ES2579836T3 - Compuestos de monometilvalina capaces de conjugación con ligandos - Google Patents

Compuestos de monometilvalina capaces de conjugación con ligandos Download PDF

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Svetlana O. Doronina
Peter D. Senter
Brian E. Toki
Allen J. Ebens
Toni Beth Kline
Paul Polakis
Mark X. Sliwkowski
Susan D. Spencer
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Abstract

Un compuesto de conjugado de anticuerpo-farmaco que comprende un anticuerpo unido de forma covalente a uno o mas restos de farmaco, teniendo el compuesto la Formula Ic:**Fórmula** o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: Ab es un anticuerpo que se une a uno o mas antigenos asociados a tumor (1)-(8): (1) CD79b (CD79B, CD79 ß, IGb (beta asociada a inmunoglobulina), B29); (2) MUC16; (3) ETBR (receptor de endotelina de tipo B); (4) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de vehiculo soluto (fosfato sodico), transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, miembro 2); (5) IRTA2 (Translocacion asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagenesis de linfocitos B; la desregulacion de los genes por translocacion se produce en algunas neoplasias de linfocitos B); (6) PSCA hlg (genes 2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 270005OC12); (7) STEAP1 (antigeno epitelial de seis dominios transmembrana de prostata); (8) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciacion de megacariocitos, mesotelina); A es a unidad Bastidor, a es 0 o 1, cada -W- es independientemente un unidad Aminoacido, w es un numero entero que varia de 0 a 12, Y es una unidad Espaciadora, e y es 0, 1 o 2. en donde p varia de 1 a 20, y D es un resto de farmaco seleccionado entre las Formulas DE y DF:**Fórmula** en las que la linea ondulada de DE y DF indica el sitio de union covalente para A, W o Y, e independientemente en cada posicion: R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; O R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbociclico y tienen la formula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, y carbociclo C3-C8, y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C 5 3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre el grupo que consiste en arilo y heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH, o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2; m es un numero entero que varia entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparicion de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparicion de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; R18 se selecciona entre el grupo que consiste en -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8) y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un numero entero que varia de 0 a 6.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Compuestos de monometilvalina capaces de conjugación con ligandos
5 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de anticuerpo-fármaco, a composiciones que los incluyen y a métodos para uso de los mismos para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa. En el presente documento también se describen métodos para usar compuestos de conjugados de anticuerpo-fármaco para diagnóstico o tratamiento in vitro, in situ, e in vivo de células de mamífero, o afecciones patológicas asociadas.
2. Antecedentes de la invención 
La mejora de la administración de fármacos y de otros agentes a células, tejidos y tumores diana para conseguir una
15 eficacia máxima y una toxicidad mínima ha sido el foco de una investigación considerable durante muchos años. Aunque se han hecho muchos intentos para desarrollar métodos eficaces para importar moléculas biológicamente activas en células, tanto in vivo como in vitro, ninguno ha demostrado ser totalmente satisfactorio. La optimización de la asociación del fármaco con su diana intracelular, a la vez que se minimiza la redistribución intercelular del fármaco, por ejemplo, a células vecinas, a menudo es difícil o ineficaz.
La mayoría de los agentes administrados actualmente a un paciente por vía parenteral no son dirigidos, lo que da como resultado la administración sistémica del agente a células y tejidos del organismo en los que no es necesario, y a menudo indeseable. Ésto puede dar como resultado efectos secundarios adversos del fármaco, y a menudo limita la dosis que se puede administrar de un fármaco (por ejemplo, agentes quimioterapeúticos (anticáncer), 25 citotóxicos, inhibidores de enzimas y fármacos antivirales o antimicrobianos). Por comparación, aunque se considera que la administración oral de fármacos es un modo de administración conveniente y económica, ésta comparte las mismas preocupaciones de toxicidad no específica a células sin afectar una vez que el fármaco se ha absorbido en la circulación sistémica. Complicaciones adicionales implican problemas con la biodisponibilidad oral y la permanencia de fármaco en el intestino lo que conduce a una exposición adicional del intestino al fármaco y por lo tanto riesgo de toxicidades intestinales. Por consiguiente, un objetivo fundamental ha sido desarrollar métodos para dirigir específicamente agentes a células y tejidos. Los beneficios de dicho tratamiento incluyen evitar los efectos psicológicos generales de una administración inapropiada de dichos agentes a otras células y tejidos, tales como células sin infectar. La dirección intracelular se puede conseguir con métodos, compuestos y formulaciones que permitan acumulación o retención de agentes biológicamente activos, es decir metabolitos activos, dentro de células.
35 Se ha establecido terapia de anticuerpos monoclonales para el tratamiento dirigido de pacientes con trastornos como cáncer, inmunológicos y angiogénicos.
El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, por ejemplo, fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26: 151-172; Patente de Estados Unidos Nº 4975278) permite teóricamente una administración dirigida del resto de fármaco a tumores, y acumulación intracelular en el mismo, a la vez que una administración sistémica de estos agentes de fármaco sin conjugar puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad en las células tumorales que se buscan para 45 su eliminación (Baldwin et al., 1986 Lancet pp. (15 Mar., 1986): 603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications,
A. Pinchera et al. (ed.s), páginas 475-506). De este modo se busca eficacia máxima con toxicidad mínima. Se informado tanto de anticuerpos policlonales como de anticuerpos monoclonales útiles en estas estrategias (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., 1986, mencionado anteriormente). Toxinas usadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxina de plantas tales como ricino, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8 (6): 781-784; Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791),
55 maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden afectar a sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen unión a tubulinas, unión al ADN, o inhibición de la topoisomerasa (Meyer, D.L. y Senter, P.D. "Recent Advances in Conjugado de Anticuerpo Fármacos for Cancer Therapy" en Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Capítulo 23, 229-237). Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o con ligandos receptores de proteínas.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal de IgG1 kappa de murino dirigido frente al antígeno CD20 que se encuentra en la superficie 65 de linfocitos B normales y malignos y en radioisótopo 111In o 90Y unido mediante un quelante-conector de tiourea (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12): 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69). A pesar de que ZEVALIN tiene actividad frente al Linfoma no Hodgkin de linfocitos B (NHL), su administración da como resultado citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de fármaco y anticuerpo compuesto por un anticuerpo hu CD33 unido a 5 caliqueamicina, se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; Patentes de Estados Unidos Nº 4970198; Nº 5079233; Nº 5585089; Nº 5606040; Nº 5693762; Nº 5739116; Nº 5767285; Nº 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de fármaco y anticuerpo compuesto por el anticuerpo huC242 unido a través del conector disulfuro SPP al resto de fármaco maitansinoide, DM1, está avanzando en ensayos en Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), conjugado de fármaco y anticuerpo ah compuesto por el anticuerpo monoclonal de antígeno de membrana específico antipróstata (PSMA) unido al resto de fármaco maitansinoide, DM1, está en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. El mismo resto de fármaco maitansinoide, DM1, se unió a través de un conector no disulfuro, SMCC, a un anticuerpo monoclonal murino de ratón, TA.1 (Chari et al. (1992) Cancer Research 52:
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15 127-131). Se informó que este conjugado era 200 veces menos potente que el correspondiente conjugado de conector disulfuro. Se consideró que el conector SMCC en el mismo era "no escindible".
Se han aislado varios compuestos peptídicos cortos a partir del molusco marino Dolabella auricularia y se ha encontrado que tienen actividad biológica (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49: 9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron Letters 36: 5059-5062; Sone et al. (1995) Jour. Org Chem. 60: 4474). También se han preparado análogos de estos compuestos, y se encontró que algunos tienen actividad biológica (para una revisión, véase Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277). Por ejemplo, auristatina E (Patente de Estados Unidos Nº 5635483) es un análogo sintético del producto natural marino Dolastatina 10, un agente que inhibe la polimerización de la tubulina mediante unión al mismo dominio en la tubulina que el fármaco anticáncer vincristina (G. R. Pettit,
25 (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70: 1-79). Dolastatina 10, auristatina PE, y auristatina E son péptidos lineales que tienen cuatro aminoácidos, tres de los cuales son únicos esta clase de compuestos de dolastatina, y una amida C-terminal.
Los péptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos de Lewis Y en carcinomas); (ii) cAC10 que es específico de CD30 en neoplasias hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784; "Monometilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102 (4): 1458-1465; publicación de PCT WO2004/010957: Publicación de Estados Unidos Nº 2004/0018194; (iii) anticuerpos anti-CD20 tales como RITUXAN® (documento
35 WO 04/032828) para el tratamiento de cánceres que expresan CD20 y trastornos inmunes; (iv) anticuerpos anti-EphB2 2H9 y anti-IL-8 para el tratamiento de cáncer colorrectal (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64 (3): 781788); (v) anticuerpo E-selectina (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394); y (vi) otros anticuerpos anti-CD30 (documento WO 03/043583).
La auristatina E conjugada con anticuerpos monoclonales se desvela en Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de marzo de 2004.
A pesar de los datos in vitro para compuestos de la clase dolastatina y sus análogos, toxicidades generales significativas a dosis necesarias para conseguir un efecto terapéutico comprometen su eficacia en estudios clínicos.
45 Por consiguiente, existe una clara necesidad en la técnica de derivados de dolastatina/auristatina que tengan una toxicidad significativamente menor, y que sin embargo tengan eficacia terapéutica útil. Éstas y otras limitaciones y problemas del pasado se abordan con la presente invención.
La familia ErbB de tirosina quinasas son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros distintos que incluyen receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tiro2). Se ha caracterizado un panel de anticuerpos anti-ErbB2 usando la línea celular de tumor de mama humano SKBR3 (Hudziak et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9 (3): 115-1172. La inhibición máxima se obtuvo con el anticuerpo denominado 4D5 que inhibió la proliferación celular en un 56 %. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular en 55 menor grado en este ensayo. Se encontró adicionalmente que el anticuerpo 4D5 sensibilizada líneas celulares de tumores de mama que sobreexpresan ErbB2 a los efectos citotóxicos de TNF-a (Patente de Estados Unidos Nº 5677171). Los anticuerpos anti-ErbB2 analizados en Hudziak et al. se caracterizan adicionalmente en Fendly et al. (1990) Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al. (1990) In vitro 26 (3): 59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1: 72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3): 117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11
(2) 979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9: 18291838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54: 5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (20): 1466114665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5; D’souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56: 1457-1465; y Schaefer et al. (1997) Oncogene 15: 1385-1394.
65 Se han descrito otros anticuerpos anti-ErbB2 con diversas propiedades en Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al.
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Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); documento WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51: 45754580; Shawver et al. (1994) Cancer Res. 54: 1367-1373; Arteaga et al. (1994) Cancer Res. 54: 3758-3765; Harwerth
5 et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15160-15167; Patente de Estados Unidos Nº 5783186; y Klapper et al. (1997) Oncogene 14: 2099-2109.
El cribado de homología ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores ErbB; ErbB3 (Patente de Estados Unidos Nº 5.183.884; Patente de Estados Unidos Nº 5.480.968; KraU.S. et al.
10 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197) y ErbB4 (documento EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750; y Plowman et al. (1993) Nature 366: 473-475). Ambos de estos receptores presentan mayor expresión en al menos algunas líneas celulares de cáncer de mama.
HERCEPTIN® (Trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une
15 selectivamente con alta afinidad en un ensayo basado en células (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de la proteína del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, HER2 (ErbB2) (Patente de Estados Unidos Nº 5821337; Patente de Estados Unidos Nº 6054297; Patente de Estados Unidos Nº 6407213; Patente de Estados Unidos Nº 6639055; Coussens L, et al. (1985) Science 230: 1132-9; Slamon DJ, et al. (1989) Science 244: 707-12). Trastuzumab es un anticuerpo IgG1 kappa que contiene regiones marco humanas con las regiones que determinan
20 la complementariedad de un anticuerpo de murino (4D5) que se une a HER2. Trastuzumab se une al antígeno de HER2 y de este modo inhibe el crecimiento de células cancerosas. Debido a que Trastuzumab es un anticuerpo humanizado, éste minimiza cualquier respuesta de HAMA en pacientes. El anticuerpo humanizado frente a HER2 se produce mediante un cultivo de suspensión de células de mamífero (Ovario de Hámster Chino, CHO). El protooncogen de HER2 (o c-erbB2) codifica una proteína receptora transmembrana de 185 kDa, que está relacionado
25 estructuralmente con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. La sobreexpresión de la proteína HER2 se observa en un 25 %-30 % de cánceres primarios de mama y se puede determinar usando una evaluación basada en inmunohistoquímica de bloques tumorales fijados (Press MF, et al. (1993) Cancer Res 53: 4960-70. Se ha mostrado que, tanto en ensayos in vitro como en animales, inhibe la proliferación de células tumorales humanas que sobreexpresan HER2 (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9: 1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol
30 Immunother; 37: 255-63; Baselga J, et al. (1998) Cancer Res. 58: 2825-2831). Trastuzumab es un mediador de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, ADCC (Hotaling TE, et al. (1996) [resumen]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [resumen]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602). In vitro, se ha mostrado que ADCC mediado por Trastuzumab se ejerce preferentemente sobre células cancerosas que sobreexpresan HER2 en comparación con células cancerosas que no sobreexpresan HER2. HERCEPTIN® como
35 un agente individual está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer metastásico de mama cuyos tumores sobreexpresa la proteína HER2 y que han recibido uno o más regímenes de quimioterapia para su enfermedad metastásica. HERCEPTIN® en combinación con paclitaxel está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer metastásico de mama cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2 y que no han recibido quimioterapia para su enfermedad metastásica. HERCEPTIN® es clínicamente activo en pacientes con cánceres metastásicos de mama
40 que sobreexpresan ErbB2 que han recibido anteriormente una terapia anticáncer extensa (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14: 737-744).
El anticuerpo anti-HER2 monoclonal de murino inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama que sobreexpresan HER2 en el nivel 2+ y 3+ (1-2 x 106 receptores de HER2 por célula), pero no tiene actividad sobre
45 células que expresan niveles más bajos de HER2 (Lewis et al., (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263). Basándose en esta observación, se humanizó anticuerpo 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente de Estados Unidos Nº 5821337; Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289) y se sometió a ensayo en pacientes con cáncer de mama cuyos tumores sobreexpresaban HER2 pero que habían progresado después de quimioterapia convencional (Cobleigh et al., (1999) J. Clin. Oncol. 17: 2639-2648).
50 A pesar de que HERCEPTIN es un gran avance en el tratamiento de pacientes con cánceres de mama que sobreexpresan ErbB2 que han recibido anteriormente terapia anticáncer extensa, algunos pacientes de esta población no responden a o solamente responden muy poco al tratamiento con HERCEPTIN.
55 Por lo tanto, existe una necesidad clínica significativa para desarrollar terapias adicionales frente al cáncer dirigidas por HER2 para los pacientes con tumores que sobreexpresan HER2 u otras enfermedades asociadas con la expresión de HER2 que no responden, o responden muy poco, al tratamiento con HERCEPTIN.
La relación de cualquier referencia en la presente solicitud no es una admisión de que la referencia sea técnica 60 anterior a la presente solicitud.
3. Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un 65 anticuerpo unido de forma covalente a uno o más restos de fármaco, compuesto que tiene la Fórmula Ic:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
5 Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor (1)-(8):
(1)
CD79b (CD79B, CD79 β, IGb (beta asociada a inmunoglobulina), B29);
(2)
MUC16;
(3)
ETBR (receptor de endotelina de tipo B);
10 (4) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de vehículo soluto (fosfato sódico), transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, miembro 2);
(5) IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B);
15 (6) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 270005OC12 gene);
(7)
STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata);
(8)
MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina);
20 A es a unidad Bastidor, a es 0 o 1, cada -W- es independientemente un unidad Aminoácido, w es un número entero que varía de 0 a 12, Y es una unidad Espaciadora, e
25 y es 0, 1 o 2. en la que p varía de 1 a 20, y D es un resto de fármaco seleccionado entre las Fórmulas DE y DF:
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y
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en las que la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente a A, W, o Y, e independientemente en cada posición:
35 R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil
40 C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 en conjunto forman un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
45 R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
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R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8 -(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
5 R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre el grupo que consiste en arilo y heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH, o NR12, en el que R12 es alquilo C1-C8;
R11
se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8,-(R13O)m-R14, y (R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
15 cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; R18
se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un número entero que varía entre 0 a 6.
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se proporciona un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente, para
25 uso en combinación con una cantidad eficaz de un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor, y un agente antiinfeccioso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
También se proporciona un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente para uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga, en el que dicho tratamiento comprende además opcionalmente el tratamiento con un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor, y un agente antiinfeccioso.
35 También se proporciona el uso de un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de vejiga, en el que dicho tratamiento comprende además opcionalmente el tratamiento con un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor, y un agente antiinfeccioso.
Breve descripción de las figuras
45 La Figura 1 muestra un ensayo de eficacia, de una sola dosis, in vivo de cAC10-mcMMAF en xenoinjertos subcutáneos de Karpas-299 ALCL. La Figura 2 muestra un ensayo de eficacia, de una sola dosis, in vivo de cAC10-mcMMAF en L540cy subcutáneas. Para este estudio había 4 ratones en el grupo sin tratar y 10 en cada uno de los grupos de tratamiento. Las Figuras 3a y 3b muestran la eficacia in vivo de cBR96-mcMMAF en L2987 subcutáneas. Los triángulos presentados en la Figura 3a y las flechas en la Figura 3b indican los días de terapia. Las Figuras 4a y 4b muestran la actividad in vitro de conjugados de cAC10-anticuerpo-fármaco frente a líneas celulares CD30+ .
55 Las Figuras 5a y 5b muestran la actividad in vitro de conjugados de cBR96-anticuerpo-fármaco frente a líneas celulares Ley+. Las Figuras 6a y 6b muestran la actividad in vitro de conjugados de cIF6-anticuerpo-fármaco frente a líneas celulares de carcinoma de células renales CD70+ . La Figura 7 muestra un ensayo de proliferación celular, in vitro con células SK-BR-3 tratadas con conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC): -●- Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o- Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab, y -∆-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab, medido en Unidades de Fluorescencia Relativa (RLU) frente a concentración en µg/ml de ADC. H = Trastuzumab cuando H se une a través de una cisteína [cys]. La Figura 8 muestra un ensayo de proliferación celular, in vitro con células BT-474 tratadas con ADC: -●- Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -○-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab, y -∆- Trastuzumab
65 MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab. La Figura 9 muestra un ensayo de proliferación celular, in vitro con células MCF-7 tratadas con ADC: -●- Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -○-Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab, y -∆Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab. La Figura 10 muestra un ensayo de proliferación celular, in vitro con células MDA-MB-468 tratadas con ADC: -●- Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab, -○-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab, y -∆
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5 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab. La Figura 11 muestra un estudio de aclaramiento de la concentración de plasma después de la administración de H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG y H-MC-vc-PAB-MMAF a ratas Sprague-Dawley: La dosis administrada fue de 2 mg de ADC por kg de ratas. Las concentraciones de anticuerpo total y de ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab). La Figura 12 muestra un estudio de aclaramiento de la concentración de plasma después de la administración de H-MC-vc-MMAE a monos Cynomolgus a diferentes dosis: 0,5, 1,5, 2,5, y 3,0 mg/kg administradas el día 1 y el día 21. Las concentraciones de anticuerpo total y de ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab). La Figura 13 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con aloinjertos de tumor de Mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con Vehículo, Trastuzumab-MC-vc-PAB
15 MMAE (1250 µg/m2) y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 µg/m2). (H = Trastuzumab). La Figura 14 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con aloinjertos de tumor de Mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con 10 mg/kg (660 µg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE y 1250 µg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. La Figura 15 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con aloinjertos de tumor de Mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con Vehículo y 650 µg/m2 de trastuzumab-MC-MMAF. La Figura 16 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con aloinjertos de tumor de Mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con Vehículo y 350 µg/m2 de cuatro conjugados de trastuzumab-MC-MMAF cuando la relación de MMAF/trastuzumab (H) es 2, 4, 5,9 y 6.
25 La Figura 17 muestra el Cambio medio en el grupo, con barras de error, en pesos corporales de animales (rata) (Media ± DT) después de la administración de Vehículo, trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF. La Figura 18 muestra el Cambio medio en el grupo en pesos corporales de animales (rata) (Media ± DT) después de la administración de 9,94 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 24,90 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 10,69 mg/kg de H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 26,78 mg/kg de H-MC (Me)-vc-PAB-MMAF, 10,17 mg/kg de H-MC-MMAF, 25,50 mg/kg de H-MC-MMAF, y 21,85 mg/kg de H-MC-vc-PAB-MMAF. H = trastuzumab. Conector MC se une a través de una cisteína de trastuzumab para cada conjugado. La Figura 19 muestra el Cambio medio en el grupo, con barras de error, en pesos corporales de rata Sprague Dawley (Media ± DT) después de la administración de trastuzumab (H)-MC-MMAF a dosis de 2105, 3158, y 4210
35 µg/m2. El conector MC se une a través de una cisteína de trastuzumab para cada conjugado.
4. Descripción detallada de las realizaciones a modo de ejemplo 
4.1 DEFINICIONES Y ABREVIATURA 
A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos y expresiones tal como se usan en el presente documento pretenden tener los siguientes significados:
Cuando se usan nombres comerciales en el presente documento, los solicitantes pretenden incluir de forma 45 independiente la formulación del producto del nombre comercial, el fármaco genérico, y el ingrediente o ingredientes farmacéuticos del producto del nombre comercial.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmune que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico. Descrito en términos de su estructura, un anticuerpo tiene por lo general una proteína con forma de Y que consiste en cuatro cadenas de aminoácidos, dos pesadas y dos ligeras. Cada anticuerpo tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable,
55 situada en los extremos de los brazos de la Y, se une a e interactúa con el antígeno diana. Esta región variable incluye una región de determinación de la complementariedad (CDR) que reconoce y se une un sitio de unión específico en un antígeno en particular. La región constante, situada en la cola de la Y, es reconocida por e interactúa con el sistema inmune (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5ª Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un antígeno diana generalmente tiene numerosos sitios de unión, también denominados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por lo tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente.
El término "anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, también se refiere a una molécula de 65 inmunoglobulina de longitud total o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de
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longitud total, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión antígenos que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o parte de la misma, incluyendo dichas dianas pero no limitadas a, célula o células cancerosas que producen anticuerpos autoinmunes asociados con una enfermedad autoinmune. La inmunoglobulina que se desvela en el presente documento puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, 5 IgD, e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas se pueden derivar de cualquier especie. En un aspecto, sin embargo, la inmunoglobulina es de origen humano, murino, o de conejo. En otro aspecto, los anticuerpos son anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, Fv, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab’), fragmentos de F(ab’)2, fragmentos producidos con una biblioteca de expresión de Fab,
10 anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR, y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores que se unen de forma inmunoespecífica a antígenos de células cancerosas, antígenos virales o antígenos microbianos.
La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales 15 que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos frente a un solo sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a determinantes diferentes (epítopos), capa anticuerpo monoclonal se dirige frente a un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son 20 ventajosos en que se pueden sintetizar sin ser contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo tal como si se obtuviera a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, y no se debe interpretar como que se necesite la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar con el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o se pueden
25 preparar con métodos de ADN recombinante (véase, Patente de Estados Unidos Nº 4816567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas que se describen, por ejemplo, en Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628 y Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597.
En el presente documento, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los
30 que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos Nº
35 4816567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855).
Se han usado diversos métodos para producir anticuerpos monoclonales (MAb). La tecnología del hibridoma, que se refiere a una línea celular clonada que produce un solo tipo de anticuerpo, usa las células de diversas especies, incluyendo ratones (murino), hámsters, ratas, y seres humanos. Otro método para preparar los MAb usa ingeniería 40 genética que incluye técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales preparados a partir de estas técnicas incluyen, entre otros, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Un anticuerpo quimérico combina regiones de codificación del ADN a partir de más de un tipo de especie. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede proceder de la región variable de un ratón y la región constante de un ser humano. Un anticuerpo humanizado procede predominantemente de un ser humano, incluso aunque contenga porciones no humanas. Al igual que un
45 anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado puede contener una región constante totalmente humana. Pero a diferencia de un anticuerpo quimérico, la región variable puede proceder parcialmente de un ser humano. Las porciones sintéticas, no humanas de un anticuerpo humanizado a menudo provienen de las CDR en anticuerpos de murino. En cualquier caso, estas regiones son cruciales para permitir que el anticuerpo reconozca y se una a un antígeno específico.
50 Tal como se ha indicado, se pueden usar anticuerpos de murino. Aunque son útiles para diagnóstico y terapias a corto plazo, los anticuerpos de murino no se pueden administrar a personas a largo plazo sin aumentar el riesgo de una respuesta inmunogénica perjudicial. Esta respuesta, denominada Anticuerpo Anti-Ratón Humano (HAMA), se produce cuando un sistema inmune humano reconoce el anticuerpo de murino como extraño y lo ataca. Una
55 respuesta HAMA shock tóxico o incluso la muerte.
Los anticuerpos quiméricos y humanizados reducen la probabilidad de una respuesta HAMA al minimizar las porciones no humanas de anticuerpos administrados. Además, los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen el beneficio adicional de activar respuestas inmunes humanas secundarias, tales como citotoxicidad celular
60 dependiente de anticuerpos.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión al antígeno o variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos
65 multiespecíficos formados a partir de un fragmento o fragmentos de anticuerpo.
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Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos.
5 El anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectuadas" que se refieren a las actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fc (una región Fc de secuencia narrativa o región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos defunciones efectoras de anticuerpo incluyen unión a C1q; citotoxicidad y pendiente de complementos; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos intactos a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE,
15 IgG, e IgM, y varias de éstas se pueden dividir adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan α, δ, ε, γ, y µ, respectivamente. Se conocen bien estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a proteína HER2 humana que se describe, por ejemplo, en Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., (1986) Nature, 319: 230-234 (número de acceso en Genbank X03363). El término "erbB2" se refiere al gen que codifica ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185neu de rata. ErbB2 preferente es ErbB2 humano de secuencia nativa.
25 En el mercado están disponibles anticuerpos para receptores ErbB a partir de un número de fuentes, que incluyen, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.
Por "ligando ErbB" se hace referencia a un polipéptido que se une a y/o activa un receptor ErbB. El ligando ErbB puede ser un ligando ErbB humano de secuencia narrativa tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al. (1972) J. Biol. Chem., 247:7612-7621); factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-α) (Marquardt et al. (1984) Science 223: 1079-1082); anfiregulina también conocida como factor de crecimiento autocrino de schwanoma
o de queratinocitos (Shoyab et al. (1989) Science 243: 1074-1076; Kimura et al., Nature, 348: 257-260 (1990); y Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science, 259: 1604-1607 (1993); y
35 Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251: 936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem.,
270: 7495-7500 (1995); y Komurasaki et al., Oncogene, 15: 2841-2848 (1997)); una heregulina (véase a continuación); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272 (6): 3330-3335 (1997)). Ligandos ErbB que se unen a EGFR incluyen EGF, TGF-α, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Ligandos ErbB que se unen a ErbB3 incluyen heregulinas. Ligandos ErbB capaces de unirse a ErbB4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas. El ligando ErbB también puede ser un ligando ErbB sintético. El ligando sintético puede ser específico para un receptor ErbB en particular, o puede reconocer complejos de receptor ErbB en
45 particular. Un ejemplo de un ligando sintético es la biregulina quimera de heregulina/EGF sintética (véase, por ejemplo, Jones et al., (1999) FEBS Letters, 447: 227-231, que se incorpora por referencia).
"Heregulina" (HRG) se refiere a un polipéptido codificado por el producto genético de heregulina tal como se desvela en la Patente de Estados Unidos Nº 5641869 o en Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Ejemplos de heregulinas incluyen heregulina-α, heregulina-β1, heregulina-β2 y heregulina-β3 (Holmes et al., Science, 256: 12051210 (1992); y Patente de Estados Unidos Nº 5641869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)); actividad de inducción de receptores de acetilcolina (ARIA) (Falls et al. (1993) Cell 72: 801-815); factores de crecimiento glial (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer et al.,
55 Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido HRG de secuencia nativa, tal como un fragmento de dominio de tipo EGF de los mismos (por ejemplo, HRGβ1177-244).
El "hetero-oligómero de ErbB" es un oligómero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores ErbB diferentes. Un "dímero de ErbB" es un oligómero asociado de forma no covalente que comprende dos receptores ErbB diferentes. Dichos complejos se pueden formar cuando una célula que expresa dos o más receptores ErbB se expone a un ligando ErbB. Oligómeros de ErbB, tales como dímeros de ErbB, se pueden aislar por inmunoprecipitación y analizar por SDS-PAGE tal como se describe, por ejemplo, en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994). Ejemplos de dichos hetero-oligómeros de ErbB incluyen complejos EGFR65 ErbB2 (también denominado HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) y ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Además, el
ErbB hetero-oligómero puede comprender dos o más receptores ErbB2 combinados con un receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 o EGFR (ErbB1). Otras proteínas, tales como una subunidad receptora de citoquinas (por ejemplo, gp130) se pueden incluir en el hetero-oligómero.
5 Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido, por ejemplo, receptor de antígeno asociado a tumores, procedente de la naturaleza. Dichos polipéptidos de secuencia narrativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o de síntesis. Por lo tanto, un polipéptido de secuencia narrativa puede tener la secuencia de aminoácidos de polipéptido humanos de origen natural, polipéptido de murino, o polipéptido a partir de cualquier otra especie de mamífero.
La expresión "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto de un polipéptido de secuencia nativa. Habitualmente, las variantes de secuencias de aminoácidos poseerán al menos una homología de aproximadamente un 70 % con al menos un dominio de unión a receptores de un ligando nativo, o con al menos un dominio de unión ligandos de un receptor
15 nativo, tal como un antígeno asociado a tumores, y preferentemente, serán homólogos en al menos aproximadamente un 80 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % con dichos dominios de unión a receptores o a ligandos. Las variaciones secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones, y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa.
La "identidad de secuencia" se define como el porcentaje de restos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia. En la técnica se conocen bien métodos y programas de ordenador para el alineamiento. Uno de dichos programas de ordenador es "Align 2", creado por Genentech, Inc., que se
25 presentó con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.
"Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos Citolíticos Naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la celular diana. Las células primarias para mediar ADCC, linfocitos NK, expresan solamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9: 457
92. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal
35 como el que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5500362 o Nº 5821337. Células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos Citolíticos Naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el que se desvela en Clynes et al., Prco. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 652-656 (1998).
Los términos "receptor Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, que incluyen variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen
45 FcγRIIA (un "receptor de activación") y FcγRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares y difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de las mismas. El receptor de activación FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor de inhibición FcγRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase revisión M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Otros FcR, que incluyen los que se van a identificar en el futuro, están incluidos con el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternales al feto. (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
55 "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana más en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente el sistema complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) formando complejo con un antígeno semejante. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los 65 dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los
dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan regiones marco (FR). Cada uno de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprende cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina β, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en
5 lámina β. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen en conjunto en proximidad cercana mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
La expresión "región hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende generalmente restos de aminoácidos de una "región de determinación de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 15 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al. mencionado anteriormente) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chotia y Lesk (1987) J. Mol. Biol.,
196: 901-917). Los restos de la "Región Marco" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable tal como se define en el presente documento.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento de "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene
25 dos sitios de unión a antígeno y que además es capaz de reticular antígenos.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígenos y de unión a antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, estrecha. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables transmiten al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígenos, aunque a una afinidad más baja que la de todo el sitio de unión.
35 El fragmento de Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab’ de diferencia de los fragmentos de Fab mediante la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El presente documento, Fab’-SH es la denominación para Fab’ en la que el resto o restos de cisteína de los dominios constantes soportan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 se producían originalmente como pares de fragmentos de Fab’ que tienen cisternas bisagra entre ellos. Además, se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno o dos tipos
45 claramente distintos, denominados kappa (κ) y lambda (λ), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende adicionalmente un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígenos. Para una revisión de scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere un fragmento pequeño de anticuerpos con dos sitios de unión a antígenos,
55 fragmentos que comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en el documento EP 404.097; en el documento WO 93/11161; y Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una región hipervariable del 65 receptor se reemplazan con restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate lo humano que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En
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algunos casos, restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan con restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá básicamente todos de al menos uno,
5 y por lo general todos, dominios variables, en los que todos o básicamente todos los bucles hipervariables corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o básicamente todas los de las FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), por lo general la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323329; y Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596.
Anticuerpos anti-ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D55, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como se describe en la Tabla 3 de la Patente de Estados Unidos Nº 5821337 que se incorpora expresamente en el presente documento por referencia; 520C9
15 humanizado (documento WO 93/21319) y anticuerpos 2C4 humanizados tal como los que se describen a continuación en el presente documento.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros absolutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferentes, el anticuerpo estará purificado (1) hasta más de un 95 % en peso del anticuerpo tal como se determina con el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencias de aminoácidos N-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones
25 reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de intereses uno capaz de unirse a ese antígeno con una afinidad suficiente de modo que el anticuerpo es útil para dirigirse a una célula que expresa el antígeno.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es una que induce muerte celular programada tal como se determina mediante unión de anexina V, fragmentaación del ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplasmático,
35 fragmentación celular, y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). Las células una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreática o de vejiga. Diversos métodos están disponibles para evaluar los sucesos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de la fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante unión de anexina; la fragmentación del ADN se puede evaluar a través de marcado del ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación del ADN se puede evaluar mediante cualquier aumento de células hipodiploides.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento de la presente invención. Éste incluye trastornos o enfermedades, crónicos y agudos, que incluyen las afecciones patológicas que predisponen al mamífero
45 al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen tumores benignos y malignos; leucemia y neoplasias linfoides, en particular cáncer mama, ovarios, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreático, cáncer de próstata o vejiga; trastornos neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz el fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar
55 hasta cierto punto y preferentemente detener) metástasis tumorales; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en la que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o eliminación de las células cancerosas existentes, éste puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento del cáncer, la eficacia, por ejemplo, se puede medir por evaluación del tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR).
La expresión "cantidad básica" se refiere a una mayoría, es decir > 50 % de una población, de una colección o de una muestra.
La expresión "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto que resulta de un proceso metabólico o de una
65 reacción dentro de una célula en un conjugado de fármaco de anticuerpo (ADC). El proceso metabólico o la reacción de ser un proceso enzimático tal como escisión proteolítica y un conector etílico del ADC, o hidrólisis de un grupo funcional tal como una hidrazona, éster, o amida. Los metabolitos intracelulares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fármacos libres que han experimentado escisión intracelular después de entrada, difusión, absorción o transporte en una célula.
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5 Las expresiones "escindido intercelularmente" y "escisión intracelular" se refieren a un proceso metabólico o reacción dentro de la célula en un Conjugado de Fármaco-Ligando, un Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando, un conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC) o similares a través de los cuales la unión covalente, por ejemplo, el conector, entre el resto de fármaco (D) y el anticuerpo (Ab) se rompe, dando como resultado el fármaco libre disociado a partir del anticuerpo dentro de la célula. Los restos escindidos del Conjugado de Fármaco-Ligando, un Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando o ADC son por lo tanto metabolitos intracelulares.
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad cada de fármaco administrada a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medida tanto del tiempo (velocidad) como de la cantidad total (alcance) de fármaco que alcanza la circulación
15 general de una forma de fármaco administrada.
La expresión "actividad citotóxica" se refiere a un efecto de eliminación de células, citostático o antiproliferación de un compuesto de conjugado de fármaco de anticuerpo o un metabolito intracelular de un compuesto de conjugado de fármaco de anticuerpo. La actividad citotóxica se puede expresar como el valor de CI50 que es la concentración (molar o másica) por unidad de volumen a la que sobreviven la mitad de las células.
Los términos "cáncer" y " canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que por lo general se caracteriza por un crecimiento celular sin regular. Un "tumor" comprender una o mas células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o
25 neoplasias linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC"), adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello del útero, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
35 Un "cáncer que expresa ErbB" es uno que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de células del mismo, de modo que un anticuerpo anti-ErbB2 se puede unir al mismo y puede tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer.
Un cáncer "caracterizado por una activación excesiva" de un receptor ErbB2 es uno en el que la extensión de la activación del receptor ErbB2 en células cancerosas supera significativamente el nivel de activación de ese receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Dicha activación excesiva puede dar como resultado una sobreexpresión del receptor ErbB2 y/o niveles superiores a los normales de un ligando ErbB2 disponible para la activación del receptor ErbB2 en las células cancerosas. Dicha activación excesiva puede provocar y/o ser provocada por un estado maligno de una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el cáncer estará sometido a un
45 ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si se está produciendo una amplificación y/o sobreexpresión de un receptor ErbB2 lo que da como resultado dicha activación excesiva del receptor ErbB2. Como alternativa, o adicionalmente, el cáncer se puede someter a un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si se está produciendo una amplificación y/o sobreexpresión de un ligando ErbB2 en el cáncer que se atribuye a una activación excesiva del receptor. En un subconjunto de dichos cánceres, una activación excesiva del receptor puede dar como resultado una ruta de estimulación autocrina.
Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor ErbB2 es uno que tiene niveles significativamente más elevados de un receptor ErbB2 en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tejido. Dicha sobreexpresión se puede y por amplificación genética o por transcripción o traducción aumentada. La 55 sobreexpresión del receptor ErbB2 se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o de pronóstico mediante la evaluación de mayores niveles de la proteína ErbB2 presente en la superficie de una célula (por ejemplo, mediante un ensayo inmunohistoquímico; IHC). Como alternativa, o adicionalmente, se pueden medir niveles de ácidos nucleicos que codifican ErbB2 en la célula, por ejemplo, mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH; véase el documento WO 98/45479), transferencia de southern, o técnicas reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). La sobreexpresión del ligando ErbB2, se puede determinar de forma diagnóstica evaluando los niveles del ligando (o ácido nucleico que los codifica) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia de tumor o mediante diversos ensayos de diagnóstico tales como los ensayos de IHC, FISH, transferencia de southern, PCR o in vivo que se han descrito anteriormente. Además se puede estudiar la sobreexpresión del receptor ErbB2 midiendo el antígeno desprendido (por ejemplo, dominio extracelular de ErbB2) 65 en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4933294; documento WO 91/05264; Patente de Estados Unidos Nº 5401638; y Sias et al., (1990) J. Immunol. Methods, 132: 73-80). Aparte de
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los ensayos que se han mencionado anteriormente, otros diversos ensayos in vivo assays están disponibles para el experto en la materia. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del organismo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente está marcado con una marca detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a células en el paciente, por ejemplo, mediante exploración externa de radiactividad o por
5 análisis de una biopsia tomada de un paciente expuesto previamente al anticuerpo.
Los tumores que sobreexpresan HER2 se clasifican mediante puntuaciones inmunohistoquímicas que corresponden al número de copias de moléculas de HER2 expresadas por célula, y se pueden determinar de forma bioquímica: 0 = 0-10,000 copias/célula, 1+ = al menos aproximadamente 200.000 copias/célula, 2+ = al menos aproximadamente
500.000 copias/célula, 3+ = aproximadamente 1-2 x 106 copias/célula. La sobreexpresión de HER2 en el nivel 3+, que conduce a la activación independiente de ligamentos de la tirosina quinasa (Hudziak et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7159-7163), se produce en aproximadamente un 30 % de los cánceres de mama, y en estos pacientes, disminuye la supervivencia sin recaída o toda la supervivencia (Slamon et al., (1989) Science, 244: 707712; Slamon et al., (1987) Science, 235: 177-182).
15 Por el contrario, a un cáncer que "no se puede caracterizar mediante sobreexpresión del receptor ErbB2" es uno que, en un ensayo de diagnóstico, no expresa niveles más elevados que los normales de receptor ErbB2 en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido.
La expresión "agente citotóxico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o causa la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen análogos y derivados de las mismas. En un aspecto, la expresión
25 no pretende incluir isótopos radiactivos.
Un "agente quimioterapeútico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapeúticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); briostatina; callistatina; 35 CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozoticina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; bisfosfonatos, tales como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I y caliqueamicina omegaI1 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) y antraciclinas tales como annamicina, AD 32, alcarubicina, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogarilo, 45 dinemicina, que incluye dinemicina A, una esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos relacionados de antibiótico de enedina cromoproteínas, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (que incluye morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2pirrolino-doxorubicina, liposomal doxorubicina, y desoxidoxorrubicina), esorrubicin, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodotrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, y zorrubicina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, pteropterina, y trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, y floxuridina; andrógenos tales como 55 calusterona, propionato de dromoestanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, y trilostano; reforzadores de ácido fólico tales como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplásicos de antifolato tales como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inhibidores de la dihidrofolato reductasa tales como metotrexato, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos tales como UFT, S-1 y capecitabina, y inhibidores de la timidilato sintasa e inhibidores de la glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXRM , TDX); inhibidores de la dihidropirimidina deshidrogenasa tales como eniluracilo; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansine y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; 65 losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2’,2"-triclorotrietilamina; tricotecenos
(especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxano, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ sin Cremophor, formulación de nanopartículas modificadas por ingeniería con albúmina de paclitaxel
5 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos a base de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); etopósido (VP16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); alcaloides de la vinca; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; RFS 2000 inhibidor de la topoisomerasa; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los mencionados anteriormente; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.
15 Además, en esta definición se incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (que incluye tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; inhibidores de aromatasas que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, FEMARA® letrozol, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido citosina); Oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la
25 expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación celular anómala, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacunas para terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los mencionados anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "fármaco dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une a EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Ejemplos científicos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (Nº CRL HB 8506 de la ATCC), MAb 455 (Nº CRL HB8507 de la ATCC), MAb 225 (Nº CRL 8508
35 de la ATCC), MAb 528 (Nº CRL 8509 de la ATCC) (véase, Patente de Estados Unidos Nº 4943533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBITUX®) y 225 humano reconformado (H225) (véase, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (Patente de Estados Unidos Nº 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5891996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tales como ABX-EGF (véase el documento WO 98/50433, Abgenix). El anticuerpo anti-EGFR se puede conjugar con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, el documento EP 659.439A2, Merck Patent GmbH). Ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), Erlotinib HCl (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).
45 Un "inhibidor de la tirosina quinasa" es una molécula que inhibe hasta cierto punto la actividad de tirosina quinasa de una tirosina quinasa como un receptor ErbB. Ejemplos de dichos inhibidores incluyen los fármacos dirigidos a EGFR indicados en el párrafo anterior así como quinazolinas tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, y pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas, curcumina (diferuloíl metano, 4,5-bis(4fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contienen restos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antisentido (por ejemplo, las que se unen a ácidos nucleicos que codifican ErbB); quinoxalinas (Patente de Estados Unidos Nº 5.804.396); trifostinas (Patente de Estados Unidos Nº 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores de pan-ErbB tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato
55 de Imatinib (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); o tal como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: Patente de Estados Unidos Nº 5804396; documento WO 99/09016 (American Cyanamid); documento WO 98/43960 (American Cyanamid); documento WO 97/38983 (Warner Lambert); documento WO 99/06378 (Warner Lambert); documento WO 99/06396 (Warner Lambert); documento WO 96/30347 (Pfizer, Inc); documento WO 96/33978 (Zeneca); documento WO 96/3397 (Zeneca); y documento WO 96/33980 (Zeneca).
Un "agente antiangiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere con, hasta cierto punto, el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico, por ejemplo, puede ser una molécula pequeña o anticuerpo que se
65 une a un factor de crecimiento o a un receptor del factor de crecimiento implicado en la estimulación de la angiogénesis. En una realización, el factor antiangiogénico es un anticuerpo que se une al Factor de Crecimiento
Endotelial Vascular (VEGF).
El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por la población celular que actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y 5 hormonas politécnicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como hormona de estimulante de folículos (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor-α y -β de 10 necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-β; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGF) tales como TGFα y TGF-β; factor de crecimiento de tipo insulinínico I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón-α, -β, y -γ; factores de estimulación de colonias (CSF) tales como macrófago-CSF
15 (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (IL) tales como IL-1, IL1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-α o TNF-β; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa en el presente documento, el término citoquina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o a partir de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
20 El término "profármaco" tal como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma de derivados de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco precursor y destapar de ser activada o convertida de forma enzimática o hidrolítica en la forma precursora más activa. véanse, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions,
25 14, páginas 375-382, 615º Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen β-lactama, profármacos que
30 contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco sin citotóxicos más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapeúticos que se han descrito anteriormente.
35 Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para administrar un fármaco (tal como se incluyen los anticuerpos anti-CD30, CD40, CD70 o Lewis Y y, opcionalmente, un agente quimioterapeútico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se colocan normalmente en una formación de bicapa, similar a la colocación lipídica de membranas biológicas.
40 El término "prospecto" se usa para hacer referencia a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa a partir de
45 al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en la fuente natural de ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula aislada de ácido nucleico es distinta en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas aisladas de ácido nucleico se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo
50 cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico esta en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida operativamente en un organismo huésped en particular. Las secuencias de control que son
55 adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.
Un ácido nucleicos está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de
60 ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una secuencia previa o directora de secreción está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una proteína previa que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia de codificación si está colocado de modo que se facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" Server las secuencias de
65 ADN que se están uniendo son contiguas, y, en el caso de una directora de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se puede realizar por ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se pueden usar de acuerdo con la práctica convencional.
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5 Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas las denominaciones incluyen progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de las mismas sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie pues de no ser exactamente idéntica en el contenido del ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función
o actividad biológica tal como se identifica sistemáticamente en la célula transformada originalmente. Siempre que se pretenden denominaciones distintas, éstas serán evidentes a partir del contexto.
En el presente documento, una "enfermedad autoinmune" es una enfermedad o trastorno que se deriva de y que se dirige frente a tejidos propios de un individuo o un cosegregado o manifestación de la misma o afección resultante de 15 la misma. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática, y espondilitis anquilosante), psoriasis, dermatitis que incluye dermatitis atópica; urticaria idiopática crónica, que incluye urticaria autoinmune crónica, polimiositis/dermatomiositis, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia sistémica y esclerosis, respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), e IBD con cosegregado de pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, y/o epiescleritis), síndrome de dificultad respiratoria, que incluye síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), meningitis, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinitis alérgica, encefalitis tales como encefalitis de Rasmussen, uveítis, colitis tal como colitis microscópica y colitis colágena, glomerulonefritis (GN) tal como GN membranosa, GN membranosa idiopática, GN membranosa proliferativa (MPGN), que incluye Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, 25 afecciones alérgicas, eccema, asma, afecciones que implican infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, aterosclerosis, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus sistémico eritematoso (SLE) tal como SLE cutáneo, lupus (que incluye nefritis, cerebritis, pediátrica, no renal, discoide, alopecia), diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple (MS) tal como MS espino-óptica, encefalomielitis alérgica, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y por linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis que incluye granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis de Vasos Grandes (que incluye Polimialgia Reumática y Arteritis de Células Gigantes (de Takayasu)), vasculitis de Vasos Medios (que incluye Enfermedad de Kawasaki y Poliarteritis Nodosa), vasculitis del SCN, y vasculitis asociada a ANCA, tales como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica inmune que incluye anemia hemolítica 35 autoinmune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SCN, síndrome de disfunción orgánica múltiple, miastenia gravis, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet, síndrome de Castleman, Síndrome de Goodpasture, Síndrome Miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo al transplante de órganos sólidos (que incluye tratamiento previo para títulos de anticuerpos de panel reactivo alto, depósito de IgA en tejidos, y rechazo que surge del transplante renal, transplante de hígado, trasplante de intestino, trasplante de corazón, etc.), enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD), penfigoide bulloso, pénfigo (que incluye pénfigo vulgaris, foliáceo, y penfigoide de la membrana mucosa), 45 poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, nefritis por complejos inmunes, polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia (como la desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), que incluye trombocitopenia autoinmune, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios que incluye orquitis y ooforitis, hipotiroidismo primario; enfermedad endocrina autoinmunes que incluye tiroiditis autoinmune, tiroiditis crónica (Tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), diabetes de Tipo I también denominada diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), que incluye IDDM pediátrica, y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmune, neumonitis intersticial Linfoide (HIV), bronquiolitis obliterante (no trasplante) frente a NSIP, Síndrome de Guillain-Barré, Enfermedad de Berger (nefropatía por IgA),
55 cirrosis biliar primaria, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe refractario con dermatitis herpetiforme cosegregada, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad arterial coronaria, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida de audición autoinmune, síndrome de opsoclono mioclono (OMS), policondritis tal como policondritis refractaria, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, hepatitis de células gigantes, escleritis, gammapatía monoclonal de significado incierto/desconocido (MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, severa, parálisis periódica, y canalopatías del SCN; autismo, miopatía inflamatoria, y glomeruloesclerosis segmentaria focal (FSGS).
"Alquilo" es hidrocarburo C1-C18 que contiene átomos de carbono, normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Son
65 ejemplos metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3) CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2pentilo (-CH(CH3) CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2
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5 pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
"Alquenilo" es hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono, normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir un doble enlace sp2, carbon-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2).
"Alquinilo" es hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono, normales, secundarios, terciarios o cíclicos con
15 al menos un sitio de insaturación, es decir un triple enlace sp, carbon-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: acetilénico (-C≡CH) y propargilo (-CH2C≡CH).
"Alquileno" se refiere un radical hidrocarburo saturado, de cadena ramificada o lineal o cíclico de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radical monovalente que se obtiene por la retirada de dos átomos de hidrógeno a partir del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano precursor. Los radicales alquileno habituales incluyen, pero no se limitan a: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-), y similares.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, de cadena ramificada o lineal o cíclico de 2-18 átomos
25 de carbono, y que tiene dos centros de radical monovalente que se obtiene por la retirada de dos átomos de hidrógeno a partir del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno precursor. Los radicales alquenileno habituales incluyen, pero no se limitan a: 1,2-etileno (-CH=CH-).
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, de cadena ramificada o lineal o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radical monovalente que se obtiene por la retirada de dos átomos de hidrógeno a partir del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino precursor. Los radicales alquinileno habituales incluyen, pero no se limitan a: acetileno (-C≡C-), propargilo (-CH2C≡C-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C≡CH).
35 "Arilo” significa un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono que se obtiene por la retirada de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Los grupos arilo habituales incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.
"Arilalquilo” se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, por lo general un átomo de carbono terminal o sp3, está reemplazado con un radical arilo. Los grupos arilalquilo habituales incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-il y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a
45 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, que incluye grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo este 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo” se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, por lo general un átomo de carbono terminal o sp3, está reemplazado con un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo habituales incluyen, pero no se limitan a, 2-benzoimidazolilmetilo, 2-furiletilo, y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, que incluye grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo es de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 átomos de carbono o un
55 biciclo que tiene de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido", y "arilalquilo sustituido" se refieren a alquilo, arilo, y arilalquilo respectivamente, en el que uno o más átomos de hidrógeno cada uno está reemplazado independientemente con un sustituyente. Los sustituyentes habituales incluyen, pero no se limitan a, -X, -R, -O, -OR, -SR, -S, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR,
S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 , -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, en los que cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br, o I; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-C18, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14, grupo
65 protector o resto de profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno, y alquinileno tal como se ha descrito anteriormente también pueden estar sustituidos de forma similar.
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"Heteroarilo" y "Heterociclo" se refieren a un sistema de anillo en el que uno o más átomos en el anillo es un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, y azufre. El radical heterociclo comprende de 1 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tienen de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N,
5 O, P, y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6].
Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterociclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente en los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterociclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la actualidad), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.
Ejemplos de heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo,
15 pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzoimida-zolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranoílo, bistetrahidrofuranoílo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzoisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoílo.
25 A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, en la posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, en la posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, en la posición 2, 3, 5 o 6 de un pirazina, en la posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, en la posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, en la posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, en la posición 2 o 3 de una aziridina, en la posición 2, 3 o 4 de una azetidina, en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7,
o 8 de una quinolina o en la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una isoquinolina. Además de forma más habitual, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, o 5-tiazolilo.
35 A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, en la posición 2 de un isoindol, o isoindolina, en la posición 4 de una morfolina, y que la posición 9 de un carbazol, o β-carbolina. Still Además de forma más habitual, los heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1imidazolilo, 1-pirazolilo, y 1-piperidinilo.
"Carbociclo" se refiere a un anillo saturado por insaturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo
o de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Dos carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos en el anillo,
45 además de forma más habitual 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, colocados con un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos en el anillo colocados con un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Ejemplos carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1ciclohex-3-enilo, cicloheptilo, y ciclooctilo.
"Conector", "Unidad Conectora", o "conectar" se refiere un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un anticuerpo a un resto de fármaco. En diversas realizaciones, conectó se especifica como LU. Los conectores incluyen un radical divalente tal como un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, restos tales como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades repetición de alquiloxi (por ejemplo, polietilenoxi, PEG,
55 polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino, Jeffamina™); y éster diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato, y caproamida.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición del compañero en la imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que se superponen en su compañero en la imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero que difieren con respecto a la colocación de los átomos o grupos en el espacio.
65 "Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, sociedades espectrales, de actividades. Las mezclas de diastereómeros se pueden separar con procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
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"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles 5 entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en el presente documento por lo general siguen S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, IncNueva York. Muchos compuestos 10 orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de luz polarizada en un plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos d y l o (+) y (-) se usan para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, con (-) o l significando que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos 15 estereoisómeros son idénticos excepto en que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también se puede denominar enantiómero, y una mezcla de dichos isómeros a menudo se denomina una mezcla de enantiomérica. Una mezcla de enantiómeros a 50:50 se denomina una mezcla racémica o un racemato, que se puede producir cuando no se ha producido estereoselección ni estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies
20 enantioméricas, desprovistas de actividad óptica.
Ejemplos de un "paciente" incluyen, pero no se limitan a, un ser humano, rata, ratón, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, pájaro y ave de corral. En una realización a modo de ejemplo, el paciente es un ser humano.
25 "Arilo” se refiere a un grupo aromático carbocíclico. Ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo aromático carbocíclico o un grupo aromático heterocíclico pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’,-S(O)R’, -OH, -halógeno, -N3,
30 -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
El término "alquilo C1-C8", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado, de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos "alquilo C1-C8" representativos incluyen, pero no se limitan a, -metilo, -etilo, - n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n35 octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen, pero no se limitan a, -isopropilo, sec-butilo, -isobutilo, - terc-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, los alquilos C1-C8 insaturados incluyen, pero no se limitan a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo,-3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo,-acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2pentinilo, -3-metil-1 butinilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tercbutilo, n-pentilo, 40 isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetil-butilo, 2,2dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2,3,4-trimetilpentilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetil-hexilo, 2,4dimetilhexilo, 2,5-dimetilhexilo, 3,5-dimetilhexilo, 2,4-dimetilpentilo, 2-metilheptilo, 3-metilheptilo, n-heptilo, isoheptilo, n-octilo, y isooctilo. Un grupo alquilo C1-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’,-C(O)NH2, -C(O)NHR’,
45 C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico no aromático saturado o insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 o 8 miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, pero no se limitan a, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, 50 ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo,-1,3cicloheptadienilo, -1,3,5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo, y -ciclooctadienilo. Un grupo carbociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’,-C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo
55 C1-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 que se ha definido anteriormente en el que uno de los átomos de hidrógeno de los grupos carbociclo está reemplazado con un enlace.
60 Un "alquileno C1-C10" es un grupo hidrocarburo saturado, de cadena lineal de fórmula -(CH2)110-. Ejemplos de un alquileno C1-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno y decaleno.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta, o 65 para tal como se muestra en las siguientes estructuras
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en las que el grupo fenilo puede estar sin sustituir o sustituido con hasta cuatro grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 5 NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, - halógeno, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el que de uno a cuatro de los átomos de carbono en el anillo están reemplazados independientemente con un heteroátomo del grupo que consiste 10 en O, S y N. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, pero no se limitan a, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, coumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta siete grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’,-C(O)N(R’)2
15 NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 que se ha definido anteriormente en el que uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo está reemplazado con un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin
20 sustituir o sustituido con hasta seis grupos que incluyen, pero no se limitan a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 y -CN; en los que cada R’ se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
25 Un "Compuesto a modo de Ejemplo" es un Compuesto de Fármaco o un Compuesto de Fármaco-Conector.
Un "Conjugado a modo de Ejemplo" es un Conjugado de Fármaco-Ligando que tiene una unidad de Fármaco que se puede escindir del Conjugado de Fármaco-Ligando o un Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando.
30 En algunas realizaciones, los Compuestos a modo de Ejemplo y los Conjugados a modo de Ejemplo están en forma aislada o purificada. Tal como se usa en el presente documento, "aislado" se refiere a separado de los otros componentes de (a) una fuente natural, tal como una célula o cultivo celular vegetal o animal, o (b) una mezcla de reacción química orgánica sintética. Tal como se usa en el presente documento, "purificado" se refiere que cuando está aislado, el aislado contiene al menos un 95 %, y en otro aspecto al menos un 98 %, de Compuesto o Conjugado
35 a modo de Ejemplo en peso del aislado.
Ejemplos de un "grupo protector hidroxilo" incluyen, pero no se limitan a, metoximetil éter, 2-metoxietoximetil éter, éter tetrahidropiranílico, éterbencílico, éter p-metoxibencílico, éter trimetilsilílico, éter trietilsilílico, triisopropil silil éter, t-butildimetil silil éter, trifenilmetil silil éter, éster de acetato, ésteres de acetato sustituido, pivaloato, benzoato,
40 metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que se puede sustituir con otro grupo funcional. Dichos grupos salientes son bien conocidos en la técnica, y ejemplos incluyen, pero no se limitan a, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluenosulfonilp (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato), y
45 trifluorometilsulfonato.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un Compuesto a modo de Ejemplo o Conjugado a modo de Ejemplo. Los Compuestos a modo de Ejemplo y los Conjugados a modo de Ejemplo contienen al menos un grupo 50 amino, y en consecuencia se pueden formar sales de adición ácida con este grupo amino. Las sales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, y pamoato (es decir, sales de 55 1,1’-metil-en-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ión de acetato, un ión de succinato otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabilice la carga en el compuesto precursor. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Ejemplos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal
60 farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
"Solvato farmacéuticamente aceptable" o "solvato" se refiere a una asociación de una o más moléculas de disolvente y un compuesto de la invención, por ejemplo, un Compuesto a modo de Ejemplo o Conjugado a modo de Ejemplo. Ejemplos de disolventes que forman solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, y etanolamina.
5 En el presente documento se usan las siguientes abreviaturas y tienen las definiciones que se indican: AE es auristatina E, Boc es N-(t-butoxicarbonilo), cit es citrulina, dap es dolaproína, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es N,Ndiisopropiletilamina, dil es dolaisoleucina, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es etilenglicol dimetil éter (o 1,2-dimetoxietano), DMF es N,N-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfóxido, doe es dolafenina, dov es N,N-dimetilvalina, DTNB es ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico), DTPA es ácido dietilentriaminpentaacético, DTT es ditiotreitol, EDCI es clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ES-MS es espectrometría de masas por electronebulización, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de O-(7
15 azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol, HPLC es cromatografía líquida de alta presión, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4anisildifenilmetilo (o 4-metoxitritilo), nor es (1S, 2R)-(+)-norefedrina, PAB es p-aminobencilo, PBS es solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), PEG es polietilenglicol, Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6maleimidocaproílo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo tris-pirrolidino fosfonio, SEC es cromatografía de exclusión por tamaño, Su es succinimida, TBTU es tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-ilN,N,N,Ntetrametiluronio, TFA es ácido trifluoroacético, TLC es cromatografía en capa fina, UV es ultravioleta, y val es valina.
En el presente documento se usan las siguientes abreviaturas para conectores y tienen las definiciones que se
25 indican: Val Cit es una valina-citrulina, sitio dipeptídico en el conector de escisión de proteasa; PAB es paminobencilcarbamoílo; (Me)vc es N-metil-valina citrulina, en la que el enlace peptídico del conector se ha modificado para evitar su escisión por la catepsina B; MC(PEG)6-OH es maleimidocaproílo-polietilenglicol; SPP es Pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio); y SMCC es N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a menos que se indique de otro modo en el contexto, se refieren a tratamiento tanto terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en los que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o propagación del cáncer. Para fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados beneficial incluyen, pero no se limitan a, alivio de
35 síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), retraso o disminución del avance de una enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad, y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. "Tratamiento" también se puede referir a prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada sino se recibiera tratamiento. Los individuos que tienen necesidad de tratamiento incluyen los que ya padecen la afección o trastorno así como los propensos a tener la afección o trastorno o aquéllos en los que se va a prevenir la afección o trastorno.
En el contexto del cáncer, el término " que trata" incluye cualquiera o todos de: prevenir el crecimiento de células tumorales, células cancerosas, o de un tumor; prevenir la replicación de células tumorales o de células cancerosas, disminuir la carga tumoral global o disminuir el número de células cancerosas, y mejorar uno o más síntomas
45 asociados con la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmune, el término "que trata" incluye cualquiera o todos de: prevenir la replicación de células asociadas con un estado de enfermedad autoinmune que incluyen, pero no se limitan a, células que producen un anticuerpo autoinmune, disminución de la carga de anticuerpo autoinmune y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad autoinmune.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el término "que trata" incluye cualquiera o todos de: prevenir el crecimiento, multiplicación o replicación del agente patógeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad infecciosa.
55 En el presente documento se usan las siguientes abreviaturas para fármacos citotóxicos y tienen las definiciones que se indican: MMAE es mono-metil auristatina E (Pm 718); MMAF es N-metilvalina-valina-dolaisoleucinadolaproína-fenilalanina (Pm 731,5); MMAF-DMAEA es MMAF con DMAEA (dimetilaminoetilamina) en una unión amida con la fenilalanina C-terminal (Pm 801,5); MMAF-TEG es MMAF con tetraetilenglicol esterificado a la fenilalanina; MMAF-NtBu es N-t-butilo, unido como una amida al extremo C de MMAF; AEVB es auristatina E valeril bencilhidrazona, conector lábil ácido a través del extremo C de AE (Pm 732); y AFP es Monoamida de p-fenilen diamina con Fenilalanina C-terminal de Auristatina F (Pm 732).
4.2 COMPUESTOS 
65
4.2.1 LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA (Ia) En el presente documento se describen Conjugados Fármaco-Conector-Ligando que tienen la Fórmula Ia:
imagen19
L(Aa-Ww-Yy-D)p Ia
5 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la que, L- es una unidad Ligando; -Aa-Ww-Yy- es una unidad Conectora (LU), en la que la unidad Conectora incluye:
10 -A- es a unidad Bastidor,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad Aminoácido,
w es un número entero que varía de 0 a 12,
-Y- es a unidad Espaciadora, y 15 y es 0, 1 o 2;
p varía de 1 a aproximadamente 20; y
-D es una unidad de Fármaco que tiene las Fórmulas DE y DF:
imagen20
en las que, independientemente en cada posición:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
25 R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre H y metilo;
30 o R4 y R5 en conjunto forman un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3
35 C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8;
40 Z es O, S, NH, o NR12, en el que R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8;
45 cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, or -(CH2)n-SO3alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; R18 se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un número entero que varía de 0 a 6.
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En el presente documento también se describen Compuestos de Fármaco que tienen la Fórmula Ib:
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
o sales o solvatos del mismo farmacéuticamente aceptables, en la que:
R2 se selecciona entre hidrógeno y -alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, -arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8) en la que R5 se selecciona entre -H y metilo; o R4 y R5 en conjunto, tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C8 y -carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el átomo de carbono al que se unen; R6 se selecciona entre H y -alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, -OH, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y -alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre grupo arilo o -heterociclo C3-C8; Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR12-, en la que R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, -heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo -C2-C8; R14 es H o -alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2,-(CH2)n-SO3H, r -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, -alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; y n es un número entero que varía de 0 a 6.
En el presente documento también se describen Conjugados de Fármaco-Conector-Ligando que tienen la Fórmula Ia’:
imagen23Fórmula Ia’
o sales o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que:
Ab es un anticuerpo, A es una unidad Bastidor, a es 0 o 1, cada W es independientemente una unidad de Aminoácido, w es un número entero que varía de 0 ha 12, Y es una unidad Espaciadora, y y es 0, 1 o 2, p varía de 1 a aproximadamente 20, y D es un resto de Fármaco seleccionado entre las Fórmulas DE y DF:
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
en las que, independientemente en cada posición:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 en conjunto forman un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH, o NR12, en el que R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, or -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH;
R18
se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un número entero que varía de 0 a 6. Ab es cualquier anticuerpo unido covalentemente a una o más unidades de fármaco. Ab incluye un anticuerpo que se une a antígeno CD30, CD40, CD70, Lewis Y. En otra realización, Ab no incluye un anticuerpo que se une a un receptor ErbB o a uno o más receptores (1)-(35):
(1)
BMPR1B (receptor de proteína morfogenética ósea de tipo IB, Nº de acceso en Genbank NM_001203);
(2)
E16 (LAT1, SLC7A5, Nº de acceso en Genbank NM_003486);
(3)
STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata, Nº de acceso en Genbank NM_012449);
(4)
0772P (CA125, MUC16, Nº de acceso en Genbank AF361486);
(5)
MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina, Nº de acceso en Genbank NM_005823);
(6)
Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato sódico), miembro 2, transportador de fosfato dependiente de sodio de tipo II 3b, Nº de acceso en Genbank NM_006424);
(7)
Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B, Nº de acceso en Genbank AB040878);
(8)
PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 gene, Nº de acceso en Genbank AY358628);
(9)
ETBR (Receptor de endotelina de tipo B, Nº de acceso en Genbank AY275463);
imagen25
(10)MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, Nº de acceso en Genbank NM_017763);
(11)STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP 1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana, Nº de acceso en Genbank AF455138);
5 (12)TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4, Nº de acceso en Genbank NM_017636);
(13)CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, Nº de acceso en Genbank NP_003203 o NM_003212);
(14)CD21 (CR2 (Receptor de complemento2) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs.73792, Nº de acceso en Genbank M26004);
(15)CD79b (IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29, Nº de acceso en Genbank NM_000626);
(16)FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína de anclaje 1a de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C, Nº de acceso en Genbank NM_030764);
(17)HER2 (Nº de acceso en Genbank M11730); 15 (18)NCA (Nº de acceso en Genbank M18728);
(19)MDP (Nº de acceso en Genbank BC017023);
(20)IL20Rα (Nº de acceso en Genbank AF184971);
(21)Brevican (Nº de acceso en Genbank AF229053);
(22)Ephb2R (Nº de acceso en Genbank NM_004442);
(23)ASLG659 (Nº de acceso en Genbank AX092328);
(24)PSCA (Nº de acceso en Genbank AJ297436);
(25)GEDA (Nº de acceso en Genbank AY260763);
(26)BAFF-R (Nº de acceso en Genbank NP_443177.1);
(27)CD22 (Nº de acceso en Genbank NP-001762.1);
25 (28)CD79a (CD79A, CD79α, asociado a inmunoglobulina alfa, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie de moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank NP_001774.1);
(29)CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la proteína G que se activa con la quimioquina CXCL13, funciona en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, desempeña un papel en la infección por VIH-2 y quizá en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia, Nº de acceso en Genbank NP_001707.1);
(30)HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+, Nº de acceso en Genbank NP_002111.1);
(31)P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X, un canal aniónico abierto por ATP
35 extracelular, puede estar implicado en la transmisión y en la neurogénesis sináptica, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de inestabilidad, Nº de acceso en Genbank NP_002552.2);
(32)CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B , Lyb-2, Nº de acceso en Genbank NP_001773.1);
(33)
LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR), regula la activación y apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función está asociada con mayor actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso, Nº de acceso en Genbank NP_005573.1);
(34)
FCRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc,1 supuesto receptor para el dominio Fc de la inmunoglobulina
que contiene los dominios similar a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de 45 linfocitos B, (Nº de acceso en Genbank NP_443170.1); y/o
(35) IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank NP_112571.1). En una realización -Ww- es -Val-Cit-.
R3, R4 y R7 pueden ser independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En una realización a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo. En otra realización más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
55 Además, en otra realización, cada aparición de R8 es -OCH3.
En una realización a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo en particular, R10 es -fenilo.
65 En un ejemplo en particular, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otro Ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-SO3H. Ab puede ser cAC10, cBR96, cS2C6, c1F6, c2F2, hAC10, hBR96, hS2C6, hIF6, y h2F2. Algunos conjugados a modo de ejemplo de Fórmula Ia tienen las siguientes estructuras:
imagen26
o
imagen27
15 en las que L es un anticuerpo, Val es valina, y Cit es citrulina.
La carga del fármaco drug se representa con p, el número medio de moléculas de fármaco por anticuerpo en una
molécula (por ejemplo, de Fórmula Ia, Ia’ e Ic). La carga del fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por
Ligando (por ejemplo, Ab o mAb). Las composiciones de Fórmula Ia y de Fórmula Ia’ incluyen colecciones de 20 anticuerpos conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 20. El número medio de fármacos por anticuerpo en la
preparación de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como
espectroscopía de masas, ensayo de ELISA, y HPLC. Además, se puede determinar la distribución cuantitativa de
Conjugados de Ligando-Fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización
de conjugados de Ligando-Fármaco en los que p es un valor determinado para Conjugados de Ligando-Fármaco 25 con otras cargas de fármaco se pueden conseguir por cualquier medio tal como HPLC en fase inversa o
electroforesis.
4.2.2 LOS COMPUESTOS FARMACOLÓGICOS FÓRMULA (Ib)
imagen28
En el presente documento también se describen compuestos de Fármaco que tienen la Fórmula (Ib):
imagen29
5 o una sal o solvato de los mismos, farmacéuticamente aceptables, en la que:
R2 se selecciona entre -hidrógeno y -alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre -hidrógeno, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8
10 (carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre -hidrógeno, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, -arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8) en la que R5 se selecciona entre -H y metilo; o R4 y R5 en conjunto, tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C8 y -carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el átomo
15 de carbono al que se unen; R6 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre -H, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquil-arilo C1-C8, -alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre -H, -OH, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8);
20 R9 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre grupo arilo o -heterociclo C3-C8; Z is -O-, -S-, -NH-, o -NR12-, en el que R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre -H, alquilo C1-C20, arilo, -heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000;
25 R13 es -alquilo C2-C8; RI4 es -H o -alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2,-(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo C1-C8, or -(CH2)n-COOH; y
30 n es un número entero que varía de 0 a 6.
En un ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
35 En un ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
Además, en otro ejemplo, cada aparición de R8 es -OCH3. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
40 En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo, R10 es -fenilo. 45 En un ejemplo, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH. 50 En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Los Compuestos Ilustrativos de Fórmula (Ib), cada uno de los cuales se puede usar como restos de fármaco (D) en ADC, incluyen compuestos que tienen las siguientes estructuras: 55
imagen30
imagen31
imagen32
y sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos. LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA (Ic) En el presente documento también se describen compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que tienen la
Fórmula Ic:
imagen23
10 que comprenden un anticuerpo unido covalentemente a uno o más unidades de fármaco (restos). Los compuestos de conjugados de anticuerpo-fármaco incluyen sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Se definen compuestos de Fórmula Ic, en la que:
15 Ab es un anticuerpo que se une a uno o más receptores de antígenos asociados a tumor (1)-(35):
(1)
BMPR1B (receptor de proteína morfogenética ósea de tipo IB, Nº de acceso en Genbank NM_001203);
(2)
E16 (LAT1, SLC7A5, Nº de acceso en Genbank NM_003486);
(3)
STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata, Nº de acceso en Genbank 20 NM_012449);
(4)
0772P (CA125, MUC16, Nº de acceso en Genbank AF361486);
(5)
MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina, Nº de acceso en Genbank NM_ 005823);
(6)
Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato sódico), miembro 2, 25 transportador de fosfato dependiente de sodio de tipo II 3b, Nº de acceso en Genbank NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B, Nº de acceso en Genbank AB040878);
(8)
PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 30 gene, Nº de acceso en Genbank AY358628);
(9)
ETBR (Receptor de endotelina de tipo B, Nº de acceso en Genbank AY275463);
(10)
MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, Nº de acceso en Genbank NM_017763);
(11)
STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de
próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de 35 próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana, Nº de acceso en Genbank AF455138);
(12)
TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4, Nº de acceso en Genbank NM_017636);
(13)
CRIPTO, (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, Nº de acceso en Genbank NP_003203 o NM_003212);
40 (14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento2) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs.73792 Nº de acceso en Genbank M26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29, Nº de acceso en Genbank NM_ 000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína de anclaje 1a de fosfatasa que contiene el dominio SH2), 45 SPAP1B, SPAP1C, Nº de acceso en Genbank NM_030764);
(17) HER2 (Nº de acceso en Genbank M1 1730);
(18)NCA (Nº de acceso en Genbank M18728);
(19)MDP (Nº de acceso en Genbank BC017023);
(20)IL20Rα (Nº de acceso en Genbank AF184971); 50 (21)Brevican (Nº de acceso en Genbank AF229053);
(22)Ephb2R (Nº de acceso en Genbank NM_004442);
(23)ASLG659 (Nº de acceso en Genbank AX092328);
(24)PSCA (Nº de acceso en Genbank AJ297436);
(25)GEDA (Nº de acceso en Genbank AY260763; 55 (26)BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor 3 de BLyS, BR3, NP_443177.1);
(27)CD22 (isoforma CD22-B de receptores de linfocitos B, NP-001762.1);
(28)CD79a (CD79A, CD79α, asociado a inmunoglobulina alfa, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie de moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank NP_001774.1);
60 (29)CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la proteína G que se activa con la quimioquina CXCL13, funciona en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, desempeña un papel en la infección por VIH-2 y quizá en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia, Nº de acceso en Genbank NP_001707.1);
(30)HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno Ia) que se une a péptidos y los 65 presenta a linfocitos T CD4+, Nº de acceso en Genbank NP_002111.1);
imagen33
(31)P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X, un canal aniónico abierto por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión y en la neurogénesis sináptica, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de inestabilidad, Nº de acceso en Genbank NP_002552.2);
(32)CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B , Lyb-2, Nº de acceso en Genbank NP_001773.1);
5 (33)LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR), regula la activación y apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función está asociada con mayor actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso, Nº de acceso en Genbank NP_005573.1);
(34)FCRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc,1 supuesto receptor para el dominio Fc de la inmunoglobulina
10 que contiene los dominios similar a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank NP_ 443170.1); y
(35)IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank
15 NP_112571.1).
A es a unidad Bastidor, a es 0 o 1,
cada W es independientemente una unidad Aminoácido,
w es un número entero que varía de 0 a 12, 20 Y es a unidad Espaciadora, e
y es 0, 1 o 2,
p varía de 1 a aproximadamente 8, y
D es un resto de Fármaco seleccionado entre las Fórmulas DE y DF:
imagen34
en la que la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente para A, W, o Y, e independientemente en cada posición:
30 R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
35 R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 en conjunto forman un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8),
40 heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH, o NR12, en el que R12 es alquilo C1-C8;
45 R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8;
imagen35
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH;
R18
se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C35 C8); y n es un número entero que varía de 0 a 6. En un ejemplo -Ww- es -Val-Cit-. 10 En otro ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo. En otro ejemplo más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
15 Además, en otro ejemplo, cada aparición de R8 es -OCH3. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es-H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
20 En un ejemplo, Z es -O- o -NH-. En un ejemplo, R10 es arilo. En un ejemplo, R10 es -fenilo.
25 En un ejemplo, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH. 30 En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Algunos conjugados a modo de ejemplo de Fórmula Ic ADC tienen las siguientes estructuras: en las que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más receptores de antígenos asociados a tumor (1)-(35); Val es valina; y Cit es citrulina.
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5 La carga de fármacos se representa por p, el número medio de fármacos por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga del fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por anticuerpo (Ab o mAb). Las composiciones de ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 20. El número medio de fármacos por anticuerpo en las preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación se
10 puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de UV/visible, espectrometría de masas, ensayo de ELISA, y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. en algunos casos, la separación purificación, y caracterización de ADC homogéneos en los que p es un determinado valor a partir de ADC con otras cargas de fármaco se pueden conseguir por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis.
15 Para algunos conjugados de fármaco de anticuerpo, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de la cisteína, tal como las realizaciones a modo de ejemplo mencionadas anteriormente, un anticuerpo puede tener solamente uno o varios grupos tiol de la cisteína, o por detener solamente uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través los que se puede unir un conector.
20 Por lo general, menos del máximo teórico de restos de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con el compuesto intermedio de fármaco-conector o reactivo conector. Solamente los grupos lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo conector de amina-reactivo. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos, si los
25 hubiera, grupos tiol de la cisteína libres y reactivos que se pueden unir a un resto de fármaco. La mayoría de los restos tiol de la cisteína en los anticuerpos de los compuestos de la invención existen como puentes disulfuro se deben reducir con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT). Además, el anticuerpo se debe someter a condiciones de desnaturalización para dejar al descubierto grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína. La carga (relación de fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar diferentes maneras, que incluyen: (i) limitar
30 el exceso molar de compuesto intermedio de fármaco-conector o reactivo conector con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación, y (iii) hacer parciales o limitar las condiciones de reducción para la modificación del tiol de la cisteína.
Se debe observar que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un compuesto intermedio de fármaco
35 conector, o reactivo conector seguido de reactivo de resto de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número medio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante ensayos de anticuerpos por ELISA doble, específicos para anticuerpos y específicos para el fármaco. Se pueden identificar moléculas individuales de ADC en la mezcla por espectroscopía de masas, y separa por HPLC, por ejemplo, cromatografía de
40 interacción hidrófoba ("Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, K.J., et al, Resumen Nº 624, American Association for Cancer Research; Annual Meeting de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al, Resumen Nº 627, American Association for Cancer Research; Annual Meeting de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR,
45 Volumen 45, marzo de 2004). Por lo tanto, un ADC homogéneo con un solo valor de carga se puede aislar a partir de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
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4.3 LA UNIDAD CONECTORA
5 Una "unidad Conectora" (LU) es un compuesto bifuncional, que se puede usar para unir una unidad de Fármaco y una unidad de Ligando para formar Conjugados de Fármaco-Conector-Ligando, o que son útiles en la formación de inmunoconjugados dirigidos frente a antígenos asociados a tumores. Dichos inmunoconjugados permiten la administración selectiva de fármacos tóxicos a células tumorales.
10 En algunos ejemplos, la unidad Conectora del Compuesto de Fármaco-Conector y Conjugado de FármacoConector-Ligando tiene la fórmula:
-Aa-Ww-Yy-
15 en la que:
-A- es a unidad Bastidor; a es 0 por 1; cada -W- es independientemente una unidad Aminoácido;
20 w es independientemente un número entero que varía de 0 a 12; -Y- es a unidad Espaciadora; y y es 0, 1 o 2.
En el Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando, el Conector es capaz de unirse al resto Fármaco y a la unidad 25 Ligando.
4.3.1 LA UNIDAD BASTIDOR
La unidad Bastidor (-A-), cuando está presente, es capaz de unirse a una unidad Ligando para formar una unidad
30 aminoácido (-W-). A este respecto, un Ligando (L) tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con grupo funcional de un Bastidor. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un ligando, bien naturales o a través de manipulación química incluyen, pero no se limitan a, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anómero de un hidrato de carbono, y carboxilo. En un aspecto, los grupos funcionales de Ligando pueden ser sulfhidrilo y amino. Los grupos sulfhidrilo se pueden generar por reducción de un enlace disulfuro intramolecular
35 de un Ligando. Como alternativa, los grupos sulfhidrilo se pueden generar por reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un Ligando usando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo que genere sulfhidrilo.
La unidad Bastidor puede formar un enlace con un átomo de azufre de la unidad Ligando. El átomo de azufre puede provenir de un grupo sulfhidrilo de un Ligando. Las unidades Bastidor representativas de la presente realización se 40 representan dentro de los corchetes de las Fórmulas IIIa y IIIb, en las que L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se han definido anteriormente, y R17 se selecciona entre -alquileno C1-C10-, -carbociclo C3-C8 -, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C1 -, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, (CH2CH2O)r-. y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1-10. Se debe entender que a partir de los
45 conjugados a modo de ejemplo de Fórmula Ia, tales como IIIVI, que incluso cuando no se indica de forma expresa, de 1 a 20 restos de fármaco están unidos a un Ligando (p = 1-20).
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50 Una unidad Bastidor ilustrativa es la de Fórmula IIIa en la que R17 es -(CH2)5-:
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Otra unidad Bastidor ilustrativa es la de Fórmula IIIa en la que R17 es -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es 2:
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Además, otra unidad Bastidor ilustrativa es la de Fórmula IIIb en la que R17 es -(CH2)5-:
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10
En otro ejemplo, la unidad Bastidor está unida a la unidad Ligando a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad Ligando y un átomo de azufre de la unidad Bastidor. Una unidad Bastidor representativa de la presente realización se representa dentro de los corchetes de Fórmula IV, en la que R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son
15 tal como se han definido anteriormente.
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En otro ejemplo más, el grupo reactivo del Bastidor contiene husillo reactivo que puede formar un enlace con un
20 grupo amino primario o secundario de un Ligando. Ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades Bastidor representativas de la presente realización se representan dentro de los corchetes de las Fórmulas Va y Vb, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se han definido anteriormente;
25
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En otro aspecto más, el grupo reactivo del Bastidor puede contener un sitio reactivo que es reactivo a un grupo modificado del hidrato de carbono (-CHO) que puede estar presente en un por. Por ejemplo, un hidrato de carbono 5 se puede oxidar suavemente usando un reactivo tal como peryodato sódico y la unidad (-CHO) resultante del hidrato de carbono oxidado se puede condensar con un Bastidor que contiene una funcionalidad tal como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina, y una arilhidrazida tal como las que se describen en Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2: 133-41. Las unidades Bastidor representativas de la presente realización se representan dentro de los corchetes de Fórmulas
10 VIa, VIb, y VIc, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se han definido anteriormente.
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15 4.3.2 LA UNIDAD AMINOÁCIDO
La unidad Aminoácido (-W-), cuando está presente, une la unidad Bastidor a la unidad Espaciadora si la unidad Espaciadora está presente, une la unidad Bastidor al resto de Fármaco si la unidad Espaciadora está ausente, y une la unidad Ligando a la unidad de Fármaco si la unidad Bastidor y la unidad Espaciadora están ausentes.
20 Ww-es una unidad dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W- tiene independientemente la fórmula que se indica a continuación entre paréntesis, y w es un número entero que varía de 0 a 12: en las que R19 es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo,  -butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2,
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5 (CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, (CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
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La unidad Aminoácido se puede escindir enzimáticamente con una o más enzimas, que incluyen proteasa asociada a tumores, para liberar la unidad de Fármaco (-D), que en una realización se protona in vivo después de su liberación para proporcionar un Fármaco (D). Unidades Ww ilustrativas se representan con las fórmulas (VII)(IX): 
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en la que R20 y R21 son como sigue a continuación:
R20 bencilo metilo isopropilo
R21 (CH2)4NH2; (CH2)4NH2; (CH2)4NH2;
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isopropilo (CH2)3NHCONH2; bencilo (CH2)3NHCONH2; isobutilo (CH2)3NHCONH2; sec-butilo (CH2)3NHCONH2; (CH2)3NHCONH2;
bencilo metilo; y(CH2)3NHC(=NH)NH2; bencilo
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en la que R20, R21 y R22 son como sigue a continuación:
R20
R21 R22
5
bencilo isopropilo H bencilo bencilo bencilo (CH2)4NH2; (CH2)4NH2; y (CH2)4NH2;
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en la que R20, R21, R22 y R23 son como sigue a continuación: R20 R21 R22 R23
H bencilo isobutilo H; y
metilo isobutilo metilo Isobutilo 10 Unidades Aminoácido a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, unidades de fórmula (VII) en la que: R20 es bencilo y R21 es -(CH2)4NH2;R20 isopropilo y R21 es -(CH2)4NH2; R20 isopropilo y R21 es -(CH2)3NHCONH2. Otra unidad Aminoácido a modo de ejemplo es una unidad de fórmula (VIII) en la que R20 es bencilo, R21 es bencilo, y R22 es -(CH2)4NH2. 15 Las unidades -Ww-útiles se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para escisión enzimática con una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores. En un ejemplo, una unidad -Ww-es aquélla cuya escisión está catalizada por catepsina B, C y D, o una proteasa de plásmido.
20 En un ejemplo, -Ww- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido o pentapéptido.
Cuando R19, R20, R21, R22 o R23 es distinto de hidrógeno, el átomo de carbono al que R19, R20, R21, R22 o R23 está unido es quiral.
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Cada átomo de carbono al que R19, R20, R21, R22 o R23 está unido está independientemente en la configuración (S) o (R).
En un ejemplo de la unidad Aminoácido, la unidad Aminoácido es valina-citrulina. En otro aspecto, la unidad
5 Aminoácido es fenilalanina-lisina (es decir, fk). En otro ejemplo más de la unidad Aminoácido, la unidad Aminoácido es N-metilvalina-citrulina. En otro aspecto más, la unidad Aminoácido es ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato de lisina, ciclohexilalanina lisina, ácido isonipecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina y ácido isonipecótico.
10 En determinados casos, la unidad Aminoácido puede comprender aminoácidos naturales. En otros casos, la unidad Aminoácido puede comprender aminoácidos no naturales.
4.3.3 LA UNIDAD ESPACIADORA 
15 La unidad Espaciadora (-Y-), cuando está presente, une una unidad Aminoácido al resto de Fármaco cuando una unidad Aminoácido está presente. Como alternativa, la unidad Espaciadora une la unidad Bastidor al resto de Fármaco cuando la unidad Aminoácido está ausente. La unidad Espaciadora también une el resto de Fármaco a la unidad Ligando cuando tanto la unidad Aminoácido como la unidad Bastidor están ausentes.
20 Las unidades Espaciadoras son de dos tipos generales: autoinmolativas y no autoinmolativas. Una unidad Espaciadora no autoinmolativa es una en la que parte o toda la unidad Espaciadora permanece unida al resto de Fármaco después de la escisión, particularmente enzimática, de una unidad Aminoácido a partir del Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando o del Compuesto Fármaco-Conector. Ejemplos de una unidad Espaciadora no autoinmolativa incluyen, pero no se limitan a una unidad Espaciadora (glicina-glicina) y una unidad Espaciadora
25 glicina (ambas representadas en el Esquema 1) (véase a continuación). Cuando un Compuesto a modo de Ejemplo que contiene una unidad Espaciadora glicina-glicina o una unidad Espaciadora glicina experimenta escisión enzimática a través de una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos, un resto de Fármaco glicina-glicina o un resto de Fármaco glicina se escinde de L-Aa-Ww-. En un ejemplo, una reacción de hidrólisis independiente se produce dentro de la célula diana, escindiendo
30 el resto de Fármaco glicina y liberando el Fármaco.
En otro ejemplo, -Yy- es una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) (véanse los Esquemas 2 y 3) cuya porción de fenileno está sustituida con Qm en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno,- nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0-4.
35
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En un ejemplo, una unidad Espaciadora no autoinmolativa (-Y-) es -Gly-Gly-. En otro ejemplo, una unidad Espaciadora no autoinmolativa (-Y-) es -Gly-.
40 En un ejemplo, se proporciona un Compuesto de Fármaco-Conector o un Conjugado de Fármaco-Conector Ligando en el que la unidad Espaciadora está ausente (y = 0), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Como alternativa, un Compuesto a modo de Ejemplo que contiene una unidad Espaciadora autoinmolativa puede
45 liberar -D sin la necesidad de una etapa de hidrólisis separada. En esta realización, -Y- es un grupo PAB que se une a -Ww-a través del átomo de nitrógeno del amino del grupo PAB, y se conecta directamente a -D a través de un grupo carbonato, carbamato o éter. Sin quedar ligado a teoría o mecanismo alguno en particular, el Esquema 2 representa un mecanismo posible de liberación de Fármaco de un grupo PAB que se une directamente a -D a través de un grupo carbamato o carbonato adoptado por Toki et al. (2002) J Org. Chem. 67: 1866-1872.
50 en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; y p varía de 1 a aproximadamente 20.
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Sin quedar ligado a teoría o mecanismo alguno en particular, el Esquema 3 representa un mecanismo posible de liberación de Fármaco de un grupo PAB que se une directamente a -D a través de una unión éter o amina.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno,-nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; y p varía de 1 a aproximadamente 20.
5 Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Se pueden usar espaciadores que experimentan ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas sustituidas y sin sustituir del ácido 4
10 aminobutírico (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223), sistemas de anillo biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] sustituidos apropiadamente (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815) y amidas del ácido 2aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) también son ejemplos de espaciador autoinmolativo útil en Compuestos a modo de Ejemplo.
15 En un ejemplo, la unidad Espaciadora es una unidad de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado tal como se representa en el Esquema 4, que se puede usar para incorporar y liberar múltiples fármacos.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro r -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; n es 0 o 1; y p varía de 1 a aproximadamente 20. En un ejemplo, los restos -D son los mismos. En otra realización más, los restos -D son diferentes. En un ejemplo, las unidades Espaciadoras (-Yy-) se representan con las Fórmulas (X)(XII):
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 1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 04;
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y
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Algunos ejemplos de los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco de Fórmulas Ia’ e Ic incluyen:
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25 y,
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en la que w e y son cada uno 0,
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y
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4.4 LA UNIDAD FÁRMACO (RESTO)
5 El resto de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) son los del tipo dolastatina/auristatina (Patentes de Estados Unidos Nº 5635483; Nº 5780588) que se ha mostrado que interfieren con la dinámica de microtúbulos, hidrólisis de GTP, y división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents y Chemother. 45 (12): 3580-3584) y tienen actividad anticáncer (Patente de Estados Unidos Nº 5663149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965).
10 D es una unidad de Fármaco (resto) que tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la unidad Espaciadora cuando y = 1 o 2, con el grupo carboxilo C-terminal de una unidad Aminoácido cuando y = 0, con el grupo carboxilo de una unidad Bastidor cuando w e y = 0, y con el grupo carboxilo de una unidad de Fármaco cuando a, w, e y = 0. Se debe observar que las expresiones "unidad de fármaco" y "resto de fármaco" son sinónimos
15 y se usan indistintamente en el presente documento.
En un ejemplo, -D es cualquier fórmula DE o DF:
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20
en las que, independientemente en cada posición:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8),
25 heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n-en la que Ra y Rb se
30 seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil C1-C8-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
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R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH, o NR12, en el que R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2;
5 m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
10 cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; R18
se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un número entero que varía de 0 a 6.
15 En un ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es H.
20 Además en otro ejemplo, cada aparición de R8 es -OCH3. En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
25 En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo, R10 es -fenilo.
En un ejemplo, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo. 30 En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en el que R15 es -(CH2)n-SO3H. 35 Unidades de Fármaco (-D) ilustrativas incluyen las unidades de fármaco que tiene las siguientes estructuras:
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5 y sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de las mismas.
Algunos grupos hidrófilos, tales como pero no limitados a ésteres de trietilenglicol (TEG), como se ha mostrado anteriormente, se pueden unir a la Unidad de Fármaco en R11. Sin quedar ligado a la teoría, los grupos hidrófilos
10 ayudan en la internalización y no aglomeración de la Unidad de Fármaco.
4.5 LA UNIDAD LIGANDO 
La unidad Ligando (L-) incluye dentro de su alcance cualquier unidad de un Ligando (L) que se una o que se asocie
15 de forma reactiva o que forme complejos con un receptor, antígeno u otro resto receptor asociado con una relación dada de células diana. Un Ligando es una molécula que se une a, forma complejos con, o reacciona con un resto de una población celular que se trata de modificar terapéuticamente o de otro modo biológicamente. En un ejemplo, la unidad Ligando actúa para administrar la unidad de Fármaco a la población de células diana en particular con la que reacciona la unidad Ligando. Dichos Ligandos incluyen, pero no se limitan a, proteínas de alto peso molecular tales como, por ejemplo, anticuerpos de longitud total, fragmento de anticuerpos, proteínas de peso molecular más pequeño, polipéptidos o péptidos, lectinas, glicoproteínas, no péptidos, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tales como, pero no limitadas a, transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión a células.
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5 Una unidad Ligando puede formar un enlace con una unidad Bastidor, una unidad Aminoácido, una Unidad Espaciadora, o una Unidad Fármaco. Una unidad Ligando puede formar un enlace con una unidad Conectora a través de un heteroátomo del Ligando. Los heteroátomos que pueden estar presentes en una unidad Ligando incluyen azufre (en una realización, de un grupo sulfhidrilo de un Ligando), oxígeno (en una realización, de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un Ligando) y nitrógeno (en una realización, de un grupo amino primario o secundario de un Ligando). Estos heteroátomos pueden estar presentes en el Ligando en el estado natural del Ligando, por ejemplo un anticuerpo de origen natural, o se pueden introducir en el Ligando a través de modificación química.
En un ejemplo, un Ligando tiene un grupo sulfhidrilo y el Ligando se une a la unidad Conectora a través del átomo de 15 azufre del grupo sulfhidrilo.
En otro ejemplo más, el Ligando tiene uno o más restos de lisina que se pueden modificar químicamente para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. La unidad Ligando se une a la unidad Conectora a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo. Los reactivos que se pueden usar para modificar lisinas incluyen, pero no se limitan a, Sacetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) y Clorhidrato de 2-iminotiolano (Reactivo de Traut).
En otro ejemplo, el Ligando puede tener uno o más grupos de hidrato de carbono que se puede modificar químicamente para que tengan uno o más grupos sulfhidrilo. La unidad Ligando se une a la Unidad Conectora, tal como la Unidad Bastidor, a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
25 En otro ejemplo más, el Ligando puede tener uno o más grupos de hidratos de carbono que se pueden oxidar para proporcionar un grupo aldehído (-CHO) (véase, por ejemplo Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32 (3), 548-55). El aldehído correspondiente puede formar un enlace con un Sitio Reactivo en un Bastidor. Los sitios reactivos en un Bastidor que pueden reaccionar con a grupo carbonilo en un Ligando incluyen, pero no se limitan a, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificación de proteínas para la unión o asociación de Unidades de Fármaco se describen en Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002).
Ligandos útiles no inmunoreactivos de proteína, polipéptido, o péptido incluyen, pero no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido de liberación de gastrina, factor de
35 crecimiento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento transformantes ("TGF"), tales como TGF-α y TGF-β, factor de crecimiento de vaccinia ("VGF"), factores de crecimiento I y II insulínicos y de tipo insulínico, lectinas y apoproteína de lipoproteína de baja densidad.
Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo que provienen de los sueros de animales inmunizados. Se pueden usar diversos procedimientos bien conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales para un antígeno de interés. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos policlonales, diversos animales huésped se pueden inmunizar por inyección con un antígeno de interés o derivado del mismo, que incluyen, pero no se limitan a, conejos, ratones, ratas, y cobayas. Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huéspedes, e incluyen pero no
45 se limitan a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.
 por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno viral, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, un agente químico, ácido nucleico, o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (mAb) para un antígeno de interés se puede preparar usando cualquier técnica conocidas en la
55 materiaque proporciona para la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridomas que se describió originalmente en Köhler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72), y la técnica de hibridomas de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de una clase de inmunoglobulinas que incluyen IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los mAb rehusó la presente invención se pueden cultivar in vitro o in vivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmento de anticuerpos, o anticuerpos monoclonales quiméricos humano-ratón (u 65 otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden tratar mediante cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas en la materia (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7308-7312;
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Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79; y Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16).
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico. En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la
5 coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las que solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. Procedimientos similares se desvelan en la Publicación Internacional Nº WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se condensan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina,
15 que comprende al menos parte de las regiones CH2, y CH3, bisagra. Es preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unión a la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ácidos nucleicos con secuencias que codifican las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Ésto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos cuando las relaciones no son particularmente significativas.
25 En un ejemplo de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos tienen una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama, y un par híbrido de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina (que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solamente en una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo de separación fácil (Publicación Internacional Nº WO 94/04690) que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos véanse, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
35 Enzymology, 1986, 121: 210; Rodrigues et al., 1993, J. of Immunology 151: 6954-6961; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167; Carter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4: 463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 677-681. Usando dichas técnicas, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades tal como se define en el presente documento.
Además, se describen anticuerpos bifuncionales, en Publicación de Patente Europea Nº EPA 0 105 360. Tal como se desvela en esta referencia, los anticuerpos híbridos o bifuncionales se pueden derivar biológicamente, es decir, mediante técnicas de fusión celular, o químicamente, especialmente con agentes de reticulación o reactivos formadores de puentes disulfuro, y puede comprender anticuerpos enteros o fragmentos de los mismos. Métodos para obtener dichos anticuerpos híbridos se desvelan por ejemplo, en la Publicación Internacional WO 83/03679, y
45 en la Publicación de Patente Europea Nº EPA 0 217 577.
El anticuerpo puede ser un fragmento, derivado o análogo funcionalmente activo de un anticuerpo que se une de forma y especifica a antígenos de células cancerosas, antígenos virales, o antígenos microbianos u otros anticuerpos unidos a células o matrices tumorales. A este respecto, "funcionalmente activo" se refiere a que el fragmento, derivado o análogo es capaz de obtener anticuerpos anti-anti-idiotipo que reconocen el mismo antígeno que el anticuerpo a partir del que el fragmento, derivado o análogo se deriva o se reconoce. De forma específica, en una realización a modo de ejemplo, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina se puede potenciar por supresión de las secuencias marco y CDR que son C-terminales a la secuencia CDR que reconoce específicamente al antígeno. Para determinar que secuencias de CDR se unen al antígeno, se pueden usar péptidos
55 sintéticos que contienen las secuencias CDR en ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica (por ejemplo, el ensayo de núcleos BIA) (Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat E et al., 1980, J. of Immunology 125 (3): 961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, pero no limitados a, fragmentos de F(ab’)2, que contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada que se pueden producir por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y fragmentos de Fab, que se pueden generar por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos de F(ab’) . Otros anticuerpos útiles son dímeros de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpos, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tales como Fvs o 65 anticuerpos de una sola cadena single (SCA) (por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4946778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y Ward et
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al., 1989, Nature 334: 544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.
Además, anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que se pueden producir usando técnicas de ADN
5 recombinante convencionales, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quiméricos una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de regiones constantes de inmunoglobulina monoclonal de murino y humana. (Véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos Nº 4816567).
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de las especies no humanas y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Queen, Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089). Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos que se describen en la Publicación Internacional Nº WO
15 87/02671; Publicación de Patente Europea Nº 184.187; Publicación de Patente Europea Nº 171496; Publicación de Patente Europea Nº 173494; Publicación Internacional Nº WO 86/01533; Patente de Estados Unidos Nº 4816567; Publicación de Patente Europea Nº 12.023; Berter et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47: 999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Patente de Estados Unidos Nº 5225539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables y se pueden producir usando ratones
25 transgénicos que son incapaces de expresar genes endógenos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, pero que pueden expresar genes humanos de cadena pesada y ligera. Los ratones transgénicos e inmunizan de la forma habitual con un antígeno seleccionado, por ejemplo por ejemplo, las
35 Patentes de Estados Unidos Nº 5625126; Nº 5633425; Nº 5569825; Nº 5661016; Nº 5545806. Otros anticuerpos humanos se pueden obtener en el mercado en, por ejemplo, Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA).
Los anticuerpos totalmente humanos que reconocen un epítopo seleccionado se pueden generar usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo totalmente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12: 899-903). Los anticuerpos humanos tales se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la materia, que incluyen bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Quan, M. P. y
45 Carter, P. 2002. The rise of monoclonal antibodies as therapeutics. In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. y Fick Jr., R. B, eds., Marcel Dekker, Nueva York, NY, Capítulo 20, páginas 427-469).
En otros ejemplos, el anticuerpo es una proteína de fusión de un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente activo de la misma, por ejemplo en la que el anticuerpo se funde a través de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), del extremo N o al extremo C a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma, preferentemente al menos 10, 20 o 50 porciones de aminoácidos de una proteína) que no son el anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo se une covalentemente a la otra proteína en el extremo N del dominio constante.
55 Los anticuerpos incluyen análogos y derivados que están modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre y cuando dicha unión covalente permita que el anticuerpo retenga su inmunoespecificidad de unión a antígenos. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de los anticuerpos incluyen los que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etc. Se puede realizar cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. Además, el análogo derivado por contener uno o más aminoácidos no naturales.
65 Los anticuerpos incluyen anticuerpos que tienen modificaciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones) en restos de aminoácidos que interactúan con receptores Fc. En particular, los anticuerpos incluyen anticuerpos que tienen modificaciones en restos de aminoácidos que se identifican como implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, Publicación Internacional Nº WO 97/34631). Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa se pueden obtener en el mercado, por ejemplo, en Genentech (San Francisco, CA) o se pueden producir mediante cualquier método
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5 conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, técnicas de síntesis química o de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos y específicos para un antígeno de célula cancerosa se puede obtener, por ejemplo, a partir de la base de datos de GenBank o una base de datos similar a ésta, las publicaciones de bibliografía, o mediante clonación y secuenciación de rutina.
En un ejemplo específico, se pueden usar anticuerpos conocidos para el tratamiento o prevención del cáncer. Se pueden obtener anticuerpos específicos para un antígeno de célula cancerosa en el mercado coproducir mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa se puede tener, por ejemplo, a partir de la base de datos de GenBank o una base de datos similar a ésta, las 15 publicaciones de bibliografía, o mediante clonación y secuenciación de rutina. Ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado, HERCEPTIN® (trastuzumab; Genentech) para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico; RITUXAN® (rituximab; Genentech) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin; OvaRex (AltaRex Corporation, MA) que es un anticuerpo de murino para el tratamiento de cáncer de ovarios; Panorex (Glaxo Wellcome, NC) que es un anticuerpo IgG a de murino para el tratamiento de cáncer colorrectal; Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimérico IgG anti-EGFR para el tratamiento de cánceres positivos para el factor de crecimiento epidérmico, tales como cáncer de cabeza y cuello; Vitaxin (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sarcoma; Campath I/H (Leukosite, MA) que es un anticuerpo IgGt humanizado para el tratamiento de leucemia linfocítica
25 crónica (CLL); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AML); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ) que es un anticuerpo IgG anti-CD22 humanizado para el tratamiento de linfoma no Hodgkin; Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no Hodgkin; Oncolym (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-Dr10 de murino radiomarcado para el tratamiento de linfoma no Hodgkin; Allomune (BioTransplant, CA) es un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o linfoma no Hodgkin; Avastin (Genentech, Inc., CA) que es un anticuerpo humanizado anti-VEGF para el tratamiento de cánceres de pulmón y colorrectales; Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA) que es un anticuerpo anti-CD22 para el tratamiento de linfoma no Hodgkin; y CEAcide (Immunomedics, NJ) que es un anticuerpo anti-CEA humanizado para el tratamiento de cáncer colorrectal.
35 Otros anticuerpos útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a los siguientes antígenos: CA125 (ovarios), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), alfa fetoproteína (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatasa alcalina placentaria (carcinomas), antígeno específico de próstata (próstata), fosfatasa ácida prostática (próstata), factor de crecimiento epidérmico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE4 (carcinomas), receptor de anti-transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cáncer de mama), CEA (colorrectal), gp100 (melanoma), MART1 (melanoma), PSA (próstata), IL-2 receptor (leucemia y linfomas de linfocitos T), CD20 (linfoma no Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiple), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas),
45 MPG (melanoma), y producto oncogenético Neu (carcinomas). Algunos anticuerpos útiles, específicos incluyen, pero no se limitan a, mAb BR96 (Trailo, P. A., Willner, D. Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellström, I., Hellström, K. E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261, 212-215), BR64 (Trailo, PA, Willner, D, Knipe, J., Henderson, A. J. Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., (Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K. E., y Hellstrom, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates" Cancer Research 1997, 57, 100-105, mAb frente al antígeno CD40, tales como mAb S2C6 (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., y Wahl, A. F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231), mAb frente al
55 antígeno CD70, tales como mAb 1F6 y mAb 2F2, y mAb frente al antígeno CD30, tales como AC10 (Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., y Podack, E. R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol., 151, 5896-5906, 1993: Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62 (13): 3736-42). Se pueden usar otros muchos anticuerpos de internalización que se unen a antígenos asociados a tumores y se han revisado (Franke, A. E., Sievers, E. L., y Scheinberg, D. A., "Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leucemia: a review" Cancer Biother Radiopharm. 2000,15, 459-76; Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64-70; Breitling, F., y Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, y Sons, Nueva York, 1998).
En ciertos ejemplos, el anticuerpo no es Trastuzumab (anti-HER2 humanizado, de longitud total, (PM 145167)),
65 Herceptina F(ab’)2 (derivado de anti-HER2 enzimáticamente (PM 100000)), 4D5 (antiHER2 de murino, de longitud total, de hibridoma), rhu4D5 (anticuerpo humanizado de longitud total, expresado de forma transitoria), rhuFab4D5 (Fab humanizado recombinante (PM 47738)), 4D5Fc8 (antiHER2 de murino, de longitud total, con dominio de unión a FcRn mutado), o Hg (4D5 humanizado de longitud total "sin bisagra", con cisteínas bisagra de cadena pesada mutadas a serinas. Expresadas en E. coli (por lo tanto no glicosiladas)). En otro ejemplo específico, se usan anticuerpos conocidos para el tratamiento de la prevención de una enfermedad
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5 autoinmune de acuerdo con las composiciones y métodos de la invención. Anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de una célula que es responsable de la producción de anticuerpos autoinmunes se pueden obtener a partir de cualquier organización (por ejemplo, una universidad científica o una empresa) o reducir mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, técnicas de síntesis química o de expresión recombinante. En otra realización, los anticuerpos útiles son inmunoespecíficos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e incluyen, pero no se limitan a, Anticuerpo Anti-Nuclear; ADN Anti-ds; ADN Anti-ss, Anticuerpo IgM Anti-Cardiolipina, IgG; Anticuerpo IgM Anti-Fosfolípido, IgG; Anticuerpo Anti-SM; Anticuerpo Anti-Mitocondrial; Anticuerpo Tiroideo; Anticuerpo Microsómico; Anticuerpo Tiroglobulina; Anti-SCL-70; Anti-Jo; Anti-U1RNP; Anti-La/SSB; Anti SSA; Anti-SSB; Anticuerpo de Células Anti-Parietales; Anti-Histonas; Anti-RNP; C-ANCA; P-ANCA; Anti centrómero; Anti-Fibrilarina, y Anticuerpo Anti-GBM.
15 En ciertos casos, los anticuerpos útiles se pueden unir tanto a un receptor como un complejo receptor expresado en un linfocito activado. El receptor el complejo receptor puede comprender un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, un miembro de la superfamilia receptores TNF, una integrina, un receptor de citoquinas, un receptor quimioquinas, una proteína de histocompatibilidad principal, una lectina, o una proteína de control de complementos. Los ejemplos no limitantes de miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas adecuados son CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, e ICOS. Ejemplos no limitantes de miembros de la superfamilia de receptores TNF son CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, y APO-3. Ejemplos no limitantes de integrinas adecuadas son CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b,
25 CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103, y CD104. Ejemplos no limitantes de lectinas adecuada son lectina de tipo C, de tipo S, y de tipo 1.
En un ejemplo, el Ligando se une a un linfocito activado que está asociado con una enfermedad autoinmune.
En otro ejemplo específico, los Ligandos inmunoespecíficos útiles para un antígeno viral o microbiano son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno viral" incluye, pero no se limita a, cualquier péptido viral, proteína polipeptídica (por ejemplo, VIH gp120, VIH nef, glicoproteína RSV F, virus de la gripe neuraminidasa, hemaglutinina del virus de la gripe, HTLV tax, glicoproteína del virus del herpes simplex (por
35 ejemplo, gB, gC, gD, y gE) y antígeno de superficie de hepatitis B) que es capaz de provocar una respuesta inmune. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno microbiano" incluye pero no se limita a, cualquier péptido microbiano, polipéptido, proteína, sacárido, polisacárido, o molécula de lípido (por ejemplo, un polipéptido bacteriano, fúngico, protozoo patógeno, o levadura que incluye, por ejemplo 
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un agente viral o microbiano se pueden obtener en el mercado, por ejemplo, en BD Biosciences (San Francisco, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), o Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) o producir mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal y como, por ejemplo, técnicas de síntesis química o de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que
45 codifica anticuerpos que son inmunoespecíficos para un agente viral o microbiano se puede obtener, por ejemplo, a partir de la base de datos de GenBank o una base de datos similar a ésta, publicaciones de bibliografía, o mediante clonación y secuenciación de rutina. En un ejemplo específico, algunos Ligandos útiles son los que son útiles para el tratamiento con la prevención de una infección vírica o microbiana de acuerdo con los métodos que se desvelan en el presente documento. Ejemplos de anticuerpos disponibles útiles para el tratamiento de sección vírica o infección bacteriana incluyen, pero no se limitan a, SYNAGIS (Medlmmune, Inc., MD) que es un anticuerpo monoclonal de virus sincitial anti-respiratorio humanizado (RSV) útil para el tratamiento de pacientes con infección por RSV; PRO542 (Progenies) que es un anticuerpo de fusión de CD4 útil para el tratamiento de infección por VIH; OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo humano útil para el tratamiento de virus de la hepatitis B; PROTOVIR (Protein Design Labs,
55 Inc., CA) que es un anticuerpo IgG1 humanizado útil para el tratamiento de citomegalovirus (CMV); y anticuerpos anti-LPS.
Otros anticuerpos útiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a los antígenos de cepas patogénicas de bacterias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococc aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hidrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium,
65 Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); hongos patógenos (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoa (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma
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5 rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); o Helmintos (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, y anquilostomas).
10 Otros anticuerpos para el tratamiento de enfermedades víricas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a antígenos del virus patógenos, que incluyen como ejemplos y no como limitación: Poxviridae, Herpesviridae, virus 1 del Herpes Simplex, virus 2 del Herpes Simplex, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, virus de la gripe, virus de parainfluenza, paperas, sarampión, virus sincitial respiratorio, rubéola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis B, virus
15 de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis E, virus de la Hepatitis No A/No B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, y Virus de Inmunodeficiencia Humana.
En intentos para descubrir dianas celulares eficaces para diagnósticos y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana o asociados de otro modo a tumores que se expresan 20 específicamente en la superficie de uno o más tipos de cáncer en particular en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados a tumores se expresan más abundantemente la superficie de las células cancerosas en comparación con la expresión en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de dichos polipéptidos antigénicos de superficie celular asociada a tumores ha dado lugar a la capacidad de dirigir específicamente células cancerosas para destrucción través de terapias basadas en
25 anticuerpos.
Los anticuerpos que comprenden Ab en conjugados de anticuerpo y fármaco de Fórmula Ic (ADC) y que pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a antígenos asociados a tumores (TAA). Dichos antígenos asociados a tumores son conocidos en la técnica, y se pueden preparar para su uso en la 30 generación de anticuerpos usando métodos e información que son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de TAA incluyen (1)-(35), pero no se limitan a TAA (1)-(35) que se indican a continuación. Por conveniencia, la información con respecto a estos antígenos, todos los cuales son conocidos en la técnica, se enumeran a continuación e incluye nombres, nombres alternativos, números de acceso en Genbank y referencia o referencias primarias. Los antígenos asociados a tumores dirigidos por anticuerpos incluyen todas las variantes secuencias de aminoácidos que 35 isoformas que poseen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, o un 95 % con respecto a las secuencias identificadas en las correspondientes secuencias enumeradas (SEC ID Nºs: 1-35) o las secuencias identificadas en las referencias citadas. En algunos ejemplos, TAA que tiene variantes de secuencia de aminoácidos es capaz de unirse específicamente un anticuerpo que se une específicamente a los TAA con la correspondiente secuencia enumerada. Las secuencias y divulgación mencionadas específicamente en el
40 presente documento se incorporan expresamente por referencia.
ANTÍGENOS ASOCIADOS A TUMORES (1)-(35):
BMPR1B (receptor de proteína morfogenética ósea de tipo IB, Nº de acceso en Genbank NM_001203, ten
45 Dijke,P., et al. Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11): 1377-1382 (1997)); documento WO2004063362 (Reivindicación 2); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); US2003134790-A1 (Páginas 38-39); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 296); documento WO2003055443 (Páginas 91-92); documento WO200299122 (Ejemplo 2; Páginas 528-530); documento WO2003029421 (Reivindicación 6); documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 112); documento WO200298358
50 (Reivindicación 1; Página 183); documento WO200254940 (Páginas 100-101); documento WO200259377 (Páginas 349-350); documento WO200230268 (Reivindicación 27; Página 376); documento WO200148204 (Ejemplo; Fig 4) receptor de proteína morfogenética ósea NP_001194, tipo IB /pid = NP_001194.1 – Referencias cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; M_001203_1 502 aa
55
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(2) E16 (LAT1, SLC7A5, Nº de acceso en Genbank NM_003486); Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699): 288-291 (1998), Gaugitsch,H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 5 11267-11273); documento WO2004048938 (Ejemplo 2); documento WO2004032842 (Ejemplo IV); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200278524 (Ejemplo 2); documento WO200299074 (Reivindicación 19; Páginas 127-129); documento WO200286443 (Reivindicación 27; Páginas 222,393); documento WO2003003906 (Reivindicación 10; Página 293); documento WO200264798 (Reivindicación 33; Página 93-95); documento WO200014228 (Reivindicación 5; Páginas 133
10 136); US2003224454 (Fig 3); documento WO2003025138 (Reivindicación 12; Página 150); familia 7 de vehículos de soluto NP_003477 (transportador catiónico de aminoácidos, sistema y+), miembro 5 /pid = NP_003477.3 – Referencias cruzadas de Homo sapiens: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1 507 aa
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(3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata, Nº de acceso en Genbank NM_012449 Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (25): 14523
20 14528); documento WO2004065577 (Reivindicación 6); documento WO2004027049 (Fig 1L); documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento WO2004016225 (Reivindicación 2); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); US2003157089 (Ejemplo 5); US2003185830 (Ejemplo 5); US2003064397 (Fig 2); documento WO200289747 (Ejemplo 5; Páginas 618-619); documento WO2003022995
25 (Ejemplo 9; Fig 13A, Ejemplo 53; Páginas 173, Ejemplo 2; Fig 2A); antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata NP_036581 Referencias cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1 339 aa
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(4)
0772P (CA125, MUC16, Nº de acceso en Genbank AF361486
J.
Biol. Chem. 276 (29): 27371-27375 (2001)); documento WO2004045553 (Reivindicación 14); documento
5 WO200292836 (Reivindicación 6; Fig 12); documento WO200283866 (Reivindicación 15; Páginas 116-121); documento US2003124140 (Ejemplo 16); documento US2003091580 (Reivindicación 6); documento WO200206317 (Reivindicación 6; Páginas 400-408); Referencias cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1 6995 aa
10
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(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina, Nº de acceso en Genbank NM_005823 Yamaguchi,N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (20):
5 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1): 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37): 21984-21990 (1995)); documento WO2003101283 (Reivindicación 14); (documento WO2002102235 (Reivindicación 13; Páginas 287-288); documento WO2002101075 (Reivindicación 4; Páginas 308-309); documento WO200271928 (Páginas 320-321); documento WO9410312 (Páginas 52-57); Referencias cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
10 622 aa
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(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato sódico), miembro 2, 15 transportador de fosfato dependiente de sodio de tipo II 3b, Nº de acceso en Genbank NM_006424,
J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002), Genomics 62 (2): 281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3): 578-582); documento WO2004022778 (Reivindicación 2); documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 326); documento EP875569 (Reivindicación 1; Páginas 17-19); documento WO200157188 (Reivindicación 20; Página 329); documento
20 WO2004032842 (Ejemplo IV); documento WO200175177 (Reivindicación 24; Páginas 139-140); Referencias cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1 690 aa (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B, Nº de acceso en Genbank AB040878, Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); documento WO2004000997 (Reivindicación 1); documento
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5 WO2003003984 (Reivindicación 1); documento WO200206339 (Reivindicación 1; Página 50); documento WO200188133 (Reivindicación 1; Páginas 41-43, 48-58); documento WO2003054152 (Reivindicación 20); documento WO2003101400 (Reivindicación 11); Accession: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737; 1093 aa
10
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(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gen RIKEN cADN2700050C12, Nº de acceso en Genbank AY358628); US2003129192 (Reivindicación 2); US2004044180 (Reivindicación 12);
15 US2004044179 (Reivindicación 11); US2003096961 (Reivindicación 11); US2003232056 (Ejemplo 5); documento WO2003105758 (Reivindicación 12); US2003206918 (Ejemplo 5); EP1347046 (Reivindicación 1); documento WO2003025148 (Reivindicación 20); Referencias cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1 141 aa
20
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(9) ETBR (Receptor de endotelina de tipo B, Nº de acceso en Genbank AY275463); Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470,
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1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 5 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.documento W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al. Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.documento W., et al. Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. 10 Genet. 111, 198-206; documento WO2004045516 (Reivindicación 1); documento WO2004048938 (Ejemplo 2); documento WO2004040000 (Reivindicación 151); documento WO2003087768 (Reivindicación 1); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200261087 (Fig 1); documento WO2003016494 (Fig 6); documento WO2003025138 (Reivindicación 12; Página 144); documento WO200198351 (Reivindicación 1; Páginas 124-125); EP522868 (Reivindicación 8; Fig 2); documento
15 WO200177172 (Reivindicación 1; Páginas 297-299); documento US2003109676; documento US6518404 (Fig 3); documento US5773223 (Reivindicación 1a; Col 31-34); documento WO2004001004; 442 aa
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(10)MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, Nº de acceso en Genbank NM_017763); documento WO2003104275 (Reivindicación 1); documento WO2004046342 (Ejemplo 2); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO2003083074 (Reivindicación 14; Página 61); documento WO2003018621 (Reivindicación 1); documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 93); documento WO200166689 (Ejemplo 6); Referencias cruzadas: ID de Locus:54894; NP_060233.2; NM_017763_1 783 aa (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de
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5 próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana, Nº de acceso en Genbank AF455138, Lab. Invest. 82 (11): 1573-1582 (2002)); documento WO2003087306; documento US2003064397 (Reivindicación 1; Fig 1); documento WO200272596 (Reivindicación 13; Páginas 54-55); documento WO200172962 (Reivindicación 1; Fig 4B); documento WO2003104270 (Reivindicación 11); documento WO2003104270 (Reivindicación 16); documento US2004005598 (Reivindicación 22); documento WO2003042661 (Reivindicación
10 12); documento US2003060612 (Reivindicación 12; Fig 10); documento WO200226822 (Reivindicación 23; Fig 2); documento WO200216429 (Reivindicación 12; Fig 10); Referencias cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1 490 aa
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(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4, Nº de acceso en Genbank NM_017636 Xu,X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (19): 10692-10697 (2001), Cell 109 (3): 397-407 (2002), J. Biol.
20 Chem. 278 (33): 30813-30820 (2003)); documento US2003143557 (Reivindicación 4); documento WO200040614 (Reivindicación 14; Páginas 100-103); documento WO200210382 (Reivindicación 1; Fig 9A); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO200230268 (Reivindicación 27; Página 391); documento US2003219806 (Reivindicación 4); documento WO200162794 (Reivindicación 14; Fig 1A-D); Referencias cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; N_017636_1
25 1214 aa (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, Nº de acceso en Genbank NP_003203 o NM_003212,
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5 Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3): 555-565 (1991)); documento US2003224411 (Reivindicación 1); documento WO2003083041 (Ejemplo 1); documento WO2003034984 (Reivindicación 12); documento WO200288170 (Reivindicación 2; Páginas 52-53); documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 58); documento WO200216413 (Reivindicación 1; Páginas 94-95, 105); documento WO200222808 (Reivindicación 2; Fig 1); documento US5854399 (Ejemplo 2; Col 17-18); documento US5792616
10 (Fig 2); Referencias cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1 188 aa
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15
(14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento2) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs.73792 Nº de acceso en Genbank M26004, Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4): 2118-2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031,
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5
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29, Nº de acceso en Genbank NM_000626 o 11038674, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2003) 100 (7): 4126-4131, Blood (2002) 100 (9): 30683076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625); documento WO2004016225 (reivindicación 2, Fig 140); documento WO2003087768, documento US2004101874 (reivindicación 1, página 102); documento
10 WO2003062401 (reivindicación 9); documento WO200278524 (Ejemplo 2); documento US2002150573 (reivindicación 5, página 15); US5644033; documento WO2003048202 (reivindicación 1, páginas 306 y 309); documento WO 99/558658, documento US6534482 (reivindicación 13, Fig 17A/B); documento WO200055351 (reivindicación 11, páginas 1145-1146); Referencias cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
15 229 aa
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(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína de anclaje 1a de fosfatasa que contiene el dominio SH2),
20 SPAP1B, SPAP1C, Nº de acceso en Genbank NM_030764, Genome Res. 13 (10): 2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2): 87-95 (2002), Blood 99 (8): 2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (17): 9772-9777 (2001), Xu,M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3): 768-775; documento WO2004016225 (Reivindicación 2); documento WO2003077836; documento WO200138490 (Reivindicación 5; Fig 18D-1-18D-2);
25 documento WO2003097803 (Reivindicación 12); documento WO2003089624 (Reivindicación 25); Referencias cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1 508 aa
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(16) HER2 (ErbB2, Nº de acceso en Genbank M11730, Coussens L., et al. Science (1985) 230 (4730): 11321139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 64975 6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 3642236427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429; documento WO2004048938 (Ejemplo 2); documento WO2004027049 (Fig 1I); documento WO2004009622; documento WO2003081210; documento WO2003089904 (Reivindicación 9); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento US2003118592; documento WO2003008537 (Reivindicación 1); documento 10 WO2003055439 (Reivindicación 29; Fig 1A-B); documento WO2003025228 (Reivindicación 37; Fig 5C); documento WO200222636 (Ejemplo 13; Páginas 95-107); documento WO200212341 (Reivindicación 68; Fig 7); documento WO200213847 (Páginas 71-74); documento WO200214503 (Páginas 114-117); documento WO200153463 (Reivindicación 2; Páginas 41-46); documento WO200141787 (Páginas 15); documento WO200044899 (Reivindicación 52; Fig 7); documento WO200020579 (Reivindicación 3; Fig 2); documento
15 US5869445 (Reivindicación 3; Col 31-38); documento WO9630514 (Reivindicación 2; Páginas 56-61); EP1439393 (Reivindicación 7); documento WO2004043361 (Reivindicación 7); documento WO2004022709; documento WO200100244 (Ejemplo 3; Fig 4); Acceso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1. 1255 aa
20
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(18) NCA (CEACAM6, Nº de acceso en Genbank M18728); Barnett T., etal Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988;
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10 344 aa
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(19) MDP (DPEP1, Nº de acceso en Genbank BC017023,
15 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (26): 16899-16903 (2002)); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200264798 (Reivindicación 33; Páginas 85-87); documento JP05003790 (Fig 6-8); documento WO9946284 (Fig 9); Referencias cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1 411 aa
20
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(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, Nº de acceso en Genbank AF184971); Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg
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10 WO200146261 (Páginas 57-59); documento WO200146232 (Páginas 63-65); documento WO9837193 (Reivindicación 1; Páginas 55-59); Acceso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1. 553 aa
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(21) Brevican (BCAN, BEHAB, Nº de acceso en Genbank AF229053) Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899-16903, 2002; documento US2003186372 (Reivindicación 11);
20 documento US2003186373 (Reivindicación 11); documento US2003119131 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119122 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119126 (Reivindicación 1); documento US2003119121 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119129 (Reivindicación 1); documento US2003119130 (Reivindicación 1); documento US2003119128 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119125 (Reivindicación 1); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200202634
25 (Reivindicación 1); 911 aa (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Nº de acceso en Genbank NM_004442) Chan, J. y Watt,V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5): 897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21: 309-345 (1998),
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5 Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000)); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO200053216 (Reivindicación 1; Página 41); documento WO2004065576 (Reivindicación 1); documento WO2004020583 (Reivindicación 9); documento WO2003004529 (Páginas 128-132); documento WO200053216 (Reivindicación 1; Página 42); Referencias cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
10 987 aa
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(23) ASLG659 (B7h, Nº de acceso en Genbank AX092328) documento US20040101899 (Reivindicación 2); documento WO2003104399 (Reivindicación 11); documento WO2004000221 (Fig 3); documento US2003165504 (Reivindicación 1); documento US2003124140 (Ejemplo 2); documento US2003065143 (Fig 60); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 299); documento
5 US2003091580 (Ejemplo 2); documento WO200210187 (Reivindicación 6; Fig 10); documento WO200194641 (Reivindicación 12; Fig 7b); documento WO200202624 (Reivindicación 13; Fig 1A-1B); documento US2002034749 (Reivindicación 54; Páginas 45-46); documento WO200206317 (Ejemplo 2; Páginas 320-321, Reivindicación 34; Páginas 321-322); documento WO200271928 (Páginas 468-469); documento WO200202587 (Ejemplo 1; Fig 1); documento WO200140269 (Ejemplo 3; Paginas 190-192); documento WO200036107
10 (Ejemplo 2; Páginas 205-207); documento WO2004053079 (Reivindicación 12); documento WO2003004989 (Reivindicación 1); documento WO200271928 (Páginas 233-234,452-453); documento WO 0116318; 282 aa
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15
(24) PSCA (Percusor antigénico de células madre prostáticas, Nº de acceso en Genbank AJ297436) Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3): 783-788; documento WO2004022709; documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento US2004018553 (Reivindicación 17); documento WO2003008537 (Reivindicación 1); documento
20 WO200281646 (Reivindicación 1; Página 164); documento WO2003003906 (Reivindicación 10; Página 288); documento WO200140309 (Ejemplo 1; Fig 17); documento US2001055751 (Ejemplo 1; Fig 1b); documento WO200032752 (Reivindicación 18; Fig 1); documento WO9851805 (Reivindicación 17; Página 97); documento WO9851824 (Reivindicación 10; Página 94); documento WO9840403 (Reivindicación 2; Fig 1B); Acceso: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
25 123 aa
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(25) GEDA (Nº de acceso en Genbank AY260763);
30 AAP14954 proteína de tipo pareja de fusión de lipoma de hmgic /pid = AAP14954.1 - Homo sapiens Especie: Homo sapiens (humano) documento WO2003054152 (Reivindicación 20); documento WO2003000842 (Reivindicación 1); documento WO2003023013 (Ejemplo 3, Reivindicación 20); documento US2003194704 (Reivindicación 45);
35 Referencias cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1 236 aa
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(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor 3 de BLyS, BR3, Nº de acceso en Genbank NP_443177.1); NP_443177 BAFF receptor/pid=NP_443177.1 -Homo sapiens Thompson,J.S., et al.
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Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); documento WO2004058309; documento W02004011611; documento WO2003045422 (Ejemplo; Páginas 32-33); documento WO2003014294 (Reivindicación 35; Fig 6B); documento WO2003035846 (Reivindicación 70; Páginas 615-616); documento WO200294852 (Col 136-137); documento WO200238766 (Reivindicación 3; Página 133); documento WO200224909 (Ejemplo 3; Fig 3); Referencias cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1 184 aa
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10 (27) CD22 (isoforma CD22-B de receptores de linfocitos B, Nº de acceso en Genbank NP-001762.1); Stamenkovic,I. y Seed, B., Nature 345 (6270), 74-77 (1990); documento US2003157113; documento US2003118592; documento WO2003062401 (Reivindicación 9); documento WO2003072036 (Reivindicación 1; Fig 1); documento WO200278524 (Ejemplo 2); Referencias cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
15 847 aa
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(28) CD79a (CD79A, CD79α, asociado a inmunoglobulina alfa, una proteína específica de linfocitos B que
20 interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie de moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mpggpgv...dvqlekp (1..226; 226 aa), pI: 4.84, PM: 25028 TM: 2 [P] Gen Cromosoma: 19q13.2, Nº de acceso en Genbank NP_001774.1; documento WO2003088808, documento US20030228319; documento WO2003062401 (reivindicación 9);
25 documento US2002150573 (reivindicación 4, páginas 13-14); documento WO9958658 (reivindicación 13, Fig 16); documento WO9207574 (Fig 1); documento US5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148 (5): 1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40( 4): 287-295; Preud’homme e al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148 (2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7 (11): 3457-3464;
30 226 aa (29) CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la proteína G que se activa con la quimioquina CXCL13, funciona en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, desempeña un papel en la
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5 infección por VIH-2 y quizá en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mnyplt1...atslttf (1..372; 372 aa), pI: 8.54 PM: 41959 TM: 7 [P] Gen Cromosoma: 11q23.3, Nº de acceso en Genbank NP_001707.1; documento WO2004040000; documento WO2004015426; documento US2003105292 (Ejemplo 2); documento US6555339 (Ejemplo 2); documento WO200261087 (Fig 1); documento WO200157188 (Reivindicación 20,
10 páginas 269); documento WO200172830 (página 12-13); documento WO200022129 (Ejemplo 1, páginas 152153, Ejemplo 2, páginas 254-256); documento WO9928468 (reivindicación 1, página 38); documento US5440021 (Ejemplo 2, col 49-52); documento WO9428931 (páginas 56-58); documento WO9217497 (reivindicación 7, Fig 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779; 372 aa
15
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(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mgsgwvp...vllpqsc (1..273; 273 aa, pI: 6.56 PM:
20 30820 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 6p21.3, Nº de acceso en Genbank NP_002111.1; Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4 (11): 2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29 (6): 411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228: 433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255: 1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59: 512-519; documento WO9958658 (reivindicación 13, Fig 15); documento US6153408
25 (Col 35-38); documento US5976551 (col 168-170); documento US6011146 (col 145-146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30 (1): 66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 (26): 14111-14119; 273 aa
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30
(31) P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X, un canal aniónico abierto por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión y en la neurogénesis sináptica, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de inestabilidad) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mgqagck...lephrst (1..422; 422 aa), pI: 7.63, PM: 47206 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 17p13.3, Nº de acceso en Genbank NP_002552.2;
35 Le et al. (1997) FEBS Lett. 418 (1-2): 195-199; documento WO2004047749; documento WO2003072035 (reivindicación 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10: 165-173; documento WO200222660 (reivindicación 20); documento WO2003093444 (reivindicación 1); documento WO2003087768 (reivindicación 1); documento WO2003029277 (página 82); 422 aa
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(33)CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B , Lyb-2) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8.66, PM: 40225 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 9p13.3, Nº de acceso en
10 Genbank NP_001773.1; documento WO2004042346 (reivindicación 65); documento WO2003026493 (páginas 51-52, 57-58); documento WO200075655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144 (12): 4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; 359 aa
15
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(33) LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR), regula la activación y apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función está asociada con mayor 20 actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mafdvsc...rwkyqhi (1..661; 661 aa), pI: 6.20, PM: 74147 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 5q12, Nº de acceso en Genbank NP_005573.1; documento US2002193567; documento WO9707198 (reivindicación 11, páginas 39-42); Miura et al. (1996) Genomics 3 (3): 299-304; Miura et al. (1998) Blood 92: 2815-2822; documento WO2003083047; documento WO9744452 (reivindicación 8, páginas 57-61); documento W0200012130 (páginas
25 24-26); 661 aa (34) FCRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc,1 supuesto receptor para el dominio Fc de la inmunoglobulina que contiene los dominios similar a Ig de tipo C2 e TTAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B)
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5 SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mlprlll...vdyedam (1..429; 429 aa), pI: 5.28, PM: 46925 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 1q21-1q22, Nº de acceso en Genbank NP_ 443170.1; documento WO2003077836; documento WO200138490 (reivindicación 6, Fig 18E-1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (17): 9772-9777; documento WO2003089624 (reivindicación 8); documento EP1347046 (reivindicación 1); documento WO2003089624 (reivindicación 7);
10 429 aa
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15 (35) IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B) SECUENCIA DE PROTEÍNA Total mllwvil...assaphr (1..977; 977 aa), pI: 6.88 PM: 106468 TM: 1 [P] Gen Cromosoma: 1q21, Nº de acceso en Genbank NP_112571.1; documento WO2003024392 (reivindicación 2, Fig 97); Nakayama et al. (2000) Biochem.
20 Biophys. Res. Commun. 277 (1): 124-127; documento WO2003077836; documento WO200138490 (reivindicación 3, Fig 18B-1-18B-2); 977 aa Véase también: documento WO04/045516 (03 Jun 2004); documento WO03/000113 (03 Ene 2003); documento WO02/016429 (28 Feb 2002); documento WO02/16581 (28 Feb 2002); documento WO03/024392 (27 Mar 2003); documento WO04/016225 (26 Feb 2004); documento WO01/40309 (07 Jun 2001), y solicitud de patente Provisional de Estados Unidos con Nº de Serie 60/520842 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGIN", presentada el 17 Nov 2003.
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En un ejemplo, el Conjugado de Ligando-Conector-Fármaco tiene la Fórmula IIIa, en la que el Ligando es un anticuerpo Ab que incluye uno que se une a al menos un antígeno de CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 0, y = 0, y D tiene la Fórmula Ib. Conjugados a Modo de ejemplo de Fórmula IIIa incluyen aquéllos en los que R17 es -(CH2)5-. Además, se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que D tiene la estructura del Compuesto 2 en el Ejemplo 3 y ésteres del mismo. Además, se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa que contienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, en un aspecto, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 restos de Fármaco D, es decir, los Conjugados de Fórmula Ia en la que p es un valor en el intervalo de aproximadamente 3-8, por ejemplo aproximadamente 3-5. También se describen conjugados que contienen combinaciones de las características estructurales que se indican en este párrafo.
En otro ejemplo, el Conjugado de Ligando-Conector-Fármaco tiene la Fórmula IIIa, en la que el Ligando es un Anticuerpo Ab que se une a un antígeno de CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 1, y = 0, y D tiene la Fórmula Ib. Se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que R17 es -(CH2)5-. Además, se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que W es -Val-Cit-, y/o en la que D tiene la estructura del Compuesto 2 en el Ejemplo 3 y ésteres del mismo. Además, se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa que contienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 restos de Fármaco D, es decir, Conjugados de Fórmula Ia en la que p es un valor en el intervalo de aproximadamente 3-8, preferentemente de aproximadamente 3-5. Los Conjugados que contienen combinaciones de las características estructurales que se indican en este párrafo también son a modo de ejemplo.
En un ejemplo, el Conjugado de Ligando-Conector-Fármaco tiene la Fórmula IIIa, en la que el Ligando es un Anticuerpo Ab que se une a un antígeno de CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 1, y = 1, y D tiene la Fórmula Ib. Se incluyen los Conjugados de Fórmula IIIa en la que R17 es -(CH2)5-. Además, se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que: W es -Val-Cit-; Y has Fórmula X; D tiene la estructura del Compuesto 2 en el Ejemplo 3 y ésteres del mismo; p es de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 restos de Fármaco D. También se contemplan conjugados que contienen combinaciones de las características estructurales que se indican en este párrafo.
Un ejemplo adicional es un conjugado de anticuerpo fármaco (ADC), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Ab es un anticuerpo que se une a uno de los antígenos asociados a tumores (1)-(35) que se han indicado anteriormente (el "Compuesto TAA").
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Otro ejemplo es el Compuesto TAA o sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo que está en forma aislada y purificada.
También se describe un método para eliminar o inhibir la multiplicación de una célula tumoral o célula cancerosa que comprende administrar a un paciente, por ejemplo un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad del Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para eliminar o inhibir la multiplicación de una célula tumoral o una célula cancerosa.
También se describe un método para tratar cáncer que comprende administrar a un paciente, por ejemplo un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad del Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para tratar cáncer, solo o junto con una cantidad eficaz de un agente anticáncer adicional.
También se describe un método para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un paciente, por ejemplo un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad del Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para tratar una enfermedad autoinmune.
Los anticuerpos adecuados para su uso en la invención se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferentemente mediante técnicas de expresión recombinante.
4.5.1 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES
Los anticuerpos se pueden producir usando cualquier método conocido en la técnica por ser útil para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmento, derivado o análogo de los mismos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo se pueden ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, tal como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242), que implica la síntesis de oligonucleótidos de solapamiento que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligadura de esos oligonucleótidos, y a continuación amplificación de los oligonucleótidos ligados, por ejemplo, por PCR.
Como alternativa, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo se puede generar a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el anticuerpo en particular no está disponible, pero se conoce la secuencia del anticuerpo, se puede obtener un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de cADN de anticuerpos, o una biblioteca de cADN generada a partir de cualquier tejido o células que expresan la inmunoglobulina) mediante, por ejemplo, amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que se pueden hibridar en los extremos 3’ y 5’ de la secuencia mediante clonación usando una secuencia de oligonucleótidos específica para la secuencia genética en particular.
Si un anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno en particular no está disponible en el mercado (o una fuente para una biblioteca de cADN para clonar un ácido nucleico que codifica dicha inmunoglobulina), los anticuerpos específicos para un antígeno en particular se pueden generar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por inmunización de un paciente, o modelo animal adecuado tal como conejo o ratón, para generar anticuerpos policlonales o, más preferentemente, mediante generación de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, tal como se describe en Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) o, tal como se describe en Kozbor et al. (1983, Immunology Today 4:72) o Cole et al. (1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Como alternativa, se puede obtener un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo por cribado de bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, tal como se describe en Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para clones de fragmentos de Fab que se unen al antígeno específico o mediante cribado de bibliotecas de anticuerpos (Véase, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937).
Una vez que se obtiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifican al menos el dominio variable del anticuerpo, se puede introducir en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica las regiones constantes del anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicación Internacional Nº WO 86/05807; documento WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos Nº 5122464). Están disponibles vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa que permite la expresión de una molécula completa de anticuerpo. A continuación, se puede usar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo para introducir las sustituciones o supresiones de nucleótidos necesarias para sustituir (o suprimir) el uno o más restos de cisteína de la región variable que participan en una unión disulfuro intracadena con un resto de aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Dichas modificaciones se pueden realizar mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o supresiones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero no se limitan a, mutagénesis química y mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551).
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Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature
314: 452-454) mediante empalme de genes a partir del molécula de anticuerpos de ratón de una especificidad a antígenos apropiada junto con genes a partir de una molécula de anticuerpo humano y actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Como alternativa, técnicas que se describen para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente de Estados Unidos Nº 4.694.778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena. Los anticuerpos de una sola cadena se forman por unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de una sola cadena. Además, se pueden usar técnicas para el ensamblaje de fragmentos funcionales de Fv en E. coli (Skerra et al., 1988, Science
242: 1038-1041).
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a los fragmentos de F(ab’)2 que se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos de Fab que se pueden generar por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos de F(ab’)2.
Una vez que se ha obtenido una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la materia. Se pueden usar métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican el anticuerpo y señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas que se describen en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo o la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo se puede transferir a una célula huésped mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal, y precipitación con fosfato de calcio), y las células transfectadas se cultivan a continuación mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo. En realizaciones específicas, la expresión del anticuerpo se regula mediante un promotor específico constitutivo, inducible o un tejido.
Las células huésped usadas para expresar el anticuerpo recombinante pueden ser células bacterianas tales como Escherichia coli, o, preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina recombinante. En particular, células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunto con un vector tal como el elemento promotor genético primitivo intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para inmunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
Diversos sistemas de vectores de expresión en huésped se puede usar para expresar los anticuerpos de inmunoglobulina. Dichos sistemas de expresión en huésped representan vehículos mediante los cuales se pueden producir las secuencias de codificación del anticuerpo y purificar posteriormente, pero también representan células que, cuando se transforma o se transfectan con la secuencia de codificación de nucleótidos apropiada, expresan una molécula de inmunoglobulina de anticuerpo in situ. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B.  ) transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN cósmido que contiene secuencias de codificación de inmunoglobulina; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; sistemas celulares de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de inmunoglobulina; sistemas celulares vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; o sistemas celulares de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus de vaccinia).
En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión se puede seleccionar ventajosamente dependiendo del uso pretendido para el anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, podrían ser deseables vectores que dirigen la expresión de niveles altos de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector pUR278 de expresión de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo se puede librar individualmente en el vector en marco con la región de codificación lac Z de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. Además, se pueden usar Vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas por adsorpción y unión a una matriz de perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de proteasa de trombina o factor Xa de modo que el producto genético diana clonado se puede liberar del resto de GST.
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En un sistema de insecto, el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) o el virus análogo de Drosophila Melanogaster se usa como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica anticuerpos se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocar bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina).
En células huésped de mamífero, se puede usar un número de sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia que codifica anticuerpos de interés se puede ligar un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia directora tripartita. Este gen quimérico se puede insertar a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) da como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359). Además como señales de iniciación específicas pueden ser necesarias para una traducción eficaz de secuencias de codificación de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales exógenas de control de traducción y codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión se puede potenciar con la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminado desde transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
Además, se puede elegir una cepa de célula huésped para modular la expresión de las secuencias insertadas, o modificar y procesar el producto genético en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteícos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación después de la traducción de productos proteicos y genéticos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas de huésped apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación, y fosforilación del producto genético. Dichas células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para producción de proteínas recombinantes con alto rendimiento, a largo plazo, es precedente la expresión estable. Por ejemplo, se puede modificar genéticamente líneas celulares que expresan de forma estable un anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, se pueden transformar células huésped con ADN controlado mediante elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminado desde la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador que se puede seleccionar. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que células modificadas genéticamente crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se intercambian a un medio selectivo. El marcador que se puede seleccionar en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede usar ventajosamente para modificar genéticamente líneas celulares que expresan el anticuerpo. Dichas líneas celulares modificadas genéticamente pueden ser particularmente útiles en el cribado y evaluación de antígenos tumorales que interactúan directa o indirectamente con el anticuerpo.
Se puede usar un número de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817), se pueden usar genes en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, se puede usar resistencia antimetabolitos como la base de selección para los siguientes genes: DHFR, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3: 8795; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215) e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Los métodos conocidos normalmente en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1).
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Los niveles de expresión de un anticuerpo se pueden elevar por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo se puede amplificar, un aumento en el nivel de inhibir el presente en cultivo de células huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada se asocia con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped se puede cotransfectar con dos vectores de expresión, el primer vector que codifica una cadena pesada derivada de polipéptidos y el segundo vector que codifica una cadena ligera derivada de polipéptidos. Los dos lectores pueden contener marcadores idénticos que se pueden seleccionar que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, se puede usar un solo vector que codifique polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera se debería colocar antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada sin tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender cADN o ADN genómico.
Una vez que el anticuerpo se ha expresado de forma recombinante, se puede purificar usando cualquier método conocido en la técnica a la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de Proteína A, y cromatografía de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.
En cualquier caso, los anticuerpos híbridos tienen una especificidad doble, preferentemente con uno o más sitios de unión específicos para el hapteno de elección o uno o más sitios de unión específicos para un o antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado con un tumor, una enfermedad autoinmune, un organismo infeccioso, u otro estado de enfermedad.
4.5.2 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
La producción de anticuerpos se ilustrará con referencia a anticuerpos anti-CD30 pero será evidente para los expertos en la materia que se pueden producir anticuerpos para otros miembros de la familia de receptores la TNF y modificar de una manera similar. El uso de CD30 para la producción de anticuerpos se hace solamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitante.
El antígeno CD30 a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de CD30 o una porción del mismo, que contiene el epítopo deseado. Como alternativa, las células que expresan CD30 en su superficie celular (por ejemplo, L540 (línea celular derivada de linfoma Hodgkin con un fenotipo de linfocitos T) y L428 (línea celular derivada de linfoma Hodgkin con un fenotipo de linfocitos B)) se pueden usar para generar anticuerpos. Otras formas de CD30 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia.
En otro ejemplo, el antígeno ErbB2 a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una porción del mismo, que contiene el epítopo deseado. Como alternativa, las células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo, células NIH-3T3 transformadas para que sobreexpresen ErbB2; o una línea celular de carcinoma tal como células SK-BR-3, véase Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8691-8695 (1991)) se pueden usar para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia.
(i) Anticuerpos Policlonales
Los anticuerpos policlonales aumentan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoíl sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
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Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados por combinación, por ejemplo, de 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la solución se inyecta por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se extrae sangre a los animales y el suero se somete al ensayo para título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta las mesetas del título. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden preparar en cultivo celular recombinante en forma de fusiones de proteínas. Además, agentes de agregación tales como alum se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmune.
(ii) Anticuerpos Monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos distintos.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el método del hibridoma que se describió primero en y Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se puede preparar mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos Nº 4816567).
En el método del hibridoma, un ratón otro modelo animal apropiado, tal como un hámster, se inmuniza tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento para hacer que los linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína se usen para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se funden con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma precursoras, sin fundir. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá por lo general hipoxantina, aminopterina, y timidinla (medio de HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferentes son las que se funden de forma eficaz, mantienen un nivel alto estable de producción de anticuerpos mediante las células seleccionadas que producen anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como medio de HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferentes son líneas de mieloma de murino, tales como las obtenidas a partir de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Mariland USA. Además, se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Los medios de cultivo en los que se cultivan células de hibridoma se someten a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, se puede determinar con el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y cultivar con métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero con procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía por afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped tales como células de cells, células COS de simios, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteínas de anticuerpos, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Artículos de revisión sobre expresión recombinantes en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
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Los anticuerpos monoclonales o fragmento de anticuerpos se pueden aislar a partir de fagotecas de anticuerpos generadas usando las técnicas que se describen en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y malos, respectivamente, usando fagotecas. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (de rango nM) human mediante redistribución de cadenas (Marks et al., Bio/technology, 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir fagotecas muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Además, el ADN puede modificar, por ejemplo, mediante sustitución de la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humanos en lugar de las secuencias de murino homólogas (Patente de Estados Unidos Nº 4816567; y Morrison, et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851), o mediante unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido de no inmunoglobulina.
Por lo general, dichos polipéptidos de no inmunoglobulina se sustituyen para los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen para los dominios variables de un sitio de combinación con antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con antígenos que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación con antígenos que tiene especificidad para un antígeno diferente.
(iii) Anticuerpos Humanizados
Un anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácido no humano a menudo se denominan restos "de importación", que por lo general se toman de un dominio variable "de importación". La humanización se puede realizar básicamente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,
332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), mediante sustitución de secuencias de la región hipervariable las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567) en los que básicamente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son por lo general anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y posiblemente algún resto de FR están sustituidos con restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usar en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se identifica sistemáticamente frente a toda la biblioteca de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana es la más cercana a la del roedor se acepta a continuación como la región marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chotia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método usa una región marco en particular obtenida a partir de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
Los anticuerpos se pueden humanizar con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Los anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursora y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están disponibles habitualmente son familiares para los expertos en la materia. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y presentan estructuras conformacionales en tres dimensiones probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias, receptora y de importación, de modo que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los restos de la región hipervariable están directamente y más básicamente implicados en la influenciación de la unión a antígenos.
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Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo de IgG1 intacto.
Los Ejemplos describen la producción de un anticuerpo anti-ErbB2 humanizado a modo de ejemplo. El anticuerpo humanizado puede comprender, por ejemplo, restos de la región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano y puede comprender adicionalmente una sustitución de la región marco (FR) en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en 69H, 71H y 73H usando el sistema de numeración del dominio variable se establece en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En una realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR endosó todas las posiciones de 69H, 71H y 73H. Otro Ejemplo describe la preparación de anticuerpo de trastuzumab unificado a partir de la formulación de HERCEPTIN®.
(iv) Anticuerpos Humanos
Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, en la actualidad es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigoto del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después de la estimulación con antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Patentes de Estados Unidos Nº 5.591.669, Nº 5.589.369 y Nº 5.545.807.
Como alternativa, se puede usar tecnología de presentación de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios genéticos dominio variable (V) de inmunoglobulina a partir de donantes sin inmunizar. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio V de anticuerpos se clona en el marco en un gen de proteína de revestimiento principal o secundario de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presenta como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también darán como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de los linfocitos B. La presentación de fagos se puede realizar en diversos formatos; para su revisión véanse, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de gen V para presentación de fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) aislaron una matriz variada de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V obtenidos a partir de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de parlantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para una matriz variada de antígenos (que incluye autoantígenos) básicamente siguiendo las técnicas que se describen en Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Véanse, también, las Patentes de Estados Unidos Nº 5565332 y Nº 5573905. Tal como se ha analizado anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos mediante linfocitos B activados in vitro (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5567610 y Nº 5229275). Anticuerpos anti-CD30 humanos se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Nº de Serie 10/338.366.
(v) Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir en la actualidad directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar a partir de las fagotecas de anticuerpos que se han analizado anteriormente. Como alternativa, fragmentos de Fab’-SH pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos de F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden usar fragmentos de F(ab’)2 directamente de cultivos de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; Patente de Estados Unidos Nº 5.571.894; y Patente de Estados Unidos Nº
5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.641.870 por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o específicos.
(vi) Anticuerpos biespecíficos
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Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína CD30. Como alternativa, una rama anti-CD30 se puede combinar con una rama que se une a receptores Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcRIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa CD30. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar citotóxicos para células que expresan CD30.
La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las que solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía por afinidad, es bastante difícil de manejar, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se desvelan en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991). De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se condensan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones CH2, y CH3, bisagra. Es preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unión a la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Ésto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos cuando las relaciones no son particularmente significativas.
En un ejemplo de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están formados por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama, y un par híbrido de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina (que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solamente en una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo de separación fácil. Este enfoque se desvela en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods en Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.731.168, la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpos que se pueden modificar genéticamente para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo celular recombinante. La superficie de contacto preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la superficie de contacto de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de la cadena o cadenas laterales grandes en la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Ésto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos secundarios no deseados tales como homodímeros.
También se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando unión química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente arsenito sódico de formación de complejos de ditiol para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos de Fab’ generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab’-TNB se vuelve a convertir a continuación en el Fab’-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos de Fab’-SH a partir de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab’)2 biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento de Fab’ fue segregado separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Además, se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina a partir de las proteínas Fos y Jun se unieron con las porciones de Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación volver a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede usar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" que se describe en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) con un conector que es demasiado corto, para permitir el emparejamiento en los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de VL y VH de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. Además se ha indicado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
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Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Otras modificaciones en la secuencia de aminoácidos
Se contemplan modificación o modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se preparan variantes de secuencias de aminoácidos mediante introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones a partir de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se prepara cualquier combinación de supresión, inserción, y sustitución para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios en aminoácidos también pueden alterar los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo, tales como el cambio del número o la posición de sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de determinados restos por regiones del anticuerpo que son ubicaciones favorecidas por la mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración con alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un resto o grupo de restos diana se identifican (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan con un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con antígenos. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones a continuación se refinan mediante introducción adicional o de otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, a pesar de que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza exploración con ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de anticuerpos expresados se identifican sistemáticamente para la actividad deseada.
Inserciones en secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxil-terminal que varían en su longitud de un resto a polipéptidos que contienen cieno más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado con un resto diferente. Los sitios con el mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR.
Modificaciones básicas en las propiedades biológicas del anticuerpo se consiguen seleccionando sustituciones que difiere significativamente en su efecto mediante el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, tiene una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1)
hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3)
ácidos: asp, glu;
(4)
básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5)
restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
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Un tipo particularmente preferente de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán mejores propiedades biológicas con respecto al anticuerpo precursor a partir del que se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitución implica maduración por afinidad usando presentación de fagos. En resumen, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de este modo se presentan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones para el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. A continuación, las variantes de presentación de fagos se identifican sistemáticamente para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se desvela en el presente documento. Para identificar sitios candidatos de la región hipervariable por modificación, se puede realizar mutagénesis de exploración con alanina para identificar restos de la región hipervariable que contribuye significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas que se elaboran en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describen en el presente documento y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
por ejemplo, con el fin de mejorar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Como alternativa o adicionalmente, resto o restos de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas de esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o mayor muerte celular mediada por complementos y citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos (ADCC). Véase Caron et al. J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral usando agentes de reticulación heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Como alternativa, un anticuerpo se puede modificar genéticamente para que tenga regiones Fc dobles y de ese modo pueda tener mejor lisis de complemento y capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión a receptores de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5739277, por ejemplo. Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo de unión a receptores de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3,
o IgG4) que es responsable del aumento de la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.
(viii) Variantes de Glicosilación
Los anticuerpos en el ADC de la invención pueden estar glicosilados en posiciones conservadas de sus regiones constantes (Jefferis y Lund, (1997) Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright y Morrison, (1997) TibTECH 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, (1990) Biochem. 29: 4175-4180), y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína que puede afectar a la conformación y presentar superficie tridimensional de la proteína (Hefferis y Lund, mencionado anteriormente; Wyss y Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína dada a determinadas moléculas basándose en estructuras específicas de reconocimiento. Por ejemplo, se ha informado que en IgG agalactosilada, el resto de oligosacárido ’se voltea’ fuera del espacio entre -CH2 y restos de N-acetilglucosamina se hacen disponibles para unirse a la proteína de unión a manosa (Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1: 237-243). La retirada mediante glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo IgG1 monoclonal de murino humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que como resultado una reducción completa en la lisis mediada por complementos (CMCL) (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318), mientras que la retirada selectiva de restos de ácido siálico usando neuraminidasa dio como resultado ninguna pérdida de DMCL. También se ha informado glicosilación de anticuerpos que afecta a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se informó que células CHO con expresión regulada por tetraciclina de β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc de bisección, tienen mejor actividad de ADCC (Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17: 176-180).
La glicosilación de anticuerpos por lo general está unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-Xserina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimáticas del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial.
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Glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5hidroxilisina.
Las variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en las que se altera el patrón de glicosilación de un anticuerpo. Por alteración se hace referencia a la supresión de uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo, añadiendo uno o más restos de hidrato de carbono al anticuerpo, cambiando la composición de la glicosilación (patrón de glicosilación), la extensión de la glicosilación, etc.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas que se han descrito anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución con, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O). De forma análoga, la retirada de sitios de glicosilación se puede realizar por alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación nativos del anticuerpo.
La secuencia de aminoácidos normalmente se altera mediante la alteración de la secuencia de ácidos nucleicos subyacente. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) mutagénesis, mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.
La glicosilación (incluyendo patrón de glicosilación) de los anticuerpos también se puede alterar sin alterar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped usada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo celular usado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como agentes terapéuticos potenciales es en raras ocasiones la célula nativa, se pueden esperar variaciones significativas en el patrón de glicosilación de los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 9062-9070. Además de la elección de células huésped, factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen modo de crecimiento, formulación de medios, densidad de cultivos, oxigenación, pH, esquemas de purificación y similares. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilación conseguido en un organismo huésped en particular que incluyen la introducción o sobreexpresión de determinadas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Patentes de Estados Unidos Nº 5047335; Nº 5510261; Nº 5278299). La glicosilación, o determinados tipos de glicosilación, se pueden eliminar enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo usando endoglicosidasa H (Endo H). Además, la célula huésped recombinante se puede modificar genéticamente, por ejemplo, hacerla defectuosa en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estas técnicas y similares son bien conocidas en la técnica.
La estructura de glicosilación de anticuerpos se puede analizar fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de hidratos de carbono, que incluyen cromatografía de lectina, RMN, Espectrometría de masas, HPLC, GPC, análisis composicional de monosacáridos, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que usa cromatografía de intercambio aniónico a pH elevado para separar oligosacáridos basados en la carga. Además se conocen métodos para la liberación de oligosacáridos para fines analíticos, e incluyen, sin limitación, tratamiento enzimático (realizado normalmente usando péptido-N-glicosidasa F/endo-β-galactosidasa), eliminación usando entorno alcalino riguroso para liberar principalmente estructuras unidas a O, y métodos químicos que usan hidrazina anhidra para liberar oligosacáridos unidos tanto a N como a O.
4.5.2a CRIBADO PARA CONJUGADOS DE ANTICUERPOFÁRMACO (ADC)
Animales transgénicos y líneas celulares son particularmente útiles en el cribado de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) que tienen potencial como tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos que implican sobreexpresión de proteínas que incluyen Lewis Y, CD30, CD40, y CD70. Animales transgénicos y líneas celulares son particularmente útiles en el cribado de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) que tienen potencial como tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos implicados en la sobreexpresión de HER2 (documento US6632979). El cribado para un ADC útil puede implicar la administración de ADC candidato sobre un intervalo de dosis al animal transgénico, y someter a ensayo en diversos puntos temporales para el efecto o efectos del ADC en la enfermedad o trastorno que se está evaluando. Como alternativa, o adicionalmente, el fármaco se puede administrar antes de o simultáneamente con exposición a un inductor de la enfermedad, si fuera aplicable. El ADC candidato se puede identificar sistemáticamente de forma seriada e individualmente, o en paralelo el formato de cribado media o de alto rendimiento. La velocidad a la que se puede identificar sistemáticamente ADC para utilidad en tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos está limitada solamente por la velocidad de síntesis o metodología de cribado, que incluye detección/medida/análisis de datos.
Un ejemplo es un método de cribado que comprende (a) trasplantar células de una línea celular de cáncer de células renales estable en un animal no humano, (b) administrar un candidato de fármaco de ADC al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato para inhibir la formación de tumores a partir de la línea celular trasplantada.
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Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular estable de enfermedad de Hodgkin con un candidato de fármaco de ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para bloquear la activación de ligandos de CD40.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular estable de enfermedad de Hodgkin con un candidato de fármaco de ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para inducir muerte celular. En una realización, se evalúa la capacidad del candidato de ADC para inducir apoptosis. Un ejemplo es un método de cribado que comprende (a) trasplantar células de una línea celular de cáncer estable en un animal no humano, (b) administrar un candidato de fármaco de ADC al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato para inhibir la formación de tumores a partir de la línea celular trasplantada. La invención también se refiere a un método para identificar sistemáticamente candidatos de ADC para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por la sobreexpresión HER2 que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular de cáncer de mama estable con un candidato de fármaco y (b) evaluar la capacidad del candidato de para inhibir el crecimiento de la línea celular estable.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular de cáncer estable con un candidato de fármaco de ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para bloquear la activación de ligandos de HER2. En una realización, se evalúa la capacidad del candidato de ADC para bloquear la unión de heregulina. En otra realización, se evalúa la capacidad del candidato de ADC para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada con ligandos.
También se describe un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular de cáncer estable con un candidato de fármaco de ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para inducir muerte celular. En una realización, se evalúa la capacidad del candidato de ADC para inducir apoptosis.
También se describe un método de cribado que comprende (a) administrar un candidato de fármaco de ADC a un mamífero no humano transgénico que sobreexpresa en sus células de las glándulas mamarias una proteína HER2 humana nativa o un fragmento de la misma, en el que dicho mamífero transgénico ha integrado de forma estable en su genoma una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína HER2 humana nativa o un fragmento de la misma que tiene la actividad biológica de la humana HER2, unida operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción que dirige su expresión a la glándula mamaria, y desarrolla un tumor de mama que no responde por responde muy poco a tratamiento con anticuerpos anti-HER2, o a un mamífero no humano portador de un tumor trasplantado a partir de dicho mamífero no humano transgénico; y (b) evaluar el efecto del candidato de ADC en enfermedad o trastorno diana. Sin limitaciones, la enfermedad o trastorno puede ser un cáncer que sobreexpresa HER2, tal como cáncer de mama, ovarios, estómago, endometrio, glándulas salivales, pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreático y vejiga. El cáncer es preferentemente cáncer de mama que expresó HER2 en al menos aproximadamente 500.000 copias por célula, más preferentemente al menos aproximadamente 2.000.000 copias por célula. Los candidatos de fármaco de ADC, por ejemplo, se pueden evaluar por su capacidad para inducir muerte celular y/o apoptosis, usando métodos de ensayo bien conocidos en la técnica y que se describen en lo sucesivo en el presente documento.
En un ejemplo, el candidato de ADC se identifica sistemáticamente siendo administrado al animal transgénico en un intervalo de dosis, y evaluando la respuesta fisiológica del animal a los compuestos con el tiempo. La administración puede ser oral, o mediante inyección adecuada, dependiendo de la naturaleza química del compuesto que se está evaluando. En algunos casos, puede ser apropiado administrar el compuesto en conjunto con cofactores que potenciarían la eficacia del compuesto. Si se usan líneas celulares obtenidas a partir de los animales transgénicos objetivo para identificar sistemáticamente compuestos útiles en el tratamiento de diversos trastornos, los compuestos de ensayo se añaden al medio de cultivo celular en un momento apropiado, y la respuesta celular al compuesto se evalúa con el tiempo usando los ensayos bioquímicos y/o histológicos apropiados. En algunos casos, puede ser apropiado aplicar el compuesto de interés al medio de cultivo en conjunto con cofactores que potenciarían la eficacia del compuesto.
Por lo tanto, en el presente documento se describen ensayos para identificar ADC que se dirigen específicamente y se unen a una proteína diana, cuya presencia se correlaciona con la función celular anómala, y en la patogénesis de proliferación y/o diferenciación celular que se relaciona de forma causal con el desarrollo de tumores.
Para identificar un ADC que bloquea la activación de ligandos de un receptor ErbB (por ejemplo, ErbB2), se puede determinar la capacidad del compuesto para bloquear ligandos ErbB que se unen a células que expresan el receptor ErbB (ErbB2) (por ejemplo, en conjugación con otro receptor ErbB con el que el receptor ErbB de interés forma un ErbB heterooligómero). Por ejemplo, se pueden incubar células aisladas a partir del animal transgénico que sobreexpresa HER2 y transfectarlas para que expresen otro receptor ErbB (con el que HER2 forma heterooligómero), es decir cultivar, con el ADC y a continuación exponer a ligando de ErbB marcado. A continuación, se puede evaluar la capacidad del compuesto para bloquear la unión de ligandos al receptor ErbB en el heterooligómero de ErbB.
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Por ejemplo, la inhibición de heregulina (HRG) que se une a líneas celulares de tumores de mama, que sobreexpresa HER2 y que se establece a partir de los mamíferos no humanos transgénicos (por ejemplo, ratones) en el presente documento, con el candidato de ADC se puede realizar usando cultivos en monocapa sobre hielo en un formato de placa de 24 pocillos. Se pueden añadir anticuerpos monoclonales Anti-ErbB2 a cada pocillo e incubar durante 30 minutos. A continuación se puede añadir rHRGβ1177224 marcado con 125I (25.000 cpm), y se puede continuar con la incubación durante 4 a 16 horas. Se pueden preparar las curvas de respuesta a la dosis y se puede calcular un valor de CI50 (actividad citotóxica) para el compuesto interés.
Como alternativa, o adicionalmente; se puede evaluar la capacidad de un ADC para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada con ligandos de ErbB de un receptor ErbB presente en un heterooligómero de ErbB. Por ejemplo, las líneas celulares establecidas a partir de los animales transgénicos en el presente documento se pueden incubar con un ADC de ensayo y a continuación someter a ensayo para la actividad de fosforilación de tirosina dependiente de ligandos ErbB usando un anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (que está conjugado opcionalmente con una marca detectable). La activación del receptor de quinasas que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5766863 también está disponible para determinar la activación del receptor ErbB y el bloqueo de esa actividad con el compuesto.
En un ejemplo, se puede identificar sistemáticamente el ADC que inhibe la estimulación de HRG de la fosforilación de p180 tirosina en células MCF7 básicamente tal como se describe a continuación. Por ejemplo, una línea celular establecida a partir del animal transgénico para HER2 se puede sembrar en placas de 24 pocillos y compuestos se puede añadir a cada pocillo e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente; a continuación, se puede añadir rHRGβ1177244 a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y se puede continuar con la incubación durante aproximadamente 8 minutos. Los medios se pueden aspirar de cada pocillo, y las relaciones se pueden detener mediante la adición de 100 l de tampón de muestra de SDS (SDS al 5 %, DTT 25 mM, y Tris-HCl 25 mM, pH 6.8). Cada muestra (25 µl) se puede someter a electroforesis en un gel con un gradiente de un 4-12 % de Novex) y a continuación transferir de forma electroforética a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Se pueden desarrollar inmunotransferencias de antifosfotirosina (a 1 µg/ml), y la intensidad de la banda reactiva predominante a la Mr -180.000 se puede cuantificar mediante densitometría de reflectancia. Un método alternativo para evaluar la inhibición de la fosforilación del receptor es el ensayo KIRA (activación del receptor de quinasas) de Sadick et al. (1998) Jour. of Pharm. and Biomed. Anal. Algunos de los anticuerpos monoclonales bien establecidos frente a HER2 que se sabe que inhiben la estimulación de HRG de fosforilación de p180 tirosina se pueden usar como control positivo en este ensayo. Se puede preparar una curva de dosis-respuesta para la inhibición de la estimulación de HRG de fosforilación de p180 tirosina tal como se determina con densitometría de reflectancia y se puede calcular una CI50 para el compuesto interés.
Además, se puede evaluar los efectos inhibidores del crecimiento de un ADC de ensayo en líneas celulares obtenidas a partir de un animal transgénico para HER2, por ejemplo, básicamente tal como se describe en Schaefer et al. (1997) Oncogene 15: 1385-1394. De acuerdo con este ensayo, las células se pueden tratar con un compuesto de ensayo a diversas concentraciones durante 4 días y teñir con violeta de cristal o con el tinte redox Azul de Alamar. La incubación con el compuesto puede presentar un efecto inhibidor del crecimiento sobre esta línea celular similar al que se presenta con anticuerpo monoclonal 2C4 en células MDA-MB-175 (Schaefer et al., mencionado anteriormente). En una realización más, HRG exógeno no invertirá significativamente esta inhibición.
Para identificar los compuestos inhibidores de crecimiento que se dirigen específicamente a un antígeno de interés, se pueden identificar sistemáticamente compuestos que inhiben el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan antígenos de interés obtenidos a partir de animales transgénicos, y se puede realizar el ensayo que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5677171. De acuerdo con este ensayo, células cancerosas que sobreexpresan el antígeno de interés se cultivan en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células se siembran a 20.000 células en un disco de cultivo celular de 35 mm (2 ml/35 mm de disco) y el compuesto de ensayo se añade a diversas concentraciones. Después de seis días, se hace recuento del número de células, en comparación con células sin tratar usando un contador celular electrónico COULTER™. Los compuestos que inhiben el crecimiento celular en aproximadamente un 20-100 % o aproximadamente un 50-100 % se pueden seleccionar como compuestos inhibidores del crecimiento.
Para seleccionar compuestos que inducen la muerte celular, la pérdida de la integridad de la membrana tal como se indica, por ejemplo, con PI, azul de tripano o absorción de 7AAD se puede evaluar con respecto al control. El ensayo de absorción de PI usa células aisladas a partir del tejido tumoral de interés de un animal transgénico. De acuerdo con este ensayo, las células se cultivan en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) complementado con FBS inactivado con calor al 10 % (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. Por lo tanto, el ensayo se realiza en ausencia de células de complemento y efectoras inmunes. Las células se siembran con una densidad de 3 x 106 por disco en discos de 100 x 20 mm y se permite que se unan durante una noche. A continuación el medio se retira y se reemplaza con medio recién preparado solo o con medio que contiene diversas concentraciones del compuesto. Las células se incubaron durante un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización. Las células se centrifugan a continuación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 ºC, el sedimento se vuelve a suspender en 3 ml de tampón de unión de Ca2+ frío (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) y se toman alícuotas en tubos de 12 x 75 mm cerrados con tamiz de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retirada de grupos de células. Los tubos reciben a continuación PI (10 µg/ml). Las muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y el software
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5 de CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Los compuestos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular tal como se determina mediante absorción de PI se pueden seleccionar como compuestos que inducen la muerte celular.
Para seleccionar compuestos que inducen la apoptosis, se realiza un ensayo de unión de anexina que usa células establecidas a partir del tejido tumoral de interés del animal transgénico. Las células se cultivan y se siembran en discos tal como se ha analizado en el párrafo anterior. El medio se retira a continuación y se reemplaza con medio recién preparado solo o medio que contiene 10 µg/ml del conjugado de anticuerpo fármaco (ADC). Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización. Las células se centrifugan a continuación, se vuelven a suspender en tampón de unión de Ca2+ y se toman alícuotas en
15 tubos tal como se ha analizado anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos reciben a continuación anexina (por ejemplo, anexina V-FITC) (1 µg/ ml). Las muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y el software de CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Los compuestos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina con respecto al control se seleccionan como compuestos que inducen la apoptosis.
4.5.3 ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO
Generalmente, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpo fármaco (ADC) se mide mediante: exposición de células mamíferos que tienen proteínas receptoras al anticuerpo del ADC en un medio de cultivo
25 celular; cultivar las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y medir la viabilidad celular. Se usaron ensayos in vitro basados en células para medir viabilidad (proliferación), citotoxicidad, e inducción de apoptosis (activación de caspasas) del ADC de la invención.
La potencia in vitro de conjugados de anticuerpo y fármaco se midió con un ensayo de proliferación celular (Ejemplo 18, Figuras 7-10). El Ensayo de Viabilidad Celular Luminescente CellTiter-Glo® es un método de ensayo homogéneo disponible en el mercado (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresión recombinante de luciferasa de Coleópteros  
35 Estados Unidos Nº 6602677). El Ensayo CellTiter-Glo® se realizó en formato de 96 pocillos, lo que lo hace susceptible el cribado de alto rendimiento automatizada (HTS) (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404). El procedimiento de ensayo homogéneo implica la adición del reactivo individual (Reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las células cultivadas en medio complementado con suero. No son necesarios lavado celular, retirada del medio y etapas múltiples de pipeteo. El sistema detecta una cantidad tan pequeña como 15 células/pocillo en un formato de 384 pocillos a los 10 minutos después de la dicción del reactivo y mezcla. Las células se pueden tratar continuamente con ADC, o se pueden tratar y separar de ADC. Generalmente, las células tratadas brevemente, es decir 3 horas, mostraron los mismos efectos de potencia que las células tratadas continuamente.
El formato homogéneo de "añadir-mezclar-medir" da como resultado lisis celular y generación de una señal
45 luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células presentes en el cultivo. El Ensayo CellTiter-Glo® genera una señal luminiscente "de tipo brillo", producida por la reacción de la luciferasa, que tiene una vida media generalmente mayor que cinco horas, dependiendo del tipo de célula y medio usados. Las células viables se reflejan en unidades de luminiscencia relativa (RLU). El sustrato, Luciferina de Escarabajo, se descarboxilasa oxida activamente mediante luciferasa de luciérnaga recombinante con conversión simultánea de ATP en AMP y generación de fotones. La vida media extendida elimina la necesidad del uso de inyectores de reactivo y proporciona flexibilidad para procesamiento en modo continuo o discontinuo de múltiples placas. Este ensayo de proliferación celular se puede usar con diversos formatos de múltiples pocillos, por ejemplo, formato de 96 o 384 pocillos. Los datos se pueden registrar con luminómetro o un dispositivo de formación de imágenes con cámara CCD. La producción de luminiscencia se presenta como unidades
55 de luz relativa (RLU), medidas en el tiempo.
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Los efectos antiproliferativos de conjugados de anticuerpo y fármaco se midieron con el ensayo de muerte celular in vitro, proliferación celular mencionado anteriormente frente a cuatro líneas celulares diferentes de tumor de mama (Figuras 7-10). Los valores de CI50 se establecieron para SK-BR-3 y BT-474 que se sabe que sobreexpresan la proteína receptora HER2. La Tabla 2a muestra las medidas de la potencia (CI50) de conjugados de anticuerpo y fármaco a modo de ejemplo en el ensayo de proliferación celular frente a células SK-BR-3. La Tabla 2b muestra las medidas de la potencia (CI50) de conjugados de anticuerpo y fármaco a modo de ejemplo en el ensayo de proliferación celular frente a células BT-474.
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5 Conjugados de anticuerpo y fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3.3 MMAE/Ab; y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab no inhibieron la proliferación de células MCF-7 (Figura 9).
10 Conjugados de anticuerpos y fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3.3 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab; y Trastuzumab-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab no inhibieron la proliferación de células MDA-MB-468 (Figura 10).
15 Las células MCF-7 y MDA-MB-468 no se sobreexpresan en la proteína receptora HER2. Los conjugados de anticuerpo y fármaco anti-HER2 descritos en el presente documento muestran por lo tanto selectividad para la inhibición de células que expresan HER2.
Tabla 2a células SK-BR-3 Tabla 2b células BT474
Conjugado de Anticuerpo Fármaco H = trastuzumab unido a través de una cisteína [cys] excepto cuando se indica
CI50 (µg de ADC/ml)
H-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab
0,008
H-MC-MMAF, 4.8 MMAF/Ab
0,002
H-MC-vc-PAB-MMAE,
0,007
H-MC-vc-PAB-MMAE
0,015
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab
0,0035 - 0,01
H-MC-vc-PAB-MMAF, 4.4 MMAF/Ab
0,006 - 0,007
H-MC-vc-PAB-MMAF, 4.8 MMAF/Ab
0,006
H-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab
0,0035
H-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab
0,0035
H-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab
0,010
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab
0,007
H-MC-vc-PAB-MMAE 4.1 MMAE/Ab
0,015
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab.
0,010
H-MC-vc-PAB-MMAE, 7.5 MMAE/Ab
0,0025
H-MC-MMAE, 8.8 MMAE/Ab
0,018
H-MC- MMAE, 4.6 MMAE/Ab
0,05
H-MC-(L)val-(L)cit-PAB-MMAE, 8.7 MMAE/Ab
0,0003
H-MC-(D)val-(D)cit-PAB-MMAE, 8.2 MMAE/Ab
0,02
H-MC-(D)val-(L)cit-PAB-MMAE, 8.4 MMAE/Ab
0,0015
H-MC-(D)val-(L)cit-PAB-MMAE, 3.2 MMAE/Ab
0,003
H-Trastuzumab
0,083
H-vc-MMAE, unido a través de una lisina [lys]
0,002
H-phe-lys-MMAE, unido a través de una lisina [lys]
0,0015
4D5-Fc8-MC-vc-PAB-MMAF, 4.4 MMAF/Ab
0,004
Hg-MC-vc-PAB-MMAF, 4.1 MMAF/Ab
0,01
7C2-MC-vc-PAB-MMAF, 4.0 MMAF/Ab
0,01
4D5 Fab-MC-vc-PAB-MMAF, 1.5 MMAF/Ab
0,02
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Anti-TF Fab-MC-vc-PAB-MMAE
-
Conjugado de Anticuerpo Fármaco H = trastuzumab unido a través de una cisteína [cys]
CI50 (µg de ADC/ml)
H-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab
0,008
H-MC-MMAF, 4.8 MMAF/Ab
0,002
H-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab
0,015
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab
0,02 - 0,05
H-MC-vc-PAB-MMAF, 4.4 MMAF/Ab
0,01
H-MC-vc-PAB-MMAF, 4.8 MMAF/Ab
0,01
H-MC-vc-PAB-MMAE 3.3 MMAE/Ab
0,02
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab,
0,02
H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab
0,015
H-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab
0,010
H-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab
0,00015
H-MC-vc-PAB-MMAE, 7,5 MMAE/Ab
0.0025
H-MC-MMAE, 8.8 MMAE/Ab
0,04
H-MC- MMAE, 4.6 MMAE/Ab
0,07
4D5-Fc8-MC-vc-PAB-MMAF, 4.4 MMAF/Ab
0,008
Hg-MC-vc-PAB-MMAF, 4.1 MMAF/Ab
0,01
7C2-MC-vc-PAB-MMAF, 4.0 MMAF/Ab
0,015
4D5 Fab-MC-vc-PAB-MMAF, 1.5 MMAF/Ab
0,04
Anti-TF Fab-MC-vc-PAB-MMAE*
-
H = trastuzumab 7C2 = anticuerpo de murino anti-HER2 que se unen a un epítopo diferente que el trastuzumab. Fc8 = mutante que no se une a FcRn Hg = 4D5 humanizado de longitud total "sin bisagra", con cisteínas bisagra de cadena pesada mutadas a serinas. Expresado en E. coli (por lo tanto no glicosilado). Anti-TF Fab = fragmento de anticuerpo de factor anti-tejido * actividad frente a células MDA-MB-468
En un descubrimiento sorprendente e inesperado, los resultados de la actividad de proliferación celular in vitro del
5 ADC en las Tablas 2a y 2b muestran por lo general que ADC con un número medio bajo de restos de fármaco por anticuerpo mostró eficacia, por ejemplo, CI50 < 0,1 µg de ADC/ml. Los resultados sugieren que al menos para ADC de trastuzumab, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor que 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
10  IN VIVO 
El aclaramiento y la estabilidad de plasma farmacocinético de ADC se investigaron en ratas y monos cynomolgus. La concentración de plasma se midió con el tiempo. La Tabla 2c muestra datos farmacocinéticos de conjugados de anticuerpo y fármaco y otras muestras dosificadas en ratas. Las ratas son un modelo no específico para anticuerpos
15 receptores de ErbB, debido a que, no se sabe que la rata exprese proteínas receptoras de HER2.
Tabla 2c Farmacocinética en Ratas H = trastuzumab unido a través de una cisteína [cys] excepto cuando se indica 2 mg/kg de dosis excepto cuando se indica
Dosis de la muestra en mg/kg
AUCinf día* µg/ml CL ml/día/kg Cmáx µg/ml T½ Term. días % Conj.
imagen136
H-MC-vc-PAB-MMAE (Ab Total
78,6 26,3 39,5 5,80 40,6
H-MC-vc-PAB-MMAE (Conj.)
31,1 64,4 33,2 3,00
H-MC-vc-PAB-MMAF (Total Ab)
170 12,0 47,9 8,4 50,0
H-MC-vc-PAB-MMAF (Conj.)
83,9 24,0 44,7 4,01
H-MC-MMAE (Total Ab)
279 18,9 79,6 7,65 33
H-MC-MMAE (Conj.) 5 mg/kg
90,6 62,9 62,9 4,46
H-MC-MMAF (Total Ab)
299 6,74 49,1 11,6 37
H-MC-MMAF (Conj.)
110 18,26 50,2 4,54
H-MC-vc-MMAF, wo/PAB, (Total Ab)
306 6,6 78,7 11,9 19,6
H-MC-vc-MMAF, wo/PAB, (Conj.)
59,9 33,4 82,8 2,1
H-Me-vc-PAB-MMAF (Total Ab)
186 10,8 46,9 8,3 45,3
H-Me-vc-PAB-MMAF (Conj.)
84,0 23,8 49,6 4,3
H-Me-vc-PAB-MMAE (Total Ab)
135 15,0 44,9 11,2 23,8
H-Me-vc-PAB-MMAE (Conj.)
31,9 63,8 45,2 3,0
H-MC-vc-MMAF, wo/PAB, (Total Ab)
306 6,6 78,7 11,9 19,6
H-MC-vc-MMAF, wo/PAB, (Conj.)
59,9 33,4 82,8 2,1
H-MC-(D)val-(L)cit-PAB-MMAE (Total Ab)
107 19,2 30,6 9,6 38,1
H-MC-(D)val-(L)cit-PAB-MMAE (Conj.)
40 50,4 33,7 3,98
H-MC-(Me)-vc-PAB-MMAE, Total Ab
135,1 15,0 44,9 11,2 23,8
H-MC-(Me)-vc-PAB-MMAE, Conj.
31,9 63,8 45,2 2,96
H-MC-(D)val-(D)cit-PAB-MMAE, Total Ab
88,2 22,8 33,8 10,5 38,3
H-MC-(D)val-(D)cit-PAB-MMAE, Conj.
33,6 59,8 36,0 4,43
H-MC-vc-PAB-MMAE, Total Ab
78,6 26,3 39,5 5,8 40,6
H-MC-vc-PAB-MMAE, Conj. H unido a MC mediante lisina [lys]
31,1
64,4 33,2 3,00
MMAF 200 µg/kg
0,99 204 280 0,224 -
MMAE 206 µg/kg
3,71 62,6 649 0,743 -
HER F(ab’)2-MC-vc-MMAE, Total Ab
9,3 217 34,4 0,35 95
HER F(ab’)2-MC-vc-MMAE, Conj.
8,8
227 36,9 0,29
4D5-H-Fab-MC-vc-MMAF, Total Ab
43,8 46,2 38,5 1,49 68
4D5-H-Fab-MC-vc-MMAF, Conj.,
29,9 68,1 34,1 1,12
4D5-H-Fab-MC-vc-MMAE,
71,5 70,3 108 1,18 59
Total Ab 4D5-H-Fab-MC-vc-MMAE, Conj.
42,2 118,9 114 0,74
4D5-H-Fab
93,4 53,9 133 1,08 -
H-MC-vc-PAB-MMAF, Total Ab H-MC-vc-PAB-MMAF, Conj.
170 12,03 47,9 8,44 49,5
83,9
23,96 44,7 4,01
H-MC-vc-PAB-MMAF-DMAEA, Total AbH-MC-vc-PAB-MMAF-DMAEA, Conj.
211 9,8 39,8 8,53 34,3
71,5
28,2 38,8 3,64
H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG, Total Ab
209 9,75 53,2 8,32 29,7
imagen137
H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG, Conj.
63,4 31,8 34,9 4,36
El AUC inf es el área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo desde el momento de la dosificación hasta el infinito y es una medida de la exposición total a la entidad medida (fármaco, ADC). CL se define como el volumen de plasma aclarado de la entidad medida en unidades de tiempo y se expresa mediante normalización a peso corporal. 5 El término T1/2 es la mitad del fármaco en el organismo medido durante su fase de eliminación. La expresión % Conj. es la cantidad relativa de ADC en comparación con el anticuerpo total detectado, mediante ensayos separados de inmunoafinidad de ELISA ("Analytical Methods for Biotechnology Products", Ferraiolo et al, páginas 85-98 en Pharmacokinetics of Drugs (1994) P.G. Welling y L.P. Balant, Eds., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.
110, Springer-Verlag. El cálculo del % Conj. es simplemente el AUCinf de ADC
imagen23AUCinf total de Ab, y es un 10 indicador general de la estabilidad del conector, aunque pueden tener efecto otros factores y mecanismos.
La Figura 11 muestra un gráfico de un estudio de aclaramiento de la concentración de plasma después de la administración de los conjugados de anticuerpo fármaco: H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG y H-MC-vc-PAB-MMAF a ratas Sprague-Dawley. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron en el tiempo.
15 La Figura 12 muestra un gráfico de un estudio de aclaramiento de la concentración de plasma en dos etapas en el que ADC se administró a dosificaciones diferentes y las concentraciones del anticuerpo total y ADC se midieron en el tiempo.
20 EFICACIA IN VIVO 
La eficacia in vivo del ADC de la invención se midió con un modelo de ratón de explante transgénico de HER2 de alta expresión. Se propagó un aloinjerto desde el ratón transgénico Fo5 mmtv que no responde a, o responde muy poco a, la terapia con HERCEPTIN®. Los sujetos se trataron una vez con ADC y se controlaron durante 3-6
25 semanas para medir el tiempo de duplicación tumoral, log de muerte celular, y disminución tumoral. Se realizaron experimentos de seguimiento de respuesta a dosis y dosis múltiples.
Los tumores aparecen fácilmente en ratones transgénicos que expresan una forma activada de forma mutacional de neu, el homólogo de rata de HER2, pero el HER2 que se sobreexpresa en cánceres de mama no muta y la 30 formación de tumor es mucho menos robusta en ratones transgénicos que sobreexpresa en HER2 sin mutar (Webster et al. (1994) Semin. Cancer Biol. 5: 69-76).
Para mejorar la formación de tumores con HER2 sin mutar, se produjeron ratones transgénicos usando un plásmido de cADN de HER2 en el que un ATG secuencia arriba se suprimió para prevenir el comienzo de la traducción en 35 dichos codones de ATG secuencia arriba, que de otro modo reducirían la frecuencia del comienzo de la traducción desde el codón de iniciación auténtico secuencia debajo de HER2 (por ejemplo, véase Child et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341). Además, se añadió un intrón quimérico en el extremo 5’, que también potenciaría el nivel de expresión tal como se ha indicado anteriormente (Neuberger y Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6713; Buchman y Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 4395; Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836). El intrón 40 quimérico se obtuvo a partir de un vector de Promega, vector de expresión de mamífero pCI-neo (bp 890-1022). En extremo 3’ del cADN está flanqueado por los exones 4 y 5 de la hormona de crecimiento humano, y secuencias de poliadenilación. Además, se usaron ratones FVB por qué esta cepa es más susceptible al desarrollo tumoral. Se usó el promotor de MMTV-LTR para asegurar la expresión de HER2 específica de tejidos en la glándula mamaria. Los animales alimentaron con la dieta AIN 76A para aumentar la susceptibilidad a la formación de tumores (Rao et al.
45 (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45: 149-158).
Tabla 2d Medidas de tumor en modelo de aloinjerto de ratón - Tumor de mama MMTV-HER2 Fo5, ratones atímicos desnudos Una sola dosis el día 1 (T = 0) excepto cuando se indica H = trastuzumab unido a través de una cisteína [cys] excepto cuando se indica
Fármacos de Muestra por anticuerpo
Dosis Ti PR CR Tiempo de duplicación tumoral (días) log medio de muerte celular
Vehículo
2-5 0
H-MC-vc-PAB-MMAE 8.7 MMAE/Ab
1250 µg/m2 5/5 4/7 0/7 18 1,5
H-MC-vc-PAB-MMAF 3.8 MMAF/Ab
555 µg/m2 2/5 2/7 5/7 69 6,6
H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF
> 50 6,4
imagen138
H-MC-MMAF 4.8 MMAF/Ab
9.2 mg/kg Ab 550 µg/m2 a 0, 7, 14 y 21 días 7/7 6/7 0/7 63 9
H-MC-MMAF 4.8 MMAF/Ab
14 mg/kg Ab 840 µg/m2 a 0, 7, 14 y 21 días 5/5 5/7 2/7 > 63
H-MC-vc-PAB-MMAF 5.9 MMAF/Ab
3,5 mg/kg Ab 300 µg/m2 a 0, 21, y 42 días 5/6 1/7 3/7 > 36
H-MC-vc-PAB-MMAF 5.9 MMAF/Ab
4,9 mg/kg Ab 425 µg/m2 a 0, 21, y 42 días 4/7 2/7 5/7 > 90
H-MC-vc-PAB-MMAF 5.9 MMAF/Ab
6,4 mg/kg Ab 550 µg/m2 a 0, 21, y 42 días 3/6 1/7 6/7 > 90
H-(L)val-(L)cit-MMAE 8.7 MMAE/Ab
10 mg/kg 7/7 1/7 0/7 15,2 1,1
H-MC-MMAE 4.6 MMAE/Ab
10 mg/kg 7/7 0/7 0/7 4 0,1
H-(D)val-(D)cit-MMAE 4.2 MMAE/Ab
10 mg/kg 7/7 of 0/7 3
H-(D)val-(L)cit-MMAE 3.2 MMAE/Ab
13 mg/kg 7/7 0/7 0/7 9 0,6
H-MC(Me)-vc-MMAE 3.0 MMAE/Ab
13 mg/kg 7/7 3/7 0/7 17 1,2
H-(L)val-(D)cit-MMAE 3.5 MMAE/Ab
12 mg/kg 7/7 0/7 0/7 5 0,2
H-vc-MMAE 8.7 MMAE/Ab
10 mg/kg 7/7 17
H-cys-vc-MMAF 3.8 MMAF/Ab
1 mg/kg 7/7 3
H-cys-vc-MMAF 3.8 MMAF/Ab
3 mg/kg 7/7 > 17
H-cys-vc-MMAF 3.8 MMAF/Ab
10 mg/kg 4/7 4/7 3/7 > 17
H-MC-vc-MMAF-TEG 4 MMAF/Ab
10 mg/kg 3/6 1/7 6/7 81 7,8
H-MC-vc-MMAF-TEG 4 MMAF/Ab
10 mg/kg q3wk x 3 0/5 0/7 7/7 81 7,9
H-vc-MMAF (lote 1)
10 mg/kg 4/6 2/8 5/8
H-vc-MMAF (lote 2)
10 mg/kg 7/8 1/8 1/8
H-MC-MMAF
10 mg/kg 550 µg/m2 8/8 1/8 0/8 18
H-(Me)-vc-MMAF
10 mg/kg 3/7 2/8 5/8
H-vc-MMAE 7.5 MMAE/Ab
3,7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 6/6 0/7 1/7 17 2,3
H-vc-MMAE 7.5 MMAE/Ab
7.5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 5/7 3/7 3/7 69 10
anti IL8-vc-MMAE 7.5 MMAE/Ab
7.5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 0/7 0/7 5 0,5
anti IL8-vc-MMAE 7.5 MMAE/Ab
3.7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 6/6 0/7 0/7 3 0,2
H-fk-MMA 7.5 MMAE/Ab
7.5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 1/7 0/7 31 4,4
imagen139
H-fk-MMAE 7.5 MMAE/Ab
3.7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 0/7 0/7 8,3 0,9
anti IL8-fk-MMAE 7.5 MMAE/Ab
7.5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 0/7 0/7 6 0,5
anti IL8-fk-MMAE 7.5 MMAE/Ab
3,7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 0/7 0/7 3 0,1
Trastuzumab
7,5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 días 7/7 0/7 0/7 5 0,4
H-vc-MMAE 8.7 MMAE/Ab
10 mg/kg 1250 mg/m2 6/6 3/6 0/6 15 1,3
H-vc-MMAE
10 mg/kg 1250 µg/m2 a 0, 7, y 14 días 7/7 5/7 > 19
H-vc-MMAE
3 mg/kg a 0, 7, y 14 días 7/7 8
H-vc-MMAE
1 mg/kg a 0, 7, y 14 días 7/7 7
H-vc-MMAF
10 mg/kg 8/8 5/8 > 21
H-vc-MMAF
10 mg/kg a 0, 7, y 14 días 4/7 4/7 3/7 > 21
H-vc-MMAF
3 mg/kg a 0, 7, y 14 días 7/7 6
H-vc-MMAF
1 mg/kg a 0, 7, y 14 días 8/8 4
Trastuzumab
10 mg/kg a 0 y 7 días 8/8 3
Hg-MC-vc-PAB-MMAF 4.1 MMAF/Ab
10 mg/kg a 0 días 6/7 3/8 5/8 56 5,1
Fc8-MC-vc-PAB-MMAF 4.4 MMAF/Ab
10 mg/kg a 0 días 7/7 6/8 0/8 25 2,1
7C2-MC-vc-PAB-MMAF 4 MMAF/Ab
10 mg/kg a 0 días 5/6 6/8 1/8 41 3,7
H-MC-vc-PAB-MMAF 5.9 MMAF/Ab
10 mg/kg a 0 días 3/8 3/8 5/8 62 5,7
2H9-MC-vc-PAB-MMAE
9/9 > 14 días
2H9-MC-vc-PAB-MMAF
9/9 > 14 días
11D10-vc-PAB-MMAE
9/9 > 14 días
11D10-vc-PAB-MMAF
9/9 11 días
7C2 = anticuerpo de murino anti-HER2 que se une a un epítopo diferente a trastuzumab. Fc8 = mutante que no se une a la FcRn Hg = 4D5 humanizado de longitud total "sin bisagra", con cisteínas bisagra de cadena pesada mutadas a serinas. Expresado en E. coli (por lo tanto no glicosilado). 2H9 = Anti-EphB2R 11D10 = Anti-0772P
El término Ti es el número de animales en el grupo de estudio con tumor a T = 0
imagen23
animales totales en el grupo. El término PR es el número de animales que alcanzan la remisión parcial del tumor
imagen23
animales con tumor a T = 0 en el grupo. El término CR es el número de animales que alcanzan la remisión completa del tumor
imagen23animales con tumor 5 a T = 0 en el grupo. El término Log de muerte celular es el tiempo en días para que el volumen del tumor se duplique
– el tiempo en días para que el volumen del tumor de control se duplique dividido por 3,32 X tiempo para que el volumen tumoral se duplique en animales de control (dosificados con Vehículo). El cálculo del log de muerte celular tiene en cuenta el retraso del crecimiento del tumor que resulta del tratamiento y el tiempo de duplicación del volumen del tumor en el grupo de control. La actividad antitumoral de ADC se clasifica con valores de log de muerte
10 celular de:
+ ≥ 3,4 (muy activo)
+++ = 2,5-3,4 ++ = 1,7-2,4
imagen140
+ = 1,0-1,6
inactivo = 0
La Figura 13 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con Aloinjertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con: Vehículo, Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (1250 µg/m2) y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 µg/m2). (H = Trastuzumab). El crecimiento de los tumores se retrasó por tratamiento con ADC en comparación con el nivel de crecimiento de control (Vehículo). La Figura 14 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con Aloinjertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados el Día 0 con 10 mg/kg (660 µg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE y 1250 µg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. La Figura 15 muestra el cambio del volumen tumoral medio con el tiempo en ratones atímicos desnudos con Aloinjertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosificados con 650 µg/m2 de Trastuzumab-MC-MMAF. La Tabla 2d y las Figuras 13-15 muestran que el ADC tiene fuerte actividad antitumoral en el aloinjerto de un tumor positivo para HER2 (Fo5) que originalmente en un ratón transgénico MMTV-HER2. el anticuerpo solo (por ejemplo, Trastuzumab) no tiene actividad antitumoral significativa en este modelo (Erickson et al. Patente de Estados Unidos Nº 6632979). Tal como se ilustra en las Figuras 13-15, el crecimiento de los tumores se retrasó con el tratamiento con ADC en comparación con el nivel de crecimiento de control (Vehículo).
En un descubrimiento sorprendente e inesperado, los resultados de la actividad antitumoral in vivo del ADC en la Tabla 2d muestran generalmente que ADC con un número medio más bajo de restos de fármacos por anticuerpo mostraron eficacia, por ejemplo, tiempo de duplicación del tumor > 15 días y log medio de muerte celular > 1,0. La Figura 16 muestra que para el conjugado de anticuerpo fármaco, trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, el volumen tumoral medio disminuyó y no progresó cuando la relación MMAF:trastuzumab era 2 y 4, mientras que el tumor progresaba con una relación de 5,9 y 6, pero una velocidad menor que con el Vehículo (tampón). La velocidad de la progresión tumoral en este modelo de xenoinjerto de ratón fue aproximadamente la misma, es decir 3 días, para Vehículo y trastuzumab. Los resultados sugieren que al menos para el ADC de trastuzumab, la relación óptima de restos de fármacos con anticuerpo puede ser menor que aproximadamente 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 4.
4.5.5 TOXICIDAD EN ROEDORES
Los conjugados de anticuerpo y fármaco y un control menos ADC, "Vehículo", se evaluaron en un modelo de rata de toxicidad aguda. La toxicidad del ADC se investigo por tratamiento de ratas Sprague-Dawley macho y hembra con el ADC y posterior inspección y análisis de los efectos sobre diversos órganos. Las observaciones macroscópicas incluyeron cambios en los pesos corporales y signos de lesiones y sangrado. Se realizaron parámetros de patología clínica (química y hematología en suero), histopatología, y necropsia en animales dosificados.
Se considera que la pérdida de peso, o el cambio de peso con respecto animales dosificados solamente con Vehículo, en animales después de la dosificación con ADC son un indicador macroscópico y general de toxicidad sistémica o localizada. La Figuras 17-19 muestran los efectos de diversos ADC y control (Vehículo) después de la dosificación en el peso corporal de las ratas.
Se midió la hepatotoxicidad mediante enzimas hepáticas elevadas, mayores números de figuras mitóticas y apoptóticas y necrosis de hepatocitos. Se observó toxicidad hematolinfoide por supresión de leucocitos, principalmente granulocitos (neutrófilos), y/o plaquetas, e implicación orgánica linfoide, es decir atrofia o actividad apoptótica. También se observó toxicidad por lesiones en el tracto gastrointestinal tales como números aumentados de figuras mitóticas y apoptóticas y enterocolitis degenerativa.
Las enzimas indicativas de lesión hepática que se estudiaron incluyen:
AST (aspartato aminotransferasa)
-Localización: citoplasmática; hígado, corazón, músculo esquelético, riñón
-Relación Hígado:Plasma de 7000:1
-T1/2: 17 horas
ALT (alanina aminotransferasa)
-Localización: citoplasmática; hígado, riñón, corazón, músculo esquelético
-Relación Hígado:Plasma de 3000:1
- T1/2: 42 horas; variación diurna GGT (g-glutamil transferasa)
- Localización: membrana plasmática de células con alta capacidad secretora o de absorción; hígado, riñón, intestino
imagen141
-Mal indicador de lesión hepática; normalmente elevada en trastornos de conductos biliares.
Los perfiles de toxicidad de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF and trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF se estudiaron en ratas Sprague-Dawley hembra (Ejemplo 19). El anticuerpo de trastuzumab humanizado no se une de forma apreciable al tejido de rata, y cualquier toxicidad se consideraría no específica. Las variantes a niveles de dosis de 840 y 2105 ug/m2 de MMAF se compararon con trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF a 2105 ug/m2 .
Los animales en los grupos 1, 2, 3, 4, 6, y 7 (Vehículo, 9,94 y 24,90 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, 10,69 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, y 10,17 y 25,50 mg/kg de trastuzumab-MC-MMAF, respectivamente) ganaron peso durante el estudio. Los animales a los grupos 5 y 8 (26,78 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF y 21,85 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, respectivamente) perdieron peso durante el estudio. En el Día del Estudio 5, el cambio en los casos corporales de animales en los grupos 2, 6 y 7 no fueron significativamente diferentes de los animales del grupo 1. The cambio de pesos corporales de los animales en los grupos 3, 4, 5 y 8 fueron de los de los animales del grupo 1 (Ejemplo 19).
Las ratas tratadas con trastuzumab-MC-MMAF (grupos 6 que 7) eran indistinguible es de los animales de control tratados con vehículo a ambos niveles de dosis; es decir este conjugado mostró un perfil de seguridad superior en este modelo. Las ratas tratadas con trastuzumab-MC-val-cit-MMAF (sin del resto de PAB autoinmolativo; grupos 2 ir 3) mostraron cambios dependientes de la dosis habituales para conjugados de MMAF; del alcance de los cambios fue menor en comparación con un conjugado de MC-val-cit-PAB-MMAF de longitud total (grupo 8). Los recuentos de plaquetas el Día 5 fueron de aproximadamente un 30 % de los valores de la medida inicial en animales del grupo 3 (trastuzumab-MC-val-cit-MMAF a dosis elevada) en comparación con un 15 % en animales del grupo 8 (trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF a dosis elevada). El aumento de enzimas hepáticas AST que ALT, de bilirrubina del alcance de trombocitopenia temas evidentes en animales tratados con trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF (grupos 4 Inc. 5) de una manera dependiente de la dosis; animales del grupo 5 (grupo de dosis elevadas) mostraron el día 5 niveles de ALT de aproximadamente 10x el valor de la medida inicial y las plaquetas se redujeron en aproximadamente un 90 % en el momento de la necropsia.
Ratas Sprague Dawley Hembra también se dosificaron con niveles elevados (Ejemplo 19, estudio de Dosis Elevada: Grupos 2, 3, 4) con trastuzumab-MC-MMAF, y control de Vehículo (Grupo 1). Se observaron ligeras señales de toxicidad, incluyendo elevación de enzimas hepáticas dependientes de la dosis ALT, AST y GGT. El Día 5, animales en el grupo de dosis más elevadas mostraron un aumento de 2 veces de ALT y un aumento de 5 veces de AST; GGT también está elevada (6 U/l). Los niveles enzimáticos muestran una tendencia hacia la normalización el Día 12. Hubo una granulocitosis moderada en todos los tres grupos de dosis el Día 5, el recuento de plaquetas permanece básicamente sin cambios en todos los animales. Los cambios morfológicos fueron los suaves; animales tratados con un nivel de dosis de 4210 µg/m2 (Grupo 2) mostró histología sin complicaciones de hígado, bazo, timo, intestinos y médula ósea. Se observó un leve aumento de la actividad apoptótica y mitótica en timo e hígado, respectivamente en animales tratados con el nivel de dosis de 5500 µg/m2 (Grupo 3). La medular ósea era normocelular, pero mostró evidencias de hiperplasia granulocítica, que es coherente con la granulocitosis absoluta observada en los recuentos de sangre periférica en estos animales. Los animales con la dosis más elevada en el grupo 4 mostraron cualitativamente las mismas características; la actividad mitótica en el hígado parece en cierto modo mayor en comparación con animales en el Grupo 3. Además, se observó hematopoyesis extramedular en bazo e hígado.
EphB2R es un receptor de tirosina quinasa TM de tipo 1 con una homología próxima entre ratón y ser humano, y se sobreexpresa en células de cáncer colorrectal. 2H9 es un anticuerpo frente a EphB2R. El anticuerpo desnudo no tienen efecto en el crecimiento tumoral, pero 2H9-val-cit-MMAE eliminó células que expresan EphB2R demostró eficacia en un modelo de xenoinjerto de ratón que usa tumores de colon humano CXF1103 (Mao et al. (2004) Cancer Res. 64: 781-788). Tanto 2H9 como 7C2 son anticuerpos anti-HER2 de IgG1 de ratón. Se compararon los perfiles de toxicidad de 2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF (3.7 MMAF/Ab), 7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF (4 MMAF/Ab), que trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF (5.9 MMAF/Ab). Las diferencias en la estructura de cada inmunoconjugado o porción de fármaco del inmunoconjugado pueden afectar a la farmacocinetica y por último al perfil de seguridad. El anticuerpo de trastuzumab humanizado no se une de forma apreciable al tejido de rata, y cualquier toxicidad se consideraría no específica.
TOXICIDAD/SEGURIDAD EN MONO CYNOMOLGUS
Del mismo modo que el estudio de toxicidad la seguridad en ratas, monos cynomolgus se trataron con ADC seguido de medidas de enzimas hepáticas, e inspección y análisis de los efectos sobre diversos órganos. Las observaciones macroscópicas incluyeron cambios en los pesos corporales y signos de lesiones y sangrado. Se realizaron parámetros de patología clínica (química y hematología en suero), histopatología, y necropsia en animales dosificados (Ejemplo 19).
El conjugado de anticuerpo y fármaco, H-MC-vc-PAB-MMAE (H = trastuzumab unido a través de cisteína) no mostró evidencia de toxicidad hepática a ninguno de los niveles de dosis sometidos a ensayo. Los granulocitos de sangre periférica mostraron reducción después de una sola dosis de 1100 mg/m2 con recuperación completa 14 días después de la dosis. El conjugado de anticuerpo y fármaco H-MC-vc-PAB-MMAF mostró aumento de enzimas hepáticas a 550 (transitorio) y 880 mg/m2 de nivel de dosis, ninguna evidencia de granulocitopenia, y una disminución de plaquetas dependiente de la dosis, transitoria (grupos 2 y 3).
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4.6 SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS  
Los Compuestos a modo de Ejemplo y los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden preparar usando los procedimientos de síntesis que se describen a continuación en los Esquemas 5-16. Tal como se describe con más detalle a continuación, los Compuestos a modo de Ejemplo o los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden preparar convenientemente usando un Conector que tiene un sitio reactivo para la unión al Fármaco y Ligando. En un ejemplo, un Conector tiene un sitio reactivo que quien un grupo electrófilo que es reactivo a un grupo no nucleófilo presente en un Ligando, tal como, pero no limitado a un anticuerpo. Grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen pero no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrófilo de un Conector y forma un enlace covalentes con una unidad Conectora. Grupos electrófilos útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrófilo proporciona un sitio conveniente para unión a anticuerpos.
En otro ejemplo, un Conector tiene un sitio reactivo que has un grupo nucleófilo que es reactivo a un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo de aldehído y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace, lente con una unidad de anticuerpo. Grupos nucleófilos útiles en un Conector incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para unión a un Conector.
Además, grupos funcionales de ácido carboxílico y grupos funcionales de cloroformiato son sitios reactivos útiles para un Conector porque pueden reaccionar con grupos amino secundario de un Fármaco para formar una unión amida. Además es útil como un sitio reactivo un grupo funcional carbonato en un Conector, tal como pero no limitado a p-nitrofenil carbonato, que puede reaccionar con un grupo amino de un Fármaco, tal como pero no limitado a Nmetil valina, para formar una unión carbamato. Por lo general, los Fármacos basados en péptidos se preparan mediante la formación de un enlace peptídico entre dos o más fragmentos de aminoácido y/o péptido. Dichos enlaces peptídico se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schröder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
La síntesis de un Bastidor ilustrativo que tiene un grupo electrófilo de maleimida se ilustra continuación en los Esquemas 8-9. En el Esquema 10 se describen métodos de síntesis generales útiles para la síntesis de un Conector. El Esquema 11 muestra la construcción de una unidad Conectora que tiene un grupo val-cit, un grupo electrófilo de maleimida y un grupo Espaciador autoinmolativo PAB. El Esquema 12 representa la síntesis de un Conector que tiene un grupo phe-lys, un grupo electrófilo de maleimida, con y sin el grupo Espaciador autoinmolativo PAB. El Esquema 13 presenta una descripción general para la síntesis de un Compuesto de Fármaco-Conector, mientras que el Esquema 14 presenta una ruta alternativa para preparar un Compuesto de Fármaco-Conector. El Esquema 15 representa la síntesis de un conector ramificado que contiene un grupo BHMS. El Esquema 16 describe la unión de un anticuerpo a un Compuesto de Fármaco-Conector para formar un Conjugado de Fármaco-Conector-Anticuerpo, y el Esquema 14 ilustra la síntesis de Conjugados de Fármaco-Conector-Anticuerpo que tienen, por ejemplo pero no se limitan a, 2 o 4 fármacos por Anticuerpo.
Tal como se describe con más detalle a continuación, los Conjugados a modo de Ejemplo se preparan convenientemente usando un Conector que tiene dos o más Sitios Reactivos para la unión al y a un Ligando. En un ejemplo, un Conector tiene un sitio Reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo a un grupo nucleófilo presente en un Ligando, tal como un anticuerpo. Grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen pero no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrófilo en un Conector y forma un enlace covalente con una unidad Conectora. Grupos electrófilos útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrófilo proporciona un sitio conveniente para unión a anticuerpos.
En otro ejemplo, un Conector tiene un sitio Reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo a un grupo electrófilo presente en un Ligando, tal como un anticuerpo. Grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos aldehído y cetona carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formaron el tráfico Valente con una unidad de anticuerpo. Grupos nucleófilos útiles en un Conector incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para unión a un Conector.
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4.6.1 SÍNTESIS DE RESTOS DE FÁRMACO
Por lo general, los Fármacos basados en péptido se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más fragmentos de aminoácido y/o péptido. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con 5 el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schröder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
Los restos de fármacos de auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos generales de: Patente de Estados Unidos Nº 5635483; Patente de Estados Unidos Nº 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. 10 Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; y Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863.
En una realización, un Fármaco se prepara por combinación de aproximadamente un equivalente estequiométrico de un dipéptido y un tripéptido, preferentemente en una reacción en una etapa en condiciones de condensación 15 adecuadas. Este enfoque se ilustra en los Esquemas 5-7, que siguen a continuación.
El Esquema 5 ilustra la síntesis de una unidad F de tripéptido N-terminal que es un compuesto intermedio útil para la síntesis de los compuestos de fármaco de Fórmula Ib.
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Tal como se ilustra en el Esquema 5, un aminoácido protegido A (en el que PG representa un grupo de protección de amina, R4 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquil-arilo, alquil-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, alquil-(heterociclo C3-C8) en el que R5 se selecciona entre H y metilo; o 25 R4 y R5 se unen, tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el átomo de carbono al que están unidos), se acopla con el éster t-butílico B (en el que R6  1-C8; y R7 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquil-arilo, alquil-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil-(heterociclo C3-C8)) en condiciones adecuadas de acoplamiento, por ejemplo, en
30 presencia de PyBrop y diisopropiletilamina, o usando DCC (véase, por ejemplo, Miyazaki, K. et. al. Chem. Pharm. Bull. 1995, 43 (10), 1706-1718).
Grupos protectores PG adecuados, y métodos de síntesis adecuados para proteger un grupo amino con un grupo protector son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Greene, T.W. y Wuts, P.G.M., Protective Groups in
35 Organic Synthesis, 2ª Edición, 1991, John Wiley & Sons. Los aminoácidos A protegidos a modo de ejemplo son PG-Ile y, particularmente, PG-Val, mientras que otros aminoácidos protegidos adecuados incluyen, sin limitación: PGciclohexilglicina, PG-ciclohexilalanina, ácido PG-aminociclopropano-1-carboxílico, ácido PG-aminoisobutírico, PGfenilalanina, PG-fenilglicina, y PGtercbutilglicina. Z es un grupo protector a modo de ejemplo. Fmoc es otro grupo protector a modo de ejemplo. Un a modo de ejemplo éster t-butílico B es éster t-butílico de dolaisoleucina.
40 El dipéptido C se puede purificar, por ejemplo, usando cromatografía, y posteriormente desproteger, por ejemplo, usando H2 y Pd al 10 %-C en etanol cuando PG es benciloxicarbonilo, o usando dietilamina para la retirada de un grupo protector Fmoc. La amina D resultante forma rápidamente un enlace peptídico con un aminoácido BB (en el que R1 se selecciona entre -H, -alquilo C1-C8 y -carbociclo C3-C8; y R2 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8; o R1 y R2 se unen, tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, -alquilo C -C8 y -carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6, y forman un anillo con el átomo de nitrógeno al que están unidos; y R3 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquil-arilo, alquil-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil-(heterociclo C3-C8)). N,N-Dialquil aminoácidos son aminoácidos a modo de ejemplo para BB, tal como las N,N-dimetil valina disponible en el mercado. Se pueden preparar otros N,Ndialquil aminoácidos por bis -alquilación reductora usando procedimientos conocidos (véase, por ejemplo, Bowman, R.E, Stroud, H.H J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340). Fmoc-Me-L-Val y Fmoc-Me-L-glicina son dos aminoácidos BB a modo de ejemplo útiles para la síntesis de derivados de N-monoalquilo. La amina D y el aminoácido BB reaccionan para proporcionar el tripéptido E usando reactivo de acoplamiento DEPC con trietilamina como la base. El grupo protector de E con el extremo C se desprotege posteriormente usando HCl para proporcionar el compuesto tripeptídico de fórmula F.
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La metodología de acoplamiento a DEPC ilustrativa y la metodología de acoplamiento a PyBrop mostrada en el Esquema 5 se resumen a continuación en el Procedimiento General A y en el Procedimiento General B, respectivamente. La metodología ilustrativa para la desprotección de una amina protegida con Z a través de hidrogenación catalítica se resume a continuación en el Procedimiento General C.
Procedimiento General A: Síntesis de péptidos usando DEPC. El aminoácido o péptido N-protegido o N,Ndisustituido D (1,0 equiv.) y una amina BB (1,1 equiv.) se diluyen con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano (de 0,1 a 0,5 M). Una base orgánica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 equiv.) se añade a continuación, seguido de DEPC (1,1 equiv.). La solución resultante se agita, preferentemente en atmósfera de argón, durante hasta 12 horas a la vez que se va controlando por HPLC o TLC. El disolvente se retira al vacío a temperatura ambiente, y el producto en bruto se purifica usando, por ejemplo, HPLC o cromatografía en columna ultrarrápida (columna en gel de sílice). Las fracciones relevantes se combinan y se concentran al vacío para proporcionar el tripéptido E que se seca al vacío durante una noche.
Procedimiento general B: Síntesis de péptidos usando PyBrop. El aminoácido B (1,0 equiv.), opcionalmente que tiene un grupo protector carboxilo, se diluye con un disolvente orgánico aprótico tal como diclorometano o DME para proporcionar una solución de una concentración entre 0,5 y 1,0 mM, a continuación se añade diisopropiletilamina (1,5 equiv.). El aminoácido Fmoc-, o Z-protegido A (1,1 equiv.) se añade en forma de un sólido en una porción, a continuación se añade PyBrop (1,2 equiv.) a la mezcla resultante. La reacción se controla por TLC o HPLC, seguido de un procedimiento de tratamiento similar al que se ha descrito en el Procedimiento General A.
Procedimiento general C: Retirada de Z a través de hidrogenación catalítica. El aminoácido o péptido C Zprotegido se diluye con etanol para proporcionar una solución de una concentración entre 0,5 y 1,0 mM en un recipiente adecuado, tal como un matraz de fondo redondo de paredes gruesas. Se añade paladio al 10 % sobre carbono (5-10 % en p/p) y la mezcla de reacción se coloca en una atmósfera de hidrógeno. La evolución de la reacción se controla usando HPLC y generalmente está completa en 1-2 h. La mezcla de reacción se filtra a través de un lecho de celite lavado previamente y el celite se lava de nuevo con un disolvente orgánico polar, tal como metanol después de filtración. La solución de eluyente se concentra al vacío para proporcionar un resto que se diluye con un disolvente orgánico, preferentemente tolueno. El disolvente orgánico se retira a continuación al vacío para proporcionar la amina C desprotegida.
El Esquema 6 muestra un método útil para preparar un dipéptido C-terminal de fórmula K y un método para acoplamiento del dipéptido de fórmula K con el tripéptido de fórmula F para preparar compuestos de fármaco de Fórmula Ib.
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El dipéptido K se puede preparar fácilmente por condensación del aminoácido modificado Boc-Dolaproína G (véase, por ejemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), con una amina de fórmula H usando agentes de condensación bien conocidos en la química de péptidos, tales como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, tal como se muestra en el Esquema 5.
El dipéptido de fórmula K se puede acoplar a continuación con un tripéptido de fórmula F usando el Procedimiento General D para preparar los compuestos de fármaco protegidos con Fmoc de fórmula L que se pueden desproteger posteriormente usando el Procedimiento General E para proporcionar los compuestos de fármaco de fórmula (Ib).
Procedimiento general D: Síntesis de Fármacos. Una mezcla de dipéptido K (1,0 equiv.) y tripéptido F (1 equiv.) se diluye con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano, para formar una solución 0,1 M, a continuación se añade un ácido fuerte, tal como ácido trifluoroacético (1/2 en v/v) se añade y la mezcla resultante se agita en una atmósfera de nitrógeno durante dos horas a 0 ºC. La reacción se puede controlar usando TLC o, preferentemente, HPLC. El disolvente se retira al vacío y el resto resultante se seca de forma azeotrópica dos veces, preferentemente usando tolueno. El resto resultante se seca a alto vacío durante 12 h y después se diluye con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano. A continuación se añade una base orgánica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 equiv.), seguido de PyBrop (1,2 equiv.) o DEPC (1,2 equiv.) dependiendo de la funcionalidad química en el resto. La mezcla de reacción se controla por TLC o HPLC y después de la finalización, la reacción se somete a un procedimiento de tratamiento similar o idéntico al que se ha descrito en el Procedimiento General A. 
Procedimiento general E: Retirada de Fmoc usando dietilamina. Un Fármaco protegido con Fmoc se diluye con un disolvente orgánico aprótico tal como diclorometano y a la solución resultante se le añade dietilamina (1/2 en v/v). La evolución de la reacción se controla por TLC o HPLC y por lo general se completa en 2 h. La mezcla de reacción se concentra al vacío y el resto resultante se seca de forma azeotrópica, preferentemente usando tolueno, después se seca a alto vacío para proporcionar el Fármaco Ib que tiene un grupo amino desprotegido.
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El Esquema 7 muestra un método útil para preparar derivados de MMAF de Fórmula (Ib).
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5 El dipéptido O se puede preparar fácilmente por condensación del aminoácido modificado Boc-Dolaproína G (véase, por ejemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), con un aminoácido protegido de fórmula M usando agentes de condensación bien conocidos en la química de péptidos, tales como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, tal como se muestra en los Esquemas 5 y 6.
10 El dipéptido de fórmula O se puede acoplar a continuación con un tripéptido de fórmula F usando el Procedimiento General D para preparar los compuestos de MMAF protegidos con Fmoc de fórmula P que se pueden desproteger posteriormente usando el Procedimiento General E para proporcionar los compuestos de fármaco de MMAF de Fórmula (Ib).
15 Por lo tanto, los métodos anteriores son útiles para preparar Fármacos como se describe en el presente documento.
4.6.2 SÍNTESIS DE CONECTOR DE FÁRMACO
Para preparar un Compuesto de Fármaco-Conector, el Fármaco se hace reaccionar con un sitio reactivo en el 20 Conector. En general, el Conector puede tener la estructura:
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cuando están presentes tanto una unidad Espaciadora (-Y-) como una unidad Bastidor (-A-). Como alternativa, el Conector puede tener la estructura:
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cuando la unidad Espaciadora (-Y-) está ausente. 10 El Conector también puede tener la estructura:
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cuando están ausentes tanto la unidad Bastidor (-A-) como la unidad Espaciadora (-Y-). El Conector también puede tener la estructura:
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20 cuando están ausentes tanto la unidad Aminoácido (W) como la Unidad Espaciadora (Y).
En general, un Conector adecuado tiene una unidad Aminoácido unida a una Unidad Bastidor opcional y a una Unidad Espaciadora opcional. El Sitio Reactivo 1 está presente en el extremo de la unidad Espaciadora y el sitio Reactivo 2 está presente en el extremo del Bastidor. Si no está presente una unidad Espaciadora, entonces el sitio
25 Reactivo 1 está presente en el extremo C de la unidad Aminoácido. En un ejemplo, el Sitio Reactivo Nº 1 es reactivo a un átomo de nitrógeno del Fármaco, y el Sitio Reactivo Nº 2 es reactivo a un grupo sulfhidrilo en el Ligando. Los Sitios Reactivos 1 y 2 pueden ser reactivos a diferentes grupos funcionales.
En un ejemplo, el Sitio Reactivo Nº 1 es 30
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En otro ejemplo, el Sitio Reactivo Nº 1 es
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Además, en otro ejemplo, el Sitio Reactivo Nº 1 es un p-nitrofenil carbonato de que tiene la fórmula
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En un ejemplo, el Sitio Reactivo Nº 2 es un grupo aceptor de tiol. Grupos aceptores de tiol adecuados incluyen grupos haloacetamida que tienen la fórmula
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en la que X representa un grupo saliente, preferentemente O-mesilo, O-tosilo, -Cl,-Br, o -I; o un grupo maleimida que tiene la fórmula
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Los Conectores útiles se pueden obtener a través de agentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o preparar tal como se resume en los Esquemas 8-10 que siguen a continuación.
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en el que X es -CH2- o -CH2OCH2-; y n es un número entero que varía de 0-10 cuando X es -CH2- ; o 1-10 cuando X es -CH2OCH2-.
El método que se muestra en el Esquema 9 combina maleimida con un glicol en condiciones de Mitsunobu para preparar un Bastidor de polietilenglicol maleimida (véase por ejemplo, Walker, M.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5), seguido de instalación de un grupo de Sitio Reactivo de p-nitrofenil carbonato.
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en el que E es -CH2- o -CH2OCH2-; y e es un número entero que varía de 0-8.
Como alternativa, los bastidores de PEG-maleimida y PEG-haloacetamida se pueden preparar tal como se describe en Frisch, et al., Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186. El Esquema 10 ilustra una síntesis general de una unidad Conectora ilustrativa que contiene un grupo Bastidor de maleimida y opcionalmente una unidad Espaciadora autoinmolativa de éter p-aminobencílico.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno,-nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; y n es un número entero que varía de 0-10.
15 Los Bastidores útiles se pueden incorporar en un Conector usando los compuestos intermedios disponibles en el mercado en Molecular Biosciences (Boulder, CO) que se describen a continuación mediante el uso de técnicas
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conocidas de síntesis orgánica. Los Bastidores de fórmula (IIIa) se pueden introducir en un Conector haciendo reaccionar los siguientes compuestos intermedios con el extremo N de una unidad Aminoácido tal como se representa en los Esquemas 11 y 12:
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en el que n es un número entero que varía de 1-10 y T es -H o -SO3Na;
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en el que n es un número entero que varía de 0-3;
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15 y
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Las unidades Bastidor de fórmula (IIIb) se pueden introducir en un Conector haciendo reaccionar los siguientes 20 compuestos intermedios con el extremo N de una unidad Aminoácido:
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en el que X es -Br o -I; y
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Las unidades Bastidor de fórmula (IV) se pueden introducir en un Conector haciendo reaccionar los siguientes compuestos intermedios con el extremo N de una unidad Aminoácido:
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y
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Las unidades Bastidor de fórmula (Va) se pueden introducir en un Conector haciendo reaccionar los siguientes compuestos intermedios con el extremo N de una unidad Aminoácido:
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y
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5
Otros Bastidores útiles se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos. Los Bastidores de aminooxi de la fórmula que se muestra a continuación se pueden preparar por tratamiento de haluros de alquilo con N-Bochidroxilamina de acuerdo con procedimientos que se describen en Jones, D.S. et al., Tetrahedron Letters, 2000, 41
10 (10), 1531-1533; y Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23(11), 4441-4447.
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en la que -R17-se selecciona entre -alquileno C1-C10-, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquil C1-C81
15 C10-arileno-, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2O)r-,(CH CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1-10; Los Bastidores de isotiocianato de la fórmula que se muestra a continuación se pueden preparar a partir de cloruros de ácido isotiocianatocarboxílico tal como se describe en Angew. Chem., 1975, 87 (14): 517.
20
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en la que -R17- es tal como se describe en el presente documento.
25 El Esquema 11 nuestro método para obtener un Conector dipeptídico de val-cit que tiene un Bastidor de maleimida y opcionalmente un Espaciador autoinmolativo de p-aminobencilo.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0
4.
El Esquema 12 ilustra la síntesis de una unidad Conectora dipeptídica de phe-lys(Mtr) que tiene una unidad Bastidor de maleimida y una unidad Espaciadora autoinmolativa de p-aminobencilo. El material de partida de AD (lys(Mtr)) está disponible en el mercado (Bachem, Torrance, CA) o se puede preparar de acuerdo con Dubowchik, et al. Tetrahedron Letters (1997) 38: 5257-60.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0
4.
5 Tal como se muestra en el Esquema 13, un Conector se puede hacer reaccionar con un grupo amino de un Compuesto de Fármaco de Fórmula (Ib) para formar un Compuesto de Fármaco-Conector que contiene un grupo amida o carbamato, que une la unidad de Fármaco con la unidad Conectora. Cuando el Sitio Reactivo Nº 1 es un grupo ácido carboxílico, tal como en el Conector AJ, la reacción de acoplamiento se puede realizar usando HATU o
10 PyBrop y una base de amina apropiada, dando como resultado un Compuesto de Fármaco-Conector AK, que contiene un enlace amida bond entre la unidad de Fármaco y la unidad Conectora. Cuando el Sitio Reactivo Nº 1 es un carbonato, tal como en el Conector AL, el Conector se puede acoplar con el Fármaco usando HOBt en una mezcla de DMF/piridina para proporcionar un Compuesto de Fármaco-Conector AM, que contiene un enlace de carbamato entre la unidad de Fármaco y la unidad Conectora
15 Como alternativa, cuando el Sitio Reactivo Nº 1 es un buen grupo saliente, tal como en el Conector AN, el Conector se puede acoplar con un grupo amina de un Fármaco a través de un proceso de sustitución nucleófila para proporcionar un Compuesto de Fármaco-Conector que tiene una unión de amina (AO) entre la unidad de Fármaco y la unidad Conectora.
20 Los métodos ilustrativos útiles para unir un Fármaco a un Ligando para formar un Compuesto de Fármaco-Conector
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se representan en el Esquema 13 y se resumen en los Procedimientos Generales G-H.
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Procedimiento General G: Formación de amida usando HATU. Un Fármaco (Ib) (1,0 equiv.) y un Conector Nprotegido que contiene un sitio Reactivo de ácido carboxílico (1,0 equiv.) se diluyen con un disolvente orgánico adecuado, tal como diclorometano, y la solución resultante se trata con HATU (1,5 equiv.) y una base orgánica, preferentemente piridina (1,5 equiv.). La mezcla de reacción se deja en agitación en una atmósfera inerte, preferentemente argón, durante 6 h, tiempo durante el cual la mezcla de reacción se controla usando HPLC. La mezcla de reacción se concentra y el resto resultante se purifica usando HPLC para producir la amida de fórmula
AK.
Procedimiento H: Formación de carbamato usando HOBt. Una mezcla de un Conector AL que tiene un sitio Reactivo de p-nitrofenil carbonato (1,1 equiv.) y Fármaco (Ib) (1,0 equiv.) se diluyen con un disolvente orgánico aprótico, tal como DMF, para proporcionar una solución que tienen una concentración de 50-100 mM, y la solución resultante se trata con HOBt (2,0 equiv.) y se coloca en una atmósfera inerte, preferentemente argón. La mezcla de reacción se deja en agitación durante 15 min, a continuación se añade una base orgánica, tal como piridina (1/4 en v/v), y la evolución de la reacción se controla usando HPLC. El Conector por lo general se consume en 16 h. Después, la mezcla de reacción se concentra al vacío y el resto resultante se purifica usando, por ejemplo, HPLC para producir el carbamato AM.
Un método alternativo para preparar Compuestos de Fármaco-Conector se resume en el Esquema 14. Usando el método del Esquema 14, el Fármaco se une a una unidad Conectora parcial (ZA, por ejemplo), que no tiene unida una unidad Bastidor. Ésto proporciona el compuesto intermedio AP, que tiene una unidad Aminoácido que tiene un extremo N protegido con Fmoc. El grupo Fmoc se retira a continuación y el compuesto intermedio de amina AQ resultante se une a continuación a una unidad Bastidor a través de la reacción de acoplamiento catalizada usando PyBrop o DEPC. La preparación de Compuestos de Fármaco-Conector que contienen un Bastidor AR de bromoacetamida o un Bastidor AS de PEG maleimida se ilustra en el Esquema 14.
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en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0
4.
La metodología útil para la preparación de una unidad Conectora que contiene un espaciador ramificado se muestra en el Esquema 15.
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El Esquema 15 ilustra la síntesis de un conector dipeptídico deval-cit que tiene una unidad Bastidor de maleimida y una unidad de bis(4-hidroximetil)estireno (BHMS). La síntesis del compuesto intermedio de BHMS (AW) se ha
5 mejorado a partir de procedimientos anteriores de bibliografía (véase la Publicación Internacional Nº WO 9813059 de Firestone et al., y Crozet, M.P.; Archaimbault, G.; Vanelle, P.; Nouguier, R. Tetrahedron Lett. (1985) 26: 5133-5134) y usa como materiales de partida, (4-nitrobencil)fosfonato de dietilo (AT) disponible en el mercado y 2,2-dimetil-1,3dioxan-5-ona (AU) disponible en el mercado. Los conectores AY y BA se pueden preparar a partir del compuesto AW usando la metodología que se describe en el Esquema 9.
10
4.6.3 CONECTORES DENDRÍTICOS
El conector puede ser un conector de tipo dendrítico para unión covalente de más de un resto de fármaco a través de un resto conector multifuncional, de ramificación con un Ligando, tal como pero no limitado a un anticuerpo (Sun
15 et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Los conectores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir la carga, que está relacionada con la potencia del Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando. Por lo tanto, cuando un anticuerpo modificado genéticamente con cisteína lleva solamente un grupo reactivo tiol de cisteína, una multitud de restos de fármaco se pueden unir a través de un conector dendrítico.
20 Las siguientes realizaciones a modo de ejemplo de reactivos de conector dendrítico permiten que se conjuguen hasta nueve reactivos de resto de fármaco nucleófilo por reacción con los grupos funcionales cloroetilo de la mostaza de nitrógeno
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4.6.4 CONJUGACIÓN DE RESTOS DE FÁRMACOS A ANTICUERPOS
El Esquema 16 ilustra metodología útil para preparar conjugados de Fármaco-Conector-Ligando que tienen de
10 aproximadamente 2 a aproximadamente 4 fármacos por anticuerpo. Un anticuerpo se trata con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) para reducir alguno o todos los restos disulfuro de la cisteína para formar grupos tiol de cisteína nucleófilos (-CH2SH). El anticuerpo parcialmente reducido reacciona de este modo con compuestos de fármaco-conector, o reactivos de conector, con grupos funcionales electrófilos tales como maleimida o α-halo carbonilo, de acuerdo con el método de conjugación en la página 766 de Klussman, et al. (2004), Bioconjugate
15 Chemistry 15 (4): 765-773.
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Por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, AC10, disuelto en borato sódico 500 mM y cloruro sódico 500 mM a pH 8,0 20 se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Después de incubación a 37 ºC durante aproximadamente 30
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minutos, el tampón se intercambia mediante elución sobre resina Sephadex G25 y elución con PBS con DTPA 1 mM. El valor de tiol/Ab se comprueba por determinación de la concentración de anticuerpos reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinación del absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría con hielo. El conector de 5 fármaco, por ejemplo, MC-val-cit-PAB-MMAE en DMSO, disuelto en acetonitrilo y agua en una concentración conocida, se añade al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para inactivar la reacción se protege cualquier grupo tiol de anticuerpos sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y el ADC, por ejemplo, AC10-MC-vc-PAB-MMAE, se purifica y se desala por elución a través de resina G25 en PBS, se filtra a través de filtros de 0,2 µm en condiciones
10 estériles, y se congela para su almacenamiento.
Se preparó diversos conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC), con diversos conectores, y los restos de fármaco, MMAE y MMAF. La siguiente tabla es un grupo a modo de ejemplo de ADC que se prepararon siguiendo el protocolo del Ejemplo 27, y se caracterizaron por HPLC y ensayo de carga de fármaco.
15 Diana ADC cantidad aislada (mg) relación fármaco/Ab (antígeno) 0772P 16E12-MC-vc-PAB-MMAE 1,75 4 0772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAE 46,8 4,4 0772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAF 54,5 3,8 Brevican Brevican-MC-MMAF 2 6 Brevican Brevican-MC-vc-MMAF 2 6 Brevican Brevican-MC-vc-PAB-MMAF 1,4 6 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAE 38,1 4,3 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAF 43 4,1 CRIPTO 11F4-MC-vc-PAB-MMAF 6 4,8 CRIPTO 25G8-MC-vc-PAB-MMAF 7,4 4,7 E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 2,3 4,6 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 2,9 4,6 E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 1,4 3,8 E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 5,1 4 E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 3 4,6 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 4,8 4,1 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 24,7 4,4 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 29,9 7,1 EphB2R 2H9-MC-fk-PAB-MMAE 25 7,5 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 175 4,1 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 150 3,8 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 120 3,7 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 10,7 4,4 IL-20Ra IL20Ra-fk-MMAE 26 6,7 IL-20Ra TL20Ra-vc-MMAE 27 7,3 EphB2 EL8-MC-vc-PAB-MMAE 251 3,7 MDP MDP-vc-MMAE 32 MPF 19C3-vc-MMAE 1,44 6,5 MPF 7D9-vc-MMAE 4,3 3,8 MPF 19C3-vc-MMAE 7,9 3 MPF 7D9-MC-vc-PAB-MMAF 5 4,3
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Napi3b 10H1-vc-MMAE 4,5 4,6 Napi3b 4C9-vc-MMAE 3,0 5,4 Napi3b 10H1-vc-MMAE 4,5 4,8 Napi3b 10H1-vc-MMAF 6,5 4 NCA 3E6-MC-flc-PAB-MMAE 49,6 5,4 NCA 3E6-MC-vc-PAB-MMAE 56,2 6,4 PSCA PSCA-fk-MMAE 51,7 8,9 PSCA PSCA-vc-MMAE 61,1 8,6 Napi3b 10H1-MC-vc-PAB-MMAE 75 4,2 Napi3b 10H1-MC-vc-PAB-MMAF 95 4,4 Napi3b 10H1-MC-MMAF 92 4 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 79 5 EphB2R 2H9-MC-MMAF 92 4,9 0772P 11D10(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 79 4,3 0772P 11D10(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAF 70 4,5 0772P 11D10(Fc quimera)-MC-MMAF 23 4,5 Brevican 6D2-MC-vc-PAB-MMAF 0,3 4,5 Brevican 6D2-MC-MMAF 0,36 4,5 EphB2R 2H9(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 1983 4,3 E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 14,1 4,6 E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAF 16,4 4,5 E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 10,5 4,1 E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAF 10,2 3,8 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 58,6 3,8 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 8 3,1 0772P 11D10(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 340 3,9 Steap1 (Steap1-92)-MC-vc-PAB-MMAE 3,5 4 Steap1 (Steap1-92)-MC-vc-PAB-MMAF 4,7 4 Steap1 (Steap1-120)-MC-vc-PAB-MMAE 2 4 Steap1 (Steap1-120)-MC-vc-PAB-MMAF 2,3 4 E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 52,2 4,5
4.7 COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN
También se describe una composición que incluye una cantidad eficaz de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o
5 Conjugado a modo de Ejemplo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por conveniencia, las unidades de Fármacos y Compuestos de Fármaco-Conector se pueden mencionar como Compuestos a modo de Ejemplo, mientras que Conjugados Fármaco-Ligando y Conjugados Fármaco-Conector-Ligando se pueden mencionar como Conjugados a modo de Ejemplo. Las composiciones son adecuadas para administración veterinaria
o en seres humanos.
10 Las presentes composiciones pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un paciente. Por ejemplo, la composición puedes estar en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las vías de administración habituales incluyen, sin limitación, oral, tópica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intratumoral, e intranasal. La administración parenteral incluye inyecciones subcutánea, intravenosa, intramuscular,
15 inyección intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones se pueden administrar por vía parenteral. Como alternativa, los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo o composiciones se pueden administrar por vía intravenosa.
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Las composiciones farmacéuticas se pueden formular con el fin de que permitan que un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo esté biodisponible tras la administración de la composición un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, en las que por ejemplo, un comprimido puede ser una sola unidad de dosificación, y un envase de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo en forma de aerosol pueda contener una pluralidad de unidades de dosificación.
Los materiales usados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los expertos en la materia que la dosificación óptima del ingrediente o ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerá de diversos factores. Factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, ser humano), la forma en particular del Compuesto a modo de Ejemplo
o Conjugado a modo de Ejemplo, la forma de administración, y la composición usada.
El vehículo o excipiente farmacéuticamente activo puede ser de partículas, de modo que las composiciones, por ejemplo, estén en forma de comprimido o de polvo. El vehículo o vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral o un líquido inyectable. Además, el vehículo o vehículos pueden ser gaseosos o con partículas, con el fin de proporcionar una composición de aerosol útil, por ejemplo, en administración por inhalación.
Cuando está destinada a la administración oral, la composición está preferentemente en forma sólida o líquida, en la que las formas semisólida, semilíquida, suspensión y gel están incluidas dentro de las formas que se consideran en el presente documento como sólidas o líquidas.
Como una composición sólida para administración oral, la composición se prevé formular en una forma de polvo, gránulo, comprimido fabricado por compresión, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o similares. Dicha composición sólida contiene por lo general uno o más diluyentes inertes. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etil celulosa, celulosa microcristalina, o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como ácido algínico, alginato sódico, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; agentes deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente saborizante tales como menta, salicilato de metilo por sabor a naranja, y un agente colorante.
Cuando la composición está en forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, ésta puede contener, además de materiales del tipo que se han mencionado anteriormente, un vehículo líquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composición puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser útil para administración oral o para administración por inyección. Cuando está destinado para administración oral, una composición que de comprender uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador del sabor. En una composición para administración por inyección, también se puede incluir uno o más tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizante el agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, también pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro sódico isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como medio disolvente o de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes de quelación tales como ácido etilendiamintetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para la justa de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. Una composición parenteral puede estar incluida en ampolla, una jeringa desechable o un vial de dosis múltiples fabricado de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante a modo de ejemplo. Una composición inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad del Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección en particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden usar opcionalmente ensayo in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos óptimos de dosificación. La dosis precisa a usar en las composiciones dependerá también de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad o el trastorno, y se debería decidir de acuerdo con el criterio del médico en cada una de las circunstancias del paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo de modo que se obtendrá una dosificación adecuada. Por lo general, esta cantidad es de al menos aproximadamente un 0,01 % de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo en peso de la composición. Cuando se pretende que sea para administración oral, esta cantidad se puede variar para que oscile de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 80 % en peso de la composición. Las composiciones orales pueden comprender de aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 50 % del Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo el peso de la composición. Además, las composiciones presentes se pueden preparar de modo que una unidad de dosificación parenteral contenga de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 2 % el peso del Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo.
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Para la administración intravenosa, la composición de comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo por kg de peso corporal del animal. La composición puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo por kg de peso corporal del animal. La cantidad administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo.
Generalmente, la dosificación de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo administrada a un paciente es por lo general de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 2000 mg/kg del peso corporal del animal. La dosificación administrada a un paciente puede estar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada a un pacientes puede estar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg del peso corporal del animal, además, en otro aspecto, la dosificación administrada a un paciente es entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada es entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada es entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal.
Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composiciones se pueden administrar mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen diversos sistemas de administración, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y se pueden usar para administrar un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composición. En determinados casos, se administra más de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composición a un paciente.
En casos específicos, puede ser deseable administrar uno o más Compuestos a modo de Ejemplo y/o Conjugados a modo de Ejemplo o composiciones localmente en el área con necesidad de tratamiento. Esto se puede conseguir, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, en conjunto con un apósito para heridas después de la cirugía; por inyección; por medio de un catéter; por medio de un supositorio; o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En un ejemplo, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un cáncer, tumor o tejido neoplásico o pre-neoplásico. En otro ejemplo, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestación de una enfermedad autoinmune.
En ciertos casos, puede ser deseable introducir uno o más Compuestos a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composiciones en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, que incluye inyección intraventricular e intratecal. La inyección intraventricular se puede facilitar a través de un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tales como un depósito de Ommaya.
Además, se puede usar administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulaciones con un agente de aerosol, o a través de perfusión en un tensioactivo pulmonar de fluorocarbono o sintético.
En otro ejemplo más, los Compuestos a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composiciones se pueden administrar en un sistema de liberación controlada, tales como pero no se limitan a, una bomba o se pueden usar diversos materiales poliméricos. En otro ejemplo más, un sistema de liberación controlada se puede colocar en proximidad a la diana de los Compuestos a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composiciones, por ejemplo, el cerebro, necesitando de este modo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, mencionado anteriormente, vol. 2, páginas 115-138 (1984)). Se pueden usar otros sistemas de liberación controlada que se analizan en la revisión de Langer (Science
249: 1527-1533 (1990)).
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el que se administra un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos pueden ser solución salina, goma de acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea, y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En un ejemplo, cuando se administran a un paciente, el Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo o composiciones y vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un vehículo a modo de ejemplo cuando los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo se administran por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol solutions también se pueden usar como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, quizá, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o de emulsificación, o agentes de tamponamiento del pH.
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Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.
Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden formular de acuerdo con procedimientos de rutina en forma de una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa en animales, particularmente seres humanos. Por lo general, los vehículos su excipientes para la administración intravenosa son soluciones tampón acuosas isotónicas estériles. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan en conjunto en forma de dosificación individual, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un envase cerrado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecito que indique la cantidad del agente activo. Cuando se va a administrar un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo por infusión, se puede dosificar, por ejemplo, con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando el Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
Las composiciones para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden contener uno o más agentes opcionales opcionalmente, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes saborizantes tales como menta, aceite de gaulteria, o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente agradable al paladar. Además, cuando están en forma de comprimido o píldora, las composiciones se pueden revestir para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando una acción sostenida durante un período de tiempo prolongado. Las membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto de dirección osmóticamente activo también son adecuadas para compuestos administrados por vía oral. En estas últimas plataformas, el fluido del entorno que rodea a la cápsula es embestido por el compuesto de dirección, que se hincha para desplazar el agente o composición de agente a través de una apertura. Estas plataformas de administración pueden proporcionar un perfil de liberación básicamente de orden cero en oposición a los perfiles con adiciones de formulaciones de liberación inmediata. También se puede usar un material de retardo con el tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol.
Las composiciones pueden estar destinadas a la administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede estar en forma de una solución, emulsión, pomada o base de gel. Si están destinadas a la administración transdérmica, la composición puede estar en la forma de un parche transdérmicos o un dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden comprender una concentración de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo de aproximadamente un 0,05 % a aproximadamente un 50 % en p/v (peso por volumen unitario de la composición), en otro aspecto, de un 0,1 % a un 10 % en p/v.
La composición puede estar destinada a la administración rectal, en la forma, por ejemplo, de un supositorio que se fundirá en el recto y liberará el Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo.
La composición puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida
o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la cubierta de revestimiento por lo general son inertes, y se pueden seleccionar entre, por ejemplo, azúcar, goma laca, y otros agentes de revestimiento entérico. Como alternativa, los principios activos se pueden encerrar en una cápsula de gelatina.
Las composiciones pueden consistir en unidades de dosificación gaseosa, por ejemplo, pueden estar en forma de un aerosol. El término aerosol se usa para indicar diversos sistemas que varían de los de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. Administración puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bombeo adecuado que dosifica los principios activos.
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Ya sea en forma sólida, líquida o gaseosa, las presentes composiciones pueden incluir un agente farmacológico usado en el tratamiento de cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa.
4.8 USOS TERAPÉUTICOS DE LOS CONJUGADOS A MODO DE EJEMPLO  
5 Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo son útiles para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un paciente.
4.8.1 TRATAMIENTO DE CÁNCER 
10 Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o de una célula cancerosa, causando apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden usar en consecuencia de acuerdo con diversos entornos para el tratamiento de cánceres en animales. Los
15 Conjugados Fármaco-Conector-Ligando se pueden usar para administrar un Fármaco o unidad de Fármaco a una célula tumoral o célula cancerosa. Sin quedar ligado a teoría alguna, en una realización, la unidad Ligando de un Conjugado a modo de Ejemplo se une a o se asocia con un antígeno asociado a célula cancerosa asociado una célula tumoral, y el Conjugado a modo de Ejemplo se puede recoger dentro de una célula tumoral o célula cancerosa a través de endocitosis mediada por receptores. El antígeno se puede unir a una célula tumoral o célula cancerosa o
20 puede ser una proteína de matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa. Una vez dentro de la célula, una o más secuencias peptídicas específicas dentro de la unidad Conectora se extienden hidrolíticamente con una o más proteasas asociadas a células tumorales o a células cancerosas, dando como resultado la liberación de un Fármaco o un Compuesto de Fármaco-Conector. A continuación, el Fármaco liberado o Compuesto de Fármaco-Conector es libre para migrar dentro de la célula e inducir actividades citotóxicas citostáticas. En una
25 realización alternativa, el Fármaco o unidad de Fármaco se escinde del Conjugado a modo de Ejemplo fuera de la célula tumoral o célula cancerosa, y el Fármaco o Compuesto de Fármaco-Conector penetra posteriormente en la célula. En un ejemplo, la unidad Ligando se une a la célula tumoral o célula cancerosa.
En otro ejemplo, la unidad Ligando se une a una célula tumoral o antígeno de célula cancerosa que está en la 30 superficie de la célula tumoral o célula cancerosa.
En otro ejemplo, la unidad Ligando se une a una célula tumoral o antígeno de célula cancerosa que está en una proteína de matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa.
35 La especificidad de la unidad Ligando para una célula tumoral o célula cancerosa en particular puede ser importante para determinar los tumores o cánceres que se tratan de forma más eficaz. Por ejemplo, los Conjugados a modo de Ejemplo que tienen una unidad Ligando BR96 pueden ser útiles para tratar carcinomas positivos a antígenos que incluyen los de pulmón, mama, colon, ovarios, y páncreas. Los Conjugados a modo de Ejemplo que tienen una unidad Ligando Anti-CD30 o una anti-CD40 pueden ser útiles para tratar neoplasias hematológicas.
40 Otros tipos de cánceres en particular que se pueden tratar con los Conjugados a modo de Ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los que se desvelan en la Tabla 3.
TABLA 3
Tumores sólidos, que incluyen pero no se limitan a:
fibrosarcoma
mixosarcoma
liposarcoma
condrosarcoma
sarcoma osteogénico
cordoma
angiosarcoma
endoteliosarcoma
linfangiosarcoma
linfangioendoteliosarcoma
sinovioma
mesotelioma
tumor de Ewing leiomiosarcoma
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rabdomiosarcoma cáncer de colon cáncer colorrectal cáncer de riñón cáncer pancreático cáncer óseo cáncer de mama cáncer de ovarios cáncer de próstata cáncer de esófago cáncer de estómago cáncer oral cáncer nasal cáncer de garganta carcinoma de células escamosas carcinoma de células basales adenocarcinoma carcinoma de glándulas utópicas carcinoma de glándulas sebáceas carcinoma papilar adenocarcinomas papilares cistadenocarcinoma carcinoma medular carcinoma broncogénico carcinoma de células renales hepatoma carcinoma de conductos biliares coriocarcinoma seminoma carcinoma embrionario tumor de Wilms cancer cervical cancer uterino cancer testicular carcinoma de pulmón de células pequeñas carcinoma de vejiga cáncer de pulmón carcinoma epitelial glioma glioblastoma multiforme astrocitoma meduloblastoma
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craneofaringioma ependimoma pinealoma hemangioblastoma neurinoma del acústico oligodendroglioma meningioma cáncer de piel melanoma neuroblastoma retinoblastoma
cánceres de transmisión sanguínea, que incluyen pero no se limitan a
leucemia linfoblástica aguda "ALL" leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T leucemia mieloblástica aguda "AML" leucemia promielocítica aguda "APL" leucemia monoblástica aguda leucemia eritroleucémica aguda leucemia megacarioblástica aguda leucemia mielomonocítica aguda leucemia no linfocítica aguda leucemia sin diferenciar aguda leucemia mielocítica crónica "CML" leucemia linfocítica crónica "CLL" leucemia de células pilosas mieloma múltiple
leucemias aguda y crónica:
linfoblástica mielogénica linfocítica leucemias mielocíticas
Linfomas:
enfermedad de Hodgkin Linfoma no Hodgkin Mieloma múltiple macroglobulinemia de Waldenström
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Enfermedad de cadena pesada
Policitemia vera
Los Conjugados a modo de Ejemplo proporcionan una dirección al tumor o cáncer específica de conjugación, reduciendo de este modo la toxicidad general de estos compuestos. Las unidades Conectoras estabilizan los Conjugados a modo de Ejemplo en sangre, sin embargo se pueden escindir con proteasas específicas de tumores dentro de la célula, liberando un Fármaco.
4.8.2 TERAPIA DE MODALIDAD MÚLTIPLE PARA CÁNCER
Los cánceres, que incluyen, pero no se limitan a, un tumor, metástasis, u otra enfermedad o trastorno caracterizado por crecimiento celular descontrolado, se pueden tratar o prevenir mediante administración de un Conjugado a modo de Ejemplo y/o un Compuesto a modo de Ejemplo.
Métodos para tratar o prevenir el cáncer son los que se describen en el presente documento, que incluyen administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un Conjugado a modo de Ejemplo y un agente quimioterapeútico. En un ejemplo, el agente quimioterapeútico es uno con el que no se ha encontrado que el tratamiento del cáncer sea resistente. En otro ejemplo, el agente quimioterapeútico es uno con el que se ha encontrado que el tratamiento del cáncer es resistente. Los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden administrar a un paciente que también ha experimentado cirugía como tratamiento para el cáncer.
En un ejemplo, el método adicional de tratamiento es la terapia de radiación.
En un ejemplo específico, el Conjugado a modo de Ejemplo se administró simultáneamente con el agente quimioterapeútico o con terapia de radiación. En otro ejemplo específico, el agente quimioterapeútico o terapia de radiación se administra antes su después de la administración de un Conjugado a modo de Ejemplo, por ejemplo al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes, en aspectos adicionales o varios meses (por ejemplo, hasta tres meses), antes o después de la administración de un Conjugado a modo de Ejemplo.
Un agente quimioterapeútico se puede administrar durante una serie de sesiones. Se puede administrar uno cualquiera o una combinación de los agentes quimioterapeúticos que se enumeran en la Tabla 4. Con respecto a la radiación, se puede usar cualquier protocolo de terapia de radiación dependiendo del tipo de cáncer a tratar. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, se puede administrar radiación de rayos X; en particular, se puede usar megavoltaje de alta energía (radiación mayor que 1 MeV de energía) para tumores profundos, y se pueden usar radiación de haz de electrones rayos X de ortovoltaje para cánceres de piel. Además, se pueden administrar radioisótopos que emiten rayos gamma, tales como isótopos radiactivos de radio, cobalto y otros elementos.
Además, se describen métodos tratamiento del cáncer con un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo como una alternativa a la quimioterapia o a la terapia de radiación cuando se ha demostrado, o se puede demostrar, que la quimioterapia o la terapia de radiación puede ser demasiado tóxica, por ejemplo, da como resultado efectos secundarios inaceptables o insoportables, para el sujeto que se está tratando. El animal que se está tratando, opcionalmente, se puede tratar con otro tratamiento de cáncer tal como cirugía, terapia de radiación o quimioterapia, dependiendo del tratamiento que se encuentre aceptable o soportable.
Los Compuestos a modo de Ejemplo y/o los Conjugados a modo de Ejemplo también se pueden usar de forma in vitro o ex vivo, de modo que para el tratamiento de determinados cánceres, que incluyen, pero no se limitan a leucemias y linfomas, dicho tratamiento implica trasplantes de células madre autólogas. Esto puede implicar un proceso en etapas múltiples en el que las células madre hematopoyéticas autólogas del animal se cosechan y se purgan de todas las células cancerosas, a continuación se erradica la población de células de médula ósea restantes del animal mediante la administración de una dosis elevada de un Compuesto a modo de Ejemplo y/o Conjugado a modo de Ejemplo con o sin terapia de radiación de dosis elevada adjunta, y el injerto de células madre se infunde de nuevo en el animal. A continuación, se proporciona cuidados de apoyo mientras que la función de la médula ósea se restablece y el animal se recupera.
4.8.3 TERAPIA CON MÚLTIPLES FÁRMACOS PARA CÁNCER
Se desvelan métodos para tratar el cáncer que incluyen administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un Conjugado a modo de Ejemplo y otro agente terapéutico que es un agente anticáncer. Agentes anticáncer adecuados incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, taxol, L-asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecán, mostazas de nitrógeno, cytoxan, etopósido, 5-fluorouracilo, BCNU, irinotecán, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel, and docetaxel. En un aspecto, el agente anticáncer
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incluye, pero no se limitan a, un fármaco que se enumera en la Tabla 4. TABLA 4
Agentes de alquilación
Mostazas de nitrógeno:
ciclofosfamida ifosfamida trofosfamida clorambucilo melfalano
Nitrosoureas:
carmustina (BCNU) lomustina (CCNU)
Alquilsulfonatos busulfán
treosulfán
Triazenos:
decarbazina
Compuestos que contienen platino:
cisplatino carboplatino
Alcaloides Vegetales
Alcaloides de la vinca:
vincristina vinblastina vindesina vinorelbina
Taxoides:
paclitaxel docetaxol
Inhibidores de la ADN Topoisomerasa
Epipodofilinas:
etopósido tenipósido topotecán 9-aminocamptotecina camptotecina crisnatol
mitomicinas:
mitomicina C
Anti-metabolitos
Anti-folatos:
Inhibidores de DHFR:
metotrexato trimetrexato
Anti-metabolitos
Inhibidores de la IMP deshidrogenasa:
ácido micofenólico tiazofurina ribavirina EICAR
Inhibidores de la ribonucleótido reductasa:
hidroxiurea deferoxamina
Análogos de pirimidina:
Análogos de un acilo
5-Fluorouracilo
floxuridina doxifluridina ratitrexed
Análogos de citosinas
citarabina (ara C) arabinósido de citosina fludarabina
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Análogos de purina:
mercaptopurina tioguanina
Terapias hormonales:
Antagonistas de receptores:
Antiestrógenos
tamoxifeno raloxifeno megestrol
Agonistas de LHRH:
goserilina acetato de leuprolida
Antiandrógenos:
flutamida bicalutamida
Retinoides/Deltoides
Análogos de vitamina D3:
EB 1089 CB 1093 KH 1060
Terapias fotodinámicas:
vertoporfina (BPD-MA) ftalocianina fotosensibilidador Pc4 demetoxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA)
Citoquinas:
Interferón- α Interferón- γ factor de necrosis tumoral
Otros:
Gemcitabina Velcade Revamid Talamid
Inhibidores de isoprenilación:
Lovastatina
Neurotoxinas dopaminérgicas:
ión de 1-metil-4-fenilpiridinio
Inhibidores del ciclo celular
estaurosporina
Actinomicinas:
Actinomicina D
dactinomicina
Bleomicinas:
bleomicina A2 bleomicina B2 peplomicina
Antraciclinas:
daunorrubicina Doxorrubicina (adriamicina) idarrubicina epirrubicina pirarubicina zorubicina mtoxantrona
Inhibidores de MDR:
verapamilo
Inhibidores de ATPasa Ca2+:
tapsigargina
4.8.4 TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES 
Los Conjugados a modo de Ejemplo son útiles para eliminar o inhibir la replicación de una célula que produce una enfermedad autoinmune o para tratar una enfermedad autoinmune. Los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden usar en consecuencia en diversos entornos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente. Los Conjugados Fármaco-Conector-Ligando se pueden usar para administrar un Fármaco a una célula diana. Sin quedar ligado a teoría alguna, el Conjugado de Fármaco-Conector-Ligando se puede asociar con un antígeno en la superficie de una célula diana, y el Conjugado a modo de Ejemplo se recoge a continuación dentro de una célula diana a través de endocitosis mediada por receptores. Una vez dentro de la célula, una, secuencias peptídicas específicas dentro de la unidad Conectora se escinden enzimáticamente o hidrolíticamente, dando como resultado la liberación de un Fármaco. A continuación, el Fármaco liberado es libre para migrar en el citosol e inducir actividades citotóxica as o citostáticas. En un ejemplo alternativo, el Fármaco se escinde del Conjugado a modo de Ejemplo
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5 fuera de la célula diana, y el Fármaco penetra posteriormente en la célula.
En un ejemplo, la unidad Ligando se une a un antígeno autoinmune. En un aspecto, el antígeno está en la superficie de una célula implicada en una afección autoinmune.
10 En otro ejemplo, la unidad Ligando se une a un antígeno autoinmune que está en la superficie de una célula.
En un ejemplo, el Ligando se une a linfocitos activados que están asociados con el estado de enfermedad autoinmune.
15 En un ejemplo más, los Conjugados a modo de Ejemplo eliminan o inhiben la multiplicación de células que producen un anticuerpo autoinmune asociado con una enfermedad autoinmune en particular.
Los tipos de enfermedades autoinmunes en particular que se pueden tratar con los Conjugados a modo de Ejemplo incluyen, pero no se limitan a, trastornos relacionados con linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, asma 20 atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica, y enfermedad de injerto frente a huésped); trastornos relacionados con linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, Enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, y tuberculosis); trastornos relacionados con linfocitos B activados (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide, y diabetes de tipo I); y las que se desvelan en la Tabla 5.
25 TABLA 5
Hepatitis Activa Crónica Enfermedad de Addison Alveolitis Alérgica Reacción Alérgica Rinitis Alérgica Síndrome de Alport Anafilaxis Espondilitis Anquilosante Síndrome antifosfolipídico Artritis Ascariasis Aspergilosis Alergia Atópica Dermatitis Atrópica Rinitis Atrópica Enfermedad de Behcet Pulmón de Bird-Fancier Asma Bronquial Síndrome de Caplan Cardiomiopatía Enfermedad Celíaca Enfermedad de Chagas Glomerulonefritis Crónica Síndrome de Cogan Enfermedad de Aglutinina Fría Infección por Rubéola Congénita Síndrome de CREST Enfermedad de Crohn Crioglobulinemia Síndrome de Cushing Dermatomiositis Lupus Discoide Síndrome de Dressler Síndrome de Eaton-Lambert Infección por Ecovirus Encefalomielitis Oftalmopatía Endocrina Infección por Virus Epstein-Barr Vómitos Equinos Eritematosis Síndrome de Evan Síndrome de Felty Fibromialgia Ciclitis de Fuch Atrofia Gástrica Alergia Gastrointestinal Arteritis de Células Gigantes Glomerulonefritis Síndrome de Goodpasture Enfermedad de Injerto frente a Huésped Enfermedad de Graves Enfermedad de Guillain-Barre Tiroiditis de Hashimoto Anemia Hemolítica Púrpura de Henoch-Schonlein Atrofia Adrenal Idiopática Fibritis Pulmonar Idiopática Nefropatía de IgA Enfermedades Intestinales Inflamatorias Diabetes Mellitus dependiente de Insulina Artritis Juvenil Diabetes Mellitus Juvenil (Tipo I) Síndrome de Lambert-Eaton Laminitis Liquen Plano Hepatitis Lupoides Lupus Linfopenia Enfermedad de Meniere Enfermedad de Tejido Conectivo Mixto Esclerosis Múltiple Miastenia Gravis Anemia Perniciosa Síndromes Poliglandulares Demencia Presenil Agammaglobulinemia Primaria Cirrosis Biliar Primaria Psoriasis Artritis Psoriática Fenómeno de Raynauds Aborto Recurrente Síndrome de Reiter Fiebre Reumática Artritis Reumatoide Síndrome de Sampter esquistosomiasis Síndrome de Schmidt Esclerodermia Síndrome de Shulman Síndrome de Sjorgen Síndrome de Stiff-Man Oftalmia Simpática Lupus Sistémico Eritematoso Arteritis de Takayasu Arteritis Temporal Tiroiditis Trombocitopenia Tirotoxicosis Necrólisis Epidérmica Tóxica Resistencia a Insulina de Tipo B Diabetes Mellitus de Tipo I Colitis Ulcerosa Uveítis Vitíligo Macroglobulemia de Waldenstrom Granulomatosis de Wegener
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4.8.5 TERAPIA CON MÚLTIPLES FÁRMACOS DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
Además, se desvelan métodos para tratar una enfermedad autoinmune que incluyen administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad eficaz de un Conjugado a modo de Ejemplo y otro agente terapéutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En un ejemplo, la anti-enfermedad autoinmune incluye, pero no se limita a, los agentes que se enumeran en la Tabla 6.
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Tabla 6
ciclosporina ciclosporina A micofenilato mofetilo sirolimus tacrolimus enanercept prednisona azatioprina metotrexato ciclofosfamida prednisona ácido aminocaproico cloroquina hidroxicloroquina hidrocortisona dexametasona clorambucilo DHEA danazol bromocriptina meloxicam infliximab
5 4.8.6 TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Los Conjugados a modo de Ejemplo son útiles para eliminar o inhibir la multiplicación de una célula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar una enfermedad infecciosa. Los Conjugados a modo de Ejemplo se pueden usar en consecuencia en diversos entornos para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un paciente. Los
10 Conjugados Fármaco-Conector-Ligando se pueden usar para administrar un Fármaco a una célula diana. En un ejemplo, la unidad Ligando se une a la célula de la enfermedad infecciosa.
En un ejemplo, los Conjugados eliminan o inhiben la multiplicación de células que producen una enfermedad infecciosa en particular.
15 Los tipos de enfermedades infecciosas en particular que se pueden tratar con los Conjugados a modo de Ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las que se desvelan en la Tabla 7.
TABLA 7 Enfermedades Bacterianas: Diftheria Pertussis Bacteremia Oculta Infección del Tracto Urinario Gastroenteritis Celulitis Epiglotitis
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Enfermedades Bacterianas:
Traqueitis Hipertrofia Adenoide Abceso Retrofaríngeo Impétigo Ectima Neumonía Endocarditis Artritis Séptica Pneumococos Peritonitis Bacteremia Meningitis Meningitis Purulenta Aguda Uretritis Cervicitis Proctitis Faringitis Salpingitis Epididimitis Gonorrea Sífilis Listeriosis Ántrax Nocardiosis Salmonella Fiebre tifoidea Disentería Conjuntivitis Sinusitis Brucelosis Tularemia Cólera Plaga Bubónica Tétano Enteritis Necrotizante Actinomicosis Infecciones Anaerobias Mixtas Sífilis Fiebre Recurrente Leptospirosis Enfermedad de Lyme
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Enfermedades Bacterianas:
Fiebre por Mordedura de Rata Tuberculosis Linfadenitis Lepra Clamidia Neumonía por Clamidia Tracoma Conjuntivitis por Inclusión
Enfermedades Fúngicas Sistémicas:
Histoplamosis Coccidiodomicosis Blastomicosis Esporotricosis Criptococosis Candidiasis Sistémica Aspergilosis Mucormicosis Micetoma Cromomicosis
Enfermedades por Rickettsia:
Tifus Fiebre Maculada de las Montañas Rocosas Ehrlichiosis Rickettsiosis Oriental Transmitida por Garrapatas
Fiebre Q Bartonelosis
Enfermedades Parasitarias:
Malaria Babesiosis Tripanosomiasis Africana Enfermedad de Chagas Leishmaniasis Fiebre Dum-Dum Toxoplasmosis Meningoencefalitis
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Enfermedades por Rickettsia:
Queratitis Entamebiasis Giardiasis Criptosporidiasis Isosporiasis Ciclosporiasis Microsporidiosis Ascariasis Infección por Tricocéfalos Infección por Anquilostomas Infección por Lombrices Larva Migrans Ocular Triquinosis Enfermedad del Gusano de Guinea Filariasis Linfática Loiasis Oncocercosis Infección Canina del Gusano del corazón Esquistosomiasis Urticaria del Nadador Trematodo Oriental de Pulmón Trematodo Oriental de Hígado Fascioliasis Fasciolopsiasis Opistorquiasis Infecciones por Tenia Enfermedad Hidatídica Enfermedad Hidatídica Alveolar
Enfermedades Víricas: Sarampión Panencefalitis esclerososante subaguda Resfriado Común Paperas Rubeola Roseola Quinta Enfermedad Varicela Infección por el virus sincitial respiratorio Crup
Bronquiolitis Enfermedades Víricas:
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Mononucleosis infecciosa Poliomielitis Herpangina Enfermedad de manos, pies y boca Enfermedad de Bornholm Herpes Genital Verrugas Genitales Meningitis Aséptica Miocarditis Pericarditis Gastroenteritis Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA) Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) Síndrome de Reye Síndrome de Kawasaki Gripe Bronquitis Neumonía Vírical del "Caminante" Enfermedad Respiratoria Febril Aguda Fiebre faringoconjuntiva aguda Queratoconjuntivitis Epidémica Virus del Herpes Simplex 1 (VHS-1) Virus del Herpes Simplex 2 (VHS-2) Herpes Enfermedad Citomegálica de Inclusión Rabia Leucoencefalopatía Multifocal Progresiva Kuru Insomnio Familiarl Fatal
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker Paraparesis Espástica Tropical Encefalitis Equina Occidental Encefalitis de California Encefalitis de St. Louis Fiebre Amarilla Dengue Coriomeningitis Linfocítica Fiebre de Lassa Fiebre Hemorrágica Síndrome Pulmonar por Hantvirus Enfermedades Víricas:
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Infecciones por el Virus de Marburg
Infecciones por el Virus del Ébola
Viruela
4.8.7 TERAPIA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS CON MÚLTIPLES FÁRMACOS
Se desvelan métodos para tratar una enfermedad infecciosa que incluyen administrar a un paciente con necesidad
5 del mismo un Conjugado a modo de Ejemplo y otro agente terapéutico que es un agente anti-enfermedad infecciosa. En un ejemplo, el agente anti-enfermedad infecciosa es, pero no se limitan a, los agentes que se enumeran en la Tabla 8.
TABLA 8
Antibióticos de β-Lactama:
Penicilina G
Penicilina V Cloxacilina Dicloxacilina Meticilina Nafcilina Oxacilina Ampicilina Amoxicilina Bacampicilina Azlocilina Carbenicilina Mezlocilina Piperacilina
Ticarcilina
10 Aminoglicósidos:
Amicacina Gentamicina Kanamicina Neomicina Netilmicina
Streptomicina Tobramicina
Macrólidos:
Azitromicina Claritromicina Erithromicina Lincomicina Clindamicina
Tetraciclinas:
Demeclociclina Doxiciclina
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Minociclina Oxitetraciclina Tetraciclina
Quinolonas:
Cinoxacina
Ácido Nalidíxico
Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacina Enoxacina Grepafloxacina Levofloxacina Lomefloxacina Norfloxacina Ofloxacina Sparfloxacina Trovafloxicina
Polipéptidos:
Bacitracina Colistina Polimixina B
Sulfonamidas:
Sulfisoxazol
Sulfametoxazol Sulfadiazina Sulfametizol Sulfacetamida
Diversos Agentes Antibacterianos:
Trimetoprim Sulfametazol Cloramfenicol Vancomicina Metronidazol Quinupristina Dalfopristina Rifampina Espectinomicina Nitrofurantoína
Agentes Antivirales:
Agentes Antivirales Generales:
Idoxuradina
Vidarabina Trifluridina Aciclovir Famciciclovir Penciciclovir Valaciclovir Ganciciclovir Foscarnet Ribavirina Amantadina Rimantadina Cidofovir Oligonucleótidos Antisentido Inmunoglobulinas Inteferones
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Fármacos para infección por VIH
Tenofovir Emtricitabina Zidovudina Didanosina Zalcitabina Estavudina Lamivudina Nevirapina Delavirdina Saquinavir Ritonavir Indinavir Nelfinavir
5. Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación del compuesto AB
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Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 equiv., Patente de Estados Unidos Nº 6214345 de Firestone et al.) se diluyó con DMF (120 ml, 0,2 M) y a esta solución se añadió a dietilamina (60 ml). La reacción se controló por HPLC y 10 se encontró que estaba completa en 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el resto resultante se precipitó usando acetato de etilo (aprox. 100 ml) con sonicación durante 10 min. Se añadió éter (200 ml) y el precipitado se sonicó adicionalmente durante 5 min. La solución se dejó en reposo durante 30 min. sin agitación y a continuación se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21 mmol) se diluyó con DMF (110 ml) y la solución 15 resultante se trató con MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4: 521; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 equiv.). La
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reacción era completa de acuerdo con HPLC después de 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se precipitó usando acetato de etilo (50 ml). Después de sonicar durante 15 min, se añadió éter (400 ml) y la mezcla se sonicó adicionalmente hasta que todas las partículas grandes se separaron. La solución se filtró a continuación y el sólido se secó para proporcionar un sólido intermedio de color blanquecino. Rendimiento: 11,63 g
5 (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H]
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 equiv., Patente de Estados Unidos Nº 6214345 de Firestone et al.) se diluyó con DMF (120 ml, 0,2 M) y a esta solución se añadió a dietilamina (60 ml). La reacción se controló por HPLC y se encontró que estaba completa en 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el resto resultante se precipitó 10 usando acetato de etilo (aprox. 100 ml) con sonicación durante 10 min. Se añadió éter (200 ml) y el precipitado se sonicó adicionalmente durante 5 min. La solución se dejó en reposo durante 30 min. sin agitación y a continuación se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21 mmol) se diluyó con DMF (110 ml) y la solución resultante se trató con MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4: 521; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 equiv.). La
15 reacción era completa de acuerdo con HPLC después de 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se precipitó usando acetato de etilo (50 ml). Después de sonicar durante 15 min, se añadió éter (400 ml) y la mezcla se sonicó adicionalmente hasta que todas las partículas grandes se separaron. La solución se filtró a continuación y el sólido se secó para proporcionar un sólido intermedio de color blanquecino. Rendimiento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H].
20 El sólido intermedio de color blanquecino (8,0 g, 14,0 mmol) se diluyó con DMF (120 ml, 0,12 M) y a la solución resultante se añadió bis(4-nitrofenil)carbonato (8,5 g, 28,0 mmol, 2,.0 equiv.) y DIEA (3,66 ml, 21,0 mmol, 1,5 equiv.). La reacción se completó en 1 h de acuerdo con HPLC. La mezcla de reacción se concentró para proporcionar un aceite que se precipitó con EtOAc, y a continuación se trituró con EtOAc (aprox. 25 ml). El soluto se precipitó
25 adicionalmente con éter (aprox. 200 ml) y se trituró durante 15 min. El sólido se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar el Compuesto AB que era puro en un 93 % de acuerdo con HPLC y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 9,7 g (94 %).
Ejemplo 2  Preparación del compuesto 1
30
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Sal de HCl del éster t-butílico de fenilalanina (868 mg, 3 mmol), N-Boc-Dolaproína (668 mg, 1 equiv.), DEPC (820 µl, 1,5 equiv.), y DIEA (1,2 ml) se diluyeron con diclorometano (3 ml). Después de 2 horas (h) a temperatura ambiente
35 (aproximadamente 28 grados Celsius), la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó sucesivamente con NaHCO3 acuoso (ac.) saturado (2 x 10 ml), NaCl ac. saturado (2 x 10 ml). La fase orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se volvió suspender en acetato de etilo y se purificó por cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el dipéptido en forma de un sólido de color blanco: 684 mg (46 %). ES-MS m/z 491,3 [M+H]+ .
40 Para escisión selectiva de Boc en presencia de éster de t-butilo, el dipéptido anterior (500 mg, 1,28 mmol) se diluyó con dioxano (2 ml). Se añadió HCl 4 M/dioxano (960 µl, 3 equiv.), y la mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Se observó desprotección de Boc casi completa por RP-HPLC con una cantidad mínima de escisión del éster de tbutilo. La mezcla se enfrió en un baño de hielo, y se añadió trietilamina (500 µl).
45 Después de 10 min, la mezcla se retiró del baño de enfriamiento, se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó sucesivamente con NaHCO3 ac. saturado (2 x 10 ml), NaCl ac. saturado (2 x 10 ml). La fase orgánica se concentró para dar una espuma de color amarillo: 287 mg (57 %). El compuesto intermedio se usó sin purificación adicional.
El tripéptido Fmoc-Meval-val-dil-O--Bu (preparado tal como se describe en el documento WO 02/088172, titulado
50 "Pentapeptide Compounds and Uses Related Thereto"; 0,73 mmol) se trató con TFA (3 ml), diclorometano (3 ml) durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentró a sequedad, el resto se co-evaporó con tolueno (3 x 20 ml), se secó al vacío durante una noche. El resto se diluyó con diclorometano (5 ml) y se añadió dipéptido desprotegido (287 mg, 0,73 mmol), seguido de DIEA (550 µl, 4 equiv.), DEPC (201 µl, 1,1 equiv.). Después de 2 h a temperatura ambiente la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 ml), se lavó sucesivamente con ácido
55 cítrico ac. al 10 % (2 x 20 ml), NaHCO3 ac. saturado (2 x 10 ml), NaCl ac. saturado (10 ml). La fase orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se volvió a suspender en acetato de etilo y se purificó por cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar FmocMeval-val-dil-dap-phe-O-tBu en forma de un sólido de color blanco: 533 mg (71 %). Rf 0.4 (EtOAc). ES-MS m/z 1010,6 [M+H]+ .
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5 El producto (200 mg, 0,2 mmol) se diluyó con diclorometano (3 ml), dietilamina (1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Los disolventes se retiraron para proporcionar un aceite que se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente de la etapa de MeOH al 0-10 % en diclorometano para proporcionar el Compuesto 1 en forma de un sólido de color blanco: 137 mg (87 %). Rf 0,3 (MeOH/CH2Cl2 al 10 %). ES-MS m/z 788,6 [M+H]+ .
10
Ejemplo 3  Preparación del compuesto 2
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15 El compuesto 2 se preparó a partir del compuesto 1 (30 mg, 0,038 mmol) por tratamiento con HCl 4 M/dioxano (4 ml) durante 7 h a temperatura ambiente. El disolvente se retiró, y el resto se secó al vacío durante una noche para proporcionar el Compuesto 2 en forma de un sólido higroscópico de color blanco: 35 mg (120 % calculado para sal de HCl). ES-MS m/z 732,56 [M+H]
20 Ejemplo 4  Preparación del compuesto 3
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Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-Ot-Bu (Ejemplo 2, 50 mg) se trató con HCl 4 M/dioxano (4 ml) durante 16 h a 25 temperatura ambiente. El disolvente se retiró, y el resto se secó al vacío durante una noche para dar 50 mg de un sólido intermedio higroscópico de color blanco.
El sólido intermedio de color blanco (20 mg, 0,02 mmol) se diluyó con diclorometano (1 ml); se añadió DEPC (5 µl, 0,03 mmol, 1,5 equiv.) seguido de DIEA (11 l, 0,06 mmol, 3 equiv.), y t-butilamina (3,2 µl, 0,03 mmol, 1,5 equiv.). 30 Después de 2 h a temperatura ambiente, se encontró que la reacción era completa por RP-HPLC. Se añadió más DEPC (10 µl) y t-butilamina (5 µl) y la reacción se agitó durante un periodo adicional de 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (15 ml), se lavó sucesivamente con agua (5 ml), HCl ac. 0,1 M (10 ml), NaCl ac. saturado (10 ml). La fase orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se diluyó con diclorometano y se purificó por cromatografía ultrarrápida en un gradiente de etapa de MeOH al 0-5 % en diclorometano. Las fracciones
35 relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el compuesto intermedio protegido con Fmoc en forma de un sólido de color blanco: 7,3 mg (36 %). Rf 0,75 (Me-OH al 10 % /CH2Cl2).
El compuesto intermedio protegido con Fmoc se diluyó con diclorometano (0,5 ml) y se trató con dietilamina (0,5 ml) durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a sequedad. El producto se aisló por
40 cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente de etapa de MeOH al 0-10 % en diclorometano para proporcionar el Compuesto 3 en forma de un sólido de color blanco: 4 mg (70 %). Rf 0.2 (MeOH al 10 %/CH2Cl2). ES-MS m/z 787 [M+H]+, 809 [M+Na]+ .
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Ejemplo 5  Preparación del compuesto 4
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Boc-L-Fenilalanina (265 mg, 1 mmol, 1 equiv.) y éter monometílico de trietilenglicol (164 µl, 1 mmol, 1 equiv.) se diluyeron con diclorometano (5 ml). A continuación, se añadió DCC (412 mg, 2 mmol, 2 equiv.), seguido de DMAP (10 mg). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El precipitado se retiró por filtración. El disolvente se retiró al vacío, el resto se diluyó con acetato de etilo, y se purificó por gel de sílice cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se concentraron, y se secaron al vacío para dar un sólido de color blanco: 377 mg (91 %). Rf 0,5 (EtOAc). ES-MS m/z 434 [M+Na]+ .
La retirada del grupo protector Boc se realizó por tratamiento del material anterior en dioxano (10 ml) con HCl 4 M/dioxano (6 ml) durante 6 h a temperatura ambiente. El disolvente se retiró al vacío, el resto se secó al vacío para dar un sólido de color blanco.
La sal de HCl del éster del éter monometílico de Fenilalanina-trietilenglicol (236 mg, 0,458 mmol, 1 equiv.) y N-Boc-Dolaproína (158 mg, 0,55 mmol, 1,2 equiv.) se diluyeron con diclorometano (3 ml). DEPC (125 µl, 1,5 equiv.) y se añadió a la mezcla seguido de DIEA (250 µl, 3 equiv.). Después de 2 h a temperatura ambiente la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (30 ml), se lavó sucesivamente con NaHCO3 ac. saturado (2 x 10 ml), ácido cítrico ac. al 10 % (2 x 10 ml), NaCl ac. saturado (10 ml). La fase orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se volvió suspender en acetato de etilo y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar una espuma intermedia de color blanco: 131 mg (50 %). Rf 0,25 (EtOAc). ES-MS m/z 581,3 [M+H]+ .
La desprotección de Boc se realizó en diclorometano (2 ml), TFA (0,5 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se retiró al vacío, y el resto co-evaporó con tolueno (3 x 25 ml), después se secó al vacío para dar 138 mg de sal de TFA de dipéptido.
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Ejemplo 2, 147 mg, 0,23 mmol, 1 equiv.), y sal de TFA de dipéptido (138 mg) se diluyeron con diclorometano (2 ml). A la mezcla se añadió DEPC (63 µl, 1,5 equiv.), seguido de DIEA (160 µl, 4 equiv.). Después de 2 h a temperatura ambiente la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (30 ml), se lavó sucesivamente con ácido cítrico ac. al 10 % (2 x 20 ml), NaCl ac. saturado (20 ml). La fase orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se volvió a suspender en diclorometano y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente de etapa de MeOH al 0-5 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar una espuma de color blanco: 205 mg (81 %). Rf 0,4 (MeOH al 10 %/CH2Cl2). ES-MS m/z 1100,6 [M+H]+, 1122,4 [M+Na]+ .
El grupo protector Fmoc se retiró por tratamiento con dietilamina (2 ml) en diclorometano (6 ml). Después de 6 h a temperatura ambiente, el disolvente se retiró al vacío, el producto se aisló por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente de etapa de MeOH al 0-10 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron. Después de la evaporación de diclorometano/hexano, 1:1, se obtuvo el Compuesto 4 en forma de una espuma de color blanco: 133 mg (80 %). Rf 0,15 (MeOH al 10 %/CH2Cl2m/z 878,6 [M+H]+ .
Ejemplo 6  Preparación del compuesto 5
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Fmoc-Meval-val-dil-OH (Ejemplo 2, 0,50 g, 0,78 mmol) y dap-phe-OMe·HCl (0,3 g, 0,78 mmol, preparado de acuerdo con Pettit, G.R., et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243-277) se disolvieron en CH2Cl2 (10 ml) seguido de la adición de diisopropiletilamina (0,30 ml, 1,71 mmol, 2,2 equiv.). Se añadió DEPC (0,20 ml, 1,17, 1,5 equiv.) y los contenidos se mantuvieron en Ar. La reacción era completa de acuerdo con HPLC en 1 h. La mezcla se concentró
5 hasta un aceite y se purificó por cromatografía en SiO2 (columna de 300 x 25 mm) y se eluyó con EtOAc al 100 %. El producto se aisló en forma de un sólido espumoso de color blanco. Rendimiento: 0,65 g (87 %). ES-MS m/z 968,35 [M+H]+, 991,34 [M+Na]+; λmáx de UV 215, 265 nm.
El péptido protegido con Fmoc (0,14 g, 0,14 mmol) en cloruro de metileno (5 ml) se trató con dietilamina (2 ml) y los
10 contenidos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción, completa por HPLC, se concentró hasta un aceite, se recogió en 2 ml de DMSO y se inyectó en una HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 µ, 100 Å, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 25 ml/min). las fracciones que contenían el producto se evaporaron para proporcionar un polvo de color blanco para la sal de trifluoroacetato. Rendimiento: 0,126 g (98 %). Rf 0,28 (EtOAc al 100 %); ES-MS m/z
15 746,59 [M+H]+, 768,51 [M+Na]+; λmáx de UV 215 nm.
Ejemplo 7  Preparación del compuesto 6
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20 La sal de trifluoroacetato del Compuesto 5 (0,11 g, 0,13 mmol), Compuesto AB (0,103 g, 0,14 mmol, 1,1 equiv.) y HOBt (3,4 mg, 26 µmol, 0,2 equiv.) se suspendieron en DMF/piridina (2 ml/0,5 ml, respectivamente). Se añadió diisopropiletilamina (22,5 µ
25 0,5 equiv. del conector activado en la mezcla de reacción. Después de 40 h totales, la reacción se completó. Los contenidos se evaporaron, se recogieron en DMSO y se inyectaron en una HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 µ, 100 Å, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 50 ml/min). Las fracciones deseadas se evaporaron para dar el producto en forma de un aceite de color amarillo. Se añadieron cloruro de metileno (aprox. 2 ml) y éter en exceso para proporcionar el
30 Compuesto 6 en forma de un precipitado de color blanco que se filtró y se secó. Rendimiento: 90 mg (52 %). ES-MS m/z 1344,32 [M+H]+, 1366,29 [M+Na]+; λmáx de UV 215,248 nm.
Ejemplo 8  Preparación del compuesto 7
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El Compuesto 4 (133 mg, 0,15 mmol, 1 equiv.), Compuesto AB, (123 mg, 0,167 mmol, 1,1 equiv.), y HOBt (4 mg, 0.2 equiv.) se diluyeron con DMF (1,5 ml). Después de 2 min, se añadió piridina (5 ml) y la reacción se controló usando RP-HPLC. La reacción mostró que estaba completa en 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 40 ml), se lavó sucesivamente con ácido cítrico ac. al 10 % (2 x 10 ml), agua (10 ml), NaCl ac. saturado (10 ml). La fase
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orgánica se separó y se concentró. El resto resultante se volvió a suspender en diclorometano y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente de etapa de MeOH al 0-10 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el Compuesto 7 en forma de una espuma de color blanco: 46 mg (21 %). Rf 0,15 (MeOH al 10 %/CH2Cl2). ES-MS m/z 1476,94 [M+H]+ .
Ejemplo 9  Preparación del éster tbutílico de MCValCitPABMMAF 8
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10 El Compuesto 1 (83 mg, 0,11 mmol), Compuesto AB (85 mg, 0,12 mmol, 1,1 equiv.), y HOBt (2,8 mg, 21 µmol, 0,2 equiv.) se recogieron en DMF seca (1,5 ml) y piridina (0,3 ml) en una atmósfera de argón. Después de 30 h, se encontró que la reacción está básicamente completa por HPLC. La mezcla se evaporó, se recogió en una cantidad mínima de DMSO y se purificó por HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 µ, 100 Å, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 25 ml/min)
15 para proporcionar el Compuesto 8 en forma de un sólido de color blanco. Rendimiento: 103 mg (71 %). ES-MS m/z 1387,06 [M+H]+, 1409,04 [M+Na]+; λmáx de UV 205, 248 nm.
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solución resultante se mantuvo durante 2 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó por HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 µ, 100 Å, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 25 ml/min). Las fracciones deseadas se concentraron
25 9 en forma de un sólido de color blanquecino. Rendimiento: 11 mg (25 %). ES-MS m/z 1330,29 [M+H]+, 1352,24 [M+Na]+; λmáx de UV 205, 248 nm.
Ejemplo 11  Preparación de MCvalcitPABMMAF tercbutil amida 10
30 El Compuesto 3 (217 mg, 0,276 mmol, 1,0 equiv.), Compuesto AB (204 mg, 0,276 mmol, 1,0 equiv.), y HOBt (11 mg, 0,0828 mmol, 0.3 equiv.) se diluyeron con piridina/DMF (6 ml). A esta mezcla se añadió DIEA (0,048 ml), y la mezcla se agitó durante aproximadamente 16 h. los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron al vacío. El resto en bruto se purificó por Chromatotron® (cromatografía en capa fina radial) con un gradiente de etapa (metanol al 0-5-10 % en DCM) para proporcionar MC-val-cit-PAB-MMAF terc-butil amida 10. Rendimiento: 172 mg (45 %); ES-MS m/z 1386,33 [M+H]+, 1408,36 [M+Na]+; λmáx de UV 215, 248 nm.
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Ejemplo 12  Preparación de AC10MCMMAE por conjugación de AC10 y MCMMAE
AC10, disuelto en borato sódico 500 mM y cloruro sódico 500 mM a pH 8,0 se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Después de incubación a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambia por elución sobre resina de Sephadex G25 y se eluyó con PBS con DTPA 1 mM. El valor de tiol/Ab se comprueba mediante la determinación de la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo.
El reactivo de conector de fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E, es decir MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a una concentración conocida, y se añade al anticuerpo reducido enfriado AC10 en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para inactivar la reacción y proteger cualquier grupo tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra mediante un tipo de ultrafiltración en centrífuga y AC10-MC-MMAE se purifica y se desala por elución a través de resina G25 en PBS, se filtra a través de filtros de 0,2 µm en condiciones estériles, y se congela para su almacenamiento.
Ejemplo 13  Preparación de AC10MCMMAF por conjugación de AC10 y MCMMAF
AC10-MC-MMAF se preparó por conjugación de AC10 y MC-MMAF siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 14  Preparación de AC10MCvalcitPABMMAE por conjugación de AC10 y MCvalcitPABMMAE
AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE se preparó por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAE siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 15 Preparación de AC10MCvalcitPABMMAF por conjugación de AC10 y MCvalcitPABMMAF 
(9) 
AC10-MC-val-cit-PAB-MMAF se preparó por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAF (9) siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 16 – Determinación de citotoxicidad de compuestos seleccionados 
La actividad de citotoxicidad de MMAF y los Compuestos 15 se evaluaron en las líneas celulares OVCAR-3 positivas para Lewis Y, las líneas celulares positivas para Lewis Y de carcinoma de mama H3396, carcinoma de pulmón L2987 y carcinoma de colon LS174t se puede someter al ensayo para la citotoxicidad. Para evaluar la citotoxicidad de los Compuestos 15, se puede sembrar células a aproximadamente 5 – 10.000 por pocillo en 150 µl de medio de cultivo tratado a continuación con dosis graduadas de los Compuestos 15 por cuadruplicado al comienzo del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad normalmente se realizan durante 96 horas después de la adición de los compuestos de ensayo. Cincuenta µl de colorante de resazurina se pueden añadir a cada pocillo durante las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. La reducción del colorante se puede determinar mediante espectrometría de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitación y de emisión de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el análisis, el alcance de la reducción con resazurina mediante las células tratadas se puede comparar con el de las células de control sin tratar.
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Para ensayos de exposición de 1 h las células se pueden pulsar con el fármaco durante 1 h y a continuación lavar; el efecto citotóxico se puede determinar después de 96 h de incubación.
Ejemplo 17 – cata citotoxicidad in vitro para compuestos seleccionados
5 La Tabla 10 muestra el efecto citotóxico de Conjugados de los Compuestos cAC10 710, sometidos al ensayo tal como se describe en el Procedimiento General I en una línea celular Karpas 299 de CD30+. Se presentan los datos de dos experimentos separados. Se encontró que los conjugados cAC10 de los Compuestos 7 y 9 eran ligeramente más activos que cAC10-val-cit-MMAE.
10 TABLA 10
Conjugado
CI50 (ng/ml)
cAC10-val-cit-MMAE
6
cAC10-7
1,0
cAC10-8
15
cAC10-9
0,5
cAC10-10
20
En otros experimentos, BR96-val-cit-MMAF era al menos 250 veces más potente que el MMAF libre.
Procedimiento General I – Determinación de citotoxicidad. Para evaluar la citotoxicidad de los Conjugados a
15 modo de Ejemplo 710, se sembraron celulasa aproximadamente 5 – 10.000 por pocillo en 150 l de medio de cultivo y a continuación se trató con dosis graduadas de los Conjugados a modo de Ejemplo 710 por cuadruplicado al comienzo del ensayo. Se realizaron ensayos de citotoxicidad durante 96 horas después de la adición de los compuestos de ensayo. Cincuenta µl de colorante de resazurina se añadieron a cada pocillo durante las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. La reducción del colorante se puede
20 determinar mediante espectrometría de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitación y de emisión de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el análisis, el alcance de la reducción con resazurina mediante las células tratadas se puede comparar con el de las células de control sin tratar.
Ejemplo 18 – Ensayo de proliferación celular in vitro 
25 La eficacia de ADC se puede medir con un ensayo de proliferación celular usando el siguiente protocolo (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62: 5485-5488):
1.
Una alícuota de 100 µl de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 o 30 MDA-MB-468) en medio se depositó en cada pocillo del una placa de paredes opacas, de 96 pocillos.
2.
Se prepararon pocillos de control que contenían medio y sin células.
3.
Se añadió ADC a los concilios experimentales y se incubó durante 3-5 días.
4.
Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5.
Se añadió un volumen de Reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada 35 pocillo.
6.
Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
7.
La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia.
8.
La luminiscencia se registró y se indicó en gráficos como RLU = unidades relativas de luminiscencia.
40 Ejemplo 19 – Aclaramiento de plasma en ratas La farmacocinética del aclaramiento de plasma de conjugados de anticuerpo y fármaco y anticuerpo total se estudiaron en ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 gramos cada una). Los animales se dosificaron con inyección embolo en la vena de la cola (Impulso IV). Se recogieron aproximadamente 300 µl de sangre entera a través de cánula yugular, o extracción en la cola, en recipientes con anticoagulante de litio/heparina
45 en cada punto temporal: 0 (dosis previa), 10, y en 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 y 36 horas; y 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28 días después de la dosis. El anticuerpo total se midió por ELISA -ECD/GxhuFc-HRP. El conjugado de anticuerpo y fármaco se midió por ELISA-MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP.
Ejemplo 20  Aclaramiento de plasma en monos
50 La farmacocinética del aclaramiento de plasma de conjugados de anticuerpo y fármaco y anticuerpo total se puede estudiar en monos cynomolgus. La Figura 12 muestra un estudio en dos etapas de aclaramiento de la concentración en plasma después de la administración de H-MC-vc-MMAE a monos Cynomolgus a diferentes dosis: 0,5, 1,5, 2,5, y 3,0 mg/kg, administradas el día 1 y el día 21. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab).
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Ejemplo 21 – Eficacia in vivo del volumen tumoral en ratones transgénicos con explantes
5 Los animales adecuados para experimentos transgénicos se pueden obtener en fuentes comerciales convencionales tales como Taconic (Germantown, N.Y.). Muchas cepas son adecuadas, pero son preferentes los ratones hembra FVB debido a su mayor susceptibilidad a la formación de tumores. Los machos de FVB se pueden usar para apareamiento y se pueden usar sementales CD.1 vasectomizados para estimular un pseudo-embarazo. Los ratones vasectomizados se pueden obtener de cualquier proveedor comercial. Los fundadores se pueden criar con ratones
10 FVB o con ratones heterocigotos 129/BL6 x FVB p53. Los ratones con heterocigosidad en el alelo p53 se pueden usar para aumentar potencialmente la formación de tumores. Algunos tumores F1 son de cepas mixtas. Los tumores en los fundadores solamente pueden ser FVB.
Los animales que tienen tumores (aloinjerto propagado de ratones transgénicos Fo5 mmtv) se pueden tratar con una
15 sola dosis o con múltiples dosis por inyección IV de ADC. El volumen tumoral se puede evaluar en diversos puntos temporales después de la inyección.
20 Síntesis 1:
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MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (compuesto 1, 128,6 mg, 0,163 mmol) se suspendió en CH2Cl2 (0,500 ml). Se
25 añadieron ácido 6-maleimidocaproico (68,9 mg, 0,326 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (0,0505 ml, 0,326 mmol) seguido de piridina (0,500 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1,0 h. El análisis de HPLC indicó consumo completo del compuesto de partida 1. Los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron a presión reducida. El producto se aisló por cromatografía en columna ultrarrápida, usando un gradiente de etapa de Metanol al 0 a 5 % en CH2Cl2. Se recuperó un total de 96 mg de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (12) pura (rendimiento de
30 un 60 %). ES-MS m/z 981,26 [M+H]+; 1003,47 [M+Na]+; 979,65 [M-H].
MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Compuesto 12,74 mg, 0,0754 mmol) se suspendió en CH2Cl2 (2,0 ml) y TFA (1 ml) a temperatura ambiente. Después de 2,5 h, el análisis de HPLC indicó consumo completo del material de partida. Los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron a presión reducida, y el producto se aisló a través de RP-HPLC
35 12 de 80 Å de Phenomenex (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal de MeCN del 10 % al 90 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 30 minutos, a continuación MeCN al 90 %/ TFA al 0,05 % (ac.) isocrático para un periodo adicional de 20 minutos. ES-MS m/z 925,33 [M+H]+; 947,30 [M+Na]+; 923,45 [M-H].
40 Ejemplo 23a  Síntesis de MCMMAF (11) a través de éster dimetoxibencílico
Síntesis 2:
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Preparación de éster Fmoc-L-Fenilalanina-2,4-dimetoxibencílico (Fmoc-Phe-ODMB)
5 Un matraz de fondo redondo de 5 l de 3 bocas, se cargó con Fmoc-L-Fenilalanina (200 g, 516 mmol de Bachem), alcohol 2,4-dimetoxibencílico (95,4 g, 567 mmol, Aldrich), y CH2Cl2 (2,0 l). Se añadió t-butil acetal de N,Ndimetilformamida (155 ml, 586 mmol, Fluka) a la suspensión resultante durante 20 min en atmósfera de N2, que dio como resultado una solución transparente. Después, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una
10 noche, tras lo cual el análisis de TLC (0,42, Heptano/EtOAc = 2:1) indicó que la reacción era completa. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar un aceite de color amarillo claro, que se disolvió de nuevo en CH2Cl2 (200 ml) y se purificó a través de un lecho corto de gel de sílice (25 cm x 25 cm, CH2Cl2) para dar una espuma incolora (250 g). Se añadió MeCN (1 l) en la espuma resultante, que disolvió totalmente el lote. A continuación se concentró a sequedad y se volvió a disolver en MeCN (1 l) y la suspensión resultante se agitó
15 durante 1 h, se filtró y la torta de filtro se aclaró con MeCN (2 x 200 ml) para dar éster Fmoc-L-fenilalanina-2,4dimetoxibencílico en forma de un sólido de color blanco (113,58 g, 41 %, AUC de un 95,5 % por análisis de HPLC). Datos: HPLC.
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Preparación Éster L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencílico (Phe-ODMB)
Un matraz de fondo redondo de 500 ml se cargó con éster Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencílico (26,00 g, 48,3 mmol), CH2Cl2 (150 ml) y dietilamina (75 ml, Acros). La mezcla se agitó a temperatura ambiente y la finalización se controló por HPLC. Después de 4 h, la mezcla se concentró (temperatura del baño < 30 ºC). El resto se volvió a suspender en CH2Cl2 (200 ml) y se concentró. Ésto se repitió una vez. Al resto se añadió MeOH (20 ml), que provocó la formación de un gel. Este resto se diluyó con CH2Cl2 (200 ml), se concentró y el aceite turbio se dejó vacío durante una noche. El resto se suspendió en CH2Cl2 (100 ml), a continuación se añadió tolueno (120 ml). La mezcla se concentró y el resto se dejó al vacío durante una noche.
Datos: HPLC, RMN 1H.
Preparación de Fmoc-Dolaproína (Fmoc-Dap)
Boc-Dolaproína (58,8 g, 0,205 mol) se suspendió en HCl 4 N en 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Después de agitar durante 1,5 horas, el análisis de TLC indicó que la reacción era completa (MeOH al 10 %/CH2Cl2) y la mezcla se concentró casi hasta sequedad. Se cargó 1,4-dioxano adicional (50 ml) y la mezcla se concentró a sequedad y se secó al vacío durante una noche. El sólido de color blanco resultante se disolvió en H2O (400 ml) y se transfirió a un to matraz de fondo redondo, de tres bocas, de 3 l, con un agitador mecánico y sonda de temperatura. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) durante un minuto, causando una exotermia de 20,5 a 28,2 ºC (interna). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió 1,4-dioxano (400 ml). Una solución de Fmoc-OSu (89,90 g, 0,267 mol, Advanced ChemTech) en 1,4-dioxano (400 ml) se añadió desde un embudo de adición durante 15 minutos, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 9 ºC. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 19 horas, tras lo cual la mezcla se concentró por evaporación rotatoria hasta una suspensión acuosa (390 g). La suspensión se diluyó con H2O (750 ml) y Et2O (750 ml), provocando que se formara un precipitado de color blanco abundante. Las fases se separaron, manteniendo los sólidos con la fase orgánica. La fase acuosa se acidificó usando HCl conc. (30 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 500 ml). Los extractos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtró y se concentró para dar 59,25 g de un aceite de color amarillo A. El extracto de Et2O se extrajo una vez con NaHCO3 sat. (200 ml), manteniendo los sólidos con la fase acuosa. La suspensión acuosa se acidificó usando HCl conc. (50 ml) y se extrajo con Et2O (50 ml) manteniendo los sólidos con la fase orgánica. La fase orgánica se filtró y se concentró para dar 32,33 g de un aceite de color amarillo B. Los dos aceites (A y B) se combinaron y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con CH2Cl2 (3,5 l), a continuación MeOH al 3 %/CH2Cl2 (9 l) para dar 68,23 g de Fmoc-dolaproína en forma de una espuma de color blanco (81 %, pureza de un 97,5 % por HPLC (AUC)).
Preparación de Fmoc-Dap-Phe-ODMB
Phe-ODMB en bruto (48,3 mmol) se suspendió en DMF anhidra (105 ml, Acros) durante 5 minutos y se añadió Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3 mmol). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió TBTU (17,08 g, 53,20 mmol, Matrix Innovations). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0 mmol, Acros) mediante una jeringa durante 3 min. Después de 1 h, el baño de hielo se retiró y la mezcla se dejó calentar durante 30 min. La mezcla se vertió en agua (1 l) y se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Después de separación, la fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de etilo (2 x 150 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (150 ml), se secó (MgSO4) y se filtró (papel de filtro) para retirar las sustancias insolubles (compuestos inorgánicos y algo de dibenzofulveno). Después de concentración, el resto (41 g) se adsorbió sobre sílice (41 g) y se purificó por cromatografía (columna de 22 cm x 8 cm; Heptano al 65 %/EtOAc (2,5 l); Heptano al 33 %/EtOAc (3,8 l), para dar 29,4 g de producto en forma de una espuma de color blanco (86 %, pureza de un 92 % por HPLC).
Datos: HPLC, RMN 1H, TLC (EtOAc a 1:1/Heptano Rf = 0,33, tinción con rojo en vanillina).
Preparación de Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redondo de 1 l se cargó con Fmoc-Dap-Phe-ODMB (27,66 g), CH2Cl2 (122 ml) y dietilamina (61 ml, Acros). La solución se agitó a temperatura ambiente y la finalización se controló por HPLC. Después de 7 h, la mezcla se concentró (temp. del baño < 30 ºC). El resto se suspendió en CH2Cl2 (300 ml) y se concentró. Ésto se repitió dos veces. Al resto se añadió MeOH (20 ml) y CHCl2 (300 ml), y la solución se concentró. El resto se suspendió en CH2Cl2 (100 ml) y tolueno (400 ml), se concentró, y el resto se dejó al vacío durante una noche para dar un resto de color similar a una crema.
Datos: HPLC, RMN 1H, MS.
Preparación de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB Dap-Phe-ODMB en bruto (39,1 mmol) se suspendió en DMF anhidra (135 ml, Acros) durante 5 minutos y se añadió Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24,94 g, 39,1 mmol, véase el Ejemplo 2 para la preparación). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió TBTU (13,81 g, 43,0 mmol, Matrix Innovations). N,N-Diisopropiletilamina (20,5 ml, 117,3 mmol, Acros) se añadió mediante una jeringa durante 2 minutos. Después de 1 hora, el baño de hielo se retiró y la mezcla se dejó calentar durante 30 min. La mezcla se vertió en agua (1,5 l) y se diluyó con acetato de etilo (480 ml). Después de reposar durante 15 minutos, las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml), se secó (MgSO4) y se filtró (papel de filtro) para retirar las sustancias insolubles (compuestos inorgánicos y algo de dibenzofulveno). Después de concentración, el resto (49 g) se raspo del matraz y se adsorbió sobre sílice (49 g) y se purificó por cromatografía (columna dia de 15 cm x 10 cm; EtOAc a2:1/Heptano (3 l), EtOAc (5 l); fracciones de 250 ml) para dar 31,84 g de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB en forma de una espuma de color blanco (73 %, pureza de un 93 % por HPLC (AUC)).
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Datos: HPLC, TLC (EtOAc a 2:1/heptano, Rf = 0.21, tinción con rojo en vanillina).
Preparación de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redondo, de 1 l se cargó con Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (28,50 g), CH2Cl2 (80 ml) y dietilamina (40 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se concentró a presión reducida. El resto se adsorbió sobre sílice (30 g) y se purificó por cromatografía ultrarrápida (columna dia de 15 cm x 8 cm; MeOH al 2 %/DCM (2 l), MeOH al 3 %/DCM (1 l), MeOH al 6 %/DCM (4 l); fracciones de 250 ml) para dar 15,88 g de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB en forma de una espuma de color blanco (69 %, pureza de un 96 % por HPLC (AUC)).
Datos: HPLC, TLC (MeOH al 6 %/DCM, Rf = 0.24, tinción con rojo en vanillina).
Preparación de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redondo, de 50 ml se cargó con MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (750 mg, 0,85 mmol), DMF anhidra (4 ml), ácido maleimidocaproico (180 mg, 0,85 mmol) y TBTU (300 mg, 0,93 mmol, Matrix Innovations) a temperatura ambiente. N,N-Diisopropiletilamina (450 µl, 2,57 mmol) se añadió mediante una jeringa. Después de 1,5 horas, la mezcla se vertió en agua (50 ml) y se diluyó con acetato de etilo (30 ml). NaCl se añadió para mejorar la separación. Después de la separación de las fases, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtró y se concentró. El aceite resultante (1 g) se purificó por cromatografía ultrarrápida [100 ml de sílice; Heptano al 25 %/EtOAc (100 ml), Heptano al 10 %/EtOAc (200 ml), EtOAc (1,5 l)] para dar MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (13) en forma de una espuma de color blanco (521 mg, 57 %, pureza de un 94 % por HPLC(AUC)).
Datos: RMN 1H, HPLC.
Preparación de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH (MC-MMAF) (11)
Un matraz de fondo redondo, de 50 ml se cargó con MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (Compuesto 13,428 mg, 0,39 mmol) y se disolvió en TFA al 2,5 %/CH2Cl2 (20 ml). La solución se volvió de color rosa-púrpura durante 2 min. La finalización se controló por HPLC y TLC (MeOH al 6 %/DCM, tinción con KMnO4). Después de 40 min, se añadieron tres gotas de agua y la mezcla de color rosa-púrpura se concentró para dar 521 mg de un resto de color rosa. La purificación por cromatografía (IPA al 15 %/DCM) proporcionó 270 mg de MC-MMAF (73 %, pureza de un 92 % por HPLC) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 23b - Síntesis de análogo de mc-MMAF
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MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (compuesto 1, 35 mg, 0,044 mmol) se suspendió en DMF (0,250 ml). Se añadieron ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-benzoico (11 mg, 0,049 mmol) y HATU (17 mg, 0,044 mmol) seguido de 5 DIEA (0,031 ml, 0,17 mmol). Esta mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2,0 h. El análisis de HPLC indicó el consumo completo del compuesto de partida 1.
El producto se aisló a través de RP-HPLC preparativa, usando una Columna Synergi Max-RP C12 de 80 Å de Phenomenex (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal de MeCN de un 10 % a un 80 %/TFA al 0,05 % (ac.)
10 durante 8 minutos, a continuación MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocrático durante un periodo adicional 12 minutos. Se aisló un total de 20 mg de producto puro (14) (0,02 mmol, rendimiento de un 46 %). ES-MS m/z 987,85 [M+H]+; 1019,41 [M+Na]+; 985,54 [M-H].
MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Compuesto 14,38 mg, 0,0385 mmol) se suspendió en CH2Cl2 (1 ml) y TFA (1 ml).
15 La mezcla se agitó durante 2,0 h, y a continuación los compuestos volátiles se evaporaron a presión reducida. El producto se purificó por RP-HPLC preparativa, usando una Columna Synergi Max-RP C12 de 80 Å de Phenomenex (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal de MeCN de un 10 % a un 80 % y TFA al 0,05 % (ac.) durante 8 minutos, a continuación MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocrático durante un periodo adicional 12 minutos. Se aisló un total de 14,4 mg de producto de MB-MMAF (0,015 mmol, rendimiento de un 40 %). ES-MS m/ z 930,96
20 [M+H]+ 952,98 [M+Na]+; 929,37 [M-H].
Ejemplo 23c  Preparación de MCMeValCitPABMMAF (16)
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A una suspensión a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OH (3,03 g, 8,57 mmol) y carbonato de N,N’disuccimidilo (3,29 g, 12,86 mmol) en CH2Cl2 (80 ml) se añadió DIEA (4,48 ml, 25,71 mmol). Esta mezcla de reacción se dejó en agitación durante 3,0 h, y después se vertió en un embudo de separación en el que la mezcla orgánica se extrajo con HCl 0,1 M (ac.). El resto orgánico en bruto se concentró a presión reducida, y el producto se
5 aisló por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente lineal de acetato de etilo al 20-100 %/hexanos. Se recuperó un total de 2,18 g de Fmoc-MeVal-OSu puro (4,80 mmoles, rendimiento de un 56 %).
A una suspensión a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OSu (2,18 g, 4,84 mmol) en DME (13 ml) y THF (6,5 ml)
10 se añadió una solución de L-citrulina (0,85 g, 4,84 mmol) y NaHCO3 (0,41 g, 4,84 mmol) en H2O (13 ml). La suspensión se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 16 h, a continuación se extrajo en tercBuOH/CHCl3/H2O, se acidificó a pH = 2-3 con HCl 1 M. La fase orgánica se separó, se secó y se concentró a presión reducida. El resto se trituró con éter dietílico dando como resultado 2,01 g de Fmoc-MeVal-Cit-COOH que se usó sin purificación adicional.
15 El Fmoc-MeVal-Cit-COOH bruto se suspendió en CH2Cl2/MeOH a 2:1 (100 ml), y se le añadió alcohol paminobencílico (0,97 g, 7,9 mmol) y EEDQ (1,95 g, 7,9 mmol). Esta suspensión se dejó en agitación durante 125 h, a continuación los compuestos orgánicos volátiles se retiraron a presión reducida, y el resto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando MeOH al 10 %/CH22. Se recuperó el Fmoc
20 MeVal-Cit-PAB-OH puro (0,55 g, 0,896 mmol, rendimiento de un 18,5 %). ES-MS m/z 616,48 [M+H]+ .
A una suspensión de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0,896 mmol) en CH2Cl2 (40 ml) se añadió STRATOSPHEREStm (unido a resina de piperazina) (> 5 mmol/g, 150 mg). Después de su agitación a temperatura ambiente durante 16 h la mezcla se filtró a través de celite (lavado previamente con MeOH), y se concentró a 25 presión reducida. El resto se trituró con éter dietílico y hexanos. El material sólido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, se suspendió en CH2Cl2 (20 ml), y se le añadió MC-OSu (0,28 g, 0,896 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99 mmol) y DMF (15 ml). Esta suspensión se agitó durante 16 h, pero el análisis de HPLC de la mezcla de reacción indicó reacción incompleta, de modo que la suspensión se concentró a presión reducida hasta un volumen de 6 ml, a continuación se añadió una solución de NaHCO3 (ac.) al 10 % y la suspensión se agitó durante un periodo adicional de16 h. El
30 disolvente se retiró a presión reducida, y el resto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de MeOH al 0-10 %/CH2Cl2, dando como resultado 42 mg (0,072 mmol, rendimiento de un 8 %) de MC-MeVal-Cit-PAB-OH.
A una suspensión de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04 mmol) y bis(nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52 mmol) en
35 CH2Cl2 (10 ml) se añadió DIEA (1,06 ml, 6,06 mmol). Esta suspensión se agitó durante 5,5 h, se concentró a presión reducida y se purificó por trituración con éter dietílico. MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196 mmol) se suspendió en una solución de piridina a 1:5/DMF (3 ml), y se le se añadió HOBt (5 mg, 0,039 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,978 mmol) y MMAF (compuesto 2, 150 mg, 0,205 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, y a continuación se purificó por RP-HPLC preparativa (x 3), usando una Columna Synergi
40 Max-RP C12 de 80 Å de Phenomenex (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal de MeCN de un 10 % a un 90 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 30 minutos, a continuación MeCN al 90 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocrático durante un periodo adicional de 20 minutos. MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16) se obtuvo en forma de un sólido de color amarillento (24,5 mg, 0,0182, rendimiento de un 0,45 %). ES-MS m/z 1344,95 [M+H]+; 1366,94 [M+Na]+ .
45 Ejemplo 23d -Preparación de éster de succinimida de suberilValCitPABMMAF (17)
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El Compuesto 1 (300 mg, 0,38 mmol), Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57 mmol, 1,5 equiv.) se suspendieron en
50 piridina anhidra, 5 ml. Se añadió HOBt (10 mg, 0,076 mmol, 0,2 equiv.) seguido de DIEA (199 µl, 1,14 mmol, 3 equiv.). La mezcla de reacción se sonicó durante 10 min, y a continuación se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Piridina se retiró a presión reducida, el resto se volvió a suspender en CH2Cl2. La mezcla se separó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice en un gradiente de etapa de MeOH, de un 0 a un 10 %, en CH2Cl2. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se concentraron, se secó al vacío durante una noche para dar 317 mg (rendimiento de un 59 %) de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu. ES-MS m/z 1415,8 [M+H]+ .
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Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu (100 mg) se agitó en TFA al 20 %/CH2Cl2 (10 ml), durante 2 h. La mezcla se diluyó con CH2Cl2 (50 ml). La fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (2 x 30 ml) y salmuera (1 x 30 ml). La fase orgánica se concentró, se cargó sobre un lecho de gel de sílice en MeOH al 10 %/CH2Cl2. El producto se eluyó con MeOH al 30 %/CH2Cl2. Después de secar al vacío durante una noche se obtuvo, Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF en forma de un sólido de color blanco, 38 mg, rendimiento de un 40 %. ES-MS m/z 1357,7 [M-H].
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, 67 mg, se suspendió en CH2Cl2 (2 ml) dietilamina (2 ml) y DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retiró a presión reducida. El resto se co-evaporó con piridina (2 ml), a continuación con tolueno (2 x 5 ml), se secó al vacío. Se obtuvo Val-Cit-PAB-MMAF en forma de un aceite de color parduzco, y se usó sin purificación adicional.
Todo el Val-Cit-PAB-MMAF preparado a partir de 67 mg de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, se suspendió en piridina (2 ml), y se añadió a una solución de suberato de disuccinimidilo (74 mg, 0,2 mmol, 4 equiv.), en piridina (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 3 horas, se añadió éter (20 ml). El precipitado se recogió, se lavó con una cantidad adicional de éter. Un sólido de color rojizo se suspendió en MeOH al 30 %/CH2Cl2, se filtra a través de una capa de gel de sílice con MeOH al 30 %/CH2Cl2 como eluyente. Se obtuvo el Compuesto 17 en forma de un sólido de color blanco, 20 mg (rendimiento de un 29 %). ES-MS m/z 1388,5 [M-H].
Ejemplo 24 – Eficacia in vivo de Conjugados de AnticuerpoFármaco de mcMMAF  
Eficacia de cAC10mcMMAF en xenoinjertos de ALCL de Karpas299: Para evaluar la eficacia in vivo de cAC10mcMMAF con un promedio de 4 restos de fármaco por anticuerpo (cAC10-mcF4), células ALCL humanas de Karpas299 se implantaron por vía subcutánea en ratones C.B-17 SCID inmunodeficientes (5 x 106 células por ratón). Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula (0,5 x L x W2) en la que L y W son la medida más larga y más corta de dos medidas bidireccionales. Cuando el volumen tumoral medio en los animales de estudio alcanzó aproximadamente 100 mm3 (intervalo de 48-162), los ratones se dividieron en 3 grupos (5 ratones por grupo) y se dejaron sin tratar o se dosificaron con una sola inyección intravenosa a través de la vena de la cola de 1 o 2 mg/kg de cAC1O-mcF4 (Figura 1). Los tumores en los ratones sin tratar crecieron rápidamente hasta un volumen medio de > 1.000 mm3 en 7 días del comienzo de la terapia. Por el contrario, todo el tumor tratado con cAC10-mcF4 mostró una rápida regresión con 3/5 en el grupo de 1 mg/kg y 5/5 en el grupo de 2 mg/kg que obtuvo una respuesta total del tumor. Aunque el tumor en uno de los pacientes con respuesta total en el grupo de 2 mg/kg recurrió aproximadamente 4 semanas más tarde, no hubo tumores detectables en los 4/5 pacientes restantes en este grupo y el los 3 pacientes de respuesta total en el grupo de 1 mg/kg a las 10 semanas después de la terapia.
Eficacia de cBR96mcMMAF en xenoinjertos de NSCLC L2987: cBR96 es un anticuerpo quimérico que reconoce el antígeno LeY. Para evaluar la eficacia in vivo de cBR96-mcMMAF con 4 fármacos por anticuerpo (cBR96-mcF4), fragmentos de tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) L2987 se implantaron en ratones atímicos desnudos. Cuando los tumores tenían un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en 3 grupos: sin tratar y 2 grupos de terapia. Para la terapia, tal como se muestra en la Figura 3a, se administró cBR96-mcF4 a los ratones a 3 o 10 mg/kg/inyección cada 4 días para un total de 4 inyecciones (q4dx4). Tal como se muestra en la Figura 3b, se administró cBR96-mcF4 a los ratones o un conjugado de control de no unión, cAC10-mcF4, a 10 mg/kg/inyección cada 4 días para un total de 4 inyecciones (q4dx4). Tal como se muestra en las Figuras 3a y 3b, BR96-mcF4 produjo un retraso del crecimiento tumoral pronunciado en comparación con los controles.
La Figura 2 muestra an un ensayo de eficacia, de una sola dosis, in vivo 
Ejemplo 25 – Eficacia in vitro de Conjugados de AnticuerpoFármaco de MCMMAF  
Actividad de conjugados de cAC10anticuerpofármaco frente a líneas celulares CD30+ . Las Figuras 4a y 16b muestran curvas de dosis-respuesta a partir de un experimento representativo en el que se incubaron cultivos de Karpas 299 (linfoma anaplásico de células grandes) y L428 (Linfoma Hodgkin) con diluciones en serie de cAC10mcMMAF (Figura 4a) o cAC10-vcMMAF (Figura 4b) durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 µM [10-óxido de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona] y se midió la fluorescencia. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando el procedimiento de ajuste de curvas de dosis-respuesta de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definen como la concentración en la que el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con cultivos de control sin tratar. Cada concentración se sometió a ensayo por cuadruplicado.
Actividad de conjugados de cBR96anticuerpofármaco frente a líneas celulares Ley+. Las Figuras 5a y 5b muestran curvas de dosis-respuesta a partir de un experimento representativo en el que se incubaron cultivos de H3396 (carcinoma de mama) y L2987 (carcinoma de pulmón de células no pequeñas) con diluciones en serie de cBR96mcMMAF (Figura 5a) o -vcMMAF (Figura 5b) durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 µM y se midió la fluorescencia. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando el procedimiento de ajuste de curvas de dosis-respuesta de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definen como la concentración en la que el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con cultivos de control sin tratar. Cada concentración se sometió a ensayo por cuadruplicado.
imagen228
Actividad de conjugados c1F6anticuerpofármaco frente a líneas celulares de carcinoma de células renales CD70+ . 
Las Figuras 6a y 6b muestran curvas de dosis-respuesta a partir de un experimento representativo en el que se incubaron cultivos de células Caki-1 y 786-O con diluciones en serie de c1F6-mcMMAF (Figura 6a) o -vcMMAF (Figura 6b) durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 µM y se midió la fluorescencia medido. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando el procedimiento de ajuste de curvas de dosis-respuesta de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definen como la concentración en la que el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con cultivos de control sin tratar. Cada concentración se sometió a ensayo por cuadruplicado.
Ejemplo 26  Purificación de trastuzumab
Un vial que contiene 440 mg de HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente de Estados Unidos Nº 5821337) anticuerpo) se disolvió en 50 ml de tampón MES (MES 25 mM, NaCl 50 mM, pH 5,6) y se cargó en una columna de intercambio catiónico (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que se había equilibrado en el mismo tampón. La columna se lavó a continuación con el mismo tampón (5 volúmenes de columna). Trastuzumab se eluyó aumentando la concentración de NaCl del tampón a 200 mM. Las fracciones que contenían el anticuerpo se combinaron, se diluyó a 10 mg/ml, y se dializó en un tampón que contenía fosfato potásico 50 mm, NaCl 50 mM, EDTA2 mM, pH 6,5.
Ejemplo 27  Preparación de trastuzumabMCMMAE por conjugación de trastuzumab y MCMMAE
Trastuzumab, disuelto en borato sódico 500 mM y cloruro sódico 500 mM a pH 8,0 se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Después de incubación a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos, el campo se intercambia por elución sobre resina Sephadex G25 y eluyendo con PBS con DTPA 1 mM. El valor de tiol/Ab se comprueba mediante la determinación de la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinación del absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo.
El reactivo de conector del fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), es decir MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a una concentración conocida, y se añade al anticuerpo trastuzumab reducido enfriado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para inactivar la reacción y se protege cualquier grupo tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se mediante un ultrafiltración en centrífuga y trastuzumab-MC-MMAE se purifica y se desala mediante elución a través de resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0,2 µm en condiciones estériles, y se congeló para su almacenamiento.
Ejemplo 28  Preparación de trastuzumabMCMMAF por conjugación de trastuzumab y MCMMAF
Trastuzumab-MC-MMAF se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-MMAF siguiendo el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 29 Preparación de trastuzumabMCvalcitPABMMAE por conjugación de trastuzumab y MCvalcitPABMMAE
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAE siguiendo el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 30 Preparación de trastuzumabMCvalcitPABMMAF por conjugación de trastuzumab y MCvalcitPABMMAF 9 
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAF 9 siguiendo el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 31 – Toxicidad en ratas 
El perfil de toxicidad aguda de fármacos libres y ADC se evaluó en ratas Sprague-Dawley adolescentes (75-125 gramos cada una, Charles River Laboratories (Hollister, CA). Los animales fueron inyectados el Día 1, se obtuvieron perfiles completos de química y hematología en la medida inicial, el día 3 y el día 5 y se realizó una necropsia completa el Día 5. Se realizaron medidas de enzimas hepáticas en todos los animales e histología de rutina tal como se realiza en tres animales aleatorios para cada grupo para los siguientes tejidos: esternón, hígado, riñón, timo, bazo, intestino grueso y delgado. Los grupos experimentales fueron como sigue a continuación:
imagen229
Grupo
Administrado mg/kg µg de MMAF/m2 MMAF/MAb N/Sexo
1
Vehículo 0 0 0 2/F
2
trastuzumab-MC-val-cit-MMAF 9,94 840 4,2 6/F
3
trastuzumab-MC-val-cit-MMAF 24,90 2105 4,2 6/F
4
trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF 10,69 840 3,9 6/F
5
trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF 26,78 2105 3,9 6/F
6
trastuzumab-MC-MMAF 10,17 840 4,1 6/F
7
trastuzumab-MC-MMAF 25,50 2105 4,1 6/F
8
trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF 21,85 2105 4,8 6/F
Para trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, el término µg de MMAF/m2 se calculó usando 731,5 como el PM de MMAF y 145167como el PM de Herceptin.
5 El área de superficie corporal se calculó como sigue a continuación: [{(peso corporal en gramos a potencia 0,667) x 11,8}/10000]. (Guidance for Industry and Reviewers, 2002).
Las soluciones de dosis se administraron mediante una sola inyección en bolo intravenoso en la vena de la cola el
10 Día del Estudio 1 con un volumen de dosis de 10 ml/kg. Los pesos corporales de los animales se midieron antes de la dosis El Día del Estudio 1 y diariamente a partir de ese momento. Se recogió sangre entera en tubos que contenían EDTA para análisis de hematología. La sangre entera se recogió en tubos separadores de suero para análisis clínico de química. Las muestras de sangre se recogieron antes de la dosis el Día del Estudio -4, Día del Estudio 3 y Día del Estudio 5. Además, se recogió sangre entera en tubos que contenían heparina sódica en el
15 momento de la necropsia del plasma se congeló a -70 ºC para un posible análisis posterior. Los siguientes tejidos se recogieron y se colocaron en formalina tamponada neutra en el momento de la necropsia: hígado, riñones, corazón, timo, bazo, cerebro, esternón secciones del tracto GI, que incluyen estómago, intestino grueso y delgado. Se examinaron el esternón, intestino delgado, intestino grueso, hígado, timo, bazo y riñón.
20 Los niveles de enzimas en suero asociados al hígado en cada punto temporal se compararon con un intervalo (percentil 5º y 95º) a partir de ratas Sprague-Dawley hembra normales. Recuentos de glóbulos blancos y plaquetas en cada punto temporal se compararon con un intervalo (percentil 5º y 95º) a partir de ratas Sprague-Dawley hembra normales.
25 Estudio de dosis elevada en ratas Sprague-Dawley hembra normales:
Grupo 1: Vehículo Grupo 2: trastuzumab-MC-MMAF, 52,24 mg/kg, 4210 µg/m2 Grupo 3: trastuzumab-MC-MMAF, 68,25 mg/kg, 5500 µg/m2 Grupo 4: trastuzumab-MC-MMAF, 86,00 mg/kg, 6930 µg/m2
Tejidos de 11 animales se sometieron a histología de rutina. Estos animales había sido parte de un estudio de toxicidad aguda de dosis variadas usando un inmunoconjugado de trastuzumab-MC-MMAF. Se observó a los 30 animales durante 12 días después de la dosificación.
Ejemplo 32 – Toxicidad/Seguridad en Mono Cynomolgus
Tres grupos de cuatro (2 machos, 2 hembras) Macaca fascicularis (mono cynomolgus) sin tratamiento previa se 35 estudiaron para trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE y trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF. La administración intravenosa se realizó los dos días 1 y 22 de los estudios.
Muestra
Grupo Dosis
Vehículo
1 1M/1F día 1 día 22
H-MC-vc-PAB-MMAE
2 2M/2F 180 µg/m2 (0,5 mg/kg) el día 1 1100 µg/m2 (3,0 mg/kg) el día 22
imagen230
H-MC-vc-PAB-MMAE
3 2M/2F 550 µg/m2 (1,5 mg/kg) el día 8 550 µg/m2 (1,5 mg/kg) el día 29
H-MC-vc-PAB-MMAE
4 2M/2F 880 µg/m2 (2,5 mg/kg) el día 15 880 µg/m2 (2,5 mg/kg) el día 36
Muestra
Grupo Dosis
Vehículo
1 1M/1F día 1 día 22
H-MC-vc-PAB-MMAF
2 2M/2F 180 µg/m2 (0,5 mg/kg) el día 1 1100 µg/m2 (3,0 mg/kg) el día 22
H-MC-vc-PAB-MMAF
3 2M/2F 55 g/m2 (1,5 mg/kg) el día 1 550 µg/m2 (1,5 mg/kg) el día 22
H-MC-vc-PAB-MMAF
4 2M/2F 880 µg/m2 (2,5 mg/kg) el día 1 880 µg/m2 (2,5 mg/kg) el día 22
H = trastuzumab
La dosificación se expresa en el área superficial de un animal con el fin de ser relevante para otras especies, es decir la dosificación en µg/m2 es independiente de las especies y por lo tanto comparable entre especies. Las 5 formulaciones de ADC contenían PBS, fosfato sódico 5,4 mM, fosfato potásico 4,2 mM, cloruro sódico 140 mM, pH 6,5.
Se recogió sangre para dosis previa de análisis de hematología, y a los 5 min, 6 h, 10 h, y a los 1, 3, 5, 7, 14, 21 días después de cada dosis. Los recuentos de eritrocitos (RBC) y de plaquetas (PLT) se midieron con el método de
10 dispersión de luz. El recuento de leucocitos (WBC) se midió con el método de peroxidasa/basófilos. El recuento de reticulocitos se midió con el método de dispersión de luz con tinte catiónico. Los recuentos celulares se midieron en un aparato Advia 120. ALT (alanina aminotransferasa) y AST (aspartato aminotransferasa) se midieron en U/L con UV/NADH; metodología IFCC en un aparato AU400 de Olympus, y usando ensayos de Ab ELISA -ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA-MMAE/MMAF//ECD-Bio/SA-HRP Total.
15
Ejemplo 33  Producción, Caracterización y Humanización de Anticuerpo Monoclonal 4D5 AntiErbB2 
El anticuerpo monoclonal 4D5 de murino que se une específicamente al dominio extracelular de ErbB2 se produjo tal como se describe en Fendly et al. (1990) Cancer Research 50: 1550-1558. En resumen, células NIH 3T3/HER2-3400 20 (que expresan aproximadamente 1 x 105 moléculas de ErbB2/célula) se produjeron tal como se describe en Hudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 7158-7163 (1987) y se cosecharon con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 25 mM y se usó para inmunizar ratones BALB/c. Se administraron inyecciones i.p. a los ratones de 107 células en 0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. A los ratones con antisueros que inmunoprecipitaban ErbB2 marcado con 32P se les administraron inyecciones i.p. de un extracto de membranas de
25 ErbB2 purificado con aglutinina-Sepharose de germen de trigo (WGA) en las semanas 9 y 13. Ésto fue seguido de una inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de ErbB2 y los estrenos y dos se fundieron con línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Dos sobrenadantes de hibridoma se identificaron sistemáticamente para la unión a ErbB2 con ELISA y radioinmunoprecipitación.
30 Elaboración y caracterización de epítopos
El epítopo de ErbB2 unido mediante el anticuerpo monoclonal 4D5 se determinó mediante un análisis de unión competitiva (Fendly et al. Cancer Research 50: 1550 -1558 (1990)). Se realizaron estudios de bloqueo cruzado mediante florescencia directa en células intactas usando la Máquina de Cribado PANDEX™ para cuantificar la 35 fluorescencia. El anticuerpo monoclonal se conjugó con isotiocianato de fluoresceína (FITC), usando procedimientos establecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel y Schiigi (eds.) San Francisco:
W.J. Freeman Co. (1980)). Las monocapas confluentes de células NIH 3T3/HER2-3400 se tripsinizaron, se lavaron una vez, y se volvieron a suspender a 1,75 x 106 células/ml en PBS frío que contenía albúmina de suero bovino al 0,5 % (BSA) y NaN3 al 0,1 %. Se añadió una concentración final de partículas de látex al 1 % (IDC, Portland, OR) 40 para reducir la obstrucción de las membranas de placa PANDEX™. Células en suspensión, 20 µl, y 20 µl de anticuerpos monoclonales purificados (de 100 µg/ml a 0,1 µg/ml) se añadieron a los pocillos de la placa PANDEX™ y se incubó en hielo durante 30 minutos. Una dilución predeterminada del anticuerpo monoclonal marcado con FITC en 20 µl se añadió a cada pocillo, se incubó durante 30 minutos, se lavó, y la fluorescencia se cuantificó con la PANDEX™. Se consideró que los anticuerpos monoclonales compartían un epítopo si cada uno bloqueaba la unión
45 del otro en un 50 % o más en comparación con un anticuerpo monoclonal de control irrelevante. En este experimento, al anticuerpo monoclonal 4D5 se le asignó el epítopo I (restos de aminoácidos de aproximadamente

Claims (21)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES 
    1. Un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo unido de forma covalente a uno
    o más restos de fármaco, teniendo el compuesto la Fórmula Ic:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
    imagen2
    10 Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor (1)-(8):
    (1)
    CD79b (CD79B, CD79 β, IGb (beta asociada a inmunoglobulina), B29);
    (2)
    MUC16;
    (3)
    ETBR (receptor de endotelina de tipo B);
    15 (4) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de vehículo soluto (fosfato sódico), transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, miembro 2);
    (5) IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B);
    20 (6) PSCA hlg (genes 2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 270005OC12);
    (7)
    STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata);
    (8)
    MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina);
    25 A es a unidad Bastidor, a es 0 o 1, cada -W- es independientemente un unidad Aminoácido, w es un número entero que varía de 0 a 12, Y es una unidad Espaciadora, e
    30 y es 0, 1 o 2. en donde p varía de 1 a 20, y D es un resto de fármaco seleccionado entre las Fórmulas DE y DF:
    imagen3
    y
    imagen4
    40 en las que la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente para A, W o Y, e independientemente en cada posición: R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil
    45 C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; O R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se
    imagen5
    seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, y carbociclo C3-C8, y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, alquil
    5 C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre el grupo que consiste en arilo y heterociclo C3-C8;
    10 Z es O,S, NH, o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero que varía entre 1-1000; R13 es alquilo C2-C8;
    15 R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; R18 se selecciona entre el grupo que consiste en -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8) y
    20 -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y n es un número entero que varía de 0 a 6.
  2. 2. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 en el que D es la Fórmula DE:
    imagen6
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 2 en el que la Fórmula DE tiene la fórmula:
    imagen7
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    35 4. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que D es la Fórmula DF:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  4. 5. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 4 en el que la Fórmula DF tiene la fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    5 6. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el anticuerpo está unido al resto de fármaco a través de un resto de cisteína del anticuerpo.
    imagen8
    imagen9
  5. 7. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable
    del mismo, en el que p es de 1 a 4. 10
  6. 8. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que A está presente.
  7. 9. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 en donde el compuesto de conjugado de 15 anticuerpo-fármaco se selecciona entre el grupo que consiste en:
    a)
    imagen10
    20 en el que L es un anticuerpo y R17 se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arilen C1-C10-alquileno-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10, -(CH2CH2O)r-, y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1
    25 a 10;
    b)
    imagen11
    c)
    imagen12
    d)
    imagen13
    e)
    imagen14
    imagen15
    f)
    imagen16
    y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
  8. 10. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable
    del mismo, en el que Y está presente. 5
  9. 11. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que w es 2.
  10. 12. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 11 o una sal farmacéuticamente 10 aceptable del mismo, en el que Ww es -valina-citrulina-.
  11. 13. El conjugado de fármaco-anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 12 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que:
    15 Ab es un anticuerpo que se une al antígeno MUC16 asociado a tumor; y D es un resto de fármaco que tiene la Fórmula DF definida anteriormente en la que R11 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2.
  12. 14. El conjugado de fármaco-anticuerpo de la reivindicación 1 que tiene una fórmula seleccionada entre 20
    imagen17
    y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, en las que Ab es un anticuerpo que se une al antígeno MUC16 asociado a tumor.
    25
  13. 15. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el anticuerpo se une al antígeno MUC16 asociado a tumor que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4.
    30 16. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el anticuerpo se selecciona entre un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.
  14. 17. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 seleccionado entre las fórmulas: 35
    imagen18
    y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, en las que Val es valina y Cit es citrulina.
  15. 18.
    El conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 16 y 17, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Ab se une a un antígeno asociado a tumor seleccionado entre CD79b, ETBR, IRTA2 STEAP1, MPF, Napi3b y PSCA.
  16. 19.
    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de conjugado de anticuerpofármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables.
  17. 20.
    El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso en combinación con una cantidad eficaz de un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor y un agente antiinfeccioso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  18. 21.
    El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
  19. 22.
    El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso en combinación con una cantidad eficaz de un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor y un agente antiinfeccioso para uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
  20. 23.
    Uso de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
    imagen19
    5
  21. 24. Uso del compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la preparación de un medicamento para uso en combinación con una cantidad eficaz de un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente inmunosupresor y un agente antiinfeccioso para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio,
    10 cáncer de glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
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