CN110506129B - 用于鉴定恶性肿瘤的试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了多重扩增反应试剂盒，用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，所述试剂盒包括能够扩增PTPRK(e13)‑RSPO3(e2)R‑脊椎蛋白基因融合体的引物对。还公开了鉴定患有恶性肿瘤的对象对Wnt信号转导抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括以引物对检测PTPRK(e13)‑RSPO3(e2)R‑脊椎蛋白基因融合体。

Description

用于鉴定恶性肿瘤的试剂盒及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月21日提交的新加坡临时申请号10201610735P和2017年5月19日提交的新加坡临时申请号10201704134V的优先权，其全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及分子生物学，特别是生物标志物。特别地，本发明涉及检测和定量与恶性肿瘤相关的生物标志物，所述恶性肿瘤对用Wnt信号转导途径抑制剂的治疗敏感或可能对其敏感。
发明背景
癌症是全球第二大死亡原因，2012年死亡人数为820万。数几十年来，基于群组的流行病学研究一直指导着标准医疗护理，其中并未考虑个体的遗传变异性，并且大多数的结论基于人口水平。此外，对于癌症的治疗传统上包括全身性细胞毒性化疗。化疗的一般目标是杀死正在生长或分裂的细胞，并且化疗在一些癌症患者中减轻症状，改善生活质量，并延长存活。然而，全身性细胞毒性化疗也会杀死正常的非癌细胞，从而导致许多副作用，如脱发、腹泻、恶心、呕吐、血液疾病、消化紊乱和排尿障碍。
现代个性化医疗的发展在过去十年中一直在改进。现代个性化医疗基于靶向疗法。在靶向癌症治疗中，重要的是获得关于导致癌症的改变的途径和组分的信息。个性化医疗的目标是在正确的时间对正确的患者使用具有最小或没有毒性的正确剂量的正确药物。对驱动恶性肿瘤的分子途径更好的理解导致对靶向恶性细胞初期特定分子途径的试剂的研发。希望是这些试剂能够优先杀死恶性细胞，但对正常细胞而言相对无害。
由于遗传和表观遗传变异以多种形式存在于癌症患者中，因此持续需要针对不同的癌症患者研发不同的靶向癌症疗法。还持续需要更快速和灵敏的筛查癌症患者并为癌症患者选择适当的靶向癌症疗法的方法。
发明内容
在第一方面中，本文提供一种多重扩增反应试剂盒，用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，其包括：能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白(Spondin)基因-融合体的引物对，能够扩增野生型PTPRK和/或野生型RSPO3序列的对照引物对，和/或合成寡核苷酸内部对照模板序列和能够扩增合成内部对照模板序列的内部对照引物对。
在第二方面中，本文提供了检测患有恶性肿瘤的对象中PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的方法，该方法包括：从来自对象的样品提取核酸；并用一种或多种引物对扩增核酸，其中所述引物对能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)基因-融合体；并检测扩增的核酸。
在第三方面中，本文提供了鉴定患有恶性肿瘤的对象对Wnt信号转导抑制剂的敏感性的方法，该方法包括：从来自对象的样品提取核酸；用能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的引物对扩增核酸；并当PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体被扩增时鉴定对Wnt信号转导抑制剂的敏感性。
在第四方面中，本文提供了治疗患有恶性肿瘤的患者的方法，其中所述恶性肿瘤已经根据第二或第三方面的方法鉴定。
附图说明
当结合非限制性实施例以及附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1显示了ETC-1922159在2种不同结直肠癌患者来源具有RSPO基因融合体CR2506和CR3150的皮下(s.c.)异种移植物中的作用。将肿瘤片段植入雌性Balb/c裸鼠(8-10周龄)的两肋(n＝6只动物/12个肿瘤/组)。(A)和(C)分别是以120和143mm3的平均肿瘤体积在第0天开始口服日处理，植入后35和22天，肿瘤体积图表显示来自每只动物2个肿瘤的组平均值(n＝12)；*指示第24天时1只动物死亡后来自n＝10的平均值。在尸体剖检时，切除肿瘤并单独称重(B和D)。图E和F显示了平均组体重(n＝6)，或用*标记的载剂组n＝5。该结果显示，ETC-1922159在两种异种移植物中均显示出抗肿瘤功效。
图2显示了CR3150结直肠癌PDX模型中ETC-1922159的抗肿瘤效力和耐受性。使用套管针将CR3150肿瘤由种子肿瘤(seed tumour)的片段皮下植入Balb/C裸鼠右肋。将动物分组(对于载剂组n＝12，对于剩余组n＝10)并每隔一天用载剂或ETC-1922159处理(从第17天开始，第二组中仅为n＝9)。(A)显示了每日测量的平均体重，而(B)显示了用卡尺每隔一天测量的肿瘤体积。最后一剂之后处死动物，收集肿瘤和替代组织用于生物标志物分析。所有误差线显示SEM。对于(C)，仅从每组n＝9(动物1-9)收集肿瘤湿重，星号指示P<0.001。该结果显示在具有PTPRK-RSPO3基因融合体的CR3150结直肠癌PDX模型中出现ETC-1922159的肿瘤效力和耐受性。
图3显示了不同剂量ETC-1922159的作用。最后一剂载剂或ETC-1922159后24小时由具有CR3150肿瘤的小鼠收获肿瘤(n＝3/组)并FFPE固定。在Leica BondRX自动染色机上用Ventana CONFIRM抗-Ki-67(30-9)单克隆一抗(primary monoclonal antibody)对免疫组织化学分析切片染色。用H&E对相应的切片染色以协助病理学检验。免疫组织化学染色的评估由病理学家手动和数字进行。确定的百分比是3个低视野图像的平均数。(A)显示了来自每组n＝3的Ki67染色(20x)。(B)显示了平均％Ki67染色，左侧为数字计数，而右侧为手动评估(C)。误差线显示标准差。该结果显示ETC-1922159处理以剂量依赖性的方式抑制肿瘤细胞增殖。
图4显示了PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合阳性对照质粒和内部对照质粒。
图5显示了含有PTPRK(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品(A)和含有人全部RNA的样品(C)中PTPRK(e1/e2)野生型的扩增图表。图5还显示了含有PTPRK(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品(B)和含有人全部RNA的样品(D)中内部对照的扩增图表。该结果显示了设计的PCR扩增反应可以成功地扩增含有PTPRK(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品和含有人全部RNA的样品中的PTPRK(e1/e2)野生型和内部对照质粒。
图6显示了含有RSPO3(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品(A)和含有人全部RNA的样品(C)中RSPO3(e1/e2)野生型的扩增图表。图6还显示了含有RSPO3(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品(B)和含有人全部RNA的样品(D)中内部对照的扩增图表。该结果显示了设计的PCR扩增反应可以成功地扩增含有RSPO3(e1/e2)野生型阳性对照质粒的样品和含有人全部RNA的样品中的RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照质粒。
图7显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图8显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e1/e2)野生型(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e1/e2)野生型(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图9显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中RSPO3(e1/e2)野生型(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中RSPO3(e1/e2)野生型(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图10显示了多重检测含有人全部RNA的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表(A)。图10还显示了PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)和RSPO3(e1/e2)野生型(D)单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。结果显示在人全部RNA样品中没有检测到PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体。该结果还显示扩增PTPRK(e1/e2)野生型的多重扩增反应比相同靶标的单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图11显示了多重检测含有CR3150肿瘤RNA的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表(A)。已知CR3150肿瘤包含PTPRK(e1)+RSPO3(e2)基因融合体。图11还显示了PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)和RSPO3(e1/e2)野生型(D)单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。结果显示在CR3150肿瘤RNA样品中没有检测到PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体。该结果还显示对于相同靶标，多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图12显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图13显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e7/e8)野生型(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中PTPRK(e7/e8)野生型(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图14显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中RSPO3(e1/e2)野生型(A)和内部对照质粒(C)的多重扩增图表。还显示了含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品中RSPO3(e1/e2)野生型(B)和内部对照质粒(D)的单重扩增图表。该结果显示多重扩增反应通常比单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图15显示了多重检测含有人全部RNA的样品中PPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7/e8)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表(A)。图10还显示了PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体(B)、PTPRK(e7/e8)野生型(C)和RSPO3(e1/e2)野生型(D)单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。结果显示在人全部RNA样品中没有检测到PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体。该结果还显示扩增PTPRK(e7/e8)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的多重扩增反应通常比相同靶标的单重反应更敏感，如负ΔCt值所示。
图16显示了EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合阳性对照质粒和内部对照质粒。
图17显示了EIF3E(e1/e2)野生型(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增EIF3E(e1/e2)野生型阳性对照质粒和内部对照质粒。
图18显示了RSPO2(e1/e2)野生型(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增RSPO2(e1/e2)野生型阳性对照质粒和内部对照质粒。
图19显示了多重检测含有人全部RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型和RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。结果显示在正常人全部RNA中没有检测到EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体。
图20显示了PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合阳性对照质粒和内部对照质粒。在组1中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。(A)中所示融合体C:FAM表的平均ΔCt值是0.26。(B)中所示IC77:HEX表的平均ΔCt值是-0.10。
图21显示了PTPRK(e12-e14)野生型(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增PTPRK(e12-e14)野生型阳性对照质粒和内部对照质粒。在组1中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。(A)中所示PTPRK:TxRd表的平均ΔCt值是1.72。(B)中所示IC77:HEX表的平均ΔCt值是0.11。
图22显示了多重检测含有人全部RNA的样品中PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e12-e14)野生型和内部对照的扩增图表。结果显示在正常人全部RNA中没有检测到PTPRK(e13)+RSPO3(e2)基因融合体。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图23显示了多重检测含有CR2506肿瘤RNA的样品中PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e12-e14)野生型和内部对照的扩增图表。已知CR2506肿瘤包含PTPRK(e13)+RSPO3(e2)基因融合体。相应的Ct值如下(B)所示。结果显示在CR2506肿瘤RNA样品中已经检测到PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图24显示了EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合阳性对照质粒和内部对照质粒。在组1中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。(A)中所示融合体D:FAM表的平均ΔCt值是0.61。(B)中所示IC77:HEX表的平均ΔCt值是0.43。
图25显示了EIF3E(e1/e2)野生型(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增EIF3E(e1/e2)野生型阳性对照质粒和内部对照质粒。在组1中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。(A)中所示EIF3E:TxRd表的平均ΔCt值是0.99。(B)中所示IC77:HEX表的平均ΔCt值是0.47。
图26显示了RSPO2(e1/e2)野生型(A)和内部对照(B)的扩增图表。各样品分别包含100个拷贝的内部对照质粒以及1000、100、10或1个拷贝的阳性对照质粒。该结果显示设计的PCR扩增反应可以成功地扩增RSPO2(e1/e2)野生型阳性对照质粒和内部对照质粒。在组1中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。(A)中所示RSPO2-004:Cy5表的平均ΔCt值是0.11。(B)中所示IC77:HEX表的平均ΔCt值是-0.18。
图27显示了多重检测含有人全部RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。结果显示在正常人全部RNA中没有检测到EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体和RSPO2(e1/e2)野生型。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图28显示了多重检测含有CR205肿瘤RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。相应的Ct值如下(B)所示。结果显示在CR205肿瘤RNA中没有检测到EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图29显示了多重检测含有CR210肿瘤RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。已知CR210肿瘤包含EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体。相应的Ct值如下(B)所示。结果显示在CR210肿瘤RNA中已经检测到EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图30显示了多重检测含有CR214肿瘤RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。相应的Ct值如下(B)所示。结果显示在CR214肿瘤RNA中已经检测到EIF3E(e1)+RSPO2(e2)基因融合体。在组1(A)中，使用了200nM的正向引物、200nM的反向引物和100nM的探针。在组2(B)中，使用了300nM的正向引物、300nM的反向引物和150nM的探针。
图31显示了获得的PCR产物的凝胶电泳。图5中还包括了靶标的扩增子大小。将下述样品用于泳道1-8——泳道1：无模板对照；泳道2：EIF3E(e1)+RSPO2(e2)阳性对照质粒；泳道3：EIF3E(e1/e2)野生型对照质粒；泳道4：RSPO2(e1/e2)野生型对照质粒；泳道5：人全部RNA；泳道6：CR205RNA；泳道7：CR210RNA；泳道8：CR214RNA。
图32显示了用于本申请的pUC57载体质粒图的示意图。
发明详述
众所周知，当给予癌症患者相同癌症治疗时，通常会有不同的反应，一些患者比另一些患者更加正向的反应，而一些患者完全不反应。很大程度上并不清楚造成这种差异的根本原因。因此，该领域的研究人员一直试图鉴定导致癌症患者反应中这类差异的各种原因，从而提供合适的靶向癌症疗法。在本申请中，发明人发现具有PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的患者相较于没有这类基因融合体的患者可以用Wnt信号转导途径的抑制剂更加成功地治疗。在另一示例中，发现的是具有PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的患者相较于没有这类基因融合体的患者也可以用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗。因此，检测患者样品中PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体和/或PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体可以用于鉴定适用使用Wnt信号转导途径的抑制剂的靶向疗法的患者。
在第一方面中，本发明涉及一种多重扩增反应试剂盒，用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，其包括：能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对(或扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对)；能够扩增野生型PTPRK和/或野生型RSPO3序列的对照引物对(或扩增野生型PTPRK和/或野生型RSPO3序列的对照引物对)；和/或合成寡核苷酸内部对照模板序列和能够扩增合成内部对照模板序列的内部对照引物对(或扩增合成内部对照模板序列的内部对照引物对)。在另一示例中，本文公开了一种多重扩增反应试剂盒，用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，其包括：能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对(或扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对)；能够扩增野生型PTPRK和/或野生型RSPO3序列的对照引物对(或扩增野生型PTPRK和/或野生型RSPO3序列的对照引物对)；和/或合成寡核苷酸内部对照模板序列和能够扩增合成内部对照模板序列的内部对照引物对(或扩增合成内部对照模板序列的内部对照引物对)。
本文所用术语“多重”或其语法上等同形式表示在单个扩增实验中检测和/或扩增给定样品中超过一个感兴趣的靶序列。在一个示例中，这类超过一个感兴趣的靶序列中只有一个用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，而其他感兴趣的靶序列作为对照。为了便于参考，这样的一个感兴趣的靶序列在本文所指的是“感兴趣的关键靶序列”。在多重扩增实验中，多重引物组通常用于相同的扩增反应以同时扩增多个感兴趣的靶序列。通过一次靶向多个感兴趣的序列，可以由单个扩增反应获得额外的信息，否则将需要数倍的试剂和更多的时间来进行。在一个具体实施方式中，多重表示在单个扩增实验中检测和/或扩增给定样品中的3个不同的靶序列。在另一具体实施方式中，多重表示在单个扩增实验中检测和/或扩增给定样品中的4个不同的靶序列。在其他各种实施方式中，多重表示在单个扩增实验中检测和/或扩增给定样品中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个不同的靶序列。
本文所用术语“扩增反应”表示产生靶序列其他拷贝的反应。用于分子生物学中扩增靶序列的典型扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。PCR的示例包括但不限于实时聚合酶链反应，实时逆转录聚合酶链反应，数字聚合酶链反应，定量聚合酶链反应，定性聚合酶链反应，定量实时聚合酶链反应或定量逆转录聚合酶链反应。在一个具体是实施方式中，扩增反应是实时PCR反应。
实时PCR在PCR期间监测靶向的DNA分子的扩增，即，实时的，而不是如常规PCR在其结束时。实时PCR可以定量地(定量实时PCR)和(即，高于/低于特定量的DNA分子(半定量实时PCR))半定量地使用。定量实时PCR(qrt-PCR)方法使用荧光染料或含有荧光团的DNA探针随着扩增过程测量扩增产物的量。
数字PCR(dPCR)同时扩增数千个样品，各样品位于乳液中分开的液滴中。
定量PCR(qPCR)用于测量样品中特定量的靶DNA(或RNA)。通过仅在真实的指数增长的阶段内测量扩增，测量的产物的量更准确地反映了靶标的初始量。使用在扩增期间监测产物量的特定热循环仪。
定性PCR表示用于检测样品中靶DNA(RNA)存在与否而不对存在量进行定量的PCR方法。
逆转录PCR用于逆转录并扩增RNA成cDNA。PCR之前是使用逆转录酶的反应，所述逆转录酶将RNA转化成cDNA。两个反应可以合并在一个试管内，PCR的起始加热加步骤用于使转录酶失活。RT-PCR被广泛地用于表达概况，其检测基因的表达。其可以用于获得RNA转录本的序列，RNA转录本的序列可以协助确定转录起始和终止位点并促进映射基因序列中外显子和内含子的位置。
在一些实施方式中PCR扩增涉及使用TaqMan探针。TaqMan探针是水解探针，其旨在增加定量PCR的特异性。TaqMan探针主要依赖于Taq聚合酶的5′–3′外切核酸酶活性以在与互补靶序列的杂交和基于荧光团的检测期间切割双重标记的探针。在其他定量PCR方法中，所得荧光信号能够在PCR的指数阶段定量测量产物的累积。TaqMan探针显著地增加检测的特异性。
本文所用术语“对象”表示动物，优选哺乳动物，更优选人，其已经作为治疗、观察或实验的对象。在一个示例中，对象不是人。例如，对象可以是非人类的哺乳动物。
本文所用术语“恶性肿瘤(malignancy)”表示其中异常细胞无控制地分裂并侵入附近组织的疾病。恶性疾病通常称为癌症。可以通过本文所述方法或试剂盒鉴定或治疗的癌症的主要类型包括但不限于癌(carcinoma)、肉瘤、淋巴瘤，生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。癌症的具体类型包括但不限于肺癌，黑色素瘤，结直肠癌，神经母细胞瘤，乳腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，移行细胞癌，胆管癌，脑癌，非小细胞肺癌，胰腺癌，胃癌，膀胱癌，食道癌，间皮瘤，甲状腺癌，头颈癌，骨肉瘤，肝细胞癌，原发性不明癌，卵巢癌，子宫内膜癌，胶质母细胞瘤，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些具体的示例中，通过本文所公开的方法或试剂盒鉴定或治疗的恶性肿瘤是肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、淋巴癌和神经母细胞瘤。在一个示例中，恶性肿瘤是实体恶性肿瘤。在一些示例中，恶性肿瘤是食道，胆囊，肝脏，胰腺，胃，小肠，大肠，结肠，直肠或肛门的胃肠癌。
在一个具体实施例中，恶性肿瘤是结直肠癌。在一个示例中，癌症是侵入性和/或代谢性癌症。在另一示例中，癌症是II期癌症、III期癌症或IV期癌症。在另一示例中，癌症是早期代谢性癌症。在一个示例中，早期代谢性癌症不一定是早期阶段癌症。在一些示例中，恶性肿瘤的特征在于Wnt活性水平升高。Wnt活性水平升高可以通过这样的Wnt活性限定，所述Wnt活性是不具有恶性肿瘤的对象Wnt活性水平或给定群体中不具有恶性肿瘤的对象中Wnt活性平均的至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％、或至少160％、或至少170％、或至少180％、或至少190％、或至少200％。在一些示例中，Wnt活性水平升高经转录或转录后升高。
本文所用术语“PTPRK”表示PTPRK基因，其编码人体中的K型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体。K型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员。K型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体具有胞外区，单个跨膜区和2个串联催化结构域，并且因此表示受体型PTP。胞外区包含甲基多巴-A5抗原-PTP mu(MAM)结构域、Ig样结构域和4个纤连蛋白III型重复。PTPRK也被称为PTP卡帕或PTPκ。人PTPRK基因和核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示，并且具有总计30个外显子。
本文所用术语“PTPRK(en)”表示PTPRK基因的外显子编号n。例如，本文所用术语“PTPRK(e13)”表示PTPRK基因的外显子13。人PTPRK基因的外显子13的核苷酸序列由SEQ IDNO:2表示。
本文所用术语“RSPO3”表示RSPO3基因。该基因术语R-脊椎蛋白家族，并且编码蛋白质R-脊椎蛋白-3。人RSPO3基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:3表示，并且具有总计5个外显子。
本文所用术语“RSPO3(em)”表示RSPO3基因的外显子编号m。例如，本文所用术语“RSPO3(e2)”表示RSPO3基因的外显子2。人RSPO3基因的外显子2的核苷酸序列由SEQ IDNO:4表示。
本文所用“基因融合体”表示由两个之前分离的基因形成的杂交基因。这通常是因为易位、间隙缺失或染色体倒位而出现的结果。基因融合体是在形成恶性肿瘤中起重要作用的突变形式。
本文所用术语“野生型”在基因的上下文中表示特定群体中的健康个体群体中基因最常见的基因型。野生型基因是不包含任何突变，特别是基因融合体的基因。野生型基因在多重扩增反应中用作对照。当样品中感兴趣的靶序列是基因融合体，例如，A-B基因融合体，野生型基因A和野生型基因B或其组合可以用作对照。
能够扩增靶序列的引物对(或扩增靶序列的引物对)通常包含正向引物和反向引物。能够扩增靶基因融合体的引物对(或扩增靶基因融合体的引物对)通常横跨融合位点。
在一个示例中，当靶序列包含PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体时，能够扩增靶序列的引物对(或扩增靶序列的引物对)横跨PTPRK(e13)的3'端和RSPO3(e2)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e13)的正向引物和靶向RSPO3(e2)的反向引物。在另一个示例中，引物对包含靶向PTPRK(e12/e13)的正向引物和靶向RSPO3(e2)的反向引物。人PTPRK基因的外显子12的核苷酸序列由SEQ ID NO:5表示。靶序列PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(SEQ ID NO:6)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GTCTGGGCTTACATGACAARCATC(SEQ ID NO:7)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物与序列SEQ ID NO:6或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的反向引物与序列SEQ ID NO:7或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
在一个示例中，为了检测野生型PTPRK基因，将表示为PTPRK(e12-e14)的PTPRK基因的外显子12-14用作靶序列。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨PTPRK(e12)的3'端(整个PTPRK(e13))和PTPRK(e14)的5'端。人PTPRK基因的外显子14的核苷酸序列由SEQ ID NO:8表示。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e12)的正向引物和靶向PTPRK(e14)的反向引物。在另一个示例中，引物对包含靶向PTPRK(e12/e13)的正向引物和靶向PTPRK(e14)的反向引物。靶序列PTPRK(e12-e14)的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(SEQ ID NO:9)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GCTATTTTCACCACTCTGTCYGT(SEQ ID NO:10)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e12-e14)的正向引物与序列SEQ ID NO:9或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列PTPRK(e12-e14)的反向引物与序列SEQ ID NO:10或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
在一个示例中，为了检测野生型RSPO3基因，将表示为RSPO3(e1/e2)的RSPO3基因的外显子1和2用作靶序列。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨RSPO3(e1)的3'端和RSPO3(e2)的5'端。人RSPO3基因的外显子1的核苷酸序列由SEQ IDNO:11表示。在一个具体示例中，引物对包含具有序列(5'-3')CTCYTTGGCAGCCTTGACT(SEQID NO:12)的正向引物和具有序列(5'-3')AATACATCGGCAGCCAAAACG(SEQ ID NO:13)或(5'-3')AATACMTYGGCAGCCAAAACG(SEQ ID NO:14)的反向引物。在一个示例中，靶序列RSPO3(e1/e2)的正向引物与序列SEQ ID NO:12或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在一个示例中，靶序列RSPO3(e1/e2)的反向引物与序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
本文所用术语“内部对照”表示内部阳性对照，其是这样的参照序列，该参照序列可以用于指示扩增系统是否工作，并由区分因例如PCR抑制而导致的扩增失败与真靶向阴性。内部对照包括不存在于任何自然产生的生物体的人工靶序列。
当样品中不存在内部对照时，在没有检测到测试的靶序列的扩增信号时不可能区分真阴性和假阴性。当样品中包含内部对照但是没有成功扩增，并且没有检测到测试的靶序列的扩增信号时，这表明阴性扩增结果是假阴性。当样品中包含内部对照并且被成功扩增，但是没有检测到测试的靶序列的扩增信号时，这表明阴性扩增结果是真阴性。
在一些实施方式中，内部对照包含靶序列SEQ ID NO:69的序列、其互补序列、片段或变体。在一些示例中，能够扩增内部对照靶序列的内部对照引物对(或扩增内部对照靶序列的内部对照引物对)包含含有序列(5'-3')GCGCCCGAACAGTATCGCGTTT(SEQ ID NO:16)的正向引物和含有序列(5'-3')AGCCTCCGCTAGTCACCCAA(SEQ ID NO:17)的反向引物。在一个示例中，内部对照靶序列的正向引物与序列SEQ ID NO:16或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，内部对照靶序列的反向引物与序列SEQ ID NO:17或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
具有如上所述组分的试剂盒被用于多重扩增反应，所述多重扩增反应旨在检测一个感兴趣的关键靶序列。检测一个感兴趣的关键靶序列的结果可以与检测另外一个或多个感兴趣的关键靶序列的结果合并，从而更好地鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，例如，通过降低假阳性或假阴性鉴定的比率。因此，在一些示例中，第一方面的试剂盒包括旨在进行一个或多个额外的多重扩增反应的组分。这类一个或多个额外的多重扩增反应旨在检测一个或多个R-脊椎蛋白基因融合体，例如，但不限于，PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体，PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体。因此，在一些示例中，第一方面的试剂盒还包括能够扩增一个或多个R-脊椎蛋白基因融合体的引物对(或扩增一个或多个R-脊椎蛋白基因融合体的引物对)，其中该R-脊椎蛋白基因融合体是PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体；能够扩增野生型PTPRK、野生型EIF3E、野生型RSPO2和/或野生型RSPO3序列的对照引物对(或扩增野生型PTPRK、野生型EIF3E、野生型RSPO2和/或野生型RSPO3序列的对照引物对)；和/或合成寡核苷酸内部对照模板序列和能够扩增一个或多个合成内部对照模板序列的内部对照引物对(或扩增一个或多个合成内部对照模板序列的内部对照引物对)。在优选的示例中，分开进行一个或多个多重扩增反应，从而使多重扩增反应之间的相互作用最小化。然而，藉由使用不同的可检测标记物适当使用探针，一个或多个多重扩增反应可以合并成一个反应。
本文所用术语“PTPRK(e1)”表示PTPRK基因的外显子1。人PTPRK基因的外显子1的核苷酸序列由SEQ ID NO:18表示。能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体的引物对(或扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体的引物对)横跨PTPRK(e1)的3'端和RSPO3(e2)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e1)的正向引物和靶向RSPO3(e2)的反向引物。靶序列PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物的一个具体示例包含序列(5'-3')CTSYTTTTGTGGCGYTCT(SEQ ID NO:19)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5'-3')CTCYTTGGCAGCCTTGACT(SEQ ID NO:20)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物与序列SEQ ID NO:19或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列PTPRK(e1)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的反向引物与序列SEQ ID NO:20或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
对于旨在检测感兴趣的PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体的关键靶序列的多重扩增反应，为了检测野生型PTPRK基因，将通过PTPRK(e1/e2)表示的PTPRK基因外显子1和2用作靶序列。人PTPRK基因的外显子2的核苷酸序列由SEQ ID NO:21表示。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨PTPRK(e1)的3'端和PTPRK(e2)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e1)的正向引物和靶向PTPRK(e2)的反向引物。靶序列PTPRK(e1/e2)的正向引物的一个具体示例包含序列(5'-3')CTSYTTTTGTGGCGYTCT(SEQ IDNO:22)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5'-3')CCTGGTGGTAATCACAGGS(SEQ ID NO:23)或(5'-3')CCTGGTGGTAATCACAGGC(SEQ ID NO:24)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e1/e2)的正向引物与序列SEQ ID NO:22或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在一个示例中，靶序列PTPRK(e1/e2)的反向引物与序列SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
对于旨在检测感兴趣的PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体的关键靶序列的多重扩增反应，为了检测野生型RSPO3基因，将RSPO3(e1/e2)用作靶序列。用于检测RSPO3(e1/e2)的示例性引物如上所示。
本文所用术语“PTPRK(e7)”表示PTPRK基因的外显子7。人PTPRK基因的外显子7的核苷酸序列由SEQ ID NO:25表示。能够扩增PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体的引物对(或扩增PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体的引物对)横跨PTPRK(e7)的3'端和RSPO3(e2)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e7)的正向引物和靶向RSPO3(e2)的反向引物。靶序列PTPRK(e7)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(SEQ ID NO:26)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)CTCYTTGGCAGCCTTGACT(SEQ ID NO:27)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e7)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物与序列SEQ ID NO:26或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列PTPRK(e7)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的反向引物与序列SEQ ID NO:27或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
对于旨在检测感兴趣的PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体的关键靶序列的多重扩增反应，为了检测野生型PTPRK基因，将通过PTPRK(e7/e8)表示的PTPRK基因外显子7和8用作靶序列。人PTPRK基因的外显子8的核苷酸序列由SEQ ID NO:28表示。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨PTPRK(e7)的3'端和PTPRK(e8)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向PTPRK(e7)的正向引物和靶向PTPRK(e8)的反向引物。靶序列PTPRK(e7/e8)的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)ATCCGAGTTCTRCTTACAAGACCT(SEQ ID NO:29)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)CCGTCTTGCCTGTATTTSAGC(SEQ ID NO:30)。在一个示例中，靶序列PTPRK(e7/e8)的正向引物与序列SEQ ID NO:29或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列PTPRK(e7/e8)的反向引物与序列SEQ ID NO:30或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
对于旨在检测感兴趣的PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体的关键靶序列的多重扩增反应，为了检测野生型RSPO3基因，将RSPO3(e1/e2)用作靶序列。用于检测RSPO3(e1/e2)的示例性引物如上所示。
本文所用术语“EIF3E”表示EIF3E基因，其编码真核翻译起始因子3(短形式eIF3)亚基E，该亚基是eIF3复合物的亚基，所述eIF3复合物是刺激翻译起始的复合物。在人类中，eIF3由13个不同亚基(eIF3a-m)组成。人EIF3E基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:31表示，并且具有总计13个外显子。
本文所用术语“EIF3E(ep)”表示EIF3E基因的外显子编号p。例如，本文所用术语“EIF3E(e1)”表示EIF3E基因的外显子1。人EIF3E基因的外显子1的核苷酸序列由SEQ IDNO:32表示。
本文所用术语“RSPO2”表示RSPO2基因。该基因属于R-脊椎蛋白家族，并且编码蛋白质R-脊椎蛋白-2。人RSPO2基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:33表示，并且具有总计3个外显子。
本文所用术语“RSPO2(eq)”表示RSPO2基因的外显子编号q。例如，本文所用术语“RSPO3(e2)”表示RSPO2基因的外显子2。人RSPO2基因的外显子2的核苷酸序列由SEQ IDNO:34表示。
能够扩增EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的引物对(或扩增EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的引物对)横跨EIF3E(e1)的3'端和RSPO2(e2)的5'端。在一个具体示例中，引物对包含靶向EIF3E(e1)的正向引物和靶向RSPO2(e2)的反向引物。靶序列EIF3E(e1)-RSPO2(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)TCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTYGGAGAAGGAAACTARAACC CAGT(SEQ ID NO:35)，靶序列EIF3E(e1)-RSPO2(e2)R-脊椎蛋白基因融合体正向引物的另一个具体示例包含序列(5’-3’)TCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTY(SEQ ID NO:36)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)AGTTCAGCGCGATCAGCA(SEQ ID NO:37)。在一个示例中，靶序列EIF3E(e1)-RSPO2(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的正向引物与序列SEQ ID NO:35或36或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一示例中，靶序列EIF3E(e1)-RSPO2(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的反向引物与序列SEQ ID NO:37或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
在一个示例中，为了检测野生型EIF3E基因，将表示为EIF3E(e1/e2)的EIF3E基因的外显子1和2用作靶序列。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨EIF3E(e1)的3'端和EIF3E(e2)的5'端。人EIF3E基因的外显子2的核苷酸序列由SEQ IDNO:38表示。在一个具体示例中，引物对包含靶向EIF3E(e1)的正向引物和靶向EIF3E(e2)的反向引物。靶序列EIF3E(e1/e2)的正向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)GCATCTAGTCTTTCCGCTT(SEQ ID NO:39)，相同靶序列的反向引物的一个具体示例包含序列(5’-3’)ACATCCATAGCAAAGTCTACC(SEQ ID NO:40)。在一个示例中，靶序列EIF3E(e1/e2)的正向引物与序列SEQ ID NO:39或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一个示例中，靶序列EIF3E(e1/e2)的反向引物与序列SEQ ID NO:40或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
在一个示例中，为了检测野生型RSPO2基因，将表示为RSPO2(e1/e2)的RSPO2基因的外显子1和2用作靶序列。能够扩增该靶序列的引物对(或扩增该靶序列的引物对)因此横跨RSPO2(e1)的3'端和RSPO2(e2)的5'端。人RSPO2基因的外显子1的核苷酸序列由SEQ IDNO:41表示。在一个具体示例中，引物对包含具有序列(5’-3’)ACGTGCTAACCAAGCGGCTC(SEQID NO:42)或(5'-3')TTCTGCCTTCTACAGCTCGGA(SEQ ID NO:43)的正向引物和具有序列(5’-3’)TTCAGCGCGATCAGCATCTCT(SEQ ID NO:44)或(5’-3’)AGTTCAGCGCGATCAGCA(SEQ ID NO:45)的反向引物。在一个示例中，靶序列RSPO2(e1/e2)的正向引物与序列SEQ ID NO:42或43或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。在另一个示例中，靶序列RSPO2(e1/e2)的反向引物与序列SEQ ID NO:44或45或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性。
在一些示例中，一个或多个多重扩增反应中使用的内部对照是相同的，因此，能够扩增内部对照的内部对照引物对(或扩增内部对照的内部对照引物对)也是相同的。可以使用已知的方法设计不同的内部对照和其相应的引物对。本领域技术人员可以意识到并理解的是，本领域技术人员可以根据本领域已知的信息和知识构建必需的内部对照。在一个示例中，内部对照序列为SEQ ID NO:69。
除了使用合适的引物，靶序列的扩增可以还包括使用能够结合靶序列的探针(或结合靶序列的探针)
在一些示例中，第一方面的试剂盒还包括与一个或多个R-脊椎蛋白基因-融合体中的序列，一个或多个野生型基因，或一个或多个内部对照序列互补的一个或多个探针序列。
在一个示例中，使用的探针包含具有至少一个可检测标记物的组分。在一个示例中，可检测标记物能够产生光学信号。在一个示例中，可检测标记物包含荧光团部分。荧光团的示例包括但不限于，荧光蛋白，例如，GFP(绿色荧光蛋白)，YFP(黄色荧光蛋白)，RFP(红色荧光蛋白)；选自下组的非蛋白质荧光团：氧杂蒽衍生物(例如，荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，曙红，6-羧基荧光素和德克萨斯红)；花青衍生物(例如，花青，吲哚羰花青(indocarbocyanine)，氧杂羰花青(oxacarbocyanine)，硫杂羰花青(thiacarbocyanine)和部花青(merocyanine))，方酸菁衍生物和环取代的方酸菁，包括Seta、SeTau和Square染料，萘衍生物(丹酰和氟硅酸钠衍生物)，香豆素衍生物，噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑，硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)，蒽衍生物(例如，蒽醌、DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)，芘衍生物(例如，级联蓝(cascade blue))，嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、嗪170)，吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙、吖啶黄)，芳基甲川衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀绿)，四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)和其衍生物。在一些示例中，荧光团是FAM(羧基荧光素)，HEX(羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素琥珀酰亚胺酯)，JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，琥珀酰亚胺酯)，花青3，花青5，TAMRA(5-(和-6)-羧基四甲基若丹明，琥珀酰亚胺酯)，Tye 563，Tye 556，TEX 615，LCRED640，德克萨斯红(磺基罗丹明101酸酰氯)或钙红(Cal Red)610。在一些具体示例中，荧光团是FAM、花青5、德克萨斯红、钙红610或HEX。
在检测多个靶序列的多重扩增反应中，不同的靶序列通常使用不同的可检测标记物。例如，可检测标记物A用于关键靶序列A，可检测标记物B用于野生型对照B，可检测标记物C用于野生型对照C，而可检测标记物D用于野生型对照D。在优选的示例中，不同可检测标记物的发射波长充分分离从而使干扰最小化。例如，各发生波长之间的差值是至少30nm、或至少40nm、或至少50nm、或至少60nm、或至少70nm、或至少80nm、或至少90nm、或至少100nm、或至少110nm、或至少120nm、或至少130nm、或至少140nm、或至少150nm、或至少160nm、或至少170nm、或至少180nm、或至少190nm、或至少200nm、或至少210nm、或至少220nm、或至少230nm、或至少240nm、或至少250nm、或至少260nm、或至少270nm、或至少280nm、或至少290nm、或至少300nm。在一些具体示例中，用于针对关键靶序列的探针的荧光团是FAM(羧基荧光素)，用于针对野生型对照的探针的荧光团是德克萨斯红(磺基若丹明101酸酰氯)，用于针对另一野生型对照的探针的荧光团是花青5，并且用于针对内部对照的探针的荧光团是HEX(羧基-2,4,4,5,7,7-氯荧光素琥珀酰亚胺酯)。
在一个示例中，至少一个可检测标记物能够产生可变信号(changeable signal)。可变信号可以通过将探针与靶序列杂交产生。例如，信号在探针与靶序列结合之前可以是可检测的，而在将探针与靶序列杂交后，信号的强度降低或变成完全不可检测的。在另一示例中，可检测信号只有在探针与靶序列杂交后才产生，或者可检测信号的强度可以在探针与靶序列杂交后增强。
在一个示例中，组分包含2个可检测标记物。在一个示例中，2个可检测标记物独立地作用，而在另一示例中，2个可检测标记物是标记物的相互作用对。标记物的相互作用对能够生成可变化信号。例如，信号在探针与靶序列结合之前可以是可检测的，而在将探针与靶序列杂交后，信号的强度降低或变成完成不可检测的。在另一示例中，可检测信号只有在探针与靶序列杂交后才产生，或者可检测信号的强度可以在探针与靶序列杂交后增强。在一个具体示例中，当两个可检测标记物被探针序列连接在一起时不生成可检测信号。一旦从探针切下至少一个可检测标记物，生成可检测信号。
在一些示例中，标记物的相互作用对可以包含荧光团和猝灭剂对。在一个具体示例中，荧光团位于探针的5'端，而淬灭剂位于探针的3'端。淬灭剂的示例包括但不限于TAMRA(四甲基若丹明)，
Figure BDA0002173347810000221
MGB(小沟结合剂)和BHQTM(Black Hole QuencherTM)。
可以用于多重扩增反应的一些具体示例性探针序列包括但不限于：针对PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体的
(6FAM)5'-CCAGYTCYCCKCAGTGCATCCT-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:46)，针对PTPRK(e1/e2)野生型对照的
(TxRd)5'-AAGTACAGCCACCTGCGGAGA-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:47)或
(TxRd)5'-AAGTAYAGCCAYCTGMGGAGA-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:48)，针对RSPO3(e1/e2)野生型对照的(Cy5)5'-TGCATTCTTCGCTGGCGCCTT-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:49)，针对内部对照的
(HEX)5'-AGGTCGGGTGGGCGGGTCGTTA-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:50)，针对PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体的
(6FAM)5'-ACCAGAASAAAATGTGCAGTGCATCC-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:51)，针对PTPRK(e7/e8)野生型对照的
(TxRd)5’-ATGTGCMGAACCTATGAGAACCCCAA-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:52)，针对PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合体的
(6FAM)5'-AYGCATTGCTACAAAAGTGCATCCTA-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:53)或(6FAM)5'-ACTAACGTTAGGATGCAMTTTTGTAGCAATG-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:54)，针对PTPRK(e12-e14)野生型对照的
(TxRd)5'-AYCCCAGATCCCGCCAAGCA-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:55)，针对EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的
(6FAM)5’-SCGCCACGAACCTCCTTTACAGAG-3'(BHQ1)(SEQ ID NO:56)，针对EIF3E(e1/e2)野生型对照的
(TxRd)5'-ATTGGARCTTCTTAGTGATACCAACA-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:57)，和针对RSPO2(e1/e2)野生型对照的
(Cy5)5'-CTCCCTAGGCGCSGTGCTCCATC-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:58)或
(Cy5)5'-CCACGAACCAATTGTRTCGCTTCCTG-3'(BHQ2)(SEQ ID NO:59)。
在一些示例中，第一方面的试剂盒还包括一个或多个阳性对照，各自针对感兴趣的基因融合体和野生型对照。各阳性对照通常包括含有对应感兴趣的靶序列的单一长寡核苷酸的质粒。在各多重扩增反应期间，依据测试反应设置合适的阳性对照反应，从而保证扩增反应起作用。
对应质粒图示于图31，并且插入序列可见于SEQ ID NO.59至68。
第一方面的试剂盒的引物和探针旨在扩增和检测短扩增子。短扩增子表示这样的扩增子，例如，小于约300个碱基对、小于约290个碱基对、小于约280个碱基对、小于约270个碱基对、小于约260个碱基对、小于约250个碱基对、小于约240个碱基对、小于约230个碱基对、小于约220个碱基对、小于约210个碱基对、小于约200个碱基对、小于约190个碱基对、小于约180个碱基对、小于约170个碱基对、小于约160个碱基对、小于约150个碱基对、小于约140个碱基对、小于约130个碱基对、小于约120个碱基对、小于约110个碱基对、小于约100个碱基对、小于约90个碱基对、小于约80个碱基对、小于约70个碱基对、小于约60个碱基对或小于约50个碱基对的扩增子。短扩增子的具体示例具有小于150个碱基对、小于140个碱基对、小于130个碱基对、小于120个碱基对、小于110个碱基对或小于100个碱基对。在一个具体示例中，短扩增子小于130个碱基对。
在一些示例中，第一方面的试剂盒还包含用于进行聚合酶链式反应的试剂。这类试剂包括但不限于脱氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶、盐和缓冲液。DNA聚合酶通过添加与模板链互补的碱基来催化向延长的DNA链添加dNTP。
在第二方面中，本文提供了检测患有恶性肿瘤的对象中PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的方法，该方法包括：从来自对象的样品提取核酸；并用一种或多种引物对扩增核酸，其中所述引物对能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)基因-融合体；并检测扩增的核酸。在一些示例中，第二方面的方法还包括用能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和/或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个引物对(或扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和/或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个引物对)扩增核酸。
在第三方面中，本文提供了鉴定患有恶性肿瘤的对象对Wnt信号转导抑制剂的敏感性的方法，该方法包括：从来自对象的样品提取核酸；用能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的引物对(扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的引物对)扩增核酸；并当PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体被扩增时鉴定对Wnt信号转导抑制剂的敏感性。在一些示例中，第三方面的方法还包括用能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个其他引物对(或扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个其他引物对)扩增核酸；和鉴定当PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体被扩增时对Wnt信号转导抑制剂的敏感性。
能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和/或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的引物和引物对(或扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和/或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的引物和引物对)在本公开中描述。
对于各多重扩增反应，至少设置下述反应(和其重复)：针对各基因融合体和野生型对照的阳性对照反应、阴性对照反应和测试反应。所有反应包含相同的试剂、引物和/或探针，唯一的区别是各反应中添加的样品。阳性对照反应中添加的样品是如上所限定的针对靶基因融合体或野生型序列的阳性对照。添加到阴性对照的样品不包含任何模板。添加到阴性对照的典型样品是不含核酸酶的水。添加到测试反应的样品是获自感兴趣对象的生物样品。在一个示例中，融合体A以3-重运行(例如，融合体A和2WT)。在另一示例中，融合体B以2-重运行(例如，融合体B和WT)。同样在另一示例中，融合体C以2-重运行(例如，融合体C和WT)。在另一示例中，融合体C以2-重运行(例如，融合体C+WT PTPRK)。在其他示例中，融合体D以3-重运行(例如，融合体D和WT)。同样在另一示例中，融合体D以3-重运行(例如，融合体D和WT EIF3E和WT RSPO2)。
在一示例中，生物样品包含至少一些生物材料，如核酸分子，特别是核糖核酸(RNA)。在一些示例中，生物样品包含获自固体组织样品或液体样品(如全血，血清，血浆，脑脊液，中央脊髓液，淋巴液，囊液，痰液，粪便，胸腔积液，粘液，胸水，腹水，羊水，腹腔液，唾液，支气管冲洗液和尿液)的RNA。在一些具体示例中，生物样品包含获自肿瘤组织(诸如福尔马林固定的肿瘤组织，石蜡包埋(FFPE)固定的肿瘤组织或来自新鲜冷冻肿瘤的组织)的RNA。
使用第一方面的试剂盒进行的各多重扩增反应的结果可以使用已知的多重扩增反应分析方法分析。当使用的扩增反应是实时聚合酶链反应(实时PCR)时，实时PCR反应的结果主要使用Ct值分析。
术语“Ct值”或循环阈值在本文中可互换使用，表示反应中产生的荧光超过荧光阈值的循环数，显著地高于背景荧光的荧光信号。阈值循环时，在反应的早期指数阶段期间已产生可检测量的扩增子产物。阈值循环与感兴趣基因的原始相对表达水平成反比。
在实时PCR反应中，可以基于扩增曲线和荧光阈值容易地获得Ct值。扩增曲线是针对样品的稀释系列获得的半对数曲线，并且Y轴表示对数标度的荧光水平，X轴表示循环数。扩增曲线具有初始期，指数期和平台期。
基于多重扩增反应中各感兴趣的靶序列的扩增曲线，可以获得各感兴趣的靶序列的Ct值。感兴趣的靶基因融合体序列的Ct值表示为Ctt，感兴趣的靶野生型对照序列的Ct值表示为Ctc。当使用超过一个野生型对照时，不同的Ctc值表示为Ctc1、Ctc2等。感兴趣的靶基因融合体和感兴趣的靶野生型对照序列的Ct值之间的差值表示为ΔCt，即ΔCt＝Ctt-Ctc。当使用超过一个野生型对照时，不同的ΔCt值可以表示为ΔCt1、ΔCt2等。各基因融合体的ΔCt表示样品内融合体的比例。
各阳性对照反应的Ct值必须落入预定的Ct值范围，从而保证适当地设置多重扩增反应。例如，当阳性对照反应是感兴趣的靶基因融合体的阳性对照时，感兴趣的靶基因融合体的Ct值必须落入预定的Ct值范围内；当阳性对照反应是感兴趣的靶野生型基因的阳性对照时，感兴趣的靶野生型基因的Ct值必须落入预定的Ct值范围内。Ct值范围通常是约15至约40，或约16至约39，或约17至约38，或约18至约37，或约19至约36，或约20至约35，或约21至约34，或约22至约33，或约23至约32，或约24至约31，或约25至约30，或约26至约29，或约27至约28。如果阳性对照的Ct值落在预定的范围外，那么认为阳性对照反应是失败的。
阴性对照反应中感兴趣的靶基因融合体和感兴趣的靶野生型基因的Ct值应当高于约40，从而保证在反应设置中不存在污染。阴性对照反应中内部对照的Ct值必须落入预定的Ct值范围。Ct值范围通常是约15至约40，或约16至约39，或约17至约38，或约18至约37，或约19至约36，或约20至约35，或约21至约34，或约22至约33，或约23至约32，或约24至约31，或约25至约30，或约26至约29，或约27至约28。如果阴性对照反应中的内部对照的Ct值落在预定的范围外，那么认为阴性对照反应是失败的。
当上述阳性对照反应和阴性对照反应中的任一项失败时，不应当使用来自所有测试反应的结果。当上述阳性对照反应和阴性对照反应两种成功设置时，将获自测试反应的结果用于样品分析。
在各测试反应中，内部对照反应的Ct值必须落入预定的Ct值范围。Ct值范围通常是约15至约40，或约16至约39，或约17至约38，或约18至约37，或约19至约36，或约20至约35，或约21至约34，或约22至约33，或约23至约32，或约24至约31，或约25至约30，或约26至约29，或约27至约28。如果一个特定测试反应中的内部对照的Ct值落在预定范围外，那么认为测试反应是失败的，并且在分析样品时应当忽略获自该测试反应的结果。
在测试反应中，如果感兴趣的靶基因融合体的Ct值(即，Ctt)落在预定的Ct值范围内，那么认为测试反应对感兴趣的靶基因融合体呈扩增阳性。如果Ctt落在预定的Ct值范围的上限之上，那么认为测试反应对感兴趣的靶基因融合体呈扩增阴性。相似地，如果感兴趣的靶向野生型对照的Ct值(即，Ctc1、Ctc2等)落在预定的Ct值范围内，那么认为测试反应对感兴趣的靶野生型对照呈扩增阳性。如果Ctc1和/或Ctc2等落在预定的Ct值范围的上限之上，那么认为测试反应对感兴趣的靶野生型对照呈扩增阴性。Ct值范围通常是约15至约40，或约16至约39，或约17至约38，或约18至约37，或约19至约36，或约20至约35，或约21至约34，或约22至约33，或约23至约32，或约24至约31，或约25至约30，或约26至约29，或约27至约28。
当测试反应对感兴趣的靶基因融合体呈扩增阴性时，将进行测试的对象鉴定为未患有对用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤。当测试反应对感兴趣的靶基因融合体和感兴趣的靶野生型对照两者呈扩增阳性时，将如上所定义的ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)用于确定进行测试的对象是否患有对用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤。
当ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)处于或低于截止值时，将进行测试的对象鉴定为患有对用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤。当ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)高于截止值时，将进行测试的对象鉴定为未患有对用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤。
测试反应的结果可以用于癌症检测。当测试反应对感兴趣的靶基因融合体呈扩增阴性时，将进行测试的对象鉴定为未患有癌症。当测试反应对感兴趣的靶基因融合体和感兴趣的靶野生型对照两者呈扩增阳性时，将如上所定义的ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)用于确定进行测试的对象是否患有癌症。当ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)处于或低于截止值时，将进行测试的对象鉴定为患有癌症。当ΔCt值(或ΔCt1、ΔCt2等)高于截止值时，将进行测试的对象鉴定为未患有癌症。
使用本文所公开的试剂盒进行的多重扩增反应允许结果能够在短时间内用于分析，其通常比2天、或1天、或22小时、或20小时、或18小时、或16小时、或12小时、或10小时、或8小时、或6小时、或4小时、或2小时短。
在第四方面，本文提供了治疗患有恶性肿瘤的对象的方法，该方法包括使用第一方面的试剂盒或第二或第三方面的方法鉴定恶性肿瘤；和用Wnt信号转导途径的抑制剂治疗对象。本文还提供了Wnt信号转导途径的抑制剂在制备用于治疗对用Wnt信号转导途径的抑制剂敏感的恶性肿瘤的药物中的用途，其中恶性肿瘤使用第一方面的试剂盒或第二或第三方面的方法鉴定。
抑制剂与酶的结合以及随后从酶释放的量度是“IC50”值，该值反映抑制剂浓度，其在给定的底物浓度导致50％酶活性。
本文所用术语“治疗有效量”表示这样的活性化合物或药剂的量，所述活性化合物或药剂将在组织系统、动物或人中引起研究人员、兽医、医生或其它临床工作人员所寻求的生物学或医学反应，包括减轻进行治疗的疾病或病症的症状。
本文所用术语“药学上可接受的”涵盖人和兽医用途：例如，术语“药学上可接受的”涵盖兽医可接受的化合物或人类医学和健康护理中可接受的化合物。在一个示例中，人类医学和健康护理被排除。
术语“任选地被取代”表示可以存在一个或多个取代基或可以不存在取代基。上述基团(烷基、芳基、杂芳基、非芳香环)上可以存在或不存在取代基。根据基团的结构，基团上可以存在0、1、2、3或4或多于4个取代基。可能的取代基包括卤素(例如，氟、氯或溴)，烷基，烷氧基(即O-烷基，其中烷基如上所定义)，芳氧基(即O-芳基，其中芳基如上所定义)，酯，酰胺或磺酸酯基团(即CO2R、CONHR、SO3R，其中R是如上定义的烷基)，但是，可以任选地或另外地存在其他取代基。在显示取代基的情况下，术语“任选地被取代”表示未显示的其他取代基的可能性。因此，例如在结构I中，当述及Ar是“任选地被取代”时，这表明除了Cy和NR5之外还有取代基的可能性，但这并不意味着Cy或NR5可能不存在的可能性。因此，例如，在述及Ar是“二取代的”芳环的情况中，这应理解为在环上仅存在两个取代基，即除Cy和酰胺氮之外不存在其他取代基。例如，化合物1中的1,4-亚苯基被认为是“二取代的”。
在本说明书的描述和权利要求书中，除非另有说明，表述“烷基”表示C1-12烷基或超过C1-12烷基，合适地是C1-6烷基，例如C1-4烷基。烷基可以是直链或支链的。合适的烷基包括，例如，甲基，乙基，丙基(例如，正丙基和异丙基)，丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)，戊基(例如，正戊基)，己基(例如，正己基)，庚基(例如，正庚基)，辛基(例如，正辛基)，异辛基，癸基和十二烷基。例如，在表述“烷氧基”、“卤代烷基”和“硫代烷基”中的表述“烷”应当根据“烷基”的定义来解释。示例性的烷氧基包括甲氧基，乙氧基，丙氧基(例如，正丙氧基)，丁氧基(例如，正丁氧基)，戊氧基(例如，正戊氧基)，己氧基(例如，正己氧基)，庚氧基(例如，正庚氧基)和辛氧基(例如，正辛氧基)示例性硫代烷基包括甲硫基-。示例性卤代烷基包括氟代烷基，例如，CF3。在某些情况中，它们可能含有环状结构。示例性的环状结构基团包括环己基，甲基环己基，异丙基环戊基，环丁基乙基等。在某些示例中，它们不是笼状结构，如金刚烷基。
除非特别限定，表述“烯基”表示C2-12烯基，合适地是C2-6烯基，例如，C2-4烯基，其在任何所需位置含有至少一个双键并且不含任何三键。烯基可以是直链或支链的。包含一个双键的示例性烯基包括丙烯基和丁烯基。包含两个双键的示例性烯基包括戊二烯基，例如(1E,3E)-戊二烯基。
除非特别限定，表述“炔基”表示C2-12炔基，合适地是C2-6炔基，例如，C2-4炔基，其在任何所需位置含有至少一个三键并且还可以含有或者可以不含有一个或多个双键。炔基可以是直链或支链的。示例性的炔基包括丙炔基和丁炔基。
表述“亚烷基”表示式-(CH2)n-的链，其中n是整数，例如1-12、1-6、2-6或2-5，除非特别限定。
除非特别限定，表述“环烷基”表示C3-10环烷基(即3至10个环碳原子)，更合适地是C3-8环烷基，例如，C3-6环烷基。示例性的环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。环碳原子最合适数量是3至6个。
除非特别限定，表述“环烯基”表示C3-10环烯基(即3至10个环碳原子)，合适地是C5-10环烯基(即5至10个环碳原子)，更适合地为C5-8环烯基，例如，C5-6环烯基。示例性的环烯基包括环丙烯基，环己烯基，环庚烯基和环辛烯基。环碳原子最合适数量是5至6个。
除非特别限定，表述“碳环基”表示任何环系统，其中所有的环原子是碳并且含有3至12个环碳原子，合适地是3至10个碳原子，更合适地在3至8个碳原子。碳环基可以是饱和的或部分不饱和的，但不包括芳环。碳环基的示例包括单环、双环和三环系统，特别是单环和双环系统。其他碳环基包括桥环系统(例如双环[2.2.1]庚烯基)。碳环基的具体示例是环烷基。碳环基的另一个示例是环烯基。
除非特别限定，表述“杂环基”和“非芳香环”可在说明书中可互换使用，表示其中一个或多个(例如1、2或3个)环原子被杂原子取代的碳环基。环可以具有4至8个环原子，通常为5或6个。杂原子通常选自N、S和O。杂环基的具体示例是环烷基(例如，环戊基或更具体地是环己基)，其中一个或多个(例如1、2或3个，特别是1或2个，尤其是1个)环原子被选自N、S或O的杂原子取代。含有一个杂原子的示例性杂环基包括吡咯烷，四氢呋喃和哌啶，并且示例性的含有两个杂原子的杂环基包括吗啉和哌嗪。杂环基的另一具体示例是环烯基(例如，环己烯基)，其中一个或多个(例如1、2或3个，特别是1或2个，尤其是1个)环原子被选自N、S和O的杂原子取代。这类基团的一个示例是二氢吡喃基(3,4-二氢-2H-吡喃-2-基-)杂环基可以通过碳环原子或氮环原子与分子的一个或多个其他部分连接。结构(I)中的基团Cy可以是这类环的一个示例。
除非特别限定，表述“芳基”表示C6-12芳基，合适地是C6-10芳基，更合适地是C6-8芳基。芳基将含有至少一个芳环(例如一个、两个或三个环)。具有多个芳环的芳基包括通过一个单键彼此连接的芳环和稠合芳环。具有一个芳环的典型芳基的示例是苯基。具有两个稠合芳环的典型芳基的示例是萘基。具有两个直接连接的芳环的芳族基团的示例是联苯基。除非另有说明，芳基可具有任何合适的取代模式，例如邻位、间位、对位。除非另有说明，否则它们可具有任何适当数量的取代基(例如，单环芳族化合物可具有1至5个取代基，稠合双环芳族化合物可具有1至7个取代基等)。
除非特别限定，表述“杂芳基”表示芳基残基，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个，合适地1、2或3个)环原子被杂原子取代，所述杂原子通常(独立地)选自N、S和O，或者含有一个或多个(例如1、2、3或4个，合适的1、2或3个)环原子的5元芳环，所述杂原子通常选自N、S和O。杂芳基不具有氮以外的环杂原子。杂芳基通常具有5或6个环原子，除非它们是双环或多环的。除非另有说明，否则它们可具有任何合适的取代模式并且可具有任何适当数量的取代基。杂芳基可以是单环或双环或多环的。稠合环可各自为杂芳基环或均芳基环，条件是至少一个是杂芳基。具有一个杂原子的示例性单环杂芳基包括：五元环(例如，吡咯、呋喃、噻吩)；和六元环(例如，吡啶，例如吡啶-2-基，吡啶-3-基和吡啶-4-基)。具有两个杂原子的示例性单环杂芳基包括：五元环(例如，吡唑，噁唑，异噁唑，噻唑，异噻唑，咪唑，如咪唑-1-基，咪唑-2-基，咪唑-4-基)；和六元环(例如，哒嗪，嘧啶，吡嗪)。具有三个杂原子的示例性单环杂芳基包括：1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,3-噁二唑和1,2,4-噁二唑。具有四个杂原子的示例性单环杂芳基包括四唑。示例性的双环杂芳基包括：吲哚(例如，吲哚-6-基)，苯并呋喃，苯并噻吩，喹啉，异喹啉，吲唑，苯并咪唑，苯并噻唑，喹唑啉和嘌呤。杂芳基可以通过碳环原子或氮环原子与分子的一个或多个其他部分连接。
在适当的情况下，上述芳基和杂芳基可任选地被一个或多个(例如1、2或3个，合适的1或2个)基团取代，所述基团各自独立地选自单价或多价(即具有大于1的化合价)官能团。合适的取代基包括烷基，烯基，炔基，卤代烷基，-烷氧基(例如，OMe)环烷基，烯氧基-，炔氧基-，烷氧基烷基-，硝基，卤素(例如，氟、氯和溴)，氰基，羟基，氧代，-C(O)-烷基(例如，COMe)，C(O)OH，-C(O)O烷基(例如，-C(O)OMe)，-OC(O)烷基(例如，-OC(O)Me)，-NH2，-NH烷基(例如，-NHMe)，-N(烷基)2(例如，二甲氨基-)，-C(O)NH2，-C(O)NH(烷基)(例如，-C(O)NHMe)，-NHC(O)烷基(例如，-NHC(O)Me)，-C(NH)NH2，硫代烷基(例如，-硫代甲基)，-SO2烷基(例如，SO2Me)，-SO烷基(例如，-SOMe)，-SO2环烷基和-SO环烷基。更典型地，取代基将选自烷基(例如，Me)，氟代烷基(例如CF3和CHF2)，烷氧基(例如，OMe)，卤素和羟基。
除非特别限定，表述“-烷基芳基”表示经由亚烷基部分例如C1-4亚烷基部分连接的芳基残基。这类基团的一个示例是苄基：PhCH2-。
术语“卤素”或“卤代”包括氟(F)、氯(Cl)和溴(Br)。
术语“氨基”指-NH2基团。
术语“氧代”是指氧原子，其与其取代的碳原子一起形成羰基C＝O。
术语“-芳基杂环基”是指经由芳基部分连接的杂环基残基。
术语“键”是化合物或分子中原子之间的连接。键可以是单键、双键或三键。
立体异构体：
要求保护的化合物的所有可能的立体异构体都包括在本发明中。
当本发明化合物具有至少一个手性中心时，它们可因此作为对映体存在。当化合物具有两个或更多个手性中心时，它们可另外作为非对映异构体存在。应当理解的是，所有这些异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
立体异构体的制备和分离：
当制备本发明化合物的方法产生立体异构体混合物时，这些异构体可通过常规技术如制备色谱法分离。可以外消旋形式制备化合物，或者可以通过对映特异性合成或通过拆分制备单个对映体。例如，可以通过标准技术将化合物拆分成它们的组分对映体，如通过与光学活性酸如(-)-二-对-甲苯酰基-d-酒石酸和/或(+)-二-对-甲苯甲酰基-1-酒石酸的盐形成来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱。也可以通过形成非对映酯或酰胺来拆分化合物，然后进行色谱分离并除去手性助剂。或者，可以使用手性HPLC柱分离化合物。
药学上可接受的盐：
考虑到游离化合物与其盐或溶剂化物形式之间的密切关系，无论何时在本文中提及化合物，也意指相应的盐、溶剂化物或多晶型物，条件是在该情况下是可能或适当的。
适用于医学的式(I)化合物的盐和溶剂化物及其生理学功能衍生物是其中抗衡离子或相关溶剂是药学上可接受的那些。然而，具有非药学上可接受的抗衡离子或相关溶剂的盐和溶剂化物在本发明的范围内，例如，用作制备其他化合物及其药学上可接受的盐和溶剂化物的中间体。
根据本发明合适的盐包括以有机和无机酸或碱形成的盐。药学上可接受的酸加成盐包括由盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，柠檬酸，酒石酸，磷酸，乳酸，丙酮酸，乙酸，三氟乙酸，三苯乙酸，氨基磺酸，磺胺酸，琥珀酸，草酸，富马酸，马来酸，苹果酸，扁桃酸，谷氨酸，天冬氨酸，草酰乙酸，甲磺酸，乙磺酸，芳基磺酸(例如，对甲苯磺酸，苯磺酸，萘磺酸或萘二磺酸)，水杨酸，戊二酸，葡萄糖酸，三羧酸，肉桂酸，取代的肉桂酸(例如，苯基，甲基，甲氧基或卤代肉桂基，包括4-甲基和4-甲氧基肉桂酸)，抗坏血酸，油酸，萘甲酸，羟基萘甲酸(例如，1-或3-羟基-2-萘甲酸)，萘丙烯酸(例如，萘-2-丙烯酸)，苯甲酸，4-甲氧基苯甲酸，2-或4-羟基苯甲酸，4-氯苯甲酸，4-苯基苯甲酸，苯丙烯酸(例如，1,4-苯二丙烯酸)，羟乙磺酸，高氯酸，丙酸，乙醇酸，羟基乙磺酸，双羟萘酸，环己烷氨基磺酸，水杨酸，糖精酸和三氟乙酸形成的那些。药学上可接受的碱盐包括铵盐，碱金属盐如钠和钾盐，碱土金属盐如钙和镁盐，以及与有机碱如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺形成的盐。
本发明化合物的所有药学上可接受的酸加成盐形式都包括在本发明的范围内。
多晶型晶体形式：
此外，化合物的一些结晶形式可以作为多晶型存在，并且因此旨在包括在本发明中。此外，一些化合物可以与水(即水合物)或常见的有机溶剂形成溶剂化物，并且这类溶剂化物也旨在包括在本发明的范围内。包括其盐的化合物也可以其水合物的形式获得，或者包括用于结晶的其它溶剂。
前药：
本发明在其范围内还包括本发明化合物的前药。通常，这种前药是化合物的功能性衍生物，其易于在体内转化成所需的治疗活性化合物。因此，在这些情况中，本发明的治疗方法，术语“给药”应包括以一种或多种要求保护的化合物的前药形式描述的各种病症的治疗，但是在给予对象后体内转化为上述特定的化合物。
保护基团：
在本发明化合物的制备过程的任意期间，可能需要和/或希望保护任意关注分子上的敏感基团或反应基团。这可以通过常规保护基团实现。可使用本领域已知方法在方便的后续阶段中除去保护基团。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含治疗有效量要求保护的化合物的产品，以及直接或间接由要求保护的化合物的组合产生的任何产品。
盖仑制剂的运载体和添加剂：
可以添加到混合物中的运载体包括必需和惰性药物赋形剂，包括但不限于合适的粘合剂，悬浮剂，润滑剂，食用香料(flavorant)，甜味剂，防腐剂，包衣，崩解剂，染料和着色剂。
因此，对于液体口服制剂如混悬剂、酏剂和溶液剂，合适的运载体和添加剂可以有利的包括水、乙二醇、油、醇、芳香剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等；对于固体口服制剂如粉末剂、胶囊、软胶囊和片剂，合适的运载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
作为可靶向药物运载体的可溶性聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚，聚羟乙基天冬酰胺-苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。而且，本发明的化合物可以偶联至一类适用于实现药物的控释的可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、以及水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
合适的粘合剂包括但不限于淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯树胶，黄蓍胶或油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。
崩解剂包括但不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶等。
现在将公开具有结构(I)的Wnt抑制剂的示例性、非限制性实施方式。
本公开提供了具有结构(I)的Wnt抑制剂：
Figure BDA0002173347810000341
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地可以是H或烷基；
D可以选自H，卤素，烷基，环烷基，芳基和二烷基氨基，各自(除H和卤素外)任选地被取代；
Ar可以是芳基或杂芳基，各自任选地被取代；
Cy可以是含有至少一个杂原子的芳基，杂芳基或饱和环，各自任选地被取代；和
n可以是1至3的整数。
在一些示例中，如果n＝1并且R3和R4中的一个是甲基而另一个是H，那么该化合物的立体化学如局部结构(II)所示：
Figure BDA0002173347810000342
在一些具体示例中，n＝1并且R3和R4中的一个是甲基而另一个是H，并且该化合物的立体化学如局部结构(II)所示。
下文中称为结构(I)的化合物5的化合物(也简称为ETC-1922159或ETC-159)明确地包括在具有结构(I)的Wnt抑制剂的范围内。结构(I)的化合物5进一步已知为如下定义的结构(IV)的化合物。
Figure BDA0002173347810000351
以下特定选项可以单独地或以任何合适的组合与具有结构(I)的Wnt抑制剂联用。
R1和R2可以独立地为甲基或乙基。它们可能都是甲基。R3和R4可以都是H。它们可以都是烷基，例如甲基或乙基。R3和R4中的一个可以是烷基(例如，甲基或乙基)而另一个是H。R5可以是氢。它可以是甲基或可以是一些其他烷基。
如果Ar是6元环，那么它可以是1,4-二取代的。如果Ar是5元环，那么它可以是1,3-二取代的。Ar可以是不是1,2-二取代的环。在本文中，“二取代的”是指Cy和NR5的取代。
Ar可以是二取代的苯环(即亚苯基环)，二取代的噻吩环或具有1至4个氮原子的二取代的氮杂环。它可以是具有0至2个氮原子的6元芳环。它可以是不是2-噻唑基环的环。它可以是哒嗪环，例如，哒嗪-3,6-二基。
Cy可以是具有0至2个氮原子，0或1个硫原子和0或1个氧原子的5或6元芳环。或者，它可以是哌嗪。哌嗪可以在两个氮原子上被取代。Cy可能不含氯。它可以是不是氯苯基的基团(额外任选地被取代)。在一些示例中，化合物I不含氯。
n可能是1。
D可能是H。
调节可能是抑制。
在具体示例中，R1和R2都是甲基。R3、R4、R5和D都是H，并且n是1。在该示例的具体实例中，Ar是具有1或2个氮原子且除Cy和酰胺氮之外没有取代基的6元环，它们在环上处于1,4-关系。
在Wnt抑制剂的结构(I)和(II)中，n可以是1至5。其可以是1至3。其可以是1、2、3、4或5中的任何一个。取代基D可以是H，卤素，烷基，环烷基，芳基或二烷基氨基，各自(除H和卤素外)任选地被取代。示例包括氢，氯，溴，甲基，乙基，丙基，环丙基，苯基，三氟甲基，二甲基氨基，N-哌啶基，N-哌嗪基，N-甲基-N'-哌嗪基等。
在许多示例中，n是1。
在某些情况中，取代基R3和R4是相同的，而在其他情况下它们是不同的。如果它们是不同的，那么它们会在它们连接的碳原子上产生立体化学。通常，该碳(或各碳)处的立体化学可以是(S)或(R)。在n为1且R3和R4中的一个为H且另一个为烷基的具体示例中，优选的立体化学如结构(II)所示，其中Me可代表烷基。在烷基为甲基的情况中，这种立体化学是特别优选的。
结构(I)中的基团Ar的示例包括1,4-亚苯基，2,5-吡啶二基，3,6-哒嗪二基，2,5-吡嗪二基，2,5-噻吩二基，2,4-噻吩二基，2,5-呋喃二基，2,4-呋喃二基等。结构(I)中的基团Cy的示例包括苯基，噻唑-2-基，噻吩-2-基，噻吩-3-基，吡啶-1-基，吡啶-2-基，吡啶-3-基，哒嗪-3-基，哒嗪-4-基，嘧啶-2-基，嘧啶-4-基，嘧啶-4-基，N-咪唑基，2-、4-或5-噻唑基，2-、4-或5-噁唑基，N-吗啉基或N'取代的N-哌嗪基。哌嗪基取代基N'位上合适的取代基包括–C(＝O)X，其中X是叔丁氧基，新戊基，甲基，苯基，对氯苯基，苄基，α,α-二氟苄基，氯苄基，氟苄基等。
在一些示例中，R1和R2是相同的。它们可能都是甲基。它们可能都是乙基。在后一种情况中，Ar可以是1,4-亚苯基，而Cy可以是噻吩-3-基。
在一些示例中，D是H。在其他示例中，D可以是甲基，环丙基，三氟甲基，苯基，二甲基氨基，吗啉基-N-基，噻吩-3-基或溴。如果D不是H(例如，是甲基，环丙基，三氟甲基，苯基，二甲基氨基，吗啉-N-基，噻吩-3-基或溴)，Ar可以是1,4-亚苯基，而Cy可以是噻吩-3-基。
在一些示例中，n是1，而在其他中它是2或3。如果n为2或3，那么Ar可以为1,4-亚苯基，而Cy可以为噻吩-3-基或噻唑-2-基。
在一些示例中，R3和R4均为H或均为甲基。在其他示例中，一个是H，另一个是甲基或乙基。如果它们都不是H，那么Ar可以是1,4-亚苯基。或者，如果它们都不是H，那么Ar是1,4-亚苯基或Cy是苯基或者是噻唑-2-基。
在一些示例中，R5是H。
在一些示例中，Ar是1,4-亚苯基，而Cy是噻吩-3-基或噻唑-2-基。在句式示例中，Ar是1,4-亚苯基，而Cy是噻吩-3-基。
在具体示例中，R1和R2都是Me，D是H，n是1，并且R3和R4都是H。在该示例中，优选地是如果Ar是1,4-亚苯基，那么Cy不是噻吩-3-基。在该示例的变形中，R1和R2都不是甲基，或者D不是H，或者n不是1，或者R3和R4不都是(任选地超过一个，并且在特定情况下，这些都适用)，并且Ar是1,4-亚苯基，而Cy是噻吩-3-基或噻唑-2-基(任选地Ar是1,4-亚苯基，而Cy是噻吩-3-基)。
在一些示例中，如结构(I)所限定的化合物7、13、27、28、39、42、43、44、58、65、71、80和83中的任一个或多个，任选地所有，可以排除在本发明的范围。在一些示例中，化合物8、12、55和85中任一个或多个，任选地所有，可以被排除。
在一些示例中，Ar和Cy不都是任选地被取代的苯环。在一些示例中，Ar和Cy中的至少一个是杂芳族或非芳族的。在一些示例中，Ar和Cy中的至少一个是杂芳族的。
在一些示例中，如果Ar是1,4-亚苯基或2,5-吡啶基，那么Cy具有不超过1个环氮原子。在其他示例中，如果Ar是5-元环，那么它不是噁唑二基。在其他示例中，如果Ar是5-元环，那么它可以是噻吩二基，例如，噻吩-2,4-二基。在本说明书的上下文中，述及“如果A然后B”应当指示A不是这样或者A和B都是这样的可能性。因此，例如，“如果Ar是5元环，它可以是噻吩二基”的陈述可以理解为要么Ar不是5元环，要么Ar是噻吩二基环。在这种情况下，Ar可以是例如吡啶二基环，但不能是呋喃二基环。
本公开可以具体地包括具有结构(I)的2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺游离碱基的无水形式，含有该游离碱无水形式的药物组合物以及在某些医学病症的治疗中使用无水形式的游离碱的方法。结构(I)的该化合物2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺或2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺被进一步标记为结构(IV)的化合物，其中也称为结构(I)的化合物5(ETC-159)。
关于结构(I)的2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，对优选的化学形式——游离碱进行了初步研究，并表明多晶现象普遍存在，发现取决于制造条件，该化合物采用一种以上的结晶形式。此外，观察到水分含量因批次而异。
因此，制备了结构(I)的2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺的单多晶型，其克服或改善了一个或多个上述问题。
本公开因此包括结构(I)的2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7)-n-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺游离碱基的无水形式(非水合单多晶型物)。
无水游离碱可以是结晶的。结晶无水游离碱在X射线衍射上在22.2°±0.5°处显示2θ标度的峰。其还在5.5°±0.5°和14.2°±0.5°处显示2θ标度的X射线衍射峰。具体地，其在X射线衍射上下述处显示2θ标度的至少4个峰：5.5°±0.5°和12.5°±0.5°，14.2°±0.5°，16.7°±0.5°，17.7°±0.5°，18.8°±0.5°，22.4°±0.5°，24.2°±0.5°和31.7°±0.5°。特别地，其在2θ标度和5.5°±0.5°和12.5°±0.5°，14.2°±0.5°，16.7°±0.5°，17.7°±0.5°，18.0°±0.5°，18.8°±0.5°，19.6°±0.5°，20.6°±0.5°，22.4°±0.5°，24.2°±0.5°，24.4°±0.5°，25.0°±0.5°，27.0°±0.5°，27.6°±0.5°，29.8°±0.5°，31.7°±0.5°和32.2°±0.5°处显示X射线衍射峰。
应当理解的是，上述各种示例中设定的许多(尽管不是全部)限制可以组合用，并且本发明在它们可行的情况中明确地考虑了这种组合。
具有结构(I)的Wnt抑制剂的具体(但非限制性)示例如下：
Figure BDA0002173347810000391
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Figure BDA0002173347810000401
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Figure BDA0002173347810000411
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Figure BDA0002173347810000461
现在将公开具有结构(III)的Wnt抑制剂的示例性、非限制性实施方式。本公开提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂或其药学上可接受的盐，溶剂化物或多晶型物，包括其所有互变异构体和立体异构体，其中：
Figure BDA0002173347810000462
R1可以表示H；烷基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2；-C(O)O烷基；卤代烷基；卤代烷氧基；或-烷基芳基；
各R2独立地可以表示H；烷基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2；-烷基芳基；碳环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；杂环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-NH烷基；-N(烷基)2；氨基；羟基；烷氧基或卤素；
n可以表示0、1或2；
R3可以表示H或烷基；
R4可以表示H或烷基；
R5可以表示H或烷基；
W和X各自独立地表示C＝O；C＝S；或CH2；
Y可以表示芳基；杂芳基；碳环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或杂环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；
Y可以进一步表示芳基或6元单环杂芳基；
Z可以表示烷基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和–N(C1-3烷基)2；芳基；杂芳基；-烷基芳基；-烷基杂芳基；碳环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；杂环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-烷基碳环基，其中碳环基被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；-烷基杂环基，其中杂环基被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-芳基碳环基，其中碳环基被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或-芳基杂环基，其中杂环基被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；和
Z可进一步表示芳基或杂芳基。
在变量Y中，术语“芳基”应理解为表示“亚芳基”(例如“苯基”应理解为表示“亚苯基”(即C6H4))，因为Y是连接基团，而不是末端基团。其他Y环(例如，杂芳基)的术语将同样地解释。当Y被称为未取代时，这应理解为表示除Z和NR5之外没有其他取代基。当Y被称为单取代时，这应理解为表示除Z和NR5之外有一个取代基。
当R1表示被一个或多个取代基任选地取代的烷基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2，示例性的取代基包括甲氧基，-NH2，-NH甲基和-NH(甲基)2。示例包括C1-6烷基(例如，未取代的C1-6烷基)，例如，甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基和乙基，特别是甲基。
当R1表示-C(O)O烷基时，示例包括-C(O)OC1-6烷基，如-C(O)OMe，-C(O)OEt，-C(O)OPr和-C(O)OiPr。具体示例是-C(O)OMe。
当R1表示卤代烷基时，示例包括C1-6卤代烷基，如CH2F，CHF2，CF3，CH2CH2F，CH2CHF2，CH2CF3，CHFCH3和CF2CH3。具体示例是CF3。
当R1表示卤代烷氧基时，示例包括C1-6卤代烷氧基，如OCF3。
当R2表示被一个或多个取代基任选地取代的烷基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2，示例性的取代基包括甲氧基，-NH2，-NH甲基和-NH(甲基)2。示例包括C1-6烷基(例如，未取代的C1-6烷基)，例如，甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基。
当R2表示-烷基芳基时，示例包括苄基。
当R2表示被一个或多个取代基任选地取代的碳环基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，C1-6卤代烷基(例如，氟代甲基，如三氟甲基)，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基，如三氟甲氧基)和卤素(例如，氟，例如，氯)，示例包括C3-C6环烷基，如环丙基，环丁基，环戊基和环己基。取代的示例包括被甲基取代的环己基。
当R2表示被一个或多个取代基任选地取代的杂环基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基，Y可以表示被C1-6烷基(如甲基)任选取代的杂环基。例子包括单环杂环基。杂环基可以是未取代的或可以具有例如一个或两个(例如，一个)取代基(例如，一个甲基)。示例包括哌啶基，吗啉基，吡咯烷基，4,5-二氢吡唑基和4,5-二氢异噁唑基。具体示例是吡咯烷基。
当R2表示-NH烷基时，示例包括-NHMe，NHEt，NHPr和NHiPr，特别是NHMe。
当R2表示-N(烷基)2时，示例包括-N(Me)2。
当R2表示烷氧基时，示例包括甲氧基和乙氧基，尤其是甲氧基。
当n表示1时，-(CHR2)n-的示例包括-CH2-和-CH(CH3)-。
当n表示2时，-(CHR2)n-的示例包括-CH2-CH2-，-CH2CH(CH3)-，-CH(CH3)CH2-和-CH(CH3)-CH(CH3)-。-(CHR2)2-基团的示例是-CH2-CH2-。
当R3表示烷基时，示例包括C1-6烷基，如甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基。
当R4表示烷基时，示例包括C1-6烷基，例如甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基。
当R5表示烷基时，示例包括C1-6烷基，如甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基。
当Y代表芳基时，示例包括任选被取代的苯基。示例性的取代基包括一个或多个(例如，一个或两个，尤其是一个)取代基，各取代基可独立地选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，卤素和C1-6卤代烷基(如氟代甲基，例如，三氟甲基)。示例包括未取代的苯基，甲基苯基，甲氧基苯基，氟苯基，氯苯基和三氟甲基苯基。具体示例包括未取代的苯基。具体示例还包括甲基苯基，甲氧基苯基，氟苯基。Z和NR5可以相对于彼此位于苯环的1-和4-位(即Z和NR5具有对位关系)。
当Y表示杂芳基时，示例包括单环(例如，5和6元)和双环(例如，9和10元)杂芳基环，尤其是单环杂芳基环，特别是6元单环杂芳基环。单环杂芳基的示例可以包含一个、两个或三个环杂原子(例如，一个或两个，例如，一个)，其包括一个或两个氮原子(例如，一个或例如两个)和任选的氧或硫原子。示例性的5-元单环杂芳基包括吡咯基，吡唑基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，噁二唑基和噻二唑基。当Y是5元单环杂芳基时，Z和NR5可以位于环上的非相邻环原子上。示例性的6元单环杂芳基包括吡啶基。示例性的6-元单环杂芳基还包括哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。当Y是6-元单环杂芳基时，Z和NR5可以相对于彼此位于环的1-和4-位(即Z和NR5具有对位关系)。上述杂芳基可以是未取代的或可以被一个或多个(例如，一个或两个，特别是一个)取代基取代。示例性的取代基独立地选自C1-6烷基(如甲基)，C1-6烷氧基(如甲氧基)，卤素(如氟)和C1-6卤代烷基(如氟代甲基，例如，三氟甲基)。当Y是未取代的杂芳基时，示例包括异噁唑基(例如，异噁唑基-5-基(其中NR5位于5-位，而Z位于3-位)和异噁唑基-3-基(其中NR5位于3-位，而Z位于5-位)，尤其是异噁唑-5-基)，噁二唑基，吡啶基(例如，吡啶-2-基或吡啶-3-基)，哒嗪基(例如，哒嗪-3-基)，嘧啶基(例如，嘧啶-3-基)，吡嗪基(例如，吡嗪-2-基)。当Y是取代的杂芳基时，Y可以例如被甲基或氟取代。当Y是取代的杂芳基时，示例包括甲基吡啶基，氟代吡啶基，甲基哒嗪基，甲基吡嗪基甲基嘧啶基和1-甲基吡唑基。
当Y表示被一个或多个取代基任选地取代的碳环基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，C1-6卤代烷基(例如，氟代甲基，如三氟甲基)，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基)和卤素(例如，氟，例如，氯)，Y可以表示被C1-6烷基任选取代的碳环基。示例包括任选地被C1-6烷基(如甲基)取代的单环碳环基。碳环基的示例包括C3-8环烷基(例如，环己基)和C5-8环烯基(例如，环己烯基)。碳环基环任选地被一个、两个或三个独立地可以是选择的取代基(例如，一个或两个，特别是一个，例如，一个甲基)取代。当Y代表碳环基时，Y可代表C3-8环烷基，如C5-6环烷基。具体示例是环己基。当Y是6-元碳环基时，Z和NR5可以相对于彼此位于碳环基环的1-和4-位。
当Y表示被一个或多个取代基任选地取代的杂环基时，取代基可以各自独立地选自C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基，Y可以表示被C1-6烷基(如甲基)任选取代的杂环基。例子包括单环杂环基。杂环基可以是未取代的或可以具有例如一个或两个(例如，一个)取代基(例如，一个甲基)。示例包括哌啶基，吗啉基，吡咯烷基，4,5-二氢吡唑基和4,5-二氢异噁唑基。具体的示例包括4,5-二氢异噁唑基(例如，4,5-二氢异噁唑-5-基)和哌啶基(例如，哌啶-4-基)。当Y是6-元杂环基时，Z和NR5可以相对于彼此位于杂环基环的1-和4-位。当Y表示杂环基时，在一个实施方式中，Z不表示-烷基芳基。
当Z表示被一个或多个取代基任选地取代的烷基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2，示例性的取代基包括甲氧基，-NH2，-NH甲基和-NH(甲基)2。示例包括C1-6烷基(例如，未取代的C1-6烷基)，例如，甲基，乙基，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例还包括C3-6烷基(例如，未取代的C3-6烷基)，例如，丙基(例如，正丙基，异丙基)，丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)，戊基(例如，正戊基)和己基(例如，正己基)。示例性的C1-6烷基是甲基和叔丁基。
当Z代表芳基时，示例包括任选被取代的苯基。示例性的取代基包括一个或多个(例如，一个或两个，尤其是一个)取代基，各取代基可独立地选自氟，氯，溴，氨基，甲氧基，甲基，卤代烷基(例如，氟甲基如三氟甲基)，-COOH，C(O)NMe2，二甲氨基和-NHC(O)Me。示例包括未取代的苯基。取代的示例包括氟苯基(例如，2-氟苯基，3-氟苯基和4-氟苯基)，氯苯基(例如，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基和3,4-二氯苯基)，溴苯基(例如2-溴苯基，3-溴苯基和4-溴苯基)，氨基苯基(例如，2-氨基苯基，3-氨基苯基，4-氨基苯基)，甲氧基苯基(例如，2-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基和4-甲氧基苯基)，甲基苯基(例如，2-甲基苯基，3-甲基苯基和4-甲基苯基)，氟代甲基苯基(例如，3-三氟甲基苯基和4-三氟甲基苯基)，羧基苯基(例如，3-(COOH)-苯基)，3-(C(O)NMe2)-苯基)，3-二甲基氨基苯基和3-(NHC(O)Me)-苯基。
当Z表示杂芳基时，示例包括单环(例如，5和6元)和双环(例如，9和10元)杂芳基环，尤其是单环。单环杂芳基的示例包含一个、两个或三个环杂原子(例如，一个或两个，例如，一个)，其包括一个或两个氮原子(例如，一个或例如两个)和任选的氧或硫原子。示例性的5-元单环杂芳基包括吡咯基，吡唑基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，噁二唑基和噻二唑基。示例性的6元单环杂芳基包括吡啶基。示例性的6-元单环杂芳基还包括哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。上述杂芳基可以是未取代的或可以被一个或多个(例如，一个或两个，特别是一个)取代基取代。示例性的取代基独立地选自甲基，氟，氯，氨基，卤代甲基(例如，氟甲基如三氟甲基)。未取代的示例包括吡啶基(例如，吡啶-2-基，吡啶-3-基和吡啶-4-基)，吡嗪基(例如，吡嗪-2-基)，哒嗪基(例如，哒嗪-3-基)，嘧啶基(例如，嘧啶-2-基，嘧啶-4-唑基和嘧啶-5-基)，噁唑基(例如，噁唑-2-基和噁唑-5-基)，噻唑基(例如，噻唑-2-基和噻唑-5-基)和吡唑基(例如吡唑-1-基)。取代的示例包括氯吡啶(例如，4-氯吡啶-2-基，5-氯吡啶-2-基和5-氯吡啶-3-基)，氟代吡啶基(例如，4-氟吡啶-2-基，5-氟吡啶-2-基和5-氟吡啶-3-基)，甲基吡啶基(例如，2-甲基吡啶-5-基，6-甲基吡啶-2-基和5-甲基吡啶-3-基)，氟代甲基吡啶基(例如，5-三氟甲基吡啶-3-基)，氨基吡啶基(例如，5-氨基吡啶-3-基)，甲基吡嗪基(例如，5-甲基吡嗪-2-基)，甲基噻唑基(例如，2-甲基噻唑-4-基)和甲基吡唑基(例如，1-甲基吡唑-5-基)。
当Z表示-烷基芳基时，示例包括苄基。
当Z表示-烷基杂芳基(例如，-CH2-杂芳基)，示例包括-烷基吡咯基，-烷基吡唑基，-烷基咪唑基，-烷基噁唑基，-烷基异噁唑基，-烷基噻唑基，-烷基异噻唑基，-烷基噁二唑基，-烷基噻二唑基，-烷基吡啶基，-烷基哒嗪基，-烷基嘧啶基和-烷基吡嗪基。
当Z表示被一个或多个取代基任选地取代的碳环基，取代基各自可以独立地选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，C1-6卤代烷基(例如，氟代甲基)，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基)和卤素(例如，氟，例如，氯)，Z可以表示被C1-6烷基任选取代的碳环基。示例包括任选地被C1-6烷基(如甲基)取代的单环碳环基。碳环基的示例包括C3-8环烷基(例如，环己基)和C5-8环烯基(例如，环己烯基)。碳环基环可以任选地被一个、两个或三个取代基(例如，一个或两个，特别是一个，例如，一个甲基)取代。当Z代表碳环基时，Z可代表C3-8环烷基，如C5-6环烷基。具体示例是环己基。
当Z表示被一个或多个取代基任选地取代的杂环基时，取代基各自可以独立地选自C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基，-C(O)NHC1-6烷基C1-6烷基(例如，甲基)，-C(O)OC1-6烷基(例如，-C(O)O甲基)，-C(O)C1-6烷基(例如，-C(O)甲基)，-C(O)NHC1-6烷基(例如，-C(O)NH甲基)，示例包括未取代的杂环基和具有一个或两个(例如，一个)取代基的杂环基。示例包括含有一个氮原子(如吡咯烷基和哌啶基)或两个氮原子(如哌嗪基)的杂环基团。示例还包括含有一个氮原子和一个氧原子(例如，吗啉基)或一个硫原子(例如，硫吗啉基)的杂环基团。在一个示例中，当Z是被取代的，那么环氮原子可以是被取代的。取代的示例包括取代的哌嗪基，如4-取代的哌嗪基，例如，4-Boc-哌嗪基，4-(C(O)Me)-哌嗪基，4-(C(O)NHEt)哌嗪基和4-甲基哌嗪基。
当Z表示-烷基碳环基(例如，-CH2-碳环基)，其中碳环基任选地被一个或多个取代基取代，取代基各自独立地可选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6卤代烷基(例如，氟代甲基，如三氟甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基)和卤素(例如，氟，例如，氯)，示例包括-CH2-环丙基和CH2-环丁基。
当Z表示-烷基杂环基，其中杂环基任选地被一个或多个取代基取代，取代基各自独立地可选自C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基，-C(O)NHC1-6烷基C1-6烷基(例如，甲基)，-C(O)OC1-6烷基(例如-C(O)O甲基)，-C(O)C1-6烷基(例如，-C(O)甲基)，-C(O)NHC1-6烷基(例如，-C(O)NH甲基)，示例包括-CH2-杂环基，如-CH2-吗啉基，-CH2-哌嗪基，-CH2-哌啶基和-CH2-吡咯烷基。
当Z表示-芳基碳环基时，其中碳环基任选地被一个或多个取代基取代，取代基各自独立地可以选自C1-6烷基(例如，甲基)，C1-6烷氧基(例如，甲氧基)，C1-6卤代烷基(例如，氟代甲基如三氟甲基)，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基)和卤素(例如，氟，例如，氯)，Z可以是苯基碳环基。碳环基环可以是未取代的或可以被一个或多个C1-6烷基取代。碳环基环可以是单环的。示例性的碳环基环是环烷基。示例包括环丙基苯基-和环己基苯基-。
当Z表示-芳基杂环基，其中杂环基任选地被一个或多个取代基取代，取代基各自独立地可选自C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基，-C(O)NHC1-6烷基C1-6烷基(例如，甲基)，-C(O)OC1-6烷基(例如，-C(O)O甲基)，-C(O)C1-6烷基(例如，-C(O)甲基)，-C(O)NHC1-6烷基(例如，-C(O)NH甲基)，Z可以是-苯基杂环基。杂环基环可以是单环的并且可以含有一个或两个(例如，一个)氮原子。示例包括吗啉基苯基-，哌嗪基苯基-，哌啶基苯基-，吡咯烷基苯基-。具体示例是3-(吗啉-4-基)苯基-。
适当地，R1可以表示H，甲基，乙基，-C(O)OMe，CF3或OMe。在一个示例中，R1表示甲基。
合适地，各R2可以独立地表示H或烷基。更合适地，R2表示H或甲基。在一个示例中，R2表示H。在一个示例中，R2表示甲基。
适当地，n可以表示0或1，例如，n表示1。
适当地，R3可以表示H或甲基，例如，R3表示H。
适当地，R4可以表示H或甲基，例如，R4表示H。
适当地，R5可以表示H或甲基，例如，R5表示H。
适当地，W和X彼此相同。
适当地，W和X各自可以表示C＝O。
适当地，Y可以表示芳基(例如，苯基)或杂芳基(例如，包含一个、两个或三个环杂原子的5-或6-元单环杂芳基，包括一个或两个氮原子，如异噁唑基，吡啶基，哒嗪基，嘧啶基或吡嗪基)。在一个示例中，Y表示苯基。在一个示例中，Y表示单环杂芳基。在一个示例中，Y被一个或多个取代基取代，取代基各自独立地选自C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤素和C1-6卤代烷基。在一个示例中，Y是未取代的。在一个示例中，Y是单取代的。当Y是5元时，适当地是Z和NR5位于环上的非相邻环原子上。当Y是6-元时，适当地是Z和NR5相对于彼此位于环的1-和4-位(即Z和NR5具有对位关系)。
适当地，Z可以表示芳基(例如，苯基)或杂芳基(例如，6-元杂芳基，如吡啶基，哒嗪基，嘧啶基或吡嗪基，尤其是吡啶基；或5-元杂芳基，如噁唑基，噻唑基，吡唑基)。在一个示例中，Z表示杂芳基。在一个示例中，Z表示芳基。在一个示例中，Z不表示甲基或乙基。在一个示例中，Z不表示未取代的烷基。
本公开提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂，其为式(IIIA)的化合物，或其药学上可接受的盐，溶剂化物或多晶型物，包括其所有互变异构体和立体异构体，其中：
Figure BDA0002173347810000551
R1可以表示烷基；
各R2独立地可以表示H，烷基，碳环基，其可以任选地被各自独立地选自下述的一个或多个取代基取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基和卤素，-NH烷基，-N(烷基)2，氨基，羟基，烷氧基或卤素；
n可以表示0、1或2；
R4可以表示H或烷基；
R5可以表示H或烷基；
W和X各自独立地可以表示C＝O或C＝S(在一些示例中，W和X均为C＝O)。
Y可以表示芳基；杂芳基；碳环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或杂环基，其被独立地选自下述的一个或多个取代基任选地取代：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；和
Z可以表示烷基；芳基；杂芳基；碳环基，其可以任选地被各自独立地选自下述的一个或多个取代基取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基(例如，氟代甲氧基)C1-6卤代烷氧基和卤素；杂环基，其可以任选地被各自独立地选自下述的一个或多个取代基取代：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-芳基碳环基，其中碳环基任选地被各自独立地选自下述的一个或多个取代基取代：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或-芳基杂环基，其中任选地被各自独立地选自下述的一个或多个取代基取代：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基。
在一个示例中，提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂，其中R1表示甲基；R2表示H；n表示1；W和X各自表示C＝O；R3表示H；R4表示H；Y表示异噁唑基；并且Z表示任选被氯、氟、溴、甲基或甲氧基取代的苯基。
在一个示例中，提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂，其中R1表示甲基；R2表示H；n表示1；W和X各自表示C＝O；R3表示H；R4表示H；Y表示苯基；并且Z表示任选被氟、氯、氨基、甲基或甲氧基取代的苯基。
在一个示例中，提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂，其中R1表示甲基；R2表示H；n表示1；W和X各自表示C＝O；R3表示H；R4表示H；Y表示吡啶基；并且Z表示任选被氟、氯、甲基、氨基或三氟甲基取代的吡啶基。
在一个示例中，提供了具有结构(III)的Wnt抑制剂，其中R1表示甲基；R2表示H；n表示1；W和X各自表示C＝O；R3表示H；R4表示H；Y表示哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基；并且Z表示任选被氟、氯、甲基、氨基或三氟甲基取代的吡啶基。
在一示例中，R2、R4和R5都为H，n＝1并且W和X都为C＝O。
在另一个示例中，提供了结构(III)的4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺。具有化合物名称4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺的结构(III)的化合物51(ETC-569)也被称之为如下所限定的结构(V)的化合物。
在一个示例中，Z不是被三氟烷基取代的苯基。
在一个示例中，当Y是异噁唑基，Z不位于异噁唑基环的4-位。
具有结构(III)的Wnt抑制剂的具体(但非限制性)示例如下：
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Wnt信号转导途径的抑制剂可以是porcupine抑制剂。porcupine抑制剂可以是Wnt-porcupine抑制剂。
porcupine抑制剂可以是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺或结构(IV)的化合物或者可以是4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶)-3-基)哒嗪(pyradizin)-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物。porcupine抑制剂也可以是结构(I)的化合物5(ETC-159)或结构(III)的化合物51(ETC-569)。
porcupine抑制剂可以是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，或结构(IV)的化合物。porcupine抑制剂也可以是结构(I)的化合物5(ETC-159)。porcupine抑制剂可以是4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物。porcupine抑制剂可以是结构(III)的化合物51(ETC-569)。
Wnt-porcupine抑制剂可以是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺或结构(IV)的化合物或者可以是4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶)-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物。Wnt-porcupine抑制剂也可以是结构(I)的化合物5(ETC-159)或结构(III)的化合物51(ETC-569)。
Wnt-porcupine抑制剂可以是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，或结构(IV)的化合物。
Wnt-porcupine抑制剂可以是4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物。Wnt-porcupine抑制剂也可以是结构(I)的化合物5(ETC-159)。Wnt-porcupine抑制剂也可以是结构(III)的化合物51(ETC-569)。
在开发适合于大规模和cGMP生产并最终用于临床和商业用途的固态药物时，针对感兴趣靶标的可接受水平的药物活性是唯一必须考虑的重要变量。例如，在药物组合物的配方中，药物活性物质应当是能够在商业制造过程中可靠地再生的形式，并且是足够稳健的以承受药物活性物质所暴露的条件。
在制造意义上，重要的是在商业制造期间，药物活性物质的制造过程在使用相同制造条件时再现相同的材料。此外，理想的是药物活性物质以固体形式存在，其中制造条件的微小变化不会导致所产生的固体形式的药物活性物质发生重大变化。例如，重要的是制造过程在可靠的基础上生产具有相同结晶性质的材料，并且还生产具有相同水合水平的材料。
此外，重要的是药物活性物质对其固体形式的降解、吸湿性和后续改变都是稳定的。这对于促进将药物活性成分纳入药物制剂是重要的。如果药物活性物质就吸收水(缓慢或随着时间的推移)而言是吸湿的(“粘性的”)，那么几乎不可能将药物活性物质可靠地配制成药物，因为待加入以提供相同剂量的物质的量将根据水合程度发生很大变化。此外，水合或固体形式(“多晶型”)的变化可以导致物理化学性质的改变，如溶解度或溶解速率，这可能反过来导致患者口服吸收的不一致。
因此，药物活性剂的化学稳定性、固态稳定性和“保质期”是非常重要的因素。在理想情况下，药物活性剂以及其包含的任何组合物应当能够在相当长的一段时间内有效储存，而不会表现出活性成分物理化学特性的显著变化，如其活性，水分含量，溶解特性，固体形式等。
本公开还包括含有如上所述的无水游离碱的药物组合物。
本公开的调节剂和抑制剂化合物和试剂可以组合物治疗性或预防性地给予。在治疗应用中，将组合物给予已经患有疾病的患者，其量足以治愈或至少部分地阻止疾病及其并发症。组合物应当提供足以有效治疗患者的量的化合物或试剂。
任何特定患者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：所治疗的病症和病症的严重程度；所用化合物或试剂的活性；所用组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；试剂或化合物的隔离率；治疗的持续时间；与治疗联合或碰巧使用的药物，以及医学上众所周知的其他相关因素。
通过常规实验，本领域技术人员能够确定治疗适用疾病所需的试剂或化合物的有效、无毒性量。
通常，有效剂量预期为约0.0001mg至约1000mg/kg体重/24小时；通常约0.001mg至约750mg/kg体重/24小时；约0.01mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约250mg/kg体重/24小时；约1.0mg至约250mg/kg体重/24小时。更典型地，有效剂量预期为约1.0mg至约200mg/kg体重/24小时；约1.0mg至约100mg/kg体重/24小时；约1.0mg至约50mg/kg体重/24小时；约1.0mg至约25mg/kg体重/24小时；约5.0mg至约50mg/kg体重/24小时；约5.0mg至约20mg/kg体重/24小时；约5.0mg至约15mg/kg体重/24小时。
或者，有效剂量可以高达约500mg/m2。通常，有效剂量预期为约25至约500mg/m2，优选约25至约350mg/m2，更优选约25至约300mg/m2，仍然更优选约25至约250mg/m2，甚至更优选约50至约250mg/m2，并且仍然甚至更优选约75至约150mg/m2。
通常，在治疗应用中，通常在疾病状态的持续时间治疗。
此外，对于本领域普通技术人员显而易见的是，个体剂量的最佳量和间隔将由所治疗的疾病状态的性质和程度，给药的形式、途径和部位以及被治疗的特定个体的性质决定。此外，这种最佳条件可以通过常规技术确定。
对于本领域普通技术人员来说同样显而易见的是，本领域技术人员可以使用常规疗程确定测试确定最佳治疗过程，如在限定的天数每天给予组合物剂量的数量。
通常，可以根据本领域普通技术人员已知的方法制备合适的组合物，并且因此可以包括药学上可接受的运载体、稀释剂和/或佐剂。
这些组合物可以通过标准途径给药。通常，组合物可以通过肠胃外(例如，静脉内，脊柱内，皮下或肌肉内)，口服或局部途径给药。更优选通过肠胃外途径给药。
所述运载体、稀释剂和佐剂必须是“可接受的”，这意味着其与该组合物的其它成分相容，并且对受体无害。
药学上可接受的运载体或稀释剂的示例是去除矿物质的水或蒸馏水；生理盐水；植物油，如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油，花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷，苯基聚硅氧烷和甲基苯基多聚环氧烷；挥发性有机硅；矿物油，如液体石蜡，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，如棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡啶酮(polyvinylpyrridone)；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶和凡士林。通常，一种或多种运载体占组合物重量的10％至99.9％。
本文公开的组合物可以是适合于通过注射给药的形式，适于口服摄入的制剂形式(例如胶囊、片剂、囊片、酏剂)，适于通过吸入给药，如通过鼻内吸入或口服吸入的气溶胶形式，适于肠胃外给药，即皮下、肌肉内或静脉内注射的形式。
对于作为可注射溶液或悬浮液给药，无毒性肠胃外可接受的稀释剂或运载体可包括林格氏溶液，等渗盐水，磷酸盐缓冲盐水，乙醇和1,2丙二醇。
用于口服使用的合适运载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些示例包括花生油，液体石蜡，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，海藻酸钠，阿拉伯树胶，黄蓍胶，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可以涂覆有化合物，如延迟崩解的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
佐剂通常包括润肤剂，乳化剂，增稠剂，防腐剂，杀菌剂和缓冲剂。
用于口服给药的固体形式可以含有人和兽医药学实践中可接受的粘合剂，甜味剂，崩解剂，稀释剂，调味剂，包衣剂，防腐剂，润滑剂和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶，明胶，玉米淀粉，黄蓍胶，海藻酸钠，羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖，乳糖，葡萄糖，阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，瓜尔胶，黄原胶，膨润土，海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖，山梨糖醇，甘露糖醇，右旋糖，高岭土，纤维素，碳酸钙，硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油，冬青油，樱桃，橙子或覆盆子调味料。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯、蜡、脂肪醇、玉米蛋白，虫胶或谷蛋白的聚合物或共聚物。合适的防腐剂包括苯甲酸钠，维生素E，α-生育酚，抗坏血酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁，硬脂酸，油酸钠，氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
除上述试剂外，用于口服给药的液体形式可含有液体运载体。合适的液体运载体包括水，油，如橄榄油，花生油，芝麻油，向日葵油，红花油，花生油，椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。
用于口服给药的悬浮液可以进一步包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，海藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇单-或二-油酸酯，-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯，-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。
用于口服给药的乳剂可以进一步包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上所例举的分散剂或天然树胶如瓜尔胶，阿拉伯树胶或黄蓍胶。
制备可胃肠外给药的组合物的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。
该组合物可以纳入任何合适的表面活性剂，如阴离子，阳离子或非离子表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂如天然树胶，纤维素衍生物或无机材料如二氧化硅，以及其他成分如羊毛脂。
组合物也可以脂质体的形式给药。脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质，并且由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒性，生理学上可接受和可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域已知的。
口服制剂可以与一种或多种药理学上可接受的成分一起配制，以制备具有肠溶包衣的片剂或胶囊等。这些制剂的方法是本领域技术人员熟知的。肠溶包衣可以这样的肠溶包衣，其增强组合物或活性药物向胃肠道的特定区域的递送以提高生物利用度，如Sands等2004年8月19日公开的题为“靶向胃肠道特定区域的药物制剂”的美国专利申请公开号20040162263中所述。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容中另有明确规定。例如，术语“一个引物”可以包括多个引物，并包括其混合物。
本文所用术语“约”在制剂组分浓度的上下文中通常表示所述值的+/-5％，更通常为所述值的+/-4％，更通常为所述值的+/-3％，更通常为所述值的+/-2％，甚至更通常为所述值的+/-1％，甚至更通常为所述值的+/-0.5％。当术语“约”在持续时间的上下文中使用时通常表示所述时间的+/-20％，更通常为所述时间的+/-15％，更通常为所述时间的+/-10％，更通常地，所述时间的+/-5％，甚至更通常为所述时间的+/-2％，甚至更通常为所述时间的+/-1％。例如，当所述持续时间为1天时，术语“约1天”可以指1天+/-0至6小时。另一个示例是当所述持续时间为1小时时，术语“约1小时”可以指1小时+/-0至10分钟。
在本公开中可以以范围格式公开某些示例。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所公开范围所示范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，应当认为诸如1至6的范围的描述具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的个别数字，例如，1、2、3、4、5和6。这普遍适用，与范围宽度无关。
在本文中示范性描述的发明可以在本文中未具体揭示的任何一种或多种元素、一种或多种限制不存在的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广义地阅读而不受限制。此外，本文中已经使用的术语和表述用作说明而非限制性的术语，这些术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，应认识到各种修改都有可能落入本发明要求的技术的范围之内。因此，应当理解的是尽管通过优选的实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员能对本文所体现的发明进行改良和变化，应认为这类改良和变化落在本发明的范围内。
本文广泛和概括性地描述了本发明。落入一般性公开内容中的各较窄种类和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或否定限制从该种属中去除任何主题，无论是否在本文中具体叙述了切除的材料。
其他实施方式在以下权利要求和非限制性实施例内。另外，当按照马库什基团(Markush group)描述本发明的特征或方面的时候，本领域技术人员将会认识到，本发明还可由此按照所述马库什基团的任意单独组成部分或子群描述本发明。
实验部分
实施例1–单重PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体阳性对照验证的PCR方案
PCR试剂
SuperScript III铂金一步定量RT-PCR系统(目录号11732-020用于100个反应，目录号11732-088用于500个反应，英杰公司(Invitrogen)。
主混合制备
如下表1制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000871
Figure BDA0002173347810000881
表1
RT-PCR循环条件
Figure BDA0002173347810000882
*此处进行荧光数据收集。_
表2
数据分析
Figure BDA0002173347810000883
表3
为了设置PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体的扩增曲线，进行含有PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒样品分别包含1000、100、10和1拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图4A和4B所示，其中各Ct值在各扩增图表下表示。
实施例2–单重PTPRK(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案和人全部RNA中的PTPRK(e1/e2)野生型单重检测
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表4制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000891
表4
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810000901
表5
为了设置PTPRK(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有PTPRK(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图5A和5B所示，含有人全部RNA的样品中的PTPRK(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表如图5C和5D所示。相应的Ct值示于各扩增图表下。
实施例3–单重RSPO3(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案和人全部RNA中的RSPO3(e1/e2)野生型单重检测
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表6制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000902
Figure BDA0002173347810000911
表6
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810000912
表7
为了设置RSPO3(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有RSPO3(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图6A和6B所示，含有人全部RNA的样品中的RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表如图6C和6D所示。相应的Ct值示于各扩增图表下。
实施例4–多重PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体阳性对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表8制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000921
表8
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810000931
表9
为了设置PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体的扩增曲线，进行含有PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1拷贝的阳性对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图7A和7C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图7B和7D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体检测计算的平均ΔCt值为-2.44，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为-0.41。
实施例5–多重PTPRK(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表10制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000932
Figure BDA0002173347810000941
表10
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810000942
表11
为了设置PTPRK(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有PTPRK(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图8A和8C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图8B和8D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。PTPRK(e1/e2)野生型检测计算的平均ΔCt值为-1.47，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为-0.07。
实施例6–多重RSPO3(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案及与单重方法的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表12制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000951
表12
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810000961
表13
为了设置RSPO3(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有RSPO3(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图9A和9C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图9B和9D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。RSPO3(e1/e2)野生型检测计算的平均ΔCt值为-0.31，内部对照检测计算的平均ΔCt值为0.20。
实施例7－显示了多重检测人全部RNA中的PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表14制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000962
Figure BDA0002173347810000971
表14
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
靶标 染料/通道 阈值
1 PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体 FAM 50RFU
2 PTPRK(e1/e2)野生型 TxRd 50RFU
3 RSPO3(e1/e2)野生型 Cy5 50RFU
4 内部对照 HEX 25RFU
表15
图10A显示了多重检测含有人全部RNA的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。图10B-10D还显示了PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
实施例8－显示了多重检测CR3150肿瘤RNA中的PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表16制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000981
表16
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
靶标 染料/通道 阈值
1 PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体 FAM 50RFU
2 PTPRK(e1/e2)野生型 TxRd 50RFU
3 RSPO3(e1/e2)野生型 Cy5 50RFU
4 内部对照 HEX 25RFU
表17
图11A显示了多重检测含有CR3150肿瘤RNA的样品中PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。图11B-11D还显示了PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e1/e2)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
实施例9–单重PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体阳性对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表18制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810000991
Figure BDA0002173347810001001
表18
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001002
表19
为了设置PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体的扩增曲线，进行含有PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图12A和12C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图12B和12D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体检测计算的平均ΔCt值为-1.14，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为-0.58。
实施例10–多重PTPRK(e7/e8)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表20制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001011
表20
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001021
表21
为了设置PTPRK(e7/e8)野生型的扩增曲线，进行含有PTPRK(e7/e8)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图13A和13C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图13B和13D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。PTPRK(e7/e8)野生型检测计算的平均ΔCt值为-0.23，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为-0.55。
实施例11–多重RSPO3(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表22制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001022
Figure BDA0002173347810001031
表22
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001032
表23
为了设置RSPO3(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有RSPO3(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的多重扩增图表示于图14A和14C。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的单重扩增图表示于图14B和14D。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。RSPO3(e1/e2)野生型检测计算的平均ΔCt值为-0.73，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为-0.18。
实施例12-多重检测人全部RNA中的PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7/e8)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表24制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001041
表24
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
靶标 染料/通道 阈值
1 PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体 FAM 50RFU
2 PTPRK(e7/e8)野生型 Cal Red 610 50RFU
3 RSPO3(e1/e2)野生型 Cy5 50RFU
4 内部对照 HEX 25RFU
表25
图15A显示了多重检测含有人全部RNA的样品中PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7/e8)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。图15B-15D还显示了PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7/e8)野生型和RSPO3(e1/e2)野生型的单重反应各自的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
实施例13–多重PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体阳性对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表26制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001051
Figure BDA0002173347810001061
表26
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001062
表27
为了设置PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体的扩增曲线，进行含有PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体检测计算的平均ΔCt值为-0.33，并将具有1质粒拷贝/μL的样品的Ct值从计算中剔除。内部对照检测计算的平均ΔCt值为0.01。
实施例14–多重PTPRK(e12-e14)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表28制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001071
表28
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001081
表29
为了设置PTPRK(e12-e14)野生型的扩增曲线，进行含有PTPRK(e12-e14)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
PTPRK(e12-e14)野生型检测计算的平均ΔCt值为0.25。内部对照检测计算的平均ΔCt值为0.07。
实施例15-多重检测人全部RNA中的PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体和PTPRK(e12-e14)野生型的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表30制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001082
/>
Figure BDA0002173347810001091
表30
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
靶标 染料/通道 阈值
1 PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体 FAM 50RFU
2 PTPRK(e12-e14)野生型 TxRd 50RFU
3 内部对照 HEX 25RFU
表31
使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
实施例16-多重检测CR2506肿瘤RNA中的PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体和PTPRK(e12-e14)野生型的PCR方案及与单重方案的比较
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表32制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001101
表32
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
靶标 染料/通道 阈值
1 PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合体 FAM 50RFU
2 PTPRK(e12-e14)野生型 TxRd 50RFU
3 内部对照 HEX 25RFU
表33
相应的Ct值示于扩增图表下。使用多重扩增反应获得的Ct值和使用单重扩增反应获得的Ct值之间的差值用ΔCt表示并且也包括在表中。
实施例17–单重EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体阳性对照验证的PCR方案
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表34制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001111
表34
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001121
表35
为了设置EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体的扩增曲线，进行含有EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图16A和16B所示，其中各Ct值在各扩增图表下表示。
实施例18–单重EIF3E(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表36制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001122
Figure BDA0002173347810001131
表36
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001132
表37
为了设置EIF3E(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有EIF3E(e1/e2)野生型野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图17A和17B所示，其中各Ct值在各扩增图表下表示。
实施例19–单重RSPO2(e1/e2)野生型阳性质粒对照验证的PCR方案
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表38制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001133
Figure BDA0002173347810001141
表36
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001142
表37
为了设置RSPO2(e1/e2)野生型的扩增曲线，进行含有RSPO2(e1/e2)野生型的阳性对照质粒的连续稀释，从而使阳性对照质粒的样品分别包含1000、100、10和1个拷贝的阳性对照质粒。向各样品添加100拷贝的内部对照质粒。含有连续稀释的阳性对照质粒和内部对照的样品的扩增图表如图18A和18B所示，其中各Ct值在各扩增图表下表示。
实施例23-多重检测人全部RNA中的EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型和RSPO2(e1/e2)野生型的PCR方案
使用的PCR试剂与实施例1中相同。
主混合制备
如下表38制备用于PCR反应的主混合物(反应体积＝25μl)。
Figure BDA0002173347810001151
表38
RT-PCR循环条件与实施例1中相同。
数据分析
Figure BDA0002173347810001152
Figure BDA0002173347810001161
表39
图19A和19B显示了多重检测含有人全部RNA的样品中EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合体、EIF3E(e1/e2)野生型和RSPO2(e1/e2)野生型和内部对照的扩增图表。相应的Ct值示于扩增图表下。
在下述实施例中提供了用于设立结果分析的接受或拒绝标准的过程的示例。
实施例24-运行对照接受标准
本文提供了用于结果分析的可接受运行Ct值的示例。
试验 样品 通道 可接受Ct范围*
融合体A NTC FAM 无扩增
PTPRK WT NTC TxRd 无扩增
RSPO3WT NTC Cy5 无扩增
*可接受值在指定的值内并包括指定的值，除非另有说明。无扩增表示Ct>42。
对于阳性对照(PC)，确保各PC反应的FAM、TxRd和Cy5信号都在Ct范围内。如果Ct值超出可接受的范围，那么进行实施例25。
无模板对照(NTC)
确保各NTC反应在FAM、TxRd和Cy5反应中均未显示扩增(即Ct>42)(扩增将表明污染)。如果任何NTC试验显示FAM、TxRd和/或Cy5通道中的扩增，即Ct值小于或等于42，那么进行实施例25。
内部对照(IC)
将不针对IC(HEX)扩增评估PC孔，因为该反应可能被融合体/WT试验反应(fusion/WT assay reaction)淘汰。确保各NTC反应显示范围内的HEX通道(IC)的Ct值。如果任何NTC反应的HEX值超出可接受范围，那么该运行的运行对照接受标准失败，而操作员应该进行实施例25。如果所有的运行对照在可接受的范围内，那么进行实施例26。
实施例25-运行对照再测试(Re-Test)标准
如果运行对照未达到实施例24中所指定的标准，那么使用者应按照以下说明继续操作。必要时，进行的再测试的细节以及调查和理由将在研究报告的附录中详细说明。必要时将记录偏差。
阳性对照(PC)
如果FAM、TxRd和Cy5 Ct值超出任何反应的规范(specification)，那么整个运行是无效的并且必须再次进行。将记录无效运行；如果失败似乎是系统性的(而不是分散的)，将调查和记录失败的原因。调查还将考虑是否应该重复该研究，或者可以从表现出问题的地方继续进行。
可以重复两次无效运行；如果相同的FAM、TxRd和C5Ct值仍然超出规范，那么因此将原因视为系统性的并进行相应的调查。如果由于不同原因(例如，NTC污染)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
无模板对照(NTC)
如果在任何NTC反应的Ct 42(或在Ct 42)之前在FAM、TxRd和/或Cy5通道中检测到扩增，那么整个运行将被视为无效。将记录无效运行；如果失败似乎是系统性的(而不是分散的)，将调查和记录失败的原因。调查还将考虑是否应该重复该研究，或者可以从表现出问题的地方继续进行。
可以重复两次无效运行；如果保留相同的FAM、TxRd和/或Cy5污染，那么因此将原因视为系统性的并进行相应的调查。如果由于不同原因(例如，PC故障)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
内部对照(IC)
如果在NTC中IC(HEX)Ct值超出规范，那么反应无效。不能使用该反应的数据；整个运行将被视为无效。将记录无效运行；如果失败似乎是系统性的(而不是分散的)，将调查和记录失败的原因。调查还将考虑是否应该重复该研究，或者可以从表现出问题的地方继续进行。
可以重复两次无效运行；如果相同的IC(HEX)Ct值仍然超出规范，那么因此将原因视为系统性的并进行相应的调查。如果由于不同原因(例如，PC故障)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
实施例26–样品接受标准
为了确认含有样品的反应是否有效，应当按照如下所示说明检查。
样品：PTPRK WT反应接受标准
确保各样品的PTPRK WT反应TxRd Ct值在一个范围内，这样可以确定试验没有过载或者没有使用不足的DNA。如果Ct值在范围内，那么满足了样品PTPRK WT反应接受标准并且可以评估样品融合反应。操作人员应当进行下述“样品：融合试验接受标准”部分。如果Ct值位于可接受范围之外，那么使用该样品的所有反应都是无效的，并且不能使用这些数据。操作人员应当进行实施例27中的再测试标准。
样品：RSPO3 WT反应接受标准
Figure BDA0002173347810001181
*可接受值在指定的值内并包括指定的值，除非另有说明。
确保各样品的RSPO3 WT反应Cy5 Ct值在上表中所示的范围内。如果Cy5 Ct值在范围内，那么满足了样品RSPO3 WT反应接受标准并且可以评估样品融合反应。操作人员应当进行下述“样品：融合试验接受标准”部分。如果Cy5 Ct值位于可接受范围之外，但是TxRdCt值位于所示范围之内，那么使用该样品的所有反应仍然是有效的，并且将使用这些数据。操作人员应当进行下述“样品：融合试验接受标准”部分。如果Cy5Ct值位于可接受范围之外，并且TxRd Ct值也位于PTPRK WT反应混合物可接受的范围之内，那么使用该样品的所有反应是无效的，并且不能使用这些数据。操作人员应当进行实施例27中的再测试标准。
样品：融合试验接受标准
融合反应 通道 可接受Ct范围*
融合体A FAM 0.00–42.00
*可接受值在指定的值内并包括指定的值。
如果FAM Ct高于上表所示的可接受范围或不存在FAM扩增，那么操作人员应当进行下述“样品：内部对照(HEX)接受标准”部分以评估IC(HEX)。如果IC(HEX)是有效的，那么认为该结果“未检测到突变”。将不会重复这些样品，并将有助于支持统计分析的数据集。
样品：内部对照(HEX)接受标准
对于具有阳性扩增的反应(即Ct≤42)的FAM/TxRd/Cy5反应，IC HEX Ct不必在指定范围之内，因为其可能被FAM/TxRd/Cy5反应淘汰。在没有FAM、TxRd和Cy5扩增的情况下，HEX Ct值必须落在指定范围内，否则将认为反应失败并且将进行下述实施例27中的再测试标准。
实施例27-样品再测试标准
样品：PTPRK WT反应再测试标准
如果样品未达到实施例26中所指定的标准，那么使用者应按照以下说明继续操作。必要时，进行的再测试的细节以及调查和理由将在研究报告的附录中详细说明。必要时将记录偏差。无效的样品可以再测试一次；如果相同的TxRd Ct仍不符合规格，那么必须使用原始未稀释的100％融合标准重新制造样品并重新测试。如果由于不同原因(例如，NTC污染)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
样品：RSPO3 WT反应再测试标准
如果样品未达到实施例26中所指定的标准，那么使用者应按照以下说明继续操作。必要时，进行的再测试的细节以及调查和理由将在研究报告的附录中详细说明。必要时将记录偏差。无效的样品可以再测试一次；如果相同的Cy5和TxRd Ct值仍不符合规格，那么必须使用原始未稀释的100％融合标准重新制造样品并重新测试。如果由于不同原因(例如，NTC污染)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
样品：融合试验再测试标准
如果样品未达到实施例26中所指定的标准，那么使用者应按照以下说明继续操作。必要时，进行的再测试的细节以及调查和理由将在研究报告的附录中详细说明。必要时将记录偏差。无效的样品可以再测试一次；如果相同的FAM Ct值仍不符合规格，那么必须使用原始未稀释的100％融合标准重新制造样品并重新测试。如果由于不同原因(例如，NTC污染)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
样品：内部对照(HEX)再测试标准
如果样品未达到实施例26中所指定的标准，那么使用者应按照以下说明继续操作。必要时，进行的再测试的细节以及调查和理由将在研究报告的附录中详细说明。必要时将记录偏差。在不存在FAM、TxRd和Cy5扩增(即Ct>42)并且IC(HEX)Ct值位于范围之外的情况下，这些反应失败并且不可以使用这些反应的数据。无效的样品可以再测试一次；如果相同的IC(HEX)Ct仍不符合规格，那么必须使用原始未稀释的100％突变标准重新制造样品并重新测试。如果由于不同原因(例如，PC故障)重复运行失败，那么该失败将不计入由于原始故障原因可能执行的重复次数。
实施例28–样品融合状态的分配
一旦运行通过接受标准，那么将如下所述定义样品融合状态。
ΔCt的计算
对于各融合反应，使用下式计算ΔCt值：
ΔCt＝Ct融合反应–CtPTPRK WT反应
将ΔCt值与提供的试验截止值进行比较。如果ΔCt值低于或等于截止值，那么认为是“检测到融合”。如果ΔCt值低于指定范围，即为负ΔCt值，那么认为是“检测到融合”。如果ΔCt值高于截止值，那么认为是“未检测到融合”。
序列表的序列
Figure BDA0002173347810001211
/>
Figure BDA0002173347810001221
/>
Figure BDA0002173347810001231
/>
Figure BDA0002173347810001241
/>

Claims (23)

1.一种多重扩增反应试剂盒，用于鉴定对Wnt信号转导途径抑制剂治疗敏感的恶性肿瘤受累对象，包含：
能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对，
具有SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:53的序列的探针，和
能够扩增野生型PTPRK和野生型RSPO3序列的对照引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其还包括：
一个或多个额外的多重扩增反应，包含：
能够扩增一个或多个R-脊椎蛋白基因融合体的引物，其中所述R-脊椎蛋白基因融合体是PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体，
能够扩增野生型PTPRK、野生型EIF3E、野生型RSPO2和野生型RSPO3序列的对照引物对。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其还包含与一个或多个R-脊椎蛋白基因-融合体或一个或多个野生型基因中的序列互补的一个或多个探针序列。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其还包含用于进行实时定量聚合酶链式反应的试剂。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述Wnt抑制剂具有结构(I)：
Figure FDA0004134652320000011
其中，
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H或烷基；
D选自H，卤素，烷基，环烷基，芳基和二烷基氨基，各自任选地被取代；
Ar是芳基或杂芳基，任选地被取代；
Cy是含有至少一个杂原子的饱和环，芳基或杂芳基，各自任选地被取代；和
n是1-3的整数，
其中，如果n＝1并且R3和R4中的一个是甲基而另一个是H，那么该化合物的立体化学如局部结构(II)中所示：
Figure FDA0004134652320000021
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述Wnt抑制剂具有结构(III)：
Figure FDA0004134652320000022
其中：
R1表示H；任选被取代的烷基，其中所述被取代的烷基的任选的取代基包括各自独立的选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2；-C(O)O烷基；卤代烷基；卤代烷氧基；或-烷基芳基；
各R2独立地表示H；任选被取代的烷基，其中，所述被取代的烷基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和-N(C1-3烷基)2；-烷基芳基；任选被取代的碳环基，其中，所述被取代的碳环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；任选被取代的杂环基，其中，所述被取代的杂环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-NH烷基；-N(烷基)2；氨基；羟基；烷氧基或卤素；
n表示0、1或2；
R3表示H或烷基；
R4表示H或烷基；
R5表示H或烷基；
W和X各自独立地表示C═O；C═S；或CH2；
Y表示芳基；杂芳基；任选被取代的碳环基，其中，所述被取代的碳环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或任选被取代的杂环基，其中，所述被取代的杂环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；和
Z表示任选被取代的烷基，其中，所述被取代的烷基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷氧基，NH2，-NHC1-3烷基和–N(C1-3烷基)2；芳基；杂芳基；-烷基芳基；-烷基杂芳基；任选被取代的碳环基，其中，所述被取代的碳环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷基，C1-6卤代烷氧基和卤素；任选被取代的杂环基，其中，所述被取代的杂环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-烷基碳环基，其中碳环基任选地被取代，其中，所述被取代的碳环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基和卤素；-烷基杂环基，其中杂环基任选地被取代，其中，所述被取代的杂环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基；-芳基碳环基，其中碳环基任选地被取代，其中，所述被取代的碳环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基和卤素；或-芳基杂环基，其中杂环基任选地被取代，其中，所述被取代的杂环基的任选的取代基包括各自独立地选自下述的一个或多个取代基：C1-6烷基，-C(O)OC1-6烷基，-C(O)C1-6烷基和-C(O)NHC1-6烷基。
7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，Wnt信号转导途径的抑制剂是porcupine抑制剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述porcupine抑制剂是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，或结构(IV)的化合物：
Figure FDA0004134652320000041
或
4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物：
Figure FDA0004134652320000042
9.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述恶性肿瘤的特征在于Wnt活性水平升高。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中，所述Wnt活性水平升高经转录或转录后升高。
11.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述恶性肿瘤是实体恶性肿瘤。
12.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述恶性肿瘤是食道，胆囊，肝脏，胰腺，胃，小肠，大肠，结肠，直肠或肛门的胃肠癌。
13.引物对和探针在制备用于检测患有恶性肿瘤的对象中PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因-融合体的方法的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含具有SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:53的序列的探针，所述方法包括：
从来自所述对象的样品提取核酸，和
用一个或多个引物对扩增所述核酸，
其中，所述引物对能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)基因融合体，和
用具有SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:53的序列的探针检测扩增的PTPRK(e13)-RSPO3(e2)基因融合体。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述方法还包括用能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体和EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个引物对扩增所述核酸。
15.如权利要求13或14所述的用途，其中，所述样品是福尔马林固定的和石蜡包埋(FFPE)固定的肿瘤组织或来自新鲜冷冻肿瘤的组织。
16.如权利要求13或14所述的用途，其中，所述核酸是RNA。
17.如权利要求13或14所述的用途，其中，所述扩增步骤包括实时PCR扩增反应。
18.如权利要求13或14所述的用途，其中，所述恶性肿瘤是食道，胆囊，肝脏，胰腺，胃，小肠，大肠，结肠，直肠或肛门的胃肠癌。
19.如权利要求13或14所述的用途，其还包括在检测到一个或多个R-脊椎蛋白基因融合体时用Wnt信号转导途径的抑制剂处理所述对象。
20.如权利要求19所述的用途，其中，Wnt信号转导途径的抑制剂是porcupine抑制剂。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述porcupine抑制剂是2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-1,2,3,6-四氢-7H-嘌呤-7-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，2-(1,3-二甲基-2,6-二氧代-2,3-二氢-1H-嘌呤-7(6H)-基)-N-(6-苯基哒嗪-3-基)乙酰胺，或结构(IV)的化合物：
Figure FDA0004134652320000061
或
4-(2-甲基-6,7-二氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-4(5H)-基)-4-氧代-N-(6-(吡啶-3-基)哒嗪-3-基)丁酰胺，或结构(V)的化合物：
Figure FDA0004134652320000062
22.引物对和探针在制备用于鉴定患有恶性肿瘤的对象对Wnt信号转导抑制剂的敏感性的方法的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含具有SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:53的序列的探针，所述方法包括：
从来自所述对象的样品提取核酸，
用能够扩增PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体的引物对扩增所述核酸，
用具有SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:53的序列的探针检测扩增的PTPRK(e13)-RSPO3(e2)基因融合体，和
当PTPRK(e13)-RSPO3(e2)R-脊椎蛋白基因融合体被扩增时鉴定对Wnt信号转导抑制剂的敏感性。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述方法还包括用能够扩增PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体的一个或多个额外的引物对扩增所述核酸，和
当PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合体、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合体或EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合体被扩增时鉴定对Wnt信号转导抑制剂的敏感性。
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