CN104718220A - R-spondin易位及其使用方法 - Google Patents

R-spondin易位及其使用方法 Download PDF

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F·J·德索瓦吉
S·杜林克
S·塞沙基里
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Abstract

本文提供了与诸如癌症等病理状况的治疗相关的疗法。

Description

R-spondin易位及其使用方法
相关申请的交叉参考
依据35 U.S.C.§119，本申请要求2012年2月11日提交的美国专利申请No.61/597,746和2012年7月23日提交的61/674,763的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提交的序列表，并且将其全部通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2013年1月31日，命名为P4853R1WO_PCTSequenceListing.txt并且为58,980字节大小。
领域
提供了涉及病理状况(如癌症)治疗的疗法。
背景
每年报道超过100,000新病例的结直肠癌(CRC)，其是第四大流行的癌症，并且在美国每年占超过50,000例的死亡(Siegel，R.等，CA：A Cancer Journal for Clinicians61：212-236(2011))。大约15％的CRC呈现出由DNA错配修复(MMR)系统中的缺陷引起的微卫星不稳定性(MSI)(Fearon，E.R.，Annu.Rev.Pathol.6：479-507(2011))。其他～85％的微卫星稳定(MSS)CRC是染色体不稳定性(CIN)的结果(Fearon，E.R.，Annu.Rev.Pathol.6：479-507(2011))。基因组研究已经鉴定出CRC进展过程中如APC、KRAS和TP53这样的基因中的突变获取(Fearon，E.R.，Annu.Rev.Pathol.6：479-507(2011))。少数样品中的结肠癌蛋白编码的外显子和全基因组的测序已经鉴定出有可能有助于肿瘤形成的几个另外的突变和染色体结构变体(Wood，L.D.等，Science 318：1108-1113(2007)；Timmermann，B.等，PloS One 5：e15661(2010))。然而，最近在结肠癌的小鼠模型中的插入诱变筛选表明在CRC发展中涉及其他基因和途径(Starr，T.K.等，Science 323：1747-1750(2009)；March，H.N.等，Nat.Genet.43：1202-1209(2011))。
对于更好地了解癌症的发病机理，特别是，人结肠癌的发病机理，以及鉴定新的治疗靶标，仍然存在着需求。
概述
本发明提供了包括R-spondin-易位拮抗剂的wnt途径拮抗剂及其使用方法。
本文提供了抑制癌细胞的细胞增殖的方法，包括将癌细胞接触有效量的R-spondin-易位拮抗剂。本文进一步提供了在个体中治疗癌症的方法，包括将有效量的R-spondin-易位拮抗剂施用于个体。在任何方法的一些实施方案中，癌症或癌细胞包括R-spondin易位。
本文提供了在个体中治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的wnt途径拮抗剂施用于个体，其中治疗基于患有包括R-spondin易位的癌症的个体。本文提供了治疗癌细胞的方法，其中癌细胞包括R-spondin易位，并且其中该方法包括提供有效量的wnt途径拮抗剂。本文还提供了如果发现个体患有包括R-spondin易位的癌症，治疗个体癌症的方法，所述治疗包括将有效量的wnt途径拮抗剂施用于个体。
此外，本文提供了治疗个体癌症的方法，该方法包括：确定获自个体的样品包括R-spondin易位，并且将有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗给予个体，由此治疗癌症。
本文提供了治疗癌症的方法，其包括：(a)选择患有癌症的个体，其中癌症包括R-spondin易位；和(b)将有效量的wnt途径拮抗剂施用于由此选定的个体，由此治疗癌症。
本文还提供了鉴定更有可能或不太可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处的癌症个体的方法，该方法包括：确定获自个体的样品中的R-spondin易位的存在或不存在，其中样品中R-spondin易位的存在表示个体更有可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处或R-spondin的不存在表示个体不太可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗。
本文提供了用于预测癌症个体是否更有可能或不太可能有效地应答用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗，该方法包括确定R-spondin易位，由此R-spondin易位的存在表示个体更有可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗，而R-spondin易位的不存在表示个体不太可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗。
本文进一步提供了预测癌症个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答或不存在应答的方法，包括检测获自个体的样品中R-spondin易位的存在或不存在，其中R-spondin易位的存在预示个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答，而R-spondin易位的不存在预示不存在个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗。
在任一种方法的一些实施方案中，R-spondin易位是RSPO1易位、RSPO2易位、RSPO3易位和/或RSPO4易位。在一些实施方案中，R-spondin易位是RSPO2易位。在一些实施方案中，RSPO2易位包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2易位包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2易位包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2易位包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，R-spondin易位是RSPO3易位。在一些实施方案中，RSPO3易位包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3易位包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。在任一种方法的一些实施方案中，在染色体水平(例如，FISH)、DNA水平、RNA水平(例如，RSPO1-易位融合转录产物)和/或蛋白质水平(例如，RSPO1-易位融合蛋白)检测R-spondin易位。
在任一种方法的一些实施方案中，癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌或直肠癌。
1)在任一种方法的一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂是RSPO1拮抗剂、RSPO2拮抗剂、RSPO3拮抗剂和/或RSPO4拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是分离的结合R-spondin的单克隆抗体。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO1-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸和/或RSPO4-易位融合多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，R-spondin-易位融合多肽和/或多核苷酸是RSPO3-易位融合的多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。在一些实施方案中，该方法进一步包括其他治疗剂。
本文提供了分离的R-spondin-易位拮抗剂，其中R-spondin-易位拮抗剂是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO1-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO-3易位融合多肽和/或多核苷酸和/或RSPO4-易位融合多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQID NO：71。在一些实施方案中，R-spondin-易位融合多肽和/或多核苷酸是RSPO3-易位融合的多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。
附图简述
图1|(A)肿瘤特异性方式的交替的新的MRPL33的5’外显子的激活改变了MRPL33的N-末端，并且使得蛋白质更长。(B)框图显示出针对每种样品，与MRPL33比对，通过总读数标准化的上游外显子的读数。(C)还显示了交替的上游MRPL33启动子区，其显示出通过USCS基因组浏览器标记的H3K27Ac以及上游外显子的EST图谱。MRLP33氨基酸序列
MFLSAVFFAKSKSNETKSPLRGKEKNTLPLNGGLKMTLIYKEKTEGGDTDSEIL(SEQ ID NO：9)；
MRLP33交替的启动子氨基酸序列
MMAHLDFFLTYKWRAPKSKSLDQLSPNFLLRGRSETKSPLRGKEKNTLPLNGGLKMTLIYKEKTEGGDTDSEIL(SEQ ID NO：10)。
图2|反复出现的R-spondin易位。(A)结肠癌中R-spondin基因融合的类型和频率的列表。(B)描绘了EIF3E-RSPO2融合在基因组上的位置、方向和外显子-内含子结构的底图。显示了使用RNA-seq数据鉴定的EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合的读数(read)证据(C)证实了EIF3E-RSPO2体细胞融合的独立的RT-PCR衍生产物溶解在琼脂糖凝胶上。对RT-PCR产物进行了Sanger测序，以证实存在融合连接和相关的代表性色谱。(D)所得到的EIF3E-RSPO2融合蛋白的示意图。(E)带有R-spondin融合的肿瘤显示出升高的相应的RSPO基因的表达，显示在热图上。按照出现的顺序，图2分别公开了SEQ ID NO 85-92和71。
图3|PTPRK-RSPO3基因融合的反复出现。(A)描绘了PTPRK-RSPO3基因融合在基因组上的位置、方向和外显子-内含子结构。显示了使用RNA-seq数据鉴定的PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合的读数证据。(B)证实了PTPRK-RSPO3体细胞融合的独立的RT-PCR衍生产物溶解在琼脂糖凝胶上。将RT-PCR产物进行Sanger测序，以证实存在融合连接和相关的代表性色谱。(C)PTPRK、RSPO3和所得到的PTPRK-RSPO3PTPRK-RSPO3融合蛋白的示意图。按照出现的顺序，图3分别公开了SEQ ID NO 93-99和72。
图4|(A)PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合。(B)显示了通过RT-PCR确认这种融合的凝胶。(C)天然和融合蛋白的示意图。按照出现的顺序，图4分别公开了SEQ IDNO 100-104和73。
图5|RSPO融合产物激活Wnt信号传输。(A)通过Western印迹检测培养基中从用编码融合蛋白的表达构建体转染的293T细胞分泌的RSPO融合蛋白。表达的产物是RSPO 1-387。(B和C)RSPO融合蛋白激活和加强Wnt信号传输，如使用荧光酶报告子试验测量的。所示的数据来自源自用融合构建体转染的细胞或与报告构建体一起直接转染至细胞中的条件培养基。显示了来自至少三个实验的代表性数据。(D)表示R-spondin介导的Wnt信号传输途径激活的底图。(E)描绘了选定组的Wnt信号传输途径基因的RSPO融合和体细胞突变。
图6|(A)KRAS突变与RSPO基因融合重叠。(B)结肠癌中的RAS/RTK途径改变。
图7|完整基因组EIF3E-RSPO2坐标示意图和序列。按照出现的顺序，图7分别公开了SEQ ID NO 105-108。
图8|完整基因组EIF3E-RSPO2坐标示意图和序列。按照出现的顺序，图8分别公开了SEQ ID NO 109-111。
图9|完整基因组PTPRK-RSPO3坐标示意图和序列。按照出现的顺序，图9分别公开了SEQ ID NO 112-116。
图10|完整基因组PTPRK-RSPO3坐标示意图和序列。按照出现的顺序，图10分别公开了SEQ ID NO 112和117-120。
详述
I.定义
术语“R-spondin”和“RSPO”在本文中是指来自任何脊椎动物来源的天然R-spondin，包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)，除非另外指出。术语包括“全长”、未处理过的R-spondin以及从细胞中的加工获得的任何形式的R-spondin。术语还包括天然产生的R-spondin的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。R-spondin是四种蛋白的家族，R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)和R-spondin 4(RSPO4)。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO1。示例性人RSPO1核酸序列的序列是SEQ ID NO：1，或示例性人RSPO1是SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO2。示例性人RSPO2核酸序列的序列是SEQ ID NO：3，或示例性人RSPO2是SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO3。示例性人RSPO3核酸序列的序列是SEQ ID NO：5，或示例性人RSPO3是SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO4。示例性人RSPO4核酸序列的序列是SEQ IDNO：7，或示例性人RSPO4是SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
“R-spondin变体”、“RSPO变体”或其变化，表示如本文中限定的与本文中公开的任一种R-spondin具有至少80％氨基酸序列同一性的R-spondin多肽或多核苷酸，其通常是或编码活性R-spondin多肽。这样的R-spondin变体包括，例如，其中添加或删除了一个或多个核酸或氨基酸残基的R-spondin。通常，R-spondin变体将与本文中公开的R-spondin具有至少约80％序列同一性，或者，至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。通常，R-spondin变体为至少约10个残基长，或者，至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个残基长，或更多。任选，R-spondin变体将具有或编码与R-spondin相比具有不超过一个保守性氨基酸置换的序列，或者，与R-spondin相比，不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸置换。
术语“R-spondin易位”和“RSPO易位”在本文中是指其中一部分破坏的染色体(包括，例如，R-spondin、其变体或片段或第二个基因、其变体或片段)重新连接在不同的染色体位置的R-spondin，例如，不同于R-spondin天然位置的染色体位置，或不同于第二个基因的天然位置的R-spondin天然位置之中和/或周围的染色体位置。R-spondin易位可以是RSPO1易位、RSPO2易位、RSPO3易位和/或RSPO4易位。
术语“R-spondin-易位融合多核苷酸”和“RSPO-易位融合多核苷酸”在本文中是指R-spondin易位基因产物或融合多核苷酸的核酸序列。R-spondin-易位融合多核苷酸可以是RSPO1-易位融合多核苷酸、RSPO2-易位融合多核苷酸、RSPO3-易位融合多核苷酸和/或RSPO4-易位融合多核苷酸。术语“R-spondin-易位融合多肽”和“RSPO-易位融合多肽”在本文中是指R-spondin易位基因产物或融合多核苷酸的氨基酸序列。R-spondin-易位融合多肽可以是RSPO1-易位融合多肽、RSPO2-易位融合多肽、RSPO3-易位融合多肽和/或RSPO4-易位融合多肽。
如本文中限定的术语“R-spondin-易位拮抗剂”是部分或完全阻断、抑制或中和由R-spondin-易位融合多肽介导的生物活性的任何分子。在一些实施方案中，这样的拮抗剂结合R-spondin-易位融合多肽。根据一个实施方案，拮抗剂是多肽。根据另一个实施方案，拮抗剂是抗-R-spondin-易位抗体。根据另一个实施方案，拮抗剂是小分子拮抗剂。根据另一个实施方案，拮抗剂是多核苷酸拮抗剂。R-spondin易位可以是RSPO1-易位拮抗剂、RSPO2-易位拮抗剂、RSPO3-易位拮抗剂和/或RSPO4-易位拮抗剂。
如本文中限定的术语“wnt途径拮抗剂”是部分或完全阻断、抑制或中和由wnt途径(例如，wnt途径多肽)介导的生物活性的任何分子。在一些实施方案中，这样的拮抗剂结合wnt途径多肽。根据一个实施方案，拮抗剂是多肽。根据另一个实施方案，拮抗剂是抗体拮抗剂。根据另一个实施方案，拮抗剂是小分子拮抗剂。根据另一个实施方案，拮抗剂是多核苷酸拮抗剂。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合成聚合物的任何物质。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以包括合成后形成的修饰，如结合标记。其他类型的修饰包括，例如，“加帽”、用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸。核苷酸间修饰，如，例如，具有不带电连接的那些(例如，甲基磷酸盐(methylphosphonates)，磷酸三酯(phosphotriesters)、磷酸酰胺(phosphoamidates)，氨基甲酸盐(carbamates)等)，和具有电荷连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)等)。含有悬垂部分的那些，如，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素。抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有插入物的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)，含有螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)，含有烷化剂的那些，具有修饰的连接物的那些(例如，α异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸盐基团、磷酸盐基团替代，被标准保护基团保护，或激活来制备与其他核苷酸的其他连接，或可以结合至固体或半固体支持物。5’和3’端OH可以磷酸化或被1至20个碳原子的胺或有机加帽基团部分取代。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括，例如，2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和碱性核苷类似物，如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯连接可以被可替换的连接基团替代。这些可替换的连接基团包括，但不限于，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文中所用的，“寡核苷酸”通常是指单链、合成的多核苷酸，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
术语“引物”是指能够与核酸杂交并且遵循互补核酸聚合的单链多核苷酸，通常通过提供游离3’-OH基团。
术语“小分子”是指具有约2000道尔顿或更小分子量的任何分子，优选约500道尔顿或更小。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指其中已经引入了外源性核酸的细胞，包括这样的细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和从其衍生的后代，与传代的数量无关。后代在核酸含量上不与亲本细胞完全相同，而是可以含有突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变后代。
如本文中所用的，术语“载体”是指能够使与其连接的另一个核酸增殖的核酸分子。术语包括作为自体复制核酸结构的载体以及结合至其中已经引入所述载体的宿主细胞的基因组中的载体。特定的载体能够指引与其可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的成分分离出来的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至高于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。对于抗体纯度评价方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的成分分离出来的核酸。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色位置的染色体位置。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们呈现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体一部分的结合完整抗体结合的抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab。Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；二抗；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争试验中阻断50％或更多参照抗体与其抗原的结合的抗体，或相反，参照抗体在竞争试验中50％或更多抗体与其抗原的结合。本文中提供了示例性竞争试验。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体或具有如本文中限定的Fc区的重链的抗体。
如本文中使用的“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然产生的突变或在单克隆抗体制备生产过程中产生的，如通常少量存在的变体。与多克隆抗体制备物不同，多克隆抗体制备物通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，但单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群的抗体的特征，并且不是理解为需要通过任何特定的方法来生产抗体。例如，可以通过各种技术，包括但不限于，杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，如用于制备本文中所述的单克隆抗体的方法和其他示例性方法，来制得根据本发明使用的单克隆抗体。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然产生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的杂四部分的糖蛋白，由二硫化物-键合的两个相同的轻链和两个相同的重链组成。从N-至C-端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。相似地，从N-至C-端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列，分配给两种类型中的一种，这两种类型称为kappa(κ)和lambda(λ)。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
“人抗体”是具有对应于人或人细胞产生的抗体或利用人抗体库或其他人抗体编码序列源自非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。这种人抗体的定义特意排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定的实施方案中，人源化抗体将包含基本上至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，而全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的源自人抗体的抗体恒定区。抗体，例如，非人抗体的“人源化形式”，是指已经经历了人源化的抗体。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“效应物功能”是指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调；和B细胞激活。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其含有至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和可变Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非本文中另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述的。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人共有构架”(“人共有框架”)是指在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中代表最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。通常，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。
用于本文目的的“受体人构架”是包含源自如下所定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个超变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自抗体的结合抗原的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
如本文中所用的，术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其序列是超变的和/或形成结构上限定的环(“超变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自超变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性超变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65和H3的95-102。(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成超变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。(参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文中所描述的那些)来测量。以下描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有改变的亲本抗体相比，在一个或多个超变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这样的改变导致抗体对抗原的亲和性提高。
术语“抗-R-spondin-易位抗体”和“结合R-spondin-易位融合多肽的抗体”是指能够以足够的亲和力结合R-spondin-易位融合多肽的抗体，使得抗体用作靶向R-spondin易位中的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-R-spondin易位抗体与未改变的、非-R-spondin-易位融合多肽和/或未易位的-R-spondin多肽的结合程度低于约10％的抗体与R-spondin-易位融合多肽的结合，例如，通过放射性免疫试验(RIA)测量的。在特定的实施方案中，结合R-spondin-易位融合多肽的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、，≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在特定的实施方案中，抗R-spondin易位抗体结合R-spondin易位中独特的R-spondin易位的表位。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
“裸抗体”是指没有缀合异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
相对于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可以使用本领域技术人员能力范围内的各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为本文中的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以X/Y比值
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
术语“检测”包括任何方式的检测，包括直接和间接检测。
如本文中使用的术语“生物标记物”是指可以在样品中检测的指示剂，例如，预测、诊断和/或预后。生物标记物可以作为特征在于特定的分子、病理、组织学和/或临床特征的疾病或失调(例如，癌症)的特定亚型的指示剂。在一些实施方案中，生物标记物是基因。在一些实施方案中，生物标记物是基因的变化(例如，突变和/或多形性)。在一些实施方案中，生物标记物是易位。生物标记物包括，但不限于，多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、基于碳水化合物和/或糖脂的分子标记物。
与个体提高的临床益处相关的生物标记物的“存在”、“含量”或“水平”在生物样品中是可检测的水平。通过本领域技术人员已知的并且在本文中也公开的方法来测量这些。测定的生物标记物的表达水平或含量可以用于确定对治疗的应答。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，并且通常是指生物样品中生物标记物的含量。“表达”通常是指信息(例如，基因编码的和/或外遗传的)通过其转化成细胞中存在和运行的结构的过程。因此，如本文中所用的，“表达”可以是指转录成多核苷酸、翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)。不管它们是源自通过交替剪接产生的转录产物或降解的转录产物，或源自多肽的翻译后加工，例如，通过蛋白水解，转录的多核苷酸片段、翻译的多肽或多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)也应当认为是表达的。“表达的基因”包括转录成作为mRNA的多核苷酸并且随后翻译成多肽的那些，以及还包括转录成RNA但未翻译成多肽(例如，转移和核糖体RNA)的那些。
“升高的表达”、“升高的表达水平”或“升高的水平”是指相对于对照，如未患有疾病或失调(例如，癌症)的一个或多个个体或内部对照(例如，管家生物标记物)，个体中提高的生物标记物表达或提高的生物标记物水平。
“降低的表达”、“降低的表达水平”或“降低的水平”是指相对于对照，如未患有疾病或失调(例如，癌症)的一个或多个个体或内部对照(例如，管家生物标记物)，个体中降低的生物标记物表达或降低的生物标记物水平。
术语“管家生物标记物”是指通常相似地存在于所有细胞类型中的一种生物标记物或生物标记物组(例如，多核苷酸和/或多肽)。在一些实施方案中，管家生物标记物是“管家基因”。“管家基因”在本文中是指编码其活性是维持细胞功能必需的蛋白质并且通常相似地存在于所有细胞类型中的一种基因或基因组。
如本文中所用的，“扩增”通常是指生产所需序列的多个拷贝的过程、“多个拷贝”意思是至少两个拷贝。“拷贝”不必定表示与模板序列完全互补或一致的序列。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，脱氧肌苷，有意识的序列改变(如，通过引物引入的包含可杂交的但与模板不互补的序列的序列改变)，和/或在扩增过程中产生的序列错误。
术语“多重-PCR”是指为了在单个反应中扩增两个或多个DNA序列的目的，使用超过一个的引物组，在获自单一来源(例如，个体)的核酸上进行的单个PCR反应。
杂交反应的“严格性”是本领域普通技术人员容易确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度用于合适的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其熔化温度的环境中时，杂交通常依赖于变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，断定较高的相对温度将易于使得反应条件更严格，而较低的温度使得反应条件严格性较低。对于杂交反应严格性的其他详细内容和解释，参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Publishers，(1995)。
如本文中限定的，“严格性条件”或“高严格性条件”可以通过以下那些来鉴定：(1)对于洗涤，使用低离子强度和高温度，例如，在50℃下，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在42℃下，在杂交过程中，使用变性剂，如甲酰胺，例如，在42℃下，50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液和750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下，在使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声波鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中杂交过夜，在42℃下，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在55℃下，由含有EDTA的0.1×SSC组成的10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以按照Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，New York：Cold Spring Harbor Press，1989中所述的来鉴定，并且包括使用比上述那些严格性较低的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的实例是在包含：20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中，在37℃下，孵育过夜，接着在约37-50℃下，在1×SSC中，洗涤滤器。本领域技术人员将知道怎样按照调节因素(如，探针长度等)的需要，来调节温度、离子强度等。
术语“诊断”在本文中用来表示分子或病况、疾病或病症(癌症)的鉴定或分类。例如，“诊断”可以是指特定类型的癌症的鉴定。“诊断”还可以是指特定亚型的癌症的分类，例如，通过组织病理学标准，或通过分子特征(例如，通过一种或组合的生物标记物(例如，特定的基因或由所述基因编码的蛋白质)的表达来表征的亚型)来分类。
术语“辅助诊断”在本文中用来表示辅助作出关于特定类型的疾病或失调(例如，癌症)的症状或病症的存在或性质的临床决定的方法。例如，疾病或病症(例如，癌症)的辅助诊断方法可以包括检测来自个体的生物样品中的特定生物标记物。
如本文中所用的，术语“样品”是指获自或源自含有待表征和/或待鉴定的细胞和/或其他分子实体的目标患者和/或个体的组合物，例如，基于物理、生化、化学和/或生理学特征。例如，短语“疾病样品”及其变化是指获自预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体的目标患者的任何样品。样品包括，但不限于，初级或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解液、血小板、血清、血浆、玻璃状液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳汁、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解液和组织培养基、组织提取物，如均质的组织、肿瘤组织、细胞提取物，及其组合。
“组织样品”或“细胞样品”意思是获自患者或个体的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体肿瘤，如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检和/或抽气；血液或任何血液组分，如血浆；体液，如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；来自患者怀孕或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可以是初级或培养的细胞或细胞系。任选，组织或细胞样品获自患病组织/器官。组织样品可以含有本质上不是与组织自然混合的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
如本文中使用的，“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”，是指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自相同患者或个体的身体的健康和/或未患病部分(例如，组织或细胞)。例如，邻近患病细胞或组织的健康和/或未患病细胞或组织(例如，邻近肿瘤的细胞或组织)。在另一个实施方案中，参照样品获自相同患者或个体身体的未治疗过的组织和/或细胞。在再另一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是患者或个体的个体身体的健康和/或未患病部分(例如，组织或细胞)。在甚至另一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是患者或个体的个体身体的未治疗过的组织和/或细胞。
对于本文中的目的，组织样品的“部分”表示组织样品的单个部分或碎片，例如，从组织样品切割的组织或细胞的薄片。理解可以获取组织样品的多个部分并且接受分子，只要理解可以在形态学和分子水平分析组织样品的相同部分，或相对于多肽和多核苷酸进行分析。
“关联(correlate)”或“关联(correlating)”意思是以任何方式，将第一种分析或实验方案的性能和/或结果与第二种分析或实验方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以在进行第二种实验方案中使用第一种分析或实验方案的结果和/或可以使用第一种分析或实验方案的结果来确定第二种分析或实验方案是否应当进行。关于多核苷酸分析或实验方案的实施方案，可以使用多核苷酸表达分析或实验方案的结果来确定特定的治疗方案是否应当进行。
可以使用表达对个体的益处的任何终点来评价“个体应答”或“应答”，包括，但不限于，(1)疾病进展(例如，癌症进展)的抑制，至一定程度，包括减缓或完全停止；(2)肿瘤大小的减小；(3)抑制(即，减少、减缓或完全停止)癌细胞浸润至邻近外周器官和/组织中；(4)抑制(即，减少、减缓或完全停止)转移；(5)与疾病或失调(例如，癌症)相关的一种或多种症状的缓解，至一定程度；(6)无进展生存长度的提高；和/或(9)治疗后给定时间点的死亡率降低。
如本文中使用的，短语“基本上相似”，是指两个数值之间相当高程度的相似性(通常一个与分子相关，而另一个与参照/比较分子相关)，使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在所述值(例如，Kd值)测量的生物学特征内容内不是统计学显著的。作为参照/比较值的函数，所述两个值之间的差异例如低于约20％，低于约10％，和/或低于约5％。短语“基本上正常”是指与参照(例如，正常参照)基本上相似。
短语“基本上不同”是指两个数值之间相当高程度的差异(通常一个与分子相关，而另一个与参照/比较分子相关)，使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在所述值(例如，Kd值)测量的生物学特征内容内是统计学显著的。作为参照/比较值的函数，所述两个值之间的差异例如高于约10％，高于约20％，高于约30％，高于约40％，和/或高于约50％。
在本文中使用时，词语“标记”是指可检测化合物或组合物。标记通常与试剂缀合或与试剂直接或间接融合，所述试剂如多核苷酸探针或抗体，并且促进与其缀合或融合的试剂的检测。标记可以自身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或，在酶标记的情况中，可以催化底物化合物或组合物的化学改变，其形成可检测的产物。
试剂的“有效量”是指在需要的剂量并持续需要的时间段下，获得所需治疗或预防结果有效的含量。
本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据如下因素而改变，所述因素如病况，个体的年龄、性别和体重，以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量还是其中物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的含量。“预防有效量”是指在需要的剂量并持续需要的时间段下，获得所需预防结果的有效含量。通常，但不是必定的，由于在疾病早期之前或在疾病早期时，在患者中使用预防剂量，因此预防有效量将低于治疗有效量。
术语“药物制剂”是指以这样的形式使得允许其中所含的活性成分的生物活性的制备物，并且其不含对给予制剂的患者有不可接受的毒性的其他成分。
“药物学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分以外的成分，其对患者是无毒的。药物学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变化，如“治疗或“处理”)是指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解(remission)或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。
“癌症(cancer)”和“癌性”是指或描述哺乳动物中特征通常为不受调节的细胞生长/增殖的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤(例如，霍奇金(Hodgkin)和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌(squamouscarcinoma of the lung)、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴增殖性失调，以及各种类型的头颈癌。
术语“抗癌治疗”是指用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括，但不限于，例如，化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放疗中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其他药剂、抗-CD20抗体、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如，GleevecTM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib))、干扰素、细胞因子、结合以下靶标PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受体、TRAIL/Apo2中的一种多种的拮抗剂(例如，中和抗体)，以及其他生物活性和有机化学剂等。其组合也包括在本发明中。
如本文中使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)、或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核水解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“化疗剂”是用于癌症治疗中的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)烷基磺酸酯(alkylsulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苄替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基氨基吖啶(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；桦木酸(betulinic acid)；喜树喊(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，))、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；足叶草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、胆留醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)，如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素gamma 1I和卡奇霉素omega I1(参见，例如，Agnew.Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，口服α-4整联蛋白抑制剂；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素生色团)，aclacinomysins、放射菌素(actinomycin)、authramycin、氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、chromomycinis、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉阿霉素、阿霉素HCl脂质体注射液脂质体阿霉素TLC D-99PEG化脂质体阿霉素和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、发波霉素(marcelIomycin)、丝裂霉素，如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，如氨甲蝶呤、吉西他滨喃氟啶(tegafur)capecitabineepothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷，双脱氧尿苷、去氟氧尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄氨(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；伊洛尼塞(elfomithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类(maytansinoids)，如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰胼；甲基苄胼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端抱霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆抱菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesin)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如，紫杉醇(paclitaxel)紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西紫杉醇chloranbucil；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂剂，如顺钼、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如，)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春花碱长春新碱长春地辛和长春瑞滨足叶乙苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲酰四氢乙酸(leucovorin)；诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类(retinoids)，如维甲酸，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类，如氯屈瞵酸盐(clodronate)(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)阿仑膦酸盐(alendronate)帕米磷酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二噁烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中涉及的信号传输通路中的基因表达的那些，如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmRHBAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(sunitinib，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib)或依托考昔(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，如哈眠那(oblimersen sodium)匹杉琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，)；法尼基转移酶抑制剂，如lonafarnib(SCH6636，SARASARTM)；和以上任一种物质的药物学上可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写；和FOLFOX，即奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和甲酰四氢乙酸的治疗方案的缩写。
如本文中所限定的，化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用于调节、降低、阻断或抑制能够促进癌症生长的激素的作用。它们可以本身就是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂谱的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，如SERM3；没有激动剂特性的纯抗雌激素，如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)以及非类固醇芳香酶抑制剂，如阿那曲唑(anastrozole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)及其它芳香酶抑制剂，包括伏罗唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；黄体生成素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类，包括孕激素，如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，雌激素，如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin)，以及雄激素/维甲类，如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式维A酸和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素类，如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；以及以上任一种物质的药物学上可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合。
如本申请中所用的术语“前药”是指与亲本药物相比对肿瘤细胞的毒性较低并且能够酶促活化或转化成活性更高的亲本形式的药物活性物质的前体或衍生物形式。参见，例如，Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy(化疗中的前药)”BiochemicalSociety Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前药：靶药传送的化学方法)”DirectedDrug Delivery，Borchardt等(编辑)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前药包括，但不限于，含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞苷和其他5-氟尿苷前药，其可以转化成活性更高的细胞毒性游离药。可以衍生成用于本发明中的前药形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上述的那些化疗剂。
“生长抑制剂”，用于本文中时，是指抑制细胞(例如，体外或体内的细胞，其生长依赖于wnt途径基因和/或R-spondin移位表达)生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在S期以外的时期)的制剂，如诱导G1停止和M-期停止的制剂。典型的M-期阻断剂包括长春碱类(vincas)(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、足叶乙苷和博来霉素。停止G1的那些制剂也能转向S-期停止，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松、氨烯咪胺(decarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、顺铂、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多的信息可以在The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn和Israel编辑，第1章，标题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs(细胞周期调控、致癌基因和抗肿瘤药物)”，Murakami等，(WB Saunders：Philadelphia，1995)中找到，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西紫杉醇)是源自紫杉树的抗癌药物。多西紫杉醇(Rhone-PoulencRorer)，源自欧洲紫杉，是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西紫杉醇促进从微管蛋白二聚物装配微管并且通过防止解聚作用来稳定微管，这导致了细胞有丝分裂的抑制。
“放疗”表示使用定向的γ射线或β射线，以诱导对细胞的充分损害，使得限制其正常发挥正常功能的能力或完全地破坏细胞。将认识到本领域存在许多已知方式来确定治疗的剂量和持续时间。作为一次给药来给予典型的治疗，并且典型的剂量范围为10至200个单位(Grays)/天。
“个体”或“患者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家畜(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在特定的实施方案中，个体或患者是人。
术语“同时地”在本文中用来表示两种或更多种治疗剂的给药，其中至少一部分给药的时间是重叠的。因此，同时给药包括中止给药一种或多种其他药剂后继续一种或多种药剂给药的给药方案。
“降低”或“抑制”表示引起整体降低20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的能力。降低或抑制可以涉及待治疗的失调的症状、转移的存在或大小，或原发性肿瘤的大小。
术语“包装插页”用于指常规地包含在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗性产品的警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂的任何产品(例如，包装或容器)或试剂盒，所述试剂例如为，用于治疗疾病或失调(例如，癌症)的药物，或特异性检测本文中所述的生物标记物的探针。在特定的实施方案中，作为用于进行文本中所述方法的装置，促销、分配或销售所述产品或试剂盒。
“目标受众”是正在向其推销或打算向其推销特定药物的一群人或公共机构，如通过销售或广告来促销，尤其是针对特定的用途、治疗或适应症来推销，如，单独的病人、病人群、报纸、医学文献和杂志的读者、电视或互联网浏览者、电台或互联网听众、医师、制药公司等。
如本领域技术人员所理解的，本文中提及“约”一个值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
理解本文中描述的方面和实施方案包括由所述方面和实施方案“组成”和/或“基本上组成”。如本文中所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非另外指出。
II.方法和用途
本文中提供了利用wnt途径拮抗剂的方法。特别地，本文中提供了利用R-spondin-易位拮抗剂的方法。例如，本文中提供了抑制癌细胞的细胞增殖的方法，包括将癌细胞接触有效量的R-spondin-易位拮抗剂。本文中还提供了治疗个体癌症的方法，包括将有效量的R-spondin-易位拮抗剂施用于个体。在一些实施方案中，所述癌症或癌症包括R-spondin易位。
本文中还提供了治疗个体癌症的方法，包括将有效量的抗癌治疗给予个体，其中所述治疗是基于患有包括一种或多种生物标记物的癌症的个体。在一些实施方案中，抗癌治疗包括wnt途径拮抗剂。例如，提供了治疗个体癌症的方法，包括将有效量的wnt途径拮抗剂施用于个体，其中所述治疗是基于患有包括R-spondin易位的癌症的个体。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中进一步提供了治疗个体癌症的方法，只要已经发现个体患有包括一种或多种生物标记物的癌症，所述治疗包括将有效量的抗癌治疗给予所述个体。在一些实施方案中，抗癌治疗包括wnt途径拮抗剂。例如，本文中提供了治疗个体癌症的方法，只要已经发现个体患有包括R-spondin易位的癌症，所述治疗包括将有效量的wnt途径拮抗剂施用于个体。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中提供了治疗癌细胞的方法，其中癌细胞包括一种或多种生物标记物，该方法包括提供有效量的wnt途径拮抗剂。例如，本文中提供了治疗癌细胞的方法，其中癌细胞包括R-spondin易位，该方法包括提供有效量的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中提供了治疗个体癌症的方法，该方法包括：确定获自个体的样品包括一种或多种生物标记物，并且将有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗给予个体，由此治疗癌症。例如，本文中提供了治疗个体癌症的方法，该方法包括：确定获自个体的样品包括R-spondin易位，并且将有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗给予个体，由此治疗癌症。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中还提供了治疗癌症的方法，包括：(a)选择患有癌症的个体，其中癌症包括一种或多种生物标记物；和(b)将有效量的wnt途径拮抗剂施用于由此选择的个体，由此治疗癌症。例如，本文中还提供了治疗癌症的方法，包括：(a)选择患有癌症的个体，其中癌症包括R-spondin易位；和(b)将有效量的wnt途径拮抗剂施用于由此选择的个体，由此治疗癌症。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中进一步提供了鉴定更有可能或不太可能呈现出来自用抗癌治疗的治疗的益处的癌症个体的方法，该方法包括：确定获自个体的样品中一种或多种生物标记物的存在或不存在，其中样品中一种或多种生物标记物的存在表示个体更有可能呈现出来自用抗癌治疗的治疗的益处或一种或多种生物标记物的不存在表示个体不太可能呈现出来自用抗癌治疗的治疗的益处。在一些实施方案中，抗癌治疗包括wnt途径拮抗剂。例如，本文中提供了鉴定更有可能或不太可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处的癌症个体的方法，该方法包括：确定获自个体的样品中R-spondin易位的存在或不存在，其中样品中R-spondin易位的存在表示个体更有可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处或R-spondin易位的不存在表示个体不太可能呈现出来自用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的益处。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中提供了用于预测癌症个体是否更有可能或不太可能有效地应答用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的方法，该方法包括测定一种或多种生物标记物，由此一种或多种生物标记物的存在表示个体更有可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗，而一种或多种生物标记物的不存在表示个体不太可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗。例如，本文中提供了用于预测癌症个体是否更有可能或不太可能有效地应答用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的治疗的方法，该方法包括确定R-spondin易位，由此R-spondin易位的存在表示个体更有可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗，而R-spondin易位的不存在表示个体不太可能有效地应答用wnt途径拮抗剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
本文中提供了预测癌症个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答或不存在应答的方法，包括检测获自个体的样品中一种或多种生物标记物的存在或不存在，其中一种或多种生物标记物的存在预示个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答，而一种或多种生物标记物的不存在预示不存在个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答。例如，本文中提供了预测癌症个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答或不存在应答的方法，包括检测获自个体的样品中R-spondin易位的存在或不存在，其中R-spondin易位的存在预示个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答，而R-spondin易位的不存在预示不存在个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗的应答。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予有效量的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在一些实施方案中，wnt途径拮抗是是R-spondin-易位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂和/或R-spondin易位拮抗剂是分离的结合R-spondin(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)的抗体。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表2中所列的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括一种或多种表2中所列基因的变化(例如，多态性多态性或突变)(例如，表2中的变化(例如，多态性或突变))的存在。在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表3中所列的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括一种或多种表3中所列基因的变化(例如，多态性或突变)(例如，表3中的变化(例如，多态性或突变))的存在。在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表4中所列的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括一种或多种表4中所列基因的变化(例如，多态性或突变)(例如，表4中的变化(例如，多态性或突变))的存在。在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表5中所列的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括一种或多种表5中所列基因的变化(例如，多态性或突变)(例如，表5中的变化(例如，多态性或突变))的存在。在一些实施方案中，变化(例如，多态性或突变)是体细胞变化(例如，多态性或突变)。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种选自KRAS，TP53，APC，PIK3CA，SMAD4，FBXW7，CSMD1，NRXN1，DNAH5，MRVI1，TRPS1，DMD，KIF2B，ATM，FAM5C，EVC2，OR2W3，SIN3A，SMARCA5，NCOR1，JARID2，TCF12，TCF7L2，PHF2，SOS2，RASGRF2，ARHGAPIO，ARHGEF33，Rab40c，TET2，TET3，EP400，MLL，TMPRSSUA，ERBB3，EPHB4，EFNB3，EPHA1，TYRO3，TIE1，FLT，RIOK3，PRKCB，MUSK，MAP2K7，MAP4K5，PTPRN2，GPR4，GPR98，TOPORS和SCN10A的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种选自CSMD1，NRXN1，DNAH5，MRVI1，TRPS1，DMD，KIF2B，ATM，FAM5C，EVC2，OR2W3，TMPRSSUA和SCN10A的基因。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括RAB40C，TCF12，C20orf132，GRIN3A和/或SOS2。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括ETV4，GRIND2D，FOXQ1和/或CLDN1。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括MRPL33。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种转录调节子(例如，TCF12，TCF7L2和/或PHF2)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种Ras/Rho相关调节子(例如，SOS1(例如，R547W，T614MR854*，G1129V)、SOS2(例如，R225*，R854C和Q1296H)RASGRF2，ARHGAP10，ARHGEF33和/或Rab40c(例如，G251S))。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种染色质修饰酶(例如，TET1，THT2，TET3，EP400和/或MLL)。在一些实施方案中，一种或多种染色质修饰酶是TET1和/或TET3。在一些实施方案中，一种或多种染色质修饰酶是TET1(例如，R81H，E417A，K540T，K792T，S879L，S1012*，Q1322*，C1482Y，A1896V和A2129V)，TET2(例如，K108T，T118I，S289L，F373L，K1056N，Y1169*，A1497V和V1857M)，和/或TET3(例如，T165M，A874T，M977V，G1398R和R1576Q/W)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种受体酪氨酸激酶(例如，ERBB3，EPHB4，EFNB3，EPHA1，TYR03，TIE1和FLT4)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种激酶(例如，RIOK3，PRKCB，MUSK，MAP2K7和MAP4K5)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种蛋白质磷酸酶(例如，PTPRN2)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种GPRC(例如，GPR4和/或GPR98)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括E3-连接酶(例如，TOPORS)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括表2、3、4和/或5中所列的一种或多种生物标记物的变化(例如，多态性或突变)的存在(例如，表2、3、4和/或5中的变化(例如，多态性或突变))。在一些实施方案中，变化(例如，多态性或突变)包括体细胞变化(例如，多态性或突变)。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种RSPO(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)。在一些实施方案中，通过一种或多种RSPO(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)升高的表达水平(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括RSPO1。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括RSPO2。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括RSPO3。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括RSPO4。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表6中所列的基因。在一些实施方案中，通过一种或多种表6中所列基因的升高的表达水平(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括FOXA1，CLND1和/或IGF2。在一些实施方案中，通过FOXA1，CLND1和/或IGF2的升高的表达水平(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括差异表达的信号传输途径，包括，但不限于，钙信号传输、cAMP-介导的信号传输、谷氨酸受体信号传输、肌萎缩性脊髓侧索硬化信号传输、氮代谢、轴突引导信号传输、IL-17A在牛皮癣中的作用、血清素受体信号传输、慢性梗阻性肺病中的气道病理学、蛋白质激酶A信号传输、膀胱癌信号传输、HIF1α信号传输、心脏β-肾上腺素能信号传输、突触长期强化、动脉粥样硬化信号传输、昼夜节律信号传输、神经元中的CREB信号传输、G-蛋白偶联受体信号传输、白细胞外渗信号传输、补体系统、Eicosanoid信号传输、酪氨酸代谢、半胱氨酸代谢、突触长期抑制、IL-17A在关节炎中的作用、Sildenafil(Viagra)的细胞作用、背角神经元中的神经疼痛信号传输、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、IL-17F在过敏性炎性气道疾病中的作用、甲状腺癌信号传输、肝纤维化/肝星形细胞激活、多巴胺受体信号传输、NANOG在哺乳动物胚胎干细胞多能性中的作用、硫酸软骨素生物合成、内皮缩血管肽-1信号传输、硫酸角质素生物合成、光转化途径、Wnt/β-catenin信号传输、趋化因子信号传输、丙氨酸和天冬氨酸盐代谢、鞘糖脂生物合成-Neolactoseries、胆汁酸生物合成、巨噬细胞的作用、类风湿性关节中的成纤维细胞和内皮细胞、α-肾上腺素能信号传输、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、LPS/IL-1介导的RXG功能抑制、结直肠癌转移信号传输、嗜曙红细胞中的CCR3信号传输和/或O-多糖生物合成。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括一种或多种表7中所列的基因。在一些实施方案中，通过一种或多种表7所列基因的升高的基因拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括IGF2、KRAS和/或MYC。在一些实施方案中，通过IGF2、KRAS和/或MYC的升高的基因拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，通过一种或多种表7所列基因的降低的基因拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括FHIT、APC和/或SMAD4。在一些实施方案中，通过FHIT、APC和/或SMAD4的降低的基因拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，通过染色体20q的升高的拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。在一些实施方案中，通过染色体18q的降低的拷贝数(例如，与参照相比)的存在来表示一种或多种生物标记物的存在。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括表9中所列的一种或多种基因。在一些实施方案中，通过表9中所列的一种或多种基因的变化(例如，多态性或突变)的存在和/或表9中所列的一种或多种基因的可替换剪接(例如，与参照相比)来表示一种或多种生物标记物的存在(例如，表9中的变化(例如，多态性或突变))。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括TP53，NOTCH2，MRPL33和/或EIF5B。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物是MRPL33。在一些实施方案中，通过表9中TP53，NOTCH2，MRPL33和/或EIF5B的变化(例如，多态性或突变)的存在(例如，表9中的变化(例如，多态性或突变))和/或TP53，NOTCH2，MRPL33和/或EIF5B的可替换剪接(例如，与参照相比)来表示一种或多种生物标记物的存在。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括表10中所列的一种或多种基因的易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括表10中所列的一种或多种基因的易位(例如，重排和/或融合)的存在(例如，表10中的易位(例如，重排和/或融合))。在任一种方法的一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是PVT1易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，PVT1易位(例如，重排和/或融合)包括PVT1和MYC。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括PVT1和IncDNA。在任一种方法的一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO1易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：12、41和/或42的引物可检测RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过EIF3E启动子来驱动。RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO2启动子来驱动。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子1和RSPO32外显子2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子7和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：13、14、43和/或44的引物可检测RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过PTPRK启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO3启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK分泌信号序列(和/或不包括RSPO3分泌信号序列)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO4易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)导致升高的R-spondin表达水平(例如，与没有R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)导致升高的R-spondin的活性和/或激活(例如，与没有R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在包括R-spondin易位(例如，重排和/或融合)，如表10中的以及KRAS和/或BRAF(重排和/或融合)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在，如表10中的易位(例如，重排和/或融合)，以及变化KRAS和/或BRAF(例如，多态性或突变)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在，如表10中的易位(例如，重排和/或融合)，以及一种或多种生物标记物的不存在是变化(例如，多态性或突变)CTNNB1和/或APC的不存在。
在任一种易位(例如，重排和/或融合)的一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是体细胞易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是染色体内易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是染色体间易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是倒置。在一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是删除。在一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是功能性易位融合多核苷酸(例如，功能R-spondin-易位融合多肽)和/或功能性易位融合多肽(例如，功能性R-spondin-易位融合多肽)。在一些实施方案中，功能性易位融合多肽(例如，功能性R-spondin-易位融合多肽)激活已知通过易位基因之一调节的途径(例如，wnt信号传输途径)。在一些实施方案中，途径是标准wnt信号传输途径。在一些实施方案中，途径是非标准wnt信号传输途径。在一些实施方案中，确定途径激活的方法是本领域已知的，并且包括本文中所述的荧光素酶受体试验。
癌症和癌细胞的实例包括，但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和岛细胞癌)、间皮瘤、许旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤和白血病或淋巴样恶性。这类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状上皮细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾(lidney或renal)癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。在一些实施方案中，癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，癌症是直肠癌。
可以基于本领域已知的任何合适的标准来定量和/或定性地测定生物标记物(例如，R-spondin易位)的存在和/或表达水平/含量，包括但不限于DNA、mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝数。在特定的实施方案中，与第二个样品中的存在/不存在和/或表达水平/含量相比，第一个样品中的存在和/或表达水平/含量提高了。在特定的实施方案中，与第二个样品中的存在/不存在和/或表达水平/含量相比，第一个样品中的存在和/或表达水平/含量降低了。在特定的实施方案中，第二个样品是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织。本文中描述了用于测定基因的存在/不存在和/或表达水平/含量的其他公开内容。
在任一种方法的一些实施方案中，升高的表达是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，通过如本文中所述那些的本领域已知的标准方法检测的，生物标记物(例如，蛋白质或核酸(例如，基因或mRNA))水平整体提高约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％。97％，98％，99％或更高。在特定的实施方案中，升高的表达是指样品中生物标记物的表达水平/含量的提高，其中提高是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中各自生物标记物的表达水平/含量的至少约1.5X，1.75X，2X，3X，4X，5X，6X，7X，8X，9X，10X，25X，50X，75X或100X。在一些实施方案中，升高的表达是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、对照组织或内部对照(例如，管家基因)相比，高于约1.5倍，约1.75倍，约2倍，约2.25倍，约2.5倍，约2.75倍，约3倍或约3.25倍的整体提高。
在任一种方法的一些实施方案中，降低的表达是指与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，通过如本文中所述那些的本领域已知的标准方法检测的，生物标记物(例如，蛋白质或核酸(例如，基因或mRNA))水平整体减低约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％。97％，98％，99％或更高。在特定的实施方案中，降低的表达是指样品中生物标记物的表达水平/含量的降低，其中降低是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中各自生物标记物的表达水平/含量的至少约0.9X，0.8X，0.7X，0.6X，0.5X，0.4X，0.3X，0.2X，0.1X，0.05X或0.01X。
可以通过多种方法来分析样品中各种生物标记物的存在和/或表达水平/含量，其中许多方法是本领域已知的并且是本领域技术人员了解的，包括，但不限于，免疫组织化学(“IHC”)、Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合试验、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、定量的基于血液的试验(例如血清ELISA)、生化酶活性试验、原位杂交、Southern分析、Northern分析、完整基因组测序、蛋白酶链式反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法，如，例如，分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱测定和/或基因表达的连续分析(“SAGE”)，以及可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的各种试验中的任何一种。用于评价基因和基因产物状况的典型实施方案可以在例如Ausubel等编辑，1995，Current Protocols InMolecular Biology，2(Northern印迹)，4(Southern印迹)，15(免疫印迹)和18(PCR分析)单元中找到。也可以使用多重免疫试验，如获自Rules Based Medicine or MesoScale Discovery(“MSD”)的那些。
在一些实施方案中，使用包括以下步骤的方法确定了生物标记物的存在和/或表达水平/含量：(a)对样品(如，患者癌症样品)进行基因表达谱测定、PCR(如rtPCR)、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术或FISH；和b)确定样品中生物标记物的存在和/或表达水平/含量。在一些实施方案中，微阵列方法包括使用微阵列芯片，所述芯片具有可以在严格条件下与编码上述基因的核酸分子杂交的一种或多种核酸分子或具有可以结合上述基因编码的一种或多种蛋白质的一种或多种多肽(如，肽或抗体)。在一个实施方案中，PCR方法是qRT-PCR。在一个实施方案中，PCR方法是多重-PCR。在一些实施方案中，通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中，通过qRT-PCR测量基因表达。在一些实施方案中，通过多重-PCR测量表达。
用于评价细胞中的mRNA的方法是公知的，并且包括，例如，使用互补DNA探针的杂交试验(如使用标记的一种或多种基因特异性的核探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增试验(如，使用一种或多种基因特异性的互补引物的RT-PCR，和其他扩增类型检测方法，如，例如，分支DNA、SISBA、TMA等)。
可以使用Northern、点印迹或PCR分析，方便地测试来自哺乳动物样品中的mRNA。此外，这样的方法可以包括一个或多个允许测定生物样品中目标mRNA水平的步骤(例如，通过同时检查“管家”基因的比较对照mRNA序列的水平，所述管家基因如肌动蛋白家族成员)。任选，可以测定扩增的目标cDNA的序列。
本发明的任选方法包括通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样品中mRNA(如，目标mRNA)的实验方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录，并且标记，以产生cDNA探针。然后将探针与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。阵列进行构造，使得阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，将其表达与抗血管生成治疗提高或降低的临床益处相关的基因的选择排列在固体支持物上。标记的探针与特定的阵列成员的杂交表示从其衍生探针的样品表达该基因。
根据一些实施方案，通过观察上述基因的蛋白质表达水平来测量存在和/或表达水平/含量。在特定的实施方案中，该方法包括在允许生物标记物结合并检测抗体和生物标记物之间形成的复合物的条件下，将生物样品接触本文中所述的生物标记物的抗体(例如，抗-R-spondin易位抗体)。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗体用于选择适合使用wnt途径拮抗剂治疗的患者，特别是R-spondin-易位拮抗剂，例如，用于个体选择的生物标记物。
在特定的实施方案中，使用IHC和染色实验方案检查样品中生物标记物蛋白的存在和/或表达水平/含量。组织切片的IHC染色已经显示出是测定或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。在一个方面中，使用包括以下步骤的方法测定了生物标记物的表达水平：(a)使用抗体进行样品(如，患者癌症样品)的IHC分析；和b)测定样品中生物标记物的表达水平。在一些实施方案中，测定相对于参照值的IHC染色强度。
可以结合其他技术，如形态学染色和/或荧光原位杂交，来进行IHC。两种IHC的一般方法是可利用的；直接和间接试验。根据第一种试验，直接测定抗体与目标抗原的结合。这种直接试验使用标记的试剂，如荧光标记物或酶-标记的一抗，其可以观察到，而不需要进一步抗体相互作用。在典型的间接试验中，未缀合的一抗结合抗原，然后标记的二抗结合一抗。在二抗缀合酶标记的情况中，加入发色或荧光底物，以提供抗原的观察。因为几种二抗可能与一抗上不同的表位反应，发生了信号放大。通常将用可检测部分标记用于IHC的一抗和/或二抗。可利用各种标记，其通常分组成以下几类：(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I；(b)胶体金颗粒；(c)荧光标记，包括，但不限于，稀土螯合物(铕螯合物)、Texas红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺(Lissamine)、伞形酮、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻蓝蛋白或商购可得的荧光团，例如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述一种或多种的衍生物；(d)可利用各种酶-底物标记，并且美国专利No.4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶标记物的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶，如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
酶-底物组合的实例包括，例如，辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的过氧化氢酶；碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯基磷酸酯；以及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如4-甲基umbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶)。对于这些的一般概述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
可以将如此制备的标本封固并盖上盖玻片。然后确定载玻片评价，例如，利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。在一些实施方案中，约1+或更高的染色模式评分是诊断和/或预后的。在特定的实施方案中，IHC试验中约2+或更高的染色模式评分是诊断和/或预后的。在其他实施方案中，约3或更高的染色模式评分是诊断和/或预后的。在一个实施方案中，理解使用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/或组织时，通常在肿瘤细胞和/或组织中测定或评价染色(与样品中存在的基质或周围组织相对比)。
在替代方法中，可以在足以使抗体-生物标记物复合物形成的条件下使样品接触所述生物标记物特异性的抗体，然后检测所述复合物。可以以多种方式来检测生物标记物的存在，如通过Western印迹和ELISA程序，其用于测定多种组织和样品，包括血浆或血清。可利用多种使用这样测定法的免疫试验技术，参见，例如，美国专利No.4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹层”试验，以及传统的竞争性结合试验。这些试验还包括标记的抗体对靶生物标记物的直接结合。
还可以通过功能性的或基于活性的试验来检查组织或细胞样品中选定生物标记物的存在和/或表达水平/含量。例如，如果生物标记物是酶，可以进行本领域已知的试验来测定或检测组织或细胞样品中给定的酶的活性的存在。
在特定的实施方案中，将样品针对测试的生物标记物的含量的差异和所用样品质量的可变性进行标准化，并且运行试验之间的可变性。可以通过检测并结合特定标准化生物标记物(包括公知的管家基因，如ACTB)的表达来完成这样的标准化。或者，标准化可以基于所有试验的基因或其大的亚组的平均或中值信号(整体标准化方法)。基于基因与基因(gene-by-gene)，将测量的标准化的患者肿瘤mRNA或蛋白质的含量与参照组中发现的含量相比。可以将针对每名患者测试的每个肿瘤的每种mRNA或蛋白质的标准化表达水平表示为参照组中测量的表达水平的百分比。待分析的特定患者样品中测量的存在和/或表达水平/含量将落在该范围内的一些百分位数上，这可以通过本领域公知的方法来确定。
在特定的实施方案中，如下测定基因的相对表达水平：
相对表达基因1样品1＝2exp(Ct管家基因-Ct基因1)，其中测定样品中的Ct。
相对表达基因1参照RNA＝2exp(Ct管家基因-Ct基因1)，其中测定参照样品中的Ct。
标准化相对表达基因1样品1＝(相对表达基因1样品1/相对表达基因1参照RNA)x100
Ct为循环阈值。Ct为反应内生成的荧光穿过阈值线时的循环数。
将所有实验相对于参照RNA标准化，参照RNA是来自多种组织来源的RNA的综合混合物(例如来自Clontech，Mountain View，CA的参照RNA#636538)。在每次qRT-PCR运行中包括相同的参考RNA，容许在不同实验运行之间比较结果。
在一个实施方案中，样品是临床样品。在另一个实施方案中，样品用于诊断试验中。在一些实施方案中，样品获自原发性或转移性肿瘤。组织活检常常用于获得肿瘤组织的代表性切块。或者，可以以已知或认为含有目标肿瘤细胞的组织或流体的形式间接获得肿瘤细胞。例如，可以通过切除、支气管镜检查、细针抽吸、支气管刷检，获得肺癌损伤的样品，或来自痰液、胸膜液或血液。可以从癌症或肿瘤组织或从其他身体样品，如尿液、痰液、血清或血浆，检测基因或基因产物。以上针对癌性样品中目标基因或基因产物的检测所讨论的相同技术可以应用于其他身体样品。癌细胞可以从癌症损伤脱落并出现在这样的身体样品中。通过筛选这样的身体样品，可以获得针对这些癌症的简单的早期诊断。此外，可以通过针对目标基因或基因产物测试这样的身体样品，来更容易地监控治疗的进展。
在特定的实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是在不同于获得测试样品时的一个或多个时间点获得的来自相同患者或个体的单一样品或组合的多重样品。例如，在比获得测试样品时更早的时间点从相同患者或个体获得参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织。如果在癌症的初始诊断过程中获得了参照样品，而在癌症变成转移性之后获得了测试样品，这样的参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是有用的。
在特定的实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是患者或个体的一个或多个健康个体的组合多重样品。在特定的实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是患者或个体的患有疾病或失调(例如，癌症)的一个或多个个体的组合多重样品。在特定的实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是患者或个体的一个或多个个体的正常组织的集合RNA样品或集合血浆或血清样品。在特定的实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是患者或个体的患有疾病或失调(例如，癌症)的一个或多个个体的来自肿瘤组织的集合RNA样品或集合血浆或血清样品。
在任一种方法的一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4拮抗剂)。在任一种方法的一些实施方案中，R-spondin拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，并且抗体片段结合wnt途径多肽，特别是R-spondin拮抗剂和/或R-spondin移位融合多肽。
在任一种方法的一些实施方案中，根据以上任一个实施方案的个体可以是人。
在任一种方法的一些实施方案中，该方法包括将有效量的wnt途径拮抗剂(特别是R-spondin-移位拮抗剂)给药于患有这类癌症的个体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括将有效量的如下所述的至少一种其他治疗剂给药于个体。在一些实施方案中，个体可以是人。
本文中所述的wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂，在治疗中可以单独使用或结合其他药剂。例如，本文中所述的wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂，可以与至少一种包括其他wnt途径拮抗剂的其他治疗剂共同给药。在特定的实施方案中，其他治疗剂是化疗剂。
以上所述的这类联合治疗包括联合给药(其中将两种或多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开给药，在这种情况下，wnt途径拮抗剂的给药，特别是R-spondin-移位拮抗剂，可以在其他治疗剂和/或佐剂给药之前、同时和/或之后进行。Wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂，也可以结合放疗使用。
可以通过任何合适的方式，包括胃肠外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，损伤内给药，来给药wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin-移位拮抗剂(例如，抗体、结合多肽和/或小分子)。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。可以通过任何合适的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，来进行给药，这部分取决于给药是否是简短的或长期的。本文中涵盖各种给药时间安排，包括但不限于在各种时间点的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。
本文中所述的wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin拮抗剂(例如，抗体、结合多肽和/或小分子)，可以以符合良好医疗实践的方式来配制、定量和给药。在这一内容中考虑的因素包括待治疗的特定疾病、待治疗的特定哺乳动物、个体的临床病症、疾病的诱因、药剂传送的部位、给药方法、给药时间表和开业医生已知的其他因素。Wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin拮抗剂，不是必需，但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾病的药剂一起配制。这样的其他药剂的有效量取决于制剂中存在的wnt途径拮抗剂(特别是R-spondin拮抗剂)的含量、疾病或治疗的类型和以上讨论的其他因素。这些通常以相同剂量来使用并且使用本文中所述的给药途径，或为本文中所述剂量的约1至99％，或以任何剂量并且通过根据经验/临床上确定合适的任何途径来给药。
对于疾病的预防或治疗，本文中所述的wnt途径拮抗剂(特别是R-spondin拮抗剂)(单独使用或结合一种或多种其他另外的治疗剂使用时)的合适剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、wnt途径拮抗剂(特别是R-spondin拮抗剂)是否是为了预防性或治疗性目的而给药的、之前的治疗、患者的临床史和对wnt途径拮抗剂的应答，以及主治医生的判断。将Wnt途径拮抗剂，特别是R-spondin拮抗剂，一次性地或在连续治疗中合适地给药于个体，这取决于以上所述的因素。对于在几天或更长时间内的重复给药，根据病症，治疗通常将持续，直至发生了期望的疾病症状的抑制。这样的剂量可以间歇地给药，例如，每周或每三周(例如，使得个体接受约两剂至约二十剂，或例如，约六剂的wnt途径拮抗剂)。可以给药初始较高的负荷剂量，接着一个或多个较低的剂量。示例性给药方案包括施用。然而，其他剂量方案也是有用的。通过常规技术和试验可以容易地盐控这种治疗的进展。
将理解可以使用本发明的免疫缀合物替代wnt途径拮抗剂或除了wnt途径拮抗剂以外使用本发明的免疫缀合物来进行以上任一种制剂或治疗方法，所述wnt途径拮抗剂特别是R-spondin拮抗剂。
III.治疗组合物
本文中提供了用于本文中所述的方法中的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子和/或多核苷酸。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是标准wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是非标准wnt途径拮抗剂。
在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂是R-spondin-移位拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制LPR6介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和LRP6的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制LGR5介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制R-spondin和LGR5的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制KRM介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和KRM的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和syndecan(例如，syndecan 4)的相互作用。R-spondin拮抗剂的实例包括，但不限于，WO2008/046649、WO2008/020942、WO2007/013666、WO2005/040418、WO2009/005809、US8,088,374、US7,541,431、WO2011/076932和/或US2009/0074782中所述的那些，在此将其全部按引用并入。
Wnt信号传输途径组分或wnt途径多肽是转换源自Wnt蛋白和Fz受体之间的相互作用的信号的组分。因为wnt信号传输途径是复杂的，并且涉及强烈的反馈调节。Wnt信号传输途径组分的实例包括Wnt(例如，WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16)、Frizzed(例如，Frz1-10)、RSPO(例如，RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)、LGR(例如，LGR5)、WTX、WISP(例如，WISP1、WISP2和/或WISP3)、βTrCp、STRA6、膜相关蛋白LRP(例如，LRP5和/或LRP6)、Axin和Dishevelled、胞外Wnt相互作用蛋白sFRP、WIF-1、LRP灭活蛋白Dkk和Krn、细胞质蛋白β-catenin、β-catenin“降解复合物”的成员APC、GSK3β、CKIα和PP2A、核转运蛋白APC、pygopus和bc19/legless和转录因子TCF/LEF、Groucho和各种组蛋白乙酰化酶，如CBP/p300和Brg-1.
A.抗体
在一个方面中，本文中提供了分离的结合wnt途径多肽的抗体。在以上任一个实施方案中，抗体是人源化的。在本发明进一步的方面中，根据以上任一个实施方案的抗-wnt途径抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，如本文中限定的完整IgG1”抗体或其他抗体类或同种型。
在任一种抗体的一些实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗-LRP6抗体。抗-LRP6抗体的实例包括，但不限于，美国专利申请No.2011/0256127中描述的抗-LRP6抗体，将其全部按引用并入。在一些实施方案中，抗-LRP6抗体抑制由第一种Wnt同种型诱导的信号传输，并且加强了由第二种Wnt同种型诱导的信号传输。在一些实施方案中，第一种Wnt同种型选自Wnt 1、2、2b、4、6、7a、8a、9a、9b、10a和10b。在一些实施方案中，第一种Wnt同种型选自Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b和10b，并且第二种Wnt同种型选自Wnt3和Wnt3a。
在任一种抗体的一些实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗-Frizzled抗体。抗-Frizzled抗体的实例包括，但不限于，美国专利No.7,947,277中描述的抗-Frizzled抗体，将其全部按引用并入。
在任一种抗体的一些实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗-STRA6抗体。抗-STRA6抗体的实例包括，但不限于，美国专利No.7,173,115、7,741,439和/或7,855,278中描述的抗-STRA6抗体，将其全部按引用并入。
在任一种抗体的一些实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗-S100-样细胞因子多肽抗体。在一些实施方案中，抗-S100-样细胞因子多肽抗体是抗-S100-A14抗体。抗-S100-样细胞因子多肽抗体的实例包括，但不限于，美国专利No.7,566,536和/或7,005,499中描述的抗-S100-样细胞因子多肽，将其全部按引用并入。
在任一种抗体的一些实施方案中，抗-wnt途径抗体是抗-R-spondin抗体。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO1。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO2。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO3。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO4。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制LPR6介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和LPR6的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制LGR5介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和LGR5的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制LGR4介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和LGR4的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制ZNRF3和/或RNF43介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和ZNRF3和/或RNF43的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制KRM介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和KRM的相互作用。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制syndecan(例如，syndecan 4)介导的wnt信号传输。在一些实施方案中，R-spondin拮抗剂抑制和/或阻断R-spondin和syndecan(例如，syndecan 4)的相互作用。R-spondin抗体的实例包括，但不限于，US2009/0074782、US8088374、US8,158,757、US8,1587,58和/或US Biological R9417-50C中公开的任一种抗体，将其全部按引用并入。
在一些实施方案中，抗-R-spondin抗体结合R-spondin-移位融合多肽。在一些实施方案中，结合R-spondin-移位融合多肽的抗体特异性地结合R-spondin-移位融合多肽，但基本上没有结合野生型R-spondin和/或第二种移位基因。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO 1-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO2-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO3-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO4-移位融合多肽。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。
在进一步的方面中，根据以上任一个实施方案的抗-wnt途径抗体，特别是，抗-R-spondin-移位抗体，可以单独或组合地结合任一种特征，如以下部分中所述的：
1.抗体亲和性
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，按照以下试验所述的，通过放射性标记的抗原结合试验(RIA)来测量Kd，使用目标抗体的Fab形式及其抗原来进行。在滴定系列的未标记抗原的存在下，通过用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体覆盖的平板捕获结合的抗原，从而测量Fab对抗原的溶液结合亲和性(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立用于试验的条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)，将多孔平板(Thermo Scientific)覆盖过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭两小时至五小时。在非吸附剂平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目标Fab混合(例如，与Presta等，CancerRes.57：4593-4599(1997)中的抗VEGF-抗体，Fab-12的评价一致)。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长的时间段(例如，约65小时)，以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板，用于在室温下孵育(例如，约一小时)。然后除去溶液，并且用PBS中的0.1％聚山梨酸酯20将平板洗涤八次。平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择产生低于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合试验中。
根据另一个实施方案，使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，在25℃，使用～10应答单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，使用表面等离子体共振试验来测量Kd。简而言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。用10mM醋酸钠，pH4.8，将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得大约10应答单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺，以阻断未反应的基团。为了动力学测量，在25℃以大约25μl/min的流速，注入在含有0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用单纯一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software，版本3.2)来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。按照koff/kon的比例来计算平衡解离常数(Kd)。参见，Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过以上的表面等离子体共振试验的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过荧光淬灭技术来测定结合速率，所述荧光淬灭技术在递增浓度的抗原的存在下，在25℃下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的提高或降低(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在分光光度计中测量的，如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)，使用搅拌比色杯。
2.抗体片段
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药物学)中，vol.113，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag，NewYork)，pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的可以为二价或双特异性的抗体。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。三抗和四抗也描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在特定的实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过各种技术来制得抗体片段，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的产生，如本文中所述的。
3.嵌合和人源化抗体
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。特定的嵌合抗体描述于，例如，美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或非人灵长类动物，如猴子的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中来自亲本抗体的类或亚类已经改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在特定的实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化，以降低对人的致免疫性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，从其产生HVR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和性。
人源化抗体及其制备方法综述于，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，并且进一步描述于，例如，Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重修(resurfacing)”；Dall’Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR改组”)和Osbourn等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述FR改组的“定向选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等，J.Immunol.151：2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体总地描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
可以通过将免疫原给予已经改变以应答抗原挑战产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体。这样的动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替代内源性的免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还可以参见，例如，描述XENOMOOUSETM技术的美国专利No.6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利5,770,429；描述K-M技术的美国专利7,041,870和描述技术的美国专利申请公开No.US2007/0061900。例如，通过组合不同的人恒定区，可以进一步修饰通过这样的动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制得人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；和Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991))。经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。其他方法包括例如美国专利No.7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findingsin Experimental and Clincal Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库分泌的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这样的可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。以下描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过为了具有所需的一种或多种活性的抗体而筛选组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知各种用于产生噬菌体展示文库并为了具有所需结合特征的抗体筛选这样的文库的方法。这样的方法综述于，例如，Hoogenboom等，METHODS IN MOL.BIOL.178：1-37(O’Brien等编辑，Human Press，Totowa，NJ，2001)，并且进一步描述于例如McCafferty等，Nature 348：552-554；Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，METHODS IN MOL.BIOL.248：161-175(Lo编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在特定的噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因库，并且在噬菌体文库中随机重新组合，然后针对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述的。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自免疫来源的文库提供了免疫原的高亲和性抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如从人)克隆天然库，以提供针对多种非自体以及自体抗原的单一抗体源，而没有任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)中所述的。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段，并且使用含有PCR引物的随机序列来编码高可变性的CDR3区并且在体外完成重排，从而合成制得天然文库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)中所述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如，美国专利No.5,750,373和美国专利公开No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对于至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在特定的实施方案中，结合特异性之一是针对wnt途径多肽的，如R-spondin-移位融合多肽，而另一个针对任何其他抗原。在特定的实施方案中，双特异性抗体可以结合wnt途径多肽如R-spondin-移位融合多肽的两个不同表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达wnt途径多肽如R-spondin-移位融合多肽的细胞。可以作为全长抗体或抗体片段来制备双特异性抗体。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))和“钮孔(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利No.5,731,168)。还可以通过工程化用于制备抗体Fc-杂二聚分子的静电牵引作用来制得多特异性抗体(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，美国专利No.4,676,980，和Brennan等，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗”技术(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994))；和制备三特异性抗体，按照例如Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)中所述的。
本文中还包括具有三个或多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“Octopus抗体”(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合wnt途径多肽(如，R-spondin-移位融合多肽)以及另一个不同抗原的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
a)糖基化变体
在特定的实施方案中，改变本文中提供的抗体，以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得形成或去除一个或多个糖基化位点，因而方便地完成添加或删除抗体的糖基化位点。
在抗体包含Fc区抗体的情况中，可以改变与其连接的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、二天线型寡糖，其通常通过N-连接连接Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接二天线型寡糖结构的“茎干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以为了形成具有特定的提高的特性的抗体变体，形成本发明的抗体中的寡糖的改变。
在一个实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接)连接Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这样的抗体中的岩藻糖含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。可以例如，如WO 2008/077546中所述的，通过MALDI-TOF质谱测量，相对于连接Asn297的全部糖结构的总和(例如，复合物、杂合体和高甘露糖结构)，计算Asn297处的糖链内的岩藻糖平均含量，来确定岩藻糖的含量。Asn297是指位于Fc区中的大约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中较小的序列改变，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的大约±3个氨基酸，即，位置294至300。这样的岩藻糖化变体具有提高的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖化”或“缺乏岩藻糖”抗体变体的公开实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生脱岩藻糖化抗体的细胞系实例包括蛋白岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)和WO2003/085107)。
进一步提供了具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中通过GlcNAc将连接抗体Fc区的二天线型寡糖二等分。这样的抗体变体具有降低的岩藻糖化和/或提高的ADCC功能。这样的抗体变体的实例描述于，例如，WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)和US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在连接Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有提高的CDC功能。这样的抗体变体描述于，例如，WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)。
b)Fc区变体
在特定的实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在特定的实施方案中，本发明涵盖具有一些但非全部效应物功能的抗体变体，这使其成为用于其中抗体在体内的半衰期是重要的但特定的效应物功能(如补体和ADCC)是不需要的或有害应用的理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒隆试验，来证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合试验，来确保抗体缺乏FcγR结合(因此，很可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中。评价目标分子的ADCC活性的体外试验的非限制性实例描述于美国专利No,5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)，5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以使用非放射性试验方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性试验(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和非放射性细胞毒性试验(Promega，Madison，WI)。用于这样的试验的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PNMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替换地或另外地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，如Clynes等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的。还可以进行C1q结合试验来证实抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC试验(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova，S.B.等，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应物功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(美国专利No.6,737,056)。这样的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的称为“DANA”的Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有提高的或降低的与FcR结合的特定抗体变体(参见，例如，美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。在特定的实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334的置换(残基的EU编号)。在一些实施方案中，在Fc区形成了导致改变的(即，提高的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如美国专利No.6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述的。
具有提高的半衰期和提高的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994)))结合的抗体，描述于US2005/0014934A1中(Hinton等)。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，其中其提高了Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个具有置换的那些，例如，Fc区残基434的置换(美国专利No.7,371,826)。关于Fc区变体的其他例子，还可以参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和WO 94/29351。
c)半胱氨酸工程化抗体变体
在特定的实施方案中，希望形成半胱氨酸工程化抗体，例如，“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在特定的实施方案中，置换的残基发生在抗体的易接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此将反应性硫醇基团放置在抗体的易接近位点，并且可以用于将抗体与其他部分偶联，如药物部分或连接物-药物部分，以形成免疫缀合物，如本文中进一步所述的。在特定的实施方案中，以下残基的任何一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照，例如，美国专利No.7,521,541中所述的，来产生半胱氨酸工程化抗体。
B.免疫缀合物
本文中进一步提供了包含本文中的抗-wnt途径抗体(如，R-spondin-移位融合多肽)与一或多种细胞毒性剂，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(参见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀(monomethylauristatin)药物结构部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；和Lode等，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)，如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见Kratz等，CurrentMed.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；和美国专利No.6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)和奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(tricothecene)；和CC 1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与酶活性毒素或其片段缀合，酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如Tc99或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，如还是碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以按照Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述的来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。连接物可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解连接物”。例如，可使用酸不稳定连接物、肽酶敏感性连接物、光不稳定连接物、二甲基连接物或含二硫化物的连接物(Chari等，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
C.结合多肽
本文中提供了用作本文中所述任一种方法中的wnt途径拮抗剂的wnt途径结合多肽拮抗剂。Wnt途径结合多肽拮抗剂是结合(优选特异性地结合)wnt途径多肽的多肽。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂是嵌合多肽。在一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂包括(a)Frizzled结构域组成部分，和(b)Fc结构域。例如，美国专利No.7,947,277中描述的任一种wnt途径拮抗剂，将其全部按引用并入。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂是特异性结合Dvl PDZ的多肽，其中所述多肽包括C-端区，其包括在位置-2具有Gly，位置-1具有Trp或Tyr，位置0具有Phe或Leu和位置-3具有疏水性或芳香族残基的序列，其中氨基酸编号是基于位置0的C-端残基。在一些实施方案中，位置-6是Trp。在一些实施方案中，位置-1是Trp。在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂是以IC50＝1.5uM或更高的结合亲和力特异性结合Dvl PDZ的多肽。在一些实施方案中，多肽抑制Dvl PDZ与其内源性结合配偶体的相互作用。在一些实施方案中，多肽抑制内源性Dvl-介导的Wnt信号传输。在一些实施方案中，多肽包括由KWYGWL(SEQ ID NO：80)组成的C-端。在一些实施方案中，多肽包括氨基酸序列X1-X2-W-X3-D-X4-P，并且其中X1是L或V，X2是L，X3是S或T，并且X4是I、F或L。在一些实施方案中，多肽包括氨基酸序列GEIVLWSDIPG(SEQ ID NO：81)。在一些实施方案中，多肽是美国专利No.7,977,064和/或7,695,928中所述的任一种多肽，将其全部按引用并入。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，结合多肽结合WISP。在一些实施方案中，WISP是WISP1、WISP2和/或WISP3。在一些实施方案中，多肽是美国专利No.6,387,657、7,455,834、7,732,567、7,687,460和/或7,101,850和/或美国专利申请No.2006/0292150中所述的任一种多肽，将其全部按引用并入。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，结合多肽结合S100-样细胞因子多肽。在一些实施方案中，S100-样细胞因子多肽是S100-A14多肽。在一些实施方案中，多肽是美国专利No.7,566,536和/或7,005,499中所述的任一种多肽，将其全部按引用并入。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂是特异性结合STRA6的多肽。在一些实施方案中，多肽是美国专利No.7,173,115、7,741,439和/或7,855,278中所述的任一种多肽，将其全部按引用并入。
在任一种wnt途径结合多肽拮抗剂的一些实施方案中，结合多肽结合R-spondin多肽。在一些实施方案中，R-spondin多肽是RSPO1多肽。在一些实施方案中，R-spondin多肽是RSPO2多肽。在一些实施方案中，R-spondin多肽是RSPO3多肽。在一些实施方案中，R-spondin多肽是RSPO4多肽。
在任一种结合多肽的一些实施方案中，wnt途径结合多肽拮抗剂结合R-spondin-移位融合多肽。在一些实施方案中，结合多肽特异性地结合R-spondin-移位融合多肽，但基本上不结合野生型R-spondin和/或第二种移位的基因。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO1-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO2-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO3-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO4-移位融合多肽。在一些实施方案中，RSPO2移位包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3移位融合多肽包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。
可以使用已知多肽合成方法化学合成结合多肽，或可以使用重组技术制备和纯化。结合多肽通常至少约5个氨基酸长，或者，至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸长或更多，其中这样的结合多肽能够结合(优选特异性地结合)靶标，wnt途径多肽，如本文中所述的。可以使用公知的技术鉴定结合多肽，而不需要过度的实验。在这点上，注意到用于筛选能够特异性结合多肽靶标的结合多肽的多肽文库的技术是本领域公知的(参见，例如，美国专利No.5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公开No.WO84/03506he WO84/03564；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3998-4002(1984)；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：178-182(1985)；Geysen等，in Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen等，J.Immunol.Meth.102：259-274(1987)；Schoofs等，J.Immunol.140：611-616(1988)；Cwirla，S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6378；Lowman，H.B.等，(1991)Biochemistry 30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature 352：624；Marks，J.D.等(1991)，J.Mol.Biol.222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8363；Smith，G.P.，(1991)，Current Opin.Biotechnol.2：668)。
在这点上，噬菌体(bacteriophage)(噬菌体(phage))展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott，J.K.和Smith，G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla，S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等，(1991)Biochemistry 30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature 352：624；Marks，J.D.等，(1991)J.MoI.Biol.222：581；Kang，A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些多肽或寡肽(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2：668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩充大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利5,223,409，5,403,484，5,571,689和5,663,143。
尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，λ类(lambdoid)噬菌体展示系统(WO95/34683；US5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等，Gene 215：439(1998)；Zhu等，CancerResearch58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等，Infection&Immunity65(11)：4770-4777(1997)；Ren等，Gene195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.5：1833(1996)；Efimov等，Virus Genes10：173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott，Methods in Enzymology 217：228-257(1993)；US5,766,905)也是已知的。
现在已经对基础噬菌体展示概念开发了很多其它改进和变通。这些改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO98/20169；WO98/20159)和受约束(constrained)螺旋肽的特性(WO98/20036)。WO97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合靶分子。WO97/46251描述了这样一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的使用(Li等，(1998)Mol.Biotech.9：187)。WO97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体展示库的组合文库。WO97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5,498,538，5,432,018和WO98/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它方法。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利No.5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908,5、498,530,5、770,434,5、734,018,5、698,426,5、763,192，和5,723,323。
D.结合小分子
本文中提供了用作本文中所述任一种方法中的wnt途径拮抗剂的wnt途径小分子拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是标准wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是非标准wnt途径拮抗剂。
在任一种小分子的一些实施方案中，wnt途径小分子拮抗剂是R-spondin小分子拮抗剂(例如，RSPO1、2、3和/或4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，R-spondin小分子拮抗剂是RSPO 1-移位小分子拮抗剂。在一些实施方案中，R-spondin小分子拮抗剂是RSPO2-移位小分子拮抗剂。R-spondin小分子拮抗剂是RSPO3-移位小分子拮抗剂。R-spondin小分子拮抗剂是RSPO4-移位小分子拮抗剂。
在任一种小分子的一些实施方案中，小分子结合R-spondin-移位融合多肽。在一些实施方案中，小分子特异性地结合R-spondin-移位融合多肽，但基本上不结合野生型R-spondin和/或第二种移位的基因。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO1-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO2-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO3-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO4-移位融合多肽。在一些实施方案中，RSPO2移位包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易-位融合多肽包括SEQ ID NO：72和/或SEQID NO：73。
小分子优选是如本文中限定的结合多肽或抗体以外的，结合(优选特异性地结合)本文中所述的wnt途径多肽的有机分子。可以使用已知方法(参见，例如，PCT公开No.WO00/00823和WO00/39585)鉴定和化学合成有机小分子。有机小分子通常低于约2000道尔顿大小，或者，低于约1500，750，500，250或200道尔顿大小，其中可以使用公知技术，鉴定这样的能够结合(优选特异性地结合)如本文中所述的多肽的有机小分子，而不需要过度的实验。在这点上，注意到用于对有机分子文库筛选能够结合多肽靶标的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开No.WO00/00823和WO00/39585)。有机小分子可以是，例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(aryl sulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkyl sulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acid chloride)等。
E.拮抗剂多核苷酸
本文中提供了用作本文中所述的任一种方法中的wnt途径拮抗剂的wnt途径多核苷酸拮抗剂。多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包括与wnt途径基因的RNA转录产物的至少一部分互补的序列。然而，尽管优选，但不需要绝对互补。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是标准wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是非标准wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径多肽是R-spondin。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO1。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO2。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO3。在一些实施方案中，R-spondin是RSPO4。多核苷酸拮抗剂的实例包括WO2005/040418中所述的那些，如TCCCATTTGCAAGGGTTGT(SEQ ID NO：82)和/或AGCTGACTGTGATACCTGT(SEQ ID NO：83)。
在任一种多核苷酸的一些实施方案中，多核苷酸结合R-spondin-移位融合多肽。在一些实施方案中，多核苷酸特异性结合R-spondin-移位融合多肽，但基本上不结合野生型R-spondin和/或第二种移位的基因。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO1-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO2-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO3-移位融合多肽。在一些实施方案中，R-spondin-移位融合多肽是RSPO4-移位融合多肽。在一些实施方案中，RSPO2移位包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2-移位融合多肽包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3-移位融合多肽包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易-位融合多肽包括SEQ ID NO：72和/或SEQID NO：73。
本文中涉及的“与RNA的至少一部分互补的”序列表示具有足够的互补性能够与RNA杂交，形成稳定双链体的序列；在双链wnt途径反义核酸的情况中，因此可以测试双链DNA的单链，或可以分析三链体形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度。通常，杂交核酸越大，wnt途径RNA可能含有的碱基错配越多，并且将形成稳定的双链体(或作为可能的情况，三链体)。本领域技术人员可以通过使用标准程序，测定杂交的复合物的熔点，从而确定可容忍的错配程度。
与信使5’端互补的多核苷酸，例如，5’未翻译序列直至并且包括AUG启动密码子，应当在抑制翻译中是最有效的。然而，与3’未翻译的mRNA序列互补的序列已经显示出在抑制mRNA的翻译中也是有效的。通常，参见，Wagner，R.，1994，Nature372：333-335。因此，与wnt途径基因的5’-或3’-未翻译的、非编码区互补的寡核苷酸，可以用于反义方法中，来抑制内源性wnt途径mRNA的翻译。与mRNA的5’未翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的补充。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是不太有效的翻译抑制剂，但根据本发明可以使用。不管是否设计成与wnt途径mRNA的5’-、3’-或编码区杂交，反义核酸应当为至少六个核苷酸长，并且优选为6至约50个核苷酸长的寡核苷酸。在特定的方面中，寡核苷酸为至少10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，通过从内源性序列转录，在胞内产生本发明的wnt途径反义核酸。例如，转录载体或其一部分，产生wnt途径基因的反义核酸(RNA)。这样的载体将含有编码wnt途径反义核酸的序列。这样的载体可以保留游离基因或变成染色体整合的，只要其可以转录产生所需的反义RNA。可以通过本领域标准的重组DNA技术方法来构建这样的载体。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其他的，用于在脊椎动物细胞中的复制和表达。可以通过本领域已知的在脊椎动物(优选，人细胞)中起作用的任何启动子来驱动编码wnt途径的序列或其片段的表达。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。这样的启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，Nature 29：304-310(1981))，劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中包含的启动子(Yamamoto等，Cell 22：787-797(1980))、疱疹胸苷启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，Nature 196：39-42(1982))等。
F.抗体和结合多肽变体
在特定的实施方案中，考虑了本文中提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，希望提高抗体和/或结合多肽的结合亲和性和/或其他生物特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成，来制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内残基的删除，和/或插入和/或置换。可以进行删除、插入和置换的任意组合，以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特征，例如，靶标结合。
在特定的实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体和/或结合多肽。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。保守性置换显示于表1的标题“保守性置换”下。更多实质性变化提供于表1的标题“示例性置换”下，并且如以下参照氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸置换可以引入感兴趣的抗体和/或结合多肽中，并且针对所需活性来筛选产物，所需活性例如为保留的/提高的抗原结合、降低的免疫原性，或提高的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换需要将这些类别中的一个的成员替换为另一个类别的。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，为了进一步研究选择的所得到的变体相对于亲本抗体将在特定的生物特性(例如，提高的亲和性、降低的致免疫性)中具有变化(例如，提高)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的特定生物特性。示例性置换变体是亲和性成熟抗体，其可以是方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和性成熟技术，如本文中描述的那些。简而言之，一个或多个HVR残基突变，变体抗体展示在噬菌体上，并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和性)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以提高抗体亲和性。这样的改变可以在HVR“热点”中进行，热点即由体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或在SDR(a-CDR)中进行，并针对结合亲和性测试所得到的变体VH或VL。通过构建并且从第二个文库重新选择的亲和性成熟已经描述于例如(Hoogenboom等，METHODS IN MOL.BIOL.178：1-37(O’Brien等编辑，HumanPress，Totowa，NJ，(2001))。在亲和性成熟的一些实施方案中，将多样性引入选择用于通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种进行成熟的可变基因中。然后形成第二个文库。然后筛选文库，以鉴定具有所需亲和性的抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。涉及抗原结合的HVR残基可以特异性地鉴定，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在特定的实施方案中，置换、插入或删除可以发生在一个或多个HVR中，只要这样的改变没有实质性地降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上没有降低结合亲和性的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这样的改变可以在HVR“热点”或SDR外。在以上提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以靶向诱变的抗体和/或结合多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085中所述的。在这种方法中，鉴定靶标残基的一个残基或组(例如，带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)并且由中性或负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。在氨基酸位置引入了更多置换，证明对初始置换的功能敏感性。或者或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以作为置换的候选物，靶向或消除这样的接触残基和邻接的残基。可以筛选变体，以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有上百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-端融合子，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶的融合子(例如，ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
G.抗体和结合多肽衍生物
在特定的实施方案中，进一步修饰本文中提供的抗体和/或结合多肽，以含有本领域已知的且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体和/或结合多肽衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁茂烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(同型聚合物或随机共聚物)，以及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同型聚合物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇，及其混合物。由于在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支链或直链的。连接抗体和/或结合多肽的聚合物数量可以改变，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来决定，所述考虑包括，但不限于，待提高的抗体的特定特性或功能、抗体和/或结合多肽衍生物是否将用于限定条件下的治疗中等等。
在另一个实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射选择性加热的抗体和/或结合多肽与非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括，但不限于，没有伤害正常细胞的波长，但其将非蛋白质部分加热至杀灭抗体和/或结合多肽-非蛋白质部分最接近的细胞的温度。
H.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物生产抗体和/或结合多肽，例如，如美国专利No.4,816,567中所述。在一个实施方案中，分离的核酸编码抗-wnt途径抗体。这样的核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了一个或多个包含这样的编码抗体和/或结合多肽的核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下物质转染)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一个载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二个载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗抗体(如，抗-wnt途径抗体)和/或结合多肽的方法，其中该方法包括在适于抗体表达的条件下，培养如上提供的包含编码抗体和/或结合多肽的核酸的宿主细胞，并且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)收集抗体。
为了抗体(如，抗-wnt途径抗体和/或结合多肽)的重组生产，分离例如如上所述的编码抗体和/或结合多肽的核酸，并且插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离这样的核酸并且测序。
用于载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生产抗体，特别是不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还可以参见，Charlton，METHODS IN MOL.BIOL.，Vol.248(B.K.C.Lo编辑，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以以可溶性片段从细菌细胞糊状物中分离出抗体，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化通路已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致具有部分或完全人糖基化模式的抗体的产生。参见，Gemgross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于糖基化抗体和/或糖基化结合多肽表达的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株可以用于与昆虫细胞联合，特别是用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物可以用作宿主。参见，例如，美国专利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如例如Graham等，J.GenVirol.36：59(1997)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如，例如，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如，Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的特定哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，METHODS IN MOL.BIOL.，Vol.248(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。
尽管描述主要涉及通过培养用含有抗体-和结合多肽-编码核酸的载体转化或转染的细胞来生产抗体和/或结合多肽。当然，考虑了可替换的方法，其是本领域中公知的，可以用于制备抗体和/或结合多肽。例如，可以使用固相技术通过直接的肽合成来产生合适的氨基酸序列或其一部分[参见，例如，Steward等，Solid-Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)]。可以使用人工技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。例如，可以使用制造商的说明，使用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City，CA)，来完成自动化合成。可以分开地化学合成抗体和/或结合多肽的各个部分，并使用化学或酶方法结合，以产生所需的抗体和/或结合多肽。
IV.筛选和/或鉴定具有所需功能的Wnt途径拮抗剂的方法
以上已经描述了用于产生wnt途径拮抗剂(如，抗体、结合多肽和/或小分子)的技术。可以通过本领域已知的各种试验来鉴定、筛选本文中提供的其他wnt途径拮抗剂，如抗-wnt途径抗体、结合多肽、小分子和/或多核苷酸，或表征它们的物理/化学特性和/或生物活性。
本文中提供了筛选和/或鉴定抑制wnt途径信号、诱导癌细胞周期停止、抑制癌细胞增殖和/或促进癌细胞死亡的wnt途径拮抗剂的方法，所述方法包括：(a)将(i)癌细胞、癌组织和/或癌样品，其中癌细胞、癌组织和/或癌症包括一种或多种生物标记物，和(ii)参照癌细胞、参照癌组织和/或参照癌样品接触wnt途径候选拮抗剂，(b)测定wnt途径信号传输的水平、细胞周期阶段的分布、细胞增殖的水平和/或癌细胞死亡的水平，由此癌细胞、癌组织和/或癌样品(其中癌细胞、癌组织和/或癌症包括一种或多种生物标记物)与参照癌细胞、参照癌组织和/或参照癌样品之间降低的wnt途径信号传输水平、细胞周期阶段分布的差异、降低的细胞增殖水平和/或提高的癌细胞死亡水平将wnt途径候选拮抗剂鉴定为抑制wnt途径信号、诱导癌细胞周期停止、抑制癌细胞增殖和/或促进癌细胞死亡的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂。
本文中进一步提供了筛选和/或鉴定抑制wnt途径信号、诱导癌细胞周期停止、抑制癌细胞增殖和/或促进癌细胞死亡的wnt途径拮抗剂，所述方法包括(a)将癌细胞、癌组织和/或癌样品接触wnt途径候选拮抗剂，其中癌细胞、癌组织和/或癌症包括一种或多种生物标记物，(b)测定wnt途径信号的水平、细胞周期阶段的分布、细胞增殖的水平和/或癌细胞死亡的水平，并与wnt途径候选拮抗剂不存在情况下的癌细胞、癌组织和/或癌样品相比，由此wnt途径候选拮抗剂存在情况下的癌细胞、癌组织和/或癌样品与wnt途径候选拮抗剂不存在情况下的癌细胞、癌组织和/或癌样品之间降低的wnt途径信号水平、细胞周期阶段分布的差异、降低的细胞增殖水平和/或提高的癌细胞死亡水平将wnt途径候选拮抗剂鉴定为抑制wnt途径信号传输、诱导癌细胞周期停止、抑制癌细胞增殖和/或促进癌细胞死亡的wnt途径拮抗剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂。
在任一种方法的一些实施方案中，一种或多种生物标记物是表9中所列的一种或多种基因的易位(例如，重排和/或融合)。在任一种方法的一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO1易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2易位包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：12、41和/或42的引物可检测RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过EIF3E启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO2启动子来驱动。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：13、14、43和/或44的引物可检测RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过PTPRK启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO3启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK分泌信号序列(和/或不包括RSPO3分泌信号序列)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO4易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)导致升高的R-spondin表达水平(例如，与没有R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)以及KRAS和/或BRAF。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在以及变化KRAS和/或BRAF(例如，多形性或突变)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在，以及一种或多种生物标记物的不存在是变化(例如，多形性或突变)CTNNB1和/或APC的不存在。
测定wnt途径信号的方法是本领域已知的，并且描述于本文中的实施例中。在一些实施方案中，使用如实施例中所述的荧光素酶报告子试验来测定wnt途径信号传输的水平。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂通过将wnt途径信号的水平降低约10，20，30，40，50，60，70，80，90或100％来抑制wnt途径信号传输。
可以通过本领域已知的方法，例如，使用内源性表达wnt途径或用代表性基因转染后的细胞，来评价本文中所述的wnt途径拮抗剂的生长抑制作用。例如，可以用各种浓度的本文中所述的wnt途径拮抗剂处理合适的肿瘤细胞系和wnt途径多肽转染的细胞数天(例如，2-7天)，并且用结晶紫或MTT染色，或通过一些其他比色试验来分析。测量增殖的另一种方法将通过比较由存在或不存在本发明的抗体、结合多肽、小分子和/或多核苷酸的情况下细胞吸收的3H-胸腺嘧啶来进行。处理后，收集细胞并且在闪烁计数器中定量结合至DNA中的放射性含量。合适的阳性对照包括用已知抑制该细胞系生长的生长抑制抗体处理选定的细胞系。可以以本领域已知的各种方式来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。
测定细胞周期分布、细胞增殖的水平和/或细胞死亡的水平的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，癌细胞周期停止是G1停止。
在一些实施方案中，与未处理的癌细胞、癌组织或癌样品相比，wnt途径拮抗剂在体外或体内将癌细胞、癌组织或癌样品的癌细胞增殖抑制约25-100％，更优选地，约30-100％，甚至更优选约50-100％或约70-100％。例如，可以以细胞培养物中约0.5至约30μg/ml或约0.5nM至约200nM的wnt途径拮抗剂浓度来测量生长抑制，其中在肿瘤细胞暴露于wnt途径候选拮抗剂后1-10天测定生长抑制。如果给药约1μg/kg至约100mg/kg体重的wnt途径候选拮抗剂，在第一次给药wnt途径候选拮抗剂的约5天之3个月内，优选在约5天至30天内，导致肿瘤大小的减小或肿瘤细胞增殖的降低，则wnt途径拮抗剂在体内是生长抑制的。
为了选择诱导癌细胞死亡的wnt途径拮抗剂，可以相对于参照评价例如由碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD吸收所示的膜完整性的丢失。可以在补体和免疫效应细胞不存在的情况下进行PI吸收试验。用单独的培养基或含有合适的wnt途径拮抗剂的培养基孵育wnt途径-表达肿瘤细胞。将细胞孵育3-天时间段。每次处理后，将细胞洗涤并且等分至35mm滤网盖住的12×75试管(1ml/试管，3个试管/处理组)，用于除去细胞结块。然后试管接收PI(10μg/ml)。可以使用流式细胞计数器和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。那些如通过PI吸收测定的诱导统计学上显著的细胞死亡水平的wnt途径拮抗剂可以选择作为细胞死亡-诱导抗体、结合多肽、小分子和/或多核苷酸。
为了筛选结合由目标抗体结合的多肽上的表位或与目标抗体结合的多肽相互作用的wnt途径拮抗剂，可以进行常规的交叉阻断试验，如Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Harlow和DavidLane编辑，(1988)中所述的。该试验可以用于确定候选wnt途径拮抗剂是否与已知抗体相同的位点或表位结合。或者或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位图谱作图。例如，可以如通过丙氨酸筛选来诱变抗体和/或结合多肽序列，以鉴定接触残基。最初测试突变抗体与多克隆抗体和/或结合多肽的结合，以确保正确的折叠。在不同的方法中，对应于多肽不同区域的肽可以用于候选抗体和/或多肽或候选抗体和/或结合多肽与具有表征过的或已知表位的抗体的竞争试验中。
在筛选和/或鉴定的任一种方法的一些实施方案中，wnt途径候选拮抗剂是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，wnt途径候选拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin-易位拮抗剂)是小分子。
在一个方面中，测试wnt途径拮抗剂的抗原结合活性，例如，通过已知方法，如ELISA、Western印迹等，来进行测试。
V.药物制剂
通过将具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药物学上可接受的载体(REMINDTON’S PHARMA.SCI.第16版，Osol，A.编辑(1980))混合，制得冻干制剂或水溶液形式的如本文中所述的wnt途径拮抗剂的药物制剂。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂是小分子、抗体、结合多肽和/或多核苷酸。药物学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，聚乙二醇(PEG)。本文中示例性的药物学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂，如可溶性中性-活性透明植酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20植酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。特定的示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP结合一种或多种其他葡糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)，如软骨素酶。
示例性冻干制剂描述于美国专利No.6,267,958。含水抗体制剂包括在美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中所述的这些，后一种制剂包括组氨酸-醋酸盐缓冲剂。
按照待治疗特定适应症的需求，本文中的制剂还可以含有超过一种的活性成分，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。这样的活性成分合适地以对于计划的目的有效的含量组合地存在。
活性成分可以包裹在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制得的微胶囊中，例如，分别在胶状药物传送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳液(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这样的技术公开于REMINDTON’S PHARMA.SCI.第16版，Osol，A.编辑(1980)。
可以制得持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有wnt途径拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是球形物质形式的，例如，膜，或微胶囊。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜的过滤，可以容易地实现无菌性。
VI.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的材料的制品。制品包括容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以从各种材料(如，玻璃或塑料)形成。容器容纳用于治疗、预防和/或诊断病症有效的组合物自身或结合另一种组合物并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文中所述的wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin拮抗剂，例如，R-spondin-易位拮抗剂)。标签或包装说明书表示组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可以包括(a)第一个容器，其中含有组合物，其中组合物包括wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin拮抗剂，例如，R-spondin-易位拮抗剂)；和(b)第二个容器，其中含有组合物，其中组合物包括另一种细胞毒性或其他治疗剂。
在一些实施方案中，制品包括容器、所述容器上的标签和所述容器内含有的组合物；其中组合物包括一种或多种试剂(例如，结合一种或多种生物标记物或探针的一抗和/或本文中所述的一种或多种生物标记物的引物)，容器上的标签表明组合物可以用于评价样品中一种或多种生物标记物的存在，并且说明使用试剂，用于评价样品中一种或多种生物标记物的存在。制品可以进一步包括一套用于制备样品和利用试剂的说明书和材料。在一些实施方案中，制品可以包括如一抗和二抗这样的试剂，其中二抗与标记缀合，例如，酶标记。在一些实施方案中，制品包括本文中所述的一种或多种生物标记物的一种或多种探针。
在任一种制品的一些实施方案中，一种或多种生物标记物包括表9中所列的一种或多种基因的易位(例如，重排和/或融合)。在任一种制品的一些实施方案中，易位(例如，重排和/或融合)是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO1易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，RSPO2易位包括SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：12、41和/或42的引物可检测RSPO2易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过EIF3E启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO2易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO2启动子来驱动。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，RSPO3易位包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。在一些实施方案中，通过包括SEQ ID NO：13、14、43和/或44的引物可检测RSPO3易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过PTPRK启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)通过RSPO3启动子来驱动。在一些实施方案中，RSPO3易位(例如，重排和/或融合)包括PTPRK分泌信号序列(和/或不包括RSPO3分泌信号序列)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)是RSPO4易位(例如，重排和/或融合)。在一些实施方案中，R-spondin易位(例如，重排和/或融合)导致升高的R-spondin表达水平(例如，与没有R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)以及KRAS和/或BRAF。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在以及变化KRAS和/或BRAF(例如，多形性或突变)。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物的存在是R-spondin易位(例如，重排和/或融合)的存在，以及一种或多种生物标记物的不存在是变化(例如，多形性或突变)CTNNB1和/或APC的不存在。
在任一种制品的一些实施方案中，制品包括引物。在一些实施方案中，引物是SEQ ID NO：12、13、14、41、42、43和/或44中的任一种。
在任一种制品的一些实施方案中，wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin-易位拮抗剂)是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin-易位拮抗剂)是小分子。在一些实施方案中，wnt途径拮抗剂(例如，R-spondin-易位拮抗剂)是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，并且抗体片段结合wnt途径多肽(例如，R-spondin-易位融合多肽)。
本发明实施方案中的制品可以进一步包括包装说明书，其表明了组合物可以用于治疗特定的病症。或者或另外地，制品可以进一步包含第二个(或第三个)容器，该容器包含药物学上可接受的缓冲剂，如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制品可以进一步包括在商业和使用者立场上所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针和注射器。
制品中的其他任选成分包括一种或多种缓冲剂(例如，阻断缓冲剂、洗涤缓冲剂、底物缓冲剂等)、其他试剂，如底物(例如，色原)，其通过酶标记在化学上改变，表位恢复溶液、对照样品(正和/或负对照)、对照载玻片等。
将理解替代wnt途径拮抗剂，或除了wnt途径拮抗剂以外，以上任一种制品可以包括本文中所述的免疫缀合物。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。将理解鉴于以上提供的一般描述，可以实施各种其他实施方案。
实施例的材料和方法
样品、DNA和RNA制备和MSI测试
从接受以下所述的染色体组分析的商业来源获得病人匹配的新鲜冷冻原发性结肠肿瘤和正常组织样品。将所有肿瘤和正常组织接受病理学评价。从一组90个样品中，鉴定了74个肿瘤对，用于进一步分析。使用Qiagen AllPrep DNA/RNA试剂盒(Qiagen，CA)提取肿瘤DNA和RNA。使用MSI检测试剂盒(Promega，WI)，评价肿瘤样品的微卫星不稳定性。
外显子组(exome)捕获和测序
通过外显子组测序分析了七十二个肿瘤样品和匹配的正常组织。使用由2.1百万个靶向～30,000个编码基因(～300,000个外显子，总大小365.Mb)的以经验为主优化的寡核苷酸组成的SeqCap EZ人外显子组文库v2.0(Nimlegen，WI)，进行了外显子组捕获。文库能够捕获总共44.1Mb的基因组，包括RefSeq(2010年1月)、CCDS(2009年9月)和miRBase(v.14，2009年9月)中代表的基因和外显子。在HiSeq 2000(Illumina，CA)上进行所产生的外显子组捕获文库的测序。针对每个样品，收集2×75bp配对-端数据的一个泳道。
RNA-seq
使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina，CA)，将来自68个结肠肿瘤和匹配的正常样品对的RNA用于产生RNA-seq文库。RNA-seq文库是多重的(每个泳道两个)，并且按照制造商的推荐(Illumina，CA)，在HiSeq 2000上测序。产生了每个样品～3千万个2×75bp配对-端测序读数。
序列数据加工
为了质量控制使用Bioconductor ShortRead包评价所有短读数数据。Morgan，M.等，Bioinformatics 25，2607-2608(2009)。为了证实所有样品得到了正确鉴定，比较了与Illuman 2.5M阵列数据重叠的所有外显子组和RNA-seq数据变体，并且检查一致性。还在所有样品之间进行了全部(all by all)种系变体比较，以检查肿瘤和正常之间的所有对正确匹配，并且因此没有与高于90％截留的任何其他病人对匹配。
变体识别(variant calling)
使用设定为缺省参数的BWA软件，将测序读数作图于UCSC人基因组(GRCh37/hg19)。Li.H，&Durbin，R.Bioinformatics 25，1754-1760(2009)。按照之前所述的，进行了局部重新排列、双重标记和原始变体识别。DePristo，M.A.等，Nat.Genet.43，491-498(2011)。另外滤出了dbSNP Build 131中代表的(Sherry，S.T.等，Nucleic Acids Res 29，308-311(2001))，但未在COSMIC中代表的(Forbes，S.A.等，Nucleic Acids Res 38，D652-657(2010))已知种系变化。此外，取出肿瘤和正常样品中都存在的变体作为种系变化。预测肿瘤样品中存在的但在匹配的正常中不存在的剩余变化是体细胞的。另外使用Fisher’s精确性检验过滤预测的体细胞变化，使得只包括在肿瘤和匹配的正常中具有最小10×覆盖以及在匹配的正常中观察到的变体等位基因频率＜3％和变体等位基因计数显著差异的位置。为了评价这种算法的性能，随机选择了807个蛋白质-改变变体并且按照之前所述的，使用Sequenom(San Diego，CA)核酸技术进行证实。Kan，Z.等，Nature 466，869-873(2010)。在这些中，93％(753个)证实为癌症特异性的，证实的变体在肿瘤中未看到的和附近正常(种系)中看到的之间相等地分布。使用GATK Indel Genotyper Version 2(其阅读给定对的肿瘤和正常BAM文件)识别Indel。DePristo，M.A.等，Nat.Genet.43，491-498(2001)。
为了鉴定严重违背二项式假设的变体，或受特定作图器影响的变体识别，使用以下算法另外地包括Sequenom证实的变体。使用GSNAP，将读数作图于UCSC人基因组(GRCh37/hg19)。Wu，T.D.&Nacu，S.Bioinformatics 26，873-881(2010)。选择了在给定的位置看到至少两倍并且高于10％等位基因频率的变体。使用Fisher’s精确性检验，针对在链和位置中显著偏倚，对这些变体进行了另外过滤。此外，排除了在12.5％的正常等位基因频率下使用β-二项式分布测定为至少1％错失机会的邻近正常中部具有适当覆盖的变体。通过Sequenom证实了包括在第二个算法中的所有新的蛋白质-改变变体，这形成了总共515个另外的变体。使用SIFT(Ng，P.C.&Henikoff，S.Genome Res 12，436-446(2002))和PolyPhen(Ramensky，V.，Bork，P.&Sunyaev，S.Nucleic Acids Res 30，3894-3900(2002))预测所有非同义体细胞突变对基因功能的作用。使用Ensembl(版本59，www.ensembl.org)注解所有变体。
体细胞突变和indel的证实
按照之前所述的，使用单碱基对延伸接着核酸质谱分析(Sequenom，CA)，来证实预测的体细胞突变。肿瘤和匹配的正常DNA是扩增的完整基因组，并使用REPLI-g Whole Genome Amplification Midi试剂盒(Qiagen，CA)，并且按照制造商的推荐清洗和使用。将发现为肿瘤中预期的但在正常中不存在的变体指定为体细胞的。在肿瘤和正常中都存在的那些归类为种系。在肿瘤或正常中不能证实的变体指定为失败。对于indel证实，设计将产生包含在indei区域中的～300bp扩增子的引物。按照制造商的说明，使用Phusion(NEB，MA)，在肿瘤和匹配的正常样品中对该区域进行PCR扩增。然后在凝胶上将PCR片段纯化为分离的相关条带并且将其进行Sanger测序。使用Mutation Surveyor(SoftGenetics，PA)，分析了测序痕迹文件。将肿瘤中存在而正常中不存在的indel指定为体细胞的并且记载于表3中。
突变显著性
使用之前描述的方法评价了基因的突变显著性。简而言之，这种方法可以鉴定比基于计算的背景突变率预期的具有统计学上显著更多的蛋白质-改变突变的基因。针对六个不同核苷酸突变类别(A、C、G、T、CG1、CG2)计算了背景突变，其中在肿瘤和匹配的正常样品中存在显著覆盖(≥10×)。使用突变所有蛋白质编码核苷酸并且观察所得到的变化是否将导致同义或非同义变化的模拟来计算非同义与同义的比例，ri。通过将同义体细胞变体的数量乘以ri并且通过蛋白质编码核苷酸的总数标准化来确定背景突变率，fi。作为蛋白质编码碱基的数量乘以fi并且在所有突变类别整合，来确定给定基因的预期突变数。已知预期和观察到的每个基因的突变数，使用Poisson概率函数计算p-值。使用Benhamini Hochberg方法，针对多重检验，校正P值，并且通过取q-值的负log10，将所得到的q-值转化成q-评分。已知对于MSI和MSS样品存在不同突变率，针对每个分开计算q评分，两个超突变的样品完全去除。为了不低估背景突变率，从分析中排除了具有低于50％肿瘤含量的七个样品。按照之前所述的，还计算了Pathway突变显著性，除了使用的BioCara Pathway数据库，其可以作为MsigDB的一部分下载(Subramanian A.等，Proc.ofthe Natl Acad.OfSci.USA 102，15545-15550(2005))。
完整基因组测序和分析
使用BWA，将配对-端DNA-Seq读数与GRCh37比对。为了获得突变细胞的比对的进一步加工与使用GATK途径的外显子组测序分析相似。通过计算机化10kb非重叠储存中的读数数量并且取这些计数的肿瘤/正常比，来计算拷贝数。使用breakdancer预测染色体断点。Chen，K.等，Nat.Methods 6，677-681(2009)。使用Circos(Krzywinski，M.等，Gemome Res.19，1639-1459(2009))形成基因组图。
RNA-seq数据分析
使用GSNAP(Wu，T.D.&Nacu，S.Bioinformatics 26，873-881(2010))，将RNA-Seq读数与人基因组版本GRCh37比对。通过计数比对一致并且对每个基因座独特(如通过CCDS限定的)的读数的数量来获得每个基因的表达计数。然后针对文库大小，将基因技术标准化，并且随后使用DESeq Bioconductor软件包稳定变量。Anders，S.&Huber，W.Genome Biology 11，R106(2010)。通过对变量稳定的计数的配对t-检验，接着使用Benjamini&Hochberg方法针对多重检验进行校正，将差异基因表达计算机化。
SNP阵列数据产生和分析
将Illumina HumanOmni2.5_4vl阵列用于测定74个结肠肿瘤和匹配的正常在～2.5百万个位置的基因型、DNA拷贝和LOH。对于样品同一性和数据质量，这些样品全部通过我们的质量控制规格(参见下文)。选择了2295239个高质量SNP的子集用于所有分析。
进行修正以允许与Illumina阵列数据一起使用后，应用PICNIC(Greenman，C.D.等，Biostatistics 11，164-175(2010))算法，以估算总的拷贝数和等位基因拷贝数/LOH。修正包括用CBS算法替代区段初始化成分(Venkatraman，E.S.&Olshen，A.B.Bioinformatics 23，657-663(2007))，并且针对背景原始拷贝数信号调整之前的分布(0.7393的调节平均和0.05的标准偏差)。对于PICNIC’s隐藏的Markov模型(HMM)需要的预加工，Bayesiaan模型用来估算每个SNP的簇质心。对于SNPk和基因型g，按照以下的二变量高斯分布，将正常样品中观察到的数据建模。通过6-维高斯分布，将三个双重基因型的簇中心共同建模，平均处理为超参数，并且基于156个正常样品的训练集以经验为主地进行设定。按照逆Wishart，将簇中心和基因组内协方差矩阵建模，标度矩阵超参数也以经验为主地进行设定，并且将自由度手动调整，以对于大范围的探针行为和较小的等位基因频率提供令人满意的结果。最后，用非线性函数：y＝αkxγk+βk转化SNP k的信号(分开地针对A和B等位基因)，使用基于以上计算机化的后验分布选择的参数。
使用所有样品之间的基因型一致性来证实样品同一性。预期来自相同病人的肿瘤对具有＞90％一致性，并且预期所有其他对具有＜80％一致性。从所有分析中排除不满足这些标准的样品。按照改进的PICNIC，通过测量针对每个SNP的原始和HMM-拟合值之间的根平均均方误差(RMSE)，来评价整体HMM拟合的质量。从所有分析中排除RMSE＞1.5的样品。最后为了说明两种通常观察到的人工产物，对于具有拟合拷贝数0的单元素，或对于刻度外的拷贝增加区域，观察到并且拟合平均差异超过2时，将拟合的拷贝数值设定为“NA”。
反复出现的DNA拷贝数增加和丢失
使用GISTIC，版本2.0，鉴定具有反复出现的DNA拷贝增加和丢失的基因组区域。Mermel，C.H.等，Genome Biology 12，R41(2011)。将从PICNIC获得的分段整数总拷贝数值转化成log2比值，y，因为y＝log2(c+0.1)-1。使用+/-0.2的截留，将log2比值分别归类为增加或丢失。使用了最小20SNP的区段长度和3的log2比“帽”值。
融合检测和证实
使用计算管道研发的称为GSTRUCT-融合鉴定推定的融合。管道是基于基本上与之前报道的用于发现连读融合的方法相似的产生-和-测试策略。Nacu，S.等，BMCMed Genomics 4，11(2011)。使用我们的比对程序GSNAP比对配对-端读数。Nacu，S.等，BMC Med Genomics 4，11(2011)。GSNAP具有检测表示单个阅读端内的易位、倒置和其他远融合的剪接的能力。
这些远剪接提供了一组用于随后的测试阶段的候选融合子。其他组的候选融合子源自未配对的独特比对，其中配对-端阅读的每个末端与不同的染色体唯一地比对，并且也来自配对的，但不一致的唯一比对，其中每个末端与相同的染色体唯一地比对，但具有超过200,000的明显基因组距离，或具有表明了倒置或不规则事件的基因组方向。
然后将候选融合子相对于来自RefSeq的已知转录产物进行过滤，使用GMAP，与基因组比对。Wu，T.D.&Watanabe，C.K.Bioinformatics 21，1859-1875(2005)。需要将远剪接两侧的片段，或未配对的两端或不一致的配对-端比对作图于已知的外显子区域。这一过滤步骤排除了大约90％的候选物。进一步排除表明了这些基因的重排以及涉及基因组中邻近基因的明显连读融合事件的候选倒置和删除，我们之前的研究所表明的很可能具有转录来源，而不是基因组来源。
对于剩余的候选融合事件，构建了由支持供体外显子远端的外显子和支持受体外显子近端的外显子组成的人工外显子-外显子连接。近端和远端计算中包括的外显子是有限的，使得沿着每个基因的累积长度在估算的200bp最大插入片段长度内。作为对照，对于有助于候选融合事件的所有基因，构建了由相同基因内的外显子组合组成的全部外显子-外显子连接。
在我们管道的测试阶段，我们使用作为GMAP和GSNAP包的一部分包括的GMAP_BUILD程序，从人工外显子-外显子连接构建了基因组指数。将这种具有剪接检测关闭的基因组指数和GSNAP程序用于重新比对与基因组不一致的初始阅读末端。提取与对应于候选融合的基因间连接比对的读数，而不是与对照基因间连接比对。
过滤重新比对的结果，以要求每个候选融合子具有至少一个具有20bp悬垂物的读数。还要求每个候选融合子具有至少10个支持读数。对于每个剩余的候选融合子，使用GMAP，将两个组成基因相对于彼此进行比对，并且如果比对在75bp的窗口中具有任何含有60个匹配的区域，则排除该融合子。还使用GMAP，将外显子-外显子接头相对于组成基因的每一个进行比对，并且如果比对具有高于90％的连接覆盖和高于95％的同一性，则排除该融合子。
使用结肠肿瘤和匹配的正常样品，使用逆转录(RT)-PCR方法，来进行基因融合的证实。按照制造商的说明，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Life Technologies，CA)，将500ng的总RNA逆转录成cDNA。在25μl含有400pM每种引物、300μM每种三磷酸脱氧核苷和2.5单位的LongAmp Taq DNA聚合酶(NewEngland Biolabs，MA)的反应中扩增50ng的cDNA。进行PCR，使用95℃的初始变性，持续3分钟，接着95℃10秒，56℃1分钟和68℃30秒35个循环，并且最终延伸步骤在68℃下进行10分钟。将3μl PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上运行，以鉴定含有基因融合的样品。用QIAquick PCR纯化试剂盒或Gel Extraction试剂盒(Qiagen，CA)纯化特定的PCR产物。用每个融合子特异性的PCR引物，将纯化的DNA直接测序，或在Sanger测序之前，克隆至TOPO克隆载体pCR2.1(LifeTechnologies，CA)中。按照制造商的说明，在ABI3730xl(Life Technologies，CA)上，使用Sanger测序，将克隆测序。使用Sequencher(Gene Cordes Corp.，MI)，分析了Sanger测序痕迹文件。
RSPO融合活性检测
使用标准PCR和克隆策略，产生了驱动c-端FLAG标记物EIF3E、PTPKR(氨基酸1-387)、RSPO2、RSPO3、EIF3E(e1)-RSPO2(e2)、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)表达的真核生物表达质粒pRK5E。
细胞、条件培养基、免疫沉淀和Western印迹
将HEK293细胞，人真核肾细胞，维持于补充了10％FBS的DMEM中。为了表达分析和条件培养基产生，将3×105HEK29T细胞涂布于6-孔平板中的1.5ml的含有10％FBS的DMEM。根据制造商的说明，使用图6(Roche)，用1μg DNA转染细胞。将培养基调节48小时，收集，离心，并且用于刺激荧光素酶报告子试验(终浓度0.1-0.4X)。为了表达分析，收集培养基，离心，以除去碎片，并且用于免疫沉淀。
荧光素酶报告子试验
将HEK293T细胞以50,000细胞/ml的密度涂布于96-孔平板每孔中的90μl含有2.5％FBS的培养基中。24小时后，根据制造商的说明(Roche，CA)，使用图6转染细胞，每孔使用以下DNA：0.04μg TOPbrite萤火虫报告子(Nature Chem.Biol.5，217-219(2009))，0.02μg pRL SV40-Renilla(Promega，WI)和0.01μg合适的R-spondin或对照构建体。用25μl含有10％FBS的新鲜或条件培养基刺激细胞，使用或不用rm Wnt3a(20-100ng/ml(终)，R&D Systems，MN)。24小时刺激后，除去50μl培养基，并且根据制造商的说明，用Dual-Glo荧光素酶检测试剂(Promega，WI)替代。使用Envision Luminometer(Perkin-Elmer，MA)来检测发光。为了控制转染效率，将萤火虫荧光素酶水平标准化至Renilla荧光素酶水平，以产生相对荧光素酶单位(RLU)的测量。将实验数据呈现为来自三个独立孔的平均±SD。
免疫沉淀和Western印迹
为了证实分泌了RSPO野生型和RSPO融合蛋白，使用抗-FLAG-M2抗体偶联珠子(Sigma，MO)，从培养基免疫沉淀FLAG标记的蛋白质，在SDS-PAGE加样缓冲剂中煮沸，溶解于4-20％SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且转移至硝基纤维素膜上。按照之前所述的(Bijay p85 paper)，使用western印迹，从细胞裂解物检测细胞中表达的RSPO和其他FLAG标记的蛋白质。简而言之，使用FLAG-HRP-缀合的抗体和化学发光Super signal West Dura化学发光检测底物(Thermo Fisher Scientific，IL)，通过Western印迹，检测了免疫沉淀的蛋白质和来自细胞裂解物的蛋白质。
实施例1-CRC突变谱
鉴定和了解癌症基因组中的变化是靶向治疗发展必需的。在这些实施例中，通过使用下一代测序来表征外显子组、转录物组和拷贝数变化，以获取70多对原发性人结肠癌的系统分析。鉴定了36,303个蛋白质改变体细胞变化，其包括Wnt途径基因中的多个新的反复出现的突变，如TCF12和TCF7L2，染色质重塑蛋白，如TET2和TET3，以及包括ERBB3的受体酪氨酸激酶。用于重要的癌基因的分析鉴定出18个候选物，包括细胞周期检查点激酶ATM。拷贝数和RNA-seq数据分析鉴定了结肠肿瘤子集中IGF2的扩增和相应的超表达。此外，使用RNA-seq数据，鉴定了多个融合转录产物，包括反复出现的R-spondin基因RSPO2和RSPO3的基因融合，其在10％的样品中产生。证明了RSPO融合蛋白在生物学上是有活性的并且加强了Wnt细胞。RSPO融合子与APC突变互相排斥，表明它们很可能在激活Wnt细胞和肿瘤发生中起着作用。在这些实施例中鉴定的R-spondin基因融合子和几个其他基因突变提供了用于结肠癌中的治疗干预的新机会。
表征了74个原发性结肠肿瘤及其匹配的邻近正常组织。进行了74个结肠肿瘤和邻近正常组织对中的72个(15个MSI和57个MSS)的完整外显子组测序，以评价突变谱。还在Illumina 2.5M阵列上分析了这74个肿瘤/正常对，以评价染色体拷贝数变化。还获得了68个肿瘤/正常对的RNA-seq数据。最后，将来自这组样品的30x覆盖下的MSI和MSS肿瘤/正常对的基因组进行测序和分析。
使用Nimblegen SeqCap EZ人外显子组文库v2.0捕获外显子，并且在HiSeq 2000(Illumina，CA)上测序，以产生75bp配对-端测序读数。靶向的区域具有179×的平均覆盖，在≥10倍下，覆盖了97.4％碱基。鉴定出分析的72个结肠肿瘤样品中的95,075个体细胞突变中的36,303个是蛋白质-改变的。两个MSS样品显示出不同寻常的大量的突变(24,830和5,780个突变，其中分别9,479和2,332个是蛋白质改变的突变)。将这些指定为超突变样品，并且没有考虑用于计算背景突变率。发现了研究的15个MSI样品中的52,312个体细胞突变(18,436个错义、929个无义、22个停止丢失、436个必需剪接位点、363个蛋白质改变插入缺失、8,065个同义、16,675个内含子和7,386个其他)和55个MSS样品中的12,153个体细胞突变(3,922个错义、289个无义、6个停止丢失、69个必需剪接位点、20个蛋白质改变插入缺失、1,584个同义、4,375个内含子和1,888个其他)(表2和3)。这些实施例中记载的蛋白质改变单核苷酸变体中的约98％(35,524/36,303)是新的，并且在COSMIC v54中没有报道过(Forbes，S.A.等，NucleisAcids Res.38：D652-657(2010))。使用RNA-seq数据或质谱基因型测定证实了百分之三十七的体细胞突变，具有93％的证实率(表2)。使用Sanger测序，证实了所有报道的插入缺失是体细胞的(表3-体细胞插入缺失)。观察到MSS样品中2.8/Mb(55个样品中31-149个编码区突变)和MSI样品中40/Mb(15个样品中764-3113个编码区突变)的平均非同义突变率，与之后的MMR缺陷一致。
表3-体细胞插入缺失
突变位点的基础水平转变和转换的分析揭示了在CRC中，C至T的转变是突出的，与MMR状况无关，在完整外显子组和完整基因组分子中都是如此。这与之前的突变报道一致(Wood，L.D.等，Science 318：1108-1113(2007)；Sjoblom，T.等，Science 314：268-274(2006)；Basss，A.J.等，Nat.Genet.43：964-968(2011))。检查的两个超突变肿瘤样品也显示出较高比例的C至A和T至G转换，与这些样品中观察到的更高的突变率一致。
与外显子组突变数据一致，与MSI完整基因组中观察到的97,968个突变相比，分析的MSS完整基因组显示出17,651个突变。MSS和MSI基因组各自的平均完整基因组突变率为6.2/Mb和34.5/Mb。之前对MSS CRC基因组报道了4.0-9.8/Mb的突变率(Bass，A.J.等，Nat.Genet.43：964-968(2011))。
实施例2-突变基因的分析
突变分析鉴定了12,956个基因中蛋白质改变体细胞单核苷酸变体，包括MSS样品中的3,257个，MSI样品中的9,851个和两个超突变样品中的6，891个。其中，频繁突变的蛋白质类别是人激酶，包括RTK、G-蛋白偶联受体和核激素受体。在了解突变对基因功能的影响的尝试中，应用了SIFT(Ng，P.C.&Henikoff，S.，Genome Res12：436-446(2002))、Polyphen(Ramensky，V.等，Nucleic Acids Res 30：3894-3900(2002))和mCluster(Yue，P.等，Hum.Mutat.31：264-271(2010))，并且基于三种方法中的至少两种(表2)，与来自正常样品的种系变体的12％形成对照，发现了36.7％突变可能具有功能性结果。
为了进一步了解突变基因的相关性，将之前描述的q-评分度量用于将显著突变的癌基因分级(Kan，Z.等，Nature 466：869-873(2010))。在MSS样品中，鉴定了18个显著的癌基因(q-评分＞＝1；≤10％假发现率)(KRAS、TP53、APC、PIK3CA、SMAD4、FBXW7、CSMD1、NRXN1、DNAH5、MRVI1、TRPS1、DMD、KIF2B、ATM、FAM5C、EVC2、OR2W3、TMPRSS11A和SCN10A)。显著突变的MSS结肠癌基因包括之前报道的基因，包括KRAS、APC、TP53、SMAD4、FBXM7和PIK3CA，以及几个新的基因，包括细胞周期检查点基因ATM。如KRAS和TP53基因是其中顶级的突变MSI结肠癌基因，然而，由于分析的MSI样品的数量有限，没有一种基因获得了统计学显著性。
在建立突变基因相关性的尝试中，将突变基因与399个候选结肠癌基因进行比较，所述基因是在涉及癌症的小鼠模型的筛选中鉴定的(Starr，T.K.等，Science 323，1747-1750(2009)；March，H.N.等，Nat.Genet.43，1202-1209(2011))。在399个基因中，在327个中发现了突变。通过替换方法分析数据集时，432个基因中，在356个中发现了突变。数据集中与小鼠结肠癌模型命中重叠的频繁突变的基因包括KRAS、APC、SMAD4、FBXW7和EP400。另外，在小鼠CDC筛选中发现了染色质重塑中涉及的基因，如SIN3A、SMARCA5和NCOR1和组蛋白修饰酶JARID2(Starr，T.K.等，Science 323，1747-1750(2009)；March，H.N.等，Nat.Genet.43，1202-1209(2011))在我们的外显子组筛选中也是突变的。此外，在小鼠结肠癌模型筛选中鉴定的TCF12，在我们的5个样品(Q179*、G144*和R603W/Q)中是突变的(7％)，并且在R603含有热点突变(5个突变中3个；R603W/Q)。TCF12螺旋-环-螺旋结构域内的这种热点突变可能消除了其结合DNA的能力，表明是丢失功能突变。有趣地，在MSI样品中鉴定了全部的TCF12突变。TCF12转录因子之前已经涉及结肠癌转移(Lee，C.C.等，J.of Biol.Chem.287：2798-2809(2011))。该基因中热点的存在及其在小鼠CRC模型筛选中的鉴定表明其可能作为CRC驱动基因起作用。
突变热点，其中基因中相同位置在独立的样品中突变，表示功能上相关的驱动癌基因。在这个研究中，鉴定了270个具有热点突变的基因(表4)。这些基因中的七十个之前没有在COSMIC中报道过。我们的突变与COSMIC中报道的那些的比较鉴定了166个基因中另外的245个热点突变(表5)。利用可替换的数据分析方法，鉴定了274个具有热点突变的基因，这些基因中的四十个之前在COSMI中没有，以及361个基因中另外435个热点突变。具有新热点突变的基因包括转录调节子(TCF12、TCF7L2和PHF2)、Ras/Rho相关调节子(SOS1(例如，R547W、T614MR854*、G1129V)、SOS2(例如，R225*、R854C和Q1296H)、RASGRF2、ARHGAP10、ARHGEF33和Rab40c(例如，G251S))、染色质修饰酶(TET2、TET3、EP400和MLL)、谷氨酸受体(GRIN3A和GRM8)、受体酪氨酸激酶(ERBB3、EPHB4、EFNB3、EPHA1、TYRO3、TIE1和FLT4)、其他激酶(RIOK3、PRKCB、MUSK、MAP2K7和MAP4K5)、蛋白磷酸酶(PTPRN2)、GPRC(GPR4和GPR98)和E3-连接酶(TOPORS)。在这个基因集中更令人感兴趣的TET2和TET3，两者编码涉及DNA甲基化的甲基胞嘧啶加双氧酶(Mohr，F.等，Exp.Hematol.39：272-281(2011))。尽管TET2中突变已经在骨髓癌中有报道，但迄今为止实体肿瘤中的TET3或TET1中进一步的突变尚未有报道，尤其是在CRC中(Mohr，F.等，Exp.Hematol.39：272-281(2011))。所有三个家族成员TET1(例如，R81H、E417A、K540T、K792T、S879L、S1012*、Q1322*、C1482Y、A1896V和A2129V)、TET2(例如，K108T、T118I、S289L、F373L、K1056N、Y1169*、A1497V和V1857M)和TET3(例如，T165M、A874T、M977V、G1389R和R1576Q/W)在这些实例中是突变的。
表4-热点突变
表5-通过使用COSMIC突变数据的met分析鉴定的热点突变
实施例3-表达和拷贝数改变
将RNA-seq数据用于计算肿瘤和正常样品之间差异表达的基因(表6)。顶级差异超表达的基因包括FOXQ1和CLND1，其都涉及肿瘤发生(Kaneda，H.等，CancerRes.70：2053-2063(2010))。重要地，在分析RNA-seq数据中，在检查的结肠肿瘤的12％(8/68)中，鉴定了IGF2上调。如通过Illumina2.5M阵列测量的，大部分(7/8)具有IGF2超表达的肿瘤也显示出IGF2的病灶性增强。全部的差异表达基因影响多个信号传输途径，包括钙信号传输、cAMP-介导的信号传输、谷氨酸受体信号传输、肌萎缩性脊髓侧索硬化信号传输、氮代谢、轴突引导信号传输、IL-17A在牛皮癣中的作用、血清素受体信号传输、慢性梗阻性肺病中的气道病理学、蛋白质激酶A信号传输、膀胱癌信号传输、HIF1α信号传输、心脏β-肾上腺素能信号传输、突触长期强化、动脉粥样硬化信号传输、昼夜节律信号传输、神经元中的CREB信号传输、G-蛋白偶联受体信号传输、白细胞外渗信号传输、补体系统、Eicosanoid信号传输、酪氨酸代谢、半胱氨酸代谢、突触长期抑制、IL-17A在关节炎中的作用、Sildenafil(Viagra)的细胞作用、背角神经元中的神经疼痛信号传输、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、IL-17F在过敏性炎性气道疾病中的作用、甲状腺癌信号传输、肝纤维化/肝星形细胞激活、多巴胺受体信号传输、NANOG在哺乳动物胚胎干细胞多能性中的作用、硫酸软骨素生物合成、内皮缩血管肽-1信号传输、硫酸角质素生物合成、光转化途径、Wnt/β-catenin信号传输、趋化因子信号传输、丙氨酸和天冬氨酸盐代谢、鞘糖脂生物合成-Neolactoseries、胆汁酸生物合成、巨噬细胞的作用、类风湿性关节中的成纤维细胞和内皮细胞、α-肾上腺素能信号传输、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、LPS/IL-1介导的RXG功能抑制、结直肠癌转移信号传输、嗜曙红细胞中的CCR3信号传输和/或O-多糖生物合成。
表6-差异表达的基因
通过将GISTIC应用于PICNIC分段的拷贝数数据，来评价74个肿瘤/正常对中的拷贝数改变。除了IGF2增强，发现了已知涉及增强的位于染色体8q上的宽扩增子中的KRAS(13％；10/74)和MYC(31％；23/74)。在21％(16/74)的样品中，观察到了涉及病灶性删除的FHIT，FHIT是一种肿瘤遏制剂(表8)。FHIT，其编码涉及嘌呤代谢的5’，5”’-PI，P3-三磷酸水解酶，已经报道了在其他癌症中丢失(Pichirri，F.等，Future Oncol.4：815-824(2008))。还观察到了APC(18％；14/74)和SMAD4(29％；22/74)的删除。最后，发现常常得到染色体20q，而相反，18q丢失。
使用PICNIC探针-水平拷贝数识别分析拷贝数改变时，拷贝数肿瘤/正常比例的CBS分段和这些肿瘤/正常比例的GISTIC，具有拷贝数改变的顶级基因组是相似的，尽管百分比略有变化。已知涉及增强的KRAS(13％；10/74)和MYC(23％；17/74)位于染色体8q上的宽扩增子中。在30％(22/74)的样品中观察到了涉及删除的FHIT，其是一种肿瘤遏制剂。APC(8％；6/74)、PTEN(4％，3/74)和SMAD3(9％，10/74)的删除。在27％(20/74)的样品中，SMAD4和SMAD2都改变了，并且位于常常丢失的18q上彼此3Mb内。
表7-具有显著拷贝数增加的基因
表8-具有显著拷贝数丢失的基因
除了评价表达，还利用RNA-seq数据来检查剪接模式。在突变的基因中，存在几个在标准剪接位点携带体细胞突变，这可能将影响其剪接。发现了112个基因具有标准剪接位点突变，这显示出基于RNA-seq数据的针对剪接缺陷的证据。受影响的基因包括TP53、NOTCH2和EIF5B(表9)。RNA-seq数据还用于分析基因编码区中的特定外显子的肿瘤特异性表达。鉴定了线粒体大亚基MRPL33基因的头一个5’注释的外显子上游的两个新的肿瘤特异性外显子(图1)。这一基因组区域的分析鉴定了这些新外显子的转录因子结合位点5’，经一步支持了我们的观察。
表9-剪接位点突变作用
实施例4-反复出现的R-spondin融合子激活了Wnt途径信号传输
接着将RNA-seq数据用于鉴定癌症基因组中产生的染色体内和染色体间重排，如基因融合(Ozsolak，F.&Milos，P.M.Nature Rev Genet.12：87-98(2011))。在配对-端RNA-seq数据作图中，在分析的CRC转录物组中鉴定了36个体细胞基因融合子，包括两个反复出现的。通过使用RT-PCR证实其存在于肿瘤中而不存在于相应的匹配的正常中确定了融合子的体细胞性质。进一步，对这些实施例中记载的所有融合子进行了测序和验证(表10)。鉴定的大部分预测的体细胞融合子是染色体内的(89％；32/36)。
这些实施例中鉴定的反复出现的融合子涉及在MSS CRC样品中发现的R-spondin家族成员，RSPO2(3％；2/68)和RSPO3(8％；5/68；图2A)。R-spondin是已知加强标准Wnt信号传输的分泌蛋白(Yoon，J.K.&Lee，J.S.Cell Signal.24(2)：369-77(2012))，可能是通过结合GPCR的LGR家族(Carmon，K.S.等，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 108：11452-11457(2011)；de Lau，W.等，Nature 476：293-297(2011)；Glinka，A.等，EMBO Reports 12：1055-1061(2011))。在两个肿瘤样品中鉴定的反复出现的RSPO2融合子涉及EIF3E(真核生物易位启动因子3)外显子1和RSPO2外显子2(图2B)。预期这一融合转录产物产生由EIF3E启动子驱动的功能性RSPO2蛋白(图2D)。相同样品中检测到的第二种RSPO2融合子涉及EIF3E外显子1和RSPO2外显子3(图10)。然而，没有预期这种EIF3E(e1)-RSPO2(e3)会产生功能性蛋白。为了证实基因组水平的改变的性质，进行了肿瘤的含有RSPO2融合子的完整基因组测序(WGS)。源自WGS数据的连接跨越读数、配对读数和拷贝数数据的分析在一个样品中鉴定出158kb删除，在第二个样品中鉴定出113kb删除，两者都在RSPO25’端的近端放置了EIF3E的外显子1。
在68个肿瘤中的5个中观察到了RSPO3易位，并且它们涉及PTPRK(蛋白酪氨酸激酶受体κ)，作为其5’配偶体。来自表达RSPO3融合子的5个肿瘤的WGS读数显示出涉及简单(3个样品)或复杂(2个样品)倒置的重排，将RSPO3放置在染色体6q上PTPRK相同链上的PTPRK的附近。鉴定出由PTPRK的外显子1(e1)或外显子7(e7)和RSPO3的外显子2(e2)组成的两种不同的RSPO3融合子变体(图3和图4)。RSPO3融合子可能源自染色体水平的删除-倒置事件，因为通常PTPRK和RSPO3是在染色体6q上的相对链上隔开850Kb。在四个样品中发现的PTPRK(e1)-RSPO3(e2)是框内融合子，其保留了完整的RSPO3的编码序列并且用PTPKR的替代了它的分泌信号序列(图3C)。在一个样品中检测到的PTPRK(e7)-RSPO3(e2)，也是框内融合子，其编码由包括其分泌信号序列的PTPRK的头387个氨基酸和缺乏其天然信号肽的RSPO3氨基酸34-272组成的～70KDa蛋白(图4C)。有趣地，与RSPO3相比，PTPRK含有更强的分泌信号序列，并且可能导致鉴定的融合变体更强的分泌。此外，RNA-seq数据显示出与匹配的正常样品和缺乏R-spondin融合子的肿瘤样品相比，含有融合子的结肠肿瘤样品中RSPO2和RSPO3的mRNA表达升高(图2E)。此外，所有RSPO阳性融合肿瘤表达可能的R-spondin受体LGR4/5/623-25，尽管与LGR4/5相比，LGR6表达较低。
为了确定预测的R-spondin融合蛋白是否是功能性的，产生了含有C-端flag tag的表达构建体，并且测试其转染至哺乳动物293T细胞后的表达。条件培养基的western印迹分析显示出表达并分泌了融合蛋白(图5A)。如使用Wnt荧光素酶报告子，通过它们增强Wnt信号传输能力所测定的，R-spondin融合产物在生物学上是有活性的。与使用野生型RSPO2/3观察到的一样，与对照感染细胞相比，用RSPO融合表达构建体转染的细胞的条件培养基的刺激导致Wnt荧光素酶报告子的激活(图5B)。在重组WNT的存在下，进一步增强了所观察到的激活，尽管在内源性WNT不存在下是明显的，这与R-spondin在Wnt信号传输中的已知作用相一致(Carmon，K.S.等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America108：11452-11457(2011)；de Lau，W.等，Nature 476：293-297(2011)；Glinka，A.等，EMBO Reports 12：1055-1061(2011))。
为了进一步表征RSPO基因融合子，在包括Wnt信号传输级联的细胞信号传输途径的组成部分中发生的突变和其他改变的内容中，分析了RSPO基因融合子(图6B)。除了与APC突变互相排斥外，RSPO2和RSPO3融合子彼此之间互相排斥(图5E)，除了一个在APC编码区中具有单个拷贝删除的样品(图5E)。此外，RSPO基因融合子与CTNNB1互相排斥，CTNNB1是CRC种突变的另一种Wnt途径基因。此外，所有具有RSPO基因融合子的样品在KRAS和BRAF中也携带突变(图6A)。大部分APC突变体样品具有RAS途径基因突变，表明RSPO基因融合子可能通过促进结肠肿瘤发展过程中的Wnt信号传输起着与APC突变相同的作用。在未显示的数据中，具有RSPO基因融合子的肿瘤显示出呈现与APC突变肿瘤相似的WNT表达标签，表明R-spondin可以在下游WNT突变不存在的情况细激活结肠肿瘤中的WNT途径。这些发现表明R-spondin可能作为人CRC中的驱动子。
在这些实施例中，记载了人原发性结肠肿瘤深入的大范围基因组分析。在人CRC外显子组和转录物组的测序和分析中，发现了多个新的反复出现的体细胞突变。这些实施例中许多显著突变的基因(APC、KRAS、PIK3CA、SMAD4、FBXW7、TP53、TCF7L2)与之前的发现一致。此外，记载了在他们的研究中强调的140个基因中111个中的多个突变。此外，已经鉴定出之前未报道过的11个另外的显著结肠癌基因，包括ATM和TMPRSS 11A。实施例鉴定了多个含有基因的热点，所述基因包括TCF12和ERBB3。本文鉴定的ERBB3致癌突变体可能提供了用于CRC治疗干预的新机会。表达和拷贝数数据的组合分析鉴定了我们的人CRC样品子集中的IGF2超表达。
最后，使用RNA-seq数据，已经鉴定出新的涉及R-spondin的反复出现的融合子，其以大约10％的频率出现。融合形成了加强Wnt信号传输的功能性R-spondin蛋白。R-spondin给带有它们的结肠癌病人的基于抗体的治疗提供了有吸引力的靶标。除了直接靶向R-spondin以外，阻断Wnt信号传输的其他治疗策略对抗R-spondin融合阳性的肿瘤将可能是有效的。
RSPO1核酸序列(SEQ ID NO：1)
ATGCGGCTTGGGCTGTGTGTGGTGGCCCTGGTTCTGAGCTGGACGCACCTCACCATCAGCAGCCGGGGGATCAAGGGGAAAAGGCAGAGGCGGATCAGTGCCGAGGGGAGCCAGGCCTGTGCCAAAGGCTGTGAGCTCTGCTCTGAAGTCAACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAAGCTGTTCATCCTGCTGGAGAGGAACGACATCCGCCAGGTGGGCGTCTGCTTGCCGTCCTGCCCACCTGGATACTTCGACGCCCGCAACCCCGACATGAACAAGTGCATCAAATGCAAGATCGAGCACTGTGAGGCCTGCTTCAGCCATAACTTCTGCACCAAGTGTAAGGAGGGCTTGTACCTGCACAAGGGCCGCTGCTATCCAGCTTGTCCCGAGGGCTCCTCAGCTGCCAATGGCACCATGGAGTGCAGTAGTCCTGCGCAATGTGAAATGAGCGAGTGGTCTCCGTGGGGGCCCTGCTCCAAGAAGCAGCAGCTCTGTGGTTTCCGGAGGGGCTCCGAGGAGCGGACACGCAGGGTGCTACATGCCCCTGTGGGGGACCATGCTGCCTGCTCTGACACCAAGGAGACCCGGAGGTGCACAGTGAGGAGAGTGCCGTGTCCTGAGGGGCAGAAGAGGAGGAAGGGAGGCCAGGGCCGGCGGGAGAATGCCAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCGAAGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACTCACATCTGCAGGGCCTGCCTAG
RSPO1氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
RSPO2核酸序列(SEQ ID NO：3)
ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCACTGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGCAAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAATCGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATGAGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGAGCTAACCAATAA
RSPO2氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
RSPO3核酸序列(SEQ ID NO：5)
ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTATGGAATACATCGGCAGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG
RSPO3氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERK
RSPO4核酸序列(SEQ ID NO：7)
ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATGCTCGCCCTGAACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAACTGCACAGGCTGTATCATCTGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGGGAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTGCCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATCCGCGGCCAGGAGGTCAACAGGTGCAAAAAATGTGGGGCCACTTGTGAGAGCTGCTTCAGCCAGGACTTCTGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCCACCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGGAGTGTGAACTGGGTCCCTGGGGCGGCTGGAGCCCCTGCACACACAATGGAAAGACCTGCGGCTCGGCTTGGGGCCTGGAGAGCCGGGTACGAGAGGCTGGCCGGGCTGGGCATGAGGAGGCAGCCACCTGCCAGGTGCTTTCTGAGTCAAGGAAATGTCCCATCCAGAGGCCCTGCCCAGGAGAGAGGAGCCCCGGCCAGAAGAAGGGCAGGAAGGACCGGCGCCCACGCAAGGACAGGAAGCTGGACCGCAGGCTGGACGTGAGGCCGCGCCAGCCCGGCCTGCAGCCCTGA
RSPO4氨基酸序列(SEQ ID NO：8)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多核苷酸(SEQ ID NO：74)
GAGCACAGACTCCCTTTTCTTTGGCAAGATGGCGGAGTACGACTTGACTACTCGCATCGCGCACTTTTTGGATCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTCTTGAATTTCTCTCTGTAAAGGAGGTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGGTGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCGCGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAGGCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCCCAGATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCACTGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGCAAGSGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAATCGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATGAGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGAGCTAACCAATAA
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：75)
MAEYDLTTRIAHFLDRHLVFPLLEFLSVKEVRGGEMLIALNMQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
EIF3E(e1)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQ ID NO：76)
ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCCTCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG
EIF3E(e1)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：77)
MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGR
EIF3E(e7)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQ ID NO：78)
ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCCTCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGGTGGCTGTACTTTTGATGATGGTCCAGGGGCCTGTGATTACCACCAGGATCTGTATGATGACTTTGAATGGGTGCATGTTAGTGCTCAAGAGCCTCATTATCTACCACCCGAGATGCCCCAAGGTTCCTATATGATAGTGGACTCTTCAGATCACGACCCTGGAGAAAAAGCCAGACTTCAGCTGCCTACAATGAAGGAGAACGACACTCACTGCATTGATTTCAGTTACCTATTATATAGCCAGAAAGGACTGAATCCTGGCACTTTGAACATATTAGTTAGGGTGAATAAAGGACCTCTTGCCAATCCAATTTGGAATGTGACTGGATTCACGGGTAGAGATTGGCTTCGGGCTGAGCTAGCAGTGAGCACCTTTTGGCCCAATGAATATCAGGTAATATTTGAAGCTGAAGTCTCAGGAGGGAGAAGTGGTTATATTGCCATTGATGACATCCAAGTACTGAGTTATCCTTGTGATAAATCTCCTCATTTCCTCCGTCTAGGGGATGTAGAGGTGAATGCAGGGCAAAACGCTACATTTCAGTGCATTGCCACAGGGAGAGATGCTGTGCATAACAAGTTATGGCTCCAGAGACGAAATGGAGAAGATATACCAGTAGCCCAGACTAAGAACATCAATCATAGAAGGTTTGCCGCTTCCTTCAGATTGCAAGAAGTGACAAAAACTGACCAGGATTTGTATCGCTGTGTAACTCAGTCAGAACGAGGTTCCGGTGTGTCCAATTTTGCTCAACTTATTGTGAGAGAACCGCCAAGACCCATTGCTCCTCCTCAGCTTCTTGGTGTTGGGCCTACATATTTGCTGATCCAACTAAATGCCAACTCGATCATTGGCGATGGTCCTATCATCCTGAAAGAAGTAGAGTACCGAATGACATCAGGATCCTGGACAGAAACCCATGCAGTCAATGCTCCAACTTACAAATTATGGCATTTAGATCCAGATACCGAATATGAGATCCGAGTTCTACTTACAAGACCTGGTGAAGGTGGAACGGGGCTCCCAGGACCTCCACTAATCACCAGAACAAAATGTGCAGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG
EIF3E(e7)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：79)
MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAGGCTFDDGPGACDYHQDLYDDFEWVHVSAQEPHYLPPEMPQGSYMIVDSSDHDPGEKARLQLPTMKENDTHCIDFSYLLYSQKGLNPGTLNILVRVNKGPLANPIWNVTGFTGRDWLRAELAVSTFWPNEYQVIFEAEVSGGRSGYIAIDDIQVLSYPCDKSPHFLRLGDVEVNAGQNATFQCIATGRDAVHNKLWLQRRNGEDIPVAQTKNINHRRFAASFRLQEVTKTDQDLYRCVTQSERGSGVSNFAQLIVREPPRPIAPPQLLGVGPTYLLIQLNANSIIGDGPIILKEVEYRMTSGSWTETHAVNAPTYKLWHLDPDTEYEIRVLLTRPGEGGTGLPGPPLITRTKCAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
尽管为了理解清楚的目的，之前的发明已经通过说明和实施例有一些详细描述，但描述和实施例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容特意将其全部按引用并入。

Claims (44)

1.一种治疗个体中癌症的方法，包括将有效量的wnt途径拮抗剂给药于个体，其中所述治疗是基于该个体患有包括R-spondin易位的癌症。
2.一种治疗癌细胞的方法，其中癌细胞包括R-spondin易位，该方法包括提供有效量的wnt途径拮抗剂。
3.一种治疗个体中癌症的方法，条件是该个体已经发现患有包括R-spondin易位的癌症，该方法包括将有效量的wnt途径拮抗剂给药于该个体。
4.一种治疗个体中癌症的方法，该方法包括：确定获自该个体的样品包括R-spondin易位，并且将有效量的包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗给予该个体，由此治疗所述癌症。
5.一种治疗癌症的方法，包括：(a)选择患有癌症的个体，其中所述癌症包括R-spondin易位；和(b)将有效量的wnt途径拮抗剂给药于由此选择的个体，由此治疗所述癌症。
6.一种鉴定癌症个体的方法，所述个体更有可能或不太可能从用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗进行的治疗获益的，该方法包括：确定获自个体的样品中R-spondin的存在或不存在，其中样品中R-spondin的存在表示个体更有可能从用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗进行的治疗获益或R-spondin的不存在表示个体不太可能从用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗进行的治疗获益。
7.一种用于预测癌症个体是否更有可能或不太可能有效地应答用包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗进行的治疗的方法，该方法包括确定R-spondin易位，由此，R-spondin易位的存在表示个体更有可能有效地应答用wnt途径拮抗剂进行的治疗，而R-spondin易位的不存在表示个体不太可能有效地应答用wnt途径拮抗剂进行的治疗。
8.一种预测癌症个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗有应答或无应答的方法，包括检测获自该个体的样品中R-spondin易位的存在或不存在，其中R-spondin易位的存在预示改个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗有应答，而R-spondin易位的不存在预示该个体对包括wnt途径拮抗剂的抗癌治疗无应答。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中该方法进一步包括将有效量的wnt途径拮抗剂给药于所述个体。
10.一种抑制癌细胞增殖的方法，包括将癌细胞接触有效量的R-spondin-易位拮抗剂。
11.一种治疗个体中癌症的方法，其包括将有效量的R-spondin-易位拮抗剂给药于该个体。
12.权利要求10-11任一项的方法，其中所述癌症或癌细胞包括R-spondin易位。
13.权利要求1-9和12任一项的方法，其中R-spondin易位是RSPO1易位、RSPO2易位、RSPO3易位和/或RSPO4易位。
14.权利要求13的方法，其中R-spondin易位是RSPO2易位。
15.权利要求14的方法，其中RSPO2易位包括EIF3E和RSPO2。
16.权利要求14的方法，其中RSPO2易位包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。
17.权利要求14的方法，其中RSPO2易位包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。
18.权利要求14的方法，其中RSPO2易位包括SEQ ID NO：71。
19.权利要求13的方法，其中R-spondin易位是RSPO3易位。
20.权利要求19的方法，其中RSPO3易位包括PTPRK和RSPO3。
21.权利要求19的方法，其中RSPO3易位包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。
22.权利要求19的方法，其中RSPO3易位包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。
23.权利要求19的方法，其中RSPO3易位包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。
24.权利要求1-9和12-23任一项的方法，其中在染色体水平(例如，FISH)、DNA水平、RNA水平(例如，RSPO1-易位融合转录产物)和/或蛋白质水平(例如，RSPO1-易位融合多肽)检测R-spondin易位。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述癌症或癌细胞是结直肠癌。
26.权利要求25的方法，其中所述癌症或癌细胞是结肠癌或直肠癌。
27.权利要求1-9和13-26任一项的方法，其中wnt途径拮抗剂是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。
28.权利要求1-9和13-27任一项的方法，其中wnt途径拮抗剂是R-spondin拮抗剂。
29.权利要求28的方法，其中wnt途径拮抗剂是分离的结合R-spondin的单克隆抗体。
30.权利要求29的方法，其中R-spondin是RSPO2和/或RSPO3。
31.权利要求28-30任一项的方法，其中R-spondin拮抗剂是R-spondin-易位拮抗剂。
32.一种分离的R-spondin-易位拮抗剂，其中所述R-spondin-易位拮抗剂是抗体、结合多肽、小分子或多核苷酸。
33.权利要求31的方法或权利要求32的拮抗剂，其中R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO1-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸、RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸、和/或RSPO4-易位融合多肽和/或多核苷酸。
34.权利要求33的方法或拮抗剂，其中R-spondin-易位拮抗剂结合RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸。
35.权利要求34的方法或拮抗剂，其中RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E和RSPO2。
36.权利要求34的方法或拮抗剂，其中RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。
37.权利要求34的方法或拮抗剂，其中RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。
38.权利要求34的方法或拮抗剂，其中RSPO2-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQ ID NO：71。
39.权利要求33的方法或拮抗剂，其中R-spondin-易位融合多肽和/或多核苷酸是RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸。
40.权利要求39的方法或拮抗剂，其中RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK和RSPO3。
41.权利要求39的方法或拮抗剂，其中RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。
42.权利要求39的方法或拮抗剂，其中RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。
43.权利要求39的方法或拮抗剂，其中RSPO3-易位融合多肽和/或多核苷酸包括SEQ ID NO：72和/或SEQ ID NO：73。
44.权利要求1-41任一项的方法，其中该方法进一步包括给药另外的治疗剂。
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