ES2768784T3

ES2768784T3 - Anticuerpos anti-CEACAM6 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2768784T3
Application number: ES16713784T
Authority: ES
Inventors: Jörg Willuda; Mark Trautwein; Uwe Gritzan; Christoph Freiberg; Frank Dittmer; Dorian Schönfeld; Julian Glück; Jessica Pinkert; Sven Golfier; Simon Holton; Philip Beckhove; Yingzi Ge
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2036-03-21
Also published as: US11773164B2; JP2021058199A; US20180162940A1; EP3274370B1; CN107743495A; PE20171790A1; RU2739163C2; CN107743495B; EP3628688A1; BR112017020373A2; ZA201707138B; AR104047A1; TW201713693A; AU2016236270B2; US10584167B2; AU2016236270A1; IL254534B; EP3274370A2; RS59878B1; WO2016150899A3

Abstract

Un anticuerpo anti-CEACAM6 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: i. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 48, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 49 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 50 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 52, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 53 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 54, o ii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 106, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 107 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 108 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 110, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 111 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 112, o iii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 4, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 8, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 9 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 10, o iv. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 34, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 35 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 36 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 38, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 39 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 40, o v. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 120, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 121, y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 122 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 124, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 125 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 126, o vi. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 24, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 25 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 26 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 28, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 30, o vii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 76, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 77 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 78 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 80, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 81 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 82, o viii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 134, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 135 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 136 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 138, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 139 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 140, o ix. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 148, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 149 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 150 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 152, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 153 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 154, o x. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID Nº: 14, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 15 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 16 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 18, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 19 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 20, o xi. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 62, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 63 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 64 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 66, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 67 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 68, o xii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 92, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 93 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 94 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 96, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 97 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 98.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CEACAM6 y usos de los mismos

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones. La divulgación proporciona regiones de unión a antígeno y anticuerpos recombinantes y fragmentos funcionales que contienen tales regiones de unión a antígeno que son específicas de la CEACAM6 (molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6, CD66c, antígeno no específico de reacción cruzada, NCA, NCA-50/90) humana y de Macaca fascicularis, y que por lo tanto no presentan una reacción cruzada significativa con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas. La divulgación proporciona además procedimientos para generar este tipo de anticuerpos.

Por consiguiente, los anticuerpos se pueden usar para tratar el cáncer y otros trastornos y afecciones asociadas con la expresión de la CEACAM6. La invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos precedentes, vectores que contienen los mismos y composiciones farmacéuticas. La divulgación proporciona además kits con instrucciones para su uso.

Antecedentes de la invención

Una terapia basada en anticuerpos es un tratamiento eficaz y clínicamente establecido de diversos tipos de cáncer, incluyendo tumores sólidos. Por ejemplo, HERCEPTIN® se ha utilizado satisfactoriamente para tratar el cáncer de mama y RITUXAN® es eficaz en los tipos de cáncer relacionados con linfocitos B. Es fundamental para el desarrollo de una nueva terapia exitosa basada en anticuerpos el aislamiento de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular que se expresan preferencialmente sobre células diana (por ejemplo, células cancerosas, células inmunitarias, etc.), que puedan modificar funcionalmente la actividad del receptor correspondiente.

El bloqueo por anticuerpos de moléculas de control inmunitario para la activación de células inmunitarias y, por lo tanto, para inmunoterapia de cáncer, es un abordaje clínicamente validado. En el 2011, el anticuerpo Ipilimumab que bloquea CTLA-4 fue aprobado por la FDA para terapia de 2a línea del melanoma metastásico (Yervoy). Otro ejemplo es el bloqueo del eje PD-1/PD-L1 para lo cual hay varios fármacos ya sea aprobados o actualmente en desarrollo clínico, y para lo que se han informado respuestas clínicas impresionantes en melanoma, CCR y cáncer de pulmón (Henick y col., Expert Opin Ther Targets, diciembre de 2014;18(12):1407-20)).

Las proteínas de la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM) pertenecen a la familia de supergenes de inmunoglobulina (Ig) y en general presentan un dominio variable tipo (V) identificado como el dominio N. El dominio N es seguido ya sea por ninguno o por hasta seis dominios constantes de Ig tipo C2 (denominados A o B). Estos dominios extracelulares son necesarios para la funcionalidad de CEACAM como moléculas de adhesión intercelular homo y heterofílicas (Obrinck, Curr Opin Cell Biol., octubre de 1997; 9(5): 616-26) o como receptores de patógenos humanos y de roedores (Kuespert y col., Curr Opin Cell Biol., octubre de 2006; 18(5): 565-71; Voges y col., PLoS One, 2012; 7(6): e39908). Los receptores de CEACAM se asocian como dímeros u oligómeros y múltiples asociaciones con otros compañeros en la membrana y como consecuencia modulan funciones importantes. Además de su expresión en tejidos humanos, la familia de genes CEACAM está altamente conservada en otras 27 especies de mamífero y está mejor descrita en ratón, rata, ganado vacuno, perro, ornitorrinco y zarigüeya (Kammerer y Zimmermann, BMC Biol., 4 febrero de 2010; 8:12). La función biológica mejor caracterizada de las CEACAM es el soporte de la adhesión celular a través de sus interacciones homo y heterofílicas, incluyendo un papel en la diferenciación y formación de una estructura tisular tridimensional, la angiogénesis, la apoptosis, la supresión tumoral y metástasis. (Kuespert y col., Curr Opin Cell Biol., octubre de 2006; 18(5):565-71). Se describen más detalles sobre los miembros de la familia en otras revisiones (Horst y Wagener, Handb Exp Pharmacol., 2004;(165): 283-341; Gray-Owen y Blumberg, Nat Rev Immunol., junio de 2006; 6(6):433-46).

La CEACAM6 (molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6, CD66c, antígeno no específico de reacción cruzada, NCA, NCA-50/90) es una proteína de la superficie celular unida a glucosilfosfatidilinositol (GPI) con un dominio N y 2 dominios tipo C2 que intervienen en numerosas posibles interacciones dirigidas en cis o trans de las proteínas CEACAM a través de sus dominios extracelulares con una diversidad de receptores de membrana, de los cuales se han identificado unos pocos. (Beauchemin y Arabzadeh, Cancer Metastasis Rev., diciembre de 2013; 32(3-4):643-71).

La CEACAM6 se expresa en una diversidad de epitelios de tejidos normales humanos, tal como el colon (Blumenthal y col., BMC Cancer, enero de 2007, 3;7:2.), pulmón (Kolla y col., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 296: L1019-L1030) y granulocitos (Kuroki y col., Biochem Biophys Res Commun., 31 enero de 1992; 182(2):501-6). En el linaje granulocítico, CEACAM6 se expresó en todas las fases de la maduración granulocítica excepto por las células precursoras tempranas con comprometidas al linaje (Strickland y col., J Pathol., julio de 2009; 218(3): 380-90); Scholzel y col., American Journal of Pathology, 156 (2), 595-605). CEACAM6 no se expresa en roedores. (Beauchemin y col., Exp Cell Res., 1 de noviembre de 1999; 252(2):243-9).

La expresión de la CEACAM6 se ha descrito en varios cánceres. En el cáncer de colon, CEACAM6 está regulada al alza en el 55 % de los casos y es un factor de pronóstico independiente que permite la subdivisión de los pacientes en grupos de alto y bajo riesgo (Jantscheff y col., J Clin Oncol., 1 de octubre de 2003; 21(19):3638-46). En el adenocarcinoma pancreático, se encontró que el 92 % (n = 82) de las muestras de estudio analizadas eran positivas mientras que la expresión de la CEACAM6 era más prevalente en las lesiones PanIN de grado alto que en las de grado bajo (Duxbury y col., Ann Surg., marzo de 2005; 241(3): 491-6). Esto se confirmó en otro estudio donde >90 % de los adenocarcinomas pancreáticos invasivos (110 de 115 analizados) mostró una (sobre)expresión fuerte de la CEACAM6 (Strickland y col., J Pathol., julio de 2009; 218(3):380-90). Además, Blumenthal y col., informaron la expresión de la CEACAM6 en tumores de mama, en tumores pancreáticos, en adenocarcinomas de ovario, en adenocarcinoma de pulmón, metástasis de ganglios linfáticos y metástasis a partir de tumores de mama, colon y pulmón. (Blumenthal y col., BMC Cáncer, 3 de enero de 2007; 7:2).

La expresión de la CEACAM6 en cáncer de mama también fue informada por otros (Maraqa y col., Clin Cáncer Res., 15 de enero de 2008; 14(2):405-11; Poola y col., Clin Cancer Res., 1 de agosto de 2006;12(15):4773-83; Balk-Moller y col., Am J Pathol., abril de 2014;184(4):1198-208); Tsang y col., Breast Cancer Res Treat, noviembre de 2013;142(2):311 -22). Además, se ha informado la expresión de la CEACAM6 en mieloma múltiple (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de mayo de 2013; 121(22):4493-503), cáncer gástrico (Deng y col., Genet Mol Res., 26 de septiembre de 2014; 13(3):7686-97) y cáncer de cabeza y cuello (Cameron y col., Mol Cancer, 28 de septiembre de 2012;11:74).

La evidencia experimental respalda un papel para CEACAM6 como un regulador importante de la metástasis. Kim y col. han demostrado que al atenuar la expresión de la CEACAM6 en células LoVo usando un ARNsi específico de la CEACAM6 o al aumentar su expresión en células HCT116, respectivamente, se puede impedir o aumentar la invasión a través de la matriz extracelular (Kim y col., Clin Chim Acta, 16 de enero de 2013; 415:12-9). La supresión de la expresión de la CEACAM6 conduce a una actividad elevada del promotor de E-cadherina. Blumenthal y col. demostraron que CEACAM5 y CEACAM6 contribuían en la diseminación de CCR metastásico, lo que se podía bloquear mediante anticuerpos monoclonales in vivo. (Blumenthal y col., BMC Cancer, 3 de enero de 2007; 7:2). También se ha demostrado la expresión de la CEACAM6 en células positivas para CD133 en muestras de cáncer de colon que pueden formar esferas de colon enriquecidas en células madre cuya proliferación, potencial clonogénico, así como potencial tumorigénico in vivo eran significativamente impedidas luego de su silenciamiento (Gemei y col., Cancer, 15 de febrero de 2013;119(4):729-38). Se demostró que en cáncer de mama las muestras resistentes a tamoxifeno sobreexpresan CEACAM6 y que CEACAM6 era un predictor significativo de la recidiva de la enfermedad (Maraqa y col., Clin Cancer Res, 15 de enero de 2008;14(2):405-11). El silenciamiento de la CEACAM6 mediado por ARNsi en un derivado de células MCF7 resistentes a tamoxifeno MMU1 revirtió la resistencia endócrina, la independencia de anclaje de estas células y las propiedades invasivas (Lewis-Wambi y col., Eur J Cancer, agosto de 2008^{; 44(12):1770-9). En el adenocarcinoma de pulmón, la expresión de la CEACAM6 estaba significativamente}asociada con un resultado clínico adverso (Kobayashi y col., Br J Cancer, 6 de noviembre de 2012; 107(10):1745-53). En el cáncer de páncreas, el silenciamiento de la CEACAM6 con ARNsi revirtió la resistencia a anoikis adquirida de células tumorales pancreáticas Mia(AR). La sobreexpresión de la CEACAM6 en células de cáncer de páncreas Capan2 aumentó la resistencia a gemcitabina mientras que la supresión mediada por ARNsi de la expresión de la CEACAM6 en células BxPC3 las quimiosensibilizó al fármaco mediante modulación de la actividad de la AKT de una manera dependiente de Src (Duxbury y col., Cancer Res., 1 de junio de 2004; 64(11):3987-93). Estos efectos correspondían a una invasividad aumentada de las células de alta expresión de CEACAM6 que presentan actividad de c-src y expresión de metaloproteinasa de la matriz (MMP9) (Duxbury y col., Br J Cancer, 4 de octubre de 2004; 91(7):1384-90).

Las respuestas de los linfocitos T contra antígenos asociados a tumores se han descrito para muchos tumores (Beckhove y col., J Clin Invest., julio de 2004;114(1):67-76; Choi y col., Blood, 1 de marzo de 2005;105(5):2132-4; Sommerfeldt y col., Cancer Res., 15 de agosto de 2006; 66(16):8258-65; Schmitz-Winnenthal y col., Cancer Res., 1 de noviembre de 2005; 65(21):10079-87.; Jager y col., Proc Natl Acad Sci USA, 25 de abril de 2000; 97(9):4760-5; Romero y col., Adv Immunol., 2006; 92:187-224) y a menudo causan acumulación de linfocitos T de memoria específicos del tumor en los órganos linfoides o en la sangre (Choi y col., Blood, 1 de marzo de 2005; 105(5):2132-4; Feuerer y col., Nat Med, abril de 2001; 7(4):452-8; Letsch y col., Cancer Res., 1 de septiembre de 2003; 63(17):5582-6). Sin embargo, en general la capacidad de los linfocitos T para reaccionar contra células tumorales autólogas es baja (Horna y Sotomayor, Curr Cancer Drug Targets, febrero de 2007; 7(1):41-53); Yang y Carbone, Adv Cancer Res., 2004; 92:13-27). Muchos tumores tienen la capacidad para bloquear las funciones efectoras de los linfocitos T, lo cual contribuye a una actividad limitada de una inmunoterapia tumoral. Se ha demostrado la falta de respuesta de los linfocitos T contra células tumorales para una amplia diversidad de cánceres (Pardoll, Nat Immunol., diciembre de 2012; 13(12):1129-32).

La CEACAM6 también contribuye a la regulación de la respuesta de linfocitos T CD8+. Recientemente, Witzens-Harig y col. demostraron en mieloma múltiple que expresa varios miembros de la familia de las CEACAM que el tratamiento con mAb (forma siglada de monoclonal antibody: anticuerpo monoclonal) anti-CEACAM6 o el silenciamiento con ARNsi de la CEACAM6 restablecía la reactividad de los linfocitos T contra células plasmáticas malignas, lo que indica un papel de la CEACAM6 en la regulación de la respuesta de linfocitos T CD8+ (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de mayo de 2013; 121(22):4493-503). Hasta ahora, no se ha identificado un receptor para la CEACAM6 en los linfocitos T. Sin embargo, el cocultivo de células de mieloma positivas para CEACAM6 con linfocitos T dio como resultado la modulación de sucesos de señalización de linfocitos T, incluyendo una activación de fosfatasas SHP por unión a CEACAM6 (Lin y Weiss, J Cell Sci., enero de 2001; 114(Pt 2):243-4; Latour y col., Mol Cell Biol, agosto de 1997; 17(8):4434-41; Wen y col., J Immunol., 1 de diciembre de 2010;185(11):6413-9). CEACAM6 no tiene una capacidad de señalización intrínseca, y su capacidad inhibidora presumiblemente está mediada por la unión a receptores en la superficie de los linfocitos T. Un receptor tal puede ser, por ejemplo, CEACAM1, para el cual se ha descrito un mecanismo para la modulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. CEACAM1 (CD66a) tiene una cola citoplasmática que contiene un motivo inhibidor de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM). CEACAM1 se almacena en vesículas intracelulares y con la activación de los linfocitos T se externaliza rápidamente (24 h a 72 h) y se expresa en la superficie de los linfocitos T, donde interviene en el bloqueo de las funciones efectoras de los linfocitos T después de la unión homo o heterofílica a los ligandos expresados en las células diana (Gray-Owen y Blumberg, Nat Rev Immunol., junio de 2006; 6(6):433-46). La naturaleza de esta unión es desconocida y podría ser una unión homo o heterofílica a otras CEACAM o una unión a otros componentes de la matriz extracelular, receptores de factores de crecimiento, integrinas o cadherinas. Se han descrito interacciones homofílicas entre CEACAM1 y CEACAM1 (Ortenberg y col., Mol Cáncer Ther., junio de 2012; 11(6):1300-10). Se han descrito interacciones de CeACAM heterofílicas, por ejemplo, entre CEACAM1 y CEACAM5, y C^eACA^m6 y CEACAM8 (Cavallaro y Christofori, Nat Rev Cancer, febrero de 2004; 4(2): 118-32). Según se describió previamente, CEACAM6 es una diana muy atractiva para la intervención terapéutica en una inmunoterapia del cáncer. Según se indicó ya, CEACAM6 es un miembro de una familia de proteínas altamente homólogas. Un anticuerpo adecuado para una terapia en seres humanos, que alivia la inmunosupresión de la CEACAM6, debe por lo tanto poder distinguir entre CEACAM6 y otras proteínas parálogas como CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, cada una de las cuales presenta diferentes funciones y distribuciones tisulares, para restringir su modo de acción y la localización en la CEACAM6 y para evitar los efectos secundarios adversos indeseados.

Dado que CEACAM6 no solo se expresa en células tumorales sino también en tejidos normales (en especial granulocitos, pero también células epiteliales, por ejemplo, de pulmón, y células gastrointestinales - Chan y Stanners, Mol Ther., junio de 2004; 9(6):775-85; Strickland y col., J Pathol., julio de 2009; 218(3):380-90), resulta absolutamente crítico poder predecir el perfil de efectos secundarios adversos del anticuerpo terapéutico. Esto es aún más importante dado que el modo de acción anticipado será una inhibición de la inmunosupresión, es decir, una inmunoactivación, que puede dar como resultado peligros graves (incidente del ensayo TGN1412 con el superagonista de CD28; Suntharalingam y col., N Engl J Med., 7 de septiembre de 2006; 355(10):1018-28). De modo que los efectos indirectos sobre el sistema inmunitario además de los efectos directos sobre los granulocitos deben ser evaluados cuidadosamente. Para permitir el desarrollo de un anticuerpo terapéutico humano y un análisis de tolerabilidad preclínico predictivo, es obligatorio que el anticuerpo presente una reactividad cruzada relevante con una especie relevante para la toxicología, en el caso de la CEACa M6 con primates no humanos, preferentemente Macaca fascicularis (cinomolgo).

Como un prerrequisito, es necesario que un anticuerpo terapéutico se una con alta afinidad a la CEACAM6 de ser humano presente en células, que se una selectivamente a CEACAM6 (sin unirse a ningún parálogo), que sea reactivo de manera cruzada con la CEACAM6 de mono dentro de un orden de magnitud de una Kd monovalente (para reflejar la unión con seguridad en tejidos normales en el modelo de toxicología en monos, incluso a densidades de superficie bajas en condiciones de unión basadas en falta de avidez), que se una a un epítopo similar al de la CEACAM6 de ser humano, que pueda aliviar una inmunosupresión mediada por CEACAM6, que no sea inmunogénico en una terapia en seres humanos (es decir, un anticuerpo humano o humanizado) y que sea suficientemente estable como para permitir el desarrollo clínico, la formulación y el almacenamiento por períodos prolongados como un producto farmacéutico. Esto último es importante ya que se ha observado con anterioridad que la degradación física (en especial la agregación) puede potenciar la respuesta inmunitaria para una proteína terapéutica (Hermeling y col., Pharm Res., junio de 2004; 21(6):897-903) y que la agregación está estrechamente relacionada con el desplegado de la IgG y su estabilidad térmica (Vermeer y Norde, Biophys J. enero de 2000; 78(1):394-404).

Existen varios anticuerpos anti-CEACAM6. La mayoría de ellos son anticuerpos de reactivos no humanos, muchos de ellos son policlonales. En la mayoría de los casos, la especificidad y selectividad por la CEACAM6 de ser humano, así como la reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono no están desveladas o son desconocidas. Los anticuerpos terapéuticos dirigidos contra CEACAM6 también son conocidos en la técnica. Algunos no son selectivos para la CEACAM6 de ser humano (por ejemplo, MN-3 de Immunomedics, Neo201/h16C3 de Neogenix; ambos se unen además a la CEACAM5 de ser humano). El anticuerpo de un solo dominio 2A3 y sus variantes de fusión (documento WO2012040824 y Niu y col., J Control Release, 10 de julio de 2012; 161(1):18-24) no se ha caracterizado con respecto a selectividad y reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono (Cheng y col., Eur J Cancer. marzo de 2014; 50 (4):713-21). Song y col. (documento US 2011/212095 A1) desvela un anticuerpo anti-CEACAM6 que se une a un epítopo en el dominio 2 (dominio A). Lee y col. describen otros anticuerpos anti-CEACAM6 (Virchows Arch. Feb de 2015 Feb; 466(2):151-9) y por Riley y col. (Cancer Res. 1 de marzo de 2009;69 (5):1933-40).

No se han desvelado anticuerpos anti-CEACAM6 selectivos que aparentemente presenten reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono (Strickland y col., J Pathol., julio de 2009; 218(3):380-90).

El anticuerpo 9A6 murino (Genovac/Aldevron) es el único anticuerpo descrito que puede modular la actividad inmunosupresora de la C^eA^cAM6 (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de mayo de 2013; 121(22):4493-503). El 9A6 inhibe la actividad inmunosupresora de la CEACAM6, lo que conduce a una secreción potenciada de citocinas por parte de los linfocitos T in vitro y a una eficacia antitumoral in vivo (Khandelwal y col., Resumen de Póster 61, Resumen del Congreso del 22nd Annual International Cáncer Immunotherapy Symposium, 6-8 de octubre, 2014, Nueva York, EE.UU.). Aunque su selectividad parece ser la apropiada, no ha sido caracterizado previamente con respecto a su reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono. Además, su naturaleza murina impide una aplicación terapéutica directa en seres humanos.

Según se muestra en los ejemplos, el anticuerpo 9A6 se une a la CEACAM6 recombinante humana pero no se ha detectado unión a la CEACAM6 de Macaca mulatta o de Macaca fascicularis. A efectos comparativos, también se analizó el Neo201-hIgG1. Este anticuerpo presentó una alta afinidad de unión a ambas CEACAM6 de ser humano y de mono. Pero Neo201 se une a la CEACAM5 y la CEACAM6 de ser humanos y por ello no es específico para CEACAM6.

En conclusión, existe una gran necesidad de un anticuerpo monoclonal terapéutico que comprenda las siguientes características:

i. El anticuerpo es un ligante de alta afinidad de la CEACAM6 de ser humano.

ii. El anticuerpo es selectivo para CEACAM6, no se une a ningún parálogo, en especial CEACAM1, CEACAM3 y CEACAM5.

iii. El anticuerpo presenta reacción cruzada con la CEACAM6 de mono dentro de un orden de magnitud de la Kd monovalente.

iv. El anticuerpo no es inmunogénico en una terapia en seres humanos, es decir, es un anticuerpo humano o humanizado.

v. El anticuerpo puede aliviar la inmunosupresión mediada por CEACAM6.

Un anticuerpo tal no existe en la técnica anterior. El 9A6 que se une al dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 de ser humano es el único anticuerpo anti-CEACAM6 conocido que puede aliviar una inmunosupresión mediada por CEACAM6, pero no obstante no presenta reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono además de ser un anticuerpo de ratón. El Neo201 se une a un dominio diferente fuera del dominio 1 N-terminal de la CEACAM6. Se ha publicado que la eficacia terapéutica de Neo201-hIgG1 se basa en CCDA (Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2-6 de abril de 2011; Orlando, FL, Filadelfia (PA): AACR: Du y col., Cancer Res, 15 de abril, 2011; 71(suplemento 8): 4582).

Los inventores asumieron que el alivio de la inmunosupresión mediada por CEACAM6 está relacionado con la unión al dominio 1 N-terminal. Pero la generación de anticuerpos que se unen al dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 da como resultado un problema de selectividad que representa un reto.

El alineamiento de secuencias en la Figura 1 muestra un grado de similitud muy alta de secuencias proteicas de la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM3 de ser humano, la CEACAM5 de ser humano y la CeAcAM1 de ser humano por toda la región extracelular. La región diana (dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano) es especialmente similar a otras CEACAM, lo que también se refleja en la Tabla 7. Los parálogos de la CEACAM6 de ser humano (por ejemplo, la CEACAM1, la CEACAM3 y la CEACAM5) son mucho más similares a la CEACAM6 de ser humano que el ortólogo de cinomolgo. De hecho, solamente hay 2 posiciones en la región N-terminal en la secuencia primaria que son idénticas en la CEACAM6 de ser humano y de cinomolgo pero diferentes de los aminoácidos en los otros parálogos humanos (marcados con asteriscos en la Figura 1).

Inesperadamente, los inventores pudieron hallar un procedimiento para generar anticuerpos que comprendan todas las características de selectividad y funcionales deseadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones. La presente invención está relacionada con anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que presentan una alta afinidad por la proteína CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascicularis, y que no presentan una reacción cruzada significativa con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas. Esto significa que los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, son selectivos para CEACAM6. Los anticuerpos proporcionados se unen al dominio 1 N-terminal que está altamente conservada entre estas proteínas.

Los anticuerpos anti-CEACAM6 de la presente divulgación pueden cambiar in vitro el perfil de citocinas de linfocitos T específicos del tumor por un fenotipo más citotóxico y/o activado caracterizado por una secreción aumentada de IFN-gamma y/o IL-2, y/o TNF-alfa. Por ello, los anticuerpos de la presente divulgación pueden aliviar una inmunosupresión mediada por CEACAM6 e inducir una inmunoactivación, lo que finalmente da como resultado una eficacia antitumoral in vivo.

Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, interfieren con la interacción de la CEACAM6 y CEACAM1, lo que podría ser un mecanismo de modulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.

Por lo tanto, los anticuerpos de la divulgación son adecuados para el tratamiento del cáncer así como de sus metástasis, en particular tumores que expresan CEACAM6, tales como cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, forma siglada de non-small-cell lung cáncer), cáncer de pulmón microcítico (SCLC, forma siglada de small cell lung cáncer), cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de mama y mieloma múltiple.

La divulgación describe anticuerpos que se pueden distinguir de los anticuerpos anti-CEACAM6 existentes en que se pueden unir a la CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascicularis dentro de un orden de magnitud de una Kd monovalente (para reflejar la unión con seguridad en tejidos normales en un modelo de toxicología en monos, incluso a bajas densidades de superficie en condiciones de unión basadas en falta de avidez) y no presentan una reacción cruzada significativa con los parálogos CEACAM1, CEACAM3 y CEACAM5 estrechamente relacionados. Entonces, estos anticuerpos son adecuados para estudios toxicológicos preclínicos en monos cinomolgos para evaluar sus perfiles de seguridad. Dado que CEACAM6 no solo se expresa en células tumorales sino también en tejidos normales (en especial granulocitos, pero también células epiteliales, por ejemplo de pulmón, y células gastrointestinales - Chan y Stanners, Mol Ther., junio de 2004; 9(6): 775-85; Strickland y col., J Pathol., julio de 2009; 218(3): 380-90), resulta absolutamente crítico poder predecir el perfil de efectos secundarios adversos del anticuerpo terapéutico. Esto es aún más importante, dado que el modo de acción anticipado será una inhibición de la inmunosupresión, es decir, una inmunoactivación, lo que puede dar como resultado peligros graves (incidente del ensayo TGN1412 con el superagonista de CD28), de modo que los efectos indirectos sobre el sistema inmunitario además de los efectos directos sobre los granulocitos deben ser cuidadosamente evaluados.

Los anticuerpos anti-CEACAM6 muy preferidos de la divulgación están representados en la Tabla 1, caracterizados por sus características estructurales.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Gln60, Asn6l, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa, por ejemplo se une, con un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno, dos, tres cuatro, cinco, ocho, diez, quince o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa, por ejemplo se une, con un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

Un anticuerpo anti-CEACAM6 de la invención se podría coadministrar con medicamentos conocidos y, en algunos casos, se puede modificar el propio anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo se podría conjugar con un agente citotóxico, una inmunotoxina, un toxóforo o un radioisótopo para potencialmente aumentar aún más la eficacia. La divulgación proporciona además anticuerpos que constituyen una herramienta para el diagnóstico de condiciones malignas o displásicas, en las cuales la expresión de la CEACAM6 es elevada en comparación con el tejido normal. Se proporcionan anticuerpos anti-CEACAM6 conjugados con un marcador detectable. Los marcadores preferidos son un radiomarcador, una enzima, un cromóforo o un fluoróforo.

La invención también está relacionada con polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células que expresan los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para producir los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para inhibir el crecimiento de células displásicas usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y procedimientos para tratar y detectar el cáncer usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

La divulgación también está relacionada con secuencias de ácidos nucleicos aisladas, cada una de las cuales puede codificar un anticuerpo mencionado previamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para un epítopo de la CEACAM6. Los ácidos nucleicos de la invención son adecuados para la producción recombinante de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno. Por lo tanto, la invención también se relaciona con vectores y células hospedadoras que contienen una secuencia de ácido nucleico de la invención. Las composiciones de la invención se pueden usar en aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Por lo tanto, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno o una afección asociada con la presencia indeseada de células que expresan CEACAM6. En una realización preferida, el trastorno mencionado anteriormente es cáncer. Dicho procedimiento comprende las etapas de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención como se describe o contempla en el presente documento.

La presente divulgación además está relacionada con procedimientos para generar este tipo de anticuerpos. La divulgación proporciona instrucciones para utilizar una biblioteca de anticuerpos en el aislamiento de uno o más miembros de dicha biblioteca que se unan específicamente a la CEACAM6. Además, la divulgación proporciona instrucciones para inmunizar ratones a fin de producir líneas de células de hibridomas que secretan anticuerpos que se unen específicamente a la CEACAM6 y que presentan reacción cruzada con la CEACAM6 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo). Las instrucciones para la humanización de anticuerpos de murinos que se unen específicamente a la CEACAM6 también se proporcionan en la divulgación.

Descripción de las figuras

Figura 1: Alineamiento de secuencias de proteína de regiones extracelulares de parálogos de CEACAM6 de ser humano, así como también el ortólogo de CEACAM6 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo). Los números indican la posición de aminoácido después de la eliminación de la secuencia del péptido señal. Las posiciones de la región N-terminal en la secuencia primaria que son idénticas en CEACAM6 de humano y de cinomolgo, pero diferentes de los aminoácidos en esta posición en los otros parálogos humanos, se marcan con asteriscos. El dominio 1 N-terminal está dentro de un recuadro.

Figura 2: Secuencias de aminoácidos de los dominios variables VL y VH de TPP-2971. Las secuencias injertadas en los armazones humanos están resaltadas como letras en negrita subrayadas. Las CDR de acuerdo con la definición de Kabat están escritas en cursiva. Las letras sombreadas en gris representan diferencias de las secuencias de TPP-3187 en comparación con TPP-2971.

Figura 3: Secuencias de aminoácidos de los dominios variables VL y VH de TPP-3310 y TPP-3714. Las secuencias procedentes de las CDR murinas de TPP-2971 se resaltan como letras en negrita subrayadas. Las CDR de acuerdo con la definición de Kabat están escritas en cursiva. Los anticuerpos TPP-3310 y TPP-3714 difieren en dos aminoácidos dentro del armazón de VH, resaltados como letras subrayadas sin negritas.

Figura 4: Secuencias de aminoácidos de los dominios variables VL y VH de TPP-3820 y TPP-3821. Las secuencias procedentes de las CDR murinas de TPP-3187 se resaltan como letras en negrita subrayadas. Las CDR de acuerdo con la definición de Kabat están escritas en cursiva. Los anticuerpos TPP-3820 y TPP-3821 difieren en dos aminoácidos dentro del armazón de VH, resaltados como letras subrayadas sin negritas.

Figura 5: Efecto farmacológico in vitro de anticuerpos anti-CEACAM6 sobre la secreción de IFN-gamma de linfocitos T específicos para el péptido survivina y grado de esta secreción. A+B. Ensayo ELISpot para IFN-gamma de linfocitos T específicos para péptido survivina y células tumorales KS. Se cocultivaron 10.000 células tumorales KS junto con 2.500 LT para Survivina durante 20 h. La concentración de anticuerpo en el cocultivo fue de 30 |jg/ml. C. Ensayo de ELISA para IFN-gamma de LT específicos para péptido survivina y células tumorales KS. Se cocultivaron 10.000 células tumorales KS junto con 20.000 LT para survivina durante 20 h. La concentración de anticuerpo en el cocultivo fue de 30 jg/ml. El eje X muestra las diferentes condiciones analizadas: en A: 1 = 10.000 células KS; 2 = 2.500 linfocitos T; 3 = sin tratamiento con anticuerpo; 4 = control de anticuerpo de isotipo coincidente; 5 = TPP-3470 (9A6-hIgG2) 6 = TPP-3323; en B: 1 = 10.000 células KS; 2 = 2.500 linfocitos T; 3 = sin tratamiento con anticuerpo; 4 = control de anticuerpo de isotipo coincidente; 5 = TPP-3470 (9A6-hIgG2) 6 = TPP-3310; 7 = TPP-3707; en C: 1 = 10.000 células KS; 2 = 20.000 linfocitos T; 3 = sin tratamiento con anticuerpo; 4 = control de anticuerpo de isotipo coincidente; 5 = TPP-3470 (9A6-hIgG2) 6 = TPP-3310; 7 = TPP-3707; el eje Y corresponde a los recuentos de manchas de IFN-gamma por pocillo (en A y B) o la concentración de IFN-gamma en pg/ml (en C). Los asteriscos indican resultados estadísticamente significativos de acuerdo con la prueba t de Student para datos no apareados, bilateral. Las barras de error representan el ETM.

Figura 6: Efecto farmacológico in vitro de anticuerpos anti-CEACAM6 sobre la secreción de citocinas (IFN-gamma, IL-2 y TNF-alfa) de linfocitos T específicos para péptido survivina. A. Análisis por Luminex para IFN-gamma. B. Análisis por Luminex para IL-2. C. Análisis con Luminex para TNFa. Análisis con Luminex para citocinas de LT específicos para péptido survivina y células tumorales KS. Se cocultivaron 10.000 células tumorales KS junto con 20.000 LT para Survivina durante 20 h. La concentración de anticuerpo en el cocultivo fue de 30 |jg/ml. El eje X representa las diferentes condiciones analizadas: 1 = 10.000 células KS; 2 = 20.000 linfocitos T; 3 = sin tratamiento con anticuerpo; 4 = control de anticuerpo de isotipo coincidente; 5 = TPP-3470 (9A6-hIgG2) 6 = TPP-3310; 7 = TPP-3707; el eje Y corresponde a la concentración de citocinas en pg/ml.

Figura 7: Efecto de anticuerpos anti-CEACAM6 sobre el crecimiento tumoral in vivo. Se inocularon 2 x 106 células KS de cáncer de mama s.c. En el día 23 y 27 se inyectaron linfocitos T específicos de antígeno tumoral (específicos para péptido survivina) i.v. Se administraron 200 jg de anticuerpos anti-CEACAM6 o el control de isotipo coincidente i.p. en el día 22, 24, 26 y 28. El crecimiento tumoral se evaluó cada 2 a 3 días. Las barras de error representan el ETM. Eje Y = superficie tumoral (mm2); eje X = días; LT = linfocitos T específicos de péptido survivina. 1 = tratadas con PBS; 2 = tratamiento con linfocitos T y control de anticuerpo de isotipo coincidente; 3 = tratamiento con linfocitos T y TPP-3470 (9A6-hIgG2); 4 = tratamiento con linfocitos T y TPP-3310; 5 = tratamiento con linfocitos T y TPP-3707.

Figura 8: Secuencias anotadas de anticuerpos anti-CEACAM6 preferidos de la presente divulgación. Se proporcionan las secuencias de proteína y ADN para las cadenas pesada y ligera de las IgG así como también para las regiones VH y VL de anticuerpos seleccionados. Debajo de las secuencias están anotadas las regiones importantes (regiones VH y VL en las IgG de longitud completa, y las regiones CDR (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).

Figura 9: Ilustración esquemática del dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 de ser humano (TPP-1794, blanco) unido al fragmento Fab APP-1574 (las cadenas pesada y ligera están en color gris oscuro y claro, respectivamente).

Figura 10: Detalles de la interfaz de proteínas que se muestra en la Figura 9. Los restos seleccionados se representan en representación con barritas y coloreados como en la Figura 9. La numeración corresponde a TPP-1794 (SEQ-ID NO:169)

Figura 11: Ensayo de citotoxicidad xCELLigence usando linfocitos T CD8+ específicos para péptido survivina. A. 20.000 células tumorales KS de cáncer de mama en cocultivo con 20.000 linfocitos T específicas para survivina B. 40.000 células tumorales HCT-116-hC6 en cocultivo con 20.000 linfocitos T específicos para survivina. La citotoxicidad se controló durante ~100 h. Los anticuerpos se usaron a 30 jg/ml de concentración final: n.° 1, punto de tiempo de adición de los linfocitos T; n.°2, células tumorales solas; n.° 3, sin anticuerpo; n.° 4, control de anticuerpo de isotipo coincidente; n.° 5, Ac anti-PD-L1 como IgG2 humana; n.° 6, Ac TPP-3470 9A6 como IgG2 humana; n.° 7 TPP-3310 hIgG2. Los asteriscos indican resultados estadísticamente significativos de acuerdo con la prueba t de Student, para datos no apareados, bilateral. X, eje X, Tiempo (horas); Y, eje Y, índice celular normalizado.

Figura 12: Ensayo de citotoxicidad xCELLigence usando linfocitos T procedentes de pacientes de un cáncer de páncreas (TIL-12).

A y B: 10.000 células tumorales HCC2935 en cocultivo con 50.000 linfocitos infiltrantes de cáncer de páncreas (TIL-12). Se controló la citotoxicidad durante ~150 h. Se añadió un mAb biespecífico anti-CD3 x EpCAM (0,25 ng/ml) en el cocultivo para dirigir los linfocitos T contra las células tumorales independientes de HLA.

A: n.°1, adición de linfocitos T; n.° 2 células tumorales solamente; n.° 3, sin anticuerpo; n.°4, control de anticuerpo de isotipo coincidente; n.° 5, Ac anti-PD-L1 como IgG2 humana; n.° 6, TPP-3470; n.° 7 TPP-3310; los anticuerpos se usaron a 30 jg/ml.

B: Dependencia con la concentración del efecto mediado por TPP-3310: n.°1, adición de linfocitos T; n.°2, células tumorales solamente; n.° 3, TPP-3310 a 0,07 jg/ml; n.°4, TPP-3310 a 0,02 jg/ml; n.° 5, control de anticuerpo de isotipo coincidente a 50 jg/ml; n.°6, TPP-3310 a 0,021 jg/ml; n.° 7, t Pp-3310 a 0,062 jg/ml; n.° 8, TPP-3310 a 1,85 jg/ml; n.° 9, TPP-3310 a 5,5 jg/ml; n.° 10, TPP-3310 a 16,67 jg/ml; n.° 11, TPP-3310 a 50 jg/ml;

X- eje X, Tiempo (horas); Y, eje Y, índice celular normalizado

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones. La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos anticuerpos que tienen una afinidad específica por CEACAM6 y proporcionan un beneficio terapéutico a un sujeto. Los anticuerpos de la divulgación, que pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, se pueden usar en muchos contextos, que se describirán más acabadamente en el presente documento.

Definiciones

A menos que se los defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el significado que le dan los especialistas en la técnica a la que concierne la presente invención. Sin embargo, las siguientes referencias pueden proporcionarle al especialista en la técnica a la cual pertenece la presente invención una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención, y se puede hacer referencia a las mismas y usarse siempre que dichas definiciones sean consistentes con el significado comúnmente empleado en la técnica. Dichas referencias incluyen, pero sin limitación, Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); y Lackie y col., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3a ed. 1999); y Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman y Pober, 2a edición, W.B. Saunders Company. Se puede consultar cualquier recurso técnico adicional disponible para el especialista en la técnica, que proporcione las definiciones de los términos usados en el presente documento y que tengan el significado comúnmente entendido en la técnica. A los efectos de la presente invención, se definirán además los siguientes términos. Otros términos adicionales se definen en otra parte en la descripción. Según se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "la" y "el" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un gen" es la referencia a uno o más genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los especialistas en la técnica, y semejantes.

Los términos "polipéptido" y "proteína", se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más de los restos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos que no son de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de polipéptido particular también abarca implícitamente las variantes modificadas de forma conservativa de la misma.

En el presente documento los aminoácidos pueden estar denominados por los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos se pueden denominar por su código de una única letra comúnmente aceptado.

Según se usa en el presente documento, "CEACAM6" designa la "molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6", también conocida como "CD66c" (agrupación de diferenciación 66c) o antígeno no específico de reacción cruzada o NCA, o NCA-50/90. La CEACAM6 es una proteína unida a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de superficie celular implicada en la adhesión célula-célula. CEACAM6 es de alta expresión en la superficie de diferentes células tumorales como de cáncer de colon, pancreático, de mama y de pulmón.

Existe una secuencia de referencia para la CEACAM6 de ser humano disponible en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de referencia P40199.3 (SEQ ID NO: 179 = TPP-4639), que incluye un péptido señal (posiciones 1-34) y una cadena de un propéptido (posiciones 321-344). Se ha observado un polimorfismo de un solo nucleótido en la posición 239 (intercambio de G a V). El dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de ser humano consiste en los aminoácidos de las posiciones 35-320 de la SEQ ID NO: 179.

CEACAM6 de ser humano (SEQ ID NO: 179)

MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIG

YSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEA

TGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLS

VKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDGPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFIN

GTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI

Los inventores dedujeron una secuencia proteica de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo) y está representada por t Pp-4189 (SEQ ID nO: 177). El dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de cinomolgo consiste en los aminoácidos de las posiciones 35-320 de la SEQ ID NO: 177.

CEACAM6 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo) (SEQ ID NO: 177)

MGPPSAPPCRICVPWKEVLLTASLLTFWSPPTTAQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNTLG

FNWYKGERVDAKRLIVAYVIGTQQTTPGPAHSGREMIYSNASLLIQNVTQNDTGSYTLQAIKEDLVTEEA

TGRFWVYPELPKPYITSNNSNPVEDKDAVDFTCEPD1HSTTYLWWVNDQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLS

VKRNDAGAYECEIQNPVSANLSDPVILNVLYGPDVPTISPSNSNYRPGENLNLSCHAASNPTAQYSWFVN

GTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAYNSATGLNRTTVMMITVSGSAPGLSAVATVGIMIGVLARVALI

La organización de dominios de la CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascicularis (mono cinomolgo) es como sigue (basado en la secuencia de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de referencia P40199.3 y la SEQ ID NO: 179 = TPP-4639 y la SEQ ID NO: 177 = TPP-4189, respectivamente):

La proteína de longitud completa de la CEACAM1 de ser humano se encuentra disponible en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de referencia P13688.2 (SEQ ID NO: 173 = TPP-4185). El dominio extracelular maduro de la CEACAM16 de ser humano consiste en los aminoácidos de las posiciones 35-428 de la SEQ ID NO: 173.

CEACAM1 de ser humano (SEQ ID NO: 173) MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFG

YSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEA

TGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLS

VTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLIN

GTFQQSTQELFIPNITVNN SG SY TC HA NN SVT GC NR TT VK TI IV TEL SP WA KP QI KA SK TTV TG DK DS V

NLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNV

NYNALPQENGLSPGAIAGIVIGWAL VA LI AVA LA CF LH FG KT GR ASD QR DL TE HK PS VS NHT QD HS ND P

PNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASPSLTATEIIYSEVKKQ

La proteína de longitud completa de la CEACAM3 de ser humano se encuentra disponible en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de acceso P40198.2 (SEQ ID NO: 175 = TPP-4187). El dominio extracelular maduro de la CEACAM3 de ser humano consiste en los aminoácidos de las posiciones 35-155 de la SEQ ID NO: 175.

CEACAM3 de ser humano (SEQ ID NO: 175)

MGPPSASPHRECIPWQGLL LT AS LL NF WN PPT TA KL TI ES MP LS VAE GK EV LL LV HN LP QHL FG

YSWYKGERVDGNSLIVG YV IG TQ QA TP GA AYS GR ET IY TN AS LL IQN VT QN DI GF YT LQ VIK SD LV NE EA

TG QF HV YQ EN AP GL PVG AV AG IV TG VL VG VAL VA AL VC FL LL AK TGR TS IQ RD LK EQ QP QAL AP GR GP SH

SS AF SM SP LS TAQAPLPNPRTAASIYEELLKHDTNIYCRMDHKAEVAS

La proteína de longitud completa de la CEACAM5 de ser humano se encuentra disponible en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de acceso P06731.3 (SEQ ID NO: 176 = TPP-4188). El dominio extracelular maduro de la CEACAM5 de ser humano consiste en los aminoácidos de las posiciones 35-685 de la SEQ ID NO: 176.

CEACAM5 de ser humano (SEQ ID NO: 176)

M E S P S A P P H R W C I P W Q R L L L T A S L L T F W N P P T T A K L T I E S T P F N V A E G K E V L L L V H N L P Q H L F G

Y S W Y K G E R V D G N R Q I I G Y V I G T Q Q A T P G P A Y S G R E I I Y P N A S L L I Q N I I Q N D T G F Y T L H V I K S D L V N E E A

TG QF R V Y P E L P K P S I S S N N S K P V E D K D A V A F T C E P E T Q D A T Y L W W V N N Q S L P V S P R L Q L S N G N R T L T L F N

V T R N D T A S Y K C E T Q N P V S A R R S D S V I L N V L Y G P D A P T I S P L N T S Y R S G E N L N L S C H A A S N P P A Q Y S W F V N

GT FQ QS TQ EL F I P N I T V N N S G S Y T C Q A H N S D T G L N R T T V T T I T V Y A E P P K P F I T S N N S N P V E D E D A V A L T

C E P E I Q N T T Y L W W V N N Q S L P V S P R L Q L S N D N R T L T L L S V T R N D V G P Y E C G I Q N K L S V D H S D P V I L N V L Y G

PD DP TI SP SY TY YR PGV NL S L S C H A A S N P P A Q Y S W L I D G N I Q Q H T Q E L F I S N I T E K N S G L Y T C Q A N N S A S

G H S R T T V K T I T V S A E L P K P S I S S N N S K P V E D K D A V A F T C E P E A Q N T T Y L W W V N G Q S L P V S P R L Q L S N G N R

T L T L F N V T R N D A R A Y V C G I Q N S V S A N R S D P V T L D V L Y G P D T P I I S P P D S S Y L S G A N L N L S C H S A S N P S P Q

Y S W R I N G I P Q Q H T Q V L F I A K I T P N N N G T Y A C F V S N L A T G R N N S I V K S I T V S A S G T S P G L S A G A T V G I M I G

VL VGVALI

Las expresiones "anticuerpo anti-CEACAM6" y "un anticuerpo que se une a CEACAM6" se refieren a un anticuerpo capaz de unirse a CEACAM6 con una afinidad suficiente de manera tal que el anticuerpo sea de utilidad como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento a la CEACAM6. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-CEACAM6 a una proteína no CEACAM6, no relacionada, es menor que aproximadamente un 5 %, o preferentemente menor que aproximadamente un 2 % de la unión del anticuerpo a CEACAM6 medida, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (RPS). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a CEACAM6 tiene una constante de disociación (K^d) de < 1 j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, entre 10-8 M y 10-13 M, por ejemplo, entre 10-9 M y 10-13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CEACAM6 se une a un epítopo de la CEACAM6 que está conservado entre las CEACAM6 de especies diferentes.

El término "anticuerpo", según se usa en el presente documento, tiene por objeto referirse a moléculas de inmunoglobulina, preferentemente constituidas por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que normalmente están interconectadas mediante puentes disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviado en el presente documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada puede comprender, por ejemplo, tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio (CL). Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL normalmente está compuesta por tres CDR y hasta cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Según se usa en el presente documento, la expresión "regiones determinantes de complementariedad" (las CDR; por ejemplo, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los restos de aminoácidos de un dominio variable del anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable tiene normalmente tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Cada región determinante de complementariedad puede comprender restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" definida por Kabat (por ejemplo, que comprende aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5a Ed. Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, aproximadamente los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26- 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada (Chothia y Lesk; J Mol Biol, 196: 901-917 (1987)). En algunos casos, una región determinante de complementariedad puede incluir aminoácidos tanto de una región de CDR definida de acuerdo con Kabat como un bucle hipervariable.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco grandes clases de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunos de estas se pueden dividir además en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Una clase preferida de inmunoglobulinas para su uso en la presente invención es IgG.

Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman [alfa], [delta], [épsilon], [gamma] y [mu], respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Según se usa en el presente documento, los anticuerpos son los anticuerpos conocidos convencionalmente, y fragmentos funcionales de los mismos.

Un "fragmento funcional" o un "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define en el presente documento como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que conserva la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo normalmente se encuentra en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, por ejemplo, las regiones CDR1, 2 y/o 3; sin embargo, las regiones "marco conservadas" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión al antígeno, tal como por proporcionar un andamiaje para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los restos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferentemente los restos de aminoácidos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH, y con particular preferencia son las cadenas VL y VH completas (posiciones de aminoácido 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de acuerdo con el documento WO 97/08320).

Los "fragmentos funcionales", "fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno" o "fragmentos de anticuerpo" de la ^{invención incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')}2 ^{y Fv; diacuerpos; anticuerpos de un}solo dominio (los DAb), anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarios (scFv); y multiespecíficos, tal como bi y triespecífico, anticuerpos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editores (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Se considera que un anticuerpo distinto de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión ^{idénticos. El fragmento F(ab')}2 ^{o Fab se puede genomanipular para minimizar o eliminar por completo las}interacciones disulfuro intermoleculares que tienen lugar entre los dominios CH1 y CL.

La expresión "región Fc" en el presente documento, se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una fracción de la región constante. La expresión incluye secuencias nativas de regiones Fc y de regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de la cadena pesada de la IgG de ser humano se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otra manera en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o la región constante es acorde con el sistema de numeración EU, también llamado el índice EU, que se describe en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Las variantes de los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, contempladas en la invención son moléculas en las cuales se mantiene la actividad de unión del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.

Las "proteínas de unión" contempladas en la invención son, por ejemplo, miméticos de anticuerpos, tal como Afficuerpos, Adnectinas, Anticalinas, DARPins, Avímeros, Nanocuerpos (revisados por Gebauer M. y col., Curr. Opinion in Chem. Biol., 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. y col., Curr. Opinion in Pharmacology, 2008; 8:608-617). Un anticuerpo "humano", o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se define en el presente documento como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no (ya sea por completo o en parte) de una especie no humana. Un anticuerpo humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede proceder de un anticuerpo humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en el presente documento como un anticuerpo que tiene una secuencia que procede, por completo o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpo humanas conocidas. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo humano, o un fragmento del mismo, se puede lograr, por ejemplo, mediante análisis de una base de datos de secuencias de anticuerpos humanos, o fragmentos de anticuerpo, e ideando una secuencia de polipéptido utilizando los datos obtenidos de la misma. Otro ejemplo de un anticuerpo humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado a partir de una biblioteca de secuencias de anticuerpo de origen humano (por ejemplo, estando basada dicha biblioteca en anticuerpos tomados de una fuente humana natural). Los ejemplos de anticuerpos humanos incluyen los anticuerpos que se describen en Soderlind y col., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.

Un "anticuerpo humanizado" o un fragmento de unión a antígeno humanizado del mismo se define en el presente documento como uno (i) que procede de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico portador de un sistema inmunitario heterólogo), anticuerpo basado en una secuencia de la línea germinal humana; (ii) donde los aminoácidos de las regiones marco conservadas de un anticuerpo no humano se intercambian parcialmente por secuencias de aminoácidos humanas mediante ingeniería genética o (iii) injertado con CDR, en las que las CDR del dominio variable son de origen no humano, en tanto uno o más regiones marco conservadas del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si hubiera alguno) es de origen humano.

Un "anticuerpo quimérico", o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se define en el presente documento como uno en el que los dominios variables proceden de un origen no humano y algunos o todos los dominios constantes proceden de un origen humano.

La expresión "anticuerpo monoclonal", según se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el término "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de no ser una mezcla de anticuerpos discretos. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal resultan ventajosas porque normalmente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas. El término "monoclonal" no debe interpretarse como que precisa la producción del anticuerpo por ningún método particular. La expresión anticuerpo monoclonal incluye específicamente anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado de un componente de la célula que lo expresa. Los componentes contaminantes de la célula son materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos.

Un ácido nucleico "aislado" es uno que se ha identificado y separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

Según se usa en el presente documento, un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" un antígeno de interés, por ejemplo, una diana antigénica de un polipéptido asociado a tumor, es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea de utilidad como un agente terapéutico en el direccionamiento a una célula o tejido que expresa al antígeno, y no tiene una reactividad cruzada significativa con otras proteínas o no tiene una reactividad cruzada significativa con proteínas distintas de ortólogos y variantes (por ejemplo, formas mutantes, variantes de corte y empalme, o formas truncadas de forma proteolítica) del antígeno diana mencionado anteriormente. La expresión "reconoce específicamente" o "se une específicamente a" o es "específico de/para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular, según se usa en el presente documento, puede presentarse, por ejemplo, por un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una K^dmonovalente para el antígeno de menos de aproximadamente 10-4 M, como alternativa menos de aproximadamente 10-5 M, como alternativa menos de aproximadamente 10-6 M, como alternativa menos de aproximadamente 10-7M, como alternativa menos de aproximadamente 10-8M, como alternativa menos de aproximadamente 10-9M, como alternativa menos de aproximadamente 10-10M, como alternativa menos de aproximadamente 10-11 M, como alternativa menos de aproximadamente 10-12 M o menos. Un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" un antígeno si dicho anticuerpo puede discriminar entre tal antígeno y uno o más antígenos de referencia. En su forma más general, "unión específica", "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" se refieren a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, determinado, por ejemplo, en conformidad con uno de los siguientes procedimientos. Dichos procedimientos comprenden, pero sin limitación, resonancia de plasmón superficial (RPS), transferencias de Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y exploración de péptidos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA convencional. La calificación se puede realizar mediante desarrollo de color convencional (por ejemplo, un anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano picante y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). Se califica la reacción en determinados pocillos por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (= reacción negativa) puede ser una DO de 0,1; una reacción positiva típica puede ser una DO de 1. Esto significa que la diferencia positivo/negativo es de más de 5 veces, 10 veces, 50 veces y preferentemente más de 100 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión no se realiza usando un solo antígeno de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.

La "afinidad de unión" o "afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula y su compañero de unión. A menos que se indique de otra manera, según se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno). Habitualmente, se usa la constante de disociación "K^d" para describir la afinidad entre una molécula (tal como un anticuerpo) y su compañero de unión (tal como un antígeno), es decir, cuán fuertemente se une un ligando a una proteína particular. Las afinidades de ligando-proteína están influenciadas por interacciones intermoleculares no covalentes entre las dos moléculas. La afinidad se puede medir mediante procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los que se describen en el presente documento. En una realización, la "K^d" o "valor de K^d" de acuerdo con la presente invención se miden usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando los dispositivos adecuados que incluyen, pero sin limitación, instrumentos Biacore tal como Biacore T100, Biacore T200, Biacore 2000, Biacore 4000, Biacore 3000 (GE Healthcare Biacore, Inc.) o un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Según se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de linfocito T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activos, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, o combinaciones de los mismos, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia o "un anticuerpo que compite por la unión" con un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo con su antígeno en un ensayo de competencia en un 10%, 20%, 30 %, 40 %, 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

Un "anticuerpo que se une a un epítopo de una proteína diana Z, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácido X1, X2, X3, ..." es un anticuerpo que comprende átomos dentro de 5 A, preferentemente dentro de 4 A, de los átomos de dichos restos de aminoácidos X1, X2, X3, ... de la proteína diana Z después de la unión del anticuerpo a su proteína diana. Dichos epítopos se pueden determinar usando una estructura cristalina por rayos X como se ejemplifica en el Ejemplo 16.

La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "CCDA" se refiere a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores Fc gamma (FcyR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos NK, neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora del antígeno y a continuación que destruyan la célula diana, por ejemplo con citotoxinas. Para evaluar la actividad de CCDA de un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de CCDA in vitro, tal como el que se describe en la Patente de Estados Unidos. N.° 5.500.362 o 5.821.337 o en la Patente de Estados Unidos N.° 6.737.056 (Presta). Las células efectoras que son de utilidad para tales ensayos incluyen CMSP y linfocitos NK.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en la presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento es iniciada por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase apropiada), que están unidos a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de la región Fc alteradas (polipéptidos con una región Fc variante) y con una unión a C1q aumentada o disminuida se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642.

Según se usa en el presente documento, un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con una fracción heteróloga (por ejemplo, una fracción citotóxica) o un radiomarcador. Este anticuerpo desnudo puede estar presente en una composición farmacéutica.

El término "inmunoconjugado" (denominado indistintamente "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC" (forma siglada de antibody-drug congugate)) se refiere a un anticuerpo conjugado a uno o más agentes citotóxicos o citostáticos, tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Los inmunoconjugados se han usado para el suministro local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que destruyen o inhiben el crecimiento o la proliferación de células, en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, Liu y col., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618 8623)). Los inmunoconjugados permiten un suministro dirigido de una fracción farmacológica en un tumor, y la acumulación intracelular en el mismo, donde una administración sistémica de los fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles de toxicidad inaceptables en células y/o tejidos normales. Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tal como la toxina diftérica, toxinas vegetales tal como ricina, toxinas de molécula pequeña tal como geldanamicina. Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de la topoisomerasa.

El "porcentaje ( %) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polinucleótido o de polipéptidos de referencia respectivamente, se define como el porcentaje de restos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de polinucleótido o de polipéptido de referencia, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Las sustituciones conservativas no se consideran como parte de la identidad de secuencia. Se prefieren los alineamientos sin huecos. El alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro del conocimiento en la técnica, por ejemplo, usando un conservativa disponible al público, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los especialistas en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr un alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias a comparar.

La "homología de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que ya sea es idéntico o que representa sustituciones de aminoácidos conservativas.

La expresión "anticuerpos madurados" o "fragmentos de unión a antígeno madurados", tales como variantes de Fab madurados, incluye derivados de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que presenta una unión más fuerte - es decir, una unión con una afinidad aumentada - a un antígeno dado, tal como el dominio extracelular de una proteína diana. La maduración es el procedimiento de identificar un pequeño número de mutaciones, por ejemplo, dentro de las seis CDR de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo, que conduzca a este aumento de la afinidad. El procedimiento de maduración es la combinación de procedimientos de biología molecular para la introducción de mutaciones en el anticuerpo y una exploración para identificar los ligantes mejorados.

Un anticuerpo "antagonista" o un anticuerpo "bloqueante" es uno que inhibe significativamente (ya sea parcialmente o completamente) una actividad biológica del antígeno al que se une.

Un anticuerpo "agonista" o un anticuerpo con "actividad agonista" es uno que se une a su diana e induce la activación (ya sea parcialmente o completamente) de la diana respectiva, que conduce, por ejemplo, a la activación de las rutas de señalización o los efectos biológicos (ya sea parcialmente o completamente) que están mediadas por la diana respectiva. Un anticuerpo "agonista" o un anticuerpo con "actividad agonista", según se usa en el presente documento, es un anticuerpo que puede imitar al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

La expresión "formulación farmacéutica" / "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permitirá la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma para que sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto a quien se le administrará la formulación.

El término "vector", según se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual está unido. El término incluye al vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como al vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la cual fue introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos con los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento como "vectores de expresión".

Las expresiones "célula hospedadora", "línea de células hospedadoras" y "cultivo de células hospedadoras" se usan indistintamente y se refieren a células en las cuales se han introducido ácidos nucleicos exógenos, incluyendo la progenie de tales células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes", "células transformadas", "transfectantes", "células transfectadas" y "células transducidas", que incluyen la célula primaria transformada/transfectada/transducida y la progenie procedente de la misma, sin considerar el número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica, en cuanto al contenido de ácidos nucleicos, a una célula parental, sino que puede contener mutaciones. Se incluye en el presente documento la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada o seleccionada en la célula transformada originalmente. Anticuerpos de la presente invención

La presente invención está relacionada con anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que por lo tanto no reaccionan significativamente de manera cruzada con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas.

Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen específicamente al dominio extracelular maduro de la CEACAM6 y el dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y no presentan una reacción cruzada significativa con los dominios extracelulares maduros de la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas. Los dominios extracelulares maduros podrían ser parte de las proteínas de longitud completa expresadas en la superficie celular, así como proteínas solubles (de origen natural o expresadas de manera recombinante).

Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen específicamente a proteínas que comprenden el dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de ser humano y/o el dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de Macaca fascicularis y no presentan una reacción cruzada significativa con proteínas que solamente comprenden los dominios extracelulares maduros de la CEACAM1 de ser humano y/o de la CEACAM3 de ser humano, y/o de la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas.

En una realización de la presente divulgación se proporcionan anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que son específicos de la CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascilularis, lo que significa que los anticuerpos presentan reactividad cruzada con la CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascilularis.

Es una realización de la presente divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que sean selectivos de la CEACAM6, lo que significa que no presentan una reacción cruzada significativa con la CEACAM1, la CEACAM3 y la CEACAM5 estrechamente relacionadas.

Es otra realización de la divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unan a la CEACAM6 de ser humano y que presenten reactividad cruzada con la CEACAM6 de otra especie incluyendo, pero sin limitación, monos, con una afinidad similar. Preferentemente, dicha otra especie es un primate no humano, tal como, por ejemplo, Macaca fascicularis, Macaca mulatta, orangután, gorila y chimpancé. Muy preferentemente, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen a la CEACAM6 de ser humano y presentan reactividad cruzada con la CEACAM6 de cinomolgo.

Un anticuerpo monoclonal que se unen al antígeno 1 (Ag1) tiene "reactividad cruzada" con el antígeno 2 (Ag2) cuando los valores de CE⁵⁰y/o de K^dse encuentran en un intervalo similar para ambos antígenos. En la presente divulgación, un anticuerpo monoclonal que se une al Ag1 presenta reactividad cruzada con Ag2 cuando la relación de la afinidad por Agí con respecto a la afinidad por Ag2 es igual o menor que 10 (< 10) e igual o mayor que 0,1 (> 0,1), lo que significa que las afinidades por Ag1 y Ag2 no difieren en más de un factor de 10 (las afinidades se encuentran dentro de un orden de magnitud de la K^dmonovalente), con la condición que las afinidades se midan con el mismo procedimiento en el mismo contexto experimental para ambos antígenos.

Por consiguiente, el anticuerpo de acuerdo con la divulgación tiene una relación de la afinidad por la CEACAM6 de ser humano con respecto a la afinidad por la CEACAM6 de Macaca fascicularis que es igual o menor que 10 (< 10) e igual o mayor que 0,1 (> 0,1), lo que significa que las afinidades por la CEACAM6 de ser humano y de Macaca fascicularis no difieren en más de un factor de 10 (las afinidades se encuentran dentro de un orden de magnitud de la K^dmonovalente). Por lo tanto, el anticuerpo de la presente divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, de acuerdo con la invención, se puede usar en estudios toxicológicos realizados en monos debido a que el perfil de toxicidad observado en monos sería importante para anticipar los potenciales efectos adversos en seres humanos.

Un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno 1 (Ag1) "no presenta una reactividad cruzada significativa" con el antígeno 3 (Ag3) cuando las afinidades son muy diferentes para los dos antígenos. La afinidad por Ag3 no será medible si la respuesta de unión (la señal de unión medida en un ensayo) es demasiado baja. En la presente divulgación, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 "no presenta una reactividad cruzada significativa" con Ag3, cuando la respuesta de unión (la señal de unión medida en un ensayo) del anticuerpo monoclonal a Ag3 es menor que un 5 %, preferentemente menor que un 2 %, de la respuesta de unión del mismo anticuerpo monoclonal a Ag1 en el mismo contexto experimental y a la misma concentración de anticuerpo. En la práctica, la concentración de anticuerpo usada puede ser la CE⁵⁰o de K^do la concentración necesaria para alcanzar la meseta de saturación obtenida con Ag1.

De acuerdo con la divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, no presentan una reactividad cruzada significativa con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano.

Una realización preferida de la divulgación tiene una afinidad por la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis que es < 400 nM, preferentemente < 200 nM, como alternativa preferentemente < 100 nM, determinada como la afinidad monovalente para la CEACAM6 recombinante (véase el Ejemplo 2) como se muestra en la Tabla 13, la Tabla 18 y la Tabla 20.

De acuerdo con la divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen al dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 179) y al dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177) (las afinidades se encuentran dentro de un orden de magnitud de la K^dmonovalente). El dominio 1 de la CEACAM6 también se conoce como dominio N.

En una realización de la divulgación se proporcionan anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente al dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ iD NO: 179) y específicamente al dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177) con afinidades (K^dmonovalente) que se encuentran dentro de un orden de magnitud. Son muy preferidos los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que tienen afinidad por el dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano y por el dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis con una K^d< 100 nM. Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen específicamente a proteínas que comprenden el dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 179) y/o el dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177).

Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen específicamente a proteínas que comprenden el dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 179) y/o el dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177) y no presentan una reacción cruzada significativa con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas.

Los anticuerpos de la presente divulgación, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen específicamente a proteínas que comprenden el dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 179) y/o el dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177) y no presentan una reacción cruzada significativa con proteínas que solamente comprenden los dominios extracelulares maduros de la CEACAM1 de ser humano y/o de la CEACAM3 de ser humano, y/o de la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas.

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente al dominio extracelular maduro de la CEACAM6 y al dominio extracelular maduro de la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que compiten por la unión con el anticuerpo 9A6 (Genovac/Aldevron) en la CEACAM6 de ser humano y no presentan una reacción cruzada significativa con los dominios extracelulares maduros de la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano estrechamente relacionadas.

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se une específicamente al dominio 1 de la CEACAM6 de ser humano (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 179) y al dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (representado por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177), y que compiten por la unión al anticuerpo 9A6 (Genovac/Aldevron) en la CEACAM6 de ser humano.

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que interfieren con la interacción de CEACAM6 y CEACAM1. Un anticuerpo interfiere con la interacción de la CEACAM6 y CEACAM1, cuando la señal de unión de un complejo de anticuerpo-CEACAM6 preformado se ha reducido en más de un 20 %, preferentemente más de un 50 % en comparación con la de la proteína CEACAM6 sola en un ensayo de unión con la CEACAM1 típico que se proporciona en los ejemplos. La interferencia con la interacción de CEACAM6 y CEACAM1 podría ser un mecanismo para la modulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que tienen una actividad inmunomoduladora. La "inmunomodulación" es el ajuste de la respuesta inmunitaria a un nivel deseado como en la inmunopotenciación, inmunosupresión o inducción de la tolerancia inmunológica. Un fármaco de "anticuerpo inmunomodulador" es un agente modificador de la respuesta inmunitaria que estimula o suprime la respuesta inmunitaria para el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, cáncer, o para antiinflammación. La divulgación proporciona un anticuerpo anti-CEACAM6 inmunomodulador, como se muestra en el Ejemplo 11, que bloquea la CEACAM6, que es un ligando supresor sobre las células inmunitarias presente en células cancerosas y potencialmente otras células, incluyendo componentes del sistema inmunitario, que da como resultado un cambio del perfil de expresión de marcadores inmunológicos y el estado de activación de los linfocitos T hacia una reactivación de linfocitos T antitumorales y una respuesta inmunitaria contra el cáncer eficaz. Se prefiere un anticuerpo que se una al dominio 1 de la CEACAM6.

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que pueden aliviar la inmunosupresión mediada por CEACAM6 de linfocitos T específicos para antígeno tumoral medida ya sea mediante la secreción de IFN-gamma por los linfocitos T específicos para antígeno tumoral o el número de linfocitos T activados secretores de IFN-gamma. Un anticuerpo anti-CEACAM6 puede aliviar la inmunosupresión mediada por CEACAM6 de linfocitos T específicos para antígeno tumoral si un anticuerpo en cocultivo de linfocitos T específicos para tumor con células tumorales produce un aumento de >1,2, preferentemente >1,5 veces de la secreción de IFN-gamma en comparación con las muestras de control. Preferentemente, los linfocitos T específicos para antígeno tumoral son linfocitos T CD8+. Se prefiere un anticuerpo que no presenta una reacción cruzada significativa con la CEACAM1, la CEACAM3 y la CEACAM5 estrechamente relacionadas y que se une al dominio 1 de la CEACAM6. Esto se muestra a modo de ejemplo mediante el bloqueo de la CEACAM6 por los anticuerpos de la divulgación en el cocultivo de linfocitos T CD8+ específicos para péptido de survivina con células tumorales KS, lo que produce un aumento de >1,5 veces de la secreción de IFN-gamma en comparación con las muestras de control que se trataron con el control de isotipo coincidente (Figura 5 y Figura 6). Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y la CEACAM6 de Macaca fascicularis, y que pueden cambiar el perfil de citocinas de linfocitos T específicos para antígeno tumoral hacia un fenotipo más citotóxico y/o activado caracterizado por una secreción aumentada de IFN-gamma y/o IL-2, y/o TNF-alfa. Preferentemente, los linfocitos T específicos para antígeno tumoral son linfocitos T CD8+ y el fenotipo es una secreción aumentada de IFN-gamma e IL-2 y TNF-alfa. Un anticuerpo anti-CEACAM6 puede cambiar el perfil de citocinas de linfocitos T específicos para antígeno tumoral hacia un fenotipo más citotóxico y/o activado si el anticuerpo en el cocultivo de linfocitos T CD8+ específicos para tumor con células tumorales produce un aumento >1,2, preferentemente >1,5 veces de la secreción de IFN-gamma y/o IL-2, y/o TNF-alfa en comparación con las muestras control que se trataron con el control de isotipo coincidente. El bloqueo de la CEACAM6 por los anticuerpos de la divulgación en el cocultivo de linfocitos T específicos para péptido de survivina con células tumorales KS produce un aumento de >1,5 veces en la secreción de IFN-gamma, IL-2 y TNF-alfa en comparación con las muestras control que se trataron con el control de isotipo coincidente (Figura 6).

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen a una amplia gama de diferentes líneas celulares que expresan CEACAM6 incluyendo, pero sin limitación, las que se muestran en los ejemplos. Estos ejemplos incluyen líneas celulares humanas de muchos orígenes tumorales (por ejemplo, NSCLC, SCLC, CCR, CAPanc, CAMama, CAGástrico, mieloma múltiple, cuello uterino, cáncer de piel, que representan las indicaciones de cáncer descritas previamente en la bibliografía como positivas para CEACAM6 (véase la introducción o la revisión de Beauchimen y Arabzadeh, Cáncer Metástasis Rev., diciembre de 2013; 32(3-4):643-71).

Es una realización de la divulgación proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que son seguros para su administración a seres humanos. Preferentemente, los anticuerpos son quiméricos, humanizados o humanos. Son muy preferidos los anticuerpos humanizados o humanos.

No obstante, en determinados ensayos se prefiere la expresión de los anticuerpos de la presente invención como IgG murinas; por ejemplo, se puede analizar la inmunohistoquímica con muestras humanas con mayor facilidad usando anticuerpos murinos o anticuerpos quiméricos humanos-ratón.

Es otra realización de la divulgación proporcionar anticuerpos que constituyen una herramienta para el diagnóstico de afecciones malignas o displásicas en las cuales está elevada la expresión de CEACAM6, en comparación con el tejido normal o en donde la CEACAM6 se desprende de la superficie celular y se vuelve detectable en suero. Se proporcionan anticuerpos anti-CEACAM6 conjugados con un marcador de detección. Los marcadores preferidos son un radiomarcador, una enzima, un cromóforo o un fluoróforo.

En todo este documento, se hace referencia a los siguientes anticuerpos anti-CEACAM6 preferidos de la invención representados en la Tabla 1.

continuación

Tabla 1: Secuencias proteicas de los anticuerpos preferidos de la presente invención

Las secuencias de los anticuerpos preferidos de la presente invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos representados en la Tabla 1 se proporcionan y explican además en la Figura 8.

TPP-3308 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 43 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 44.

TPP-3310 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 57 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 58.

TPP-3714 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 129 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 130.

TPP-3323 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 85 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 86.

TPP-3820 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 143 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 144.

TPP-3821 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 157 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 158.

TPP-3322 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 71 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 72.

TPP-3707 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 115 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 116.

TPP-3705 representa un anticuerpo que comprende una región de la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 101 y una región de la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 102.

En una realización preferida adicional de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, comprenden secuencias de CDR de la cadena pesada o ligera que son al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a al menos una, preferentemente correspondiente, secuencia de CDR de los anticuerpos "TPP-2971", "TPP-3186", "TPP-3187", "TPP-3308", "TPP-3310", "TPP-3322", "TPP-3323", "TPP-3705", "TPP-3707", "TPP-3714", "TPP-3820", "TPP-3821" o al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% o 95% idénticas a la secuencia de VH o VL de "TPP-2971", "TPP-3186", "TPP-3187", "TPP-3308", "TPP-3310", "TPP-3322", "TPP-3323", "TPP-3705", "TPP-3707", "TPP-3714", "TPP-3820", "TPP-3821", respectivamente.

En una realización preferida adicional, el anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende al menos una secuencia de CDR o al menos una secuencia de la cadena pesada variable o la cadena ligera variable representada en la Tabla 1.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 5 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 6 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 8 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 9 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 10 (L-CDR3).

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 35 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 36 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 38 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 39 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 40 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 48 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 49 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 50 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 52 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 53 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 54 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 120 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 121 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 122 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 124 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 125 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 126 (L-CDR3).

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 25 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 26 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 29 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 30 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 76 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 77 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 78 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 80 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 81 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 82 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 134 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 135 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 136 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 138 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 139 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 140 (L-CDR3).

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 148 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 149 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 150 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 152 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 153 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 154 (L-CDR3).

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 62 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 63 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 64 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 66 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 67 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 68 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 14 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 15 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 16 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 18 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 19 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 20 (L-CDR3). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 106 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 107 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 108 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 110 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 111 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 112 (L-CDR3).

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 92 (H-CDR1), la SEQ ID NO: 93 (H-CDR2) y la SEQ ID NO: 94 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 96 (L-CDR1), la SEQ ID NO: 97 (L-CDR2) y la SEQ ID NO: 98 (L-CDR3). Los anticuerpos difieren en secuencia, no solo dentro de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR), sino también en la región marco conservada (FR). Estas diferencias de secuencia están codificadas en los diferentes genes V. El repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos ya se secuenció por completo. Hay aproximadamente 50 genes de línea germinal de VH funcionales que se pueden agrupar en seis subfamilias, de acuerdo con la homología de secuencia, VH1, VH2, VH3, VH4, VH5 y VH6 (Tomlinson y col., 1992, J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda y Honjo, 1996, Advan. Immunol. 62, 1-29). Se conocen aproximadamente 40 genes de VL kappa funcionales que comprenden siete subfamilias (Cox y col., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 827-836; Barbie y Lefranc, 1998, Exp. Clin. Immunogenet. 15, 171-183): Vkappa1, Vkappa2, Vkappa3, Vkappa4, Vkappa5, Vkappa6 y Vkappa7. En el presente documento se desvelan cadenas pesadas de anticuerpos de la presente invención que pertenecen a la subfamilia VH2 humana y las cadenas ligeras de los anticuerpos de la presente invención que pertenecen a la subfamilia Vkappa1 humana, respectivamente. Se sabe que las secuencias de armazón de los anticuerpos que pertenecen a la misma subfamilia están estrechamente relacionadas, por ejemplo, los anticuerpos que comprenden un miembro de la subfamilia VH3 humana, comparten una estabilidad comparable (Honegger y col., 2009, Protein Eng Des Sel. 22(3):121-134). Es un hecho bien conocido en la técnica que las CDR de los anticuerpos se pueden injertar en diferentes armazones al tiempo que se mantienen las características especiales del correspondiente anticuerpo original. Se han injertado CDR satisfactoriamente en armazones que pertenecen a diferentes especies, así como en armazones de la misma especie que pertenecen a una subfamilia diferente. En una realización adicional, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la invención comprende al menos una secuencia de CDR de anticuerpo de la invención representada en la Tabla 1 y una secuencia de armazón de la cadena variable humana.

En una realización preferida, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la invención comprende una cadena ligera variable o una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la secuencia L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 de la cadena ligera variable y una cadena pesada variable o una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la secuencia H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 de la cadena pesada variable del anticuerpo de la invención representada en la Tabla 1 y una secuencia de armazón de la cadena ligera variable humana y la cadena pesada variable humana.

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 3 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 7 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 33 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 37 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 119 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 123 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 23 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 27 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 75 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 79 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 133 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 137 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 147 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 151 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 13 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 17 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 61 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 65 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 105 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 109 (VL).

En una realización muy preferida, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 91 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 95 (VL).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno, dos, tres cuatro, cinco, ocho, diez, quince o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la invención, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno, dos, tres cuatro, cinco, ocho, diez, quince o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno, dos, tres cuatro, cinco, ocho, diez, quince o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL), y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación se une a un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL) y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende uno, dos, tres cuatro, cinco, ocho, diez, quince o más restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena variable ligera como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL) y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM6 de la divulgación interactúa con, por ejemplo se une, un epítopo de la CEACAM6 de ser humano, en el que dicho epítopo comprende los restos de aminoácidos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 de la SEQ ID NO: 179, y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, compite por la unión a la CECEAM6 con un anticuerpo que comprende una secuencia de la cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 (VH) y una secuencia de la cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51 (VL) y en el que dicho anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Leu y no se une a la proteína CEACAM6 de ser humano que comprende una mutación Ile63Phe (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 179).

Un anticuerpo de la invención puede ser una IgG (inmunoglobulina G, por ejemplo, IgG1 IgG2, IgG3, IgG4) o una ^{IgA, IgD, IgE, IgM, en tanto un fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')}2^{, Fab'-SH o scFv.}Por consiguiente, un fragmento de anticuerpo de la invención puede ser o puede contener una región de unión a antígeno que se comporta de una o más de las maneras descritas en el presente documento.

En una realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención son monoclonales.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o ácidos nucleicos que los codifican, están aislados. Un componente biológico aislado (tal como una molécula de ácido nucleico o una proteína tal como un anticuerpo) es uno que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en la cual el componente está presente de forma natural, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula hospedadora, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.

Generación de anticuerpos

Un anticuerpo de la invención puede proceder de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en secuencias de aminoácidos que se han aislado de los anticuerpos de un gran número de voluntarios sanos, por ejemplo, usando la tecnología n-CoDeR® las CDR completamente humanas se recombinan en nuevas moléculas de anticuerpos (Carlson y Soderlind, Expert Rev Mol Diagn., mayo de 2001;1(1):102-8). O como alternativa, por ejemplo, se pueden usar bibliotecas de anticuerpos como la biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos completamente humanos descrita en Hoet RM y col., Nat Biotechnol, 2005; 23(3):344-8) para aislar anticuerpos específicos de CEACAM6. Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran en el presente documento anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos también se pueden preparar mediante administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas como respuesta a una exposición con antígeno. Dichos animales contienen normalmente todo o una porción de los locus de inmunoglobulinas humanas, que reemplazan los locus de inmunoglobulinas endógenas, o que están presentes de forma extracromosómica o integradas aleatoriamente en los cromosomas del animal. Por ejemplo, se puede realizar una inmunización de ratones manipulados por ingeniería genética, entre otros, la inmunización de ratones hMAb (por ejemplo, VelocInmune mouse® o XENOMOUSE®).

Se pueden generar otros anticuerpos usando la tecnología de hibridomas (por ejemplo, véase Kohler y Milstein, Nature, 7 agosto de 1975; 256(55l7):495-7), dando como resultado, por ejemplo, anticuerpos de murino, de rata o conejo que pueden convertirse en anticuerpos quiméricos o humanizados. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para su fabricación se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y también se describen, por ejemplo, en Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); Queen y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes de Estados Unidos N.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri y col., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injertado de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describen el "acondicionamiento de la superficie" ("resurfacing")); Dall' Acqua y col., Methods 36:43-60 (2005) (que describen la "redistribución de FR" ("FR suWing") y Osboum y col., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka y col., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" para la redistribución de FR).

Se proporcionan ejemplos para la generación de anticuerpos usando una biblioteca de anticuerpos recombinantes e inmunización de ratones combinada con una humanización posterior.

Es un aspecto adicional de la divulgación proporcionar un procedimiento para generar anticuerpos que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y a la CEACAM6 de Macaca fascicularis, que no presentan una reacción cruzada significativa con la CEACAM1 de ser humano, la CEACAM3 de ser humano y la CEACAM5 de ser humano. En una realización de la divulgación se proporciona un procedimiento para la generación de anticuerpos anti-CEACAM6 caracterizado porque comprende las etapas de inmunizar un animal, preferentemente un ratón, con el dominio 1 de la CECAM6 de cinomolgo (representada por los aminoácidos 35-142 de la SEQ ID NO: 177), determinar la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se unen específicamente a la CEACAM6 de ser humano y a la CEACAM6 de cinomolgo, opcionalmente seguido por humanización o generación de un anticuerpo quimérico, y expresar dichos anticuerpos. El sistema de expresión puede ser un sistema de expresión recombinante o sin células. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión recombinante son células procariotas y eucariotas. Se prefieren los sistemas de expresión de mamífero.

Variantes de péptidos

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas proporcionadas en el presente documento. En su lugar, la invención también contiene variantes de estos polipéptidos. Con referencia a la presente divulgación y a las tecnologías y referencias disponibles convencionalmente, el especialista podrá preparar, probar y utilizar las variantes funcionales de los anticuerpos desvelados en el presente documento, en tanto que aprecia que estas variantes que tienen la capacidad de unirse a la CEACAM6 se encuentran dentro del ámbito de la presente invención.

Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tiene al menos una región determinante de complementariedad (CDR) alterada (hipervariable) y/o un dominio/posición de región marco conservada (FR) (variable), con respecto a una secuencia peptídica desvelada en el presente documento.

La alteración de uno o más restos de aminoácidos en una región CDR o FR, le permite al especialista generar de manera rutinaria secuencias de anticuerpos mutadas o diversificadas, que se pueden explorar frente al antígeno, por ejemplo, en cuanto a propiedades nuevas o mejoradas.

Una realización preferida adicional de la invención es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, en el cual las secuencias de VH y VL se seleccionan como se muestra en la Tabla 1. El especialista puede usar los datos de la Tabla 1 para diseñar variantes de péptidos que están dentro del ámbito de la presente invención. Se prefiere construir las variantes cambiando los aminoácidos dentro de una o más regiones c DR; una variante también podría tener una o más regiones marco conservadas alteradas. Además, se pueden efectuar alteraciones en las regiones marco conservadas. Por ejemplo, se podría alterar un dominio FR peptídico en el cual hay una desviación en un resto en comparación con una secuencia de la línea germinal.

Como alternativa, el especialista podría efectuar el mismo análisis comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias conocidas de la misma clase de tales anticuerpos usando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik A., y col., JMB 2000, 296:57-86.

Adicionalmente, se pueden obtener variantes usando un anticuerpo como punto de partida para una optimización adicional mediante la diversificación de uno o más restos de aminoácidos en el anticuerpo, preferentemente los restos de aminoácidos en una o más CDR, y explorando la colección resultante de variantes de anticuerpo con propiedades mejoradas. Se prefiere particularmente la diversificación de uno o más restos de aminoácidos en la CDR3 de VL y/o VH. La diversificación se puede hacer, por ejemplo, mediante la síntesis de una colección de moléculas de ADN usando la tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM, forma siglada de trinucleotide mutagenesis) (Virnekas B. y col., Nucl. Acids Res., 1994, 22: 5600.). Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyen moléculas con modificaciones/variaciones que incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, modificaciones que conducen a una semivida alterada (por ejemplo, una modificación de la parte Fc o la unión de moléculas adicionales tal como PEG), una afinidad de unión alterada o actividad CCDA o CDC alteradas.

Variantes conservativas de aminoácidos

Se pueden fabricar variantes de polipéptidos que conserven la estructura molecular global de una secuencia peptídica del anticuerpo descrita en el presente documento. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, el experto reconocerá algunas sustituciones racionales. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, "sustituciones conservativas", se pueden hacer, por ejemplo, basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados.

Por ejemplo, (a) los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina y (d) los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones normalmente se pueden realizar dentro de los grupos (a)-(d). Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse entre sí en función de su capacidad para alterar las hélices a. De manera similar, determinados aminoácidos, por ejemplo, alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico, glutamina, histidina y lisina se encuentran más comúnmente en las hélices a, mientras que valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano y treonina se encuentran más comúnmente en láminas p plegadas. Glicina, serina, ácido aspártico, asparagina y prolina se encuentran comúnmente en los giros. Se pueden realizar algunas sustituciones preferidas entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G y (iii) A, V, L y I. Dado el código genético conocido, y las técnicas recombinantes y de síntesis de ADN, un científico con experiencia puede construir fácilmente los ADN que codifican las variantes conservativas de aminoácidos.

Variantes de glucosilación

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el hidrato de carbono unido a la misma se puede alterar. Los anticuerpos nativos que producen las células de mamífero normalmente comprenden un oligosacárido ramificado biantenario que generalmente está unido por una unión de N a Asn297 usando la numeración EU de Kabat del dominio CH2 de la región Fc, véase, por ejemplo, Wright y col., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997).

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir el grado en el anticuerpo está glucosilado. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede realizar convenientemente alterando el sistema de expresión (por ejemplo, la célula hospedadora) y/o alterando la secuencia de aminoácidos de manera tal que se crean o eliminan uno o más sitios de glucosilación. En una realización de la presente divulgación, se preparan anticuerpos sin glucosilar con una función efectora disminuida o derivados de anticuerpos por expresión en un hospedador procariota. Los hospedadores procariotas adecuados incluyen, pero sin limitación, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphilococcus.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos con una función efectora disminuida, que se caracterizan por una modificación en el sitio unido en N conservado en los dominios CH2 de la porción Fc de dicho anticuerpo. En una realización de la presente invención, la modificación comprende una mutación en el sitio de glucosilación de la cadena pesada para prevenir la glucosilación en el sitio. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente divulgación, los anticuerpos sin glucosilar o los derivados de anticuerpos se preparan por mutación del sitio de glucosilación de la cadena pesada, -es decir, mutación de N297 usando la numeración de EU de Kabat y se expresan en una célula hospedadora apropiada.

En otra realización de la presente divulgación, los anticuerpos sin glucosilar o los derivados de anticuerpos tienen una función efectora disminuida, en la que la modificación en el sitio unido en N conservado en los dominios CH2 de la porción Fc de dicho anticuerpo o derivado del anticuerpo comprende la eliminación de los glucanos del dominio CH2, -es decir, desglucosilación. Estos anticuerpos sin glucosilar se pueden generar por procedimientos convencionales y luego se pueden desglucosilar enzimáticamente. Los procedimientos para la desglucosilación enzimática de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Winkelhake y Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4):1074-80).

En otra realización de la presente divulgación, la desglucosilación se puede lograr usando el inhibidor de glucosilación tunicamicina (Nose y Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). Es decir, la modificación es la prevención de la glucosilación en el sitio unido en N conservado en los dominios CH2 de la porción Fc de dicho anticuerpo.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos con una estructura de hidratos de carbono que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) medido por espectrometría de masas MALDI-TOF, según se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al resto asparagina situado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los restos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar situado aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función CCDA mejorada.

Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: Okazaki y col., J Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y col., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares con capacidad de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka y col., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986) y el documento WO 2004/056312) y líneas celulares genosuprimidas, tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO genosuprimidas (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki y col., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. y col., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)).

Las variantes de anticuerpos se proporcionan además con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo es bisectado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función de CCDA mejorada. Los ejemplos de tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878; Patente de Estados Unidos N.° 6.602.684 y US 2005/0123546.

Además, se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una función de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos WO1997/30087; WO1998/58964 y WO1999/22764. Variantes de la región Fc

En determinadas realizaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) proporcionado en el presente documento, generando de esa manera una variante de la región Fc.

En determinadas realizaciones, la divulgación contempla una variante de anticuerpo que posee algunas funciones efectoras, pero no todas, que lo hacen un candidato conveniente para aplicaciones en las cuales es importante la semivida in vivo del anticuerpo, aunque determinadas funciones efectoras (tales como las del complemento y CCDA) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/empobrecimiento de las actividades de CDC y/o CCDA. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carezca de unión a FcyR (por lo tanto, es probable que carezca de actividad de CCDA), pero conserve la capacidad de unión a FcRn. En algunas realizaciones, se hacen alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q (es decir, ya sea mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas.

En determinadas realizaciones, la divulgación contempla una variante de anticuerpo que posee una semivida aumentada o disminuida. En el documento US2005/0014934 (Hinton y col.) se describen anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., J Immunol. 117:587 (1976) y Kim y col., J Immunol. 24:249 (1994)). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma, lo que mejora la unión de la región Fc al FcRn.

Conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)

La invención también proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC, inmunoconjugados) que comprenden un conjugado de anticuerpo anti-CEACAM6 con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal, humano o animal, o fragmentos de las mismas), o isótopos radioactivos.

En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en el cual un anticuerpo está conjugado con uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitación, un maitansinoide (véanse las Patentes de Estados Unidos N.°. 5.208.020, 5.416.064 y la Patente europea EP0425235); una auristatina tal como las fracciones del fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las Patentes de Estados Unidos N.°. 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o un derivado de la misma; una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina; metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno y CC1065.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitación, a la cadena A de difteria, fragmentos activos de toxina diftérica que no se unen, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfasarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (P API, P APII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Hay una variedad de isótopos radioactivos disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen 227Th, 225Ac, 211At, 131I, 125I, 90Y 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se utiliza para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo Tc99m, o un marcador de espín para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN), tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico se pueden fabricar usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bi(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).

El engarce puede ser un "engarce escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un engarce inestable en medio ácido, un engarce sensible a peptidasa, un engarce fotoinestable, un engarce de dimetilo o un engarce que contiene disulfuro (Chari y col., Cancer Res. 52: 127-131 (1992).

En el presente documento los inmunuoconjugados o ADC contemplan expresamente, pero sin limitación, los conjugados que se preparan con reactivos reticulantes incluyendo, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo) que se pueden obtener en el mercado (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, ILO., EE.UU.).

Moléculas de ADN de la invención

La presente invención también se refiere a las moléculas de ADN que codifican un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinados casos, estas secuencias se optimizan para la expresión en mamíferos. Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias que se desvelan en el presente documento, sino que también incluyen variantes de las mismas. Las variantes de ADN dentro de la invención se pueden describir haciendo referencia a sus propiedades físicas en la hibridación. Un técnico con experiencia reconocerá que el ADN se puede utilizar para identificar su complemento y, como el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, usando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. También reconocerá que la hibridación puede producirse con una complementariedad de menos del 100%. Sin embargo, dada una selección de las condiciones adecuadas, se pueden utilizar técnicas de hibridación para diferenciar entre secuencias de ADN basándose en su grado de relación estructural con una sonda en particular. Para una orientación sobre tales condiciones véase Sambrook y col., 1989 citado anteriormente y Ausubel y col., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., y Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: John Wiley y Sons).

La similitud estructural entre dos secuencias de polinucleótido se puede expresar en función de la "rigurosidad" de las condiciones en las cuales las dos secuencias hibridarán entre sí. Según se usa en el presente documento, el término "rigurosidad" se refiere al grado en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones rigurosas desfavorecen fuertemente la hibridación, y en tales condiciones solo hibridarán entre sí las moléculas que están más relacionadas desde el punto de vista estructural. A la inversa, unas condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que presentan un menor grado de relación estructural. Por lo tanto, la rigurosidad de la hibridación se correlaciona directamente con las relaciones estructurales de dos secuencias de ácido nucleico. La rigurosidad de la hibridación es una función de muchos factores, incluyendo la concentración global de ADN, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que rompen los puentes de hidrógeno. Los factores que estimulan la hibridación incluyen altas concentraciones de ADN, altas fuerzas iónicas, bajas temperaturas, mayores tamaños de sonda y ausencia de agentes que rompan puentes de hidrógeno. La hibridación normalmente realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".

Variantes de ADN funcionalmente equivalentes

Se puede describir aún otra clase de variantes de ADN dentro del ámbito de la invención con referencia al producto que codifican. Estos polinucleótidos funcionalmente equivalentes se caracterizan por el hecho de que codifican las mismas secuencias peptídicas debido a la degeneración del código genético.

Se reconoce que las variantes de las moléculas de ADN proporcionadas en el presente documento se pueden construir de varias maneras diferentes. Por ejemplo, se pueden construir como ADN completamente sintéticos. Hay disponible una amplia variedad de procedimientos para sintetizar de forma eficaz oligonucleótidos. Véase Ausubel y col., sección 2.11, suplemento 21 (1993). Se pueden sintetizar oligonucleótidos solapantes y ensamblar de la manera que informó primero Khorana y col., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel y col., citado anteriormente, Sección 8.2. Los ADN sintéticos preferentemente se diseñan con sitios de restricción convenientes en los extremos 5' y 3' del gen para facilitar la clonación en un vector apropiado.

Como se indicó, un procedimiento para generar variantes consiste en comenzar con uno de los ADN desvelados en el presente documento y luego realizar mutagénesis dirigida. Véase Ausubel y col., citado anteriormente, capítulo 8, Suplemento 37 (1997). En un procedimiento típico, se clona un ADN diana en un vehículo bacteriófago de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se aísla e hibrida con un oligonucleótido que contiene la alteración (o alteraciones) de nucleótido que se desea. La hebra complementaria se sintetiza y el fago bicatenario se introduce en un hospedador. Parte de la progenie que se obtiene como resultado contendrá el mutante que se desea, que se puede confirmar usando secuenciación de ADN. Además, hay diversos procedimientos disponibles que aumentan la probabilidad de que el fago progenie sea el mutante que se desea. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en el campo y están disponibles en el mercado kits para generar tales mutantes.

Construcciones y expresión de ADN recombinante

La presente invención proporciona además construcciones de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se pueden utilizar en conexión con un vector, tales como un plásmido, fagómido, fago o vector vírico, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante del mismo.

Un anticuerpo, una porción de unión a antígeno, o una variante del mismo proporcionado en el presente documento se puede preparar por expresión recombinante de secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas ligera y pesada o porciones de las mismas en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo, una porción de unión a antígeno, o una variante de los mismos, de manera recombinante, se puede transfectar una célula hospedadora con uno o más vectores de expresión recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y/o pesada o porciones de las mismas, de manera tal que las cadenas ligera y pesada se expresen en la célula hospedadora. Se utilizan metodologías convencionales de ADN recombinante para preparar y/u obtener ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera, incorporar estos ácidos nucleicos en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en las células hospedadoras, por ejemplo, los que se describen en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. y col., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la Patente de Estados Unidos N.° 4.816.397 de Boss y col.

Además, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de las cadenas pesada y/o ligera se pueden convertir, por ejemplo, en secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpo de longitud completa, fragmentos Fab o en scFv. El fragmento de ADN que codifica la VL o VH puede estar unido operativamente (de manera tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN estén en marco) con otro fragmento de ADN que codifica, por ejemplo, una región constante del anticuerpo o un engarce flexible. Las secuencias de las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera humanas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación del NIH N.° 91-3242) y se pueden obtener fragmentos de ^aDⁿque abarcan estas regiones por amplificación PCR convencional.

Para crear una secuencia de polinucleótidos que codifica un scFv, los ácidos nucleicos que codifican la VH y la VL pueden estar unidos operativamente a otro fragmento que codifica un engarce flexible de manera tal que las secuencias de la VH y la VL se puedan expresar como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el engarce flexible (véase, por ejemplo, Bird y col., (1988) Science 242: 423-426; Huston y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos o variantes de los mismos se pueden utilizar procedimientos convencionales de expresión de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, el ADN que codifica el polipéptido que se desea se puede insertar en un vector de expresión que luego se transfecta en una célula hospedadora adecuada. Las células hospedadoras adecuadas son células procariotas y eucariotas. Los ejemplos de células hospedadoras procariotas son, por ejemplo, las bacterias, los ejemplos de células hospedadoras eucariotas son las levaduras, las de insectos y células de insecto, plantas y células vegetales, animales transgénicos o células de mamífero. En algunas realizaciones, los ADN que codifican las cadenas pesada y ligera se insertan en vectores distintos. En otras realizaciones, el ADN que codifica las cadenas pesada y ligera se inserta en el mismo vector. Se entiende que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de las secuencias reguladoras, se ve afectado por factores tales como la elección de la célula hospedadora, el nivel de expresión de la proteína que se desea y si la expresión es constitutiva o inducible.

Por lo tanto, una realización de la presente invención son también las células hospedadoras que comprenden al vector o una molécula de ácido nucleico, por lo cual la célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y puede ser una célula procariota, por ejemplo una célula bacteriana.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento para usar la célula hospedadora para producir un anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno, que comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.

Por lo tanto, otra realización de la presente invención es la producción de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención con las células hospedadoras de la presente invención y la purificación de estos anticuerpos hasta una homogeneidad de al menos el 95 % en peso.

Expresión en bacterias

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN que codifica una proteína que se desea junto con señales adecuadas de inicio y terminación de la traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos de selección y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es conveniente, para proporcionar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas apropiados para la transformación incluyen, pero sin limitación, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphilococcus.

Los vectores bacterianos pueden basarse, por ejemplo, en bacteriófagos, plásmidos o fagómidos. Dichos vectores pueden contener un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles en el mercado que normalmente contiene elementos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Luego de la transformación de una cepa hospedadora apropiada y el cultivo de la cepa hospedadora hasta una densidad de células apropiada, al promotor seleccionado desreprime/induce por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional. Luego las células se recogen, normalmente por centrifugación, se rompen con medios físicos o químicos, y el extracto bruto que se obtiene como resultado se conserva para su posterior purificación.

En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso que se pretende dar a la proteína a expresar. Por ejemplo, cuando se producirá una gran cantidad de tal proteína, para la generación de anticuerpos o para explorar bibliotecas de péptidos, por ejemplo, pueden ser convenientes los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente.

Por lo tanto, una realización de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos novedosos de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las variantes de los mismos incluyen productos naturales purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota, incluyendo, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphilococcus, preferentemente, de células de E. coli.

Expresión en mamífero

Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores obtenidos de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. La expresión de los anticuerpos puede ser constitutiva o regulada (por ejemplo, inducible por adición o eliminación de inductores de molécula pequeña tales como la tetraciclina en conjunto con el sistema de Tet). Para una descripción adicional de los elementos reguladores víricos, y secuencias de los mismos, véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.168.062 de Stinski, U.S. 4.510.245 de Bell y col., y U.S. 4.968.615 de Schaffner y col. Los vectores de expresión recombinante también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores de selección (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 4.399.216, 4.634.665 y U.S. 5.179.017). Los marcadores de selección adecuados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos tales como G418, puromicina, higromicina, blasticidina, zeocina/bleomicina o metotrexato, o marcadores de selección que aprovechen auxotrofías tales como Glutamina Sintasa (Bebbington y col., Biotechnology (N Y). Febrero de 1992; 10(2):169-75), en una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato, el gen neo confiere resistencia al G418, el gen bsd de Aspergillus terreus confiere resistencia a la blasticidina, la puromicina N-acetil-transferasa confiere resistencia a la puromicina, el producto del gen Sh ble confiere resistencia a la zeocina y el gen de resistencia a la higromicina E. coli (hyg o hph) confiere resistencia a la higromicina. Los marcadores de selección como DHFR o Glutamina Sintasa también son útiles para las técnicas de amplificación en conjunto con MTX y MSX.

La transfección del vector de expresión en una célula hospedadora se puede llevar a cabo usando técnicas convencionales tales como electroporación, nucleofección, precipitación con fosfato de calcio, lipofección, transfección basada en policationes tal como transfección basada en polietlilenimina (PEI) y transfección con DEAE-dextrano.

Las células hospedadoras de mamífero adecuadas para expresar los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las variantes de los mismos proporcionados en el presente documento incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) tales como CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [que incluyen a las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 y Urlaub y col., Cell, junio de 1983; 33(2):405-12, que se utilizan con un marcador de selección DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, y otras células genosuprimidas que se ejemplifican en Fan y col., Biotechnol Bioeng., abril de 2012; 109(4): 1007-15], células de mieloma NS0, células COS, células HEK293, células HKB11, células BHK21, células CAP, células E^b66 y células SP2.

La expresión también puede ser transitoria o semiestable, en sistemas de expresión tales como las células HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHOK1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 o CAP-T (por ejemplo, Durocher y col., Nucleic Acids Res. 15 de enero de 2002; 30(2):E9).

En algunas realizaciones, los vectores de expresión se diseñan de manera tal que la proteína expresada se secreta al medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos o variantes de los mismos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos convencionales de purificación de proteínas.

Purificación

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o variantes de los mismos se pueden recuperar y purificar de los cultivos de células recombinantes usando procedimientos bien conocidos que incluyen, pero sin limitación, la precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción en ácido, cromatografía de Proteína A, cromatografía de Proteína G, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Para la purificación también se puede emplear cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"). Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, ⁿY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las variantes de los mismos incluyen productos naturales purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador eucariota, incluyendo, por ejemplo, células de levadura, planta superior, insecto y mamífero. Dependiendo del hospedador que se emplee en el procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede estar glucosilado o no glucosilado. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales convencionales de laboratorio, por ejemplo, Sambrook, citado anteriormente, secciones 17.37-17.42; Ausubel, citado anteriormente, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.

En algunas realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo determinado, por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, espectroscopía UV-Vis o por electroforesis en gel capilar con SDS (por ejemplo en un dispositivo Caliper LabChip GXII, GX 90 o Biorad Bioanalyzer), y en otras realizaciones preferidas adicionales más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo de origen natural aislado incluye al anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes dado que no estará presente al menos un componente del entorno natural del anticuerpo. Sin embargo, comúnmente el anticuerpo aislado se preparará usando al menos una etapa de purificación.

Procedimientos terapéuticos

Los procedimientos terapéuticos implican administrar a un sujeto que necesita tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante del mismo, contemplado por la invención. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" se define por la presente como la cantidad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que es suficiente para reducir la proliferación de las células positivas para CEACAM6 o para reducir el tamaño de un tumor que expresa CEACAM6 en un área tratada de un sujeto - ya sea como una única dosis o de acuerdo con un régimen de dosis múltiples, solo o en combinación con otros agentes, lo que conduce al alivio de una afección adversa, cantidad que además es tolerable desde el punto de vista toxicológico. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano (por ejemplo, conejo, rata, ratón, perro, mono u otro primate de orden inferior).

Es una realización de la invención proporcionar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso como medicamento.

Es una realización de la invención proporcionar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso como medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, el cáncer es un tumor y en una realización muy preferida el cáncer es un tumor sólido.

Es una realización de la divulgación usar el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

Es una realización de la divulgación usar el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, el cáncer es un tumor y en una realización muy preferida el cáncer es un tumor sólido.

Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden utilizar como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una diversidad de situaciones con señalización de CEACAM6 anómala, por ejemplo, trastornos celulares proliferativos tales como cáncer o enfermedades fibróticas. Los trastornos y afecciones particularmente adecuados para el tratamiento con un anticuerpo de la invención son los tumores sólidos, tal como los cánceres de mama, aparato respiratorio, cerebro, órganos genitales, aparato digestivo, vías urinarias, de ojo, hígado, piel, cabeza y cuello, tiroides, paratiroides y sus metástasis a distancia. Estos trastornos también incluyen linfomas, sarcomas y leucemias.

Los tumores del tracto digestivo incluyen, pero sin limitación, cánceres anales, de colon, colorrectal, esofágico, de vesícula biliar, gástrico, pancreático, rectal, del intestino delgado y de las glándulas salivales.

Los ejemplos de cáncer esofágico incluyen, pero sin limitación, carcinomas y adenocarcinomas de células esofágicas, así como carcinomas de células escamosas, liomiosarcoma, melanoma maligno, rabdomiosarcoma y linfoma.

Los ejemplos de cáncer gástrico incluyen, pero sin limitación, adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal y de tipo difuso.

Los ejemplos de cáncer pancreático incluyen, pero sin limitación, adenocarcinoma ductal, carcinomas adenoescamosos y tumores endocrinos pancreáticos.

Los ejemplos de cáncer de mama incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama triple negativo, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ y carcinoma lobular in situ.

Los ejemplos de cánceres del aparato respiratorio incluyen, pero sin limitación, carcinomas microcítico y amicrocítico de pulmón, así como adenoma bronquial y blastoma pleuropulmonar.

Los ejemplos de cáncer de cerebro incluyen, pero sin limitación glioma del tronco encefálico y el hipotálamo, astrocitoma cerebelar y cerebral, glioblastoma, meduloblastoma, ependimoma, así como tumores neuroectodérmicos y pineales.

Los tumores de los órganos genitales masculinos incluyen, pero sin limitación, cáncer de próstata y testicular. Los tumores de los órganos genitales femeninos incluyen, pero sin limitación, cáncer de endometrio, de cuello uterino, ovárico, vaginal y vulvar, así como sarcoma de útero.

Los ejemplos de cáncer de ovarios incluyen, pero sin limitación, tumor seroso, tumor endometrioide, cistoadenocarcinoma mucinoso, tumor de células de la granulosa, tumor de células de Sertoli-Leydig y arrenoblastoma.

Los ejemplos de cáncer de cuello uterino incluyen, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma microcítico, tumor neuroendocrino, carcinoma de células vidriosas y adenocarcinoma villoglandular.

Los tumores de las vías urinarias incluyen, pero sin limitación, cánceres de vejiga, pene, riñón, pelvis renal, uréter, uretral y papilar renal hereditario y esporádico.

Los ejemplos de cáncer renal incluyen, pero sin limitación, carcinoma de células renales, carcinoma de células uroteliales, tumor de células yuxtaglomerulares (reninoma), angiomiolipoma, oncocitoma renal, carcinoma del ducto de Bellini, sarcoma del riñón de células claras, nefroma mesoblástico y tumor de Wilms.

Los ejemplos de cáncer de vejiga incluyen, pero sin limitación, carcinoma de células de transición, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, sarcoma y carcinoma microcítico.

Los cánceres del ojo incluyen, pero sin limitación, melanoma intraocular y retinoblastoma.

Los ejemplos de cánceres hepáticos incluyen, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular (carcinomas de hepatocitos con o sin variantes fibrolaminares), colangiocarcinoma (carcinoma del conducto biliar intrahepático) y colangiocarcinoma hepatocelular mixto.

Los cánceres de piel incluyen, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de células cutáneas de Merkel y cáncer cutáneo distinto del melanoma.

Los cánceres de cabeza y cuello incluyen, pero sin limitación, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer laríngeo, hipofaríngeo, nasofaríngeo, cáncer orofaríngeo, cáncer de glándulas salivales, cáncer de labios y de la cavidad bucal y cáncer de células escamosas.

Los linfomas incluyen, pero sin limitación, linfoma relacionado con SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma de linfocitos T cutáneo, linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central.

Los sarcomas incluyen, pero sin limitación, sarcoma de los tejidos blandos, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma y rabdomiosarcoma.

Las leucemias incluyen, pero sin limitación, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogénica crónica y tricoleucemia.

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son adecuados para un procedimiento terapéutico o de diagnóstico para el tratamiento o el diagnóstico una enfermedad por cáncer comprendida en un grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de mama y mieloma múltiple. Además, los anticuerpos desvelados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una diversidad de otros trastornos en los que está implicada CEACAM6, tales como, pero sin limitación, infección pulmonar, por ejemplo gripe, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, fibrosis quística del pulmón, prevención de la fijación bacteriana en el tubo gastrointestinal, traumatismo, hemorragias, quemaduras, cirugía, ictus, infarto de miocardio, sepsis, neumonía, vacunación para infección y cáncer, infección crónica por virus.

Los trastornos mencionados anteriormente se han caracterizados bien en seres humanos, pero también existen con una etiología similar en otros animales, incluyendo mamíferos, y pueden tratarse administrando las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante del mismo podría coadministrarse con medicamentos conocidos, y en algunos casos podría modificarse el anticuerpo en sí. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante del mismo se podría conjugar a un agente citotóxico o un radioisótopo para, de forma potencial, aumentar aún más la eficacia.

Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las variantes de los mismos se pueden administrar como el único agente farmacéutico o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, cuando la combinación no provoque efectos adversos inaceptables. Esta terapia de combinación incluye la administración de una única dosificación de una formulación farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo o variantes del mismo, y uno o más agentes terapéuticos adicionales, así como la administración de un anticuerpo de la invención y cada agente terapéutico adicional en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, se puede administrar al paciente un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante del mismo y un agente terapéutico juntos en una única composición líquida, o cada agente puede administrarse en una formulación de dosificación separada.

Cuando se utilizan formulaciones de dosificación separadas, se pueden administrar un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo o variantes del mismo, y uno o más agentes terapéuticos adicionales esencialmente al mismo tiempo (por ejemplo, al mismo tiempo) o en momentos escalonados separados (por ejemplo, de forma secuencial).

En particular, los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las variantes de los mismos se pueden utilizar en una combinación fija o por separado con otros agentes antitumorales tales como agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes antitumorales procedentes de plantas, agentes de terapia hormonal, inhibidores de la topoisomerasa, productos inmunológicos, anticuerpos, fármacos de anticuerpo, modificadores de la respuesta biológica, compuestos antiangiogénicos, terapias celulares y otro fármacos antitumorales, que incluyen, pero sin limitación, derivados de camptotecina, inhibidores de quinasa, fármacos dirigidos.

A este respecto, lo que sigue es un listado no limitante de ejemplos de agentes secundarios que se pueden utilizar en combinación con los anticuerpos de la presente invención:

Los agentes alquilantes incluyen, pero sin limitación, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, altretamina, apaziquona, brostalicina, bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, mafosfamida, bendamustina y mitolactol; los compuestos alquilantes con platino coordinado incluyen, pero sin limitación, cisplatino, carboplatino, eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, oxaliplatino y satraplatino;

Los antimetabolitos incluyen, pero sin limitación, metotrexato, 6-mercaptopurina ribósido, mercaptopurina, 5-fluorouracilo solo o en combinación con leucovorina, tegafur, doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, enocitabina, gemcitabina, fludarabina, 5-azacitidina, capecitabina, cladribina, clofarabina, decitabina, eflornitina, etinilcitidina, citosina arabinósido, hidroxiurea, melfalán, nelarabina, nolatrexed, ocfosfito, premetrexed disódico, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, triapina, trimetrexato, vidarabina, vincristina y vinorelbina;

Los agentes de terapia hormonal incluyen, pero sin limitación, exemestano, Lupron, anastrozol, doxercalciferol, fadrozol, formestano, inhibidores de la 11-beta hidroxiesteroide deshidrogenasa 1, inhibidores de la 17-alfa hidroxilasa/17,20 liasa tales como acetato de abiraterona, inhibidores de la 5-alfa reductasa tales como finasteride y epristeride, antiestrógenos tales como citrato de tamoxifeno y fulvestrant, Trelstar, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol, antiandrógenos tales como bicalutamida, flutamida, mifepristona, nilutamida, Casodex y antiprogesteronas, y combinaciones de los mismos;

Las sustancias antitumorales precedentes de plantas incluyen, por ejemplo, las seleccionadas de inhibidores de mitóticos, por ejemplo, epotilonas tales como sagopilona, ixabepilona y epotilona B, vinblastina, vinflunina, docetaxel y Paclitaxel;

Los agentes citotóxicos inhibidores de la topoisomerasa incluyen, pero sin limitación, aclarrubicina, doxorrubicina, amonafide, belotecan, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, diflomotecan, Irinotecan, topotecan, edotecarina, epimbicina, etopósido, exatecan, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, pirambicina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxan, taflupósido y combinaciones de los mismos;

Los productos inmunológicos incluyen interferones tales como interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a e interferón gamma-n1, GM-CSF y otros agentes de potenciación inmunitaria tales como L19-IL2 y otros derivados de IL2, filgrastim, lentinan, sizofilan, TheraCys, ubenimex, aldesleucina, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazina, daclizumab, denileucina, gemtuzumab, ozogamicina, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinan, vacuna para el melanoma (Corixa), molgramostim, sargramostim, tasonermin, tecleucina, thymalasin, tositumomab, Vimlizin, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab y Provenge; ALNX6000, Urelumab, PF-005082566, Galunisertib, AZ10606120, NF340, BMS-777607;

Los productos inmunológicos también incluyen fármacos dirigidos hacia moduladores de puntos de control inmunitario o receptores coinhibidores que incluyen, pero sin limitación, CTLA-4, PD1, PD-L1, receptor de B7-H3, receptor de B7-H4, BTLA, TIM3, LAG3, KIRDL, 2B4, VISTA, CD244, CD160, TIGIT, CEACAM1, CEACAM5, HHLA2. En concreto, algunos de estos fármacos son Ipilimumab, Tremelimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, AMP-224, AMP-514, PDR001, MDX1105, BMS-936,559, Atezolizumab, Medi4736, Avelumab, MSB0010718C, MGA271, IMP321, BMS-986,016, Bavituximab, MNRP1685A, Celecoxib, PF-04418948, RQ-15986;

incluyen activadores de receptores coestimuladores que incluyen, pero sin limitación, fármacos dirigidos hacia CD28, ICOS, 4-1BB, OX40, CD27, KIRDS, GITR, HVEM, TNFRSF25, CD40L. TMIGD2, TIM-1, CEACAM1, CEACAM5. Entre estos fármacos se encuentran CP-870893, Lucatumumab, Dacetuzumab, Anti-OX40, MEDI0562, MEDI6469, MEDI6383, CDX-1127, TRX518, Varlilumab;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes que modulan la actividad de los Treg, que incluyen, pero sin limitación, a los dirigidos hacia FOXP3, CD25, CCR4. Entre dichos agentes se encuentra el daclizumab; Los productos inmunológicos también incluyen agentes que modulan la actividad de células supresoras derivadas de mieloides, que incluyen, pero sin limitación, las dirigidas a CSF1R. Un ejemplo es emactuzumab, Taladafil;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes que modulan la respuesta inmunitaria celular innata, incluyendo a los agentes dirigidos a receptores de tipo Toll que incluyen, pero sin limitación, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, NGK2A, NKG2D. Estos fármacos son, por ejemplo, CPG7909 (PF-3512676, CPG2006); MGN1703, SD-101, hiltonol (Poly ICLC), Anti-NGK2A (IPH2201), OM-174, 852A, VTX-2337, IMO-2055;

Los productos inmunológicos también incluyen fármacos que modulan la respuesta inmunitaria innata celular, incluyendo fármacos dirigidos, pero sin limitación, a CSF-1, CSF1R, KIR, ILTs, LIRs, MICA, MICB, CD244, CCL2, CD47. En concreto, algunos de estos fármacos son Anti-KIR (IHP2101; IPH2101; 1-7F9); Lirilumab (IPH2012; BMS-986,015); Carlumab (CNTO888), IMC-CS4, FPA008, PLX3397, ARRY-382, CC-90002, Anti-CD47 (Hu5F9-G4), BLZ945;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes para redirigir células inmunitarias, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos biespecíficos, Darts, por ejemplo, contra B7-H3, Bites, por ejemplo, CD19xCD3; por ejemplo Removab anti-EPCAMxCD3xFC, agentes dirigidos hacia linfocitos NK;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes que modulan el microambiente tumoral y mejoran la infiltración y respuesta de las células inmunitarias, incluyendo vacunas y coadyuvantes, y que no se limitan a GVAX, FVAX;

A este respecto, las vacunas comprenden vacunas basadas en células dendrítica, vacunas víricas, vacunas basadas en ARNm, vacunas basadas en multipéptidos;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes para mejorar la infiltración de las células inmunitarias, incluyendo, pero sin limitación, IFN-g, IL15, IL21, IL2, CXCR4, CXCI12. Algunos de estos fármacos son Denenicokin (BMS982, 470), ALT-803, hetIL15, Ulocuplumab, BKT140, mab específico para CXCR2, AD3100, Maravirox, PF-4136309;

Los productos inmunológicos también incluyen agentes o tratamientos que mejoran la sensibilización y la activación de las CPA y de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, fármacos dirigidos hacia inhibidores de m-TOR GSK3beta, CD cargadas (por ejemplo, Provenge), radioterapia, radioterapia externa;

Los productos inmunológicos también incluyen moduladores de la ruta de la kynurenina, incluyendo fármacos dirigidos a, entre otros ID01, IDO2, TDO. Entre esos fármacos están INCB024360, Indoximod (n Lg 8189; 1-metil-D-triptófano, D-1MT), GDC-0919, NLG919, LM10;

Los productos inmunológicos también incluyen moduladores de la ruta de la adenosina, incluyendo, pero sin limitación, fármacos dirigidos hacia CD39, CD73, receptor A2A, receptor A2B. Dichos fármacos incluyen Compound9, NCX-4016, AT38, SCH58261, SCH420814, PSB1115, ARL67176, AMPCP;

Los productos inmunológicos también incluyen moduladores de la ruta de TGFbeta/ALK5. Dichos fármacos incluyen OY2157299, EW-7187;

Los productos inmunológicos también incluyen activadores de Sting;

Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa de los organismos vivos o respuestas biológicas tales como la supervivencia, el crecimiento o la diferenciación de células de tejidos para dirigirlas para que tengan actividad antitumoral; tales agentes incluyen, por ejemplo, krestin, lentinan, sizofiran, picibanil, ProMune y ubenimex;

Los compuestos antiangiogénicos incluyen, pero sin limitación, acitretina, aflibercept, angiostatina, aplidina, asentar, axitinib, bevacizumab, brivanib alaninat, cilengtida, combretastatina, endostatina, fenretinida, halofuginona, pazopanib, ranibizumab, rebimastat, recentin, regorafenib, removab, revlimid, sorafenib, escualamina, sunitinib, telatinib, talidomida, ukraína, vatalanib y vitaxin;

Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores de VEGF, incluyendo, pero sin limitación, sorafenib, regorafenib, bevacizumab, sunitinib, recentin, axitinib, aflibercept, telatinib, brivanib alaninato, vatalanib, pazopanib y ranibizumab;

Los fármacos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, rituximab, ticilimumab, ipilimumab, tremelimumab, pembrolizumab, nivolumab, Pidilizumab, RG-7446/ MPDL3280A, BMS-936559 (MDX1105), Durvalumab (Medi-4736), MSB-0010718C, lumiliximab, catumaxomab, atacicept, oregovomab, panitumumab y alemtuzumab;

Los fármacos de anticuerpo también incluyen conjugados de fármacos anticuerpo que incluyen, pero sin limitación, los dirigidos hacia mesotelina, C4.4^a, FG^fR2, HER2, PSMA;

Los fármacos de anticuerpo también incluyen conjugados dirigidos a torio, pero sin limitación a los dirigidos a mesotelina, C4.4A, FGFR2, HER2, PSMA, CEACAM6;

Los fármacos de anticuerpo también incluyen formatos de anticuerpos biespecíficos (o multiespecíficos) que incluyen, pero sin limitación, IgG biespecíficas (o multiespecíficas) y) fragmentos de anticuerpos biespecífico (o multiespecíficos) así como proteínas de fusión y conjugados de las mismas (por ejemplo CrossMab, DAF(2in1), DAF(4in1), DutaMab, DT-IgG, IgG ensamblada por KiH, IgG ensamblada por pares de carga, KiH-comúnLC, intercambio de brazos Fab, SEEDbody, Triomab, LUZ-Y, Fcab, KA-mAb, Fab ortogonal, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIHIgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, DVI-IgG (4in1), di-nanobody, BiTE, Diabody, ^dA^rT, DARTFc, TandAb, scDiabody, scDlabody-CH3, Diabody-CH3, Triple Body, Miniantibody, Minibody, TriBi minibody, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv- KIH, Fab-scFv-Fc, HCAb Tetravalente, scDiabody-Fc, Diabody-Fc, Tandem scFv-Fc, Intrabody, fusión Dock y Lock, ImmTAC, HSAbody, scDiabody-HAS, Tándem scFv-toxina, IgG-IgG, Cov-X-Body, scFv1-PEG-scFv2 y otros);

Los fármacos de anticuerpo también incluyen proteínas recombinantes generadas por tecnologías recombinantes con propiedades de unión de tipo anticuerpo, tales como, pero sin limitación, moléculas DARPIN;

Las terapias celulares incluyen, pero sin limitación, linfocitos infiltrantes de tumor aislados de pacientes con cáncer, tales como linfocitos T estimulados ex vivo, por ejemplo, Sipuleucel-T;

Las terapias celulares incluyen, pero sin limitación, linfocitos infiltrantes de tumor aislados de pacientes con cáncer, tales como Sipuleucel-T y linfocitos T modificados por ingeniería genética que portan receptores quiméricos para antígenos (los CAR) tal como, por ejemplo, linfocitos T-CAR para CD19; linfocitos T-CAR-Her2; Otros agentes contra el cáncer, incluyendo, por ejemplo, alitretinoína, ampligen, atrasentan bexaroteno, bortezomib, bosentan, calcitriol, exisulind, fotemustina, ácido ibandrónico, miltefosina, mitoxantrona, I-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pegaspargasa, pentostatina, tazaroten, velcade, nitrato de galio, canfosfamida, darinaparsina y tretinoína, PI3065, TG100-115;

Inhibidores de EGFR (HERI) tales como, por ejemplo, cetuximab, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib y Zactima;

Inhibidores de HER2 tales como, por ejemplo, lapatinib, tratuzumab y pertuzumab;

Inhibidores de mTOR tales como, por ejemplo, temsirólimus, sirólimus/Rapamicina y everólimus;

Inhibidores de c-Met;

Inhibidores de PI3K tales como inhibidor 1 de PI3K (diclorhidrato de 2-amino-N-[7-metoxi-8-(3-morfolin-4-ilpropoxi)-2,3-dihidroimidazo[1,2-c]quinazolin-5-il]pirimidina-5-carboxamida (véase compuesto de los Ejemplos 1 y 2, y el documento WO 2012/136553)

e inhibidores de AKT;

Inhibidores de CDK tales como roscovitina y flavopiridol;

Inhibidores de puntos de control del ensamblaje del huso y agentes antimitóticos dirigidos, tales como inhibidores de PLK, inhibidores de Aurora (por ejemplo, Hesperadina), inhibidores de quinasas de puntos de control e inhibidores de KSP,

Inhibidores de BRAFV600E tales como Vemurafenib, Dabrafenib;

Inhibidores de la HDAC tales como, por ejemplo, panobinostat, vorinostat, MS275, belinostat y LBH589;

Inhibidores de HSP90 y HSP70;

Inhibidores del proteosoma, tales como bortezomib y carfilzomib;

Inhibidores de la serina/treonina quinasa, incluyendo inhibidores de MEK e inhibidores de Raf, tales como sorafenib;

Inhibidores de la farnesil transferasa tales como, por ejemplo, tipifarnib;

Inhibidores de tirosina quinasa incluyendo, por ejemplo, dasatinib, nilotibib, regorafenib, bosutinib, sorafenib, bevacizumab, sunitinib, cediranib, axitinib, aflibercept, telatinib, imatinib mesilato, brivanib alaninato, pazopanib, ranibizumab, vatalanib, cetuximab, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib, lapatinib, tratuzumab, pertuzumab, e inhibidores de c-Kit;

Agonistas del receptor de vitamina D;

Inhibidores de proteínas Bcl-2, tales como obatoclax, oblimersen sódico y gosipol;

Antagonistas del receptor cúmulo de diferenciación 20, tales como, por ejemplo, rituximab;

Inhibidores de ribonucleótido reductasa, tales como, por ejemplo, gemcitabina;

Agonistas del receptor del ligando inductor de apoptosis asociado al factor de necrosis tumoral 1, tales como, por ejemplo, mapatumumab;

Agonistas del receptor del ligando inductor de la apoptosis asociado al factor de necrosis tumoral 2, tales como, por ejemplo, lexatumumab, conatumumab, CS-1008, PRO95780;

Antagonistas del receptor de 5-hidroxitriptamina, tales como, por ejemplo, rEV598, xaliprode, clorhidrato de palonosetrón, granisetrón, Zindol y AB-1001;

Inhibidores de integrinas, incluyendo inhibidores de integrina alfa5-beta1, tales como, por ejemplo, E7820, JSM 6425, volociximab y endostatina;

Antagonistas del receptor androgénico, tales como, por ejemplo, decanoato de nandrolona, fluoximesterona, Android, Prost-aid, andromustina, bicalutamida, flutamida, apo-ciproterona, apo-flutamida, acetato de clormadinona, Androcur, Tabi, acetato de ciproterona y nilutamida;

Inhibidores de la aromatasa, tales como, por ejemplo, anastrozol, letrozol, testolactona, exemestano, aminoglutetimida y formestano;

Inhibidores de metaloproteinasas de matriz;

Además, los anticuerpos de la invención se pueden combinar con tratamientos que provocan muerte celular inmunogénica, incluyendo, pero sin limitación, luz ultravioleta, tratamientos oxidantes, choque térmico, radioterapia dirigida y no dirigida, shikonina, alta presión hidrostática, virus oncolíticos y terapia fotodinámica; Además, los anticuerpos de la invención se pueden combinar con agentes que provocan muerte celular inmunogénica, incluyendo, pero sin limitación, sunitinib, inhibidores de JAK2, antraciclinas, doxorrubicina, mitoxantrona, oxaliplatino y ciclofosfamida, fármacos desestabilizantes de microtúbulos dirigidos y no dirigidos (por ejemplo, auristatinas y maitansinoides);

Los compuestos de la presente invención también se pueden emplear en el tratamiento del cáncer en conjunto con radioterapia y/o intervención quirúrgica;

Adicionalmente, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar como tales o en composiciones, en la investigación y el diagnóstico, o como patrones analíticos de referencia, y otros usos semejantes, que son bien conocidos en la técnica;

Procedimientos de diagnóstico

Los anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse para detectar la presencia de tumores que expresan CEACAM6. La presencia de células que contienen CEACAM6 o la pérdida de CEACAM6 en diversas muestras biológicas, incluidas muestras de biopsia de suero y tejido, puede detectarse con anticuerpos anti-CEACAM6. Además, los anticuerpos anti-CEACAM6 pueden usarse en diversas metodologías de obtención de imágenes tales como inmunoscintigrafía con un anticuerpo conjugado con 99Tc (u otro isótopo). Por ejemplo, para detectar carcinomas pancreáticos u ováricos, puede usarse un protocolo de obtención de imágenes similar al descrito usando un anticuerpo anti-PSMA conjugado con 111In (Sodee y col., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997). Otro método de detección que puede usarse es la tomografía por emisión de positrones conjugando los anticuerpos de la invención con un isótopo adecuado (véase Herzog y col., J. Nucl. Med. 34: 2222-2226, 1993).

Composiciones farmacéuticas y administración

Para tratar cualquiera de los trastornos anteriores, las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención, se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Se puede administrar un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión al antígeno del mismo por cualquier medio apropiado, que puede variar, dependiendo del tipo de trastorno que se esté tratando. Las posibles vías de administración incluyen la vía parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y si se desea, para un tratamiento de inmunosupresión local, administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión al antígeno del mismo o una variante del mismo, se podría administrar por infusión pulsada, por ejemplo, disminuyendo la dosis del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se da en inyecciones, aún más preferentemente, inyección intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La cantidad que se va a administrar dependerá de diversos factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo y de si se están administrando otros fármacos. El técnico con experiencia reconocerá que la vía de administración variará dependiendo del trastorno o de la afección que se vaya a tratar.

Una realización de la presente invención consiste en composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos o variantes de los mismos, solos o en combinación con al menos un agente adicional, tal como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Una realización adicional consiste en composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a CEACAM6 o un fragmento de unión al antígeno del mismo y un compuesto farmacéuticamente activo adicional que es apropiado para tratar enfermedades relacionadas con CEACAM6 tales como el cáncer. Cualquiera de estas moléculas se pueden administrar al paciente en solitario o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas en las que se mezclan con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte.

La presente divulgación también se relaciona con la administración de composiciones farmacéuticas. Dicha administración se realiza por vía oral o parenteral. Los procedimientos de suministro parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente al tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, o intranasal. Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. En la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA), se pueden consultar detalles adicionales sobre técnicas de formulación y administración.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones apropiadas para la administración oral. Dichos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para que el paciente las ingiera.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares apropiados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Son excipientes apropiados cargas de hidratos de carbono o de proteínas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata o de otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; y gomas que incluyen goma arábiga y goma de tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como, por ejemplo, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se pueden dotar de recubrimientos apropiados tales como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas, y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes apropiados. A los recubrimientos de comprimidos y grageas se les puede añadir tintes o pigmentos para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, su dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por presión (push-fit) elaboradas con gelatina, así como cápsulas blandas, selladas elaboradas con gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener principios activos mezclados con una carga o moléculas de unión tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos apropiados, tales como, aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos con o in estabilizantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuestos activos. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica tamponada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Además, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones oleaginosas apropiadas para inyecciones. Los disolventes o vehículos lipófilos apropiados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes apropiados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

Para la administración tópica o nasal, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados para la barrera particular a infiltrar. En general, dichos penetrantes son conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden elaborar de una manera conocida por sí misma, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización.

La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con ácidos, que incluyen, pero sin limitación, los ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que se encuentren en forma de las correspondientes bases libres. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM - 50 mM o fosfato o Tris, sacarosa al 0,1 %-2 % y/o manitol al 2 %-7 % con un intervalo de pH de entre 4,5 y 7,5 opcionalmente comprendiendo sustancias adicionales como polisorbato que se combina con tampón antes de su uso.

Después de preparar las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable, estas se pueden colocar en un recipiente apropiado y se pueden etiquetar para el tratamiento de una afección indicada. Para la administración de anticuerpos anti-CEACAM6 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, dichas etiquetas pueden incluir la cantidad, la frecuencia y el procedimiento de administración.

Kits

La invención se relaciona también con envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los principios de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Puede haber una nota asociada a dicho(s) recipiente(s) en la forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora acerca de la elaboración, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de la elaboración, el uso o la venta del producto para su administración a seres humanos.

Dosis terapéuticamente eficaz

Las composiciones farmacéuticas apropiadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el fin que se desea, es decir, el tratamiento de una patología particular que se caracteriza por la expresión de CEACAM6.

La determinación de una dosificación eficaz se encuentra bien dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo novedoso de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno del mismo o una variante del mismo, dependerá en gran medida de las características particulares del paciente, de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno que se esté tratando. Se puede encontrar una guía general, por ejemplo, en las publicaciones de la International Conference on Harmonization y en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, págs. 484-528 (18a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como la toxicidad y la eficacia del medicamento. La toxicidad se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica y que se pueden encontrar en las referencias anteriores. La eficacia se puede determinar utilizando la misma guía junto con los procedimientos que se describen más adelante en los Ejemplos.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente ya sea en ensayos en cultivos de células, por ejemplo, células neoplásicas, o en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros, cerdos o monos. Los modelos animales también se utilizan para obtener un intervalo de concentración y vía de administración deseables. Después, dicha información se puede utilizar para determinar las dosis y vías de administración útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de anticuerpo o de fragmento de unión al antígeno del mismo, que mejora los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales ^{experimentales, por ejemplo, la DE}50 ^{(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL}50 ^{(la dosis}letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice ^{terapéutico, y puede expresarse como la relación DE}50^/DL50^{. Se prefieren las composiciones con mayores índices}terapéuticos. Los datos que se obtienen de ensayos en cultivos de células y estudios en animales, se utilizan para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se ^{encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE}50 ^{con poca o}ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación que se emplee, de la sensibilidad del paciente y de la vía de administración.

El médico selecciona la dosificación exacta dependiendo del paciente a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la unidad activa o para conservar el efecto que se desea. Otros factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad de la patología, por ejemplo, el tamaño y lugar del tumor; la edad, el peso y sexo del paciente; la dieta, el tiempo y la frecuencia de la administración, combinación(es) de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar, por ejemplo, cada 3 a 4 días, cada semana, una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas, dependiendo de la semivida y de la tasa de eliminación de la formulación particular. Las cantidades de una dosificación normal pueden variar entre 0,1 y 100000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 10 g, dependiendo de la vía de administración. En la bibliografía se proporcionan guías sobre dosificaciones y procedimientos de suministro particulares. Véanse las Patentes de Estados Unidos N.° 4.657.760; 5.206.344 o 5.225.212. Los especialistas en la técnica emplearán diferentes formulaciones para polinucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, el suministro de polinucleótidos o polipéptidos será específico para las células, condiciones, lugares, etc. particulares. Las actividades específicas preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar entre 0,1 y 10 mCi/mg de proteína (Riva y col., Clin. Cancer Res. 5: 3275-3280, 1999; Ulaner y col., 2008 Radiology 246(3): 895-902).

Ejemplos

La presente invención se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención por referencia a realizaciones específicas. Aunque en estos ejemplos se ilustran determinados aspectos específicos de la invención, no representan las limitaciones ni definen el ámbito de la invención desvelada.

Todos los ejemplos se realizaron usando procedimientos convencionales bien conocidos y habituales para los expertos en la técnica, excepto donde se indique específicamente lo contrario. Las técnicas habituales de biología molecular de los siguientes ejemplos se pueden llevar a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Ejemplo 1. Secuencias de CEACAM6 de mono y generación de herramientas

En la tabla 2 se proporcionan detalles acerca de las secuencias proteicas de los antígenos y los compuestos de referencia que se usaron.

Tabla 2. Nombre, identificadores (ID) de las proteínas y de las secuencias (SEQ ID) que se usaron en este estudio

continuación

Las secuencias proteicas de las CEACAM humanas se obtuvieron de la base de datos UniProtKB/TrEMBL: CEACAM6 humana (P40199), CEACAM1 humana (P13688), CEACAM3 humana (P40198), CEACAM5 humana (P06731), CEACAM8 humana (P31997) y CEACAM19 humana (Q7Z692). También se disponía de la secuencia proteica de la CEACAM6 de Macaca mulatta (mono Rhesus) (F6YVW1). La secuencia proteica de la CEACAM6 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo) se dedujo de las secuencias de nucleótidos de acceso público mediante (a) la aplicación de las reglas convencionales de corte y empalme de intrones/exones, (b) la comparación con diferentes secuencias proteicas de monos/primates y (c) la conservación de la estructura genómica entre seres humanos/primates/mono. La CEACAM6 de mono cinomolgo está representada por TPP-4189.

Los dominios extracelulares recombinantes de las CEACAM se obtuvieron de fuentes comerciales o se produjeron en el propio laboratorio. Para ello, en el extremo C de los dominios extracelulares se introdujo un sitio de escisión para el factor Xa, un fragmento Fc de la IgG1 humana y una etiqueta de His y se expresó en células HEK293 usando procedimientos convencionales de transfección transitoria. Las proteínas se purificaron del sobrenadante de cultivo celular usando proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. En los casos en los que era necesario eliminar la parte Fc, las proteínas se escindieron con el factor Xa siguiendo las recomendaciones del fabricante (por ejemplo, factor Xa de proteasa de Hematologic Technologies, Inc., HTI N° HCXA-0060) y posteriormente se purificaron usando proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. En los casos en los que era necesario emplear proteínas biotiniladas, se recurrió al uso de kits de biotinilación comerciales (por ejemplo, EZ-Link Amine-PEG3-Biotin de Pierce, N° 21347), y el grado de biotinilación se caracterizó usando kits comerciales (por ejemplo, kit de cuantificación de biotina de Pierce, n.° 28005).

El dominio 1 N-terminal individual de la CEACAM6 humana se produjo en E. coli BL21 DE3 como una construcción de proteína fusionada con 6 histidinas, usando el vector pET28a (Novagen). Después de aplicar inducción durante una noche con IPTG a 37 °C, la proteína recombinante se aisló de los cuerpos de inclusión y se replegó. Antes de llevar a cabo el replegado, los cuerpos de inclusión se lavaron con tampón Tris con un pH de 8,5 que contenía NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y Tween 20 al 0,1 % y se disolvieron en el mismo tampón que contenía urea 8 M y que no contenía detergentes. La solución se diluyó (1:10) lentamente con CHES 50 mM a un pH de 9,2 que contenía arginina 500 mM y se incubó a 4 °C durante 16 horas. La purificación se consiguió realizando cromatografía convencional con níquel y NTA y cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 75 con tampón Tris 30 mM, pH 8,5 que contenía NaCl 150 mM.

El anticuerpo de IgG1 murino 9A6 (GM-0509) se obtuvo en Genovac y se quimerizó con IgG2 humana e IgG1 humana. La base de la secuencia proteica Neo201 como IgG2 humana o IgG1 humana era la del documento US 20130189268. Todos los anticuerpos se expresaron en células HEK293 usando procedimientos convencionales de transfección transitoria y se purificaron del sobrenadante del cultivo celular usando proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño.

Se generaron líneas celulares HeLa estables que expresaban diferentes receptores de CEACAM humana de longitud completa. Para ello, se transfectaron las secuencias de los siguientes receptores: CEACAM1 humana (TPP-4185), CEACAM3 humana (TPP-4187), CEACAM5 humana (TPP-4188), CEACAM6 humana (TPP-4639), CEACAM8 humana (TPP-4190), CEACEAM19 (TPP-4186) o CEACAM6 de mono cinomolgo (TPP-4189). La línea celular HeLa no expresa endógenamente ninguno de estos receptores en la superficie como se confirmó mediante análisis FACS, y la expresión en la superficie solo se pudo detectar después de la transfección del receptor de CEACAM respectivo. Resumiendo, las construcciones de expresión se clonaron en vectores basados en UCOE (EMD Millipore Corporation) y se transfectaron en células HeLa. Después de la selección con higromicina, se exploraron clones estables adecuados mediante transferencia Western del lisado celular total, así como tinción con FACS de la superficie celular usando anticuerpos adecuados.(CEACAM1 humano: #MAB22441 de R&D Systems; CEACAM5 humano: #MAB41281 de R&D Systems; CEACAM6 humano: #MAB3934 de R&D Systems; CeAcAM8 humano: ab90294 de abcam; CEACAM19 humano: #NBP1-70494 de Novus; CEACAM3 humano: AF4166 de R&D Systems; CEACAM6 de cinomolgo: Neo201-hIgG1).

Ejemplo 2. Caracterización de la inmunomodulación del anticuerpo 9A6-mIgG1

En la bibliografía se ha descrito que el anticuerpo 9A6 es un anticuerpo inmunomodulador (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de mayo de 2013; 121 (22): 4493-503). Este anticuerpo se caracterizó con respecto a su afinidad, su selectividad por otras CEACAM humanas, su reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono, su unión específica con un dominio determinado en CEACAM6 y su selectividad por otras CEACAM humanas.

Mediciones de afinidad usando resonancia de plasmón superficial (RPS)

Los experimentos de resonancia de plasmón superficial (RPS) para el análisis de unión cuantitativa se llevaron a cabo usando un instrumento Biacore T100, Biacore T200 o Biacore 4000 (GE Healthcare Biacore, Inc.) dotado de microplacas detectoras CM5 de la serie S (GE Biacore Healthcare, Inc.). El análisis de unión se realizó a 25 °C con tampón de ensayo HBS-EP+ (HEPES 10 mM a un pH de 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,05 %). Los anticuerpos se capturaron con un anticuerpo de captura anti-hIgG inmovilizado de manera covalente en la superficie de la microplaca mediante química de acoplamiento de aminas. Para el acoplamiento de aminas (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y etanolamina-HCl, a pH de 8,5) se usaron reactivos del kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare con el código de producto BR-1000-1050). Se usaron anticuerpos de captura anti-hlgG, anti-mlgG y tampón de inmovilización (acetato de sodio 10 mM, pH 5,0) del kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare, BR-1008-39) y del kit de captura de anticuerpos de ratón (GE Healthcare, BR- 1008-38), respectivamente. La superficie de la microplaca detectora se activó con una solución recién preparada de EDC 0,2 M y NHS 0,05 M que se pasó sobre la superficie de la microplaca durante 420 s a un caudal de 10 pl/min, seguido de una inyección de anticuerpo de captura anti-hlgG o anti-mlgG (disuelto a 25 mg/ml en tampón de inmovilización) durante 180 s a un caudal de 5 pl/min. El exceso de grupos activados se bloqueó con una solución 1 molar de etanolamina inyectada a un caudal de 10 pl/min durante 420 s.

Los antígenos CEACAM se usaron como analitos para determinar valores de K^d. Antes de aplicar la inyección de cada uno de los analitos, los anticuerpos se capturaron durante un período de 20 s a un caudal de 10 pl/minuto. Para determinar la afinidad cinética, se inyectaron diversas concentraciones, que variaron entre 1,56 y 200 nM, de CEACAM1 humana, CEACAM3 humana, CEACAM5 humana, CEACAM6 humana, CEACAM6 de mono cinomolgo y del dominio 1 de CEACAM6 de mono cinomolgo, en tampón de ensayo (véanse líneas anteriores) sobre los anticuerpos capturados, durante un período de 3 minutos a un caudal de 60 pl/minuto, y se controló la disociación durante 10 minutos.

Los sensogramas obtenidos se referenciaron por duplicado, es decir, por corrección de células de referencia en línea seguido de sustracción de muestra de tampón. Los valores de K^dse calcularon basándose en la relación de las constantes de velocidad de disociación (kd) y asociación (ka) que se obtuvieron ajustando globalmente los sensogramas con un modelo de unión de Langmuir de primer orden 1: 1, implementado en el paquete de programas informáticos de evaluación Biacore (programa informático de evaluación Biacore T100/T200/4000, GE Healthcare Biacore, Inc.).

Experimentos de competición de tipo sándwich mediante RPS

Los experimentos de competición de tipo sándwich realizados mediante RPS se realizaron de manera similar a la descrita anteriormente con mínimas modificaciones. En primer lugar, cada anticuerpo a analizar se inmovilizó de manera covalente en la superficie detectora mediante acoplamiento de aminas (para más detalles, véanse líneas anteriores). Para verificar si un anticuerpo diferente compite por la unión a un determinado antígeno CEACAM, el antígeno respectivo se capturó por inyección sobre el anticuerpo inmovilizado y el segundo anticuerpo que se analizó para la competencia se inyectó inmediatamente después. Si el segundo anticuerpo se une al antígeno unido por el primer anticuerpo(+), ambos anticuerpos no muestran competición y viceversa, si no se observa unión por inyección del segundo anticuerpo(-), ambos anticuerpos compiten por un epítopo similar.

Estudios de mapeo de dominios usando ELISA

Para obtener información específica acerca de los epítopos, se diseñaron, se expresaron y se purificaron diversas construcciones que comprendieron dominios quiméricos. En resumen, el extremo C de la secuencia de la CEACAM6 humana de tipo silvestre se fusionó con un fragmento Fc de la IgG1 humana, se expresó en células HEK293 y se purificó del sobrenadante usando proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño (TPP-1790). Para crear diferentes quimeras de dominio, la secuencia humana de un solo dominio se reemplazó en consecuencia por la secuencia de Macaca mulatta correspondiente (F6YVW1) en la CEACAM6 humana fusionada con Fc. Esto creó tres quimeras de dominio diferentes hDom1-hDom2-mDom3 (TPP-1793), hDom1-mDom2-hDom3 (TPP-1792) y mDom1-hDom2-hDom3 (TPP-1791), junto con la construcción de fusión de Fc de Macaca mulatta de tipo silvestre como control (TPP-1306). Además de las quimeras, el dominio 1 individual de la CEACAM6 humana se produjo como se describió anteriormente a partir de E.coli (TPP-1794).

El mapeo de la especificidad de dominio de los anticuerpos se realizó usando un ensayo ELISA:

Para el análisis ELISA, las quimeras de dominio fusionadas a Fc y el dominio 1 individual se aplicaron en placas Nunc MaxiSorb y se bloquearon con solución SmartBlock. Después de la incubación con una serie de concentración de IgG (1 nM - 1000 nM) durante 1 h, las placas se lavaron con PBS/T. El análisis de las IgG unidas a las construcciones de dominio CEACAM6 se logró mediante la detección a través del anticuerpo anti-IgG humana (específico de Fab) conjugado con peroxidasa (A0293, Sigma). La detección de la fluorescencia se realizó con AmplexRed (A12222, Invitrogen) siguiendo protocolos estándar.

Análisis de unión basado en ELISA

Para caracterizar la unión de los anticuerpos a diversos parálogos y ortólogos de CEACAM se utilizaron ensayos ELISA. Placas negras de 384 pocillos se revistieron con 25 pl/pocillo de diversas preparaciones de CEACAM a 2 pg/ml en tampón de recubrimiento (Candor) a 37 °C durante 1 hora. Después de realizar un lavado con PBS/Tween-20 al 0,05%, los pocillos se bloquearon durante 1 hora con Smart Block al 100% (Candor) a 37 °C. Después de realizar tres lavados con PBS/Tween-20 al 0,05 %, se añadieron diluciones en serie de los anticuerpos en PBS/Tween-20 al 0,05 %/Smart Block al 10 %, que variaron entre 2 pg/ml y 2 ng/ml, y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de efectuar tres lavados con PBS/Tween-20 al 0,05 %, se añadió un anticuerpo secundario apropiado. Para detectar las proteínas que comprendían un fragmento Fc humano, tales como TPP-1173, se usó un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP (Sigma, A0170) a una dilución de 1:10.000. Para detectar las proteínas que comprendían un fragmento Fc de ratón, tales como TPP-1744, se usó un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP (ThermoScientific, 31432) a una dilución de 1:10000. Como tampón de dilución, se usó PBS/Tween-20 al 0,05 %/Smart Block al 10 %, Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se llevaron a cabo tres lavados, las placas se revelaron con Amplex Red (de Life Technologies) y se ^{leyó la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 590 nm. Para calcular los valores de CE}50 ^{se usó el}programa informático GraphPad Prism 6.0 que utiliza un ajuste de curva no lineal de cuatro parámetros.

Resultados

Para medir la afinidad, forma monovalente de 9A6, por la CEACAM6 humana y para evaluar su reactividad cruzada por la CEACAM6 de mono, se realizaron experimentos de RPS como se describió con anterioridad. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Análisis de RPS: K^dforma monovalente (en nM)

Como se observa, 9A6-mIgG1 pudo unirse con afinidad elevada (22 nM) a la CEACAM6 humana recombinante. Sin embargo, no fue posible detectar la unión con la CEACAM6 de Macaca mulatta. Con fines comparativos, también se analizó Neo201-hIgG1. Este anticuerpo presentó afinidad de unión elevada tanto por la CEACAM6 humana como por la CEACAM6 de mono. En resumen, 9A6 pudo unirse a la CEACAM6 humana con una afinidad elevada pero no presentó reacción cruzada con la CEACAM6 de mono.

Para mapear el dominio de unión de 9A6 en CEACAM6, se evaluó la unión en diferentes quimeras de ser humano/mono con un ensayo ELISA, según se describió con anterioridad. Para poder realizar una comparación con Neo201-hIgG1 (TPP-1173), 9A6 se quimerizó con una IgG1 humana (TPP-1745). Los resultados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Análisis de mapeo de dominios mediante ensayo de unión ELISA

9A6 pudo unirse a la CEACAM6 humana de tipo silvestre (wildtype, WT) y a las quimeras empleando los dominios 2 o 3 de la CEACAM6 de Macaca mulatta. Sin embargo, no pudo unirse a la quimera empleando el dominio 1 de la CEACAM6 de Macaca mulatta ni a la CEACAM6 de Macaca mulatta de tipo silvestre. De acuerdo con esto, 9A6 pudo unirse al dominio 1 individual de la CEACAM6 humana. En cambio, Neo201-hIgG1 se unió a todas las formas que se analizaron, con la excepción del dominio 1 individual de la CEACAM6 humana. En conclusión, 9A6 se une al dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana.

Para corroborar estos resultados, se llevó a cabo un experimento de competición como se describió con anterioridad. Los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Experimentos de competición de tipo sándwich mediante RPS en la CEACAM6 humana recombinante (R&D Systems, TPP-1436)

Como resulta evidente de la tabla 5, 9A6-mIgG1 y Neo201-hIgG1 no compiten entre sí por la unión con la CEACAM6 humana. Esto concuerda con la información publicada, donde se indica que el epítopo de Neo201 se encuentra fuera del dominio 1.

Para analizar la selectividad de 9A6 por diferentes ortólogos de la CEACAM6 y para poder realizar una comparación con Neo201-hIgG1, se formó una quimera con 9A6 y la hIgG1 (TPP-1745). En el experimento de unión basado en ^{un ensayo ELISA y que se llevó a cabo como se describió con anterioridad, se obtuvieron los valores de CE}50 ^{que se}detallan en la tabla 6.

^Tabla6^. ^{Análisis de selectividad/reactividad cruzada mediante ensayo ELISA de unión; los valores de CE}50 ^seexpresan en nM

Se confirmó que 9A6 se unía a la CEACAM6 humana con una afinidad elevada. En consonancia con los experimentos de RPS en los que se había usado la CEACAM6 de mono, se determinó que 9A6 tampoco se unía a la CEACAM6 de mono cinomolgo. Sin embargo, 9A6 presentó selectividad por la CEACAM6, ya que no se unió a la CEACAM3 humana ni a la CEACAM5 humana.

Por el contrario, Neo201-hIgG1 muestra una unión de alta afinidad similar a la de la CEACAM6 humana e incluso reacciona en cruzado con la CEACAM6 de mono cinomolgo. Esto sucede a una selectividad reducida, ya que presenta también una unión a la CEACAM5 humana con una afinidad elevada.

Ejemplo 3. Alineamiento de secuencias proteicas de las CEACAM

La forma extracelular madura de la CEACAM6 humana (que abarca los aminoácidos 35-320 de UniProt/Swiss-Prot: P40199.3) consiste en diferentes dominios: el dominio 1 N-terminal (que según la www.uniprot.org, abarca los aminoácidos 35-142 de UniProt/Swiss-Prot: P40199.3), el dominio 2 N-terminal (que según la www.uniprot.org, abarca los aminoácidos 145-232 de UniProt/Swiss-Prot: P40199.3) y el dominio 3 (que según la www.uniprot.org, abarca los aminoácidos 237-314 de UniProt/Swiss-Prot: P40199.3). Dado que el objetivo fue identificar un anticuerpo selectivo que presentara una afinidad elevada por el dominio 1 N-terminal de CEACAM6 y que también reaccionara en cruzado con la CEACAM6 de mono cinomolgo, se evaluó la posibilidad de combinar todas las propiedades deseadas en una molécula.

Para este fin, se comparó la secuencia proteica del dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana con la de otras proteínas usando el algoritmo Blastp (NCBI) usando parámetros convencionales para identificar los homólogos más relevantes de la CEACAM6. Los dominios extracelulares maduros (parciales) de la CEACAM6 humana (aminoácidos 35-320 de UniProtKB/Swiss-Prot: P40199.3), CEACAM1 humana (aminoácidos 35-428 de UniProtKB/Swiss-Prot: P13688.2), CEACAM3 humana (aminoácidos 35-155 de UniProtKB/Swiss-Prot: P40198.2), CEACAM5 humana (aminoácidos 35-417 de UniProtKB/Swiss-Prot: P06731.3) y de la CEACAM6 de cinomolgo (Macaca fascicularis) (aminoácidos 35-320 de TPP-4189) se alinearon usando "Alineación global de Wilbur y Lipman (rápida)" en el programa informático Phylosopher (Genedata). La alineación se muestra en la Figura 1. Usando el programa informático Vector NTI (Life Technologies), se determinó el porcentaje de identidad de secuencia del dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana con respecto otros dominios N-terminales (según la alineación). Esos resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Porcentaje de identidad de secuencias proteicas de los dominios N-terminales de las diferentes CEACAM con respecto al dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana.

En el alineamiento de las secuencias de la figura 1, se observa un grado de similitud muy alto en toda la región extracelular de las secuencias proteicas de la CEACM6 humana, de la CEACAM3 humana, de la CEACAM5 humana y de la CEACAM1 humana. La región que se tomó como diana (el dominio 1 de la CEACAM6 humana) fue especialmente similar a la de las otras CEACAM, lo cual también puede observarse en la tabla 7. Los parálogos de la CEACAM6 humana fueron mucho más similares a la CEACAM6 humana que el ortólogo del cinomolgo. De hecho, solamente hubo dos aminoácidos en sendas posiciones en la región N-terminal de la secuencia primaria que fueron idénticos entre la CEACAM6 humana y la CEACAM6 de mono cinomolgo pero fueron diferentes de los aminoácidos que se encuentran en las mismas posiciones en los otros parálogos humanos (lo cual se señala con asteriscos en la figura 1).

Para concluir: es muy difícil identificar un anticuerpo de alta afinidad para el dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana que sea selectivo pero que todavía reaccione en cruzado con la CEACAM6 de mono.

Ejemplo 4. Generación de anticuerpos mediante presentación en fagos

Con el fin de identificar anticuerpos anti-CEACAM6 humana, se llevaron a cabo diversas selecciones con la fagoteca de fragmentos Fab humanos FAB-300 de DYAX, esencialmente como se ha descrito con anterioridad (Hoet y col., 2005; Huang y col., 2006). Como se resume en la tabla 8, se emplearon diferentes estrategias con hasta cuatro rondas de selección de fagos usando la CEACAM6 de ser humano y de mono cinomolgo recombinante marcada con Fc y con biotina (TPP-1436 y TPP-2443), aplicada como recubrimiento sobre perlas de estreptavidina, así como la línea celular tumoral humana KPL-4 (Kurebayashi y col., Br. J. Cancer, febrero de 1999, 79 (5-6): 707-17) en cuya superficie celular se expresó de manera endógena la proteína diana en una cantidad importante. Además, antes de cada selección en las dianas proteicas, se incluyó el empobrecimiento de moléculas de unión contra CEACAM5 (TPP-1438; hC5) y CEACAM1 (TPP-1437; hC1) (inespecíficas) o IgG1-Fc(Fc) humano recombinante como se indicó. Por ejemplo, en la estrategia A después del empobrecimiento de las perlas recubiertas con CEACAM1 humana (hC1), la primera ronda de selección se realizó en la CEACAM6 humana (hC6). El resultado resultante se dividió y una parte se usó para una segunda y tercera ronda de selección en la CEACAM6 humana. La otra parte se usó para la segunda ronda de selección en células KPL-4, una tercera ronda en la CEACAM6 humana y una cuarta ronda de selección final en células KLP-4. En la estrategia C, se realizó una etapa de elución específica, utilizando el mAb de ratón 9A6-mlgG1 (TPP-1744).

Tabla 8. Estrategias de selección de fagos; hC6 humana: TPP-1790; cinoC6 de mono cinomolgo: TPP-2443; hC1: TPP-1438; hC5: TPP-1437; Fc: fragmento Fc de IgG1 humana recombinante (R&D Systems, N.° 110-HG-100)

Se exploraron grupos de fagos enriquecidos de las diferentes rondas de selección para detectar moléculas de unión en la diana así como moléculas inespecíficas mediante un ensayo ELISA con presentación en fagos ya descrito con anterioridad (Hoet y col., Nat. Biotechnol., marzo de 2005, 23(3): 344-8), o mediante análisis FACS en células que expresaban CEACAM6. Se seleccionaron grupos de fagos con un perfil favorable para la eliminación de genelII y se exploraron posteriormente mediante un ELISA para detectar fragmentos Fab solubles. Se secuenció el ADN de los aciertos que se obtuvieron con los fragmentos sFab y se caracterizó la capacidad de diversas muestras representativas individuales de unirse a las células KPL-4 por medio de un análisis de FACS (tabla 9). En algunas estrategias, las moléculas de unión de fagos según la invención se clonaron nuevamente en una IgG.

Tabla 9. Titulación basada en FACS de los aciertos individuales de fragmentos sFab

continuación

La unión de los fragmentos Fab purificados, seleccionados por presentación en fagos (véase la lista en la tabla 9), con variantes biotiniladas de la CEACAM1 humana (TPP-1437), de la CEACAM5 humana (TPP-1438) y de la CEACAM6 humana (TPP-1436) se analizó mediante interferometría de biocapa usando un instrumento Octet RED384 (Pall Corp. ForteBio). Los antígenos biotinilados se cargaron en biodetectores con estreptavidina (SA) (ForteBio Part, número 18-5019), y después de una etapa de equilibrio inicial en tampón de ensayo (PBS complementado con BSA al 0,1 % (p/v), Tween-20 al 0,02% (v/v) y azida sódica al 0,05% (v/v); ForteBio Part, número 18-5032), se comprobó la unión de los fragmentos Fab diluidos en tampón de ensayo a una concentración final de 200 nM durante 300 segundos, seguido de una etapa de disociación durante 300 segundos.

Los fragmentos Fab purificados correspondientes de la tabla 9 también presentaron unión a la CEACAM6 humana pero no a la CEACAM5 humana ni a la CEACAM1 humana.

Para analizar si los fragmentos Fab podían competir con 9A6 por la unión con la CEACAM6 humana, se llevó a cabo un experimento de competición. En este caso, se cargó una CEACAM6 humana biotinilada (TPP-1436) en biodetectores con SA y se comparó la respuesta de unión de los fragmentos Fab que se deseaba analizar, con la respuesta de unión de otros fragmentos Fab que se habían obtenido como resultado de una carga con una CEACAM6 saturada con 9A6-mIgG1 (TPP-1744; según se describe en el ejemplo 1). Si la respuesta de unión en presencia de 9A6 se reduce o elimina significativamente, esto es una fuerte indicación de que un Fab analizado se une a un epítopo similar al de 9A6.

Sorprendentemente, todos los fragmentos Fab que se analizaron pudieron competir con 9A6 por la unión a la CeAcAM6 humana.

Las secuencias de Fab se reformatearon en formato de IgG1 humana para su caracterización adicional.

Las afinidades de los anticuerpos reformateados (Kd, forma monovalente) hacia una CEACAM6 humana recombinante (TPP-1436), se determinaron mediante RPS que se realizó de una manera análoga a la de los procedimientos experimentales descritos en el ejemplo 2. Para llevar a cabo la evaluación de los sensogramas, se recurrió a un ajuste general de primer orden basándose en una unión según un modelo 1:1 de Langmuir o un análisis de la afinidad en el estado estacionario con el conjunto de programas informáticos de evaluación de Biacore (programa de evaluación T200/4000 de Biacore). Los resultados se detallan en la tabla 10.

Tabla 10. Análisis de RPS, K^dforma monovalente (en nM)

continuación

Según puede observarse en la tabla 10, los anticuerpos en forma monovalente presentaron una afinidad más bien baja siendo el valor más bajo (correspondiente a la afinidad más alta) de 76 nM para TPP-1679. Las tres IgG que presentaron las afinidades más elevadas en su forma monovalente, se analizaron para determinar su selectividad y su capacidad de reaccionar en cruzado con la CEACAM6 de mono cinomolgo en un experimento de unión basado en ELISA (realizado de manera análoga al protocolo que se describió en el ejemplo 2).

^{Tabla 11.} ^{Análisis de selectividad/reactividad cruzada mediante ELISA de unión; los valores de CE}50 ^{se expresan en}nM

En resumen, se han obtenido anticuerpos que presentan una afinidad más bien baja en su forma monovalente. Esto podría ser una consecuencia de su incapacidad de unirse a otros parálogos. En cualquier caso, el perfil de selectividad tendió a resultar inapropiado (véase TPP-1679 y TPP-1669 en la tabla 11). De todos los anticuerpos que se analizaron, TPP-1678 fue el único que presentó una reactividad cruzada muy marginal con la CEACAM6 de mono cinomolgo recombinante (véase la tabla 11).

En conclusión, como resultado de la presentación en fagos sin una maduración adicional, se obtuvieron anticuerpos anti-CEACAM6 que no resultarían útiles desde el punto de vista terapéutico.

Ejemplo 5. Maduración de los anticuerpos obtenidos como resultado de la presentación en fagos

Para obtener anticuerpos que se caracterizaran por un perfil deseable de afinidad, de selectividad y de reactividad cruzada, algunos de los anticuerpos que se obtuvieron a partir de la presentación en fagos se sometieron a un proceso de maduración por afinidad.

En este contexto, todas las posiciones correspondientes a los aminoácidos en las CDR de TPP-1669, de TPP-1678 y de TPP-1679 se distribuyeron al azar de manera individual. Se expresaron las variantes resultantes y se evaluó su capacidad de unirse a diversos miembros de la familia de las CEACAM (CEACAM6 humana, CEACAM6 de mono cinomolgo, CEACAM3 humana y la CEACAM5 humana) sometiendo los sobrenadantes celulares a un ELISA de unión.

En el caso de TPP-1669, no se pudieron identificar mutaciones individuales que mejorasen la unión a la CEACAM6 de mono cinomolgo, sin al mismo tiempo mejorar la unión a otros miembros de la familia CEACAM humana.

En el caso de TPP-1679, se identificaron varias mutaciones individuales, que mejoraron la unión a la CEACAM6 humana sin unión mejorada concomitante a otros miembros de la familia CEACAM humana, y se generó una biblioteca de recombinación que contenía todas las permutaciones posibles. Las variantes correspondientes se expresaron como isotipos de IgG2 humana, se purificaron y se evaluó su unión a múltiples miembros de la familia CEACAM mediante RPS de forma análoga a los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 2. La Tabla 12 resume las propiedades de los anticuerpos seleccionados obtenidos con este proceso.

Tabla 12. Análisis por RPS, Kd forma monovalente (en nM)

Basándose en los resultados proporcionados en la tabla 12, se concluyó que era posible mejorar tanto la afinidad como la selectividad. Sin embargo, es evidente la dificultad que implica el objetivo de obtener moléculas de unión que también puedan reaccionar en cruzado con la CEACAM6 de mono cinomolgo, cuya afinidad no difiera por más de un orden de magnitud de la afinidad que presenten por la CEACAM6 humana en forma monovalente.

En el caso de TPP-1678, se identificaron varias mutaciones individuales, que mejoraron la unión a la CEACAM6 humana y CEACAM6 de mono cinomolgo sin mayor unión concomitante a otros miembros de la familia CEACAM humana, y se generó una biblioteca de recombinación que contenía varias permutaciones. Las variantes correspondientes se expresaron como isotipos de IgG2 humana, se purificaron y evaluaron con respecto a su unión a múltiples miembros de la familia CEACAM mediante RPS de forma análoga a los procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 2 (resumidos en la Tabla 13).

Las características de unión de estos anticuerpos también se evaluaron basándose en un ELISA de unión (en el cual se evaluaron las CEACAM biotiniladas en su forma monovalente). Se usó una dilución 1: 440 de una IgG anti humana (Sigma, 12136) en tampón de recubrimiento (Candor) para recubrir placas negras de Maxisorp de 384 pocillos (Nunc) durante 1 hora a 37 °C. Después de un lavado con PBS/Tween-20 al 0,05 %, las placas se bloquearon con SmartBlock al 100% (Candor) durante 1 hora a 37 °C. Después de tres lavados, se añadieron 2 |jg/ml de los anticuerpos relevantes a la placa en PBS/Tween-20 al 0,05 %/SmartBlock al 10%. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se añadieron series de dilución de las proteínas CEACAM biotiniladas relevantes en PBS/Tween20 al 0,05 %/SmartBlock al 10 % y las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se añadió 1 jg/ml de estreptavidina-peroxidasa (Sigma, S5512) en PBS/Tween-20 al 0,05 %/SmartBlock al 10% y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las placas se revelaron con Amplex Red (Life Technologies) y se leyó la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 590 m. Se utilizó el programa informático GraphPad ^{Prism 6.0 para calcular los valores de CE}50 ^{utilizando un ajuste de curva no lineal de cuatro parámetros.}

Las variantes con un perfil de afinidad, selectividad y reactividad cruzada sustancialmente mejoradas se identificaron como se resume en la Tabla 13 y la Tabla 14 para los anticuerpos seleccionados obtenidos mediante este proceso.

Tabla 13. Análisis mediante RPS: Kd forma monovalente (en nM)

^{Tabla 14.} ^{Análisis de selectividad/reactividad cruzada basado mediante ELISA de unión: los valores de CE}50 ^seexpresan en nM

En conclusión, usando el precursor TPP-1678, fue posible obtener unos pocos anticuerpos humanos que presentaron una afinidad elevada por la CEACAM6 humana, que también presentaron una reacción cruzada verdadera con la CEACAM6 de mono cinomolgo y que presentaron selectividad por la CEACAM6: basándose en la ^{comparación de los valores de CE}50 ^{correspondientes, se comprobó que la unión entre TPP-3707 y la CEACAM6}humana fue aproximadamente 730 veces más intensa que la unión entre TPP-3707 y la CEACAM3 humana (esta proporción fue de 620 veces para TPP-3705).

Ejemplo 6. Generación de anticuerpos mediante inmunización de ratones

Para generar anticuerpos monoclonales de ratón contra la CEACAM6, se realizaron dos estrategias de inmunización diferentes basadas en la secuencia de los inmunógenos que se aplicaron en ratones Balb/c (las estrategias A y B que se detallan en la tabla 15). En cada una de las estrategias, los ratones se inmunizaron aplicando los antígenos a través de la almohadilla plantar o por vía intraperitoneal, durante 5 rondas de inyección, según se detalla en la tabla 15. En la estrategia A, la inmunización se llevó a cabo con el dominio 1 de la CEACAM6 de mono cinomolgo, mientras que en la estrategia B, la inmunización se llevó a cabo con una combinación de la porción extracelular completa de las CEACAM6 humana y de mono cinomolgo, utilizados como inmunógenos.

Para efectuar las inmunizaciones en la almohadilla plantar, se aplicaron 5 inyecciones de 1 |jg del antígeno una vez a la semana. Para efectuar las inmunizaciones por vía intraperitoneal, se aplicaron 4 inyecciones intraperitoneales (IP) cada dos semanas (10 jg de antígeno), seguidas de un refuerzo mediante inyección intravenosa.

Tabla 15. Cronograma de inmunización

Cuatro días después de la última inyección, se fusionaron células de ganglios linfáticos o esplenocitos de los ratones según procedimientos convencionales (por ejemplo, según la descripción de Kohler y Milstein, Nature, 7 de agosto de 1975, 256 (5517): 495-7). La exploración de los hibridomas clonados resultantes se basó en un ELISA en el que se usaron antígenos biotinilados y otras proteínas inespecíficas (que se detallan en la tabla 16). En particular, se recubrieron placas de microtitulación con anticuerpos de cabra anti-ratón a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las placas se lavaron y se bloquearon con BSA al 5 % a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se realizó otra etapa de lavado. Una muestra de 20 j l de los sobrenadantes de los hibridomas, se incubó con los antígenos biotinilados a temperatura ambiente durante 1 hora y las mezclas se transfirieron a los pocillos recubiertos después de lo cual se realizó una etapa de incubación (a temperatura ambiente durante 1 hora). Después de lavar las placas, se añadieron los conjugados de anti-estreptavidina-HRP a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, los pocillos se lavaron y la reacción de color se reveló con la adición de 50 j l de TMB y los resultados se registraron en un lector de placas.

Tabla 16. Lista de las proteínas que se usaron en la exploración de hibridomas basada en un ensayo ELISA (proteínas diana e inespecíficas)

Sorprendentemente, solo la Estrategia A dio como resultado clones que mostraran un perfil favorable con respecto a la reactividad cruzada con la CEACAM6 humana y de mono cinomolgo, así como la selectividad. Además, se obtuvieron algunos clones específicos de especies de ambas estrategias.

Los candidatos seleccionados positivamente por ELISA se subclonaron durante al menos 3 rondas de clonación y se produjeron en cantidades mayores de líquido ascítico mediante cromatografía de proteína A .

Los anticuerpos que se obtuvieron como resultado de la inmunización de los ratones también se caracterizaron basándose en su capacidad de unirse a la CEACAM6 en un contexto celular. Se emplearon células HeLa que sobreexpresaban la CEACAM6 humana o de mono cinomolgo en experimentos de FACS en los que se emplearon los sobrenadantes de los hibridomas o mIg purificadas (véase el ejemplo 1). Como control negativo, se usaron células HeLa no transfectadas. En la tabla 17 se resume el perfil de los candidatos que se identificaron a partir del ELISA y del análisis de FACS.

Tabla 17. Resumen de los resultados cualitativos que se obtuvieron para la unión de anticuerpos derivados de hibridoma murino con la CEACAM6 humana y de mono cinomolgo de un ELISA (usando TPP-1436, TPP-2443 y APP-319 biotinilados) y en un análisis de FACS (usando células HeLa transfectadas como se describió en el ejemplo 1: TPP-4639 y TPP-4189)

Los anticuerpos murinos que se obtuvieron se caracterizaron de manera más precisa para determinar su afinidad en forma monovalente (Kd), su selectividad por otros parálogos humanos y su grado de reactividad cruzada con la CEACAM6 de mono cinomolgo, mediante análisis de RPS con mIgG purificadas.

La RPS se realizó de manera análoga al procedimiento experimental que se describió en el ejemplo 2.

Los resultados se resumen en la tabla 18.

Tabla 18. Análisis de RPS: K^dforma monovalente (en nM)

Se observaron discrepancias no resueltas en el caso de TPP-2969 y TPP-2970: en el primer ELISA y en el primer análisis de FACS, presentaron especificidad por la CEACAM6 de mono cinomolgo, mientras que en el análisis de RPS posterior, también pudieron unirse a una CEACAM6 humana recombinante.

En resumen, sorprendentemente, la inmunización de los ratones con el dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 de mono cinomolgo (APP-325) produjo algunos anticuerpos (por ejemplo, TPP-3186, TPP-2971 o TPP-3187) que presentaron reacción cruzada verdadera tanto con la CEACAM6 humana como con la CEACAM6 de mono cinomolgo y que también presentaron selectividad con relación a otros parálogos humanos. Las afinidades se encontraron dentro de un intervalo aceptable con fines terapéuticos, pero su origen murino y la inmunogenicidad asociada no resultaron apropiados para una aplicación de naturaleza terapéutica en seres humanos.

Ejemplo 7. Humanización de los anticuerpos

Para generar anticuerpos que resultaran apropiados para realizar una aplicación terapéutica en los seres humanos, los anticuerpos murinos seleccionados se sometieron a un procedimiento de humanización.

Las secuencias seleccionadas de los anticuerpos que se obtuvieron a partir de los hibridomas murinos se determinaron mediante secuenciación de los ADNc de anticuerpo (véase la tabla 17). De acuerdo con los resultados de secuenciación, fue posible comprobar que TPP-3100 y TPP-3186 fueron idénticos. TPP-3101 presentó una secuencia de una sola cadena pesada aunque dos de cadena ligera. TPP-2971 y TPP-3187 fueron muy similares. La diferencia entre ellos era de cuatro aminoácidos (véase la figura 2).

Las secuencias VH y VL murinas descifradas de los anticuerpos TPP-2971 y TPP-3187 se humanizaron injertando las CDR según la definición de Kabat en armazones de la línea germinal humana. Como excepción, la HCDR2 se injertó parcialmente. Debido a que esta CDR es muy larga según la definición de Rabat (comprende 16 aminoácidos), solamente se injertaron los 9 primeros aminoácidos. Estos aminoácidos representaron la porción de la HCDR2 que es idéntica a la HCDR2 según la definición de Chothia (las definiciones de las CDR según Kabat y Chothia pueden hallarse en Andre C. R. Martin, “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains”, Antibody Engineering (Springer Lab Manuals), editado por Duebel, S., y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg).

Los armazones de la línea germinal humana se seleccionaron basándose en búsquedas de similitud entre los componentes FW1, FW2, FW3 y FW4 de armazones murinos y el conjunto de VH y VL humanas así como de secuencias correspondientes al elemento J de la línea germinal humana. Las CDR murinas se injertaron en las secuencias de la línea germinal con mejor coincidencia (excluyendo las CDR), que eran IGKV1-9*01 e IGKJ2*01 para la VL (con identidades de 69,6%, FW1, 86,7%, FW2; 71,9%, FW3 y 80,0%, FW4) e IGHV2-70*01 e IGHJ6*01 para la VH (con identidades de 73,3 % (TPP-2971) y 70,0 % (TPP-3187), FW1; 85,7 %, FW271,9 %, con FW3 y 90,9 %, FW4)). Las secuencias de la línea germinal aplicadas en búsquedas de similitud se obtuvieron de la ^{base de datos VBASE}2 ^{(Retter, I., Althaus, H. H., Munich, R., Müller, W., VbAs E2, an integrative V gene database,}Nucleic Acids Res., 1 de enero de 2005; 33 (publicación de la base de datos): D671-4). Los nombres asignados a las secuencias más similares provenientes de la línea germinal se tomaron del sistema IMGT (Lefranc, M.-P., Giudicelli, V., Ginestoux, C., Jabado-Michaloud, J., Folch, G., Bellahcene, F., Wu, Y., Gemrot, E., Brochet, X., Lane, J., Regnier, L., Ehrenmann, F., Lefranc, G.. y Duroux, P., IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, Nucl. Acids Res., 37, D1006-D1012 (2009); doi: 10.1093/nar/gkn838)).

Se generaron dos variantes de secuencias humanizadas a partir de TPP-2971: TPP-3310 y TPP-3714. En la VH de TPP-3310, el elemento de J se mantuvo sin cambios, en comparación con la fuente de origen murino, mientras que en la VH de TPP-3714, el elemento J era completamente similar al de la línea germinal humana (véase la figura 3). No se encontraron sitios de glucosilación ni restos de cisteína no emparejados en las secuencias humanizadas. Por otro lado, se generaron dos variantes de secuencias humanizadas a partir de TPP-3187: TPP-3820 y TPP-3821 (véase la figura 4). En comparación con TPP-3714, la VH de TPP-3820 contenía treonina en lugar de serina en la posición 30 en HFW1 y glicina en lugar de alanina en la posición 46 en HFW2, mientras que la VL contenía dos asparaginas en lugar de dos serinas en las posiciones 92 y 93 en LCDR3. Estos cuatro cambios de aminoácidos reflejan las diferencias entre las secuencias de origen murino de TPP-3187 y TPP-2971.

El dominio variable VH de TPP-3821 fue idéntico al de TPP-3714, mientras que VL contenía dos restos de asparagina en lugar de dos restos de serina en las posiciones 92 y 93 en LCDR3 en comparación con TPP-3714. Estos dos cambios de aminoácidos reflejan las diferencias en las CDR entre las secuencias de origen murino TPP-3187 y TPP-2971. No se encontraron sitios de glucosilación ni restos de cisteína no emparejados en las secuencias de TPP-3820 y TPP-3821.

Se realizó un análisis para determinar la afinidad y experimentos competición de tipo sándwich de los anticuerpos quimerizados y humanizados mediante RPS, de manera análoga a los procedimientos experimentales que se describieron en el ejemplo 2 y los resultados se resumen en las tablas 19 y 20.

Tabla 19. Experimentos de competición de tipo sándwich mediante RPS en la CEACAM6 humana recombinante (R&D Systems, TPP-1436)

Tabla 20. Análisis de RPS, Kd forma monovalente (en nM)

Los análisis de selectividad y de reactividad cruzada se basaron en un ensayo ELISA de unión (proteínas CEACAM biotiniladas, formas monovalentes) análogo al protocolo proporcionado en el ejemplo 5. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 21.

^{Tabla 21.} ^{Análisis de selectividad/reactividad cruzada mediante ELISA de unión; los valores de CE}50 ^{se expresan en}nM

continuación

Los resultados de la tabla 19 indican que TPP-2971, TPP-3186 y TPP-3187 compiten por el mismo epítopo o uno similar en la CEACAM6 humana que 9A6-hIgG2. Los resultados de las tablas 20 y 21 destacan una alta afinidad de unión con la CEACAM6 humana y de mono cinomolgo, con una capacidad de reacción cruzada verdadera al mismo tiempo que presentaron selectividad por la CEACAM6 y no presentaron unión con parálogos de CEACAM6.

En conclusión, la humanización fue completamente satisfactoria, ya que con ella fue posible obtener anticuerpos que presentaron afinidades incluso más elevadas que las de sus precursores murinos, por lo cual podrían resultar útiles en el contexto de una aplicación de naturaleza terapéutica en seres humanos.

Ejemplo 8. Unión selectiva de CEACAM6 en las células

Para demostrar la capacidad de los anticuerpos anti-CEACAM6 de unirse a antígenos auténticos y su selectividad por ellos, se evaluó su capacidad de unirse a una CEACAM6 nativa expresada en la superficie de células provenientes de diversas líneas celulares mediante experimentos de FACS.

La selectividad por la CEACAM6 se evaluó en un panel de células HeLa que se habían transfectado con diversos receptores de CEACAM (CEACAM1 humana, CEACAM3 humana, CEACAM5 humana, CEACAM6 humana, CEACAM8 humana, CEACAM19 humana y CEACAM6 de mono cinomolgo; véase el ejemplo 1), en comparación con la unión de células HeLa de tipo silvestre que se había demostrado que eran negativas para la CEACAM6. Se ^{determinaron los valores de CE}50 ^{correspondientes a la unión a las células HeLa transfectadas con CEACAM6 de}mono cinomolgo o humana. Los resultados se detallan en la tabla 22.

En los experimentos de FACS, células HeLa de tipo silvestre se cultivaron en medio RPMI-1640 con FCS al 10 %, mientras que las células HeLa transfectadas con receptores de CEACAM recibieron adición de gentamicina al 0,5 % (solución madre de 10 mg/ml, Fa. PAA) y 200 pg/ml de higromicina B (solución madre de 50 mg/ml, Invitrogen). Las células se lavaron 3 veces con PBS sin Ca2+ ni Mg2+ y se separaron de la placa de cultivo sin usar enzimas con tampón de disociación a base de EDTA (Gibco). Las células se lavaron en tampón para FACS frío (PBS sin Ca2+ ni Mg2+ y FCS al 3 % termoinactivado) y se contaron usando un dispositivo de recuento (Invitrogen). Se colocaron 105 células en cada uno de los pocillos de las placas y se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (5 pg/ml) a 4 °C durante 1 hora en un agitador para placas. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con tampón para FACS (400 g, 5 minutos), se resuspendieron en una solución de 100 pl que contenía el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón o anti-humano con PE, dilución de 1:150, Dianova, n.° 115-115-164, n.° 109-115-098) y se incubaron a 4 °C durante 1 hora en un agitador para placas. Después de lavar 2 veces, las células se resuspendieron en 100 pl de tampón para FACS y se analizaron en un dispositivo de FACS Canto II (Beckton Dickinson) o en una matriz de FACS (Beckton Dickinson).

^{Para analizar la CE}50^{, los anticuerpos primarios se usaron a concentraciones crecientes en el intervalo de 0,1 nM a 100 nM. Los valores correspondientes a la mitad de la unión máxima (CE}50^{) se determinaron mediante}representación gráfica de la señal de intensidad de fluorescencia media frente a la concentración (en una escala logarítmica). El ajuste de curva de los datos se realizó usando el programa informático Graph Pad Prism.

Tabla 22. Unión específica a un panel de líneas celulares HeLa transfectadas con receptores de CEACAM

También se realizó análisis de FACS para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-CEACAM6 para unirse a diferentes líneas celulares de cáncer que expresaban de manera endógena CEACAM6. Las líneas celulares se cultivaron según los protocolos establecidos por la Colección Americana de Cultivo de Tejidos (ATCC, American Type Culture Collection). La señal que se observó para la unión fue específica, debido a que el control de isotipo no unido no produjo un cambio de la señal de fluorescencia. Los valores correspondientes a la mitad de la unión ^{máxima (CE}50^{) estaban en un intervalo nanomolar bajo (tabla 23).}

Tabla 23. Unión de anticuerpos anti-CEACAM6 a líneas celulares tumorales positivas que expresan de manera ^{endógena CEACAM6 (se proporcionan valores de CE}50⁾

En conclusión, se demostró que los anticuerpos murinos TPP-2971, TPP-3100, TPP-3186 y TPP-3187 y los anticuerpos humanos TPP-3820, TPP-3821, TPP-3310, TPP-3714 y TPP-3707, pudieron unirse de manera selectiva a la CEACAM6 humana auténtica en la superficie de las células (y no pudieron unirse a otros parálogos humanos).

La unión de estos anticuerpos con la CEACAM6 humana fue comparable a la unión que se observó entre 9A6 y la CEACAM6 humana expresada en líneas celulares. En el caso de TPP-3310, la unión fue similar a la que se había observado entre 9A6-hIgG2 y la CEACAM6 expresada de manera endógena en líneas celulares tumorales humanas.

Los anticuerpos de la divulgación también se unen a la CEACAM6 de mono cinomolgo con una avidez que es ^{comparable a la del receptor humano, que se manifestó como una CE}50 ^{para la unión cuyo valor se halló en un}intervalo subnanomolar de un solo dígito, mientras que no se detecta unión entre 9A6 y la CEACAM6 de mono cinomolgo en la superficie de las células cuando se aplicó a una concentración de hasta 100 nM. Este resultado indica que los anticuerpos de la divulgación presentan reactividad cruzada verdadera con la CEACAM6 humana y de mono cinomolgo, mientras que 9A6 presenta una preferencia clara por la CEACAM6 humana.

Ejemplo 9. Análisis de estabilidad térmica

La estabilidad térmica de las IgG se investigó usando calorimetría diferencial de barrido (DSC, del inglés Differential Scanning Calorimetry) que se puso en práctica en un sistema de DSC VP-Capillary (MicoCal, Inc.) con un volumen de células de 0,137 ml. Todas las muestras se diluyeron en DPBS con un pH de 7,4 hasta alcanzar una concentración final de 0,5 mg/ml, y como referencia se usó un tampón de control sin proteínas. Las muestras se sometieron a barrido a una temperatura de entre 20 °C y 120 °C y a una velocidad de barrido de 120 °C/hora. Los termogramas resultantes se corrigieron restando el resultado que se obtuvo con el barrido del tampón de control y una normalización en función de la concentración de proteínas, para lo cual se usó el análisis de datos Origin 7.0 (OriginLab Corp.). Las temperaturas de fusión se obtuvieron sometiendo los resultados que se obtuvieron en la DSC a un procedimiento de regresión no lineal con el programa Origin (según la función “Non-2-state: Cursor INIT”).

Tabla 24. Estabilidad térmica del dominio Fab

Todas las IgG medidas mostraron un dominio Fab con una estabilidad térmica elevada. La estabilidad térmica de TPP-3310 y de TPP-3714 fue notablemente alta y superaba de lejos la estabilidad térmica de TPP-3470 (9A6-hIgG2). Esto resultó sorprendente, dado que las estabilidades elevadas se habían asociado a anticuerpos que poseían un armazón de VH3 (Honegger y col., 2009, Protein Eng. Des. Sel., 22 (3): 121-134).

La estabilidad térmica elevada de TPP-3310 y de TPP-3174 podría interpretarse como una indicación de una idoneidad farmacéutica superior, en comparación con TPP-3470 (9A6-hIgG2) (lo cual podría manifestarse como una estabilidad más elevada, una propensión menor a la agregación y un riesgo más bajo de inmunogenicidad).

Ejemplo 10. Interferencia con la interacción entre CEACAM6 y CEACAM1

Se ha planteado la hipótesis de que la CEACAM1 podría ser la compañera de unión de la CEACAM6 en trans en linfocitos T activados (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de mayo de 2013, 121 (22): 4493-503); se han descrito interacciones trans o cis tanto homófilas como heterófilas entre diversas CEACAM, por ejemplo, entre CEACAM1 y CEACAM5 o entre CEACAM6 y CEACAM8. La CEACAM1 se presenta en linfocitos T activados, donde la unión de CEACAM1 y la fosforilación acumula proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) que contiene el dominio SH2. La SHP1 provoca la desfosforilación de ZAP70, lo que da como resultado la inhibición de la señalización mediada de TCR. De este modo, la unión de CEACAM1 conduce a una inhibición temprana de la activación de linfocitos T después de 10 minutos de activación.

Por otra parte, se ha indicado que la CEACAM5 podría tener un papel en la inhibición de respuestas de linfocitos citolíticos naturales (NK, natural killer) contra células de cáncer colorrectal (Zheng y col., PLoS One, 2011; 6 (6): E21146), que podría basarse en su unión heterófila a la CEACAM1 inhibidora expresada en linfocitos citolíticos naturales.

Por lo tanto, se analizó si podía haber una interacción directa entre la CEACAM6 y la CEACAM1 usando proteínas recombinantes en un ELISA de unión. Después de establecer experimentos preliminares con los cuales fue posible detectar que había una interacción moderada pero específica entre la CEACAM1 y la CEACAM6, se recurrió al siguiente protocolo. Placas negras Maxisorb de 384 pocillos (Nunc) se revistieron con 1 pg/ml de CEACAM1 (R&D Systems, TPP-1437) en tampón de recubrimiento (Candor) a 37 °C durante 1 hora o como control se usaron pocillos en los que no se aplicó recubrimiento alguno. Después de un lavado con PBS/Tween-20 al 0,05%, los pocilios se bloquearon con Smart Block al 100 % (Candor) a 37 °C durante 1 hora. En placas distintas, se incubaron series de diluciones de los anticuerpos de interés en PBS/Tween-20 al 0,05% y SmartBlock al 100% con 2 pg/ml de CEACAM6-Fc (TPP-1790) a TA durante 1 hora. Las placas bloqueadas se lavaron tres veces y se añadieron los complejos de anticuerpo-CEACAM6 que se habían preparado con antelación. Las placas se incubaron a TA durante 1 hora. Después de tres lavados, se añadió una IgG anti-humana conjugada con HRP (Sigma, A1070) a una dilución de 1:10000 y las placas se incubaron a TA durante 1 hora. Después de tres lavados, las placas se revelaron con Amplex Red (de Life Technologies) y se leyó la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 590 nm.

Tabla 25. Ensayo ELISA de competición de anticuerpos que compiten con la unión de la CEACAM6-Fc (TPP-1790) que se aplica como un recubrimiento pasivo a la CEACAM1 humana (TPP-1437).

Como se muestra en la tabla 25, fue posible competir con la interacción entre la CEACAM6 y la CEACAM1 con todos los anticuerpos que se analizaron, con la excepción de TPP-3688 (Neo201-hIgG2).

En conclusión, esta observación concuerda con la hipótesis de que (a) la CEACAM1 que se expresa en linfocitos T activados es una posible compañera de interacción con la CEACAM6, lo que conduce a la inhibición de linfocitos T, (b) el dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 participa en la interacción entre la CEACAM1 y la CEACAM6 y (c) los anticuerpos de la divulgación pueden interferir con la interacción entre la CEACAM6 y la CEACAM1.

Ejemplo 11. Inhibición de la actividad inmunosupresora de CEACAM6 in vitro

La función inmunosupresora que presenta la CEACAM6 en las células tumorales se ha estudiado recientemente tanto in vitro (Witzens-Harig y col., Blood, 30 de Mayo de 2013, 121 (22): 4493-503) como in vivo (Khandelwal y col., Poster Abstract 61, Resumen de la Reunión del 22° Simposio Internacional Anual sobre la Inmunoterapia contra el Cáncer, 6-8 de octubre de 2014, Nueva York, EEUU). En este contexto, se ha comprobado que el anticuerpo 9A6, que se encuentra disponible en el ámbito comercial (en Genovac/Aldevron), puede inhibir la actividad inmunosupresora de la CEACAM6, con lo cual puede potenciarse la secreción de las citocinas por parte de los linfocitos T in vitro y puede obtenerse una mayor eficacia antitumoral in vivo.

Para estudiar el efecto de los anticuerpos de la divulgación sobre la actividad inmunosupresora de la CEACAM6, se realizaron experimentos que estuvieron basados en el cultivo simultáneo de una línea celular de tumor modelo con un clon de linfocitos T específico con especificidad por un antígeno tumoral modelo: los linfocitos T que presentaban especificidad por el antígeno tumoral se generaron según el procedimiento descrito por Brackertz y col. (Brackertz y col., Blood Cancer J. Marzo de 2011, 1(3): e11). En resumen, linfocitos T CD8+ con especificidad por survivina se aislaron de células mononucleares periféricas mediante clasificación celular activada con magnetismo específica de CD8. Los linfocitos T HLA-A2'CD8+ que se aislaron se estimularon de manera repetitiva con células dendríticas HLA-A2+alogénicas que se habían cargado con 10 pg de un péptido útil como epítopo que presentaba restricciones ^{con relación al HLA, la survivinag}5-104 ^{(ELTLGEFLKL). Después de aplicar estimulación, los linfocitos T en}proliferación se tiñeron con multímeros de HLA-A2+/survivinag5-104 (para ello, se empleó el péptido A*02:01 391 LMLGEFLKL, que comprendió los aminoácidos 96-104 de la survivina marcada con APC, Prolmmune Limited, n° F391-4A-E), se puso en práctica el procedimiento de FACS y se realizó una clonación basada en una dilución limitante en placas de 96 pocillos.

La expansión de los linfocitos T clonadas se realizó cultivando 2 x 105 linfocitos T clonados junto con células alimentadoras compuestas por 5 x 107 CMSP irradiadas (30 Gy) y 1 x 107 LCL (estas líneas de linfocitos B linfoblastoides se generaron como resultado de una transducción mediada por el EBV (virus de Epstein-Barr) de linfocitos B de sangre periférica de donantes sanos con una línea celular de mono infectada con dicho virus (B95/8, ATTC), según la descripción de Brackertz y col., Blood Cancer J. Marzo de 2011, 1(3): e11, y según la Disertación de Andreas Moosmann y Ludwig-Maximilians en la Universidad de Munich, Alemania, en 2002) irradiadas (con 100150 Gy) provenientes de diversos donantes en 40 ml de un medio RPMI-1640 con la adición de glutamina (Sigma-Aldrich), suero humano al 10% (que fue un suero humano AB, Valley Biomedical, Inc., n.°HP1022), ^{penicilina/estreptomicina al 1 % (Life Technologies), a 37 °C y con CO}2 ^{al 5%. La expansión se produjo en}presencia de 50 U/ml de IL-2 (Proleukin, Novartis, n° 1003780), IL-15 2,5 ng/ml (rhIL-15-CF, R&D, n.° 247_IL-025/CF) y anticuerpo anti-CD3 humana 30 ng/ml (OKT3, eBiosciences, 16-0037-85), durante un período de 14 días. Por otro lado, la línea celular de mama humano KS (proporcionada por la doctora Brigitte Guckel (de la Universidad de Tübingen, Alemania)) se cultivó en medio DMEM (Sigma-Aldrich) con la adición de FCS al 10 % (FBS Superior, ^{de Biochrom) y penicilina/estreptomicina al 1 % a 37 °C y con CO}2 ^{al 5 %.}

Para analizar la actividad moduladora de los anticuerpos anti-CEACAM6 sobre la función inmunosupresora de la CEACAM6 in vitro, se sometieron los linfocitos T clonados con especificidad por CD8+ a un cultivo simultáneo con la línea celular de cáncer de mama humano KS en las que se expresaba la CEACAM6, la HLA-A2 y la survivina y se midió la secreción del IFN-gamma, que se usó como parámetro para determinar la actividad de los linfocitos T, por medio de un procedimiento ELISpot o un ELISA.

Para el cultivo simultáneo, las células tumorales de la línea KS se separaron por medios no enzimáticos usando PBS-EDTA, durante un período de 5 minutos, y posteriormente se centrifugaron, se lavaron y se contaron. Se ajustó la concentración de las células en 1 x 105 por ml en medio X-Vivo-20 (de Lonza) y se sometieron las células a un tratamiento preliminar con los anticuerpos anti-CEACAM6 o con anticuerpos de control del mismo isotipo, en hielo durante un período de 10 minutos. Después de una etapa de incubación, para medir la secreción del IFN-gamma se sembraron 10000 células diana KS directamente y por triplicado en placas para el procedimiento ELISpot o en las placas en U con 96 pocillos en las que se se realizaría el ELISA. De manera simultánea, se recogieron linfocitos T que presentaban especificidad por el péptido de survivina, se lavaron con medio X-Vivo-20 y se sembraron en una cantidad apropiada para que tuviera lugar la interacción con las células KS que se usarían como diana. En concreto, para llevar a cabo el cultivo simultáneo, las células tumorales, los anticuerpos anti-CEACAM6 y los linfocitos T se incubaron a 37 °C durante un período de 20-40 horas. En el contexto de la medición de la secreción del IFN-gamma, las placas en las que se llevó a cabo el procedimiento ELISpot (que fueron placas Mabtech n.° 3420-3PT, que eran apropiadas para poner en práctica un procedimiento ELISpot con el fin de determinar la concentración del interferón gamma humano y que se habían tratado con anticuerpos monoclonales 1-D1K, dirigidos contra el IFN-gamma, biotina 7-B6-1, estreptavidina ALP, BCIP/NBT y el sustrato para el procedimiento ELISpot N° 3650-10) y las placas en las que se llevó a cabo el ELISA (que fueron placas ^bD N° 555142 en las que se puso en práctica un ELISA apropiado para determinar la concentración del IFN-gamma humano) se revelaron según las instrucciones del fabricante. Para efectuar el recuento en las placas en las que se realizó el procedimiento ELISpot, se usó un lector para placas C.T.L. y para determinar la densidad óptica en las placas en las que se efectuó el ELISA, se usó un lector para placas Tecan Infinite M200. Se consideró que los experimentos fueron válidos cuando fue posible observar una diferencia de significación estadística entre el control positivo TPP-3470 (9A6-hIgG2) y el control que fue tratado con un anticuerpo de un isotipo idéntico al de los anticuerpos anti-CAECAM6.

Como resultado del cultivo simultáneo de las células tumorales KS con los linfocitos T CD8+ que presentaban especificidad por el péptido de survivina en presencia de anticuerpos anti-CEACAM6, se produjo un incremento estadísticamente significativo en la producción de IFN-gamma por parte de los linfocitos T (figura 5), en comparación con lo que se había observado en las muestras que no se habían tratado con los anticuerpos anti-CEACAM6 o que se habían tratado con un anticuerpo de control del mismo isotipo.

En conclusión, los anticuerpos TPP-3310, TPP-3707 y TPP-3323 que podían reaccionar de manera cruzada con la CEACAM6 de mono cinomolgo fueron útiles para paliar la inmunosupresión de los linfocitos T, con especificidad por el antígeno tumoral, mediada por la CEACAM6 en una medida similar a la que se obtuvo con ^tPP-3470 (9A6-hIgG2).

Ejemplo 12: Análisis del perfil de citocinas/quimiocinas secretadas por linfocitos T tratados con anticuerpos anti-CEACAM6

Para estudiar los efectos de los anticuerpos anti-CEACAM6 sobre el perfil de citocinas/quimiocinas de linfocitos T humanos hacia una citotoxicidad mejorada y una respuesta inmunológica antitumoral eficaz, se llevó a cabo un análisis de citocinas por multiplex basado en Luminex de experimentos de cocultivo de una línea celular tumoral modelo y un clon de linfocitos T específicos de antígeno tumoral modelo.

Se generó un clon de linfocitos T CD8+ específico de péptido survivina y se expandió in vitro como se describe en el Ejemplo 11. El cultivo de células tumorales y el cocultivo para ELISA se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 11.

Después de 20 h de cocultivo, las placas se centrifugaron durante 10 min a 1400 rpm y se recogió el sobrenadante. El análisis de multiplex se llevó a cabo usando los analitos de MILLIPLEX Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 38 Plex (Merck Millipore n.° HCYTMAG-60K-PX38) en un sistema BioPlex100 (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante. Se calcularon las curvas estándares y las concentraciones con el Bio-Plex Manager 6.0. Un experimento se consideró como válido si el control positivo TPP-3470 (9A6-hIgG2) era >1,5x superior en comparación con el control de anticuerpo del mismo isotipo.

El bloqueo de CEACAM6 mediante los anticuerpos de la divulgación en el cocultivo de linfocitos T específicos para el péptido survivina con células tumorales KS, produce un incremento de >1,5 veces de secreción de IFN-gamma, IL-2 y TNF-alfa en comparación con las muestras control que se trataron con el control del mismo isotipo (Figura 6). En conclusión, los anticuerpos de reacción cruzada con mono cinomolgo TPP-3310 y TPP-3707 son capaces de cambiar el perfil de citocinas de los linfocitos T CD8+ específicos para péptido survivina hacia un fenotipo más citotóxico y activado caracterizado por un aumento de secreción de IFN-gamma, IL-2 y TNF-alfa según la medición mediante el análisis de multiplex basado en Luminex en la misma extensión que TPP-3470 (9A6-hIgG2).

Ejemplo 13: Eficacia antitumoral en un modelo KS de transferencia adoptiva de linfocitos T

La eficacia antitumoral de un anticuerpo anti-CEACAM6 (9A6; Genovac/Aldevron) se ha estudiado in vivo en sistemas de transferencia adoptiva de linfocitos T humanos en los que se expanden linfocitos T humanos específicos de antígeno tumoral in vitro y se inyectan simultáneamente con un anticuerpo anti-CEACAM6 en ratones inmunosuprimidos que portan tumores de xenoinjerto humano (Khandelwal y col., Resumen de Póster 61, Resumen de Congreso del 22° Annual Internacional Cancer Immunotherapy Symposium, 6-8 de octubre, 2014, Nueva York, EE.UU.).

Para estudiar el efecto de los anticuerpos de la divulgación sobre la eficacia antitumoral, se llevó a cabo el siguiente experimento de transferencia adoptiva de linfocitos T: Se generó un clon de linfocitos T CD8+ específicos para péptido survivina y se expandió in vitro como se describe en el Ejemplo 11.

Ratones NOD-Scid hembra de entre seis y ocho semanas de vida (NOD.CB17-Prkdcscid/J; Charles River, Francia) recibieron, por vía subcutánea, una inyección de 2 x 106 de células tumorales KS (véase el Ejemplo 11). La aleatorización de los ratones se realizó el día 16 y se excluyó a los ratones que tenían una superficie tumoral menor a 40 mm2 (= no llevan tumor). Los ratones (n = 8-10 ratones por grupo) se trataron los días 23 y 27 con transferencia adoptiva i.v. de 5 x 106 células de clon de linfocito T específico de péptido survivina. Se administraron 200 |jg de los anticuerpos anti-CEACAM6, TPP-3740, TPP-3707, TPP-3310 o el respectivo anticuerpo de control del mismo isotipo por vía i.p. los días 22, 24, 26 y 28. El grupo control recibió inyección de PBS en lugar de linfocitos T y anticuerpos. Con un calibre se midieron los tumores subcutáneos crecidos y después se calculó la superficie usando la fórmula “longitud x anchura”. Solo se consideraron como válidos los experimentos en los que el grupo de ratones control tratados con vehículo exhibió un incremento estacionario y significativo de superficie tumoral y volumen tumoral durante todo el estudio. El resultado del experimento podría estar influenciado por parámetros que son difíciles de controlar: no solo el crecimiento in vivo de las líneas celulares KS mostró ser variable sino también la supervivencia de los linfocitos T humanos en los ratones así como también la infiltración de linfocitos T en los tumores exhibió una variación considerable.

La transferencia adoptiva de linfocitos T específicos para el péptido survivina en combinación con los anticuerpos anti-CEACAM6 ensayados produjo una carga tumoral reducida en comparación con los linfocitos T inyectados con el control del mismo isotipo o el grupo control con PBS (Figura 7). Se observó una eficacia similar usando TPP-3740 (9A6-hIgG2).

En conclusión, los anticuerpos TPP-3310 y TPP-3707 con reactividad cruzada de mono cinomolgo, exhibieron eficacia antitumoral en la misma extensión que TPP-3470 (9A6-hIgG2) en un modelo de transferencia adoptiva de linfocitos T usando linfocitos TCD8+ específicos para péptido survivina y células tumorales KS.

Ejemplo 14: Líneas celulares tumorales y tejidos tumorales que son positivos a CEACAM6

CEACAM6 se expresa en diversos tipos de cáncer que son posibles indicaciones diana para el tratamiento con anticuerpos inmunomoduladores de CEACAM6. Por ello, se ensayaron líneas celulares de cáncer de diferente origen y que representan diferentes cánceres, para expresión de CEACAM6 por análisis por FACS. Los resultados se muestran en la Tabla 26.

Las líneas celulares de cáncer que se adquirieron de bancos de tejidos disponibles al público, tales como la Colección Americana de Cultivo de Tejidos (ATCC) etc. se cultivaron según las instrucciones del fabricante.

Las células se lavaron 3 veces con PBS sin Ca2+/Mg2+ y se separaron de la placa de cultivo de manera no enzimática con tampón de disociación EDTA (Gibco). Las células se lavaron en tampón de FACS frío (PBS sin Ca2+/Mg2+ y con fCs al 3 % termoinactivado) y se contaron usando el contador de células Countess Machine (Invitrogen). Se sembraron en placas 105 células por pocillo y se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón 9A6 (TPP-1744; 5 jg/ml) o con el anticuerpo control de isotipo IgG1 de ratón NA/LE purificado (BD Pharmingen n° 553447) durante 1 h a 4° C en un agitador de placas. Después, las células se lavaron (400 g, durante 5') con tampón de FACS 2 veces, se resuspendieron en 100 j l de anticuerpo secundario anti-ratón marcado con PE (dilución 1:150, Dianova n° 115-115-164) y se incubaron durante otra hora a 4° C en un agitador de placa. Después de 2 lavados, las células se resuspendieron en 100 j l de tampón de FACS y se analizaron en una máquina FACS Canto II (Beckton Dickinson) o en una matriz de FACS (Beckton Dickinson). La señal de unión observada fue específica ya que el control de isotipo de no unión no resultó en un desplazamiento de la señal de fluorescencia (Tabla 26).

Tabla 26: Resultado de la exploración de la línea celular de cáncer humano por FACS para determinar la unión del anticuerpo específico de CEACAM6, 9A6 mlgG1 (TPP-1744) y, por lo tanto, la expresión de CEACAM6

(continuación)

(continuación)

En conclusión, CEACAM6 se expresa en líneas celulares que representan diversos cánceres (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de mama y mieloma múltiple) que constituyen posibles indicaciones diana para el tratamiento con anticuerpos inmunomoduladores de CEACAM6 y otros modificadores de respuesta (por ejemplo péptidos, moléculas pequeñas, moléculas de unión de estructuras artificiales, etc).

Ejemplo 15: Unión al dominio 1 individual de CEACAM6 de ser humano y mono cinomolgo

Para ensayar si los anticuerpos de la divulgación se pueden unir al dominio 1 individual aislado de CEACAM6 de ser humano y mono cinomolgo, se llevaron a cabo experimentos de RPS como se indica en el Ejemplo 1.

El dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 de mono cinomolgo (TPP-2453) se produjo como se describe en el Ejemplo 1 en analogía a TPP-1794:

SEQ ID NO: 180 (TPP-2453)

MQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNTLGFNWYKGERVDAKRLIVAYVIGTQQTTPGPAHSGREMIYSNASLLI

QNVTQNDTGSYTLQAIKEDLVTEEATGRFWVYPELGSGSHHHHHHHH

Las afinidades (K^d forma monovalente) de los anticuerpos de la divulgación por el dominio 1 individual recombinante de CEACAM6 de ser humano y mono cinomolgo se determinaron por RPS de manera análoga a los procedimientos experimentales que se describieron en el Ejemplo 1, y se muestran en la Tabla 27.

Tabla 27: Análisis por RPS: K^dforma monovalente (en nM)

En conclusión, los anticuerpos de la divulgación se unen al dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 tanto de ser humano como de mono cinomolgo, con afinidades comparables.

Ejemplo 16: estructura cristalina de rayos X del domino 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana en complejo con el fragmento Fab APP-1574

Se determinó la estructura cristalina del dominio 1 N-terminal individual de la CEACAM6 humana (TPP-1794; SEQ ID NO 169) unido a un fragmento Fab relacionado con TPP-3310 (denominado APP-1574).

Para facilitar la producción del fragmento Fab, TPP-3310 se produjo como variante de IgG1 humana (denominada TPP-5468, véase la Tabla 28). La escisión con papaína de ^tPP-5468 y la posterior purificación produce APP-1574. Este fragmento Fab comprende los dominios variables (VH y VL) de TPP-3310 (véase la Tabla 28).

Tabla 28: Secuencias de aminoácidos de IgG y Fab usadas para la determinación de la estructura cristalina

Como se detalla en el Ejemplo 1, el dominio 1 de CEACAM6 se ha expresado y replegado a partir de E. coli. El fragmento Fab se ha generado mediante digestión del anticuerpo con papaína, seguido de la formación de complejo. Después se empleó cristalografía de proteínas para generar resolución atómica para el dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana unido al Fab APP-1574 para definir el epítopo.

Producción de Proteína

El dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana (TPP-1794; SEQ ID 169) se produjo como construcción de proteína fusionada con 6x His como se describe en el Ejemplo 1. La proteína se concentró a 6,7 mg/ml antes de la formación del complejo.

El correspondiente fragmento Fab de TPP-5468 (IgG1 humana) se obtuvo por escisión con la proteasa papaína. Se mezcló 1 mg del anticuerpo con 50 |jl de papaína inmovilizada (ThermoFisher n.° 20341) en tampón de digestión (Na-fosfato 20 mM pH 7,0, EDTA 10 mM, Cisteína-HCl 20 mM) y se incubó durante 4 h a 37 °C con agitación continua. La papaína inmovilizada se retiró por centrifugación y los fragmentos Fc resultantes y la IgG no escindida se retiraron mediante pases sobre MabSelectSURE (GE Healthcare, n.° 11-0034-89 AC). El fragmento Fab en el flujo de paso se purificó adicionalmente a través de cromatografía por exclusión de tamaño en tampón Tris 30 mM pH 8,5, NaCl 150 mM en Superdex 75 y se concentró a 7,2 mg/ml.

Para la formación del complejo, el fragmento Fab purificado y el dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana se mezclaron en una proporción de 1 de Fab a 1,4 de dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana, durante 1 h a 4 °C. El complejo proteico resultante se aisló mediante cromatografía de exclusión por tamaño en tampón Tris 30 mM, pH 8,5, NaCl 150 mM en Superdex 75 y se concentró además a 21,2 mg/ml antes de la cristalización.

Cristalización y determinación de la estructura

El complejo de dominio 1 N-terminal individual de la CEACAM6 humana y el fragmento Fab APP-1574 se concentró a 21,2 mg/ml, se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos y se exploró su cristalización. Para la recogida de datos, los cristales crecieron por difusión de vapor por gota colgante a 20 °C. En detalle, se mezclaron 0,2 j l del complejo con 0,2 j l de solución de reserva que contenía citrato trisódico 100 mM a pH de 4,9, PEG 4000 al 19% (p/v) e isopropanol al 10 % (v/v). Después, la gota se equilibró frente a 80 j l de la misma solución de reserva. Antes de la recogida de los datos, los cristales se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Los datos de difracción se recogieron en la línea de luz 14-1 en la fuente BESSY II Synchrotron (Helmholtz Zentrum Berlín) y se procesaron usando XDS (Kabsch, W. XDS. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010). Los datos del complejo de dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana- fragmento Fab APP-1574 se procesaron a 2,7 A en el grupo espacio P1 con dimensiones de celda de a=64,7 A, b=65,2 A, c=78,6 A, alfa=66,1°, beta=87,2° y gamma= 88,5°. La estructura del complejo se resolvió por reemplazo molecular usando PHASER (McCoy AJ et al, J Appl Cryst (2007).

40, 658-674) con estructuras internas del dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana y un Fab como modelos de búsqueda. El modelo final se construyó en COOT (Emsley, P. y col, Acta Cryst D66, 486-501 (2010)) y se refinó usando CCP4 (Winn, M. D. y col., Acta. Cryst. D67, 235-242 (2011)).

El epítopo se definió como restos de dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana que contienen átomos en los 5 A de distancia con cualquier átomo del fragmento Fab APP-1574, identificados por NCONT en el grupo de programas CCP4 (Winn, M. D. y col., Acta. Cryst. D67, 235-242 (2011)) y listados en la Tabla 29). Hay dos copias de complejo de dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana-fragmento Fab APP-1574 en la unidad asimétrica (la unidad única más pequeña en el cristal). Solo aquellos restos de contacto con el anticuerpo que son comunes en ambas copias, se enumeran como restos de epítopo.

Epítopo

La estructura cristalina del complejo de dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana-fragmento Fab APP-1574, se usó para identificar el epítopo del fragmento Fab APP-1574 sobre CEACAM6. La superficie de interacción en el dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana por el fragmento Fab APP-1574 está formada por diversas secuencias continuas y discontinuas (es decir no contiguas); en concreto los restos Pro59, Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Gly64, Val83, Ile84, Gly85, Thr86, Gln88, Thr90, Pro91, Ile125, Ser127, Asp128 y Leu129 (numeración según la SEQ iD: 179; TPP-4639) como se detalla en la Tabla 29.

En un contacto directo muy cercano están los restos que tienen al menos un átomo que está a una distancia de 3,6 A o menor desde el anticuerpo. Estos restos son: Gln60, Asn61, Arg62, Ile63, Val83, Ile84, Gly85, Thr90, Ser127, Asp128 y Leu129 (numeración según la SEQ ID: 179; TPP-4639).

Estos restos forman el epítopo conformacional tridimensional ejemplar que es reconocido por el fragmento Fab APP-1574 (Figuras 9 y 10).

Tabla 29: Interacciones entre dominio 1 N-terminal individual de la CEACAM6 humana y el Fab de APP-1574

(continuación)

(continuación)

Los restos del dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 se numeran como en la SEQ ID NO 169. Los restos de anticuerpo se numeran en función de su secuencia lineal de aminoácidos (SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 184) y las correspondientes cadenas están marcadas (“H” para cadena pesada, “L” para cadena ligera). Los restos del dominio 1 N-terminal individual de CEACAM6 humana mostrados en este caso tienen al menos un átomo con 5 A desde cualquier átomo en el fragmento Fab APP-1574, para representar posibles interacciones mediadas por agua.

Cuando se analiza cuidadosamente el epítopo, es evidente que la Isoleucina-63 (según la SEQ ID NO: 179) de la CEACAM6 humana, es una parte central del epítopo. La cadena lateral de la isoleucina tiene una buena complementariedad de forma con APP-1574. El modelado indica que una leucina en esta posición en la CEACAM6 de mono cinomolgo puede alojarse estéricamente y que no alterará la interacción. Esto explica una actividad de unión conservada con la CEACAM6 de mono cinomolgo y es la base de la reactividad cruzada entre el ser humano y el mono cinomolgo. Por el contrario, una fenilalanina en esta posición (como en la CEACAM1 humana, CEACAM3 humana y CEACAM5 humana) no puede alojarse estéricamente y conducirá a una pérdida en la actividad de unión. Esta es la base de la selectividad de la CEACAM6.

Por consiguiente, el reconocimiento de la Isoleucina-63 (según la SEQ ID NO: 179) representa el “selector de selectividad” más significativo entre las CEACAM diana. El modo de reconocimiento de APP-1574 de la CEACAM6 humana aprovecha en forma óptima la diferencia de restos clave entre las moléculas diana las que son inespecíficas. Un análisis previo de una estructura del fragmento Fab de TPP-1679 (cuyo perfil de selectividad es insuficiente, véase el Ejemplo 4) en complejo con el dominio 1 N-terminal también identificó a la Isoleucina-63 (según la SEQ ID NO: 179) como un posible cambio de selectividad (datos no mostrados). Sin embargo, dado que el mecanismo de reconocimiento molecular por parte de TPP-1679 es diferente, en el que la Isoleucina-63 (según la SEQ IDNO: 179) se localiza en la periferia del sitio de unión, fue difícil aprovechar esto.

En resumen, las moléculas de unión que además de otros restos que forman el epítopo (Tabla 29) también aprovechan óptimamente la unión al resto determinante de selectividad y reactividad cruzada Isoleucina-63 (según la SEQ ID NO: 179) de CEACAM6 e incluso permiten alojar una Leucina en esa posición, pero no una Fenilalanina, serán selectivas para la CEACAM6, aunque al mismo tiempo reaccionarán en cruzado con la CEACAM6 de ser humano y de mono cinomolgo.

Mutagénesis

Para corroborar los hallazgos y las predicciones del análisis estructural en los estudios de unión, se generaron los siguientes mutantes de dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana:

Tabla 30: Secuencias de aminoácidos de las proteínas que se usan en los estudios de unión de mutaciones

continuación

Las proteínas se expresaron en E. coli, se replegaron y se purificaron como se describe en el Ejemplo 1. La actividad de unión comparativa con la proteína de dominio 1 de tipo silvestre y las dos mutaciones individuales se determinó mediante el procedimiento de ELISA. Durante una noche, placas 384 Nunc MaxiSorp (Sigma, P6491) se revistieron con 1,5 pg/ml de soluciones de proteína en PBS. Las placas se lavaron con PBS/T y se bloquearon con Smart Block (CANDOR Bioscience GmbH, 113125). Posteriormente, a los pocillos se aplicaron series de dilución de TPP-3310, TPP-1679 y un anticuerpo control de isotipo. Después de lavar con PBS/T, los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti IgG humana conjugado con Fc y POD (Sigma, A0170) y 10 pM de solución Amplex Red (Thermo, A12222). Las señales de unión positiva se detectaron a través de Fluorescencia (Ex. 535 nm/Em.

590 nm). En la Tabla 32 se muestra la actividad de unión de TPP-3310 con la proteína de dominio 1 de tipo silvestre y la mutación de Isoleucina 63 (como en la SEQ IDNO: 179) a Leucina (como en mono cinomolgo). La mutación de la posición de aminoácido 63 (como en la SEQ IDNO: 179) a fenilalanina (como en la CEACAM1 humana, CEACAM3 humana y CEACAM5 humana) produce la pérdida completa de capacidad de unión. Como control para la demonstración de un replegado eficaz de las proteínas de dominio 1 N-terminal de CEACAM6, se empleó TPP-1679 (véase el Ejemplo 4), para el que se observó una unión a un grado similar al de todos los antígenos que se ensayaron mostrados en la Tabla 31.

Tabla 31: actividad de unión en mutantes de dominio 1 N-terminal de la CEACAM6.

En conclusión, el anticuerpo TPP-3310 con reactividad cruzada verdadera con la CEACAM6 humana y de mono cinomolgo, que al mismo tiempo es selectivo con respecto a otros parálogos humanos, pudo tolerar una substitución I63L (según la SEQ IDNO: 179) (correspondiente al resto de CEACAM6 de mono cinomolgo) pero no una sustitución I63F (según la SEQ ID NO: 179) (correspondiente al resto en los parálogos humanos CEACAM1, CEACAM3 y CEACAM5) en el contexto del dominio 1 N-terminal de la CEACAM6 humana en consonancia con los resultados obtenidos de la cristalografía de rayos X y corroborando la predicción de los inventores.

Ejemplo 17: Análisis de citotoxicidad mediada por linfocitos T en presencia de anticuerpos contra CEACAM6 El efecto de los anticuerpos anti-CEACAM6 sobre la citotoxicidad mediada por linfocitos T, se estudió en experimentos de citotoxicidad con cocultivos de células tumorales positivas a CEACAM6 y linfocitos T procedentes de diferentes fuentes. Estos linfocitos T eran linfocitos TCD8+ específicos de survivina o linfocitos T de pacientes con cáncer de páncreas. Para estos experimentos de destrucción de células tumorales, se usó un sistema de ensayo de citotoxicidad basado en impedancia (xCELLigence).

Se generó el clon de linfocitos TCD8+ específicos del péptido survivina y se expandió in vitro como se describe en el Ejemplo 11. Se aislaron líneas celulares de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL, siglas del inglés tumor infiltrating lymphocyte) de cáncer de páncreas de un cultivo primario reciente de tejido tumoral extirpado con cirugía. Resumiendo, se cortó material tisular primario reciente en trozos pequeños y se cultivó durante 10-18 días en discos pequeños en medio X-Vivo-15 (Lonza) que contenía seroalbúmina bovina al 2 %, Fungizona 2,5 |jg/ml, Gentamicina 20 jg/ml, Penicilina/Estreptomicina al 1 % con 6000 UI/IL-2. Después de esto, se recogieron las células del sobrenadante y se congelaron o bien se usaron directamente para un “protocolo de expansión rápida” (PER). Para la ^{expansión rápida de los TIL, estos se descongelaron cuidadosamente y se cultivaron durante 1 día con 0,6*10}6 células/ml en Medio Completo para Linfocitos MCL, RPMI-1640 (Life Tehnologías n° 21875034), suero AB humano al 10 % (MILAN Analytica n.° 000083), Penicilina/Estreptomicina al 1 % (Life Technologies n ° 15140122), HEPES al 1 % (Life Technologies n° 15630056), p-mercaptoetanol al 0,01 % [solución madre 50 mM] (Life Technologies n.° 31350010)) con 6000 Ul/ml de IL-2. Los TIL se recogieron y se expandieron a una proporción de 1:100 con CMSP alimentadoras irradiadas con 60 Gy procedentes de 3 donantes diferentes en 400 ml de medio PER (protocolo de expansión rápida) (MCL al 50 % mezclado con medio asérico AIM-V al 50 % (Gibco n.° 12055091) que contenía 3000 UI/ml de IL-2 y anticuerpo OKT-3 30 ng/ml (eBioscience n.° 16-0037-85)) en matraces G-REX-100 (Wilson Wolf n° 80500S). Las células se cultivaron y dividieron como se describe en Jin y col., J Immunother. Abril de 2012; 5(3):283-92. Después de 14 días, las células se recogieron y se congelaron en alícuotas. Antes de realizar los ensayos de citotoxicidad en cocultivo, las alícuotas individuales de los TIL se descongelaron cuidadosamente y ^{se cultivaron con 0,6*10}6 ^{células/ml durante 2 días en MCL que contenía 6000 UI/ml de IL-2 y durante 1 día en MCL}sin IL-2.

Las células tumorales se cultivaron según protocolos convencionales y siguiendo las instrucciones del fabricante.

La citotoxicidad mediada por linfocitos T se analizó en un sistema de ensayo de citotoxicidad basado en impedancia (xCELLigence). En este sistema de ensayo sin marcador, la citotoxicidad se mide de manera directa y continua durante un periodo de tiempo prolongado de aproximadamente 100-150 horas (en tiempo real). Las células tumorales adherentes se unieron a microelectrodos situados en el fondo de una placa en E de 96 pocillos (placa en E de VIEW 96 PET; ACEA Biosciences ID n.° H000568) que cambia la impedancia eléctrica de estos electrodos. Esto se controla como un incremento del “índice celular” sin dimensiones. Después de la adherencia de las células tumorales (-24 h) se añadieron los anticuerpos y los linfocitos T a los pocillos de manera que, si los linfocitos T ejercen una actividad citotóxica, se produce la lisis de las células tumorales y su separación de los electrodos. Esta separación cambia la impedancia de los pocillos y se mide como una disminución del “índice celular” o “índice celular normalizado” que es el “índice celular” normalizado en el momento en el que se añaden los linfocitos T. Los linfocitos T solos no afectan a la impedancia eléctrica de los electrodos y por tanto solo se mide la citólisis de las células tumorales. (Peper y col., J Immunol Methods. Marzo de 2014;405:192-8).

En los primeros experimentos los inventores establecieron que la destrucción de las células tumorales observada en este sistema de ensayo era dependiente de la dosis de linfocitos T y funcionaba para diferentes proporciones de ^{células tumorales: linfocitos T y para diferentes fuentes de linfocitos T (linfocitos TCD}8^{+ específicos del péptido}survivina, TIL de pacientes con cáncer de páncreas).

^{Los inventores estudiaron después el efecto de los anticuerpos anti-CEACAM}6 ^{sobre la eficacia citolítica de los linfocitos T específicos de survivina. Por lo tanto, se añadieron células KS de cáncer de mama positivas a CEACAM}6 ^{o células de cáncer de colon HCT-116 transfectadas con CEACAM}6 ^{(HCT116-hC6) a placas de 96 pocillos durante}24 h antes de añadir los linfocitos T específicos del péptido survivina a diferentes proporciones de células junto con ^{los mAb anti-CEACAM}6^{. El cocultivo continuó durante un periodo de tiempo de 100 h. En estos experimentos, los}inventores observaron una mejora de la citotoxicidad dependiente de linfocitos T en presencia de los anticuerpos ^anti-CEACAM6^{, TPP-3310 y TPP-3470 a un porcentaje de 21 % para ambas líneas. En la Figuras 11 A y B se muestran los resultados como ejemplo de proporción para una célula. Cabe destacar que los linfocitos T CD}8⁺específicos del péptido survivina solos ya mostraron un alto impacto citotóxico de 45-62 %, que muy probablemente se debe a la preactivación de los linfocitos T cultivados y por tanto se considera como una citólisis de fondo. En resumen, el incremento de secreción de IFN-gamma que se observó en los ensayos de ELISA previos, se traduce en un efecto citotóxico al cabo de aproximadamente 24 h de cocultivo. Los inventores concluyen que el tratamiento ^{de células tumorales positivas para CEACAM}6 ^{con anticuerpos anti-CEACAM}6^{, conduce a una destrucción mejorada, mediada por linfocitos TCD}8^{+ específicos del péptido survivina, de ambas líneas celulares tumorales.}

^{En experimentos posteriores, los inventores analizaron el efecto de los anticuerpos CEACAM}6 ^{sobre la actividad}citolítica de linfocitos TIL procedentes de pacientes con cáncer de páncreas. Por lo tanto, la línea celular HCC2935 ^{de cáncer de pulmón positiva a CEACAM}6^{, se añadió a placas de 96 pocillos y se cultivó durante 24 h. Después, se añadieron los TIL a diferentes proporciones en presencia del anticuerpo contra CEACAM}6 ^{(30 jg/ml) y de un}anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-EPCAM IgG (0,25 ng/ml) (Marmé y col., Int J Cancer. 10 de sep de 2002;101(2):183-9; Salnikov y col., J Cell Mol Med. Sep de 2009;13(9B):4023-33) para permitir la destrucción de las ^{células tumorales mediada por linfocitos T independiente de HLA. En presencia de los anticuerpos anti-CEACAM}6^,TPP-3310 y TPP-3470, los inventores observaron una disminución completa de la impedancia que no se observó en presencia del anticuerpo de control del mismo isotipo. La disminución de la impedancia se interpreta como una destrucción citolítica completa de la línea celular diana HCC2935. En un experimento adicional, se pudo demostrar ^{que el efecto del anticuerpo TPP-3310, contra CEACAM}6^{, es dependiente de la dosis y se determinó un valor de CI}50 ^{de entre 0,62 y 0,21 jg/ml. En la figura 12 se muestra ejemplos de resultados para TIL-12.}

En resumen, estos experimentos muestran que los anticuerpos contra CEACAM6 de la invención tienen el potencial de bloquear eficazmente el receptor inmunosupresor de CEACAM6 y mejorar la eficacia citotóxica, no solo del modelo de linfocitos T, sino también de linfocitos infiltrantes de tumor procedentes de pacientes contra células tumorales positivas a CEACAM6.

Tabla de Secuencias

Tabla 32: Correlación de SEQ ID NO con ID de anticuerpo TPP y características asociadas de secuencia (cadena pesada y ligera de anticuerpo, regiones variables, regiones determinantes de complementariedad (CDR)) para proteínas (PRT) y ácidos nucleicos (ADN)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CEACAM6 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:

i. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 48, una H-CDR2 que comprende la SEQ iD NO: 49 y una H-CDR3 que comprende la SeQ ID NO: 50 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 52, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 53 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 54, o

ii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 106, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 107 y una H-CDR3 que comprende la SeQ ID NO: 108 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 110, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 111 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 112, o iii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 4, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 8, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 9 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 10, o

iv. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 34, una H-CDR2 que comprende la SEQ iD NO: 35 y una H-CDR3 que comprende la SeQ ID NO: 36 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 38, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 39 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 40, o

v. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 120, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 121, y una H-CDR3 que comprende la Se Q ID NO: 122 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 124, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 125 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 126, o vi. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 24, una H-CDR2 que comprende la SEQ ⁱD NO: 25 y una H-CDR3 que comprende la S^eQ ID NO: 26 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 28, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 29 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 30, o

vii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 76, una H-CDR2 que comprende la SEQ iD NO: 77 y una H-CDR3 que comprende la Se Q ID NO: 78 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 80, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 81 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 82, o

viii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 134, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 135 y una H-CDR3 que comprende la S^eQ ID NO: 136 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 138, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 139 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 140, o ix. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 148, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 149 y una H-CDR3 que comprende la SeQ ID NO: 150 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 152, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 153 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 154, o x. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID N°: 14, una H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 15 y una H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 16 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 18, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 19 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 20, o

xi. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 62, una H-CDR2 que comprende la SEQ ⁱD NO: 63 y una H-CDR3 que comprende la S^eQ ID NO: 64 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 66, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 67 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 68, o

xii. una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende una H-CDR1 que comprende la SEC ID NO: 92, una H-CDR2 que comprende la SEQ iD NO: 93 y una H-CDR3 que comprende la SeQ ID NO: 94 y una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende una L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 96, una L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 97 y una L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 98.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 que comprende:

i. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 47 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 51, o

ii. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 105 y una secuencia de cadena ligera variable como como la presentada por la SEQ ID NO: 109, o

111. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 7, o

iv. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 33 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 37, o

v. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 119 y una secuencia de cadena ligera variable como como la presentada por la SEQ ID NO: 123, o

vi. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 27, o

vii. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 75 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la por la SEQ ID NO: 79, o

viii. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 133 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 137, o

ix. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 147 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 151, o

x. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 17, o

xi. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 61 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 65, o

xii. una secuencia de cadena pesada variable como la presentada por la SEQ ID NO: 91 y una secuencia de cadena ligera variable como la presentada por la SEQ ID NO: 95.

3. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo de IgG.

4. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende:

i. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 57 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID No : 58, o

ii. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 115 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 116, o

iii. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 43 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 44, o

iv. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 129 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 130, o

v. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 85 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 86, o

vi. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 143 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 144, o

vii. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 157 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 158, o

viii. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 71 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID n O: 72, o

ix. una región de cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 101 y una región de cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 102.

5. El fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 o 2, que es un fragmento scFv, Fab, Fab' o un fragmento F(ab')2.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno.

7. Un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Una célula aislada que expresa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8 o un vector según la reivindicación 9.

11. Una célula aislada según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula procariota o eucariota.

12. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el cultivo de una célula según la reivindicación 11 y la purificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 7 para su uso como un medicamento.

14. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 7 para su uso como un agente de diagnóstico.

15. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 7 para su uso como un medicamento para el tratamiento un cáncer.

16. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 7.

17. Una combinación de una composición farmacéutica según la reivindicación 16 y uno o más compuestos terapéuticamente activos.