, um rato, etc., que sofre de, ou tem o potencial de sofrer de doenças ou sintomas relacionados a MDSC e, portanto, precisa de alívio, prevenção e / ou tratamento de MDSC.
[00100] A administração do anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção pode ser conduzida de qualquer maneira aceitável. Por exemplo, um agente terapêutico incluindo o anticorpo anti-CD66c como um ingrediente ativo é administrado por via oral ou parenteral, e de preferência parenteral, a um sujeito, por exemplo, um hunamoo ou um animal que tem doenças relacionadas a MDSC. O agente terapêutico pode incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável, e a dose do agente terapêutico pode variar dependendo da condição do paciente e pode variar de, por exemplo, 3 mg a 6.000 mg por dia. O agente terapêutico pode assumir formas como líquidos, pós, emulsões, suspensões ou injeções, mas não está limitado a eles.
[00101] Além disso, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças relacionadas a MDSC, usando pelo menos um selecionado de entre um anticorpo para uma região determinante de antígeno de CD66c, um fragmento do anticorpo (F(ab')2, Fab, Fv, etc.), e um ligante para uma região determinante de antígeno de CD66c. Um anticorpo ou um fragmento deste pode ser monoclonal ou policlonal e pode ser derivado de hunamoos ou animais. O anticorpo anti-CD66c ou seu fragmento pode compreender ainda a toxina descrita acima. A toxina pode ser fundida, acoplada, conjugada ou ligada ao anticorpo usando uma técnica bem conhecida.
[00102] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada como um único agente ativo ou em combinação com quaisquer outros agentes que sejam preferíveis para o tratamento da doença de interesse. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser usado em conjunto com outras terapias anticâncer, como quimioterapia,
radioterapia, citoterapia, etc. Os vários agentes anticâncer bem conhecidos podem ser usados em quimioterapia ou citoterapia. Efeito da invenção
[00103] A presente invenção fornece um agente de aumento imunológico compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a CD66c que é expresso em células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) ou um fragmento de ligação ao antígeno desta, e um uso do agente de aumento imunológico para prevenção, melhoria ou tratamento de doenças relacionadas com MDSC. Breve Descrição dos Desenhos
[00104] A Fig. 1 mostra o resultado da clonagem de um gene de anticorpo a partir do anticorpo 8F5 de camundongo e sua expressão como um anticorpo recombinante quimérico e ligação à superfície de células A549 positivas para o antígeno CD66c.
[00105] Figs. 2A a 2C mostram os resultados da análise de HPLC de oito tipos de anticorpos humanizados recombinantes selecionados primeiro entre 96 tipos de anticorpos humanizados recombinantes. Os resultados são mostrados como medidos à esquerda em OD 220 nm e medidos à direita em OD 280 nm para cada anticorpo. O resultado representa se a agregação de anticorpos e as impurezas derivadas de anticorpos, como fragmentos, são ou não.
[00106] As Figs. 3a a 3e mostram grau semelhante de ligação à superfície celular de anticorpos humanizados recombinantes em comparação com anticorpos quiméricos, como resultado da confirmação da ligação à superfície celular positiva do antígeno CD66c de oito anticorpos humanizados recombinantes selecionados primeiramente entre 96 anticorpos humanizados recombinantes
[00107] As Figs. 4a e 4b mostram resultados de análise ELISA para a capacidade de ligação dos cinco anticorpos humanizados recombinantes selecionados a partir de 96 anticorpos humanizados recombinantes para o antígeno CD66c. A Fig. 4a mostra os resultados para o antígeno CECACAM6 (CD66c) e a Fig. 4b mostra o resultado para o antígeno CEACAM1 (CD66a).
[00108] As Figs. 5a e 5b mostram resultados de avaliação da estabilidade do anticorpo em uma condição de temperatura severa para cinco anticorpos humanizados recombinantes selecionados entre 96 anticorpos humanizados recombinantes.
[00109] As Figs. 6a a 6d mostram a ligação à superfície celular da célula A549 positiva para o antígeno CD66c de anticorpos humanizados recombinantes expressos em células CHO.
[00110] A FIG. 7 é um diagrama esquemático para ajudar a compreensão do método de análise MDSC e, especificamente, um diagrama esquemático do gráfico de pontos específico obtido por designar apenas as regiões de monócitos e granulócitos, excluindo linfócitos de acordo com o tamanho das células no gráfico de pontos, selecionando os grupos com nenhuma ou baixa expressão de HLA-DR, e determinação do grupo que é positivo para CD11b e CD33 entre os grupos como MDSCs na parte superior, e o resultado da taxa de positividade de DNP002 entre o grupo MDSC determinado na parte inferior.
[00111] A Fig. 8 é um resultado representativo da análise do efeito de eliminação de MDSC após o tratamento com DNP002, mostrando que os MDSCs foram significativamente reduzidos por DNP002 fucosilado. O CD66b é expresso em MDSC granulocítico, mas não em MDSC monocítico, e é usado para classificação do subtipo de MDSC. A maioria dos MDSCs designados na Fig. 8 eram CD66b-positivos e podem ser classificados como MDSCs granulocíticos. Assim, os MDSCs granulocíticos foram significativamente reduzidos pelo tratamento com DNP002.
[00112] A Fig. 9 é o resultado da análise do efeito de eliminação de MDSC após o tratamento com DNP002, mostrando um resultado da comparação da porcentagem do número diminuído de MDSCs devido ao tratamento com DNP002 em todos os cinco pacientes em comparação com o grupo de controle, onde P # 1 em o eixo horizontal no gráfico significa sangue total do paciente # 1, e o eixo vertical representa uma mudança na mudança de % de viabilidade relativa de MDSC.
[00113] A Fig.10 mostra um resultado da análise do efeito de eliminação de MDSC usando um citômetro de fluxo após o tratamento de PBMCs isolados de sangue de paciente com câncer de estômago com anticorpo DNP002.
[00114] A Fig. 11a é o resultado da comparação do efeito de morte de MDSC de acordo com o isótipo de DNP002, confirmando que DNP002 no tipo IgG1 afucosilado induz a morte de MDSC no sangue de forma mais eficaz. A Fig. 11b é um resultado da comparação do efeito de morte de MDSC em cinco pacientes com estômago de acordo com o isotipo de DNP002, mostrando que DNP002 em tipo IgG1 afucosilado fornece o maior efeito de morte de MDSC no sangue de cinco pacientes com estômago a partir do resultado da comparação da porcentagem do efeito de eliminação de MDSC em que P # 1 no eixo horizontal no gráfico significa sangue total do paciente # 1, e o eixo vertical representa uma mudança na mudança relativa de% de viabilidade de MDSC.
[00115] As Fig. 12a e Fig.12b são os resultados do efeito de apoptose analisado nas condições do anticorpo DNP002 sozinho, células NK sozinhas e combinação de anticorpo DNP002 e células NK na linha de células de câncer de estômago A549 e linha de células de câncer pancreático AsPC-1 que são positivo para CEACAM6 como um antígeno alvo.
[00116] A Fig. 13 é uma imagem que mostra a presença de MDSCs positivos para CEACAM6 no local não tumoral do tecido canceroso, realizando imunocoloração CEACAM6 de tecidos cancerígenos de adenocarcinoma de pulmão em que CEACAM6 é positivo em células cancerosas e carcinoma de células escamosas do pulmão, bexiga urinária câncer e câncer de pele (malignidade do melanoma) em que CEACAM6 é negativo nas próprias células cancerosas. Concretizações para a invenção
[00117] Uma melhor compreensão da presente invenção pode ser obtida através dos seguintes exemplos, que são apresentados para ilustrar, mas não devem ser interpretados como limitando a presente invenção. Exemplo 1: Preparação do anticorpo quimérico anti-CD66c
1.1. Clonagem de sequência gênica de anticorpo anti-CD66c
[00118] O gene do anticorpo 8F5 foi clonado usando Mouse Ig-Primer Set (Millipore, Cat. #: 69831). O RNA isolado do hibridoma 8F5 foi PCR usando o conjunto de iniciador de Ig de camundongo, inserido em um vetor pGem-T (Promega, Cat. #: A3600), sequenciado para confirmar a sequência de DNA, e o gene do anticorpo de camundongo foi identificado por meio do Site IMGT (www.imgt.org). As sequências da região variável da cadeia pesada e as sequências da região variável da cadeia leve do anticorpo 8F5 analisado são as seguintes. Tabela 4 Nome Sequência SEQ ID NO 8F5-quimérico ASGYSFTDYTMN 1 VH-CDR1 8F5-quimérico LINPFHGGTVSNQRFKV 2 VH-CDR2 8F5-quimérico VRGDPVRHYYALAY 3 VH-CDR3 8F5-quimérico GASENVYGTLN 4 VL-CDR1 8F5-quimérico GATNLAD 5 VL-CDR2 8F5-quimérico VATYYCQNVLSAPYT 6 VL-CDR3 8F5-quimérico EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDY 7
VRGDPVRHYYALAYWGQGTSVTVSS 8F5-quimérico DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENVYGT 8
TFGGGTKLEII 8F5-quimérico Gaggtccagctgcaacagtctggacctgaact 62 VH ggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcct gcaaggcttctggttactcattcactgactac accatgaactgggtgaagcagagccatggaaa gaaccttgagtggattggacttattaatcctt tccatggtggtactgtctccaaccagaggttc aaggtcaaggccacattaactgtagacaagtc atccaacacagcctacatggagctcctcagtc tgacatctgacgactctgcggtctattactgt gtaagaggtgacccggtccgccattactatgc tttggcctactggggtcagggaacctcagtca ccgtctcctca 8F5-quimérico gacatccagatgactcagtctccagcttcact 63 VL gtctgcatctgtgggagaaactgtcaccatca catgtggagcaagtgagaatgtttacggtact ttaaattggtatcagcggaaacagggaaaatc tcctcagctcctgatctatggtgcaaccaact tggcagatggcatgtcatcgaggttcagtggc agtggttctggtagacagtattctc 1-2. Produção de anticorpo quimérico
[00119] Com base na sequência de aminoácidos do anticorpo 8F5 de camundongo anti-CD66c construído, foi preparado um anticorpo quimérico anti-CD66c. 1-2-1. Produção de plasmídeo
[00120] Para expressar o anticorpo quimérico anti- CD66c, um plasmídeo para a cadeia pesada e um plasmídeo de expressão da cadeia leve foram preparados, respectivamente. O vetor POptiVEC (Invitrogen) foi usado como o plasmídeo de expressão da cadeia leve e o vetor pcDNA3.3 (Invitrogen) foi usado como o plasmídeo de expressão da cadeia pesada. A fim de expressar o cDNA que codifica a região variável e o cDNA que codifica a região constante de cada anticorpo como uma sequência de aminoácidos contínua sem inserção de aminoácido adicional, a sequência de codificação da região variável clonada e a região constante de IgG1 humana conhecida (cadeia pesada) e as sequências de codificação da região constante kappa (cadeia leve) foram sintetizadas (Bioneer). O gene pesado sintetizado e o gene da cadeia leve foram cortados com as enzimas de restrição Xho I e Sal I e o fragmento do gene da cadeia leve foi ligado ao vetor pOptiVec e o fragmento do gene da cadeia pesada foi ligado ao vetor pcDNA3.3, respectivamente, para construir um plasmídeo de expressão de anticorpo completo (plasmídeo de expressão de cadeia pesada pcDNA3.3-anti-CD66c e plasmídeo de expressão de cadeia leve pOptiVEC-anti-CD66c). 1-2-2. Transfecção
[00121] O plasmídeo de expressão de cadeia pesada pcDNA3.3-anti-CD66c preparado e o plasmídeo de expressão de cadeia leve pOptiVEC-anti-CD66c foram transfectados em células DG44 derivadas de células CHO (Invitrogen).
[00122] Três dias antes da transfecção, as células DG44 em suspensão foram adaptadas ao meio MEMS contendo 5% de FBS para convertê-las em células aderentes e para melhorar a eficiência da transfecção. A transfecção foi realizada em uma placa de 6 poços usando o regente de transfecção ViaFect (Promega, Cat. #: E4981). No dia anterior à transfecção, as células DG44 adaptadas ao estado aderido foram preparadas por subcultura a uma concentração de 1 x 105 células / poço. A quantidade de DNA usada para a transfecção foi determinada usando o plasmídeo de expressão de cadeia pesada pcDNA3.3- anti-CD66c e os plasmídeos de expressão de cadeia leve pOptiVEC-anti-CD66c foram usados em uma quantidade de 2ug e 1,5ug, respectivamente, em uma proporção de 1,5:1. A transfecção foi realizada por 48 horas. A citometria de fluxo foi usada para analisar a população de células transfectadas. Como mostrado na Fig. 1, a expressão do anticorpo quimérico foi confirmada pela linha de células de câncer de pulmão de células não pequenas A549. A Fig. 1 mostra o resultado da clonagem de um gene de anticorpo a partir do anticorpo 8F5 de camundongo e sua expressão como um anticorpo quimérico recombinante e ligação à superfície de células A549 positivas para o antígeno CD66c. Exemplo 2: Preparação de anticorpo monoclonal anti-CD66c humanizado
[00123] 2.1 Seleção de sequência de anticorpo recombinante por humanização in silico
[00124] Se a afinidade de ligação ao antígeno for igual ou superior pela manutenção da sequência de CDRs (CDRH1: ASGYSFTDYTMN) SEQ ID NO: 1, CDRH2: SEQ ID NO: 2 (LINPFHGGTVSNQRFKV); CDRH3: SEQ ID NO: 3 (VRGDPVRHYYALAY); CDRL1: SEQ ID NO: 4 (GASENVYGTL); CDRL2: SEQ ID NO: 5 (GATNLAD); se CDR3: SEQ ID NO: 6 (VATYYCQNVLSAPYT) da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-CD66c de camundongo, 8F5 (sequência de aminoácidos da cadeia pesada: SEQ ID NO: 7, DNA codificador da cadeia pesada: SEQ ID NO: 62; amino da cadeia leve sequência de ácido: SEQ ID NO: 8; cadeia leve que codifica DNA: SEQ ID NO: 63) o mais similar possível as sequências de anticorpo humanizado recombinaram as sequências da região estrutural com a sequência da linha germinativa que codifica o gene do anticorpo humano foram selecionadas no método in silico. O gene da linha germinal do anticorpo humano usado como estrutura da sequência do anticorpo humanizado recombinante é mais semelhante à cadeia pesada e à cadeia leve do anticorpo CD66c 8F5 de camundongo, respectivamente, como mostrado na Tabela 5. A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve do anticorpo CD66c de camundongo e as sequências CDR da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve são mostradas na Tabela 6. Tabela 5 Linhagem germinativa Ab Hunana Cadeia Pesada Cadeia Leve IGHV1-69-2*01 IGKV1-27*01 IGHV1-2*02 IGKV1-5*01 Homo sapiens IGHV1-46*01 IGKV1-39*01 Homo sapiens
[00125] Doze (12) regiões variáveis da cadeia pesada e oito (8) regiões variáveis da cadeia leve foram selecionadas como a sequência do anticorpo 8F5 humanizado selecionada usando a sequência do gene da linha germinativa do anticorpo humano, como mostrado na Tabela 3. As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve, sequências CDR e as sequências estruturais do anticorpo humanizado selecionado são mostradas nas Tabelas 6 a 8. A região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve do anticorpo quimérico e o anticorpo humanizado são mostradas na Tabela
1. É preferível que o anticorpo de camundongo e o anticorpo humanizado tenham as mesmas sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia leve. As partes em negrito e sublinhado na Tabela 6 são as sequências CDR do anticorpo. As partes em negrito e sublinhado na Tabela 7 indicam o aminoácido modificado. Tabela 6 Número do Combinação Nome Sequência de Aminoácido anticorpo 3043 Vk8+ VH6 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQAPGQNLEWI VH6 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk8 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3058 Vk8+ VH11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTDYTMHWVKQAPGQNLEWI VH11 GLINPFGGSTSYAQKFKGRVTMTRDTSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk8 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 2938 Vk5+ VH7 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWI VH7 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk5 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENVYGTLAWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3007 Vk7+ VH6 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQAPGQNLEWI VH6 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3019 Vk7+ VH10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTMNWVKQAPGQNLEWI VH10 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATMTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3010 Vk7+ VH7 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWI VH7 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3004 Vk7+ VH5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTDYTMNWVRQAHGQNLEWI VH5 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk7 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCGASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
TFGGGTKLEIK 3046 Vk8+ VH7 QVQLVQSGAEVKKPGASMKISCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWI VH7 GLINPFHGGTVSNQRFKVKATLTVDVSTNTAYMELSRLRSDDTAVYYC
VRGDPVRHYYALAYWGQGTLVTVSS Vk8 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASENVYGTLNWYQRKPGKAPKLLI
[00126] Tabela 7
Nome CDR1 SEQ CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID
ID NO NO NO VH- ASGYSFTD 1 LINPFHGGT 2 GDPVRHYYA 3 quimérico YTMN VSNQRFKV LAY VH5, 6, 7, ASGYSFTD 1 LINPFHGGT 2 GDPVRHYYA 3 10 YTMN VSNQRFKV LAY VH11 ASGYSFTD 9 LINPFGGST 10 GDPVRHYYA 3
YTMH SYAQKFKG LAY VL- GASENVYG 4 GATNLAD 5 VATYYCQNV 6 quimérico TLN LSAPYT VK5 GASENVYG 11 GATNLAD 5 FATYYCQNV 13
TLA LSAPYT VK7 GASENVYG 4 GATNLAD 5 FATYYCQNV 13
TLN LSAPYT VK8 RASENVYG 12 GATNLAD 5 FATYYCQNV 13
[00127] Tabela 8 Nome SEQ FR1 FR2 SEQ FR3 SEQ FR4 SEQ
ID NO ID NO ID NO ID NO VH- EVQLQQS 22 WVKQS 32 NQRFKVKA 42 WGQGTS 52 quimérico GPELVKP HGKNL TLTVDVSS VTVSS
VYYCVR VH5 QVQLVQS 23 WVRQA 33 NQRFKVKA 43 WGQGTL 53
VYYCVR VH6 QVQLVQS 24 WVKQA 34 NQRFKVKA 44 WGQGTL 54
VYYCVR VH7 QVQLVQS 25 WVRQA 35 NQRFKVKA 45 WGQGTL 55
VYYCVR VH10 QVQLVQS 26 WVKQA 36 NQRFKVKA 46 WGQGTL 56
VH11 QVQLVQS 27 WVKQA 37AQKFKGRV 47 WGQGTL 57
VYYCVR VL- DIQMTQS 28 WYQRK 38 GMSSRFSG 48 FGGGTK 58 quimérico PASLSAS QGKSP SGSGRQYS LEII
TC DD VK5 DIQMTQS 29 WYQRK 39 GVPSRFSG 49 FGGGTK 59
TC DD VK7 DIQMTQS 30 WYQRK 40 GVPSRFSG 50 FGGGTK 60
TC DD VK8 DIQMTQS 31 WYQRK 41 GMPSRFSG 51 FGGGTK 61
2.2 Expressão e análise de anticorpos humanizados recombinantes
[00128] As sequências do anticorpo selecionado foram expressas em células 293 na forma de IgG1 humana conectando a região constante da cadeia pesada de IgG1 humana e a região constante da cadeia leve kapa, respectivamente. Sete dias após a transfecção, o anticorpo humanizado recombinante foi purificado usando resina KanCap A (Kaneca).
[00129] O anticorpo purificado foi quantificado medindo a DO 280 nm e foi realizada SDS-PAGE. A pureza e a agregação do anticorpo foram analisadas por análise com 280 nm e 220 nm por HPLC usando coluna de exclusão de tamanho Sepax Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies) (Figs. 2a a 2c)
2.3 Ligação celular e análise de ligação ao antígeno de anticorpos humanizados recombinantes 2-3-1 - Ensaio de ligação de células
[00130] Cada anticorpo humanizado recombinante expresso 96 foi derramado e reagiu em um tubo de ensaio contendo a mesma quantidade (1 ug) de linha de células de câncer de pulmão de células não pequenas A549 CD66c-positivo a 4 ℃ por 30 minutos, lavado com PBS e tratado com IgG de cabra anti-Huma conjugado com FITC (DiNona Inc, Coréia) foi adicionado e incubado a 4 ° C por 15 minutos. Após lavagem com PBS, as células foram analisadas com citômetro de fluxo (Stratedigm, S1000EXi) e os resultados são apresentados a seguir.
[00131] Entre os 96 candidatos a anticorpos humanizados recombinantes, oito foram primeiro selecionados com base no grau de expressão, na presença de agregação e no grau de ligação celular (Tabela 9 e Tabela 10, Figs. 3a a 3e). As Tabelas 9 e 10 são os resultados da análise do anticorpo humanizado anti-CD66c primário selecionado e 8F5 quimérico, e a Tabela 10 mostra os resultados da análise de citômetro de fluxo. Tabela 9 No. #71 #86 #93 #43 #51 #45 #41 #74 ID da 3043 3058 2938 3007 3019 3010 3004 3046 Proteína Combinação Vk8+V Vk8+V Vk5+V Vk7+V Vk7+V Vk7+V Vk7+V Vk8+V H & L H6 H11 H7 H6 H10 H7 H5 H7 Poço F11 H2 H9 D7 E3 D9 D5 G2 OD 280nm 3.54 3.86 3.32 4.01 4.03 3.5 3.56 3.54 Volume
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 (ml) Conc.
2.52 2.71 2.36 2.85 2.86 2.49 2.53 2.52 (mg/ml)
Rendimento(
0.66 0.71 0.61 0.74 0.74 0.65 0.66 0.66 mg) Coeficiente 10219 10368 10219 10219 10219 10219 10219 10219 de extinção 0 0 0 0 0 0 0 0 MW(Da) 72750 72691 72616 72633 72521 72604 72669 7272
[00132] Tabela 10 No. % Média % (% ID da Combinação delimitada delimitada proteína H & L x média) Anticorpo ** ** 73 619 100.0 quimérico #71 3043 Vk8+VH6 69 686 104.8 #86 3058 Vk8+VH11 72 645 102.8 #93 2938 Vk5+VH7 71 611 96.0 #43 3007 Vk7+VH6 71 565 88.8 #51 3019 Vk7+VH10 70 561 86.9 #45 3010 Vk7+VH7 70 554 85.8 #41 3004 Vk7+VH5 71 541 85.0 #74 3046 Vk8+VH7 71 523 82.2
[00133] A Tabela 9 mostra o grau de expressão, a presença ou ausência de agregação e o grau de ligação celular de 8 anticorpos selecionados. Especificamente, os níveis de expressão e os pesos moleculares dos 8 anticorpos selecionados foram resumidos. Além disso, de acordo com os resultados da citometria de fluxo na Tabela 10, foi confirmado que os oito anticorpos humanizados recombinantes exibiram forças de ligação celular de ± 20% que mostraram força de ligação celular muito semelhante aos anticorpos quiméricos. Como resultado, o anticorpo 8 sendo normalmente expresso e tendo poucas agregações formadas devido à instabilidade da própria proteína e a afinidade de ligação semelhante às células positivas para o antígeno alvo para o anticorpo quimérico foram selecionados em primeiro lugar a partir de 96 anticorpos candidatos humanizados
[00134] Alguns conteúdos podem ser perdidos. Em particular, a capacidade de ligação das linhagens celulares parecia ser diferente em valores numéricos. Entretanto, como mostrado na Fig. 3, o perfil de ligação celular real era semelhante ao do anticorpo quimérico, e 8 tipos de anticorpos humanizados foram determinados pela obtenção do valor numérico com a multiplicação da positividade do anticorpo (% delimitada) pela fluorescência média (média)e o comparando com o anticorpo quimérico, de modo a selecionar os anticorpos humanizados dentro de ± 20%. Em geral, quando a sequência da região CDR do anticorpo de camundongo é inserida na região estrutural do anticorpo humanizado no momento da produção do anticorpo humanizado, a afinidade de ligação do anticorpo é fortemente diminuída devido à mudança da estrutura da proteína original. Ao considerar a propriedade geral do anticorpo humanizado, anticorpos humanizados muito bons foram selecionados na presente invenção. 2-3-2 Ensaio de ligação ao antígeno
[00135] Entre os oito anticorpos humanizados recombinantes selecionados, cinco tipos de anticorpos humanizados recombinantes exibindo uma elevada afinidade de ligação em comparação com a do anticorpo quimérico foram selecionados e analisados quanto à sua afinidade de ligação ao antígeno CD66c e antígenos CD66 semelhantes por ELISA, respectivamente. Tabela 11
ID da proteína Combinação HC & LC 3043 Vk8+VH6 3058 Vk8+VH11 2938 Vk5+VH7 3007 Vk7+VH6 3019 Vk7+VH10
[00136] O antígeno CD66c (CEACAM6; Sino Biological, Inc.) e o antígeno CEACAM1 (Sino Biological, Inc.) foram revestidos em uma placa de 96 poços a uma taxa de 100 ng por poço e depois bloqueados. O anticorpo primário foi diluído 3 vezes a partir de 10 ug / ml e ligado a 37 ° C durante 1 hora. O anticorpo primário foi diluído três vezes a partir de 10ug / ml na concentração inicial e foi ligado a 37 ° C durante 1 hora, e o conjugado de cabra anti-Ig humana-HRP (Jackson ImmunoResearch) como um anticorpo secundário foi diluído 1: 10.000 e incubado em 37 ° C durante 30 minutos. A lavagem foi realizada três vezes entre cada etapa, e a reação de TMB foi realizada, interrompida com solução de H2SO4 1N na mesma quantidade de solução de TMB (100ul) e então o valor de DO foi medido a 450 nm.
[00137] Como resultado do experimento, as afinidades de ligação ao antígeno CD66c dos cinco tipos de anticorpos humanizados recombinantes selecionados entre 96 tipos de anticorpos humanizados recombinantes são mostradas na Fig. 4a, Tabela 12, Fig. 4b e Tabela 13. Fig. 4a e a Tabela 12 mostram a capacidade de ligação dos anticorpos ao antígeno CECACAM6 CD66c), e a Fig. 4b e a Tabela 13 são os resultados para o antígeno CEACAM1 (CD66a).
[00138] A partir da afinidade de ligação de anticorpos ao antígeno na Fig. 4a, Tabela 12, Fig. 4b e Tabela 13, todos os anticorpos para CECACAM6 mostraram um perfil de ligação semelhante ao anticorpo quimérico para CEACAM6 e foram divididos em grupos que não se ligaram ou vinculado fracamente CEACAM1. Tabela 12 Concentração chi hu hu hu hu hu do anticorpo 8F5 3043 3058 2938 3007 3019 (ng/ml) 10000,00 3,17 2,73 2,87 3,43 3,37 3,13 3333,33 3,41 2,95 3,18 3,27 3,24 3,26 1111,11 3,30 2,74 3,19 3,16 3,23 3,34 370,37 3,30 2,92 2,80 3,08 3,16 3,23 123,46 2,83 2,29 2,22 2,56 2,90 3,04 41,15 2,02 1,73 1,38 1,72 2,17 2,45 13,72 1,15 1,37 1,06 1,15 1,64 1,77 4,57 0,80 0,91 0,74 0,65 1,02 1,32 1,52 0,53 0,70 0,53 0,48 0,79 0,95 0,51 0,41 0,49 0,38 0,36 0,64 0,80 0,17 0,40 0,41 0,37 0,30 0,53 0,68 Tabela 13 Concentração chi hu hu hu hu hu do anticorpo 8F5 3043 3058 2938 3007 3019 (ng/ml) 10000,00 1,21 0,91 0,42 0,32 1,01 0,99 3333,33 1,24 1,22 0,31 0,27 1,15 1,07 1111,11 1,21 1,17 0,19 0,21 1,06 1,02 370,37 1,13 0,80 0,12 0,14 0,92 0,89 123,46 0,95 0,70 0,07 0,10 0,82 0,79 41,15 0,82 0,61 0,07 0,07 0,66 0,58 13,72 0,51 0,43 0,05 0,06 0,46 0,41 4,57 0,28 0,27 0,05 0,05 0,27 0,24 1,52 0,16 0,16 0,05 0,05 0,18 0,16 0,51 0,10 0,10 0,04 0,05 0,11 0,11 0,17 0,08 0,08 0,04 0,04 0,09 0,08
2.4 Análise de estabilidade de anticorpos humanizados recombinantes
[00139] Os experimentos foram conduzidos para determinar a estabilidade dos anticorpos deixando os cinco anticorpos humanizados recombinantes do Exemplo 3.3 selecionados pelo perfil de ligação ao antígeno e célula sob condições de alta temperatura.
[00140] A estabilidade foi determinada realizando as experiências de ligação usando ácido 8-anilino-1- naftalenossulfônico (ANS, Sigma). ANS é um composto que pode detectar a desnaturação de proteínas medindo a mudança no comprimento de onda de fluorescência entre a ligação e a não ligação a locais hidrofóbicos expostos quando a proteína é desnaturada.
[00141] O anticorpo humanizado recombinante foi ajustado para uma concentração de 0,2 mg / ml usando PBS (solução salina tamponada com fosfato) e deixado a 50 ° C durante 4 horas como condições severas. 0,2 μg / ml de solução de ANS foi misturado a 20 μl por 500 μl da solução diluída de anticorpo a ser analisado, e analisado 5 minutos depois com um leitor fluorescente em condições de excitação de 360 nm e emissão de 460 nm. Além disso, a reação do reagente ANS também foi medida a uma temperatura de 70 ° C por 30 minutos adicionais.
[00142] As Figs. 5a e 5b mostram os resultados da confirmação da estabilidade do anticorpo dos cinco anticorpos humanizados recombinantes mostrados na Tabela 11 sob condições de temperatura severas. Ou seja, a reatividade do reagente ANS foi medida por fluorescência após deixar o anticorpo a 50 ° C por 4 horas sob a condição severa, e posteriormente à esquerda a 70 ° C por 30 minutos. Conforme mostrado nos resultados do experimento da Fig. 5a, a maioria dos 5 tipos de anticorpos mostraram pouca resposta de ANS quando os anticorpos foram deixados na temperatura de 50 ° C por 4 horas, mas o valor de fluorescência dos anticorpos muito aumentado quando os anticorpos adicional deixado a 70 ° C por 30 minutos. Entre eles, o anticorpo recombinante com a proteína ID: 3058 exibiu o menor valor de fluorescência aumentada e, portanto, apresentou a propriedade mais estável na mudança de temperatura entre os cinco anticorpos humanizados recombinantes.
[00143] A fim de medir a taxa de alteração da reatividade do reagente ANS, a reatividade do reagente ANS foi analisada com um leitor fluorescente da mesma maneira que acima após deixar os anticorpos por 4 horas em uma condição de refrigeração (4 ± 2 ° C) e uma temperatura de 62 ° C. A variabilidade do valor de fluorescência do anticorpo contra o reagente ANS pode ser determinada pela obtenção da diferença entre o valor de fluorescência medido em condições de baixa temperatura (por exemplo, 4 ° C) e o valor de fluorescência medido em condições de alta temperatura (por exemplo, 62 ° C .) e dividindo com o valor de fluorescência medido em condições de baixa temperatura. Equação matemática
[00144] Variabilidade do valor de fluorescência = (valor de fluorescência medido em condição de alta temperatura - valor de fluorescência medido em condição de baixa temperatura) / (valor de fluorescência medido em condição de baixa temperatura)
[00145] Como mostrado na Fig. 5b, a reação foi permitida por 4 horas a uma temperatura de 62 ° C que foi um pouco aumentada em relação à temperatura (50 ° C), e então a reatividade do reagente ANS foi confirmada. Cinco anticorpos humanizados recombinantes e os anticorpos quiméricos mostraram pouca resposta ao ANS em condições refrigeradas, mas aumentaram com o aumento da temperatura. No entanto, o anticorpo 8F5 quimérico mostrou que a reatividade do reagente ANS aumentou para 1.406%, mantendo a condição de temperatura a 62 ℃, mas os precipitados tornaram-se instáveis. No entanto, os cinco anticorpos humanizados mostraram variabilidade significativamente menor de reatividade do reagente ANS do que os anticorpos quiméricos, e nenhum precipitado foi produzido. Em particular, os anticorpos humanizados Protein ID 3019 e Protein ID 3058 apresentaram variabilidade de reatividade do reagente ANS de 114% e 133%, respectivamente, e, portanto, foram considerados os anticorpos mais estáveis. O significado de reatividade aumentada do reagente ANS refere- se ao aumento da exposição do aminoácido hidrofóbico colocado dentro da estrutura da proteína, que é responsável pela desnaturação da estrutura da proteína e do agregado de proteína resultante, isto é, formação de precipitado. O anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção é considerado um anticorpo estável possuindo a variação de reatividade ANS de menos de 200%. A variação da reatividade ANS de menos uma mudança de menos de 200% é considerada muito baixa, e acima do valor, uma mudança mais significativa na estrutura da proteína é considerada a observação da reatividade ANS. Consequentemente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem ligação ao antígeno e capacidade de ligação celular semelhantes ao anticorpo quimérico, e a estabilidade física aumentada da própria proteína do anticorpo, tais fatos são uma característica muito excelente na capacidade de droga para o anticorpo terapêutico.
2.5 Expressão de células CHO e análise de anticorpo humanizado recombinante
[00146] Os cinco anticorpos humanizados recombinantes selecionados no Exemplo 2.3 foram expressos em células CHO usadas para expressar a maioria dos anticorpos terapêuticos e analisados. A sequência de DNA da região variável da cadeia leve e a sequência de DNA da região variável da cadeia pesada para construir os cinco anticorpos humanizados recombinantes selecionados foram realizadas pela otimização do códon, sintetizadas e ligadas ao gene da região constante da IgG1 humana pelo método de PCR de sobreposição. O produto foi cortado com XhoI e EcoRI e ligado ao vetor pcDNA3.4 (Life Technology). A Tabela 11 mostra as combinações de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos humanizados selecionados para a expressão de células CHO.
[00147] As sequências de iniciador de DNA usadas para PCR na região variável e no gene da região constante são mostradas na Tabela 14 abaixo.
[00148] [Tabela 14] Nome do Uso Gene alvo sequências SEQ ID NO iniciador
8F01 1o frag VH6, VH7, VH10, ATTACTCGAGGCCACCA 64 dianteiro VH11 TGAA 8F02 1o frag VH6, VH10, VH11 AGTTGAAGCGCTGCTCA 65 reverso CAGTCA 8F03 2o frag VH6, VH10, VH11 GTGAGCAGCGCTTCAAC 66 dianteiro TAAGGG 3E04 2o frag VH6, VH7, VH10, AGTCGAATTCTCATTTC 67 reverso VH11 CCAGGAGAG 8F04 1o frag VH7 AGTTGAAGCAGAAGACA 68 reverso CTGTCA 8F05 2o frag VH7 GTGTCTTCTGCTTCAAC 69 dianteiro TAAGGG 3E01 1o frag Vk5, Vk7, Vk8 ATTACTCGAGGCCACCA 70 dianteiro TGAAGTGGG 8F06 1o frag Vk5, Vk7, Vk8 AACAGTCCGCTTGATCT 71 reverso CCAGCT 3EL02(2) 2o frag Vk5, Vk7, Vk8 GAGATCAAGCGGACTGT 72 dianteiro TGCTGC 3E08 2o frag Vk5, Vk7, Vk8 ATTAGAATTCTCAGCAC 73 reverso TCGCCGCGG
[00149] Os cinco (5) anticorpos humanizados recombinantes foram transitoriamente transfectados usando o ExpiCHO (marca registrada) Expression System Kit (ThermoFisher, Cat. No. A29133), e os anticorpos expressos foram transfectados com linha de células de câncer de pulmão não pequenas A549 positivas para CD66c e analisados por citômetro de fluxo, como mostrado nas Fig. 6a a 6c. Todos os cinco anticorpos humanizados recombinantes mostraram afinidades de ligação semelhantes aos anticorpos quiméricos. O valor de fluorescência medido do citômetro de fluxo foi dividido pela quantidade de expressão de anticorpo do meio de cultura CHO para obter a afinidade de ligação relativa do anticorpo à quantidade de expressão de anticorpo, como mostrado na Fig. 6d. Portanto, foi confirmado que o anticorpo humanizado recombinante foi adequadamente expresso em células CHO. A afinidade de ligação do anticorpo à superfície celular foi determinada como 100% e a alteração relativa foi mostrada na Fig. 6d. Exemplo 3 - Expressão de células CHO e análise de DNP002
[00150] DNP002, um anticorpo humanizado contra o anti-CD66c, foi expresso e analisado em células CHO usadas para expressar a maior parte da terapêutica. Para testar a diferença de função de acordo com o subtipo do anticorpo DNP002, foram preparados anticorpos do tipo IgG1 e do tipo IgG2.
[00151] Depois de realizar a otimização de códons de sequências de DNA da região variável de cadeia leve e pesada para a construção de anticorpos recombinantes humanizados, eles foram sintetizados e ligados à região constante de IgG1 ou IgG2 humana pelo método de PCR de sobreposição, e fragmento do gene XhoI e EcoRI foi clonado em vetor pcDNA3.4 (Life Technology).
[00152] Tabela 15 classificação Sequência de Sequência de cDNA Aminoácido Região ASTKGPSVFPLAPSSKST GCTTCAACTAAGGGACCAAGCGTATTCCCAC constante de SGGTAALGCLVKDYFPEP TTGCTCCATCTAGCAAGAGCACTAGCGGAGG cadeia pesada VTVSWNSGALTSGVHTFP AACAGCTGCTTTGGGGTGTTTGGTAAAGGAT IgG1 AVLQSSGLYSLSSVVTVP TACTTTCCCGAACCTGTTACCGTGAGCTGGA
SLSPGK TCTGTCCTCACCGTCCTGCATCAGGACTGGC (SEQ ID NO: 74) TGAATGGCAAAGAGTATAAGTGCAAAGTCAG
AGAAATCTCTGAGTCTCTCTCCTGGGAAATG A (SEQ ID NO: 75) Região ASTKGPSVFPLAPCSRST GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTGTTCCCTC Constante de SESTAALGCLVKDYFPEP TGGCCCCATGTTCTAGGTCTACATCTGAGAG cadeia pesada VTVSWNSGALTSGVHTFP CACCGCCGCCCTCGGCTGTCTGGTGAAGGAT IgG2 AVLQSSGLYSLSSVVTVP TATTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGA
GK GTGGTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGG (SEQ ID NO: 76) AGTATAAGTGTAAGGTGTCTAACAAGGGCCT
CTCTGTCTCCAGGCAAGTGA (SEQ ID NO: 77) Região RTVAAPSVFIFPPSDEQL CGGACTGTTGCTGCTCCATCTGTTTTTATAT Constante de KSGTASVVCLLNNFYPRE TTCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGG cadeia leve AKVQWKVDNALQSGNSQE CACTGCCTCTGTGGTGTGTCTGCTGAATAAT
HQGLSSPVTKSFNRGEC TCAGGAAAGTGTGACAGAACAGGATAGTAAG (SEQ ID NO: 78) GACTCTACTTATAGCCTCTCTTCTACACTGA
GCGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 79)
[00153] Para preparar o anticorpo DNP002 humanizado fucosilado, quando o anticorpo do tipo DNP002 IgG1 foi expresso, 2F-PF (2F-Peracetil-Fucose; Merck, Cat #: 344827) foi adicionado ao meio de cultura a 50 uM e cultivado, e então purificado usando Mabselect coluna sure Protein A (GE Healthcare Lifescience, Cat #: 11003494). O anticorpo purificado foi dialisado com solução salina tamponada com fosfato, e a absorbância a 280 nm foi dividida pelo coeficiente de absorbância de 1,4 e convertida em uma unidade de concentração de "mg / mL", e então, foi utilizado para o experimento subsequente.
[00154] A afucosilação foi avaliada comparando relativamente a reatividade da aglutinina Biotinylated Lens culinaris (Vector laboratories, Cat #: B-1045) tendo uma propriedade de ligação à fucose. IgG1 DNP002 conjugado com fucose reagiu com aglutinina Biotinylated Lens culinaris e foram usados para o desenvolvimento de cor TMB por SA-HRP (Jackson immunoresearch, Cat #: 016-030-084). No entanto, DNP002 fucosilado teve relativamente pouco desenvolvimento de cor (Tabela 16). Tabela 16 Concentração do DNP002 anticorpo Anticorpo humanizado anticorpo humanizado DNP002 afucosilado (ng/ml) 10000 1,452 0,229 3333 1,254 0,210 1111 0,993 0,164 370 0,283 0,115 123 0,116 0,076 41 0,080 0,083 14 0,095 0,059 5 0,094 0,070 Exemplo 4 - Investigação da reatividade do anticorpo DNP002 para MDSC
[00155] A reatividade do anticorpo DNP002 contra MDSC foi avaliada por análise de citometria de fluxo.
[00156] Especificamente, após a preparação de sangue de pacientes com câncer de estômago, DNP002 ligado a APC e os anticorpos (anticorpos anti-HLA-DR-FITC, CD11b-PE, CD33- PE) contra os antígenos marcados de MDSC com fluorescência diferente juntos foram adicionados a 100 uL de sangue total e reagiu a 4 ° C por 20 minutos. O produto foi adicionado com 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) de 1X RBC Lysis Buffer (ThermoFisher, Cat #: 00-4333-57), reagiu à temperatura ambiente por 30 minutos, centrifugado para remover o RBC decomposto, lavado novamente com PBS e realizado por citometria de fluxo. A intensidade da coloração foi medida como um log da intensidade da fluorescência e expressa em unidades de dezenas.
[00157] Na análise dos resultados, após apenas monócitos e regiões de granulócitos, exceto linfócitos, terem sido designados de acordo com o tamanho das células no gráfico de pontos, os grupos com nenhuma ou baixa expressão de HLA-DR foram selecionados e os grupos positivos para CD11b e CD33 foram selecionados desses grupos e designados como MDSC. A taxa positiva de DNP002 no grupo MDSC designado foi confirmada (Fig. 7).
[00158] Especificamente, da direção da esquerda para a direita nos gráficos superiores na FIG. 7, 1) bloqueado apenas monócitos e granulócitos em gráficos de pontos FSC e SSC com exclusão de linfócitos. (FSC: dispersão direta, uma variável que indica o tamanho das células a serem analisadas, SSC: dispersão lateral, uma variável que indica a granularidade das células a serem analisadas e o grau de grânulo existente nas células), 2) HLA-DR fechado Grupos baixos ou (-), e 3) MDSC sendo positivo para CD11b e CD33 entre o primeiro e o segundo grupos. DNP002 MDSCs positivos são 90,9% (local superior direito no gráfico de pontos direito da Fig. 7) e DNP002 MDSCs negativos são 4,4% (local superior esquerdo no gráfico de pontos direito da Fig. 7). A MDSC é dividida em subtipos de MDCS monocítica e MDSC granulocítica. A MDSC granulocítica expressa CD66b, mas a MDCS monocítica não expressa CD66b, portanto, se a CD66b é expressa ou não, pode ser usado de forma útil para discriminar subtipos de MDSC.
[00161] A Fig. 7 é o resultado de provar o método de definição de MDSC (excluindo linfócitos, HLA-DR baixo / (-), CD11b +, CD33 +) e a reatividade de DNP002 (anti-CD66c) específico para MDSC. Como o DNP002 se liga ao MDSC, o DNP002 pode ser usado como um método para especificar o MDSC (Fig. 7) e o DNP002 pode causar efeitos ADCC para remover o MDSC (Fig. 8). Nos resultados do teste a seguir, o MDSC ligado ao DNP002 foi de 90,9%.
[00162] A Fig. 8 mostra um fenômeno no qual MDSCs granulocíticas positivas para CD66b foram mortas por tratamento com DNP002 e descritos em sua proporção. Na Fig. 8, o gráfico de pontos superior (grupo de controle) representa uma amostra antes do tratamento com DNP002, e o gráfico de pontos inferior (DNP002) é o resultado da diminuição de MDSC após o tratamento com DNP002. CD66b é um marcador que pode diferenciar entre MDSC monocítico e MDSC granulocítico. Nos seguintes resultados de teste, a maioria dos MDSCs eram MDSCs granulocíticas positivas para CD66b, e os MDSCs granulocíticos foram efetivamente mortos por DNP002.
[00163] Como resultado da análise do sangue de 19 pacientes com câncer de estômago, a taxa positiva de DNP002 na MDSC em todos os PBMCs foi de 34,3 ~ 76,7% e a taxa positiva média foi de 55,1%. A Tabela 17 abaixo é um resultado da análise da reatividade do anticorpo DNP002 ao MDSC com amostras de 19 pacientes com câncer de estômago.
[00164] Tabela 17 # Sangue DNP002+MDSC do total PBMC (%) Paciente GC #1 49,8 55,1 Paciente GC #2 50,5 Paciente GC #3 68,6 Paciente GC #4 61,8 Paciente GC #5 48,8 Paciente GC #6 70,5 Paciente GC #7 45,6 Paciente GC #8 36,0 Paciente GC #9 51,4 Paciente GC #10 34,3 Paciente GC #11 49,8 Paciente GC #12 53,5 Paciente GC #13 63,7 Paciente GC #14 72,0 Paciente GC #15 43,5 Paciente GC #16 67,4 Paciente GC #17 76,7 Paciente GC #18 42,5 Paciente GC #19 60,4 Exemplo 5 - Efeito de lise de DNP002 em MDSC
5.1. Efeito de lise de DNP002 em MDSC em sangue total
[00165] A fim de verificar o efeito de morte de MDSC por DNP002, tampão de lise de eritrócitos de 1X RBC Lysis
Buffer (ThermoFisher, Cat #: 00-4333-57) foi adicionado ao sangue de 5 pacientes com câncer de estômago para dissolver glóbulos vermelhos e, em seguida, o o produto foi vertido 1 x 105 por poço de placa de 12 poços. O anticorpo DNP002 foi adicionado a cada poço a uma concentração de 10 ug / mL e incubado em uma incubadora a 37 ° C por um dia. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e reagidas com anticorpos (anticorpos anti-HLA-DR, CD11b, CD33) contra os antígenos marcados com MDSC com fluorescência diferente a 4 ° C por 20 minutos. Após a lavagem com PBS, foi realizada a citometria de fluxo. A intensidade da coloração foi medida como um log da intensidade da fluorescência e expressa em unidades de dezenas.
[00166] Como resultado da experiência acima, a FIG. 8 mostra um resultado representativo em que o anticorpo DNP002 efetivamente induz apoptose de MDSC no sangue e a proporção de MDSC é significativamente reduzida em comparação com o pré-tratamento com o anticorpo DNP002. A Fig. 9 é um diagrama que ilustra o mesmo teste da FIG. 8 para as amostras de sangue de cinco (5) pacientes com câncer de estômago. A barra aberta significa a proporção de MDSC antes do tratamento com DNP002, e a barra fechada significa a proporção relativa de MDSC após o tratamento com DNP002. Após o tratamento com DNP002, pode ser visto que a proporção MDSC foi significativamente reduzida em todas as 5 amostras de pacientes.
5.2 Efeito de lise de DNP002 em MDSC em PBMC
[00167] A fim de esclarecer mais claramente a capacidade de morte direcionada a MDSC do anticorpo DNP002,
MDSC foi obtida apenas com a exclusão de neutrófilos maduros, e o efeito de morte de MDSC do anticorpo DNP002 foi testado sem o efeito de neutrófilos.
[00168] Especificamente, apenas a camada de PBMC contendo MDSC foi separada do sangue de dois pacientes com câncer de estômago usando a solução Ficoll-Paque PLUS (Ge Healthcare, Cat #: 17-1440-02). O gradiente de densidade de separação das células sanguíneas por meio da solução Ficoll exclui efetivamente os neutrófilos maduros, de modo que os efeitos de eliminação do MDSC podem ser analisados com mais precisão. As PBMC preparadas foram dispensadas a 1 × 105 por poço em uma placa de 12 poços e o anticorpo DNP002 foi adicionado a cada poço a uma concentração de 10 µg / mL, seguido por incubação a 37 ° C por 48 horas. Neste momento, a capacidade de matar MDSC foi comparada usando Nivolumab (Bristol-Myers Squibb) de um anticorpo contra PD-1, como um controle. Após o cultivo, as células foram lavadas com PBS, e o aumento ou diminuição do grupo MDSC foi analisado por citometria de fluxo (FIG. 10).
[00169] Como resultado da citometria de fluxo, o grupo tratado com DNP002 apresentou uma média de cerca de 49% de apoptose em relação ao grupo sem tratamento com DNP002. Por outro lado, o nivolumab usado como controle mostrou apenas cerca de 24% do efeito de eliminação do MDSC. O efeito de eliminação de MDSC foi o mesmo em ambos os MDSC isolados de dois pacientes. Portanto, este experimento confirma que o efeito de matar MDSC pelo anticorpo DNP002 é significativo.
[00170] O efeito de lise de MDSC por DNP002 foi confirmado para sangue total (Exemplo 5.1) e PBMC (células mononucleares de sangue periférico; Exemplo 5.2), respectivamente. No sangue total e PBMC, as células NK do paciente que podem induzir ADCC estão incluídas e podem lisar células CEACAM6-positivas com ADCC via DNP002. No entanto, no sangue total, os neutrófilos positivos para o antígeno alvo CEACAM6 e MDSC são misturados, e é difícil dizer que apenas os MDSs são seletivamente lisados. A fim de esclarecer a lise seletiva de MDSC por DNP002, um experimento adicional foi realizado em PBMCs em que os neutrófilos são removidos por separação de camadas com centrifugação (Exemplo 5.2). Consequentemente, foi confirmado que a lise de MDSC por DNP002 era evidente. Exemplo 6 - Efeito de lise de diferentes isotipos de anticorpos em MDSC
[00171] Para testar a capacidade do anticorpo DNP002 de matar o alvo MDSC, foram preparados três tipos de anticorpos DNP002. Os anticorpos diferem na afinidade para FcrRIII (CD16) expresso em células NK dependendo dos isotipos de anticorpos, e a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) aumenta proporcionalmente à afinidade. O isotipo IgG2 tinha uma afinidade muito baixa para FcrRIII e não tinha eficácia ADCC, enquanto o isotipo IgG1 tinha alta afinidade para FcrRIII e tinha excelente eficácia ADCC. Foi relatado que a eficácia ADCC de um anticorpo depende não apenas do isotipo, mas também da estrutura da cadeia de açúcar ligada à 297ª asparagina do anticorpo. Em particular, quando não há fucose na cadeia de açúcar, a eficácia do ADCC aumenta (Shitara K., et al, J Immunol Methods. 2005 Nov 30; 306 (1-2) Melhoria independente da subclasse de IgG da citotoxicidade celular dependente de anticorpos por remoção de fucose de oligossacarídeos ligados a Asn297).
[00172] Os testes in vitro foram realizados para testar a capacidade de matar alvos MDSC, dependendo do isótipo e da afucosilação do anticorpo DNP002. Tampão de lise de RBC de 1X RBC Lysis Buffer (ThermoFisher, Cat #: 00- 4333-57) foi adicionado ao sangue de cinco pacientes com câncer de estômago para lisar RBC e, em seguida, o produto foi derramado a 1 X 105 por poço em um 12- placa de poço. Três tipos de anticorpos, como tipo DNP002 IgG1, tipo DNP002 IgG2 e tipo IgG1 aflucosilado, foram adicionados a cada poço a uma concentração de 10 ug / mL e incubados em uma incubadora a 37 ° C por um dia. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e reagidas com anticorpos (anticorpos anti- HLA-DR, CD11b, CD33) contra os antígenos marcados com MDSC com fluorescência diferente a 4 ° C por 20 minutos. Após a lavagem com PBS, foi realizada a citometria de fluxo. A intensidade da coloração foi medida como um log da intensidade da fluorescência e expressa em unidades de dezenas.
[00173] Foi observado que o efeito de mortalidade de MDSC foi aumentado na ordem de IgG2, IgG1 e tipo IgG1 fucosilado em todos os cinco pacientes com câncer de estômago como sujeitos de teste (FIGS. 11a e 11b). A diferença no efeito de mortalidade de MDSC, de acordo com o isotipo e o grau de afucosilação (o teor de fucose é inferior a 10%) é considerada pela diferença na afinidade dos anticorpos para FcrRIII, e o efeito de mortalidade de MDSC pode ser entendido como o efeito ADCC por células NK.
[00174] Como mostrado na FIG. 11a, é um resultado representativo que confirma o tipo de formulação DNP002 capaz de remover MDSC com eficácia. Em comparação com a parte superior (controle), uma grande porção de MDSC permaneceu em DNP002 IgG2, mas a proporção de MDSC foi significativamente reduzida em DNP002 IgG1. Este teste confirmou que o efeito de morte de MDSC por DNP002 IgG1 foi significativamente alto, mas que por DNP002 IgG2 não foi significativo. Uma vez que o efeito ADCC do isótipo IgG2 estava ausente ou muito baixo em comparação com o isótipo IgG1, o efeito de morte de MDSC por DNP002 IgG1 foi inferido por ADCC.
[00175] Como mostrado na FIG. 11b, o mesmo teste que na FIG. 9 é testado e plotado em amostras de sangue de 5 pacientes com câncer de estômago, e o eixo horizontal do gráfico representa cada um dos 5 pacientes com câncer de estômago (P # 1, P # 2, P # 3., P # 4, P # 5). Os efeitos de mortalidade de MDSC foram observados na ordem de Controle, IgG2, IgG1 e IgG1-afucosilado. O isotipo IgG2 não tem efeito de morte de MDSC ou tem efeito insignificante, porque não tem função de ADCC, mas o efeito de mortalidade de MDSC é excelente em IgG1 com função de ADCC e IgG1-afucosilado com função de ADCC aumentada por desfucosilação. Exemplo 7 - Efeito de mortalidade de células cancerosas pelo uso combinado de DNP002 e células Natural killer
[00176] Os testes in vitro foram realizados para testar o efeito combinado do anticorpo DNP002 e células natural killer (NK). Depois de separar PBMC de três sangue normal usando solução Ficoll-Paque PLUS (Ge Healthcare, Cat
#: 17-1440-02), apenas células CD56-positivas natural killer foram isoladas usando microesferas CD56 (Miltenyi Biotec, Cat #: 130- 050-401). Nas FIGs. 12a e 12b, o eixo horizontal representa três doadores de sangue, que são as origens das células natural killer, respectivamente.
[00177] A linhagem de células de câncer de estômago A549 e a linhagem de células de câncer de pâncreas AsPC-1 que foram positivas para CEACAM6 de um antígeno alvo de DNP002, foram dispensadas em uma placa de 96 poços a 1 x 104 por poço, dispensadas com as células natural killer previamente isoladas a 2 x 105 por poço, tratada com anticorpo DNP002 a 10 µg / mL e, em seguida, foi incubada a 37° C durante 6 horas.
[00178] Como resultado da medição da viabilidade celular usando o kit de viabilidade celular EZ-cytox (Daeil Lab), foi confirmado que o efeito de apoptose pela combinação de anticorpo DNP002 e células assassinas naturais em ambas as linhas de células cancerosas aumentou em comparação com o tratamento único (Fig. 12a e Fig. 12b).
[00179] Isso indica que a capacidade de matar células cancerosas de DNP002 foi significativamente amplificada pela combinação com células natural killer. Por meio disso, é indicado que o tratamento de combinação com células NK ou agentes terapêuticos de células NK possa ser excelente para a remoção eficaz de MDSCs CEACAM6-positivos, bem como células cancerosas CEACAM6-positivas.
[00180] A lise seletiva de MDSC por DNP002 no Exemplo
5.2 e o efeito combinado com células NK ou agentes terapêuticos de células NK no Exemplo 7 confirmam que tanto células cancerígenas CEACAM6-positivas quanto MDSCs CEACAM6- positivas podem ser eliminados como alvos. Embora o Exemplo
5.2 e o Exemplo 7 mostrem ADCC para diferentes células alvo como MDSC e células cancerosas, respectivamente, no caso de pacientes com câncer em que dois tipos de células são realmente aumentados juntos, DNP002 pode remover simultaneamente ambos os tipos de alvos e pode ser usado em combinação com o agente terapêutico de células NK, a fim de dobrar a eficácia da remoção simultânea de células cancerosas e alvos de MDSCs. Exemplo 8 - Detecção de MDSC em microambiente de câncer de paciente CEACAM6-negativo
[00181] Uma vez que o antígeno CEACAM6 é expresso não apenas em células cancerosas, mas também em MDSC, é possível detectar não apenas células cancerosas, mas também MDSC usando o anticorpo DNP002. Para testar isso, MDSC, mas não células cancerosas, foram detectados em tecidos de pacientes com câncer com antígenos CEACAM6 positivos ou negativos, por imunohistoquímica (imunohistoquímica).
[00182] A coloração imuno-histoquímica foi realizada da seguinte maneira. O tecido foi desparafinado em xilol por 10 minutos em 3 vezes, álcool 100% por 10 minutos em 2 vezes, álcool 80% por 5 minutos e álcool 70% por 3 minutos, e então lavado com 3ª água destilada. Em seguida, o bloqueio da Peroxidase foi realizado por imersão em H2O2 0,03% por 10 minutos em temperatura ambiente, e lavado com 3ª água destilada. Imediatamente, a lâmina foi colocada em tampão citrato 1X (tampão citrato, pH 6,0), aquecida em água da torneira fervente por 20 minutos, resfrie lentamente, lave com água destilada 3ª e lavou novamente com PBS 1X. O anticorpo monoclonal de DNP002, anticorpo 8F5 reagiu na região do tecido à temperatura ambiente durante 90 ± 5 minutos a 150 ul (10 ug / ml) por lâmina. Após a reação, a lâmina foi lavada com 1X PBS por 5 minutos cada em 4 vezes. O anticorpo secundário reagiu com 100 µl por lâmina por 20 minutos em temperatura ambiente e, após a reação, foi lavado 4 vezes com 1X PBST por 5 minutos cada. O DAB Chromogen desenvolveu 100 µl por lâmina à temperatura ambiente durante 3 minutos e a lâmina foi lavada com água da torneira durante 10 minutos. A hematoxilina de Mayer foi contracorada em temperatura ambiente por 3 minutos a 100 µl por lâmina e lavada em água corrente por 10 minutos. Após a desidratação, a lâmina foi montada.
[00183] Como resultados da imunocoloração CEACAM6 em adenocarcinoma de pulmão que era CEACAM6 positivo em células cancerosas e carcinoma de células escamosas de pulmão, câncer de bexiga urinária e malignidade de melanoma que eram CEACAM6 negativo em células cancerosas, foi confirmado que havia MDSC CEACAM6 positivo em local não tumoral do tecido canceroso (Fig. 13). Isso indica que, independentemente da expressão do antígeno CEACAM6 em tecidos cancerígenos ou nas próprias células cancerosas, os MDSCs infiltrados em torno dos tecidos cancerosos podem ser usados como um alvo para diagnóstico e tratamento.
[00184] Independentemente do grau de CEACAM6 na superfície celular das células cancerosas, MDSC tendeu a aumentar em pacientes com câncer, o que poderia detectar e confirmar MDSCs infiltrando o microambiente tumoral como no
Exemplo 8. Isso indica que MDSC pode ser usado como um alvo para diagnóstico e fins de tratamento, independentemente da positividade de CEACAM6 em células cancerosas, quando considerado em conjunto com o resultado do Exemplo 5.2 que mostra a lise seletiva de MDSC.
A presença ou ausência da expressão de CEACAM6 na superfície celular das células cancerosas pode diferir dependendo do tipo de câncer, mas, independentemente disso, o MDSC está aumentado na maioria dos tipos de câncer.
Consequentemente, indica que DNP002 pode ser usado para fins diagnósticos e terapêuticos na maioria dos cânceres, visando MDSC.
Claims (26)
1. Agente de aumento imunológico caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c (Cluster of Diferenciação 66c), o qual é expresso em uma célula supressora derivada de mieloide (MDSC).
2. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de aumento da imunidade remove ou reduz uma atividade imunossupressora de MDSC por meio da atividade de regulação, produção ou morte celular de MDSC.
3. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de aumento da imunidade remove ou reduz a atividade imunossupressora de MDSC induzindo a morte celular de MDSC.
4. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de aumento da imunidade regula uma atividade imunossupressora de MDSC em uma atividade de célula T, célula NK ou célula T reguladora.
5. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de camundongo, anticorpo quimérico ou humanizado.
6. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende o domínio Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
7. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo fucosilado.
8. Agente de aumento imunológico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs): CDR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9, CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10, CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 13.
9. Agente de aumento imunológico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste na sequência estrutural (V-FR1) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 23, 24 , 25, 26 ou 27, sequência estrutural (V-FR2) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, sequência estrutural (V-FR3) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42, 43, 44, 45, 46 ou 47, e sequência estrutural (V-FR4) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.
10. Agente de aumento imunológico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste na sequência estrutural (L-FR1), incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 29, 30 ou 31, sequência estrutural (L-FR2) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 38, 39, 40 ou 41, sequência estrutural (L-FR3) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 48, 49, 50 , ou 51, e sequência estrutural (L-FR1) incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 58, 59, 60 ou 61.
11. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 14, 15, 16, 17 ou 18, e uma região variável de cadeia leve incluindo o aminoácido sequência de SEQ ID NOs: 8, 19, 20 ou 21.
12. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem a variabilidade de fluorescência contra o reagente ANS que é inferior a 200% a 62 ° C.
13. Agente de aumento da imunidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é scFv, (scFv)2, Fab, Fab' ou F(ab')2 do anticorpo anti-CD66c.
14. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada a MDSC caracterizada pelo fato de que compreende o agente de aumento da imunidade, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a
13.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a MDSC representam os fenótipos HLA-DR Low/ (-), CD11b + e CD33 +, exceto para linfócitos, e o número de MDSCs CD66c-positivas é aumentado em comparação com o de células normais.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que regula uma atividade supressora de MDSC na atividade da célula T, célula natural killer (célula NK) ou célula T reguladora.
17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a MDSC são câncer ou doenças inflamatórias.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a MDSC são Trypanosoma cruzi, Listeria monocytogenes, Leishmania major, helmintos, Candida albicans ou infecção por Porphyromonas gingivalis, toxoplasmose ou sepse polimicrobiana.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a MDSC são câncer de estômago, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de bexiga, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia monocítica aguda ou linfoma de Hodgkin ou linfoma não-Hodgkin.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que inibe o crescimento de células cancerosas ou a indução de metástase de câncer.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo do tipo IgG1 que reconhece CD66c e CD66b expressos em MDSC.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende ainda uma célula NK ou agente de terapia de células derivadas de células NK, bem como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD66c expresso em MDSC.
23. Composição para diagnóstico de doenças relacionadas a MDSC, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao Cluster de Diferenciação 66c (CD66c) o qual é expresso em uma célula supressora derivada de mieloide (MDSC) e detecta MDSC positivo para CD66c.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que uma amostra de diagnóstico é uma amostra biológica de um sujeito.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a MDSC representam os fenótipos HLA-DR Low / (-), CD11b + e CD33 +, exceto para linfócitos, e o número de MDSCs CD66c- positivos é aumentado em comparação com o de células normais.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que as doenças relacionadas a
MDSC são câncer de estômago, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de rim, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, bexiga câncer, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia monocítica aguda ou linfoma de Hodgkin ou linfoma não-Hodgkin.
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