DE3713272A1 - Plasminogenaktivator-inhibitor, typ 2 (pai-2) - Google Patents

Description

Die Bildung von Plasmin aus Plaminogen stellt eine bedeutende Quelle proteolytischer Aktivität in Zellen, Gewebe und biologischen Flüssigkeiten dar. Die präzise Regulierung der Aktivität von Plasminogenaktivatoren (PA) ist für viele biologische Systeme kritisch. Solche Regelungen finden bei der Bildung und Auflösung von Fibrin, bei der Wechselwirkung der PA mit Zellen und mit Hilfe von spezifischen PA-Inhibitoren (PAI) statt.

Kawano et al., Nature 217 (1968) 253-254, haben gezeigt, daß in Placenta-Homogenisaten ein Inhibitor des Urokinase-Typ-Plasminogenaktivators (uPA) nachweisbar ist. Astedt et al., Thromb. Haemostasis 53 (1985) 122-125, haben durch Affinitätschromatographie Placenta-Typ-Plasminogenaktivator-Inhibitor oder PAI-2 aus humaner Placenta gewonnen. Der Inhibitor bildet einen starken Komplex mit uPA und der zweikettigen Form von Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator (tPA), aber nur einen schwachen Komplex mit der einkettigen Form von tPA. Polyklonale und monoklonale Antikörper gegen den gewonnenen PAI-2 zeigen dessen Verschiedenheit von dem früher isolierten Endotheltzellen-Typ, Plasminogenaktivator-Inhibitor, Typ 1 (PAI-1). Daneben gibt es mindestens noch einen weiteren solchen Inhibitor, nämlich Protease-Nexin (Scott et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 7029-7034), der aber nicht spezifisch ist.

Es zeigte sich daß PA eine zentrale Rolle in vielen physilogischen und pathologischen Vorgängen spielen, die nicht nur mit dem haemostatischen System zusammenhängen, sondern auch mit Vorgängen im Gewebe, wie dessen Reparatur, Metastasenbildung, Ovulation, Befruchtung, mit der Migration von Makrophagen oder mit entzündlichen Prozessen.

Es ist bekannt, daß die Inhibierung des fibrinolytischen Systems mit niedermolekularen Substanzen wie 2-Aminocapronsäure oder trans-4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure für die Behandlung pathologischer Zustände, in denen PA eine Rolle spielen, günstig ist. Eine therapeutische Behandlung mit diesen Substanzen ist jedoch problematisch, da diese synthetischen Verbindungen eine geringe Aktivität und Spezifität aufweisen. Ihr Einsatz in der Behandlung dieser Krankheiten ist deshalb sehr eingeschränkt.

Als Alternative bietet sich die Behandlung mit physilogischen Inhibitoren der PA an, insbesondere mit PAI-2. Krankheiten, gegen die PAI-2 eingesetzt werden kann, sind Blutungen, die auf eine Überaktivität des fibrinolytischen Systems zurückgehen, oder durch eine thrombolytische Therapie mit fibrinolytischen Substanzen wie tPA und uPA bedingt sind. uPA ist an der Verbreitung von Tumoren beteiligt und so kann PAI-2 als effektiver uPA-Inhibitor in der Tumortherapie zur Inhibierung der Tumorverbreitung durch PA Verwendung finden.

Die bisher verfügbaren geringen Mengen von PAI-2 aus Placenta oder Plasma erlaubten nicht dessen Einsatz in größerem Maßstab. Die Erfindung betrifft deshalb die gentechnische Bereitstellung von PAI-2. Hierdurch wird in genügenden Mengen ein starker und spezifischer Inhibitor der aktiven Formen der PA verfügbar. Es können damit Krankheiten bekämpft werden, die mit PA zusammenhängen, und zwar sowohl mit einer erhöhten als auch einer verringerten Aktivität dieser Aktivatoren, wobei die Behandlung sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch sein kann.

Durch immunologisches "Screening" mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (Astedt et al., a. a. O.) wurde aus einer cDNA-Bibliothek (gewonnen aus Human-Placenta-mRNA) eine DNA-Sequenz isoliert und charakterisiert, die die für PAI-2 kodierende DNA umfaßt. Diese DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz sind in Tab. 1 wiedergegeben.

Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz mit anderen Proteinen zeigt, daß PAI-2 zu 32,5% mit Antithrombin-III (AT III homolog ist, zu 30,5% mit dem Vorläufer des humanen α₁-Antitrypsins (α AT), zu 29,6% mit dem Vorläufer des humanen α₁-Antichymotrypsin und zu 39,2% mit Ovalbumin. PAI-2 ist deshalb ein Mitglied der Serin-Proteinase-Inhibitor-Familie (Serpine), einer Gruppe verwandter Proteine, die die bedeutenden proteolytischen Kaskaden des Körpers kontrollieren, beispielsweise die Koagulation, das Komplementsystem, die fibrinolytischen und inflammatorischen Kaskaden.

Eine Übersicht über die Aminosäurefolge der reaktiven Zentren von PAI-2, α AT und AT III gibt die Tab. 2. Es zeigt sich, daß der P₁-Rest des PAI-2 Arginin ist. PA wandeln Plasmainogen in Plasmin unter Spaltung einer einzigen Arg-Val-Bindung um. Diese Zusammenstellung ist somit in Übereinstimmung mit der bekannten Arginin-Spezifität der PA. Damit in Übereinstimmung ist der Befund, daß der P₁₇-Rest. Glutaminsäure ist, da diese als "Scharnier" in den Serpinen wirkt und in allen bisher bekannten Serpinen konserviert ist.

Die ermittelte DNA-Sequenz von PAI-2 erlaubt den Zugang zu gentechnisch hergestellten PAI-2 und seine Verwendung als Arzneimittel bzw. in Arzneimitteln.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur gentechnischen Herstellung von PAI-2, die hierzu erforderliche mRNA, die daraus gewonnene cDNA, diese cDNA ganz oder teilweise enthaltende DNA-Strukturen und Vektoren, mit solcher DNA transformierte Zellen, das von diesen Zellen exprimierte Polypeptid und Arzneimittel, die dieses Polypeptid in einem inerten Träger enthalten. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Teilsequenzen der Aminosäuresequenz von PAI-2, damit gewonnene spezifische Antikörper, aus diesen Antikörpern hergestellte Diagnostika und Antikörpersäulen sowie ein mit Hilfe solcher Säulen gewonnenen Polypeptid. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Diagnostika, die PAI-2 kodierende DNA oder RNA ganz oder teilweise enthalten, und diagnostische Verfahren, mit denen mit solchen Diagnostika Körperflüssigkeiten und Gewebe untersucht werden. Weitere Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausgestaltungen werden im folgenden näher erläutert bzw. in den Patentansprüchen definiert.

Erfindungsgemäß kann die kodierende cDNA dazu benutzt werden, modifizierte Gene herzustellen, die für Proteine mit veränderten biologischen Eigenschaften kodieren. Hierzu können in an sich bekannter Weise Deletionen, Insertionen und Basenaustausche vorgenommen werden.

Durch die Auswahl des Wirtes kann weiterhin die Form der Modifikation von PAI-2 beeinflußt werden. So findet in Bakterien keine, in Hefezellen eine andere Glykosylierung als in höheren eukaryotischen Zellen statt. Die Erfindung bezieht sich ebenso auf PAI-2-Derivate, die N-terminal durch Met bzw. f-Met verlängert sind, also Produkte der bakteriellen Expression. Weiterhin umfaßt die Erfindung Fusionsproteine mit einem "Ballast"-Anteil, gegebenenfalls einem Brückenglied aus genetisch kodierbaren Aminosäuren, die die Abspaltung des gewünschten Proteins ermöglichen oder erleichtern, und dem PAI-22-Anteil.

In Kenntnis der Aminosäuresequenz von PAI-2 ist es möglich, nach konventionellen oder gentechnischen Methoden Aminosäure-Teilesequenzen herzustellen, die als Antigene zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern dienen können. Solche Antikörper können nicht nur zu diagnostischen Zwecken, sondern auch zur Herstellung von Antikörpersäulen dienen, mit denen PAI-2 aus Lösungen abgetrennt werden kann, die dieses Protein neben anderen Proteinen enthalten.

Mit Hilfe der cDNA bzw. Teilen davon kann man sich einfach aus einer genomischen Bank den für PAI-2 codierenden genomischen Klon isolieren, mit dessen Hilfe nicht nur eine Expression in eukaryotischen Zellen möglich ist, sondern auch weitere diagnostische Aussagen getroffen werden können. Es lassen sich so auch gegebenenfalls existierende allelische Variationen von PAI-2 ermitteln. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf solche allelischen Variationen und posttranslationale Variationen wie glykosylierte Proteine.

Die galenische Zubereitung des erfindungsgemäß erhaltenen PAI-2 und die Dosierung entspricht den bisher bekannten Präparaten.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Prozentangaben, sofern sie sich nicht auf Mengen beziehen, betreffen das Gewicht, wenn keine anderen Angaben gemacht sind.

Beispiel 1 Immunologisches "Screenin" einer λgt₁₁-cDNA-Bibliothek

Der E. coli-Stamm Y1090 wurde in 50 ml LB-Medium bei pH 7,5 und 37°C unter guter Belüftung bis zur stationären Phase kultiviert. Die E. coli-Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert und in 20 ml 10 mM Magnesiumsulfatlösung resuspendiert.

Etwa 1,7 × 10⁵ rekombinante Phagen aus einer käuflichen λgt₁₁-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc., 922 Industrial Avenue, Palo Alto, CA 94 304, USA, Katalog-Nr. HL 1008, Lot No. 1205) wurden mit 1,9 ml der Zellsuspension vermischt und bei 37°C 15 Minuten inkubiert. 100 µl der adsorbierten Phagen wurden zu 2,5 ml geschmolzenem LB-Weichagar gegeben und auf eine 90 ml LB-Platte (pH 7,5) gegossen. Insgesamt wurden 19 Platten zum "Screening" der 1,7 × 10⁵ rekombinanten Phagen benutzt.

Die Platten wurden bei 42°C 3,5 Stunden inkubiert und dann vorsichtig mit Nitrozellulose-Membranen belegt, die zuvor in einer 10 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid-Lösung (IPTG) gesättigt wurden. Anschließend wurden die Platten erneut 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert.

Nach Abbildung auf Zimmertemperatur wurde die Lage der Membranen auf den Platten mit einer Nadel markiert, die Membranen sorgfältig von den Platten entfernt, in TBST-Lösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,05% nichtionisches Tensid (TWEEN 20)) überführt und kurz darin gespült um restlichen Agar zu entfernen. Die Membranen wurden dann 30 Minuten in TBST-Lösung mit 1% Gelatine (7,5 ml pro 90 mm-Membran) gelegt, um nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen abzusättigen.

500 ml einer Übernachtkultur von E. coli Y 1090 wurde durch Zentrifugieren konzentriert, in 20 ml Wasser resuspendiert und 10 Minuten gekocht. Zu 1 ml dieser Suspension wurden 2 ml einer Lösung eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers gegen PAI-2 in Form einer Aszites-Flüssigkeit mit 2,5 mg Proteingehalt gegeben und die Mischung 1 bis 2 Stunden bei 4°C auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien durch Zentrifuguren entfernt. Dieses Verfahren wurde zweimal mit je 1 ml der gekochten Bakteriensuspension wiederholt. Nach dieser Behandlung wurde TBST-Lösung bis zu einem Endvolumen von 250 ml zugesetzt, wodurch eine Verdünnung der Antikörper auf 1 : 250, bezogen auf die ursprüngliche Aszites-Flüssigkeit, erreicht wurde. Diese Lösung wurde als primärer Antikörper im "Screening" für PAI-2 exprimierende Klone benutzt.

Die blockierten Nitrozellulose-Membranen wurden mit jeweils 7,5 ml TBST-Antikörperlösung 30 Minuten inkubiert und dann dreimal 10 Minuten in je 20 ml TBST-Lösung gewaschen. Hierauf wurden die Membranen in je 7,5 ml TBST-Lösung mit einem käuflichen Anti-Maus-IgG, gebunden an alkalische Phosphatase, in einer Verdünnung von 1 : 7500 (PROTOBLOT Immunoscreening System, Promega Biotec, Madison, WI, USA) gegeben, um gebundene Antikörper nachzuweisen. Nach 30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Membranen dreimal 10 Minuten mit je 20 ml TBST-Lösung gewaschen und nach den Anweisungen des Herstellers in die Entwicklungs-Lösung zur Farbentwicklung überführt (PROTOBLOT Immunoblotting System; Promega Biotec).

Um positiv erscheinende Signale zu überprüfen wurden Agarscheibchen ausgestochen, die Phagenpartikel aus Regionen der Platte enthielten, die den Signalen auf den Membranen entsprachen, und in getrennte Reagenzgläser überführt. Zu jedem dieser Reagenzgläser wurden 10 ml einer Mischung von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM Magnesiumchlorid gegeben und die Reagenzgläser auf einer Schüttelmaschine eine Stunde bei einer Zimmertemperatur inkubiert. Die Phagen wurden dann in verschiedenen Verdünnungen in der gleichen Weise wie beim ersten "Screening" der λgt 11-cDNA-Bibliothek ausplattiert, wobei aber jede Platte nur 100 bis 1000 plaquebildende Einheiten enthielt. Die Membranen wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und auf PAI-2-Antigen untersucht.

Nach einem zweiten Durchgang des "Screening" wurden positiv erscheinende Signale erneut in der gleichen Weise überprüft.

Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis alle Phagen auf einer Platte ein positives Signal ergaben. Nach drei Durchgängen blieben sechs positive Klone zurück.

Aus den positiven Phagen wurde die DNA nach bekannten Methoden (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982) extrahiert und die Länge der cDNA-Inserte nach Spaltung mit EcoRI durch Agarosegel-Elektrophorese bestimmt. Die rekombinanten Phagen mit den längsten cDNA-Inserten wurden als λplc1, λplc3 und λplc4 bezeichnet, die cDNA-Inserte von etwa 1,6, 1,7 und 1,5 kb enthielten. Das cDNA-Insert von λplc3 wurde in pBR322 subkliniert, mit EcoRI herausgeschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Das cDNA-Insert wurde mit ³²p durch "nick translation" markiert und als Sonde in Hybridisierungs-Experimenten unter hochstringenten Bedingungen eingesetzt. Alle sechs positiven Klone hybridisierten unter diesen Bedingungen mit der cDNA-Sonde, was die Verwandschaft der DNA-Inserte in allen diesen Klonen beweist.

Beispiel 2 Herstellung und Analyse eines Antigens aus λplc1

Zur Expression eines rekombinanten Fussionsproteins wurde der lysogene E. coli-Stamm Y 1089 mit λplc1 infiziert und das rekombinante Fusionsprotein in an sich bekannter Weise exprimiert (Huynh et al., in: DNA Clonin Techniques, A Practical Approach, Ed. Glover, IRL Press Oxford, Band 1 (1984) 98-121). Das Fusionsprotein hat ein Molgewicht von 180 kΩa. Es wird von monoklonalen Antikörpern gegen gereinigtes PAI-2 erkannt. Eine Kontrolle mit einem Extrakt eines für λgt11 lysogenen E. coli-Stamms ohne cDNA-Insert ergab kein derartiges immunoreaktives Protein. Der Befund konnte mit einem monospezifischen polyklonalen Antikörper gegen gereinigtes PAI-2 bestätigt werden.

Die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts aus den Phagen λplc1, die für PAI-2 kodiert, wurde nach den Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5487; FEBS Letters 87 (1978) 107-110, nach Klonierung des cDNA-Fragments in die EcoRI-Stelle des Vektors M13mp9 bestimmt. Nach dem Verfahren von Dale et al., Plasmid 13 (1985) 31-40, wurde eine Reihe von überlappenden Klonen hergestellt und hierdurch die komplette Nukleotidsequenz beider DNA-Stränge der cDNA mit einer Länge von 1689 bp (ausschließlich des Poly A-Schwandzes) ermittelt. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Inserts von λplc1 sind in der Tab. 1 dargestellt. Das cDNA-Insert hat einen offenen Leserahmen von 361 Aminosäuren.

Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Tab. 1 enthält drei mögliche Glykosylierungsstellen Asn-X-Ser/Thr (Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40 (1974) 17-26). Die 3′-untranslatierte Region der cDNA von λplc1 umfaßt 606 bp (ohne Poly A-Sequenz). Die "concensus polyadenylation sequence" AATAAA findet sich 20 bp oberhalb der Poly A-Bindungsstelle.

Der Klon λplc1 mit dem cDNA-Insert von 1,5 kb wurde teilweise sequenziert und erschien mit gplc3 identisch bis auf Verkürzungen am 5′-Ende des cDNA-Moleküls.

Claims (15)

1. DNA-Sequenz, kodierend für Plasminogenaktivator-Inhibitor, Typ 2 (PAI-2), enthaltend den kodierenden Strang gemäß Tabelle 1.

2. DNA, die mit der DNA gemäß Anspruch 1 hybridisiert.

3. DNA-Sequenz, kodierend für die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1.

4. Genstruktur, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 1, 2 oder 3.

5. Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

6. Transformierte Zelle, enthaltend DNA nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4.

7. Rohprotein, exprimiert von einer Zelle gemäß Anspruch 6.

8. PAI-2, erhalten aus einem Rohprotein gemäß Anspruch 7.

9. PAI-2, erhalten durch Expression in Bakterien, Hefen oder Säugerzellen.

10. Protein mit PAI-2-Aktivität, enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon, sowie Mutanten und Varianten dieser Proteine.

11. Für PAI-2 spezifische Antikörper, erhalten aus gentechnisch hergestellten PAI-2 bzw. Antigen-wirksamen Teilen davon.

12. Diagnostikum, enthaltend ein Antigen nach Anspruch 8, 9 oder 10.

13. Diagnostikum, das eine DNA nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 ganz oder teilweise enthält.

14. Diagnostizierverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß Körperflüssigkeiten, Gewebe oder daraus isolierte Nukleinsäuren mit einem Diagnostikum nach Anspruch 12 oder 13 in Kontakt gebracht werden.

15. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Protein gemäß Anspruch 8, 9 oder 10.