DE69731226T2

DE69731226T2 - Verwendung von substrat-subtraktionsbibliotheken zur unterscheidung von enzymspezifitäten

Info

Publication number: DE69731226T2
Application number: DE69731226T
Authority: DE
Inventors: L. Edwin MADISON; Song-Hua Ke
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: CA2257873A1; AU3302497A; EP0959894B1; WO1997047314A1; DE69731226D1; EP0959894A1; EP0959894A4; AU735015B2; ATE279203T1

Description

Bezug zu verwandten Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht den Nutzen der vorläufigen US-Anmeldung S. N. 60/019,495, welche am 10. Juni 1996 eingereicht wurde.
Regierungsrechte
Diese Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung seitens der Regierung der Vereinigten Staaten, National Institutes of Health, Beihilfen Nr. HL52475 und HL31950, getätigt; die Regierung der Vereinigten Staaten hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Aufklärung von Spezifitätsunterschieden zwischen eng verwandten Enzymen und zur Herstellung von Enzyminhibitoren, welche auf diesen Unterschieden basieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Chymotrypsinfamilie der Serinproteasen hat sich derart entwickelt, dass sie Mitglieder mit eng verwandten Substratspezifitäten umfasst (Perona, J. J. & Craik, C. S., Structural basis of substrate specificity in the serine proteases, Protein Science 4: 337–360, 1995). Zwei dieser Enzyme, t-PA und u-PA, wurden ausgewählt, um die Hypothese zu überprüfen, dass Bibliotheken kleiner Moleküle genutzt werden könnten, um Substrate zu identifizieren, welche zwischen eng verwandten Enzymen unterscheiden. Diese beiden Proteasen besitzen einen extrem hohen Grad an struktureller Ähnlichkeit (Spraggon G, Phillips C, Nowak UK, et al. The crystal structure of the catalytic domain of human urokinase-type plasminogen activator, Structure 3: 681–691, 1995), teilen dasselbe primäre physiologische Substrat (Plasminogen) und dieselben Inhibitoren (Plasminogenaktivator-Inhibitor Typen 1 und 2), zeigen eine bemerkenswert stringente Substratspezifität und spielen Schlüsselrollen in entscheidenden biologischen Prozessen. Plasminogenaktivator-Inhibitoren sind Beispiele für die Klasse von Molekülen, welche als Serpine bekannt sind (Serinproteaseinhibitoren) (Lawrence, D. A. und Ginsburg, D., in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, K. A. High, H. R. Roberts, Editoren, Marcel Dekker, New York, 1995, S. 517–543).
Im Allgemeinen sind Proteasen und ihre Inhibitoren, wie z. B. Serinproteasen und Serpine, an zahlreichen biologischen Prozessen zusätzlich zu der Fibrinolyse, wie z. B. an der Ovulation, Fertilisation, Embryogenese, Angiogenese, Infektion und Entzündung beteiligt. Siehe, hauptsächlich, Katunuma, N., et al., Editoren, Biological Functions of Proteases and Inhibitors, Karger, Tokyo, 1994; Troll, W., und Kennedy, A. R., Editoren, Protease Inhibitors as Cancer Chemopreventive Agents, Plenum Press, New York, 1993; Gettins, P. G. W., et al., Editoren, Serpins: Structure, Function and Biology, Chapman und Hall, New York, 1996; Sandler, M., und Smith, H. J., Editoren, Design of Enzyme Inhibitors as Drugs, Oxford University Press, New York, 1989). Eine besonders wichtige Verwendung von Proteaseinhibitoren ist die in der Behandlung von HIV-Infektion und AIDS (Huff, J. R., und Darke, P. L., Inhibition of HIV protease: A strategy to the treatment of AIDS, in Mohan, P., und Baba, M., Editoren, Anti-AIDS Drug Development, Harwood Academic Publishers, Chur, 1995).
Die lokale Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten, gefolgt von der Initiierung der Blutgerinnungskaskade (zusammen Teil dessen, was als das hämostatische System bezeichnet wird), stellt sicher, dass sich in Antwort auf eine vaskuläre Verletzung schnell ein Fibringerinnsel bildet (Roberts, N. R., und Tabares, A. N. (1995) in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, K. A. High, H. R. Roberts, Editoren, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1995, S. 35–50). Das Vorhandensein dieses Gerinnsels jedoch muss vorübergehend sein, wenn das beschädigte Gewebe ausgebessert werden soll und der normale Blutfluss wieder hergestellt werden soll. Das fibrinolytische System, welches den enzymatischen Abbau von Fibrin ausführt, ist daher eine essentielle Komponente des hämostatischen Systems. Das Endprodukt des fibrinolytischen Systems ist Plasmin, ein Enzym der Chymotrypsinfamilie mit relativ breiter, trypsinähnlicher Hauptspezifität, welches unmittelbar für den effektiven Abbau eines Fibringerinnsels verantwortlich ist (Castellino, F. J. (1995) in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, K. A. High, H. R. Roberts, Editoren, Marcel Dekker, New York, 1995, S. 495–515). Die Herstellung dieses reifen proteolytischen Enzyms aus dem inaktiven Vorläufer oder Zymogen, Plasminogen, ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der fibrinolytischen Kaskade (Collen, D., und Lijnen, H. R. (1991) Blood 78, 3114–3124). Die Katalyse dieser regulatorischen Schlüsselreaktion ist in vivo streng kontrolliert und wird durch zwei im humanen Plasma vorhandene Enzyme vermittelt, u-PA und t-PA.
u-PA und t-PA sind sehr eng verwandte Mitglieder der Chymotrypsingenfamilie. Diese beiden Proteasen weisen eine extrem hohe strukturelle Ähnlichkeit auf (Spraggon, G., et al., (1995) Structure 3: 681–691; Lamba, B., et al., (1996) J. Mol. Biol. 258: 117–135), teilen dasselbe physiologische Primärsubstrat (Plasminogen) und denselben Inhibitor (Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1, PAI-1) (Lawrence und Ginsburg, 1995) und zeigen im Gegensatz zu Plasmin eine bemerkenswert stringente Substratspezifität.
Trotz ihrer eindrucksvollen Ähnlichkeiten unterscheiden sich die physiologischen Rollen von t-PA und u-PA (Carmeliet, P., et al. (1994) Nature 368: 419–424; Carmeliet, P., und Collen, D. (1996) Fibrinolysis 10: 195–213). Viele Studien (5, 6, 12–18) legen nahe, dass die selektive Inhibition eines der beiden Enzyme nützliche therapeutische Wirkungen haben sollte. Mäuse, denen t-PA fehlt, sind z. B. resistent gegenüber spezifischen Anregungstoxinen (Excitotoxinen), welche in Wildtypmäusen erhebliche Neurodegeneration hervorrufen, und Mäuse, welchen u-PA fehlt, zeigen in einem Restenose-Modell nach vaskulärer Verletzung Defekte in der Proliferation und/oder Migration von glatten Muskelzellen.
Sowohl erhöhte Level an Proteaseinhibitoren wie z. B. PAI-1, als auch verminderte Level können mit Krankheiten assoziiert sein. Erhöhte Level an PAI-1 im Kreislauf sind mit thrombotischen Erkrankungen, einschließlich Herzinfarkt und tiefer Beinvenenthrombose und reduzierter postoperativer fibrinolytischer Aktivität verbunden (Lawrence und Ginsburg (1995) Seite 526). Zustände, in welchen vollständige oder teilweise reduzierte Level an PAI-1 gefunden werden, schließen Blutungszustände ein (Schleef, R. R., et al., J. Clin. Invest. 83: 1747–1752 (1989); Fay, W. P., et al., N. Eng. J. Med. 327: 1729–1733 (1992); Liu, Y.-X., et al., Eur. J. Biochem. 195: 54–555, 1991).
Umfangreiches Beweismaterial von Studien, welche sowohl Modellsysteme als auch humane Patienten einschließen, legt nahe, dass u-PA eine wichtige Rolle in der Tumor biologie spielen kann und liefert zwingende Gründe dafür, die Entwicklung von u-PA-Inhibitoren voran zu treiben. Zum Beispiel inhibieren anti-u-PA-Antikörper die Metastasierung von HEp3 humanen Karzinomzellen in Lymphknoten, Herz und Lunge von Hühnerembryonen (Ossowski, L., und Reich, E. (1983) Cell 35: 611–619), und ähnliche Studien zeigten, dass diese Antikörper die Lungenmetastasierung in Mäusen nach der Injektion von BI6 Melanomzellen in die Schwanzvene inhibieren (Hearing, V. J., et al., (1988) Cancer Res. 48: 1270–1278). Anti-u-PA-Antikörper inhibieren außerdem sowohl die lokale Invasivität als auch die Lungenmetastasierung in Nacktmäusen, die subkutane MDA-MB-231 Brustkrebstumore haben. Darüber hinaus deutete eine jüngere Studie darauf hin, dass u-PA-defiziente Mäuse resistent gegen die Induktion und/oder Progression von verschiedenen Tumortypen in einem zweistufigen chemischen Karzinogenese-Modell sind. Schließlich korrelieren die hohen Level an Tumor-assoziiertem u-PA sowohl mit einem verkürzten krankheitsfreien Intervall als auch mit geringem Überleben in mehreren verschiedenen humanen Krebsen stark (Duffy, M. J., et al., (1988) Cancer 62: 531–533; Janicke, F., et al., (1990) Fibrinolysis 4: 69–78; Duffy, M. J. (1993) Fibrinolysis 7: 295–302).
Da Mäuse, welchen entweder u-PA oder t-PA fehlt, keine thrombotischen Störungen entwickeln, scheint es unwahrscheinlich, dass die selektive Inhibition einer dieser beiden Enzyme thrombotische Komplikationen in vivo hervorruft. Andererseits leiden Mäuse, denen sowohl u-PA als auch t-PA fehlt, an schwerer Thrombose in vielen Organen und Geweben, was zu einer signifikant verringerten Lebenserwartung führt. Es scheint damit fast sicher, dass die nicht-selektive Inhibition dieser beiden Enzyme katastrophale Konsequenzen im klinischen Rahmen verursacht. Folglich existiert ein signifikantes Interesse an der Entwicklung von Inhibitoren, die stringent spezifisch entweder für t-PA oder für u-PA sind, von welchen erwartet wird, dass sie die detaillierte Untersuchung der genauen Rollen der beiden Enzyme in verschiedenen wichtigen pathologischen Vorgängen erleichtern werden und in der Entwicklung von neuen therapeutischen Mitteln zur Bekämpfung dieser Vorgänge helfen können. Die rationale Entwicklung dieser selektiven Inhibitoren ist jedoch aufgrund des Fehlens offensichtlicher "Leit-Verbindungen" außerordentlich kompliziert; sowohl ihr physiologisches Primärsubstrat als auch ihre Inhibitoren sind für die Unterscheidung zwischen den beiden eng verwandten Proteasen unbrauchbar.
Kombinatorische Bibliotheken stellen ein geeignetes Mittel für das Screenen einer sehr großen Anzahl von Verbindungen zur Verfügung. Im Allgemeinen stellen kombinatorische Bibliotheken eine große Anzahl (10⁴–10⁸) von Varianten kleiner Moleküle wie z. B. Peptide zur Verfügung (Lam, K. S., Synthetic peptide libraries, in Meyers, R. A., Molecular Biology and Biotechnology. A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, 1995, S. 880–883). Kombinatorische Peptidbibliotheken sind große Sammlungen verschiedener Peptide, wobei viele verschiedene mögliche Kombinationen von Aminosäuren aneinandergesetzt sind. Die Länge der Peptide in der Bibliothek kann so gewählt werden, dass sie für die jeweilige Anwendung passt.
Die verschiedenen Moleküle in einer kombinatorischen Bibliothek können mit einer Markierung (tag) wie z. B. einem von einem Antikörper erkannten Epitop ausgestattet werden, welche für die Identifikation und Manipulation verwendet werden kann. Bibliotheken können im Allgemeinen durch die Synthese von verschiedenen Molekülen auf einem Substrat hergestellt werden oder durch ein biologisches Verfahren, an welchem im Allgemeinen Bakteriophagen und Bakterien beteiligt sind.
Substrat-Bakteriophagen-Display-Bibliotheken wurden verwendet, um die optimale Teilstellenbesetzung (sub-site occupancy) für Substrate von t-PA aufzuklären und um Peptidsubstrate zu isolieren, welche so viel wie 5300 mal effizienter durch t-PA gespalten wurden als Peptide, welche die Primärsequenz der tatsächlichen Zielstelle, die in Plasminogen vorhanden ist, enthielten (Ding, C., et al., 1995). Diese selektierten Substrate wurden jedoch ebenso effizient durch u-PA gespalten und zeigten daher für die Spaltung durch t-PA im Vergleich zu u-PA eine Präferenz im Bereich von weniger als einer Größenordnung.
Was gebraucht wird, ist ein Verfahren zur Identifizierung von Substraten, die eine Selektivität für ein Enzym im Vergleich zu dem anderen im Bereich zwischen etwa 10-fach bis etwa 1000-fach aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die rationale Entwicklung von kleinmolekularen Inhibitoren als therapeutische Mittel wird häufig durch das Bedürfnis verkompliziert, zwischen der Bindung an eng verwandte Enzyme unterscheiden zu können. Die geeignete Auswahl von Substratphagen kann diese Unterscheidung erreichen. Substrat-Subtraktions-Bibliotheken der vorliegenden Erfindung stellen Substrate zur Verfügung, welche zwischen beliebigen zwei unterschiedlichen Proteasen unterscheiden können. Mehrere Proteasen können in dem Subtraktionsschritt verwendet werden, um eine noch höhere Spezifität zu erreichen. Darüber hinaus können sowohl das Substrat als auch die Substrat-Subtraktions-Bibliotheken wie hierin beschrieben für sämtliche Enzyme hergestellt werden, welche Peptide oder Proteine als Substrate verwenden können.
Die vorliegende Erfindung erzeugt Substrat-Subtraktions-Bibliotheken, welche für die Identifikation von hoch selektiven Substraten für spezifische Proteine und Enzyme geeignet sind. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich bei der Identifikation von hoch selektiven Substraten für nah verwandte Enzyme. Tatsächlich ist es möglich, Substrat-Subtraktions-Bibliotheken für alle Enzyme herzustellen, welche Peptide oder Proteine als Substrate verwenden. Diese Methoden können leicht für Proteinkinasen angepasst werden, z. B. durch die Verwendung von Antikörpern gegen Phosphoserin, Phosphothreonin oder Phosphotyrosin während der Selektion der Substratphagen. Folglich stellt die Herstellung und Charakterisierung von Substrat und Substrat-Subtraktions-Bibliotheken einen wesentlichen Beitrag zu der rationalen Entwicklung von hochspezifischen, kleinmolekularen Inhibitoren für ausgewählte Enzyme dar, ein Problem von höchster Wichtigkeit bei der Entwicklung von neuen therapeutischen Mitteln, und stellt wichtigste Einsichten in die molekularen Determinanten der Spezifität für eine Vielzahl von wichtigen Enzymen zur Verfügung.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung der Aminosäuresequenz eines Peptids zur Verfügung, das präferenziell ein Substrat für ein zweites Enzym ist. Eine kombinatorische Bibliothek, die Komponenten hat, die korrespondierende Peptide mit zufälligen Aminosäuresequenzen einer gewählten Länge darstellt, wird zur Verfügung gestellt. Die Komponenten der kombinatorischen Bibliothek werden mit dem ersten Enzym in Kontakt gebracht, und die Bibliothek wird in zwei Teile geteilt, einen, welcher Peptide aufweist, die durch das erste Enzym modifiziert wurden und einen Teil, dessen Peptide nicht modifiziert wurden. Ein Anteil oder beide Anteile der kombinatorischen Bibliothek werden mit dem zweiten Enzym in Kontakt gebracht, und die Komponenten der kombinatorischen Bibliothek, welche korrespondierende Peptide darstellen, die durch den Kontakt mit dem ersten Enzym modifiziert wurden, jedoch nicht durch das andere Enzym substanziell modifiziert wurden, werden identifiziert. Die Sequenzen der korrespondierenden Peptide, welche durch das eine Enzym modifiziert wurden, können anschließend bestimmt werden. Der beschriebene Prozess wird "Substrat-Subtraktions-Screening" und die hergestellten kombinatorischen Bibliotheken werden "Substrat-Subtraktions-Bibliotheken" genannt. Das erste Enzym und zweite Enzym gehören im Allgemeinen der gleichen weiten Klasse von Enzymen, z. B. Proteasen, Kinasen, Phosphatasen und dergleichen, an. Eine geeignete kombinatorische Bibliothek ist eine Bakteriophagen-Display-Bibliothek.
Eine weitere Ausführungsform ist eine Verbindung, welche die durch das oben beschriebene Verfahren des Substrat-Subtraktions-Screenings bestimmte Aminosäuresequenz umfasst. Solche Verbindungen sind nützlich als Enzyminhibitoren.
Stringent spezifische kleinmolekulare Inhibitoren können nicht nur verwendet werden, um die individuellen Rollen von t-PA und u-PA während einer großen Vielzahl von biologischen und pathologischen Vorgängen zu bestimmen, sondern können außerdem wichtige therapeutische Nutzen zur Verfügung stellen. Die selektive Inhibition von u-PA kann die Invasion, Metastase und Angiogenese von spezifischen Tumoren (Danø K., et al., Plasminogen activators, tissue degradation, and cancer. Adv. Cancer Res. 1985; 44: 139–266; Min, H. Y., et al., Urokinase receptor antagonists inhibit angiogenesis and primary tumor growth in syngeneic mice. Cancer Res. (1996); in press; Ossowski, L., Plasminogen activator dependent pathways in the dissemination of human tumor cells in the chick embryo. Cell 1988; 52: 321–328) sowie die vaskuläre Restenose nach invasiven Verfahren wie Angioplastie (Carmeliet P, et al. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature 1994; 368: 419–424) antagonisieren. Die selektive Inhibition von t-PA kann bestimmte Arten von neuraler Degeneration verhindern (Strickland DK. Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator. Nature 1995; 377: 340–344).
In bevorzugten Ausführungsformen wird die durch das Verfahren des Substrat-Subtraktions-Screenings bestimmte Sequenz bei der Konstruktion von rekombinanten Proteaseinhibitoren wie z. B. Varianten von PAI-1 berücksichtigt. In therapeutischen Ausführungsformen werden rekombinante Proteaseinhibitoren wie z. B. Varianten von PAI-1 einem Patienten in einer Menge von etwa 0,003 bis etwa 20 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verabreicht.
In einer weiteren Ausführungsform sind Antikörper gegen Peptide, welche unter Verwendung der Substrat-Subtraktions-Bibliotheken identifiziert wurden, außerdem nützlich als ein Assaykit und als Verfahren zum Nachweis des Levels an aktiven Proteaseinhibitoren. Die Antikörper können verwendet werden, um die Menge an Proteaseinhibitoren wie z. B. PAI-1 in einem Patienten zu bestimmen. Die Menge an Proteaseinhibitoren wie z. B. PAI-1 in einem Patienten ist ein Krankheitsmarker, welcher nützlich für die Vorhersage der Entwicklung eines (Krankheits)Zustandes (condition) ist, für die Identifizierung von Patienten mit dem Zustand, zur Vorhersage der Folge des Zustandes und hilfreich für die Wahl des richtigen Zeitpunktes und des gezielten Einsatzes (targeting) von therapeutischen Eingriffen sowie zur Bestimmung der Pathogenese des Zustandes in Patienten ist. Zustände, in welchen der Level an Proteaseinhibitoren wie z. B. PAI-1 ein nützlicher Marker ist, sind Blutungszustände, welche durch eine Unfähigkeit zur Bildung von PAI-1 oder einem Fehlen von aktivem PAI-1 charakterisiert sind. Antikörper gegen das reaktive Zentrum (reactive site) eines Serpinproteaseinhibitors wie z. B. PAI-1 wäre nützlich für die Unterscheidung zwischen aktiven und latenten Formen des Proteaseinhibitors.
In einer weiteren Ausführungsform sind Antikörper gegen Peptide, welche durch die Verwendung der Substrat-Subtraktions-Bibliotheken identifiziert wurden, außerdem für die Identifizierung neuer aktiver Proteaseinhibitoren nützlich. Die Antikörper können verwendet werden, um Moleküle mit exponierten Sequenzen zu identifizieren, welche ähnlich den Sequenzen von Peptiden sind, welche unter Verwendung der Substrat-Subtraktions-Bibliotheken identifiziert wurden. Diese Ausführungsform ist auch für das Screenen natürlich vorkommender Verbindungen auf Proteaseinhibitoraktivität in dem Verfahren zur Entdeckung von Arzneimitteln nützlich.
In einer weiteren Ausführungsform können die Antikörper gegen die identifizierten Peptide für die Affinitätsreinigung von durch die vorliegende Erfindung identifizierten Peptiden verwendet werden. Die Peptide, welche gereinigt werden sollen, können in einer Mischung von Peptiden vorliegen oder können Peptide sein, die durch rekombinante Verfahren hergestellt wurden.
Geeignete Antikörper umfassen Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. Moleküle, welche eine Antikörperkombinierungsstelle oder ein Paratop enthalten. Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, substanziell intakte Immunglobulinmoleküle und solche Teile von einem Immunglobulinmolekül, die das Paratop enthalten, einschließlich solcher Teile, die auf dem Gebiet als Fab, Fab' und F(ab')₂ bekannt sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen ist
1 ein Diagramm, das in Umrissen ein Protokoll darstellt, welches zur Herstellung der Substrat-Subtraktions-Bibliotheken verwendet wird, wobei das Gen III-Fusionsprotein, die Phagen, die monoklonalen Antikörper und das immobilisierte Protein A nicht maßstabsgetreu gezeichnet sind;
2 ist ein Diagram, das einen Umriss eines weiteren Protokolls, welches einen Umriss eines weiteren Protokolls, welches zur Herstellung von Substrat-Subtraktions-Bibliotheken verwendet wird, darstellt;
3 ist eine Darstellung der Ergebnisse einer funktionellen Analyse von individuellen Kontroll- oder Substrat-Phagen-Stämmen unter Verwendung eines Dotblot-Assays; und
4 ist eine Darstellung der Ergebnisse einer funktionellen Analyse der spezifischen Spaltung eines Fusionsproteins durch t-PA.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die offenbarten Verfahren sind allgemein nützlich bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren verschiedener Proteine und Enzyme. Das Verfahren kann bei anderen Proteasen und bei anderen Klassen von Enzymen, einschließlich Kinasen und Phosphatasen, verwendet werden. Folglich sollten die Offenbarungen bezüglich u-PA und t-PA als beispielhaft und nicht beschränkend betrachtet werden.
Beispiele für andere geeignete Enzymsysteme schließen Proteasen, einschließlich weitere Serinproteasen, wie auch Kinasen und Phosphatasen ein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Identifizierung solcher Peptide, die in selektiver Weise zwischen einem ersten Enzym und einem zweiten Enzym reaktiv sind. Eine kombinatorische Bibliothek, welche verschiedene Peptide darstellt, wird zur Verfügung gestellt. Diese kombinatorische Bibliothek kann z. B. durch die Zufallsmutation (random mutation) von Bakteriophagen, die Peptidsequenzen tragen, hergestellt werden. Der Phage exprimiert die Peptidsequenzen extern und der gewünschte Phage kann nach der Reaktion mit den Enzymen angereichert werden. Alternativ kann die kombinatorische Bibliothek eine Reihe von Peptidsubstraten beinhalten, deren Aminosäuresequenzen durch ihre Position auf dem Substrat bekannt sind. Die Herstellung solcher Bibliotheken-Arrays auf Substraten ist auf dem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. Meyers, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCM Publishers, New York 1995, S. 880–883. Die Verwendung einer Phagenbibliothek wird bevorzugt, da sie im Allgemeinen für einen größeren Bereich von verschiedenen Sequenzen, gewöhnlich im Bereich von 10⁸ verschiedenen Aminosäuresequenzen, geeignet ist.
Die kombinatorische Bibliothek wird mit dem ersten Enzym in Kontakt gebracht, um dem ersten Enzym zu ermöglichen, einige Komponenten der kombinatorischen Bibliothek zu modifizieren. Diejenigen Komponenten, die durch das erste Enzym modifiziert sind, werden anschließend von den Komponenten der Bibliothek, welche im Wesentlichen durch das erste Enzym unmodifiziert sind, getrennt.
An diesem Punkt wird anschließend entweder ein Schritt oder zwei Schritte getan. Der modifizierte Anteil wird mit dem zweiten Enzym in Kontakt gebracht oder der unmodifizierte Anteil wird mit dem zweiten Enzym in Kontakt gebracht. Es ist dann möglich, wenigstens einige der Komponenten der kombinatorischen Bibliothek, welche durch das eine Enzym modifiziert sind, jedoch im Wesentlichen durch das andere Enzym unmodifiziert sind, zu identifizieren. Ein Arbeitsbeispiel, welches diese Wege zeigt, ist in 1 dargestellt. Das Beispiel von Phagen, welche Hexamerpeptide mit Epitopmarkierungen an den Enden des Peptids darstellen, ist gezeigt. Der Phagenbibliothek wird anschießend erlaubt, mit dem t-PA-Enzym in Kontakt zu kommen, um die Peptide zu verdauen. Dies resultiert in der Trennung in zwei Teile, wobei diejenigen Komponenten, die durch das t-PA modifiziert wurden, links gezeigt werden und diejenigen Komponenten, die nicht durch das t-PA modifiziert wurden, rechts gezeigt werden. Wie dargestellt wird die Trennung durch Immobilisierung mit monoklonalen Antikörpern erreicht.
Phagen, welche durch t-PA modifiziert wurden, werden anschließend amplifiziert, um Phagen herzustellen, die das gesamte Peptid und die Epitopmarkierungen aufweisen. Wie rechts dargestellt, wurden die Phagen anschließend mit u-PA verdaut und die Phagen, welche modifiziert waren, wurden von den unmodifizierten Phagen durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern getrennt. Dies resultiert in einer ersten Population von Phagen, welche Peptide exprimiert, die sowohl mit t-PA und u-PA reagieren. Es resultiert auch in einer zweiten Population, welche mit t-PA reagiert, nicht jedoch mit u-PA. Es ist die zweite Population, welche für die vorliegende Erfindung interessant ist. Diese Population kann resuspendiert und amplifiziert werden.
Alternativ auf der linken Seite von 1 gezeigt, wird die Population von Phagen, welche durch t-PA unmodifiziert geblieben ist, resuspendiert und mit u-PA in Kontakt gebracht. Nach dem Verdau wurden monoklonale Antikörper wie zuvor verwendet. Dies resultiert in zwei weiteren Populationen, einer dritten Population, welche Phagen beinhaltet, die Peptide exprimieren, welche mit u-PA, nicht jedoch mit t-PA reagieren und einer vierten Population, welche Phagen beinhaltet, die weder mit u-PA noch mit t-PA reagierten. Es ist die dritte Population, welche ebenfalls von Interesse in der vorliegenden Erfindung ist. Diese Population kann anschließend amplifiziert werden.
Wie zu sehen ist, erlauben beide dieser Wege die Identifizierung von einigen der Komponenten der kombinatorischen Bibliothek, welche durch das eine Enzym, nicht jedoch durch das andere modifiziert werden. Wie in 1 gezeigt, sind dies die dritte und vierte Population. Das gesamte Verfahren oder einzelne Screeningschritte können ein oder mehrere Male wiederholt werden, um die Selektivität zu erhöhen.
Wenigstens einige der Komponenten, welche durch ein Enzym modifiziert werden, nicht jedoch durch das andere Enzym, werden anschließend identifiziert. In dem Fall der Phagenbibliothek werden auf diese Art und Weise Phagen in den zweiten und dritten Populationen identifiziert. Die Phagen können anschließend in Kultur wachsen gelassen werden, was ermöglicht, dass die Identifizierung auch die Bestimmung der Aminosäuresequenz von wenigstens einem der dargestellten Peptide einschließt. Die resultierenden Peptide haben vorzugsweise eine Selektivität für die gewünschte Enzymverbindung gegenüber dem ungewünschten Enzym, welche vorzugsweise wenigstens 10-fach und bevorzugter wenigstens 50-fach ist. Die Enzyme sind vorzugsweise beide Proteasen wie z. B. Kinasen und Phosphatasen.
Im Falle der Bibliothek-Arrays auf Substraten werden Teile der Bibliothek, wie z. B. durch die Verwendung von zwei identischen Arrays, individuell mit jedem der Enzyme zur Reaktion gebracht. Die Stelle der Peptidspaltung wird bestimmt, wie z. B. durch die Verwendung eines Cysteinrestes oder einer Epitopmarkierung und markierten Antikörpern auf jedem Array, und die Resultate werden verglichen, um zu bestimmen, welche Peptide mit einem Enzym, nicht jedoch mit dem anderen reagiert haben.
Die Aminosäuresequenz oder -sequenzen, welche bestimmt werden, können anschließend verwendet werden, um Peptide mit diesen Sequenzen herzustellen. Diese Peptide können verwendet werden, um Antikörper herzustellen, wie auf dem Gebiet bekannt ist, und verwendet werden, um rekombinante Peptide zu reinigen oder natürlich vorkommende Proteaseinhibitoren, welche mit den so hergestellten Antikörpern immunreaktiv sind, zu identifizieren. Die Antikörper können außerdem für diagnostische Arrays verwendet werden, die zwischen aktiven und latenten Formen der Proteaseinhibitoren unterscheiden können.
Die bestimmten Aminosäuresequenzen können verwendet werden, um Proteaseinhibitoren zu konstruieren. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz, von der bestimmt wurde, dass sie hoch selektiv gegenüber dem zweiten Enzym ist, bei der Entwicklung eines Inhibitors für das zweite Enzym verwendet werden, welcher eine geringe Reaktivität mit dem ersten Enzym hat. Dies erlaubt die Behandlung von medizinischen Zuständen, in welchen die gezielte Inhibition des zweiten Enzyms nützlich ist, während die Inhibition des ersten Enzyms nicht gewünscht wird.
Solche Inhibitoren würden eine Struktur haben, welche den natürlich vorkommenden Enzyminhibitoren entspricht. Die Aminosäuresequenz solcher Inhibitoren würde modifiziert werden, damit sie die Aminosäuresequenz, welche durch das Verfahren dieser Erfindung gelehrt wird, beinhaltet. Alternativ werden Substrate, welche die Aminosäuresequenzen wie in der vorliegenden Erfindung gelehrt enthalten, modifiziert, um Inhibitoren zu erzeugen.
Die Aminosäuresequenz wird zusammen mit den anderen für den Inhibitor kodierenden Teilen anschließend auf einem Plasmid oder einem anderen DNA-Vektor für die Einführung in eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle kodiert, wie auf dem Gebiet wohlbekannt. Solche Zellen werden den gewünschten Enzyminhibitor produzieren, welcher unter Verwendung der oben genannten Antikörper gereinigt werden kann.
Eine Substrat-Subtraktions-kombinatorische Bibliothek kann ebenfalls hergestellt werden. Die kombinatorische Bibliothek wird mit dem ersten Enzym in Kontakt gebracht, um einige der Komponenten der kombinatorischen Bibliothek zu modifizieren. Die Phagen können anschließend durch Festphase oder Präzipitation wie auf dem Gebiet bekannt abgetrennt werden, wobei jede Population als eine Substrat-Subtraktions-Bibliothek dient. Das Beispiel des ersten Enzyms wird verwendet.
Solch einer Substrat-Subtraktions-Bibliothek fehlen im Wesentlichen Peptide, welche effektive Substrate für das erste Enzym sind, was bedeutet, dass die Peptide eine Reaktivität von weniger als etwa 10 Prozent des besten natürlich vorkommenden Moleküls, mit dem das erste Enzym reagiert, aufweisen. Zum Beispiel hat, in dem Fall von u-PA wie in Tabelle 5 unten gezeigt, das native oder Wildtyp PAI-1 eine Geschwindigkeitskonstante von 1,9 × 10⁷ M^–1s^–1, während das selektierte PPAI-1/P3R eine Geschwindig keitskonstante von 1,0 × 10⁵ hat, was bedeutet, dass die Reaktivität weniger als 1 Prozent beträgt. Tabelle 8 stellt ähnliche Vergleiche für den Wildtyp an. Die Peptide in der kombinatorischen Bibliothek haben vorzugsweise ein k_cat/K_m-Verhältnis von weniger als etwa 500 M^–1s^–1 und vorzugsweise ein k_cat/K_m-Verhältnis von weniger als etwa 100 M^–1s^–1.
Während die Entfernung der Peptide, welche effektive Substrate für das erste Enzym sind, für die Herstellung einer Substrat-Subtraktions-Bibliothek bevorzugt wird, ist dies für die Ausführung der Erfindung nicht notwendig. Abhängig von dem beteiligten Enzym kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Peptiden ausgeführt werden, die eine Reaktivität haben, welche sogar größer als 10% im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Molekül ist.
Ebenfalls hierin beschrieben wird die therapeutische Behandlung eines Patienten. Diese Behandlung kann in zwei allgemeinen Formen durchgeführt werden. Das bestimmte Peptid selbst kann dem Patienten verabreicht werden, um die Enzyme des Patienten zu überlasten und dadurch einen inhibitorischen Effekt zu erzielen. In solchen Fällen liegen die bevorzugten Verabreichungsraten der Peptide, wie z. B. t-PA und u-PA, im Bereich von etwa 0,1 Mikrogramm/kg bis etwa 50 Mikrogramm/kg.
Alternativ können auch die Enzyminhibitoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, dem Patienten verabreicht werden. Diese Inhibitoren inhibieren direkt die Aktivität der Enzyme. Im Fall von u-PA und t-PA liegt die bevorzugte Verabreichungsrate im Bereich von etwa 0,003 Mikrogramm/kg bis etwa 20 Mikrogramm/kg.
Einige der Krankheiten, welche effektiv behandelt werden können, sind Serpindefizienzen wie z. B. Lungenemphysem, das mit Defizienzen an α₁-Proteinaseinhibitor assoziiert ist, Antithrombindefizienz, hereditäres Angioödem, das mit Defizienzen an C1-Inhibitor assoziiert ist, Blutungsstörungen, die mit Defizienzen in α-Antiplasmin oder PAI-1 (Gettins et al. 1996) assoziiert sind. Serpine wurden auch mit verschiedenen Formen von Krebs in Verbindung gebracht, einschließlich Schuppenzellkarzinomen (Gettins, et al. 1996). In jedem der Fälle wird eine physiologisch wirksame Menge des Peptids oder Enzyminhibitors verabreicht. Beispiele für spezifische Peptide werden unten dargestellt.
Mit Bezug auf 2 wird das spezifische Beispiel eines Phagens, welcher Hexamerpeptide und Epitopmarkierungen aufweist, offenbart. In diesem Beispiel wird die Bibliothek vorbehandelt, um die Selektivität zu erhöhen. Die Phagenbibliothek wird anschließend mit dem t-PA-Enzym in Kontakt gebracht und verdaut. Monoklonale Antikörper gegen die Epitopmarkierungen werden dann dazugegeben, um gespaltene und ungespaltene exprimierte Peptide zu trennen. Die Phagen, welche gespaltene Peptide aufweisen, werden anschließend selektiert und amplifiziert. Die amplifizierten Phagen werden dann erneut mit u-PA verdaut. Ein monoklonaler Antikörper gegen die Epitopmarkierungen wird wiederum verwendet, um die Phagen zu immobilisieren, welche Peptide haben, die nicht durch das u-PA modifiziert wurden. Die unverdauten Phagen werden anschließend gewonnen und resuspendiert. Sie werden erneut mit t-PA verdaut, und die nicht reagierten Phagen werden erneut unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern abgetrennt. Die Phagen, welche erneut mit t-PA zur Reaktion gebracht wurden, werden anschließend in dem Überstand identifiziert.
BEISPIEL 1
Herstellung und Verwendung von Substrat-Subtraktions-Bibliotheken
Reagenzien
Kompetente MCI061 (F–) E. coli und Nitrozellulose wurden von Bio-Rad Laboratories erworben. Pansorbin (Protein A enthaltende S. aureus) Zellen wurden von Calbiochem (San Diego, CA) erhalten. K91 (F+) und MCI061 (F–) Stämme von E. coli wurden durch Steve Cwirla (Affymax) zur Verfügung gestellt. MAb 3-E7 wurde von Gramsch Laboratories (Schwabhausen, FRO) erworben. u-PA wurde von Jack Henkin (Abbott Laboratories) erhalten.
Eine polyvalente fd-Phagenbibliothek, welche zufallsbestimmte Hexapeptidsequenzen (random hexapeptide sequences) aufwies und 2 × 10⁸ unabhängige Rekombinanten enthielt, wurde hergestellt (Ding, C., et al., 1995; Smith, M. M., et al., 1995). Peptide wurden wie beschrieben synthetisiert und gereinigt (Madison, E. L., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 7558–7562.). Jedes Mitglied dieser Bibliothek wies eine N-terminale Verlängerung von dem Phagen-Hüllprotein III (pIII) auf, welche eine zufällig ausgewählte (ran domisierte) Region von sechs Aminosäuren an pIII fusioniert enthielt, gefolgt von einer Linkersequenz von sechs Resten (SSGGSG) und den Epitopen für mAb 179 und mAb 3-E7. Da weder t-PA noch u-PA die pIII-Sequenz, die Antikörperepitope oder die flexible Linkersequenz verdaut, erfordert der Verlust der Antikörperepitope von der Phagenoberfläche nach Inkubation mit einem von beiden Enzymen die Spaltung des zufallsbestimmten Peptidinserts. Die Inkubation der Bibliothek mit t-PA, gefolgt von der Entfernung der Phagen, welche die Antikörperepitope behalten haben, erreicht daher die Anreicherung von Phagenklonen, deren zufallsbestimmte Hexamersequenz durch t-PA gespalten werden kann.
Die detaillierte Konstruktion des Phagenvektors fAFFI-tether C (fTC) und der zufallsbestimmten Hexapeptidbibliothek fAFF-TC-LIB ist zuvor beschrieben worden (Smith, M. M., et al., 1995). Ein Kontrollsubstratphage frC-PL, welcher die physiologischen Zielsequenzen für u-PA und t-PA enthielt, wurde durch Hybridisierung der Einzelstrangoligonukleotide 5'-TCGAGCGGTGGATCCGGTACTGGTCGTACTGGTCATGCTCTGGTAC-3' und 5'-CGCCACCTAGGCCAGGACCAGCACAACAACCACGAGAC-3', und anschließendem Ligieren der annealten, doppelsträngigen Produkte in den mit Xho I/Kpn I geschnittenen Vektor frC konstruiert. Alle Konstrukte wurden zunächst durch Elektroporation in MCI061 transformiert und anschließend in K91 transferiert.
Messung der Enzymkonzentrationen
Die Konzentrationen an funktionellem t-PA und u-PA wurden durch aktives Zentrum-Titration (active site titration) mit 4-Methylumbelliferyl-p-guanidinobenzoat (Jameson, G., et al., (1973) Biochem. J. 131, 107–117) unter Verwendung eines Perkin-Eimer LS 50B Lumineszenzfluorometers wie zuvor beschrieben gemessen (Madison, E. L., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 7558–7562). Zusätzlich wurden die Enzyme mit einer Standard-PAI-1-Herstellung titriert, welche zuvor gegen einen Trypsin-Primärstandard titriert worden war. Die Gesamtenzymkonzentrationen wurden durch ELISA gemessen.
Das Verfahren, welches für die Herstellung der Substrat-Subtraktions-Bibliotheken verwendet wird, ist in 2 skizziert. Die anfängliche Phagenbibliothek wurde drei hoch stringenten Selektionsrunden mit t-PA unterzogen, um die Herstellung einer Zwischenbibliothek sicherzustellen, welche stark mit Phagen angereichert ist, die sehr gute Sub strate von t-PA sind. Diese Zwischenbibliothek wurde anschließend bei geringer Stringenz mit u-PA verdaut, um Phagen zu entfernen, welche moderate oder gute Substrate für u-PA sind. Die Substrat-Subtraktion wurde nach dem Proteaseverdau von Phagen durch Zugabe von Mab 3E-7 und immobilisiertem Protein A (Pansorbinzelle, Calbiochem, San Diego, CA) zu der Reaktionsmischung und durch Präzipitation der ternären Komplexe, welche die unverdauten Phagen enthalten, erreicht.
Im Gegensatz zu den früheren drei Selektionsrunden wurden die in der Lösung verbleibenden Phagen anschließend verworfen und das Präzipitat, welches die ternären Komplexe enthält, wird resuspendiert. Phagen, welche vorzugsweise durch t-PA gespalten wurden, wurden anschließend durch ihre Freisetzung aus den ternären Komplexen durch Verdau bei hoher Stringenz mit t-PA identifiziert.
Herstellung und Sequenzierung der DNA von Phagenklonen
DNA-Proben wurden wie zuvor beschrieben von den identifizierten Phagenklonen hergestellt (Ding, C., et al., (1995)). Kurz beschrieben werden die Phagen aus einer 1 ml Übernachtkultur durch Zugabe von 200 μl 20%igem Polyethylenglycol in 2,5 M NaCl präzipitiert. Die Mischung wurde anschließend 30 min auf Eis inkubiert, und das Phagenpellet wurde durch Mikrozentrifugation für 5 min gewonnen. Die Phagen wurden in 40 μl Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) resuspendiert und bei 80°C für 15 min erhitzt. Einzelstrang-DNA wurde durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt und gemäß dem Verfahren nach Sanger sequenziert.
Die kinetische Analyse von bestimmten Klonen ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabellen 2 und 3 fassen die Sequenzen von weiteren zusätzlichen Klonen zusammen. Tabelle 2 zeigt die Sequenzen von 37 isolierten und funktionell überprüften t-PA-selektiven Phagenklonen, welche 32 verschiedene Substratsequenzen enthalten. Zum Vergleich sind die Sequenzen von sechs u-PA-selektiven Klonen in Tabelle 2 aufgelistet.
Um zu überprüfen, dass die Substrat-Subtraktions-Bibliothek Substrate hervorgebracht hatte, welche präferenziell von t-PA gespalten wurden, wurde der Verdau von individuellen Phagenstämmen durch t-PA und u-PA durch ein Dotblot-Assay analysiert, was wie zuvor beschrieben (Ding, L., et al., 1995; Smith, M. M., et al., 1995) durchgeführt wurde (3). Der Verlust der positiven Färbung zeigt den Verlust von Antikörperepitopen von dem Phagen aufgrund der proteolytischen Spaltung der zufallsbestimmten Hexamerregion an. Der Kontrollphage PL enthält die P3–P3'-Region der eigentlichen Zielsequenz, welche in Plasminogen vorhanden ist (PGRWG, Reste 4–9 der SEQ ID NR: 1) und wurde durch keines der beiden Enzyme unter den in diesem Test verwendeten Bedingungen verdaut. Substratphage 51 enthielt das Hexamer RIARRA (SEQ ID NR: 148) und war ein Substrat sowohl von t-PA als auch von u-PA. Phage 7 enthielt das Hexamer FRGRAA (SEQ ID NR: 25) und war ein t-PA-selektives Substrat. Phage 33 enthielt das Hexamer RSANAI (SEQ ID NR: 51) und war ein u-PA-selektives Substrat.
Kinetiken der Spaltung von synthetischen Peptiden durch t-PA und u-PA
Individuelle Phagenstämme wurden hergestellt und mit keinem Enzym, mit t-PA, mit u-PA oder mit u-PA in Anwesenheit von 1 mM Amilorid, einem spezifischen Inhibitor von u-PA, verdaut. Kinetische Daten wurden durch Inkubation verschiedener Konzentrationen an Peptid mit einer konstanten Enzymkonzentration, um zwischen 5 und 20% Spaltung des Peptids in jeder Reaktion zu erreichen, erhalten. Für Assays mit u-PA betrug die Enzymkonzentration entweder 815 oder 635 nM. Für Assays mit t-PA war die Enzymkonzentration 700 nM. Peptidkonzentrationen wurden soweit wie möglich so gewählt, dass sie den K_m einschließen und lagen in allen Fällen zwischen 0,5 und 32 mM. Der in diesen Assays verwendete Puffer ist beschrieben worden (Madison, E. L., et al., 1995). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf 0,33% oder durch Gefrieren auf Trockeneis gestoppt. Die Spaltung von 13 und 14 Reste langen Peptiden wurde durch reverse Phase HPLC wie beschrieben (Madison, E. L., et al., 1995) überwacht. Die 4–6 Reste langen Peptide wurden an ihren Aminotermini acetyliert und an ihren Carboxyltermini amidiert. Die Spaltung der 4–6 Reste langen Peptide wurde durch hydrophile Interaktion HPLC Chromatografie (hydrophilic interaction HPLC chromatography, HILIC) (Alpert, A. J. (1990) J. Chromatog. 499, 177–196) unter Verwendung von Polyhydroxyaspartamin-Säulen von PolyLC (Columbia, MD) überwacht. Puffer A bestand aus 50 mM Triethylaminphosphat in 10% Acetonitril und Puffer B bestand aus 10 mM Triethylaminphosphat in 80% Acetonitril. Die Peptide wurden durch einen Gradienten eluiert, weicher von 100% Puffer B zu 100% Puffer A während eines 13 Minuten Intervalls gewechselt wurde. Die Prozent an gespaltenem Peptid wurden durch Teilen der Fläche unter den Produktpeaks durch die gesamte Fläche unter den Substrat- und Produktpeaks errechnet. Für alle Peptide, welche mehrere basische Reste enthalten, bestätigte die Massenspektrumanalyse von Produkten, dass die Spaltung an einer einzigen Stelle stattfand und identifizierte die leicht spaltbare Bindung. Die Daten wurden durch die Eadie-Hofstee-Analyse ausgewertet. Die Fehler wurden wie beschrieben bestimmt (Taylor, J. R., 1982) An introduction to error analysis. The study of uncertainties in physical measurements. University Science Books, Mill Valley, California.) und betrugen < 25%.
Die Resultate der kinetischen Analyse sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst, welche die Werte, die für die Spaltung des nativen Targets, von Plasminogen (I), t-PA-selektiven Peptiden (II–X) und u-PA-selektiven Peptiden (XI–XVIII) bestimmt wurden, vergleicht.
Drei Peptidsubstrate (II–IV), welche die Hexamersequenzen, die in individuellen Mitgliedern der Substrat-Subtraktions-Bibliothek vorhanden sind, enthalten, wurden synthetisiert und charakterisiert, um eine quantitative Analyse der Eigenschaften von putativen t-PA-selektiven Substraten zur Verfügung zu stellen. Diese Peptide wurden zwischen 13 und 47 mal effizienter durch t-PA als durch u-PA gespalten (Tabelle 1).
Der Vergleich der Hexamersequenzen, die durch die Substrat-Subtraktions-Bibliothek erhalten wurden und der Konsensussequenzen, die für Substrate von u-PA und t-PA abgeleitet wurden, bestätigt die erwartete enge Ähnlichkeit zwischen der optimalen Teilstellen-Besetzung für diese beiden eng verwandten Enzyme. Zusätzlich weisen diese Daten stark daraufhin, dass der P3-Rest eines Substrates die primäre Determinante für die Fähigkeit, zwischen t-PA und u-PA zu unterscheiden, ist. t-PA bevorzugt Arginin oder große hydrophobe Reste an dieser Position, während u-PA kleine hydrophile Reste, insbesondere Serin, bevorzugt.
Im Gegensatz zu den unter Verwendung von t-PA erhaltenen Resultate, war ein Standard-Phagen-Display ausreichend, um hoch selektive u-PA-Substrate hervorzubringen. Einhundert Substratphagen, welche 89 verschiedene zufallsbestimmte Hexamersequenzen enthalten, wurden unter Verwendung von u-PA selektiert (Tabelle 4). Eine Dotblot-Analyse der individuellen Phagenstämme unter zunehmend stringenten Bedin gungen zeigte, dass elf Klone, welche acht verschiedene Hexamersequenzen enthalten, besonders labile u-PA-Substrate waren (Tabelle 3). Peptide, welche vier dieser acht Hexamersequenzen (XI–XIV) enthalten, wurden synthetisiert und charakterisiert. Alle vier Peptide waren wesentlich verbesserte Substrate für u-PA, um Faktor 840–5300, im Vergleich zu einem Kontrollpeptid (I), das die eigentliche Zielsequenz, die in Plasminogen vorhanden ist, enthielt (Tabelle 3). Die vier Peptide wurden außerdem 16–89 mal effizienter durch u-PA als durch t-PA gespalten.
Um die Schlüsselrolle von P3 in der Bestimmung der Spezifitätsunterschiede zwischen t-PA und u-PA zu bestätigen, wurden Varianten eines u-PA-selektiven Peptids, welches entweder Tyrosin oder Arginin an dieser Position enthielten, synthetisiert und charakterisiert. In auffälligem Kontrast zum Stammpeptid XI wurden die beiden Varianten (Peptide VIII und IX) 5,2–5,7 mal effizienter durch t-PA als durch u-PA gespalten, eine 320-fache Umkehr in der Substratpräferenz (Tabelle 1). Der weitere Austausch des Glycins, welches sich an P4 des u-PA-selektiven Substrates befindet, durch Glutamin (Peptid X) erhöhte die t-PA-Selektivität auf das 19-fache gegenüber u-PA. Punktmutationen sowohl an P4 und P3 veränderten daher die relative Spezifität von t-PA gegenüber u-PA um Faktor 1200.
Die oben beschriebene kinetische Analyse wurde unter Verwendung von Substratpeptiden, welche 14 Aminosäuren lang waren, durchgeführt. Um zu bestätigen, dass die von uns beobachtete Spezifität den selektierten Hexapeptidsequenzen inhärent war und daher von ihnen erwartet werden würde, dass sie einfach in brauchbare Peptidome kleiner Moleküle umgewandelt werden können, haben wir die Spaltungskinetiken von kurzen Peptiden, welche nur Sequenzen enthalten, die innerhalb der selektierten Hexapeptidsequenzen vorkommen, untersucht. Sowohl für t-PA als auch für u-PA-selektive Substrate wurde die Spezifität durch verwandte Pentapeptide aufrechterhalten. Das Peptid FRGRK wurde etwa 74 mal effizienter von t-PA als von u-PA gespalten, während das Peptid GSGKS etwa 120 mal effizienter von u-PA als von t-PA hydrolysiert wurde (Tabelle 1). Die relative Spezifität dieser beiden Pentapeptide für die Spaltung durch t-PA im Vergleich zu u-PA unterscheidet sich daher um einen Faktor von etwa 9000, was anzeigt, dass die geeignete Besetzung von den P4–P1' Teilstellen alleine die Fähigkeit eines Substrates, zwischen den eng verwandten Enzymen t-PA und u-PA zu unterscheiden, vermitteln kann.
Um weiterhin das Ausmaß der Substratdiskriminierung, die in anderen strukturellen Kontexten erreicht werden könnte, zu bestimmen, wurde das t-PA-selektive Hexapeptid QRGRSA in ein Fusionsprotein eingeführt, welches aus einem Photorezeptorprotein verbunden mit einem Maltosebindungsprotein besteht. t-PA spaltete das Fusionsprotein einfach (4), während u-PA dies nicht tat, was die Aufrechterhaltung der Spezifität für die Spaltung von dieser selektierten Primärsequenz in dem strukturellen Kontext eines Proteinsubstrates zeigt.
Die Fusion besteht aus einem Maltosebindungsprotein, welches mit dem Aminoterminus des HY4-Genproduktes von Arabidopsis thaliana fusioniert ist, mit einer Linkerregion dazwischen, welche für die Aminosäuresequenz QRGRSA kodiert, die von t-PA zwischen R und S gespalten wird. Die Konzentration des Fusionsproteins in jeder Spur ist 1,4 mM und die Konzentration von u-PA oder u-PA ist 150 nM. Der Reaktionspuffer enthält 50 mM Tris pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,01% Tween 20. Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 ml angesetzt und 16 Stunden bei 25°C inkubieren gelassen und anschließend durch die Zugabe von 5 ml eines 5 × Ladepuffers gestoppt und durch Elektrophorese auf 12% Polyacrylamid getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue 30 Minuten gefärbt und über Nacht entfärbt.
Tabelle 2: Primärsequenzen von Hexameren der t-PA-selektiven Substratklone
Tabelle 3: Primärsequenzen von Hexameren der labilsten u-PA-Substratklone
Tabelle 4: Zusammenfassung der u-PA-Phagenselektion
Tabelle 4 Fortsetzung: Zusammenfassung der u-PA-Phagenselektion
BEISPIEL 2
Herstellung von spezifischen Inhibitoren für t-PA
Spezifische Inhibitoren für t-PA wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 gewonnen Sequenzen konstruiert, indem Varianten von PAI-1, dem natürlichen Inhibitor von t-PA, hergestellt wurden.
Zielgerichtete Mutagenese und Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher für eine rekombinante Variante von PAI-1 kodiert
Der Expressionsvektor pPAIST7HS wurde von dem Plasmid pBR322 abgeleitet und enthielt eine vollständig lange cDNA, welche humanes PAI-1 kodiert, die von einem T7-Gen 10 Promotor transkribiert wurde (Tucker, H. M., et al., (1995) Nature Struct. Biol. 2: 442–445). Das 300 bp Sal I/Bam HI-Fragment des humanen PAI-1 wurde von pPAIST7HS in den Bakteriophagen M13mg18 subkloniert. Einzelsträngige DNA, welche von dem rekombinanten M13mg18-Konstrukt hergestellt wurde, wurde als Template für die zielgerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Zoller und Smith (Zoller, M. I., und Smith, M. (1984) DNA 3, 479–488), wie durch Kunkel modifiziert (Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 488–492) verwendet.
Die Expression von Wildtyp PAI-1 und der mutierten Variante von PAI-1 wurde in dem E. coli-Stamm BL21[DE3]pLys^s (Novagen, Madison, WI) erreicht, welcher T7 RNA-Polymerase in der Anwesenheit von Isopropylothio-B-D-galactosid (IPTG) synthetisiert. Die Bakterienkulturen wurden bei 37 Grad Celsius unter starkem Schütteln bis zu einer A₅₉₅ von 0,9–1,1 wachsen gelassen, und IPTG wurde mit einer Endkonzentration von 1 mM dazugegeben, um die Synthese der T7 RNA-Polymerase und der Produktion von PAI-1-Proteinen zu induzieren. Die Kulturen wurden für weitere 1–2 Stunden bei 37 Grad Celsius wachsen gelassen und dann auf 30 Grad Celsius für 2–6 Stunden umgestellt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 × g für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius pelletiert und in 40 ml kaltem Startpuffer (20 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl und 0,01% Tween 20, pH 5,6) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer French Press (French pressure cell (Aminco) aufgeschlossen, und die Zelltrümmer wurden durch Ultrazentrifugation für 25 Minuten bei 32000 × g entfernt.
Die Reinigung von löslichem, aktivem PAI-1 wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Sancho, E., et al., (1994) Eur. J. Biochem. 224: 125–134). Die PAI-1 enthaltenen Überstände wurden auf eine XK-26-Säule (Pharmacia Biotech), welche mit CM-50 Sephadex (Pharmacia) gefüllt war, injiziert. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina Startpuffer (20 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl und 0,01% Tween 20, pH 5,6) gewaschen, und die PAI-1-Proteine wurden unter Verwendung eines 0,2 M–1,8 M linearen NaCl-Gradienten in demselben Puffer eluiert. Die Fraktionen mit dem höchsten Wert (Peak-Fraktionen) wurden gesammelt, vereint und unter Verwendung eines Centriplus 30 Konzentrators (Amicon) konzentriert. Die gereinigten Herstellungen wurden durch Aktivitätsmessungen unter Verwendung eines Standard-Direkt-Assays von t-PA, SDS-PAGE und der Messung der optischen Dichte bei 280 nm analysiert.
Messung von aktivem PAI-1 in gereinigten Herstellungen
Ein Primärstandard von Trypsin wurde durch aktives Zentrum-Titration (active site titration) unter Verwendung von p-Nitrophenyl-guanidinobenzoat HCl wie zuvor beschrieben hergestellt (Chase, T., und Shaw, E. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 29: 508–514). Die Konzentrationen an aktiven Molekülen in den gereinigten Herstellungen von Wildtyp-PAI-1 oder mutiertem PAI-1 wurden durch Titration von standardisiertem Trypsin wie durch Olson et al. beschrieben (Olson, S. T., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 30007–30017) und durch Titration von standardisierten t-PA-Herstellungen bestimmt.
Kinetische Analyse der Inhibition von t-PA und u-PA durch rekombinantes PAI-1 und PAI-1/UKI
Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung (k_i) für die Inhibition von t-PA oder u-PA wurden unter Verwendung von Bedingungen der pseudo-ersten Order (k_i < 2 × 10⁶) oder zweiten Ordnung (k_i > 2 × 10⁶) bestimmt. Für jede Reaktion wurden die Konzentrationen an Enzym und Inhibitor so gewählt, dass sie mehrere Datenpunkte ergaben, für welche die restenzymatische Aktivität zwischen 20%–80% der ursprünglichen Aktivität variier te. Die Reaktionsbedingungen und die Datenanalyse für pseudo-erste Ordnung-Reaktionen waren wie zuvor beschrieben.
Für Reaktionen zweiter Ordnung wurden äquimolare Konzentrationen an u-PA und PAI-1 direkt in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten vermischt und bei Raumtemperatur für Zeiträume, welche zwischen 0 und 30 Minuten lagen, präinkubiert. Im Anschluss an die Präinkubation wurden die Mischungen mit einem Überschuss an neutralisierendem anti-PAI-1-Antikörper (freigiebig zur Verfügung gestellt durch Dr. David Loskutoff) gequencht und die restenzymatische Aktivität wurde unter Verwendung eines Standard-indirekten chromogenen Assays (standard, indirect chromogenic assay) gemessen. Diese indirekten chromogenen Assays wurden verglichen, um solche Reaktionen zu kontrollieren, die kein PAI-1 enthielten oder zu denen PAI-1 nach der Präinkubation, der Zugabe von anti-PAI-1-Antikörper, Plasminogen und Spec PL zu der Reaktionsmischung dazugegeben wurde. Die Daten wurden durch Blotten des Kehrwertes der Restenzymkonzentration gegenüber der Zeit der Präinkubation analysiert.
Um die Vorhersage zu überprüfen, welche auf einer Analyse der Spaltung von Peptidsubstraten beruhte, wonach die P3-Reste die Fähigkeit an eines Inhibitors, zwischen t-PA und u-PA zu unterscheiden, vermitteln kann, wurde eine ortsgerichtete Mutagenese mit PAI-1 durchgeführt, dem primären physiologischen Inhibitor sowohl von t-PA als auch u-PA.
Drei Varianten von PAI-1 wurden hergestellt und charakterisiert. Die erste war eine Variante, in welcher das P3-Serin (Ser 344) in ein Argininrest umgewandelt war. Die zweite war eine Variante, in welcher das P4-Valin (Val 343) durch ein Glutaminrest ersetzt wurde. Die dritte Variante war eine Doppelmutante, in welcher beide Substitutionen durchgeführt wurden.
Die kinetische Analyse der Inhibition sowohl von t-PA als auch von u-PA durch diese Varianten von PAI-1 war konsistent mit den Tests, welche auf den Peptidsubstraten basierten. Die Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von t-PA und u-PA durch Wildtyp PAI-1 waren 1,6 × 10⁶ M^–1s^–1 bzw. 1,9 × 10⁷ M^–1s^–1. Folglich zeigt das Wildtyp PAI-1 eine etwa 11,9-fache Spezifität gegenüber u-PA.
Dagegen waren die Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von t-PA und u-PA durch die P3-Argininmutante von PAI-1 1,4 × 10⁶ M^–1s^–1 bzw. 1,0 × 10⁵ M^–1s^–1, eine etwa 170-fache Umkehrung in der Spezifität gegenüber t-PA. Diese große Spezifitätsänderung wurde erreicht, ohne die Aktivität gegenüber dem Zielenzym zu opfern. Die P3-Argininmutation reduzierte die Aktivität von PAI-1 gegenüber u-PA um einen Faktor von etwa 190, ohne die Reaktivität gegenüber t-PA signifikant zu beeinträchtigen.
Eine individuelle Mutation des P4-Valins zu einem Glutamin hatte keinen Effekt auf die Inhibitionsgeschwindigkeit von t-PA oder u-PA. Wie durch die Vorherrschaft von Substraten in der Subtraktionsbibliothek nahegelegt, welche sowohl große P3- als auch große P4-Rest enthalten, erhöhte die P4-Glutaminmutation die t-PA-Selektivität von der P3-Argininvariante von PAI-1 nicht. Die Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von t-PA und u-PA durch diese PAI-1 Doppelmutante waren 1,4 × 10⁶ M^–1s^–1 bzw. 2,9 × 10⁴ M^–1s^–1. Während sie die volle Aktivität gegenüber t-PA behielt, zeigte die Doppelmutante eine etwa 600-fach verstärkte t-PA/u-PA-Selektivität im Vergleich zu Wildtyp-PAI-1 und eine etwa 3,5-fach höhere t-PA-Selektivität als die P3-Argininvariante von PAI-1. Die absolute t-PA/u-PA-Selektivität von Wildtyp-PAI-1, der P3-Arginin-Einzelmutante und der P3 Arg, P4 Gln Doppelmutante war 0,08, 14 bzw. 48.
Tabelle 5 Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von t-PA oder u-PA durch Wildtyp-PAI-1 und Varianten von PAI-1
BEISPIEL 3
Herstellung von spezifischen Inhibitoren von Urokinase
Das Substrat-Phagen-Display allein, ohne substraktives Substratscreening ermöglichte die Identifizierung von Peptiden, welche 840–5300 mal effizienter von u-PA gespalten werden, als Peptide, welche die physiologische Wildtyp-Zielsequenz des Enzyms enthalten. Zusätzlich wurden die selektierten Peptidsubstrate ganze 120 mal effizienter von u-PA gespalten als von t-PA.
Im Allgemeinen, mit Ausnahme des Screeningprotokolls, sind die Verfahren, die angewendet wurden, dieselben wie die in Beispiel 1 verwendeten. Der Verdau der Phagen wurde unter Verwendung von Enzymkonzentrationen, die zwischen 2–10 μg/ml lagen und Inkubationszeiten, welche zwischen 0,5 und 10 Stunden lagen, durchgeführt. Die Phagenpräzipitation und Dotblot-Analyse wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Individuelle Phagenstämme wurden hergestellt und mit keinem Enzym, mit t-PA, u-PA, oder u-PA in der Anwesenheit von 1 mM Amilorid, einem spezifischen Inhibitor von u-PA' für Zeiträume, die von 15 Minuten bis 10 Stunden variierten, verdaut. Die einzelnen Reaktionsmischungen wurden unter Verwendung eines Dotblot-Apparates (dot blotter apparatus, BioRad) auf einen Nitrozellulosefilter gespottet. Die Filter wurden mit MAb 3E-7 untersucht und unter Verwendung des Amersham Western ECL-Kits entwickelt. Ein Verlust der positiven Färbung zeigt den Verlust an Antikörperepitopen des Phagens aufgrund der proteolytischen Spaltung der randomisierten Hexamerregion an.
Kinetische Daten wurden durch Inkubation verschiedener Konzentrationen an Peptid mit einer konstanten Enzymkonzentration, so dass zwischen 5 und 20% Spaltung des Peptids in jeder Reaktion, wie in Beispiel 1 beschrieben erreicht wurde, erhalten.
Eine polyvalente fd-Phagenbibliothek, welche zufallsbestimmte Hexapeptidsequenzen aufwies und 2 × 10⁸ unabhängige Rekombinante enthielt, wurde hergestellt. Jedes Mitglied dieser Bibliothek wies eine N-terminale Verlängerung von dem Phagenhüllprotein III (pIII), welche eine zufallsbestimmte Region von sechs Aminosäuren enthielt, eine sechs Reste lange Linkersequenz (SSGGSG) und die Epitope für mAb 179 und mAb 3-E7 auf. Da u-PA die pIII-Sequenz, die Antikörperepitope oder die flexible Linkersequenz nicht verdaute, erforderte der Verlust der Antikörperepitope von der Phagenoberfläche nach Inkubation mit u-PA die Spaltung des randomisierten Peptidinserts. Die Inkubation der Bibliothek mit u-PA, gefolgt von der Entfernung der Phagen, welche die Antikörperepitope behielten, erreichte damit eine starke Anreicherung von Phagenklonen, deren zufallsbestimmte Hexamersequenz von u-PA gespalten werden konnte.
Im Anschluss an fünf Selektionsrunden, um Phagen anzureichern und zu amplifizieren, die Sequenzen aufwiesen, die leicht von u-PA gespalten werden, wurden 100 Phagenklone als u-PA-Substrate identifiziert. Die DNA-Sequenzierung dieser Klone offenbarte die Präsenz von 91 verschiedenen Hexamersequenzen unter den ausgewählten Phagen (Tabelle 6 unten). Wie von der trypsinähnlichen Primärspezifität von u-PA erwartet, enthielt jedes Hexamer wenigstens einen basischen Rest, und 89 der 91 Hexamersequenzen enthielten wenigstens einen Argininrest. 35 der 91 Substratphagen enthielten einen einzigen basischen Rest, und in 33 von diesen 35 Fällen war der einzige basische Rest ein Arginin. Weitere 22 Phagen enthielten zwei basische Reste, jedoch nur ein einziges Arginin. Das Alignment und die Analyse dieser Hexamersequenzen wies darauf hin, dass die Konsensussequenz für eine optimale Teilstellenbesetzung für Substrate von u-PA, von P3–P2', SGR(S > R, K, A)X war, wobei "X" eine Vielzahl von Aminosäureresten darstellt, jedoch meistens Alanin, Glycin, Serin, Valin oder Arginin ist.
Die Analyse dieser Daten wurde durch die Tatsache erschwert, dass etwa 72% der selektierten Substratphagen ein Arginin in der ersten Position des randomisierten Hexamers enthielten und daher die aminoterminal flankierenden Reste, Ser-Gly nutzten, um die P3- und P2-Teilstellen zu besetzen. Während diese Resultate keinen Zweifel daran ließen, dass die P3-PT SGR-Sequenz, welche durch die Fusion erzeugt wurde, eine sehr günstige Erkennungsstelle für u-PA war, erforderte diese Verwendung von flankierenden Resten eine besonders vorsichtige Untersuchung der P3- und P2-Präferenzen von u-PA.
Zwei Änderungen wurden in dem experimentellen Protokoll vorgenommen, um die P3- und P2-Präferenzen von u-PA zu untersuchen. Zunächst wurde eine ungewöhnlich große Sammlung an Substratphagen (91) isoliert, um sicherzustellen, dass eine angemessene Zahl dieser Substratphagen (23) die flankierenden Ser-Gly nicht nutzen würden, um die P3- und P2-Teilstellen auszufüllen. Dies erlaubte einen aussagefähigen Ver gleich der Konsensussequenz, welche von der gesamten Bibliothek abgeleitet wurde, mit der Sequenz, welche von den Nichtfusionsphagen abgeleitet wurde, sowie den Nachweis einer guten Übereinstimmung zwischen den beiden Konsensussequenzen. Als zweites wurde eine Dotblot-Analyse wie in Beispiel 1 beschrieben mit allen 100 Substratphagen unter Verwendung einer großen Vielfalt von Stringenzien für den Verdau durch u-PA durchgeführt. Obwohl dieser semiquantitative Assay keine kinetischen Konstanten zur Verfügung stellen kann, kann er eine akkurate Rangfolge der Labilitäten der Substratphagenklone zur Verfügung stellen.
Unter den stringentesten untersuchten Bedingungen erwiesen sich 11 der 100 Substratphagen, die 8 verschiedene randomisierte Hexamersequenzen enthalten, als besonders labile u-PA-Substrate. Die Sequenzen waren dieselben wie die in Tabelle 3 oben aufgeführten. Alle 8 der labilsten Substratphagen enthielten das P3–P1 SGR-Motiv, was zeigte, dass diese Sequenz tatsächlich eine labilere u-PA-Stelle als die verwandten, ausgewählten Sequenzen, welche in der Bibliothek vorhanden sind, wie z. B. SSR, TAR, TSR, TTR etc., ist. Diese Dotblot-Analyse erbrachte auch zusätzliche Informationen bezüglich der Präferenz von u-PA für die ungeprimten Teilstellen. Während die Analyse der gesamten Substratphagen-Bibliothek einen klaren Konsensus bei P1' und P2' nicht erkennen ließ, wiesen die labilsten Substratphagen einen offensichtliche Präferenz an beiden diesen Positionen auf. Fünf der acht labilsten Phagen enthielten einen Serinrest an P1', und sieben dieser acht Phagen enthielten einen Alaninrest an P2'. Diese Beobachtungen weisen stark daraufhin, dass die Primärsequenz SGRSA, von P3–P2', die optimale Teilstellenbesetzung für Substrate von u-PA repräsentiert.
Tabelle 6. Aminosäuresequenzen der Hexapeptide in 89 isolierten Substratphagenklonen
Tabelle 6 (Fortsetzung). Aminosäuresequenzen der Hexapeptide in 89 isolierten Substratphagenklonen
Kinetische Analyse der Spaltung von Peptiden, welche Sequenzen enthalten, die in den selektierten Substratphagen vorhanden sind
Vier Peptide, welche Aminosäuresequenzen enthalten, die in der randomisierten Hexamerregion der labilsten Phagen vorhanden sind, wurden für eine detaillierte kinetische Analyse ausgewählt (Tabelle 7) und mit der Hydrolyse eines Kontrollpeptides (I), welches die P3–P4'-Sequenz von Plasminogen enthält, eine Serie von Resten, die sich innerhalb der Disulfid-vernetzten Schlaufe in dem nativen Protein befinden, verglichen. Alle vier der selektierten Peptide stellten substanziell verbesserte Substrate für u-PA dar, um Faktor 840–5300, verglichen mit dem Kontroll-Plasminogenpeptid (Tabelle 7). Diese Zunahmen an katalytischer Effizienz wurden primär durch Zunahmen in k_cat vermittelt, was nahe legt, dass optimierte Teilstelleninteraktionen eher dazu dienten, die Energie des Übergangszustandes zu verringern, als die des Grundzustandes. Zum Beispiel wurde der K_m für die Spaltung der labilsten selektierten Peptide (II) im Vergleich mit dem des Kontrollpeptides (I) um einen Faktor von 5,6 reduziert. Der k_cat jedoch war um einen Faktor von mehr als 940 erhöht. Zusätzlich waren die Peptidsubstrate, die optimal mit den primären Teilstellen von u-PA interagierten, selektiv für die Spaltung durch u-PA relativ zu t-PA. Die vier selektierten Peptide (II–V) wurden z. B. 16–89 mal effizienter von u-PA als von t-PA gespalten, und Verbesserungen sowohl in K_m als auch in k_cat trugen zu der präferenziellen Hydrolyse durch u-PA bei.
Minimierung der selektiven Peptidsubstrate
Die oben beschriebene kinetische Analyse wurde unter Verwendung von Substratpeptiden durchgeführt, die 14 Aminosäuren lang waren. Um zu bestätigen, dass die beobachtete Spezifität den selektierten Hexapeptidsequenzen inhärent war, wurden die Spaltungskinetiken von kurzen Peptiden, welche nur Sequenzen, die innerhalb der selektierten Hexapeptidsequenzen liegen, enthalten, untersucht. Pentapeptid VII wurde z. B. von u-PA mit einer katalytischen Effizienz von 1200 M^–1s^–1 gespalten und zeigte eine u-PA/t-PA-Selektivität von 20. Das Verhalten des Pentamers VII in diesen Assays war daher ähnlich dem des Peptids IV, einem 14-mer, das dieselbe P3–P2'-Sequenz wie das Pentamer enthält. Diese Beobachtungen deuten an, dass eine geeignete Besetzung der P3–P2'-Teilstellen allein selektive Substrate für u-PA erzeugen kann.
Unterschiede zwischen u-PA und t-PA an Position 190 (Chymotrypsin-Nummernsystem) legen nahe, dass u-PA eine verringerte Diskriminierung zwischen Arginin und Lysin an der P1-Position eines Substrates im Vergleich zu t-PA zeigen kann. Übereinstimmend mit dieser Hypothese und im Gegensatz zu der selektierten t-PA-Substratbibliothek enthielt die u-PA-Bibliothek Mitglieder, welche ein P1-Lysin enthielten. Diese Beobachtung legte nahe, dass die u-PA/t-PA-Selektivität eines Peptidsubstrates durch Platzierung eines Lysins an die P1-Position verstärkt werden sollte, obwohl diese erhöhte Selektivität wahrscheinlich von einer verringerten Reaktivität gegenüber u-PA begleitet wurde. Um diese Hypothese zu überprüfen, analysierten wir die Hydrolyse einer Variante eines u-PA-selektiven Peptids (VI), das ein P1-Lysin enthielt (Peptid VIII). Die P1-Lysinmutation verringerte die katalytische Effizienz für die Spaltung dieses Peptids um Faktor 49 für t-PA und um Faktor 7 für u-PA. Wie vorhergesagt verstärkte die P1-Lysinmutation die u-PA/t-PA-Selektivität des Peptidsubstrates um einen Faktor von etwa 7. Es ist daher nicht überraschend, dass das selektivste u-PA-Substrat, Peptid IX, welches etwa 121 mal effizienter durch u-PA als durch t-PA gespalten wird, von der randomisierten Hexamerregion eines Substratphagen abgeleitet ist, die ein P1-Lysin enthielt.
Bedeutung von P3 und P4 für die Unterscheidung zwischen u-PA und t-PA
Neueste Untersuchungen, welche die optimale Teilstellenbesetzung für Substrate von t-PA untersuchten, legten nahe, dass der P3-Rest die primäre Determinante für die Fähigkeit eines Substrates, zwischen t-PA und u-PA zu diskriminieren, war und dass diese Selektivität geringfügig durch die geeignete Besetzung von P4 verstärkt werden könnte. Diese Vorschläge basierten eher auf Hinweisen, die aus einer statistischen Analyse der unter Verwendung eines Substrat-Subtraktions-Protokolls selektierten Phagen erhalten wurde, als durch eine kinetische Analyse von Peptidsubstraten. Um diese Hypothesen zu überprüfen, synthetisierten wir folglich Varianten des labilsten u-PA-selektiven Substrates (Peptid II), welche Mutationen an den P3- und/oder P4-Positionen enthielten und analysierten die Hydrolyse dieser Peptide durch u-PA und t-PA. In Peptid X wurde das P3-Serin von Peptid II durch ein Tyrosin ersetzt, und in Peptid XI wurde das P3-Serin durch ein Arginin ersetzt. Wie erwartet verringerten diese Mutationen die u-PA/t-PA-Selektivität des Peptides substanziell um Faktor 330 bzw. 360 und wandelten das Peptid tatsächlich in ein t-PA-selektives Substrat um. Darüber hinaus verringerte die Mutation sowohl des P3-Serins als auch des P4-Glycins des labilsten u-PA-Substrates zu Arginin bzw. Glutamin (Peptid XII) die u-PA/t-PA-Selektivität um einen Faktor von 1200. Diese Daten bestätigen den vorgeschlagenen Status der P3- und P4-Reste als Spezifitätsdeterminanten für Substrate von t-PA und u-PA und legten eine besonders prominente Rolle des P3-Restes in dieser Eigenschaft nahe.
BEISPIEL 4
Konstruktion und Charakterisierung einer Variante von PAI-1, die selektiv für u-PA ist
Die Analyse der selektierten Peptidsubstrate, welche in Beispiel 3 identifiziert wurden, zeigte, dass die Primärsequenz SGRSA, von Positionen P3 bis P2', eine optimale Teilstellenbesetzung für Substrate von u-PA repräsentierte. Diese Information wurde verwendet, um eine Variante des Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1 (PAI-1 ), den primären physiologischen Inhibitor sowohl von u-PA als auch von t-PA, zu konstruieren, die u-PA etwa 70 mal schneller inhibierte als sie t-PA inhibierte.
Spezifische Inhibitoren von u-PA wurden unter Verwendung des Verfahrens, welches in Beispiel 2 beschrieben ist, durch die Herstellung von Varianten von PAI-1 konstruiert. Oligonukleotid-vermittelte ortsspezifische Mutagenese wurde wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet, um eine Variante von PAI-1, welche die Primärsequenz enthielt, die in den Peptidsubstraten, welche am selektivsten für u-PA waren, vorhanden war, GSGKS, von der P4–P1'-Position der reaktiven Schleife (reactive center loop), zu konstruieren. Das mutagene Oligonukleotid hatte die Sequenz 5'-CCACAGCTGTCATAGGCAGCGGCAAAAGCGCCCCCGAGGAGATC-3'.
Im Anschluss an die Mutagenese wurde die einzelsträngige DNA, die dem gesamten 300 bp SalI-BamHI-Fragment entspricht, vollständig sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Mutationen und die Abwesenheit von irgendwelchen zusätzlichen Mutationen sicherzustellen. Das 300 bp SalI-BamHI dsDNA-Fragment der mutierten, replikativen Form der DNA wurde verwendet, um das korrespondierende Fragment in pPAIST7HS zu ersetzen, um eine vollständig lange cDNA, die für PAI-1/UK1 kodiert, zu erhalten, welche die Aminosäuresequenz GSGKSA der P4- bis P2'-Positionen der reaktiven Schleife enthielten.
Kinetische Analysen zeigten, dass die PAI-1-Variante u-PA etwa 70 mal schneller inhibierte als sie t-PA inhibierte, mit Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von u-PA und t-PA von 6,2 × 10⁶ M^–1s^–1 bzw. 9 × 10⁴ M^–1s^–1. Dagegen inhibiert Wildtyp-PAI-1 u-PA und t-PA mit Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung von 1,9 × 10⁷ M^–1s^–1 bzw. 1,8 × 10⁶ M^–1s^–1. Wie erwartet besaß das mutierte Serpin daher eine u-PA/t-PA-Selektivität, die etwa 7 mal höher war als die von Wildtyp-PAI-1. Darüber hinaus ist die 70-fache Selektivität der PAI-1-Variante konsistent mit dem Wert 120, welcher für die Hydrolyse des korrespondierenden Peptidsubstrates durch die beiden Enzyme beobachtet wurde (Tabellen 7 und 8).
Tabelle 8 Geschwindigkeitskonstanten der zweiten Ordnung für die Inhibition von t-PA oder u-PA durch Wildtyp-PAI-1 und die Variante PAI-1/UK1
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für die Fachleute auf dem Gebiet des Protein-Engineerings oder der gezielten Wirkstoffentwicklung (rational drug design) offensichtlich sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung einer Substrat-Subtraktions-Peptidbibliothek, worin jedes Peptid ein Substrat für ein erstes Peptid-modifizierendes Enzym ist, nicht aber ein Substrat für ein zweites Peptid-modifizierendes Enzym, das die folgenden Schritte umfasst: a) das zur Verfügung stellen einer kombinatorischen Bibliothek, die Komponenten umfasst, die verschiedene Peptide zur Verfügung stellen; b) das in Kontakt bringen der kombinatorischen Bibliothek mit einem ersten Peptid-modifizierenden Enzym, um es dem ersten Enzym zu ermöglichen, Peptide in der Bibliothek zu modifizieren, um einen ersten modifizierten Peptidkomponentenanteil und einen ersten nicht-modifizierten Peptidkomponentenanteil der Bibliothek auszubilden; c) das Abtrennen des ersten modifizierten Anteils der Bibliothek von dem ersten nicht-modifizierten Anteil der Bibliothek; d) das in Kontakt bringen des ersten modifizierten Anteils der Bibliothek mit einem zweiten Peptid-modifizierenden Enzym, um es dem zweiten Enzym zu ermöglichen, Peptide in dem ersten modifizierten Anteil der Bibliothek zu modifizieren, um einen zweiten modifizierten Peptidkomponentenanteil und einen zweiten nicht-modifizierten Peptidkomponentenanteil der Bibliothek auszubilden; e) das Abtrennen des zweiten modifizierten Anteils der Bibliothek von dem zweiten nicht-modifizierten Anteil der Bibliothek; und f) das Zurückbehalten des zweiten nicht-modifizierten Anteils, um eine Bibliothek von Peptiden auszubilden, die jeweils ein Substrat für das erste Enzym sind, nicht jedoch ein Substrat für das zweite Enzym sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Proteasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das erste Enzym den Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) umfasst und das zweite Enzym den Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (u-PA) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das erste Enzym den Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (u-PA) und das zweite Enzym den Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Kinasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Phosphatasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die kombinatorische Bibliothek eine Bakteriophagen-Display-Bibliothek ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Substrat-Subtraktionspeptidbibliothek, worin jedes Peptid ein Substrat für ein zweites Peptid-modifizierendes Enzym ist, nicht aber ein Substrat für ein erstes Peptid-modifiziertes Enzym, das die folgenden Schritte umfasst: a) das zur Verfügung stellen einer kombinatorischen Bibliothek, die Komponenten umfasst, die verschiedene Peptide zur Verfügung stellen; b) das in Kontakt bringen der kombinatorischen Bibliothek mit einem ersten Peptid-modifizierenden Enzym, um es dem ersten Enzym zu ermöglichen, Peptide in der Bibliothek zu modifizieren, um einen ersten modifizierten Peptidkomponentenanteil und einen ersten nicht- modifizierten Peptidkomponentenanteil der Bibliothek auszubilden; c) das Abtrennen des ersten modifizierten Anteils der Bibliothek von dem ersten nicht-modifizierten Anteil der Bibliothek; d) das in Kontakt bringen des ersten nicht-modifizierten Anteils der Bibliothek mit einem zweiten Peptid-modifizierenden Enzym, um es dem zweiten Enzym zu ermöglichen, Peptide zu modifizieren, um einen zweiten modifizierten Peptidkomponentenanteil und einen zweiten nicht-modifizierten Peptidkomponentenanteil der Bibliothek auszubilden; e) das Abtrennen des zweiten modifizierten Anteils der Bibliothek von dem zweiten nicht-modifizierten Anteil der Bibliothek und das Zurückbehalten des zweiten modifizierten Anteils, um eine Bibliothek von Peptiden auszubilden, die jeweils ein Substrat für das zweite Enzym, nicht aber ein Substrat für das erste Enzym sind.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Proteasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das erste Enzym den Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) umfasst, und das zweite Enzym den Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (u-PA) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das erste Enzym den Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (u-PA) umfasst und das zweite Enzym den Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Kinasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das erste Enzym und das zweite Enzym Phosphatasen sind.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin die kombinatorische Bibliothek eine Bakteriophagen-Display-Bibliothek ist.
Ein isoliertes Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 148 und SEQ ID NO: 150 bis SEQ ID NO: 239 besteht.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 30 besteht.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 141 bis SEQ ID NO: 148 besteht.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 150 bis SEQ ID NO: 239 besteht.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 18 besteht.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 150 ist.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 151 ist.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 152 ist.
Das Polypeptid von Anspruch 15, worin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 239 ist.