DE69733462T2

DE69733462T2 - Mutierter plasminogen-aktivator-inhibitor typ 1 und seine verwendungen

Info

Publication number: DE69733462T2
Application number: DE69733462T
Authority: DE
Inventors: A. Daniel LAWRENCE; P. Steingrimur STEFANSSON
Original assignee: American National Red Cross
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: AU726406B2; AU2665397A; EP0850252B1; CA2233670A1; EP0850252A4; ATE297466T1; CA2233670C; WO1997039028A1; US6103498A; DE69733462D1; EP0850252A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fachgebiet der Erfindung
Die Erfindung im Gebiet der Biochemie und Medizin betrifft Zusammensetzungen, die Protein-Mutanten vom Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-Typ I (PAI-1) umfassen, welche die Fähigkeit zur Hemmung des Enzyms Elastase und zur Hemmung der Vitronectin-(Vn)-abhängigen Migration von Zellen aufweisen. Diese Erfindung betrifft auch die Anwendungen dieser Proteine für die Behandlung von Krankheiten und Störungen, die mit der Elastase-Aktivität in Verbindung stehen, oder bei denen die Migration und migrationsgesteuerte Zellvermehrung pathophysiologische Konsequenzen zeigt.
Beschreibung des Hintergrunds
1. PLASMINOGEN-AKTIVATOREN
Bei Plasminogen-Aktivatoren (PAs) handelt es sich um spezifische Serin-Proteinasen, die das Proenzym Plasminogen durch Spaltung einer einzelnen Arg-Val-Peptidbindung zum Enzym Plasmin aktivieren (Saksela O, Biochim Biophys Acta (1985) 823: 35–65). Zwei Plasminogen-Aktivatoren sind in Säugern zu finden, nämlich gewebeartiges PA (tPA) und Urokinase-artiges PA (uPA) (Saksela O et al., Annu Rev Cell Biol (1988) 4: 93–126). Von diesen Enzymen wird angenommen, dass sie viele biologische Prozesse entscheidend beeinflussen, einschließlich der vaskulären Fibrinolyse (Bachmann E, Thromb Haemost (1987) 10: 227–265), der Ovulation (Hsuch AJW et al., In: Haseltine FP et al., Hrg., Meiotic Inhibition: Molecular Control of Meiosis New York: Liss 1988: 227–258), der Entzündung (Pollanen J et al., Adv Cancer Res (1991) 57: 273–328), der Tumormetastase ((Dano K et al., Adv Cancer Res (1985) 44: 139–266), der Angiogenese (Moscatelli D et al., Biochim Biophys Acta (1988) 948: 67–85) und der Geweberückbildung (Saksela, supra).
Die Regulation der PAs ist ein komplizierter Prozess, der auf vielen Ebenen kontrolliert wird. Die Synthese und Freisetzung der PAs wird durch verschiedene Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine gelenkt (Saksela, supra, Dano et al., supra). Im Anschluss an die Sekretion kann die PA-Aktivität durch ein Anzahl spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen sowohl positiv als auch negativ reguliert werden. Die Aktivität kann durch Wechselwirkungen mit Fibrin (Hoylaerts M et al., J Biol Chem (1982) 257: 2912–2919), dem uPA-Rezeptor (uPAR) (Ellis V et al., Semin Thromb Hemost (1991) 17: 194–200), dem tPA-Rezeptor (tPAR) (Hajjar KA et al., J Biol Chem (1990) 265: 2908–2916) oder dem Plasminogen-Rezeptor (Plow EF et al., Thromb Haemost (1991) 66: 32–36), erhöht oder konzentriert werden.
Die PA-Aktivität kann durch spezifische PA-Inhibitoren (PAIs) herabreguliert werden (Lawrence, D. A. et al., In: Molecular Biology of Thrombosis and Hemostasis, Roberts, H. R. et al. (Hrg). Marcel Dekker Inc., New York, Kapitel 25, S. 517–543 (1995)). Außerdem hängt die PA-Aktivität von ihrer Lokalisation oder ihrer Mikroumgebung ab und kann in Lösung (z.B. zirkulierendes Blut) im Vergleich zu einer festen Phase (z.B. auf einer Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix (ECM)) unterschiedlich sein. Die Gesamtaktivität des PA-Systems wird durch die Wechselwirkungen zwischen diesen verschiedenen Elementen und dem Gleichgewicht zwischen den entgegengesetzten Aktivitäten der Enzyme und Inhibitoren bestimmt.
Die PAIs sind als entscheidende Regulatoren des PA-Systems erkannt worden. Die Identifikation eines wirksamen Inhibitors der tPA in Endothelzellen (ECs) wurde zuerst berichtet im Jahr 1983 (Loskutoff DJ et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80: 2956–2960). Vier kinetisch relevante PAIs sind derzeit erkannt; PAI-Typ 1 (PAI-1), der ursprünglich als Endothelzellen-PAI beschrieben wurde; PAI-Typ 2 (PAI-2), auch bezeichnet als Plazenta-PAI; PAI-Typ 3 (PAI-3), auch bekannt als aktivierter Protein-C-(APC)-Inhibitor, und Proteinase-Nexin I (PN-1), auch bezeichnet als „glia-derived neurite-promoting factor". Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere PAI-1.
2. WEITERE SERIN-PROTEINASEN
Elastase ist eine durch aktivierte Neutrophile und Makrophagen und Monozyten freigesetzte Serin-Proteinase. Während entzündlicher Reaktionen werden Neutrophile aktiviert und setzen Elastase frei, was zu Gewebezerstörung durch Proteolyse führt. In der Lunge baut Elastase elastisches Gewebe ab und führt zu Emphysem. Elastase ist außerdem ein kompoundierender Faktor in der zystischen Fibrose (CF) und sowohl dem adulten als auch infantilen akuten Lungenversagen (Acute Respiratory Distress Syndrome – ARDS). Elastase ist auch mit TNF-vermittelter Entzündung (Massague, J. et al., Annu. Rev. Biochem. 62: 515–541 (1993)) und HIV-Infektion (Bristow, C. L. et al., International Immunol. 7: 239–249 (1995)) in Zusammenhang gebracht worden.
Elastase weist ein breiteres Reaktivitätsspektrum als Plasminogen-Aktivatoren auf, von denen jeder präferenziell auf ein Vorläufer-Substrat einwirkt, um es zu aktivieren.
Ein natürlicher Schutz für Elastase ist ein Protein, bezeichnet als α1-Antitrypsin (α₁AT) oder α1-Proteinase-Inhibitor (α₁PI). Patienten mit einem Mangel an α₁AT neigen zu Emphysemen, insbesondere Raucher. Außerdem fördert das Rauchen Entzündungen. Bei solchen α₁AT-Mängeln ist das Enzym vorhanden (CRM⁺), ist aber funktionell beeinträchtigt. Selbst bei Personen mit normalem Enzym inaktiviert Rauchen α₁AT direkt. Daher wäre ein verbesserter Hemmer der Elastase zur Verhütung von Emphysem bei anfälligen Personen oder für eine Umkehr des pathophysiologischen Prozesses, der zu dieser oder anderen verwandten Erkrankungen führt, in hohem Maße erwünscht.
3. SERPINE
Die wichtigsten PAIs gehören zu einer Superfamilie der Serinproteinase-Inhibitor-(Serpin)-Gene, die viele Proteinase-Inhibitoren im Blut als auch andere Proteine mit nicht-verwandter oder unbekannter Funktion umfasst (Huber R et al., Biochemistry (1989) 28: 8951–8966). Die Serpine teilen eine gemeinsame Tertiärstruktur und haben sich aus einem gemeinsamen Ahn entwickelt. Serpine regulieren viele Prozesse, einschließlich der Blutgerinnung, Fibrinolyse, Komplement-Aktivierung, Ovulation, Angiogenese, Entzündung, Neoplasie, viralen Pathogenese und allergischen Reaktivität.
Die derzeitigen Modelle der Serpin-Struktur basieren auf röntgenkristallographischen Studien eines Mitglieds der Familie, α₁AT (im Überblick angegeben bei Huber et al., supra). Ein interessantes Merkmal der Struktur einer modifizierten Form von α₁AT, die in ihrem reaktiven Zentrum gespalten ist (Loebermann H et al., J Mol Biol (1984) 177: 531–557), besteht darin, dass die beiden Aminosäure-Reste, die normalerweise das reaktive Zentrum darstellen (Met-Ser-Bindung), an entgegengesetzten Enden des Moleküls durch fast 70 Å voneinander getrennt gefunden werden. Dies ist in 2 für PAI-1 gezeigt und kann mit der in 1 modellartig dargestellten aktiven Struktur verglichen werden. Die Relaxation einer gewundenen Konfiguration findet bei Spaltung der Peptidbindung des reaktiven Zentrums statt und nicht bei einer größeren Neuanordnung der Inhibitorstruktur. Bei diesem Modell ist das reaktive Zentrum Teil einer exponierten Schleife, auch die „gewundene Schleife" genannt. Auf die Spaltung hin bewegt sich diese Schleife oder "schnappt zurück" und wird dabei zu einem von mehreren zentralen Strängen in einer Haupt-β-Faltblattstruktur. Diese Transformation wird von einer starken Zunahme der Wärmestabilität vermutlich als Folge der Wiederherstellung des sechssträngigen β-Faltblatts A begleitet.
Synthetische Peptide, die zu den Serpin-Schleifen des reaktiven Zentrums homolog sind, wenn in trans hinzugefügt, bauen sich in ihre jeweiligen Moleküle vermutlich als ein zentraler Strang der Haupt-β-Faltblattstruktur ein und erhöhen die Wärmestabilität des Moleküls, wie nach Spaltung am reaktiven Zentrum zu beobachten. Diese Strukturänderung wandelt das Serpin von einem Inhibitor zu einem Substrat für seine Zielproteinase um (Carrell RW et al., Nature (1991) 353: 576–578; Bjork I et al., J Biol Chem (1992) 267: 1976–1982).
Serpine dienen als Suizid-Inhibitoren, indem sie lediglich einmal mit ihrer Zielproteinase zur Bildung eines stabilen Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Komplexes reagieren. Diese Komplexe können sich dissoziieren, was freies aktives Enzym zusammen mit einem gespaltenen Inhibitor ergibt, der dem ähnlich ist, der in der α₁AT-Kristallstruktur zu erkennen ist (Carrell RW et al., In: Barrett AJ, et al. Hrg., Proteinase Inibitors. Amsterdam: Elsevier Science Publishers 1986: 403–420) und in 1 und 2 für PAI-1 modellartig dargestellt ist.
Serpine interagieren mit ihrer Zielproteinase durch Bereitstellung eines "bait" Aminosäure-Rests im reaktiven Zentrum, von dem man glaubt, dass er das normale Substrat des Enzyms nachahmt und sich über seine Seitenkettenatome mit der Spezifitätsspalte, oder S1-Stelle, des Enzyms verbindet (Huber et al., supra, Carrell et al., supra; Shubeita HE et al, J Biol Chem (1990) 265: 18379–18385; York JD et al., J Biol Chem (1991) 266: 8495–8500; Sherman PM et al., J Biol Chem (1992) 267: 7588–7595). Die "bait"-Aminosäure wird als der P1-Rest bezeichnet. Die Aminosäuren zur N-terminalen Seite der spaltbaren Bindung im reaktiven Zentrum sind in ihrer Reihenfolge mit P1, P2, P3, etc. bezeichnet, und die Aminosäuren an der Carboxylseite sind mit P1', P2', etc. bezeichnet (Carrell et al., 1986, supra). Die Aminosäure-Reste in der reaktiven Schleife von PAI-1 (Reste 332–351) sind nachstehend gezeigt und entsprechend der zuvor genannten Benennungsübereinkunft bezeichnet. Ebenfalls vermerkt sind die numerischen Positionen in der vollen Sequenz des reifen PAI-1:
Der Komplex zwischen Serpinen und ihren Zielproteinasen wird als über eine Esterbindung zwischen dem Serin-Rest des Aktivzentrums der Proteinase und dem neuen C-terminalen Ende des P1-Rests kovalent verknüpft erachtet, wobei er einen Acyl-Enzym-Komplex bildet (Lawrence DA et al., J Biol Chem (1995) 279: 25309–25312). Die Verbindung zwischen Inhibitor und Proteinase umfasst auch andere Regionen als den P1-Rest des Serpins und andere als die katalytische Stelle der Proteinase, basierend auf der Charakterisierung der beiden rekombinanten PA-Mutanten, worin sechs oder sieben Aminosäuren von den katalytischen Domänen deletiert wurden. Diese mutierten PAs waren nahezu vollkommen refraktorisch gegenüber einer Inhibition durch PAI-1, was nahelegt, dass die vom aktiven Zentrum entfernt gelegenen Reste nichtsdestotrotz für die Wechselwirkung mit PAI-1 entscheidend sind (Madison EL et al., Nature (1989) 339: 721–724; Adams DS et al., J Biol Chem (1991) 266: 8476–8482).
4. PLASMINOGEN-AKTIVATOR-INHIBITOR TYP 1 (PAI-1)
PAI-1 (siehe Tabelle 1) wird als einer der Hauptregulatoren des PA-Systems erachtet. Es handelt sich um ein einzelkettiges Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 50 kDa (Van Mourik JA et al., J Biol Chem (1984) 259: 14914–14921), das der wirksamste, bei den einzel- bzw. zweikettigen Formen von tPA und uPA bekannte Inhibitor ist (Tabelle 1) (Lawrence D et al., Eur J Biochem (1989) 186: 523–533). PAI-1 hemmt auch Plasmin und Trypsin (Hekman CM et al., Biochemistry (1988) 27: 2911–2918), und hemmt außerdem Thrombin und aktiviertes Protein C, wenn auch bei viel geringerer Wirksamkeit.
Tabelle 1 ZUSAMMENFASSUNG DER EIGENSCHAFTEN VON PAI-1
PAI-1 ist im Plasma in sehr geringen Konzentrationen im Bereich von 0 bis 60 ng/ml (im Mittel etwa 20 ng/ml oder 0,5 nM) (Declerck PJ et al., Blood (1988) 71: 220–225) und einer berichteten Halbwertszeit von etwa 6–7 Minuten (Vaughan DE et al., Circ Res (1990) 67: 1281–1286) vorhanden. In einer Studie, die das Clearing von zwei unterschiedlichen Formen von PAI-1 (aktiv und latent; siehe unten) vergleicht, wurde die aktive Form zweiphasig gecleart (Halbwertszeiten von 6 und 25 Minuten), wohingegen latentes PAI-1 bei einer Halbwertszeit von lediglich 1,7 Minuten gecleart wurde (Mayer EJ et al., Blood (1990) 76: 1514–1520).
PAI-1 ist in Blutplättchen und anderen Geweben vorhanden und wird durch viele Zelltypen in Kultur erzeugt (Erickson LA et al., J Clin Invest (1984) 74: 1465–1472; Sawdey MS et al., J Clin Invest (1991) 88: 1346–1353; Krishnamurti C et al., Semin Thromb Hemost (1992) 18: 67–80). In vivo scheint die primäre extravaskuläre Quelle für PAI-1 glatte Gefäßmuskelzellen (SMCs) zu sein (Loskutoff DJ, Fibrinolysis (1991) 5: 197–206). Während der Endotoxämie oder anderen pathologischen Zuständen werden ECs zur Hauptstelle der PAI-1-Synthese (Pyke C et al., Cancer Res (1991) 51: 4067–4071; Schneiderman J et al. Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 6998–7002; Keeton M et al., Am J Pathol (1993) 142: 59–70).
Plasma-PAI-1 ist als ein Komplex mit Vitronektin (Vn) oder S-Protein vorhanden (Declerck PJ et al., J Biol Chem (1988) 263: 15454–15461). PAI-1 ist auch mit Vn im ECM in Kultur verbunden und ist möglicherweise an der Beibehaltung der Unversehrtheit des Zellsubstratum in vivo beteiligt (Mimuro J et al., Blood (1987) 70: 721–728; Mimuro J et al., J Biol Chem (1989) 264: 5058–5063).
Die Hauptquelle von Plasma-PAI-1 ist nicht bekannt, und ist wahrscheinlich vaskuläres SMC, obschon ein Beitrag aus dem Blutplättchen-Pool nicht ausgeschlossen werden kann. PAI-1 funktioniert wirksam in Lösung und bei Bindung an Oberflächen ("feste Phase"), wobei es wahrscheinlich ist, dass PAI-1 die Fibrinolyse in beiden Umgebungen reguliert.
(a) PAI-1-Proteinstruktur und Funktion (siehe 1–4)
PAI-1-cDNA codiert ein Protein von 402 Aminosäuren, das eine typische Sekretions-Signalsequenz enthält (Ny et al., supra; Ginsburg et al., 1986, supra). Aus Zellkultur isolierter reifer humaner PAI-1 setzt sich aus zwei Varianten von 381 und 379 Aminosäuren in etwa gleichen Anteilen zusammen. Diese beiden Formen, die wahrscheinlich aus einer alternativen Spaltung der Sekretions-Signalsequenz entstehen, liefern Proteine mit überlappenden Amino-terminalen Sequenzen von Ser-Ala-Val-His-His und Val-His-His-Pro-Pro (Abschnitt von SEQ ID NR: 2 und 3) (Lawrence et al., 1989, supra). Diese letztere Sequenz wird allgemein als reifer PAI-1 bezeichnet.
PAI-1 ist ein Glykoprotein mit drei potenziellen N-verküpften Glykosylierungsstellen, die zwischen 15 und 20% Kohlehydrat enthalten (Van Mourik JA et al., supra). Reifer PAI-1 enthält keinen Cystein-Rest, was die effiziente Expression und Isolation des rekombi nanten PAI-1 aus E. coli erleichtert. In E. coli erzeugter PAI-1 ist, obschon nicht glykosyliert, funktionell dem nativen PAI-1 sehr ähnlich. Rekombinanter PAI-1 kann aus E. coli in einer inhärent aktiven Form (siehe unten) isoliert werden, was im Gegensatz zu aus Säugerzellkultur ausgereinigtem PAI-1 steht (Lawrence et al., 1989, supra; Hekman et al., 1988, supra).
(b) Aktive und latente Konformation
PAI-1 liegt in einer aktiven Form, die durch Zellen produziert und in das Kulturmedium ausgeschieden wird, und einer aktiven oder latenten Form vor, die sich im Gewebemedium über die Zeit ansammelt (Hekman CM et al., J Biol Chem (1985) 260: 11581–11587; Levin EG et al., Blood (1987) 70: 1090–1098). Die aktive Form wandelt sich spontan zur latenten Form bei einer Halbwertszeit von etwa 1 Stunde bei 37°C um (Lawrence et al., supra; Hekman et al., supra; Levin EG et al., 1987, supra).
Die latente Form kann zur aktiven Form durch Behandlung mit Denaturierungsmitteln, negativ geladenen Phospholipiden oder Vn umgewandelt werden (Lambers et al., supra, Hekman et al., supra; Wun T-C et al., J Biol Chem (1989) 264: 7862–7868). In Kaninchen infundierter latenter PAI-1 wurde in vivo durch einen unbekannten Mechanismus reaktiviert. Die reversible Interkonversion zwischen den aktiven und latenten Strukturen, vermutlich aufgrund einer Konformationsänderung, stellt ein einzigartiges Merkmal von PAI-1 im Vergleich zu anderen Serpinen dar. Die latente Form scheint energetisch begünstigt zu sein.
Die dreidimensionale Struktur der latenten Form von PAI-1 ist geklärt worden. Bei dieser Struktur wird die gesamte N-terminale Seite der reaktiven Schleife als dem zentralen Strang in β-Faltblatt A inseriert (2) (Mottonen et al, supra), was die erhöhte Stabilität (Lawrence, D. A. of al., Biochemistry 33: 3643–3648 (1994)) als auch das Fehlen der inhibitorischen Aktivität erklärt. Die Struktur des aktiven PAI-1 ist nach wie vor unbekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass das reaktive Zentrum bei aktivem PAI-1 als eine Oberflächenschleife freiliegt, im Gegensatz zu seiner Position in der latenten Struktur (1). Die molekulare Entstehung der funktionalen Stabilität von PAI-1 wurde weiter von Borkenpar et al., EMBOT, 1995, Band 14, S. 2969–2977, untersucht.
(c) Die reaktive Schleife (reactive-center loop – RCL)
Die RCL-Region von PAI-1 war der Gegenstand einer umfangreichen Mutationsanalyse, welche die Bedeutung des P1-"bait"-Rests bei der Inhibitorfunktion nachwies, wohingegen die umgebenden Aminosäuren eine weniger entscheidende Rolle spielen. Eine Zufallsmutagenese der P3-, P2- und P1-Reste bzw. der P1- und P1'-Reste zeigte eindeutig, dass entweder Arginin oder Lysin an P1 für die PAI-1-Funktion als einem wirksamen Inhibitor von uPA wesentlich ist (York of al., 1991, supra; Sherman et al., 1992, supra). Die P1 umgebenden Reste können die PAI-1-Inhibitoraktivität bis zu zwei Größenordnungen modulieren und können die Zielproteinase-Spezifität verändern. Die P1'-Stelle ist überraschenderweise tolerant gegenüber Aminosäure-Substitutionen, mit Ausnahme von Prolin, welches einen nahezu vollständigen Verlust der Funktion bewirkte. Wurde ein Segment von PAI-1 von 18 Aminosäuren, das den Großteil des RCL umfasste, durch dieselbe Region von PAI-2, Antithrombin III, oder eine Serpin-Konsensussequenz ersetzt, so wurde der Großteil der Anforderungen für die PAI-1-Spezifität (vom P1-Rest abgesehen) als außerhalb der RCL-Sequenz liegend befunden. Alle drei Chimären blieben wirksame Inhibitoren von tPA und uPA, wobei die Antithrombin III-Chimäre kein signifikant verbesserter Inhibitor von Thrombin war. Außerdem war die spezifische Sequenz des RCL, die in das β-Faltblatt A in der latenten PAI-1-Struktur eingeführte Region (1, siehe oben), für die Konversion zwischen den aktiven und latenten Konformationen von PAI-1 nicht entscheidend. Folglich hängt die Schleifen-Insertion mehr von der Flexibilität des β-Faltblatts A als von den spezifischen Aminosäure-Resten in der Schleife ab. Zu guter Letzt wurde die Bindung an Vn nicht durch diese Substitutionen im RCL beeinflusst. Die P4'- und P5'-Reste auf der C-terminalen Seite der Bindung im reaktiven Zentrum sind ebenfalls bei lediglich geringer Wirkung auf die PAI-1-Aktivität ersetzt worden.
(d) Wechselwirkungen mit Vitronektin (Vn)
Das adhäsive Glykoprotein Vn ist ein Glykoprotein von 72 kDa, das im Plasma bei mikromolaren Konzentrationen und in Verbindung mit vielen Geweben vorhanden ist. Wie auch PAI-1, kann Vn in vielfachen konformationellen Zuständen vorhanden sein. Vn ist an einer breiten Vielfalt von physiologischen Reaktionen beteiligt, einschließlich der Zelladhäsion, Komplementaktivierung, Thrombose und Plasma-Clearance der Protei nase-Inhibitor-Komplexe (Tomasini, B. R. of al. (1991) Prog. Hemost. Thromb. 10, 269–305).
PAI-1 in Plasma oder in der subzellulären Matrix wird durch Vn stabilisiert. Vn-gebundenes PAI-1 in Lösung ist etwa zweimal so stabil wie ungebundener PAI-1. Bei ECM kann die Halbwertszeit von PAI-1 > 24 Stunden betragen (Mimuro et al., supra). Der Großteil des in Blutplättchen gefundenen PAI-1 scheint latent zu sein, obschon dieser Punkt kontrovers ist (Lang IM et al., Blut (1992) 80: 2269–2274). Blutplättchen enthalten Vn (Preissner KT et al., Blood (1989) 74: 1989–1996), welches auf die Reaktivierung von latentem Blutplättchen-PAI-1 hinwirken könnte (Wun et al., supra). Blutplättchen-PAI-1 kann ein Hauptfaktor der Resistenz Blutplättchen-reicher Thrombi gegenüber einer Thrombolyse sein (Fay WP et al., Blood (1994) 84: 351–356). Übereinstimmend damit erhöhen Anti-PAI-1-Antikörper die Clot-Lyse, wenn mit Blutplättchenreichen Thrombi in vitro in Kontakt gebracht (Levi M et al., Circulation (1992) 85: 305–312; Braaten JV et al., Blood (1993) 81: 1290–1299).
Es wird angenommen, dass Vn PAI-1 an der ECM lokalisiert, wo es die lokale proteolytische Aktivität reguliert (Mimuro et al., 1987, supra). Die Ansichten betreffend die Wechselwirkung von PAI-1 mit Vn sind möglicherweise aufgrund der konformationellen Variabilität beider Proteine kontrovers. Die Kontroverse richtet sich sowohl auf die Natur als auch die Affinität der Bindung dieser beiden Moleküle (Sigurdardottir O et al., Biochim Biophys Acta (1990) 1035: 56–61; Kost C et al., J Biol Chem (1992) 267: 12098–12105; Seiffert D et al., Biochim Biophys Acta (1991) 1078: 23–30; Salonen E-M et al., J Biol. Chem (1989) 264: 6339–6343). Die Kontroverse kreist auch um die Vn-Bindungsstelle für PAI-1, welches an der Somatomedin-B-Domäne am N-Terminus (Seiffert D et al., J Biol Chem (1991) 266: 2824–2830) und am C-Terminus von Vn zwischen Resten 348 und 370 (Kost et al., supra) lokalisiert worden ist. Einige dieser Konflikte lassen sich möglicherweise durch Differenzen in der Affinität der Bindung der aktiven gg. latenten Form von PAI-1 mit Vn und/oder durch Differenzen im relativen Vorkommen von PAI-1-Konformern in verschiedenen PAI-1-Präparaten erklären.
Jüngere Untersuchungen des Serpin-Inhibitionsmechanismus weisen darauf hin, dass er einem vielstufigen Prozess folgt, der eine exponierte RCL erfordert (Shore, JD of al., (1994) J. Biol. Chem. 270, 5395–5398; Lawrence, D. A. et al., (1995) J Biol. Chem. 270, 25309–25312; Fa, M. et al. (1995) Biochem. 34: 13833–13840; Wilczynska, M. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 29652–29655). Auf die Verbindung mit einer Zielproteinase hin wird das Serpin-RCL an seiner P₁–P_1'-Bindung gespalten, woraufhin eine schnelle Insertion der RCL in das β-Faltblatt A erfolgt, was einen stabilen Serpin-Proteinase-Komplex ergibt. Wie durch die vorliegenden Erfinder gezeigt (siehe Beispiele), ist ein PAI-1-Vn-Bindungsepitop an der Kante des β-Faltblatts A sensitiv gegenüber dieser Konformationsänderung im β-Faltblatt A, wie auch gegenüber ähnlichen Veränderungen in Verbindung mit der Konversion von PAI-1 zur latenten Form oder Spaltung im RCL durch eine Nicht-Zielproteinase. Diese Sensitivität liefert möglicherweise einen Weg, um die Expression der PAI-1-Aktivität an spezifischen Wirkstellen zu gewährleisten. Zum Beispiel glaubt man, dass Vn PAI-1 an der ECM lokalisiert ist, wo es die lokale proteolytische Aktivität reguliert (Mimuro et al., supra). In dieser Situation mag es von Vorteil sein, die Bindung lediglich funktionell aktiven PAI-1 an Vn zuzulassen. An einer Zelloberfläche kann ein inaktiver Ligand internalisiert und abgebaut werden. Diese Art von Regulation ist jedoch möglicherweise an der weniger dynamischen ECM nicht ebenso wirksam. Um eine Sättigung des Vn mit inaktiven Formen des Inhibitors zu verhindern, kann sich daher ein System entwickelt haben, das gegenüber dem konformationellen Zustand von PAI-1, der eng an seinen aktiven Zustand geknüpft ist, sensitiv ist.
Über die Stabilisierung von aktivem PAI-1 hinaus, kann Vn die PAI-1-Spezifität verändern, wobei es zu einem wirksamen Inhibitor von Thrombin verwandelt wird (Ehrlich et al., supra; Keijer J. et al., Blood (1991) 78: 1254–1261). Vn-gebundener PAI-1 weist eine 270-mal größere Ratenkonstante gegenüber Thrombin in Abhängigkeit von der Quelle des Vn auf als freies PAI-1. Obschon alle Formen von Vn PAI-1 binden können, ist lediglich unter physiologischen Bedingungen isoliertes Vn dazu fähig, PAI-1 zur Hemmung von Thrombin zu stimulieren (Naski, M. C. et al., J Biol Chem (1993) 268: 12367–12372). Vn erhöht auch die Clearance von PAI-1-Thrombin-Komplexen durch das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandte Protein (LRP) (Stefansson, S. et al., (1996) J Biol. Chem. 271: 8215). PAI-1 scheint nicht wesentlich zur Thrombin-Inhibition von Plasma in vivo beizutragen, obschon lokale Konzentrationen von PAI-1 signifikante Wirkungen aufweisen können Vn stimuliert auch die Hemmung von tPA durch PAI-1, doch in einem viel weniger umfassenden Grade (Keijer et al., supra; Edelberg JM et al., J Biol Chem (1991) 266: 7488–7493). Vn kann die verminderte inhibitorische Aktivität von PAI-1-RCL-Mutanten gegenüber tPA teilweise wiederherstellen.
(e) Wechelwirkungen mit Thrombin
Unter der Voraussetzung, dass PAI-1 an Entzündungsstellen exprimiert und von Blutplättchen-Granuli auf die Aktivierung hin freigesetzt wird, kann es unter diesen Bedingungen ein relevanter Inhibitor von Thrombin sein. Zwar ist PAI-1 allein ein recht schlechter Hemmer von Thrombin, doch weisen PAI-1-Vn-Komplexe eine in hohem Maße verstärkte Hemmfähigkeit des Thrombins auf (Naski et al., supra). Vn ist in extrazellulären Bindegewebematrices vorhanden und wird aus Blutplättchen auf ihre Aktivierung hin freigesetzt. Thrombin-PAI-1-Komplexe bilden sich auf Endothelzell-ECM, welche mit Antikörpern gegen Vn gehemmt werden können (Ehrlich, H. J. et al., (1991) J. Cell Biol. 115, 1773–1781). Zwar spekulierten diese Autoren, dass die Thrombin-PAI-1-Interaktion die PA-Aktivität durch Neutralisierung von PAI-1 fördern könnte, doch kann diese Interaktion auch die zelluläre Clearance von Thrombin vermitteln. Diese Clearance würde der von tPA und uPA ähneln, deren Endozytose und Abbau über mehrere Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie nach der Komplexbildung mit PAI-1 gefördert sind (Nykjaer, A. et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 14543–14546; Orth, K. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7422–7426; Stefansson, S. et al., (1995) J. Cell Sci. 108: 2361–2369).
(f) Klinische Signifikanz von PAI-1 und seine Wechselwirkungen
Erhöhte Mengen an zirkulierendem PAI-1 werden mit einer thrombotischer Erkrankung in Verbindung gebracht, einschließlich Herzinfarkt und tiefe Venenthrombose (Juhan-Vague I et al., Thromb Res (1984) 33: 523–530; Hamsten A et al., N Engl. J Med (1985) 313: 1557–1563; Wiman B et al., J Lab Clin Med (1985) 105: 265–270; Paramo JA et al., BMJ (1985) 291: 573–574; Nilsson IM et al., BMJ (1985) 290: 1453–1456; Aznar J et al., Br Heart J (1988) 59: 535–541; Angles-Cano E et al., J Lab Clin Med (1993) 121: 646–653). Eine verminderte postoperative fibrinolytische Aktivität wurde mit einer erhöhten PAI-1-Aktivität unmittelbar nach einer Operation korreliert (Kluft C et al., Scand J Clin Lab Invest (1985) 45: 605–610), was offensichtlich durch einen Plasmavektor vermittelt wird, der die PAI-1-Produktion und -Sekretion aus vaskulären ECs stimuliert (Kassis J et al., Blood (1992) 80: 1758–1764). Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen führt die Überproduktion von PAI-1 in transgenen Mäusen zu einer Venenthrombose primär in den Extremitäten (Erickson LA et al., Nature (1990) 346: 74–76). Im Gegensatz dazu fand eine prospektive Studie keine Korrelation zwischen PAI-1-Mengen und Gefäßerkrankungen (Ridker PM et al., Circulation (1992) 85: 1822–1827).
Drei Fälle von teilweisem oder vollständigem PAI-1-Mangel beim Menschen sind berichtet und mit abnormaler Blutung in Verbindung gebracht worden. In einem Fall wurde normales PAI-1-Antigen nachgewiesen, doch war die PAI-1-Aktivität wesentlich vermindert (Schleef RR et al., J Clin Invest (1989) 83: 1747–1752), wohingegen in einem anderen sowohl die PAI-1-Antigen- als auch Aktivitätsmenge im Plasma deutlich vermindert waren bei normalen Mengen in den Blutplättchen (Dieval J et al., Blood (1991) 77: 528–532). Ein vollständiger Mangel an Blutplättchen und Plasma-PAI-1 bei einem 9-jährigen Amish-Mädchen wurde mit einer mäßigen Bluterstörung in Verbindung gebracht. Die Patientin war für eine Insertion von zwei Basenpaaren am Ende von Exon 4 des PAI-1-Gens homozygot (Fay WP et al., N Engl J Med (1992) 327: 1729–1733), was zu einem Frameshift führt, der ein verkürztes PAI-1-Protein und eine instabile mRNA ergibt. Der Mangel ist als eine autosomale rezessive Störung ererbt. Obschon heterozygote Eltern und Geschwister allesamt Plasma-PAI-1-Aktivität und Antigen im normalen Bereich aufwiesen, lagen diese durchwegs niedriger als bei den homozygoten gesunden Familienmitgliedern. Das Fehlen von Entwicklungs- und anderen Abnormalitäten bei diesem Patienten wurde als überraschend erachtet. Die Korrelation von komplettem PAI-1-Mangel mit abnormalem Bluten beweist eindeutig die Bedeutung von PAI-1 in der Regulierung der Hämostase. In Anbetracht des jungen Alters der genannten Patienten kann jedoch eine weitere wichtige Rolle von PAI-1 in vivo in der Kontrolle der Ovulation oder von Tumormetastase noch nicht ausgeschlossen werden (Pollanen et al., supra; Liu Y-X et al., Eur J Biochem (1991) 195: 549–555).
(g) Clearance-Rezeptoren
Das LDL-Rezeptor-verwandte Protein (LRP) ist ein Zelloberflächen-Rezeptor (Familie mit vier Mitgliedern), welcher als ein allgemeiner Clearance-Rezeptor für ein vielfältiges Set von Liganden, einschließlich der Proteinase-Inhibitor-Komplexe, agiert. Für einen Überblick, siehe Strickland, D. K. et al., FASEB J. 9: 890–898 (1995). Die Bindung an LRP führt zur Aufnahme von PAI-1-Proteinase-Komplexen in Zellen und zur Zerstörung im lysosomalen Kompartiment. Während LRP auf allen Zellen zu finden ist, sind diese Rezeptoren in höheren Mengen in der Leber und auf der Epithelauskleidung der Lungen vorhanden.
(h) Zellmigration
Die Zellmigration ist ein stark kontrollierter Prozess, welcher von der Koordination vieler Faktoren abhängt. Migrierende Zellen und Zellen mit invasiven Phänotypen exprimieren hohe Mengen an uPA. Prozesse wie die Angiogenese und Metastase können durch Proteinase-Inhibitoren blockiert werden. Die Inaktivierung des Gens für uPA in Mäusen verhindert eine Arteriostenose aufgrund einer Neointima-Bildung im Anschluss an ein Gefäßtrauma (Carmeliet, P. et al., Circulation 90: 1–144 (1994)). Während der Wundheilung zeigen die Gefäßzellen einen Anstieg in der Expression des Vn-Rezeptor-(VnR)-Integrins α_vβ₃ (Liaw L. et al., Circ Res 77: 665–72 (1995)). VnR ermöglicht die Zellmotilität auf Matrixproteinen, die auf der Wunde abgelagert sind. Spezifisch wird die Migration in die Wundfläche durch Vn erleichtert, welches durch aktivierte Blutplättchen oder von Plasma herstammend an der Stelle abgelagert ist. Migrierende Gefäßzellen zeigen ebenfalls eine erhöhte Expression des uPA und seines Rezeptors uPAR, welche sich gemeinsam mit dem VnR an fokalen Kontakten lokalisieren. Wie zuvor im Fachbereich verstanden, wird davon ausgegangen, dass die PAs eine generalisierte proteolytische Kaskade aktivieren, die zu einer für die Zellmigration und Invasion erforderlichen Matrixzerstörung führt. Allerdings legen die durch die Erfinder der vorliegenden Erfind-ung erhaltenen und hierin dargestellten Ergebnisse eine subtilere Rolle der PAs in der Regulierung der Expression von kryptischen Zellbindungsstellen nahe.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Mutanten und Varianten des humanen Wildtyp-PAI-1 (wtPAI-1) bereit, die verbesserte Eigenschaften bei der Hemmung von Serin-Proteinasen, insbesondere Elastase, aufweisen. Diese mutierten PAI-1-Moleküle sind resistenter gegenüber einer Zerstörung durch die Proteinasen, an die sie binden, und weisen daher verbesserte therapeutische Eigenschaften auf.
Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1; der komplementäre Strang ist SEQ ID NR: 10) und die Aminosäure-Sequenz (einschließlich der Signalsequenz) (SEQ ID NR: 2) des humanen PAI-1 ist in 3 und 4A gezeigt. Die volle Sequenz des reifen Proteins (SEQ ID NR: 3) ist in 4B gezeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Protein-Mutante von PAI-1-Protein, dessen Wildtyp-Sequenz SEQ ID NR: 3 oder –2 bis 379 von SEQ ID NR: 2 ist, welche Mutante Neutrophilenelastase oder andere Elastase-artige Proteinasen hemmt und welche mindestens zwei Aminosäure-Substitutionen aufweist

(a) an Position 343 von SEQ ID NR: 3, ausgewählt aus der Gruppe, besteht aus Ala, Asp, Gly, Leu und Ile; und
(b) an Position 346 von SEQ ID NR: 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Asp, Phe und Gly.

Vorzugsweise ist die Inhibition eine solche, dass nicht mehr als etwa ein Mol der Protein-Mutante zur Hemmung von 1 Mol der Elastase erforderlich ist. Vorzugsweise sind nicht mehr als etwa zwei Mol, vier Mol, zehn Mol oder am bevorzugtesten 100 Mol der Protein-Mutante erforderlich, um 1 Mol der Elastase zu hemmen.
Eine bevorzugte Protein-Mutante weicht von SEQ ID NR: 3 durch eine einzelne Substitution von Val an Position 346 und eine einzelne Substitution von Ala an Position 343 ab. Ebenfalls bereitgestellt wird eine Protein-Mutante mit einer Substitution bei 343 und 346, wobei die Aminosäure-Substitution an Position 343 (a) die Protein-Mutante resistent gegenüber einer Spaltung durch Elastase an Position 343 macht; und (b) Seitenketten aufweist, die die Bindung der Protein-Mutante an die Elastase zum Erhalt eines mutierten PAI-1-Elastase-Komplexes nicht beeinträchtigen.
Eine Protein-Mutante wie oben kann außerdem zwischen ein und vier der folgenden zusätzlichen Aminosäure-Substitutionen in SEQ ID NR: 3 aufweisen, die das Protein stabilisieren: (a) His an Position 150; (b) Thr an Position 154; (c) Leu an Position 319; und (d) Ile an Position 354. Eine bevorzugte Mutante enthält alle vier der obigen zusätzlichen Substitutionen. Zusätzliche stabilisierende Substitutionen umfassen Leu an Posi tion 91 und Ile an Position 372. Ebenfalls bevorzugt sind Mutanten mit zusätzlichem Arg an Position 333 und/oder 335 oder sowohl an 333 als auch 335. Eine weitere Substitution in dieser Region ist Gly an 331. PAI-1-Mutanten einschließlich einer beliebigen Kombination der vorangegangenen Substitutionen können als eine stabilisierte Form des Proteins, insbesondere zur Verwendung in vivo, verwendet werden.
Kürzere Peptide, die zumindest die reaktive Schleife von PAI-1 mit den oben beschriebenen Aminosäure-Substitutionen enthalten, sollen ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfasst sein. Solche Peptide können als Elastase-Inhibitoren oder Zellmigrations-Inhibitoren in vitro oder in vivo verwendet werden. Als Elastase-Inhibitoren sind diese Peptide (oder Protein-Mutante der vollen Länge) bei Methoden zur Messung oder Titrierung der Elastase-Aktivität nützlich.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Hemmung der Elastase-Aktivität in einem Individuum nützlich ist, umfassend (a) eine Protein-(oder Peptid-)-Mutante, wie oben beschrieben, und (b) einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Exzipienten.
Diese Protein-Mutante der Erfindung kann zur Hemmung der Elastase in einem Patienten mit einer Erkrankung oder einem Zustand, der mit einer pathogenen Elastase-Aktivität assoziiert ist, verwendet werden, umfassend das Verabreichen an den Patienten einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie oben. Die Erkrankung oder der Zustand ist vorzugsweise ein solcher, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Emphysem, akutem Lungenversagen (ARDS), akuter entzündlicher Lungenerkrankung, angeborenem Alpha-1-Antitrypsin-Mangel, zystische Fibrose, atopische Dermatitis, Pancreatitis, periodontale Erkrankung, Arthritis und HIV-Infektion.
Diese Erfindung richtet sich weiterhin auf ein Nukleinsäure-Molekül, vorzugsweise DNA, die eine PAI-1-Protein- oder -Peptid-Mutante, wie oben beschrieben, codiert. Das Nukleinsäure-Molekül ist vorzugsweise eine Variante von SEQ ID NR: 1 oder eines codierenden Abschnitts davon. Ebenfalls bereitgestellt wird eine mit einem DNA-Molekül wie oben transformierte oder transfizierte Wirtszelle, welche eine PAI-1-Protein-Mutante codiert. Die Erfindung umfasst Methoden zur Herstellung der PAI-1-Protein-Mutante, umfassend das Kultivieren der transformierten oder transfizierten Wirtszellen unter Bedingungen, bei denen die PAI-1-Protein- oder -Peptid-Mutante exprimiert wird.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der für ein Epitop einer PAI-1-Protein-Mutante wie oben beschrieben spezifisch ist, welches Epitop auf wtPAI-1-Protein nicht vorhanden ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1–2 zeigen Modelle (Banddiagramme) von aktivem PAI-1 (1) und RCL-gespaltenem (inaktivem) PAI-1 (2). Die PAI-1-Hauptkette ist in grau gezeigt. Bestimmte Aminosäure-Reste der RCL sind hervorgehoben. Raumfüllende Modelle der Aminosäure-Seitenketten von P1 (Arg 346), P1' (Met 347) und P9 (Ser 338) sind in dunkleren Grauschattierungen gezeigt. Die angenäherte Position von P16 (Ser 331) ist durch eine kleine schwarze Raute gezeigt.
3 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1), die humanen PAI-1 codiert, plus 5' und 3'-untranslatierte Regionen von einem bestimmten Klon. Ebenfalls gezeigt ist die Aminosäuresequenz des humanen Volllängen-PAI-1 einschließlich des Signalpeptids.
4A–4B zeigen die Aminosäuresequenz des PAI-1-Proteins. SEQ ID NR: 2 ( 4A) enthält das Signalpeptid, wohingegen SEQ ID NR: 3 (4B) das reife Protein ist. Bevorzugte Reste für die Substitution zur Erzeugung von Mutanten sind in 4A gezeigt, ebenso wie die reaktive Schleifen-(RCL)-Region.
5 zeigt ein Schaubild der Hemmung von neutrophiler oder pankreatischer Elastase durch wtPAI-1, α1AT oder P1-Ala-PAI-1. Die Ordinate steht für die restliche enzymatische Aktivität nach 30-minütiger Inkubation mit zunehmenden Konzentrationen des Inhibitors.
6 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12,5% SDS-Gele) von Gemischen von Elastase mit wtPAI-1 oder P1-Ala-PAI-1. Spuren 1–3: Neutrophilenelastase. Spuren 1 & 4: lediglich Elastase. Spuren 2 & 5: Elastase + wtPAI-1. Spu ren 3 & 6: Elastase + P1-Ala-PAI-1. Die Gele wurden mit Coomassie Blau gefärbt. Die erkennbaren Bande stehen für das Elastase-Enzym, den Inhibitor oder den Enzym-Inhibitor-Komplex.
7 zeigt ein Schaubild der Wirkung der PAI-1-P1-Ala-Mutante auf die Internalisation von ¹²⁵I-humaner Neutrophilenelastase durch Typ II-Pneumozyten.
8 und 9 zeigen ein Set von Schaubildern der Endozytose (8) und des Abbaus (9) durch Prä-Typ II-Pneumozyten von aktivem und Aktivzentrums-inhibiertem Thrombin und die Wirkungen von PAI-1-Antikörpern. ¹²⁵I-Thrombin: PPACK (¹²⁵I-Th: PPACK) und aktives ¹²⁵I-Thrombin (¹²⁵I-Th), jeweils zu 20 nM. Ebenfalls in jedem Panel gezeigt sind die Wirkungen von Kaninchen-Anti-Maus-PAI-1-IgG (0,6 mg/ml) oder normalem Kaninchen-IgG (Kontroll-IgG, 0,6 mg/ml) an aktivem ¹²⁵I-Thrombin. Die Ergebnisse stehen für 3 Experimente, die jeweils im Duplikat vorgenommen wurden. Jeder aufgetragene Wert stellt den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch die Balken gezeigten Bereich dar.
10 und 11 zeigen ein Set von Schaubildern, die den Grad der Endozytose ( 10) und des Abbaus (11) von ¹²⁵I-Thrombin im Komplex mit Serpinen vergleichen. Prä-Typ II-Pneumozytenzellen wurden mit ¹²⁵I-Thrombin im Komplex mit dem synthetischen Inhibitor Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (¹²⁵I-Th:PPACK), HCII (¹²⁵I-Th:HCII), ATIII (¹²⁵I-Th: ATIII), α₁-PI (¹²⁵I-Th: α₁PI), jeweils zu 16 nM, inkubiert. Die Ergebnisse repräsentieren vier Experimente. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch die Balken angegebenen Bereich.
12 und 13 zeigen ein Set von Schaubildern, die den Grad der Endozytose ( 12) und des Abbaus (13) von ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplex vergleichen, gehemmt durch Antagonisten der LRP-Funktion. ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplex (10 nM) wurde mit kultivierten Prä-Typ II-Pneumozytenzellen in Gegenwart von RAP (1 μM), affinitätsgereinigten LRP-1-Antikörpern (Anti-LRP-1, 150 μg/ml), affinitätsgereinigten LRP-2-Antikörpern (Anti-LRP-2, 150 μg/ml), einem Gemisch aus LRP-1 und -2-Antikörpern (Anti-LRP-1 + 2)), 300 μg/ml) oder Antikörper zu einem Peptid entsprechend dem zytoplasmatischen Schwanz von LRP (Anti-LRP-1 CD, 150 μg/ml) inkubiert. Die spezi fische Endozytose und der Abbau wurden durch Koinkubation mit einem 500-fachen molaren Überschuss an unmarkiertem Thrombin:PAI-1 bestimmt. Die Ergebnisse stehen für zwei Experimente. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch die Balken gezeigten Bereich.
14 und 15 zeigen Sets von Schaubildern der Bindung von ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplex an LRP-1 (14) und LRP-2 (15). Die Bindung wurde in Gegenwart steigender Konzentrationen an unmarkiertem Thrombin:PAI-1, Thrombin oder PAI-1 gemessen. Die Kurven stellen den Best-Fit der Daten an eine einzelne Klasse von Stellen dar. Die Ergebnisse repräsentieren vier Experimente, die jeweils im Duplikat vorgenommen wurden. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch Balken angegebenen Bereich.
16–19 zeigen ein Set von Schaubildern der Wirkung von Wildtyp-PAI-1, oder einer Mutante von PAI-1, die zur Bindung von Vn unfähig ist, auf die Endozytose und den Abbau von ¹²⁵I-Thrombin (16 und 18) oder ¹²⁵I-uPA (17 und 19). Prä-Typ II-Pneumozytenzellen wurden entweder mit Wildtyp-PAI-1 ("wtPAI-1 ", 10 nM) oder mutiertem PAI-1 ("mPAI-1, 10 nM) inkubiert, der zur Bindung von Vn unfähig ist. ¹²⁵I-Thrombin oder ¹²⁵I-uPA (10 nM) wurde mit Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von RAP (1 μM) inkubiert. 16 und 17 zeigen die Endozytose, wohingegen 18 und 19 den Abbau zeigen. Die Ergebnisse repräsentieren 4 Experimente, die jeweils im Duplikat vorgenommen wurden. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch Balken angegebenen Bereich.
20 und 21 zeigen ein Set von Schaubildern der Endozytose und des Abbaus von ¹²⁵I-Thrombin, das entweder an Wildtyp-PAI-1 (20) oder mutiertes PAI-1 ( 21) vorkomplexiert worden ist. Prä-Typ II-Pneumozytenzellen wurden mit ¹²⁵I-Th:wtPAI-1 oder ¹²⁵I-Th:mPAI-1 (1 nM-Komplex) inkubiert. Siehe 16–19 zur Bezeichnung der Gruppen. Wo angegeben, wurde RAP (1 μM) zusammen mit dem Komplex hinzugegeben. Die Endozytose und der Abbau jedes Typs der ¹²⁵I-Komplexe sind gezeigt. Die Ergebnisse repräsentieren 2 Experimente. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch Balken angegebenen Bereich.
22–25 zeigen ein Set von Schaubildern der Wirkung von nativem oder konformationell verändertem Vn auf die Endozytose und den Abbau ¹²⁵I-Thrombin ( 22 und 24) oder ¹²⁵I-uPA (23 und 25) in Gegenwart von wtPAI-1. Prä-Typ II-Pneumozyten wurden entweder mit nativem Vn ("nVn", 50 nM) oder konformationell verändertem Vn (denaturiert = "dVn", 50 nM) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit Widtyp-PAI-1 (10 nM) inkubiert, gefolgt von der Zugabe von entweder ¹²⁵I-Thrombin (10 nM) oder ¹²⁵I-uPA (10 nM). 22 und 23 zeigen die Endozytose, wohingegen 24 und 25 den Abbau zeigen. Die Ergebnisse repräsentieren 3 Experimente. Jeder aufgetragene Wert steht für den Mittelwert von Duplikat-Bestimmungen mit dem durch Balken angegebenen Bereich.
26 zeigt ein Schaubild der Bindung von rekombinantem aktiven oder latenten wtPAI-1 an Mikrotiterplatten, die mit gereinigtem nativen (nVn) oder Harnstoff-denaturiertem (dVn) Vn beschichtet waren. Gebundener PAI-1 wurde mit Affinitäts-gereinigten, biotinylierten Kaninchen-Anti-PAI-1-Antikörpern und an alkalische Phosphatase konjugiertem Streptavidin nachgewiesen. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert aus mindestens vier separaten Bestimmungen für jede Probe ± S.E.M. dar.
27 zeigt ein Schaubild der Bindung von vier zusätzlichen Formen von PAI-1 an nVn-beschichtete Mikrotiterplatten. Diese Formen enthalten PAI-1 in einem stabilem Komplex entweder mit uPA oder tPA, gespaltenem PAI-1, der unkomplexiert ist, doch ein rekonstitutiertes β-Faltblatt A aufweist, und PAI-1, vereinigt mit einem synthetischen RCL-Peptid, welches ein intaktes RCL aufweist, das nicht in das β-Faltblatt A inseriert ist, doch ein rekonstitutiertes Faltblatt A aufgrund der Insertion des synthetischen Peptids zur Bildung von Strang 4 des Faltblatts A aufweist (Kvassman, J., et al., (1995) J Biol. Chem. 270, 27942–27947). Der Assay wurde wie in 26 mit derselben Anzahl von Bestimmungen vorgenommen.
28 zeigt ein Schaubild der Bindung von aktivem wtPAI-1-kovalenten Komplexen von wtPAI-1-Trypsin, oder nicht-kovalenten PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexen an nVn-beschichtete Mikrotiterplatten. Der Assay wurde wie in 26 vorgenommen, mit der Ausnahme, dass für die Analyse der PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexbindung an Vn, 1 μM (Endkonzentration) an Anhydrotrypsin in alle Vertiefungen während des PAI-1-Inkubationsschritts aufgenommen wurde. Die Datenpunkte sind wie in 26 gezeigt.
29 zeigt ein Schaubild der Bindung von rekombinantem aktiven oder latenten wtPAI-1 und aktivem oder latentem mutierten PAI-1-Q123K an nVn-beschichtete Mikrotiterplatten. Der Assay und die Datenpunkte sind wie in 26 gezeigt.
30 zeigt ein Schaubild der Bindung von radiomarkiertem VnR an Vn und seine Kompetition durch wtPAI-1 und PAI-1-Mutanten. Die Ergebnisse stellen drei im Duplikat vorgenommene Experimente dar.
31 und 32 zeigen ein Set von Schaubildern der Inhibition durch PAI-1 und die P1-Ala-Mutante der Bindung von VnR an Vn (31) oder Fibronektin (32) und deren Umkehrung durch uPA. Die Ergebnisse repräsentieren 2 Experimente, die jeweils im Duplikat vorgenommen sind.
33 und 34 zeigen ein Set von Schaubildern der Inhibition durch PAI-1 und Mutanten davon der Adhäsion von glatten Muskelzellen an Vn (33) und Fibronektin (34) und deren Umkehrung durch uPA. Die Ergebnisse repräsentieren 4 im Duplikat vorgenommene Experimente.
35 zeigt einen funktionellen Assay für die Bindung von rekombinantem aktivem wtPAI-1 an natives oder Harnstoff-gereinigtes Vn. Die Menge an gebundenem aktiven PAI-1 wurde funktionell bestimmt. Bindung von aktivem wtPAI-1 an Vn (O); oder uVn (•). Die Datenpunkte stellen den Mittelwert aus mindestens vier separaten Bestimmungen für jede Probe ± S.E.M. dar, und die Schaubilder wurden mit dem Graphit-Programm (Erithacus Software) generiert.
36 zeigt die kompetitive Inhibition der PAI-1-Bindung an immobilisiertes nVn durch Lösungsphasen-Vn. Die Menge des an nVn gebundenen PAI-1 wird gegen die Konzentrationen des nativen oder Harnstoff-gereinigten Lösungsphasen-Vn aufgetragen. Gebundener PAI-1 wurde mittels ELISA bestimmt. Kompetition der PAI-1-Bindung durch nVn (O) oder durch uVn (•). Die Datenpunkte und die Generierung der Schaubilder (vier Parameter-logistischer Fit) waren wie für 35 beschrieben.
37 zeigt die Bindung von rekombinantem aktiven oder latenten wtPAI-1 an natives Vn (nVn) oder Harnstoff-gereinigte Vn (uVn)-beschichtete Mikroplatten. Die Menge des gebundenen PAI-1 wurde mittels ELISA bestimmt. Die leeren Symbole zeigen die PAI-1-Bindung an nVn, und die ausgefüllten Symbole zeigen die PAI-1-Bindung an uVn. Aktiver PAI-1 (O, •); latenter PAI-1 (☐,
). Die Datenpunkte und die Generierung der Schaubilder waren wie für 35.
38 zeigt die Bindung von aktivem PAI-1 (O), PAI-1: tPA-Komplex (Δ), PAI-1:uPA-Komplex (☐), PAI-1 im Komplex mit dem synthetischen RCL-Peptid (∇) oder durch Elastase gespaltener PAI-1 (♢) an nVn. Die Assays wurden wie in JBC der 3 vorgenommen. Die Datenpunkte und die Generierung der Schaubilder waren wie in 37 beschrieben.
39 zeigt die Bindung von aktivem wtPAI-1 (O), wtPAI-1-Trypsin-kovalenten Komplexen (Δ) oder nicht-kovalenten PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexen (☐) an nVn-beschichtete Mikroplatten. Der Assay wurde wie in 38 vorgenommen, außer, dass für die Analyse der PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexbindung an Vn 1 μM (Endkonzentration) an Anhydrotrypsin in alle Vertiefungen während des PAI-1-Inkubationsschritts aufgenommen wurden. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert aus mindestens vier separaten Bestimmungen für jede Probe ± S.E.M. dar, und die Schaubilder für aktiven PAI-1 ± Anhydrotrypsin wurden wie für 37 generiert.
40 zeigt die PAI-1-Inhibition der ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn. Diagramm von ¹²⁵I-VNR, gebunden an Vn, gg. Konzentration des zugesetzten PAI-1. wtPAI-1 (•) R346A-PAI-1 (♦) und Q123K-PAI-1 (O). Die Daten stellen den Mittelwert aus 5 im Duplikat vorgenommenen Experimenten dar.
41 zeigt die Inhibition der ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn durch PAI-1 mit oder ohne uPA. ¹²⁵I-VNR, gebunden an Vn, in Gegenwart jedes Kompetitors. Die Daten stellen den Mittelwert von 2 jeweils im Duplikat vorgenommenen Experimenten dar.
42A und 42B zeigen die Bindung und Migration von Kaninchen-SMC an Vn. 42A zeigt die Menge der Zellbindung an Vn-beschichtete Platten in Gegenwart jedes Kompetitors. 42B zeigt den Umfang der Zellmigration durch Vn-beschichtete Transwells in Gegenwart jedes Kompetitors. Die Daten stellen den Mittelwert von 5 Experimenten (42A) oder 3 Experimenten (42B) dar, die alle im Duplikat vorgenommen wurden.
43 zeigt die Migration von Kaninchen-SMC durch Matrigel-beschichtete Transwells mit oder ohne Vn. Umfang der Zellmigration durch Matrigel-beschichtete Transwells ± Vn in Gegenwart jedes Kompetitors. Die Daten stellen den Mittelwert von 3 jeweils im Duplikat vorgenommenen Experimenten dar.
44 zeigt die Wirkung zunehmender Konzentrationen an immobilisiertem Vn (Vn) auf die SMC-Migration. Vn in TBS wurde auf Transwells bei den angegebenen Konzentrationen geschichtet und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, woraufhin die Wells unter Verwendung von 3% BSA in TBS blockiert wurden. SMC in serumfreiem DMEM-Medium wurde oben auf die Transwell-Kammer aufgegeben und durfte 8 Stunden lang migrieren. Daraufhin wurde die Zellmigration ausgewertet (siehe Beispiel VI).
45 zeigt die Wirkung zunehmender Konzentrationen an PAI-1 auf die SMC-Migration auf Vn. Vn wurde auf die Transwells wie in 44 aufgeschichtet. SMC in serumfreiem DMEM-Medium wurde oben auf die Transwell-Kammer aufgegeben und durfte 30 Minuten lang binden, bevor PAI-1 der Zellschicht zugegeben wurde. SMC durfte 8 Stunden lang migrieren, woraufhin die Migration wie oben angegeben ausgewertet wurde.
46 zeigt, dass Vn in Serum die SMC-Migration auf Matrigel erhöht. Transwells wurden mit Matrigel (1:20-Verdünnung in TBS) für 2 Stunden bei 37°C beschichtet, woraufhin die Transwells gewaschen und mit TBS, Rinderserum oder gereinigtem nativem Vn (0,2 mg/ml in TBS) inkubiert wurden. Die Zellen durften 30 Minuten lang binden, bevor PAI-1 (1 μM) zugegeben wurde (vierter Balken). Die Migration wurde wie oben angegeben ausgewertet.
47 zeigt die Wirkung eines RGD-Peptids auf die Bindung von SMC an natives Vn. Natives Vn (1 μg/ml in TBS) wurde auf 96-Well-Platten aufgeschichtet und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, woraufhin die Platten mit 3% BSA in TBS blockiert wurden. SMC wurde den Wells in Abwesenheit oder Gegenwart der Peptide GRGDSP (100 μM in DMEM) oder GRGESP (100 μM in DMEM) oder LM609 (0,5 μg/ml in TBS) oder wtPAI-1 (1 μM in DMEM) zugegeben. Die Zellen durften 45 Minuten lang binden, bevor der Assay beendet wurde.
48 zeigt die Wirkung von PAI-1 und RGD-Peptiden auf die Bindung von SMC und Rinderaorta-Epithel-(BAE)-Zellen an natives Vn. Natives Vn wurde wie oben aufgeschichtet. SMC und BAE durften an die Wells in Gegenwart des Peptids GRGDSP (100 μM in DMEM) oder PAI-1 (1 μM in DMEM) für 45 Minuten binden, bevor der Assay beendet wurde.
49A und 49B zeigen die Wirkung von RGD-Peptiden (49A) und PAI-1 (49B) auf die Bindung von SMC und BAE an natives Vn. Natives Vn wurde wie oben bei 1 μg/ml aufgeschichtet. SMC und BAE durften an die Wells in Gegenwart zunehmender Konzentrationen an GRGDSP oder PAI-1 für 45 Minuten binden, bevor der Assay beendet wurde.
50A–50C zeigen die Wirkung von PAI-1-Mutanten auf die Zytokin-induzierte Angiogenese. Eine Angiogenese in der Hühner-Chorioallantoinmembran (CMA) wurde unter Verwendung von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor stimuliert (Brooks, P. C. et al., 1994, Science, 264: 569–571). 50A ist eine quantitative Darstellung der Angiogenese als Reaktion auf 2 μM aktiven PAI-1 (die stabilisierte 14-1B-Mutante) und 2 μM latenten PAI-1 (die Wildtypsequenz). 50B zeigt die dosisabhängige Inhibition der Angiogenese durch aktiven PAI-1 (die 14-1B-Mutante) bei 1, 0,1 und 0,01 μM. 50C vergleicht die Angiogenese-hemmende Aktivität von 2 μM "wt"PAI-1 (die 14-1B-1-Mutante, wobei sich "Wildtyp" auf seine Aktivität, nicht seine Sequenz bezieht) mit zwei PAI-1-Mutanten, die jeweils eine zusätzliche Aminosäure-Substitution aufweisen. R346A, welches Vn bindet, doch nicht fähig zur Hemmung von uPA ist, und Q123K, welches uPA hemmt, doch nicht Vn bindet.
51 zeigt einen Vergleich des zellulären Abbaus von humaner Neutrophilenelastase (NEL) in Komplexierung entweder mit PAI-1 oder α1-Proteinase-Inhibitor (α₁PI). Die zelluläre Clearance einer PAI-1-Mutante, die zur Hemmung der Neutrophilenelastase in Komplexierung an NEL (NEL:PAI-1) fähig war, wurde mit einem Komplex von NEL mit α₁PI (NEL-α₁PI) verglichen. Zuvor erzeugte Komplexe von ¹²⁵I-NEL (25 nM) mit PAI-1 oder α1-PI wurden Mäuseembryo-Fibroblasten-(MEF)-Kulturen zugegeben. Der Abbau der Komplexe wurde wie beschrieben ausgewertet (Stefansson, S. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 8515–8220). Der Abbau von NEL-PAI-1 wird durch Zugabe des Rezeptor-assoziierten Proteins (RAP, 1 μM) inhibiert, welches die Bindung aller Liganden an das LDL-verwandte Protein (LRP) antagonisiert. Der NEL-Abbau wurde außerdem durch den lysosomalen Abbauinhibitor, Chloroquin (150 μM), gehemmt.
52 vergleicht die Hemmung der humanen NEL-enzymatischen Aktivität durch PAI-1-Mutanten und α₁-Proteinasehemmer. NEL (2 nM) wurde mit steigenden Konzentrationen an "α₁PI" (•) inkubiert, einer PAI-1-Mutante mit zwei Aminosäure-Substitutionen vom Wildtyp-"V343A R346V" (O), der 14-1B-Mutante von PAI-1, die außerdem zwei Substitutionen aufweist – "V343A R346V 14.1B" (
), und der 14-1B-Mutante von PAI-1, die außerdem eine Substitution aufweist – "R346A 14.1B" (☐), inkubiert. Die restliche Aktivität der Elastase wurde durch Überwachung der Hydrolyse von N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid bei 405 nm gemessen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Einer der vorliegenden Erfinder und Kollegen wendete zuvor die positionsgerichtete Mutagenese und andere Methoden zur Erzeugung und Charakterisierung einer großen Zahl von Mutationen in der PAI-1-reaktiven Schleife (RCL) an (Sherman et al., 1992, supra; Sherman et al., 1995, supra). Die vorliegenden Erfinder haben nun neue Mutanten im RCL von PAI-1 hergestellt oder identifiziert, die PAI-1 neue und nützliche Eigenschaften verleihen, insbesondere (a) die Fähigkeit zum Wechselwirken mit und Hemmen der Elastase, eine Aktivität, die dem nativen PAI-1 fehlt, und (b) die Fähigkeit zum Hemmen der Vn-assoziierten Zellmigration. Diese Eigenschaften stellen die Grundlage für die unten beschriebenen neuen Anwendungen dieser Mutanten dar, für welche Zwecke der Wildtyp-PAI-1 ("wtPAI-1") oder andere Proteinase-Inhibitoren weniger gut geeignet oder überhaupt nicht nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt daher neuartige Zusammensetzungen in Form der Mutanten von PAI-1 mit einer erhöhten Stabilität als Proteinase-Inhibitoren, insbesondere als Inhibitoren von Elastase, bereit. Sekundär zu ihrer Inhibition der Elastase fördern diese Mutanten die Aufnahme und Clearance der Elastase (und der Elastase-PAI-1-Komplexe) durch LDL-verwandte Protein-Clearance-Rezeptoren. Folglich erhöht die Verwendung dieser Zusammensetzungen die Entfernung von Elastase von Stellen einer potenziellen oder tatsächlichen Verletzung. Die beschriebenen Mutanten neutralisieren die Elastase an Stellen mit einer Entzündung oder Verletzung wirksam.
Aufgrund der Rolle der Elastase bei Emphysem, zystischer Fibrose (CF) und bei akutem Lungenversagen (ARDS) bei Erwachsenen und Kindern, als auch bei anderen nachstehend erörterten Zuständen, kann die vorliegende Erfindung zur Behandlung dieser oder jeglicher anderer mit einer pathogenen Aktivierung der Elastase assoziierten Erkrankungen eingesetzt werden, welche Methode das Verabreichen entweder der PAI-1 oder der hierin beschriebenen PAI-1-Mutanten umfasst.
Zwei funktionelle Klassen von mutierten PAI-1-Molekülen werden in Betracht gezogen: Mutanten, die die Neutrophilenelastase (oder andere Elastasen) hemmen und Mutanten, die die Vn-abhängige Zellmigration hemmen. Bevorzugte Mutanten besitzen beide dieser Eigenschaften.
Mutanten, die Elastase hemmen
Eine bevorzugte Elastase-hemmende PAI-1-Mutante weist die folgenden Eigenschaften auf:

(1) PAI-1-Molekül weist die volle Länge auf oder ist um 1 bis 14 oder seine N-terminale Aminosäure verkürzt;
(2) eine Aminosäure-Substitution an der P1-Stelle, der P4-Stelle oder beiden, wie unten ausführlicher dargestellt;
(3) hemmt die Neutrophilenelastase mit einer Ratenkonstante der zweiten Ordnung von mindestens 10⁵ M^–1 sek^–1 mit einer Stöchiometrie von mindestens 2:1 bei physiologi schen Salzkonzentrationen und einem pH-Wert im unten beschriebenen kolorimetrischen Assay.

Die Elastase-inhibitorische Aktivität ist wie folgt definiert: nicht mehr als etwa 100 Mol des Inhibitors sind zur Hemmung von 1 Mol der Elastase erforderlich. Vorzugsweise nicht mehr als etwa 4 Mol, bevorzugter nicht mehr als etwa 2 Mol und am bevorzugtesten etwa 1 Mol der Protein-Mutante ist/sind erforderlich, um 1 Mol der Elastase zu hemmen.
Eine bevorzugte Substitution bei P1 ist Ala (R346A) oder Val (R346V), obschon andere Substitutionen, z.B. Met (α₁AT weist Met an dieser Position auf) oder Asp akzeptabel ist. Die hierin beschriebenen Aminosäure-Substitutionen sind austauschbar zum Beispiel mit "P1-Ala" bezeichnet, was die Position im PAI-1-reaktiven Zentrum als der P1-Stelle anzeigt, oder R346A, welches anzeigt, dass Arg durch Ala an Position 346 von PAI-1 der SEQ ID NR: 3 unter Verwendung von Einbuchstaben-Aminosäurecodes ersetzt ist.
Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, wird pankreatische Elastase nicht durch wtPAI-1 gehemmt, doch durch die P1-Ala-PAI-1-Mutante. Gemäß der in 6 gezeigten Ergebnisse wird ein Komplex gebildet zwischen P1-Ala-PAI-1 und Elastase, nicht jedoch zwischen wtPAI-1 und Elastase. Alle wtPAI-1 werden gespalten und so durch Wechselwirkung mit Elastase inaktiviert, was das Fehlen seiner inhibitorischen Wirkung erklärt.
Diese Inaktivierung von PAI-1 durch Elastase wurde auch durch Lawrence, D. A., et al., J. Biol. Chem. 269: 27657–27662 (1994) gezeigt. Tatsächlich haben andere veröffentlicht, dass PAI-1 kein Inhibitor der Elastase ist (Levin EG et al., J Cell Biol (1987) 105: 2543–2549). Shubeita et al. (supra) versuchten in der Tat eine Modifikation von PAI-1, um zum Inhibitor von Elastase zu werden, und schlugen damit fehl.
Eine Mutante, welche eine Ersetzung von P1-Arg durch Ala enthielt, in Kombination mit dem Wildtyp-Met bei P1', wurde früher von den vorliegenden Erfindern und deren Kollegen beschrieben (Sherman et al., 1992, supra). In 4 jener Bezugsquelle wurde gezeigt, dass solch eine Mutante die Fähigkeit zur Hemmung von uPA verlor. Bei derselben Mutante wurde später festgestellt, dass ihr die inhibitorische Aktivität gegenüber tPA und Thrombin fehlte (Sherman et al., 1995, supra, bei 1 und 2). Es ist wichtig, zur Kenntnis zu nehmen, dass diese beschriebenen Mutanten von den Mutanten der vorliegenden Erfindung darin verschieden waren, dass das PAI-1-Protein sieben zusätzliche Aminosäuren enthielt, die an ihren N-Terminus angefügt waren: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser (SEQ ID NR: 4) (Sherman et al., 1992, supra, auf Seite 7590, Spalte 2, letzter Absatz). Außerdem versuchten Shubeita H. E. et al., J. Biol. Chem. 1990, 265: 18379–85, die P1-Stelle in PAI-1 zur Hemmung der Elastase zu verändern, indem die a₁AT-Aminosäuresequenz in PAI-1 verwendet wurde, doch stellten keine Inhibition fest.
Der Grund dafür, dass die P1-Ala-Mutante Elastase hemmt, doch nicht tPA oder uPA, wird für eine Funktion der Wechselwirkung mit der Spezifitätsstelle (S1) der Proteinase gehalten (obschon die Erfinder nicht auf irgendeine spezielle mechanistische Interpretation festgelegt werden wollen). Diese S1-Stelle der Proteinase stellt die primäre Determinante der Substrat-Spezifität dar. In Abhängigkeit von der Größe und Hydrophobizität der S1-Stelle nimmt sie bevorzugt einen Typ von Aminosäure oder einen anderen auf tPA und andere PAs bevorzugen basische Reste bei P1 (Arg oder Lys). Elastase bevorzugt kleine hydrophobe Reste wie Ala und Val. Durch eine wohlüberlegte Wahl der Aminosäuren im reaktiven Zentrum der PAI-1-Mutante ist es folglich möglich, eine Substitution oder Kombination von Substitutionen auszuwählen, die die Wechselwirkung mit der Elastase-S1-Stelle optimiert und zugleich die Inaktivierung des Inhibitors verhindert und dadurch sein Inhibitionsvermögen und Begünstigungsvermögen der Clearance der Elastase maximiert.
Die Substitution an der P4-Stelle muss eine solche sein, die zu einem Protein führt, welches nicht nach dem P4-Rest durch Elastase gespalten wird. Daher ist es sinnvoll, für das Val an dieser Position im wtPAI-1 zu substituieren. Diese Resistenz gegenüber einer Inaktivierung erlaubt der Mutante eine erfolgreiche Hemmung der Elastase. Daher ist ein bevorzugter Aminosäure-Substituent (a) resistent gegenüber einer Spaltung durch Elastase an dieser Stelle, d.h. wirkt nicht als eine Substratstelle für Elastase, und (b) und präsentiert gleichzeitig keine Seitenketten, welche die Wechselwirkung und Bindung von PAI-1 an Elastase zum Erhalt eines Komplexes beeinflussen, so dass die Elastase-Aktivität gehemmt und der Komplex wirksam gecleart wird. Anders gesagt sollte die substituierende Aminosäure bei P4 eine schlechte Passung als eine primäre (Substrat)-Stelle für Elastase darstellen, ohne andere Substellen-Kontakte, die für die Interaktion und erfolgreiche Inhibition erforderlich sind, zu verändern.
Bevorzugte Aminosäuren bei P4 sind klein, wie etwa Ala und Gly, obschon auch etwas größere Reste wie Leu und Ile in Betracht gezogen werden. Die Aminosäure kann geladen sein, wie etwa Asp, was diese Stelle weniger anfällig für eine Spaltung durch Elastase machen sollte.
Ist die P4-Stelle substituiert, zum Beispiel mit Ala, so wird von einer größeren Zahl von möglichen Substitutionen bei P1 erwartet, zu einem Molekül mit den gewünschten inhibitorischen Eigenschaften zu führen. Die Wirksamkeit oder Inhibitionsrate (Ratenkonstante der zweiten Ordnung) wird erwartungsgemäß am höchsten mit Val bei P1 sein.
Mutationen, die die Zellmigration hemmen
Eine bevorzugte PAI-1-Mutante für die Inhibition der Zellmigration ist eine beliebige, die eine hohe Affinität für Vn aufweist und dadurch die Blockade der Integrin-(Vn-Rezeptor)-Bindung an Vn erlaubt. wtPAI-1 weist diese Eigenschaft auf. Ein zweites Charakteristikum solch einer Mutante ist, dass sie resistent gegenüber einer Inaktivierung durch eine Proteinase, am bevorzugtesten Elastase, Plasminogen-Aktivatoren, Plasmin, Thrombin, Cathepsin G, Chymase, Gelatinase A und B, Stromelysin und Collagenase, ist. Jegliche Mutanten, die diese Kriterien erfüllen, sind hiermit gemeint.
Ein mutiertes Protein oder Peptid mit "hoher Affinität" für Vn ist als ein solches definiert, bei dem die Bindung an das Proteinase-Ziel keinen signifikanten Verlust der Affinität für Vn (aufgrund einer Konformationsänderung des PAI-1-Proteins oder -Peptids) bewirkt. Der Verlust an Affinität für Vn ist als ein Anstieg des Kd von mehr als etwa dem 100-fachen des Kd des wtPAI-1 definiert. Wo zum Beispiel der Kd von wtPAI-1 für Vn etwa 10 nM in einem herkömmlichen Assay ist, wird eine bevorzugte Mutante einen Kd für Vn von etwa 100 nM oder weniger nach Bindung der Protease, bevorzugter einen Kd von 10 nM oder weniger, aufweisen.
Die Eigenschaft der Resistenz gegenüber einer inaktivierenden Spaltung durch eine Proteinase auf die Bindung an und Hemmung der Proteinase wird am besten durch eine PAI-1-Mutation im RCL, vorzugsweise an der P1-Stelle, erzielt. Eine bevorzugte Mutante ist P1-Ala. Alternativ, oder zusätzlich, ist eine Substitution bei P4, welche eine Proteinase-Spaltung nach der P4-Stelle hemmt, zum Beispiel P4-Ala, ebenfalls bevorzugt.
Wie oben angegeben, befindet sich ein Fragment von PAI-1, welches die erforderliche Elastase-hemmende oder Migrations-hemmende Aktivität aufweist, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Dieses Fragment weist allgemein die meisten der Aminosäuren des Volllängen-PAI-1 auf, und vorzugsweise sind nicht mehr als die 14 N-terminalen Aminosäuren abgespalten. Wird jedoch später festgestellt, dass andere Fragmente von PAI-1 die erforderlichen biochemischen Funktionen aufrechterhalten, so befinden sich Mutanten dieser Fragmente gemäß der obigen Beschreibung innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
Ebenfalls umfasst ist eine Mutante eines längeren Polypeptids, welche die skizzierten Eigenschaften von PAI-1 zusammen mit den jeweiligen Eigenschaften der hierin beschriebenen Mutanten aufweist. So sind zum Beispiel die N-terminalen 30 Aminosäuren von PAI-1 durch die N-terminalen 50 Aminosäuren von α1AT ersetzt worden, was zu einem Polypeptid führt, das um 20 Aminosäuren länger als PAI-1 ist, doch die biochemischen Eigenschaften von PAI-1 beibehält. Substitutions-Mutanten solch eines längeren Moleküls des oben beschriebenen Typs sind ebenfalls gemeint, vorausgesetzt, dass diese Mutanten Elastase hemmen.
Über die zuvor genannten Aminosäure-Substitutionen hinaus, die dem PAI-1 die gewünschten Eigenschaften zur Nutzung gemäß der vorliegenden Erfindung verleihen, sind zusätzliche Aminosäure-Substitutionen bekannt, die PAI-1 stabilisieren (Berkenpas, M. et al., EMBO J 14: 2969–2977, (1995)). Bevorzugte Zusammensetzungen umfassen wahlweise über die Substitutionen an den P1- und P4-Stellen hinaus vier weitere Substitutionen an Positionen 150, 154, 319 und 354 der SEQ ID NR: 3, wie bei der als 14-1B von Berkenpas et al., supra, bezeichneten Mutante. Diese Substitutionen sind N150H, K154T, Q319L, M354I.
Die untenstehende Liste fasst (nicht-ausschließend) PAI-1-Mutanten zusammen. Die gezeigten Aminosäure-Reste befinden sich an Positionen P4–P4' in der RCL (entsprechend den Resten 343 bis 350 der SEQ ID NR: 3).
Ebenfalls angestrebt sind Mutanten wie die nachstehend aufgelisteten, die zusätzlich eine oder mehrere der folgenden beiden Substitutionen aufweisen: T333R (Arg bei Rest 333 anstelle von Thr) und A335R (Arg bei 335 anstelle von Ala), und wahlweise S331G (Gly bei Rest 331 anstelle von Ser). Die Wichtigkeit dieser Positionen, insbesondere der 333-Position, ist beschrieben bei Lawrence, D. A. et al., J. Biol. Chem. 269: 27657–27662 (1994).
Zwar richtet sich die vorliegende Beschreibung in erster Linie auf menschliche PAI-1, doch sollte klar sein, dass Homologa von PAI-1 von anderen Spezies, und Mutanten davon, welche die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, als vom Umfang dieser Erfindung umfasst betrachtet werden sollen. Insbesondere kann das PAI-1-Protein (oder DNA) von anderen Säuger-Spezies für dieselben Zwecke wie menschliche PAI-1 in der Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen beim Menschen oder bei anderen Säuger-Spezies verwendet werden.
Wie oben angemerkt, umfasst die vorliegende Erfindung auch Peptide, die zumindest jenen Abschnitt der Sequenz enthalten, welcher die Substitution oder Substitutionen enthält, und die die erforderliche biochemische und biologische Aktivität, wie etwa die Elastase-Inhibition, aufweisen. Solche Peptide können unter Anwendung wohlbekannter synthetischer Methoden für die Synthese von Polypeptiden der gewünschten Sequenz auf Festphasen-Trägern und bei anschließender Trennung vom Träger erzeugt werden. Methoden für die Festphasen-Peptidsynthese sind in der folgenden Literatur gut beschrieben, Merrifield, B., J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2154 (1963); Merrifield, B. Science 232: 341–347 (1986); Wade, J. D. et al., Biopolymers 25: S21–S37 (1986; Fields, G. B., Int. J. Peptide Prot. Res. 35: 161 (1990); MilliGen Report Nrn. 2 und 2a, Millipore Corporation, Bedford, MA (1987). Zum Beispiel kann die klassischere Methode, "tBoc-Methode", oder die in letzter Zeit verbesserte "F-moc"-Technik angewendet werden (Atherton, E. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 538–546 (1981)).
Über ihre Anwendungen als Inhibitionsagenzien hinaus, wie für die Protein-Mutanten beschrieben, werden diese Peptide auch in Labortests verwendet, wie etwa bei neuartigen Elastase-Titrationsassays. Die Peptide werden außerdem zur Immunisierung von Tieren, um Mutanten-spezifische Antikörper zu erzeugen, als Antigene in Immunoassays zum Screening von Hybridom-Überständen oder als Festphasen-Immunadsorbenzien zur Reinigung von Mutanten-spezifischen Antikörpern verwendet.
Produktion von PAI-1-Mutanten durch Expression und Reinigung von rekombinantem PAI-1 in E. coli
Die folgenden Methoden sind bevorzugt, stellen aber nicht das ausschließliche Mittel zur Ausführung dieser Erfindung dar. Die Techniken zum Synthetisieren von Oligonukleotid-Sonden sind im Fachgebiet wohlbekannt und beschrieben zum Beispiel bei Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101–141 (1978) oder Gait, Hrg., Oligonucleotide Synthesis (aktuelle Auflage)). Die Verfahrensweisen zum Konstruieren und Exprimieren rekombinanter Moleküle gemäß dieser Erfindung, einschließlich geeigneter Promotor und anderer Kontrollelemente, Selektionsmarker, etc. sind beschrie ben bei Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Wiley-Interscience, New York, 1987; DNA Cloning: A Practical Approach, Band I & II (D. Glover, Hrg).
Umfasst von dieser Erfindung ist die DNA, die die PAI-1-Mutante codiert, welche vorzugsweise eine cDNA mit den geeigneten Nukleotidsequenz-Substitutionen ist, um die hierin beschriebenen Protein-Mutanten zu codieren. Solche Moleküle werden unter Anwendung herkömmlicher Methoden präpariert. Ebenfalls enthalten sind hierin prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert oder transifiziert sind, umfassend das obige DNA-Molekül. Auch die zum Transferieren der DNA, Exprimieren der DNA und Züchten der Wirtszellen angewendete Methode ist im Fachgebiet wohlbekannt und in den oben zitierten Literaturstellen beschrieben. Eukaryontische Wirtszellen sind vorzugsweise Säugerzellen einer etablierten Zelllinie, obschon auch Insektenzellen oder Pflanzenzellen in Betracht kommen. Geeignete Vektoren, wie z.B. Viren, Vektorsequenzen, Kontrollsequenzen wie z.B. für die Spezies der Wirtszellen geeignete Promotoren, sind herkömmlich und den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt und werden daher hierin nicht in besonderer Ausführlichkeit beschrieben. Über Sense-DNA hinaus werden hierin Antisense-DNA- und Antisense-RNA-Moleküle zur mutierten PAI-1-Codierungssequenz bereitgestellt. Ebenfalls enthalten ist ein RNA-Molekül, das die PAI-1-Mutante codiert.
Positionsgerichtete Mutagenese von PAI-1
Eine bevorzugte Methode zur Erzeugung von PAI-1-Mutanten verwendet einen handelsüblichen Reagenzsatz und wurde von einem der vorliegenden Erfinder und seinen Kollegen in einer Bezugsliteratur beschrieben (Lawrence, D. A., et al., Biochemistry 33: 3643–3648, 1994).
Die ortsspezifische oder positionsgerichtete Mutagenese erlaubt die Produktion von Peptid-Varianten durch die Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewüschten Mutation plus einer ausreichenden Anzahl benachbarter Nukleotide codieren, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zum Erhalt eines stabilen Duplex bereitzustellen, wobei auf beiden Seiten der Junktion die Deletion verschoben ist. Typischerweise ist ein Primer von etwa 20 bis 30 Nukleotiden in der Länge bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Junktion der Sequenz verändert sind. Die Technik der positionsgerichteten Mutagenese ist im Fachgebiet wohlbekannt, wie durch Veröffentlichungen z.B. von Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) beispielhaft veranschaulicht, welche hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Wie zu erkennen sein wird, verwendet die Mutagenese-Technik typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in einer einzelsträngigen als auch einer doppelsträngigen Form vorliegt. In der positionsgerichteten Mutagenese nützliche typische Vektoren sind die M13-Phagen (Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Herausgeber A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)). Diese Phagen sind kommerziell beziehbar, und ihre Anwendung ist im Fachgebiet wohlbekannt. Alternativ können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (z.B. Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987)) zum Erhalt einer einzelsträngigen DNA verwendet werden.
Im allgemeinen wird die positionsgerichtete Mutagenese gemäß dieser Erfindung so durchgeführt, dass zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die das PAI-1-Protein (oder Peptid) codiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird im allgemeinen synthetisch hergestellt (z.B. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 5765 (1978). Dieser Primer wird mit dem Vektor vereinigt, der die einzelsträngige Protein-codierende Sequenz umfasst, und wird DNA-polymerisierenden Enzymen unterzogen, wie etwa dem E. coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment, um die Synthese des Mutationstragenden Strangs abzuschließen. So tragen eine mutierte Sequenz und der zweite Strang die gewünschte Mutation. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann zum Transformieren geeigneter Zellen (wie etwa JM101-Zellen) verwendet, und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nach der Auswahl solch eines Klons, kann die mutierte Proteinregion entfernt und in einen geeigneten Vektor für die Proteinproduktion eingebracht werden, im allgemeinen einen Expressionsvektor des Typs, der zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann.
Zur Erzeugung der PAI-1-Mutanten wird die Mutagenese am bevorzugtesten unter Verwendung des Altered Sites^®-Mutagenese-Kits (heute bezeichnet als "Altered Sites II^®") gemäß den Anleitungen des Herstellers (Promega) vorgenommen. Kurz gesagt wird PAI-1-cDNA, zusammen mit T7-Promotor und Terminator-regulatorischen Sequenzen, als ein XbaI-EcoRV-Fragment vom PAI-1-Expressionsplasmid pET3aPAI-1 isoliert (Sherman et al., 1992, supra). Dieses Fragment wird an mit PstI/XbaI-geschnittenem pSELECT-1^® (Promega) (heute bezeichnet als "pALTER^®") ligiert, das an der PstI-Stelle stumpendig gemacht worden ist, wobei Phagemid pSELAI-1 geschaffen wird. Dieses Konstrukt wird dann in E. coli-Stamm JM109 transformiert, und einzelsträngige DNA wird durch Infektion mit dem Helferphagen R408 (Promega) erzeugt.
Das Folgende stellt eine Liste von Oligonukleotiden dar, die zur Generierung der bevorzugten Mutanten an den P1- und P4-Stellen von PAI-1 verwendet werden.
Eine neuere Methode steht für die verstärkte ortseliminierende Mutagenese zur Verfügung, die bei der Herstellung der mutierten PAI-1-Proteine angewendet werden kann. Der neue Chameleon^TM-Mutagenese-Kit (Stratagene) kann zur Erzeugung einer oder mehrerer ortsspezifischer Mutationen in nahezu jedem doppelsträngigen Plasmid (das eine einzelne nicht-essentielle Restriktionsstelle enthält) verwendet werden, wodurch das Erfordernis der Subklonierung in M13-basierende Vektoren und die Wiedergewinnung einzelsträngiger DNA wegfällt (Papworth, et al., Strategies 7: 38–40 (1994)). Der Chameleon^TM-Kit bietet eine Modifikation des einzigartigen ortseliminierenden Mutageneseverfahrens von Deng und Nickoloff (Anal. Biochem. 200: 81 (1992)). Das verbesserte Protokoll umfasst die Verwendung von: (1) mehr Ziel-DNA und ein neues Primer-Template-Verhältnis; (2) nativer T7-DNA-Polymerase anstelle von T4-DNA-Polymerase; (3) eine neue mutS-Zelllinie, die keine Endonuklease A erzeugt, und (4) hochkom pententen XImutS- und XL1-Blue^®-Zellen für die Transformation von mutierter Plasmid-DNA. Diese Modifikationen erhöhen die Ausbeute und Qualität der mutierten Plasmid-DNA, was zu durchgängig höheren Koloniezahlen und Mutagenese-Leistungen führt. Der Chameleon^TM-Mutagenese-Kit ist zur Einführung von Insertionen, Punktmutationen und Deletionen von sogar 40 bp verwendet worden (Papworth et al., Strategies 7: 78–79 (1994)), und ist außerdem mit drei mutagenen Oligonukleotiden zur gleichzeitigen Erzeugung von Triple-Mutationen verwendet worden. Der Kit enthält kompetente Zellen des XLmutS-Wirtsstamms, der die endA-Mutation trägt, was eine Endonuklease entfernt, die Miniprep-DNA abbaut, wobei die Ausbeute und Qualität der mutierten Plasmid-DNA und die Reproduzierbarkeit des Mutagenese-Verfahrens verbessert wird.
Das Mutagenese-Verfahren beinhaltet gleichzeitig die Vereinigung zweier Oligonukleotid-Primer am selben Strang der denaturierten doppelsträngigen Plasmid-DNA. Ein Primer (der mutagene Primer) führt eine ausgewählte Mutation ein, und der zweite Primer (der Selektionsprimer) verändert die Sequenz einer einzelnen Restriktionsstelle im Plasmid, um eine neue Restriktionsstelle zu schaffen. Der Extension dieser Primer mit T7-Polymerase und der Ligation der resultierenden Moleküle mit T4-Ligase folgen ein Restriktionsenzym-Verdau. Jegliche Plasmid-Moleküle, die ohne Einschluss des Selektionsprimers renaturieren, werden linearisiert, wohingegen dies bei jenen, die sich mit dem Selektionsprimer bilden, nicht der Fall ist. Das resultierende Gemisch wird in den hochgradig kompetenten XLmutS-E.coli-Stamm transformiert, welcher dazu unfähig ist, eine Fehlpaarungs-Reparatur zu vollbringen. Die transformierten Bakterien werden über Nacht in Flüssigkultur gezüchtet, und die Plasmid-DNA wird rückgewonnen und nochmals mit dem Restriktionsenzym behandelt, das Plasmide verdaut, die die ursprüngliche Restriktionsstelle enthalten. Plasmide, die die neue Restriktionsstelle und die gewählte Mutation enthalten, werden dem Verdau standhalten. Die Transformation dieser DNA zu hochkompetentem E. coli, wie etwa XLI-Blue, führt dazu, dass 70 bis 91 der Kolonien mutierte Plasmide enthalten. Ist eine zweite Runde der Mutagenese erwünscht, so kann ein Switch-Primer zum "Switchen" von der neuen einzelnen Restriktionsstelle zurück zur ursprünglichen oder einer anderen Restriktionsstelle verwendet werden, wobei er zugleich eine andere Mutation einbaut. Dieser Prozess macht es möglich, mehrere Runden an Mutationen vorzunehmen.
Die von Stratagene hergestellten Selektionsprimer selektieren gegen Restriktionsenzymstellen in den Antibiotikaresistenzgenen für Ampicillin, Chloramphenicol und Neomycin/Kanamycin. (Es stehen auch Primer für den ColEI-Replikationsursprung und den Polylinker sowohl von SK- als auch KS-Versionen des pBluescript^®-II-Phagemids zur Verfügung.) Die Switch-Primer erlauben eine zweite Runde der Mutagenese zur Wiederherstellung der ursprünglichen einzelnen Restriktionsstelle.
Expression, Reinigung und Charakterisierung von PAI-1-Mutanten
Ein neuartiger Phagemid-Vektor für eine effiziente Mutagenese und Proteinexpression ist durch einen der vorliegenden Erfinder und seine Kollegen entworfen worden. Dieses Konstrukt, pSELPAI-1, schaltet das Erfordernis aus, jede neue Mutante zu isolieren und in ein Expressionsplasmid zu subklonieren. Der Einbau von T7-Promotor- und Terminatorsequenzen in die pSELBAI-1-Konstrukte erlaubt eine effiziente PAI-1-Expression direkt von diesem Vektor unter Verwendung eines E. coli-Stamms, der T7-Polymerase produziert (Studier et al., 1990, Meth. Enzymol. 185: 60–89). Unter Verwendung dieses Systems wird eine positionsgerichtete Mutagenese allgemein bei einer Wirksamkeit von größer 50% erzielt. Außerdem hat eine Sequenzanalyse von größer als 10 kb von 8 unabhängigen Klonen keine weiteren Mutationen identifiziert, was eine sehr geringe Rate an Sekundärmutationen aufzeigt (< 0,01%).
Kurz gesagt werden Zellen des E. coli-Stamms BL21 (DE3), die mit den pSELPAI-1-Mutanten transformiert sind, zu einer OD₆₅₀ von 0,5 gezüchtet. Die PAI-1-Produktion wird durch die Zugabe von 1 M Isopropylthio-β-D-galactosid induziert, und das Wachstum wird bei 37°C für 2 Stunden fortgesetzt. Die Zellen werden abgeerntet, und PAI-1 wird wie von Lawrence et al., 1989, supra; Sherman et al., 1992, supr,a beschrieben gereinigt. Die Proteinausbeuten betragen etwa 1 bis 5 mg/l der Zellkultur. Die Reinheit wird mittels SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie Blau ausgewertet. Die inhibitorische Aktivität sowohl gegen uPA (American Diagnostica) als auch tPA (Activase, Genentech) wird in einem einstufigen chromogenen Assay gemessen, wie beschrieben (Lawrence et al., 1989, supra), und mit wtPAI-1, ausgereinigt aus E. coli, das das Expressionsplasmid pET3aPAI-1 trägt (Sherman et al., 1992, supra), verglichen. Die inhibitorische Aktivität gegen Elastase wird wie in nachstehendem Beispiel 1 beschrieben getestet. Andere Aktivitäten, die Erhöhung der Clearance oder Hemmung der Zellmi gration werden unter Anwendung der Methoden getestet, die in den Beispielen ausführlicher beschrieben sind.
Alle mutierten Proteine weisen spezifische Aktivitäten auf, die Wildtyp-PAI-1 ähnlich sind, was etwa 50% der errechneten maximalen theoretischen spezifischen Aktivität nachweist (Lawrence et al., 1989, supra). Die chromatographischen Profile jeder Mutante aus jedem Reinigungsschritt sind denen von wtPAI-1 ähnlich. Keine der Mutationen beeinträchtigt die Heparinbindung wesentlich. Jede Mutante bindet Vn bei etwa derselben Affinität wie wtPAI-1.
CHEMISCHE MODIFIKATION DES PROTEINS
Ein "chemisches Derivat" von PAI-1 enthält zusätzliche chemische Komponenten, die normalerweise nicht Teil des Proteins sind. Kovalente Modifikationen des mutierten PAI-1-Proteins sind vom Umfang dieser Erfindung umfasst. Solche Modifikationen können in das Molekül durch Umsetzen von angezielten Aminosäure-Resten mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zum Reagieren mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten fähig ist, in das Molekül eingeführt werden. Solche derivatisierten Komponenten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und ähnliches verbessern. Die Komponenten können jegliche unerwünschte Nebenwirkung des Proteins und ähnliches alternativ ausschalten oder abschwächen. Zum Vermitteln dieser Wirkungen befähigte Komponenten sind zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Eindeutig wird jede hierin umfasste chemische Modifikation die vorteilhaften Eigenschaften der PAI-1-Mutanten, wie oben beschrieben, nicht wesentlich verändern.
Histidyl-Reste werden durch Umsetzen mit Diethylprocarbonat bei pH 5,5 bis 7,0 derivatisiert, da dieses Agens relativ spezifisch für die Histidyl-Seitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 vorgenommen.
Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Succin- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung dieser Agenzien weist eine die Ladung der Lysinyl-Reste umkehrende Wirkung auf. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisie rung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und eine Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginyl-Reste werden durch Reaktion mit ein oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert; unter ihnen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung der Arginin-Reste macht es erforderlich, dass die Reaktion in alkalischen Bedingungen aufgrund des hohen pK_a der funktionalen Guanidingruppe vorgenommen wird. Außerdem können diese Reagenzien mit den Lysingruppen als auch der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation der Tyrosyl-Reste als solche wurde umfassend untersucht, wobei ein spezielles Interesse an der Einführung von Spektralmarkierungen in die Tyrosyl-Reste durch Reaktion mit aromatischen Diazonium-Verbindungen oder Tetranitromethan bestand. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol bzw. Tetranitromethan zur Bildung der O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate verwendet.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') modifiziert, wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid. Weiterhin werden Aspartyl- und Glutamyl-Reste zu Asparaginyl- und Glutaminyl-Resten durch Reaktion mit Ammoniumionen umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste können zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartyl-Resten deamidiert werden. Alternativ werden diese Reste unter mild sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Rahmen dieser Erfindung.
Zu weiteren Modifikationen zählen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), die Acetylierung des N-terminalen Amins und, in einigen Fällen, die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen. Zu häufig verwendeten Vernetzungsmitteln zählen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionale Maleimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Intermediate, die in Gegenwart von Licht zur Bildung von Vernetzungen fähig sind. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrices wie Cyanogenbromid-aktivierte Kohlehydrate und die reaktiven Substrate, wie beschrieben in US-Patent Nrn. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 und 4.330.440, für die Protein-Immobilisation verwendet.
Zu den erwünschten chemischen Modifikationen zählt die Markierung des mutierten Proteins oder Peptids mit einer nachweisbaren Markierung, die ihre Verwendung in diagnostischen in vivo-Methoden oder in vitro-Detektionsmethoden erlaubt. Eine "diagnostisch wirksame" Menge des Proteins ist eine Menge von nachweisbar markiertem Protein oder Peptid, welche bei Verabreichung ausreichend ist, um den Nachweis einer Positions-Proteinbindung oder -Anlagerung oder -Beseitigung zu ermöglichen. Die Verwendung des Proteins, um beispielsweise Thrombose, Fibrinablagerung, arteriosklerotische Plaque oder Krebs nachzuweisen, wird angestrebt. Allgemein wird die Dosierung der nachweisbar markierten PAI-1-Mutante für die Diagnose in Abhängigkeit von Überlegungen wie Alter, Zustand, Geschlecht und Ausmaß der Erkrankung im Patienten, Kontraindikationen, sofern vorhanden, und anderen Variablen variieren, die durch den diagnostizierenden Arzt einzustellen sind. Die Dosis kann von 0,01 μg/kg bis 2 mg/kg, vorzugsweise 0,1 μg/kg bis 1 mg/kg variieren. Der Begriff "diagnostisch markiert" bedeutet, dass an das Protein oder Peptid eine diagnostisch nachweisbare Markierung gebunden hat. Es gibt viele verschiedene Markierungen und Markierungsmethoden, die im Fachgebiet bekannt sind. Beispiele der Arten von Markierungen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten radioaktive Isotope, paramagnetische Isotope und Verbindungen, die durch Positronemissionstomographie (PET) bildhaft dargestellt werden können. Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis weitere geeignete Markierungen zur Bindung an die in der Erfindung verwendeten Proteine oder Peptide kennen, oder werden zu deren Bestimmung unter Anwendung routinemäßiger Experimente in der Lage sein. Weiterhin wird die Bindung dieser Markierungen an das Protein unter Anwendung standardmäßiger Techniken wie der Quervernetzung, kovalenten Bindung, nicht-kovalenten Bindung oder Komplexbildung vorgenommen.
FÜR EPITOPE DER PROTEIN-MUTANTE SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der für das mutierte PAI-1-Protein spezifisch ist. Der Antikörper ist ein solcher, der ein Epitop der Protein-Mutante erkennt, das nicht im wtPAI-1-Protein vorhanden ist. Solche Antikörper werden mittels herkömmlicher Methoden erzeugt, wie der Immunisierung eines Tiers mit einem mutierten Protein oder einem Peptid davon, welches ein oder mehrere Aminosäure-Aubstitutionen enthält. Diese Peptide können unter Anwendung herkömmlicher Methoden chemisch synthetisiert werden. Die Methoden zur Immunisierung, die Adjuvanzien, die Zeitpläne etc. sind alle im Fachgebiet bekannt. Ein in dieser Weise erzeugtes Antiserum wird mittels eines beliebigen immunchemischen oder serologischen Assays auf die Bindung an das mutierte Protein als auch das wt-Protein getestet. Die Reaktivität für das wt-Protein kann durch Immunadsorption des Serums an immobilisiertes wt-Protein entfernt werden, bis lediglich eine Reaktivität gegenüber mutierten Epitopen zurückbleibt.
Alternativ wird ein monoklonaler Antikörper (mAb) erzeugt, der für Epitope des mutierten PAI-1 spezifisch ist, durch geeignete Immunisierung, Zellfusion, Zucht von Hybridomzellen und Testen und Selektieren des Überstands auf die gewünschte Spezifität erzeugt. Jene Hybridom-Zelllinien, die den gewünschten mAb produzieren, werden ausgewählt und in größeren Mengen gezüchtet. Die Auswahl wird mittels standardmäßigem Immunoassay erreicht, wie etwa einem Enzymimmunoassay (EIA oder ELISA) der Kulturflüssigkeit mit dem wt-Protein und der Protein-Mutante. Alternativ können Peptide des mutierten Proteins einschließlich der Aminosäure-Substitution oder -Substitutionen im Screening-Assay verwendet werden. Ein mAb der Erfindung ist ein solcher, der stark mit einem mutierten Protein oder Peptid reagiert und wenig oder keine nachweisbare Reaktivität mit dem wtPAI-1 aufweist.
Der Antikörper der Erfindung kann zum Nachweisen und Quantifizieren des Vorhandenseins des mutierten PAI-1-Proteins in einer biologischen Probe verwendet werden, wie etwa einer Körperflüssigkeit oder Gewebeextrakt eines mit dem Protein zu behandelnden Patienten. In dieser Weise kann das Behandlungsprotokoll überwacht und die Mengen der Mutante ausgewertet werden. Weiterhin kann der Antikörper zur Isolierung oder Reinigung des mutierten Proteins aus einem Gemisch verwendet werden, das das wt-Protein enthält.
Zu mehreren standardmäßigen Referenzarbeiten, die Methoden zur Herstellung, Testung und Anwendung der oben beschriebenen Antikörper darstellen, zählen: Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, NY, (1988); Maggio, E. (Hrg.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980, Bizollon, Ch. (Hrg.), Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, New York (1984).
THERAPEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN UND METHODEN
Das bevorzugte Tier der vorliegenden Erfindung ist ein Säugetier. Die Erfindung ist besonders nützlich bei der Behandlung eines menschlichen Wesens. Mit dem Begriff "behandeln" ist die Verabreichung an Patienten einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemeint, die ein mutiertes PAI-1-Protein dieser Erfindung zur Hemmung von Elastase oder Hemmung der Vn-abhängigen Zellmigration und anschließenden Proliferation umfasst, welche Hemmung eine aus einer Reihe von hierin beschriebenen Erkrankungen verhindern, mildern oder heilen kann.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, worin ein mutiertes PAI-1-Protein mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten oder Träger kombiniert wird, kann mittels einer beliebigen Methode verabreicht werden, die ihren angestrebten Zweck erfüllt. Die Mengen und Verabreichungsschemata können ohne weiteres durch Fachleute des klinischen Gebiets der Behandlung einer der speziell genannten Erkrankungen bei üblicher Sachkenntnis bestimmt werden. Bevorzugte Mengen sind nachstehend beschrieben.
Die Verabreichung kann auf parenteralen, subkutanen (sc), intravenösen (iv), intramuskulären, intraperitonealen, transdermalen, topischen oder inhalatorischen Wegen erfolgen. Alternativ, oder gleichzeitig, kann die Verabreichung auf dem oralen Wege erfol gen. Die zu verabreichende Dosis wird vom Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, der Art der Begleitbehandlung, sofern vorhanden, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkung abhängen.
Die Zusammensetzungen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung umfassen alle Zusammensetzungen, bei denen das mutierte PAI-1-Protein oder -Peptid in einer Menge enthalten ist, die zur Erzielung des angestrebten Zwecks wirksam ist. Da die individuellen Bedürfnisse variieren, liegt die Bestimmung des optimalen Bereichs der wirksamen Mengen jeder Komponente innerhalb der Zuständigkeit des Gebiets. Typische Dosierungen umfassen 0,1 bis 100 mg/kg/Körpergewicht, obschon bevorzugtere Dosierungen für bestimmte nachstehende Anwendungen beschrieben sind.
Wie oben angegeben, können, über das pharmakologisch wirksame Protein hinaus, die neuen pharmazeutischen Präparate geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, die Exzipienzien und Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der Wirkverbindungen zu Präparaten erleichtern, die pharmazeutisch anwendbar sind, wie im Fachgebiet wohlbekannt. Geeignete Lösungen zur Verabreichung durch Injektion oder oral können etwa 0,01 bis 99 Prozent der aktiven Verbindung(en), zusammen mit dem Exzipienten, enthalten.
Umfasst vom Rahmen dieser Erfindung sind Salze des PAI-1-Proteins oder -Peptids. Der Begriff "Salze" bezieht sich sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch auf Säureadditionssalze von Aminogruppen des Proteins oder Peptids. Zu Salzen einer Carboxylgruppe zählen anorganische Salze wie Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- oder Zinksalze und ähnliches, als auch Salze mit organischen Basen wie die, die mit Aminen, wie z.B. Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und ähnliche, gebildet werden. Zu Säureadditionssalzen zählen Salze mit Mineralsäuren wie Salz- oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren wie Essig- oder Oxalsäure.
Die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung werden in einer Weise hergestellt, die als solche bekannt ist, beispielsweise durch herkömmliche Misch-, Granulier-, Löse- oder Lyophilisierprozesse. Zu geeigneten Exzipienten können Füllstoffe, Bindemittel, Aufschlussmittel, Hilfsstoffe und Stabilisatoren zählen, die alle im Fachgebiet bekannt sind. Zu geeigneten Formulierungen für die parenterale Verabreichung zählen wässrige Lösungen der Proteine in wasserlöslicher Form, zum Beispiel wasserlösliche Salze. Außerdem können Suspensionen der Wirkverbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln zählen Fettöle, zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen.
Die pharmazeutische Formulierung für die systemische Verabreichung gemäß der Erfindung kann für die enterale, parenterale oder topische Verabreichung formuliert werden, wobei alle drei Arten von Formulierung gleichzeitig verwendet werden können, um die systemische Verabreichung des aktiven Inhaltsstoffs zu erzielen.
Wie für die Lungeninstillation vorgeschrieben, werden aerosolierte Lösungen verwendet. Bei einem sprühbaren Aerosolpräparat kann das aktive Protein in Kombination mit einem festen oder flüssigen inerten Trägermaterial vorliegen. Dieses kann ebenfalls in ein Druckfläschchen oder in Mischung mit einem unter Druck gesetzten flüchtigen, normalerweise gasförmigen Treibmittel abgepackt werden. Die Aerosol-Präparate können Lösungsmittel, Puffer, grenzflächenaktive Mittel und Antioxidanzien über das Protein der Erfindung hinaus enthalten.
Für die topische Anwendung können die Proteine der vorliegenden Erfindung in topisch anzuwendende Vehikel wie Salben oder Cremes aufgenommen werden, die sowohl eine beruhigende Wirkung auf die Haut haben als auch als ein Mittel zur direkten Darreichung des Wirkstoffs an die betroffene Fläche geeignet sind.
Der Träger für den Wirkstoff kann entweder in sprühbarer oder nicht-sprühbarer Form vorhanden sein. Nicht-sprühbare Formen können halbfeste oder feste Formen sein, die einen für die topische Anwendung vorgesehenen Träger umfassen und die eine dynamische Viskosität von vorzugsweise größer der von Wasser aufweisen. Zu geeigneten Formulierungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Tinkturen, Pulver, Einreibemittel, Salben und ähnliches. Sofern erwünscht, können diese sterilisiert oder mit Hilfsmitteln, z.B. Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Puffern oder Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks und ähnlichem, gemischt werden. Beispiele bevorzugter Vehikel sind nicht-sprühbare topische Präparate einschließlich Salbengrundlagen, z.B. Polyethylenglykol-1000 (PWG-1000), herkömmliche Cremes wie HEB-Creme; Gele; als auch Petroleumgel und ähnliches. Eine besonders bevorzugte Creme ist nachstehend beschrieben.
Weitere pharmazeutisch akzeptable Träger für das PAI-1-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung sind Liposome, pharamzeutische Zusammensetzungen, in denen das aktive Protein entweder in Dispersion vorhanden ist oder alternativ in Korpuskeln vorliegt, die aus wässrigen konzentrischen Schichten in Haftung an Lipidschichten bestehen. Das aktive Protein ist vorzugsweise in der wässrigen Schicht und in der Lipidschicht, innerhalb und außerhalb, oder in jedem Fall in dem nicht-homogenen System vorhanden, das allgemein als eine liposome Suspension bekannt ist. Die hydrophobe Schicht, oder Lipidschicht, umfasst allgemein, doch nicht ausschließlich, Phospholipide wie Lecithin und Sphingomyelin, Steroide wie Cholesterol, mehr oder weniger ionische grenzflächenaktive Substanzen wie Dicetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidinsäure, und/oder andere Materialien einer hydrophoben Natur.
Die hierin beschriebenen mutierten PAI-1-Proteine sind spezifisch zur Hemmung von Elastase und zur Hemmung der Zellmigration, insbesondere der Migration glatter Muskelzellen (SMCs), entworfen worden. Daher sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die solch ein Protein umfassen, zur Hemmung von Elastase und/oder Hemmung der Zellmigration in der Behandlung verschiedener Erkrankungen und Zustände nützlich, die mit der Elastase-Aktivität oder einer unerwünschten Zellmigration und Vermehrung verbunden sind.
MIT ELASTASE ASSOZIIERTE LUNGENERKRANKUNGEN
Elastase ist dafür bekannt, dass sie eine signifikante Rolle bei einer Anzahl entzündlicher Zustände und anderer Formen von Lungenerkrankungen spielt, die zu einem aku ten Lungenversagen (ARDS) sowohl der adulten Form als auch der neonatalen Form führt (Koleff, M. H. et al., New Eng. J. Med. 332: 27–37 (1995); Speer, C. P. et al. Pediatrics 91: 794–799 (1993)). Es gibt derzeit keine sinnvollen pharmakotherapeutischen Ansätze für ARDS, insbesondere für den frühen Krankheitsverlauf. Es wird davon ausgegangen, dass ein Protease-Inhibitor-Ungleichgewicht wesentlich zu einer akuten Lungenschädigung in den Frühstadien von ARDS beitragen kann. Die mutierten PAI-1-Proteine sind in der Wiederherstellung dieses Ungleichgewichts und seiner Beeinflussung zugunsten der Proteinase-(insbesondere Elastase)-Hemmung nützlich.
Weiterhin ist bei einer Lungenverletzung die Wichtigkeit der Extravasation von Neutrophilen aus dem pulmonalen mikrovaskulären Kompartiment in das Interstitium und den Alveolarraum erkannt (Strieter, R. M. et al., J. Invest. Med. 42: 640 (1994)). Diese Prozesse beziehen β2-Integrine und Selektine ein, wobei das neutrophile L-Selektin mit aktivierten Endothel-E- und P-Selektinen interagiert und das neutrophile β2-Integrin mit EC ICAM-1 in der Neutrophilen-EC-Adhäsion, -Margination oder -Rolling interagiert. Die Expression dieser Zelloberflächen-Moleküle und die Aktivität der Zellen werden durch die Cytokine TNF und IL1 beeinflusst. Diese beiden Cytokine sind Initiatoren und Promotoren, die die Kaskade von Ereignissen in Bewegung setzen, die zu mikrovaskulärer Entzündung führen. Die mutierten PAI-1-Proteine sind zur Modulierung dieser Neutrophilen-migratorischen Aktivität, und schließlich zur Hemmung der Wirkung ihres Sekretionsprodukts, der Elastase, nützlich, welche für einen großen Teil der Gewebeverletzung verantwortlich ist.
Emphysem ist dafür bekannt, dass es zu einem großen Teil das Ergebnis einer Elastase-vermittelten Gewebeverletzung ist. Eine Erhöhung der Lungen-Antiproteasemengen würde eine wichtige therapeutische Intervention in der Verhütung oder Verzögerung der Entwicklung von Emphysem darstellen (Smith, R. M., et al. J. Clin. Invest. 84: 1145–1154 (1989)). In der vorangegangenen Studie wurden Aerosole von α1AT an die Lungen von Hunden und Schafen verabreicht. α1AT wurde auf der Oberfäche von Alveolen und distalen Bronchiolen 2 Stunden nach Verabreichung festgestellt und war in Ausspülflüssigkeit vorhanden; die Antielastase-Aktivität war zur Konzentration des verabreichten humanen α1AT proportional.
Ein sekundär zu angeborenem α1AT-Mangel auftretendes Emphysem resultiert auch aus ungenügenden Mengen an α1AT, um den unteren Atemwegstrakt vor Neutrophilenelastase zu schützen (Hubbard, R. C. et al., J. Clin. Invest. 84: 1349–1354 (1989)).
Für Emphysem, einschließlich der Form aufgrund eines α1AT-Mangels, kann die Behandlung mit den Elastase-hemmenden PAI-1-Mutanten der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Bei zystischer Fibrose, CF, führt eine Neutrophilen-dominierte Entzündung auf respiratorischen Flimmerepithel-Oberflächen zu einer chronischen Epithelbelastung mit Neutrophilenelastase (McElvaney, N. G. et al., Lancet 337: 392–394 (1991)). In Aerosolform an CF-Patienten verabreichtes α1AT unterdrückte die Neutrophilenelastase in der respiratorischen Flimmerepithel-Auskleidungsflüssigkeit (ELF) und stellte ELF-Anti-Elastase-Kapazität wieder her. Diese Behandlung kehrte auch die inhibitorische Wirkung von CF ELF auf die Pseudomonas-Abtötung durch Neutrophile um, was eine Verstärkung der Wirtsabwehr nahelegt. Die Atemwegsentzündung bei CF war vermindert, und die IL-8-Mengen auf der respiratorischen Flimmerepithel-Oberfläche waren durch Aerosolisation des rekombinanten sekretorischen Leukoprotease-Inhibitors (rSLPI) unterdrückt (McElvaney, N. G. et al., J. Clin. Invest. 90: 1296–1301 (1992)). Diese Behandlung verminderte die bei ELF nachweisbare Elastase und schien den Entzündungszyklus auf der CF-Epitheloberfläche zu unterbrechen. rSLPI ist ein einkettiges nicht-glykosyliertes Protein von 12 kDa, das in E. coli mit identischer Struktur und Funktion zu normalem menschlichem SLPI erzeugt wird (Thompson, R. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6692–6696 (1986)).
Basierend auf dem vorangegangenen werden die PAI-1-Mutanten-Zusammensetzungen zur Hemmung von Elastase bei Patienten mit CF verwendet, wodurch verschiedene Symptome der Erkrankung behandelt werden.
Zur Behandlung der obigen Formen von Lungenerkrankungen ist die Verwendung von Aerosolen bevorzugt, um schutzbringende Alveolar-Mengen aufrechtzuerhalten. Fachleute des Gebiets werden wissen, wie die Wirksamkeit zur Verabreichung in die Lungenbläschen zu bestimmen ist. Wird eine Wirksamkeit im Bereich von 10 bis 20% er wartet, so werden 10 bis 200 mg an aktivem mutiertem PAI-1-Protein in Aerosol-Darreichung pro Tag oder 70 bis 1400 mg/Woche zur Aufrechterhaltung der gewünschten Mengen in der Alveolarflüssigkeit erforderlich sein. Verbesserte Aerosol-Darreichungsmethoden würden die erforderliche Menge reduzieren. Aerosolierte mutierte PAI-1-Proteine behalten ihre Antielastase-Aktivität bei und können eindringen in und sich ablagern auf der Oberfläche von distalen Lufträumen in der Lunge. Mit aerosolierten mutierten PAI-1-Proteinen werden Probleme einer hohen Nierenclearance in Verbindung mit der intravenösen (iv) Verabreichung einiger Agenzien vermieden.
Aerosol wird mittels herkömmlicher Methoden erzeugt, zum Beispiel durch unter Druck gesetzte luftbetriebene Nebelbildner. Das Aerosol weist vorzugsweise einen mittleren Massendurchmesser von 1 bis 4 μM auf. Eine abgestufte Dosierung kann angewendet werden, und die Mengen an PAI-1-Proteinen können durch Spülung bewertet und die Dosierung entsprechend eingestellt werden.
Alternativ können die Proteine parenteral bei einem Dosierungsbereich von etwa 10 bis 200 mg/kg/Woche verabreicht werden.
WEITERE ELASTASE-BEZOGENE ERKRANKUNGEN
Nach Travis, J. et al., J. Respir. Crit. Care Med. 150: S143–146 (1994) tritt eine periodontale Erkrankung gewisse pathophysiologische Merkmale mit Emphysem, z.B. die Anhäufung und die Degranulation von Neutrophilen an Entzündungsorten als Folge einer unterdrückten Phagozytose und der spezifischen Aktivierung dieser phagozytischen Zellen. Bei Periodontitis beginnt der Prozess mit einer Ansammlung von Plaque an den Zahnhälsen, gefolgt von einem Wachstum opportunistischer anerober Bakterien unter der Zahnfleischlinie. Diese Organismen können einer Abtötung sowohl durch Monozyten als auch durch Neutrophile standhalten, sekretieren Proteinasen, die den Kallikrein-Kinin-Weg aktivieren, bauen Gerinnungsfaktoren ab und setzen den chemotaktischen Faktor C5a aus Komplement frei. Die Neutrophilen werden an entzündete Stellen abgerufen, versuchen dort die Phagozytosierung der Bakterien, gefolgt von einer Inaktivierung der Proteinase-Inhibitoren und einem Abbau der Bindegewebs-Proteine, was zu einer Zerstörung des Zahnfleisches führt. Die vorliegenden Zusammensetzun gen sind zur topischen oder systemischen Behandlung von periodontalen Erkrankungen durch Hemmung der Elastase und anderen oben erörterten Mechanismen nützlich.
Atopische Dermatitis (AD), die sowohl Kinder als auch Erwachsene befällt, verfügt über keine geklärte Ethiologie, obschon vorgeschlagen wurde, dass sich während der Entzündung ein Überschuss an Serinproteinasen an der lokalen Erkrankungsstelle ansammelt bei gleichzeitigem Mangel an deren natürlichen Inhibitoren (Wachter, A. M. et al. Ann. Allergy, 69: 407–414 (1992)). α1AT wurde auf die Behandlung von recalcitranter AD getestet. Die Patienten zeigten eine signifikante klinische Besserung innerhalb von 6 bis 21 Tagen nach Beginn einer „Alternate-Day"-Therapie. α1AT stoppte den Schmerz und Juckreiz und förderte eine Gewebeheilung ohne Vernarbung.
Periodontale Erkrankungen werden vorzugsweise durch topische Verabreichung des mutierten PAI-1-Proteins, oder alternativ durch systemische Therapie, behandelt. AD wird durch topische Verabreichung eines mutierten PAI-1-Proteins behandelt. Wirksame Dosen für beide Erkrankungen liegen im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg/ml, bevorzugt etwa 20–50 mg/ml des mutierten PAI-1-Proteins in wässriger Lösung, verabreicht bei einem „Alternate-Day"-Schema. Zur Behandlung der Hände werden etwa 5 bis 10 ml des Proteins in Lösung in einen fest abschließenden Handschuh eingebracht, der dem Patienten angezogen wird. Andere bekannte fest umschließende Bedeckungen können an anderen Stellen verwendet werden. In Verbindung mit der wässrigen Lösung wird eine Creme des mutierten PAI-1-Proteins bei einer Konzentration von etwa 0,2 bis 5%, vorzugsweise 1%, verwendet. Zum Beispiel wird eine wässrige Behandlung an abwechselnden Tagen für 2 Stunden verabreicht, gefolgt von dem topischen Auftrag der Creme. Dies wird dreimal täglich wiederholt. Nachts wird eine kontinuierliche 8 Stunden-Anwendung des wässrigen Proteins in einer fest abschließenden Umhüllung vorgenommen. Bei einer „Alternate-Day"-Therapie wird die Creme dreimal pro Tag aufgetragen. Zu späteren Behandlungsstadien wird eine Erhaltungsdosis von etwa 1 bis 8% Creme, vorzugsweise etwa 5%, gegeben. Diese Therapie kann mit topischen Steroiden kombiniert werden. Die Erhaltungstherapie kann über Wochen bis Monate in Abhängigkeit von der Reaktion des Patienten gegeben werden. Eine bevorzugte weichmachende Cremebasis besteht aus Petroleum, Mineralöl, Mineralwachs und Alkohol (Aquaphor, Beiersdorf, Inc.), obschon auch andere im Fachgebiet bekannte Zu sammensetzungen verwendet werden können. Die Formulierung erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Methoden.
Es liegen Beweise für die Beteiligung eines T-Lymphozyten-Proteinrezeptors mit einer Elastase-artigen Eigenschaft an der Fusion von HIV-1 mit permissiven Wirtszellen vor (Bristow, C. L. et al., Interntional Immunol. 7: 239–249 (1995)). Ein synthetischer Elastase-Inhibitor (MAAPVCK: Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-Chlormethylketon) verminderte die HIV-Infektivität signfikant, wenn während des Kontakts zwischen Virus und Zelle vorhanden. Das menschliche T-Zell-Elastase-artige Homologon ist Membran-assoziiert und ist vor einer „Bystander"-Proteolyse durch Assoziation mit seinem natürlichen Inhibitor, al PI, geschützt. Nachweise legen einen Ligandenaustausch zwischen gp41–gp120-CD4-Komplexen und Elastase-artigen Protease-α1PI-Komplexen nahe. Komplexe zwischen gp120 und CD4 können eine Dissoziation von Elastase und α1AT induzieren, wobei eine Zerstörung der letzteren Komplexe das Beeinflussungsvermögen des MAAPVCK einer HIV-Infektivität erklären könnte. Eine Blockierung der katalytischen Stelle von Elastase-artiger Protease wäre präventiv für eine HIV-Fusion. Daher sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zum Anzielen solcher Komplexe, Hemmen der Elastase-artigen Aktivität und dadurch Beitragen zur antiviralen Wirkung auf HIV nützlich.
ARTERIOSKLEROSE, RESTENOSE UND GEFÄßKRANKHEIT
Arteriosklerose und die Bildung von Neointima in Blutgefäßen, insbesondere in Arterien, wird durch eine Reihe von Ereignissen stimuliert, einschließlich einer Blutplättchen-Aktivierung, die zu Thrombose und Sekretions-Wachstumsfaktoren, als auch zur Stimulierung der SMC-Migration und Vermehrung führt, was in Neointima-Bildung resultiert (siehe zum Beispiel Reidy, M. A. et al., Circulation 86III: 43, 46 (1992); Jackson, C. L. et al., Arterioscler. Thromb. 13: 1218–1226; Matsuno, H. et al., Nippon Yakurigaku Zasshi 106: 143–155 (1995)). Peptide, die die RGD-Sequenz enthalten, in der Hauptsache Vn, können die Bindung mehrerer Integrine einschließlich α_vβ3 in der SMC-Migration verhindern. Durch Hemmung der Integrinfunktion, insbesondere der Bindung von α_vβ3 (hierin auch als Vn-Rezeptor oder VnR bezeichnet), wird die Bildung von Neointima als einer Folge der Herabsetzung des prozentualen Anteils an SMC, die in Gefäßmedium und Neointima migrieren und sich dort vermehren, gehemmt. Die mutierten PAI-1- Proteine der vorliegenden Erfindung sind durch Blockierung der Integrin-Wechselwirkung mit Vn in der Verminderung von Thrombus und Neointima-Bildung nützlich, wodurch die Generierung von Arteriosklerose verhindert wird.
Restenose, jene Verengung, die bei bestimmten Patienten als Folge einer neointimalen SMC-Ansammlung nach einer Ballonangioplastie als Behandlungsform einer Arteriosklerose im Endstadium auftritt, stellt eine bedeutende langfristige Komplikation dar. Ihr Auftreten liegt bei etwa 30 bis 50% innerhalb der ersten sechs Monate nach der Angioplastie (Libby, P. et al. Circulation 86: III 47–52 (1992); Groves, P. H. et al. Atheroscler. 117: 83–96 (1995); Nikol, S., Wien Klin. Wochenschr. 107: 307–89 (1995)). Aus Tiermodellen ist bekannt, dass Restenose in mehreren Phasen erfolgt: Thrombose, Entzündung, Zellwucherung und Matrixbildung. Der Prozess ist kompliziert, wobei verschiedene Faktoren in jeder Phase als Agonisten oder Antagonisten wechselwirken. Nach mehr als 15-jähriger Erfahrung in der Ballonangioplastie besteht ein dringender Bedarf nach Entwicklung von therapeutischen Strategien auf der Grundlage der derzeit verfügbaren Information. Eine Reihe von Ansätzen wurde vorgeschlagen, einschließlich der selektiven Ausschaltung oder Veränderung von proliferierenden Zellen, der Erhöhung der natürlichen Wachstumsinhibitoren, einer Blockierung der Signaltransduktion oder Hemmung der Genexpression für bestimmte Wachstums-stimulierende Proteine. Die vorliegende Erfindung bietet einen spezifischen Ansatz, der auf eine Unterbrechung der Adhäsion, Migration und anschließenden Proliferation der SMC im Gefäßsystem durch Bereitstellen einer PAI-1-Mutante gerichtet ist, die zur Hemmung dieser Schritte durch Bindung an Vn und Unterbrechung der Vn-Wechselwirkungen mit seinen Integrin-Rezeptoren auf Zellen fähig ist.
Groves, et al., supra, beschreiben ein quantitatives Schweinehalsschlagader-Modell, welches in der Auswertung der vorliegenden mutierten PAI-1-Zusammensetzungen Verwendung finden kann und welches zwei verschiedene Erkrankungsarten widerspiegelt, die bei Humankrankheiten auftreten können: eine Mediadilation und ein tiefer Mediariss mit Bruch der inneren elastischen Schichten. Bei diesem Modell wird der Zeitverlauf der Neointimabildung morphometrisch ausgewertet und die SMC-Vermehrung mittels immunzytochemischen Nachweises des "proliferierenden Zellkern-Antigens" (PCNA) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ballonverletzung gemessen. Bei die sem Modell bewirkt die Dilatationsverletzung eine Mediavergrößerung und Neointimabildung nach spätestens 7 Tagen, ebenso wie den Bruch der inneren elastischen Schichten. Die Ballonverletzung erhöht den PCNA-Index der SMCs in der Media, die unter einer intakten elastischen Innenschicht liegt, maximal nach drei Tagen, und in der Neointima und der Neomedia nach 7 Tagen.
Ein vor kurzem beschriebenes verbessertes Modell der humanen Restenose bei Affen macht Gebrauch von arteriosklerotischen Affen, die 36 Monate lang mit einer arteriogenen Diät gefüttert worden sind (Geary, R. L. et al., Arferioscler Thromb. Vasc. Biol. 16: 34–43 1996)). Die Angioplastie wird in einer Hüftkranzarterie vorgenommen. Zu verschiedenen Zeitpunkten (bis zu 28 Tage) werden proliferierende Zellen unter Anwendung einer Bromdesoxyuridin-Markierung ausgezählt und die Arterien können in situ zur Untersuchung fixiert werden. Es ist beobachtet worden, dass die Angioplastie oftmals die Intimaplaque und die Media aufbricht, wodurch vorübergehend das Lumenkaliber und die Arteriengröße erhöht wird, was aber häufig nach spätestens 7 Tagen zur Grundlinie zurückgekehrt ist. Die Proliferation war über die gesamte Arterienwand nach 4 und 7 Tagen erhöht und nahm später auf die Kontrollraten ab. Die Intima verdickte sich deutlich zwischen Tag 14 und 28. Diese Reaktion auf die Angioplastie ähnelt der beim Menschen stark. PAI-1-Mutanten gemäß dieser Erfindung werden Affen in Verbindung mit der Angioplastie zur Beurteilung der Dosierungs- und Verabreichungsschemata gegeben. Die Ergebnisse können direkt auf menschliche Patienten oder andere Säuger-Spezies übertragen werden.
Libby et al., supra erörterten Restenose-Mechanismen auf der Grundlage einer Zytokin/Wachstumsfaktor-Kaskade im Anschluss an die Angioplastie. Eine akute lokale Thrombose und/oder mechanische Verletzung löst eine Zytokin/Wachstumsfaktor-Genexpression durch residente Makrophagen und SMCs aus, was eine sekundäre Wachstumsfaktor- und Zytokinreaktion hervorruft, welche die proliferative Reaktion verstärken und unterhalten könnte. Humane Arteriome enthalten variable Makrophagenzahlen. Die Variabilität im Makrophagengehalt der Arteriome, welche die Neigung zur Entwicklung einer Restenose bestimmen können, könnte die Erklärung dafür liefern, warum nicht alle Läsionen eine Restenose entwickeln. Im Zusammenhang mit diesen Mechanismen würden mutierte PAI-1-Proteine durch Hemmung der Vn-abhängigen SMC-Migration das ungeordnete Verhalten der SMCs während der Restenose, das durch eine Gefäßverletzung ausgelöst wird, verhindern oder vermindern.
Untersuchungen mit über- oder unterexprimierenden Komponenten des fibrinolytischen Systems von transgenen Mäusen ergaben eine signifikante Rolle in der Fibringerinnungs-Überwachung, Reproduktion, vaskulären Wundheilung, Hirnfunktion, Gesundheit und Überleben (Carmeliet, P. F., Baillieres Clin Haematol 8: 391–401 (1995)). Im Laufe der Zeit scheinen beide Typen von PAs sich mit spezifischen, doch überlappenden biologischen Eigenschaften entwickelt zu haben. Ein Verlust der PA-Genfunktion wird für wichtig in der Arteriosklerose, Neoangiogenese, entzündlichen Lungen- und Nierenerkrankung und Malignität gehalten. Die PA-Knockout-Mäuse mit ihren thrombotischen Phänotypen erlaubten eine Untersuchung der Wiederherstellung der normalen thrombolytischen Funktion und der Verhinderung einer Thrombose durch Gentransfer von Wildtyp- oder mutierten PA-Genen. Eine beeinträchtigte Thrombolyse von tPA-defizienten Mäusen wurde unter Anwendung eines viral vermittelten Gentransfers von rekombinantem tPA wiederhergestellt. Die Analyse der Neointimabildung bei PA-defizienten Mäusen legte nahe, dass eine kontrollierte Reduktion der fibrinolytischen Aktivität in der Gefäßwand für die Verhinderung oder Verminderung der Restenose nützlich sein könnte. Dieses Modell erlaubt eine Auswertung der vorliegenden PAI-1-Mutanten entweder durch Gentransfer oder exogene Therapie in der Verhütung von fibrinolytischen Prozessen als auch der Hemmung der Zellmigration, wie durch die vorliegenden Erfinder entdeckt.
Sawa, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 24: 1742–1748 (1994) untersuchten Kaninchen-Halsschlagader, um zu testen, ob eine veränderte Genexpression von PAI-1 innerhalb der Arterienwand nach einer experimentellen Ballonverletzung auftrat. Die Ballonverletzung (als ein Modell für Angioplastie) induzierte eine intramurale PAI-1-Expression (mRNA und Protein) in vaskulären SMCs und ECs. Die verminderte fibrinolytische Aktivität auf der Zelloberfläche, die wahrscheinlich aus der erhöhten PAI-1-Expression resultiert, kann ein murale Thrombose einleiten oder verschärfen. Als Folge dessen kann eine übermäßige Stimulierung mit Gerinnsel-assoziierten Mitogenen die vaskuläre SMC-Proliferation stimulieren, was, gekoppelt mit einer erhöhten Ansammlung von ECM, einem herabgesetztem Plasma-vermittelten Abbau zuzuschreiben ist und zur Restenose beitragen kann.
KREBS, ANGIOGENESE UND FIBROSE
Die Arbeit von Cheresh und Kollegen hat Einblick in die verschiedenen Typen von VnR-Integrinen und ihre Rolle bei verschiedenen biologischen Reaktionen von klinischer Bedeutung erbracht. Von besonderer Wichtigkeit sind die Wechselwirkungen zwischen VnR α_vβ₃ und Vn, welche durch verschiedene der PAI-1-Mutanten dieser Erfindung hemmbar sind. Durch Vermeidung einer Wechselwirkung dieser Adhäsionsmoleküle kann der wichtige Prozess der Zellmigration vermindert oder zum Einhalt gebracht werden, bei einer Reihe von wichtigen Konsequenzen für die mit unerwünschter Zellmigration verbundenen Erkrankungen und Zustände, welche zu Proliferation und Pathogenese führt. Über das vaskuläre Phänomen und die oben erörterten Erkrankungen hinaus, ist diese Migration bei der Tumorinvasion und Metastasierung von Bedeutung, was durch die vorliegenden Zusammensetzungen und Methoden unterdrückt werden kann. Wie oben ausführlich beschrieben, ist die Angiogenese und Neovaskularisation außerdem abhängig von intakten VnR-Vn-Wechselwirkungen. Daher wird eine Unterbrechung der Zellbindung an Vn durch PAI-1-Mutanten die Angiogenese hemmen, eine Wirkung, die zur Hemmung sowohl eines lokalen als auch metastatischen Tumorwachstums nutzbar gemacht werden kann.
Homologe Integrine mit identischen α-Untereinheiten und strukturell verschiedenen β-Untereinheiten führt zu verschiedenen funktionellen Erkennungsrepertoires unter den verschiedenen Zelltypen. So wurden zum Beispiel Karzinomzellen als ein neuartiges VnR-Integrin (α_vβ_x) exprimierend beschrieben, welches die Zelladhäsion an Vn, doch nicht an Fibrinogen oder von Willebrand-Faktor vermittelte (Cheresh, D. A. et al., Cell 57: 59–69 (1989)). Im Gegensatz dazu exprimieren Melanomzellen und ECs ein VnR (α_vβ3), das die Zellbindung an all diese Matrixkomponenten fördert. Das Karzinomzell-Integrin setzte sich aus einer α-Untereinheit, die vom α_v des VnR nicht unterscheidbar war, und einer zuvor unbekannten β-Untereinheit (β_x) zusammen. Diesen Zellen fehlt auch mRNA-codierendes Integrin β₃. Diese Rezeptorvariante vermittelte die Zelladhäsion an Vn als auch Fibronektin, basierend auf Antikörper-Inhibitionsstudien.
Integrin-α-Ketten können mit mehr als einer einzelnen β-Kette in derselben Zelle komplexieren (Krissansen, G. W. et al., J. Biol. Chem. 265: 823–830 (1990)). Eine differenzielle Regulierung der Expression der verschiedenen β-Untereinheiten, die sich mit der VnR-α-Kette verbinden, können eine Rolle während der Zelldifferenzierung von Monozyt-Makrophagen spielen.
Für diese Erfindung von Bedeutung ist die Entdeckung, dass es für die Integrin-β3-Untereinheit erforderlich ist, dass sich Karzinomzellen auf Vn (und Fibrinogen) ausbreiten oder migrieren (Leavesley, D. I. J. Cell Biol. 117: 1101–1107 (1992)). Es wurde festgestellt, dass eine humanes pankreatisches Karzinom Integrin-α_vβ5 als sein primäres VnR verwendet da dieses kein α_vβ₃ exprimierte. Diese Zellen konnten keine fokalen Kontakte bilden, sich auf Vn ausbreiten oder wandern, doch taten dies ohne weiteres auf Collagen in einer β₁-Integrin-abhängigen Weise. Die Transfektion dieser Krebszellen mit cDNA, die die Integrin-β₃-Untereinheit codiert, bewirkte die Oberflächenexpression eines funktionellen α_vβ₃-Heterodimers, was diese Zellen mit neuartigen adhäsiven und biologischen Eigenschaften ausstattete, nämlich der Fähigkeit, auf Vn oder Fibrinogen bei β₃-Lokalisation an fokalen Kontakten zu binden und sich auszubreiten. Diese Zellen erwarben die Fähigkeit zur Wanderung durch eine poröse Membran als Reaktion auf entweder Vn oder Fibrinogen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die β₃- und β₅-Integrin-Untereinheiten, wenn mit α_v assoziiert, unterschiedliche zelluläre Reaktionen auf eine Vn-extrazelluläre Umgebung fördern. Gemäß dieser Erfindung sind all die vorangegangenen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ECM durch die PAI-1 Mutanten hemmbar.
Es ist wichtig zu erkennen, dass mehrere verschiedene Integrine auf denselben Zellen vorhanden sind (z.B. α_vβ₁, α_vβ₃ und α_vβ₅). Allerdings handelt es sich um die β₃-Kette, die heraufreguliert wird, wenn Zellen im Begriff zu migrieren sind. Nichtsdestotrotz wird jegliche Zelle, die irgendein Integrin zur Bindung an die RGD-Stelle von Vn verwendet, bei dieser Wechselwirkung und ihrer anschließenden Migration durch die hierin beschriebenen PAI-1-Mutanten gehemmt werden.
Das Erfordernis von vaskulärem Integrin-α_vβ₃ für die Angiogenese wurde durch Brooks, P. C. et al., Science 264: 569–571 (1994) gezeigt. Diese VnR wurde auf Blutgefäßen in Wundgranulationsgewebe exprimiert und während der Angiogenese in ihrer Expression erhöht. Ein Antikörper gegen α_vβ₃ blockierte die durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Fragmente des Melanomtumors induzierte Angiogenese. Dies identifiziert α_vβ₃ als ein therapeutisches Ziel für durch Neovaskularisation gekennzeichnete Erkrankungen. Eine therapeutische Zusammensetzung kann auf dieses Ziel ausgerichtet werden, wie bei PAI-1-Mutanten, die zur Hemmung der Migration gestaltet sind und die eine hohe Affinität für Vn beibehalten. Die Verabreichung wirksamer Mengen dieser Zusammensetzungen wird die molekularen Wechselwirkungen unterbrechen, die für die Angiogenese erforderlich sind. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen an das betroffene Gewebe zum Beispiel durch intraläsionale Injektion in Tumoren oder durch spezifisches Anzielen unter Verwendung zielgerichteter Liposome verabreicht.
Die Wundheilung erfordert den koordinierten Einfluss von Fibroblasten, Gefäßendothel und Epithel. Agenzien, die eine schnellere Zuführung von Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen in Wunden fördern, sollten die Rate erhöhen, mit der Wunden heilen. Allerdings kann eine solche Stimulierung auch zu einer ungewollten Gewebefibrose und Narbenbildung führen. Die vorzugsweise topisch angewendeten PAI-1-Mutanten der vorliegenden Erfindung sind beim Herabregulieren der Zufuhr zum Beispiel von Fibroblasten in eine Wunde nützlich. Eine wohlbedachte Verwendung dieser Proteine wird die Erzielung eines Gleichgewichts zwischen Wundheilung und Fibrose oder Narbenbildung ermöglichen.
Eine Fibrose in der Lunge stellt ein Hauptproblem der Chemotherapie mit Agenzien wie Bleomycin und Adriamycin dar. Fibroblasten migrieren in das Lungengewebe (oder ein anderes chronisch entzündetes Gewebe) auf eine Fibrinmatrix und lagern Collagen ab. An die Fibrinmatrix gebundenes endogenes PAI-1 wird zur Ermöglichung dieser Prozesse verdrängt. PAI-1 überexprimierende Knockout-Mäuse zeigten eine Inhibition der Lungenfibrose als Reaktion auf Bleomycin (Eitzman, D. T. et al., J. Clin. Invest. 97: 232–237 (1996)). Die Pathogenese der Lungenfibrose als auch der Fibrose in anderen chronisch entzündeten Geweben beinhaltet Zunahmen des Gewebefaktors, welcher die Prothrombin-Aktivierung zu Thrombin stimuliert, was zu einer Fibrinogen-Umwandlung zu Fibrin und einer Fibrinablagerung führt. Eine Entzündung reguliert auch PAI-1 herauf. Allerdings sind Zellen wie Fibroblasten zur Verdrängung von PAI-1 in der Bindung an und Wanderung entlang der Fibrinmatrix fähig. Schließlich führt ihre Migration und die Sekretion von Collagen zu Fibrose. Das mutierte PAI-1-Protein dieser Erfindung wird zur Unterbrechung dieses Prozesses durch Hemmung der Zellmatrix-Wechselwirkung und Hemmung der Fibroblastenmigration und Erzeugung von Fibrose in der Lunge oder jedem anderen chronisch entzündeten Gewebe verwendet. Das Protein kann als ein Aerosol oder durch systemische Injektion oder beides verabreicht werden. Alternativ kann das Protein auf ein spezifisches Gewebe durch liposomale Träger oder andere, im Fachgebiet der zielgerichteten Wirkstoffverabreichung bekannte Methoden, angezielt werden.
THROMBOSE
Mutierte PAI-1-Proteine dienen auch als verbesserte Thrombin-Inhibitoren. An Fibrin in einem Gerinnsel gebundenes Thrombin wird vor der Inhibition durch normale Thrombin-Inhibitoren geschützt. Die mutierten PAI-1-Proteine sind zur Hemmung dieses "geschützten" Thrombins auf Oberflächen fähig. In dieser Weise werden die mutierten PAI-1-Zusammensetzung zur Behandlung einer tiefen Venenthrombose verwendet, wo Gerinnsel-gebundenes Thrombin dazu dient, eine Erweiterung des Gerinnsels zu fördern, was zu Blockade und beispielsweise Herzinfarkt führt. Die Gerinnselerweiterung ist gegenüber einer traditionellen Antikoagulantientherapie resistent. Die Verabreichung des mutierten PAI-1-Proteins wird Thrombin aus einem Gerinnsel beseitigen und dadurch die Gerinnselerweiterung und dessen pathologische Folgen verhindern.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird dieselbe unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstehbar werden, die zu Veranschaulichungszwecken und nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung angegeben werden, sofern nicht anders spezifiziert.
BEISPIEL I
Inhibition von Elastase durch PAI-1-Mutanten
Es wurden Untersuchungen vorgenommen, um die Bindungsfähigkeit der PAI-1-Mutanten an Elastase in einer Weise zu testen, welche die Inhibition der enzymarischen Elastase-Aktivität zuließ. Ebenfalls getestet wurde die Fähigkeit der PAI-1-Mutante, eine Endozytose von Elastase zu stimulieren, und die Abhängigkeit dieser Internalisation von LDL-artigen Rezeptorproteinen.
Assay der Elastase-Aktivität und ihrer Hemmung
Neutrophilenelastase und pankreatische Elastase (1 μg/ml) wurden mit zunehmenden Konzentrationen entweder von wtPAI-1 oder P1-Ala-PAI-1 oder α1AT für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 μg/ml BSA, 0,01% Tween-80 (100 μl) inkubiert. Das chromogene Substrat Ala-Ala-Ala-pNA (Sigma) (100 μl) wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Die Veränderung der Extinktion bei 405 nm wurde bei 37°C für 30 Minuten gemessen, und die Rate der Veränderung wurde für die letzten 15 Minuten berechnet.
SDS-PAGE-Analyse der Komplexbildung zwischen PAI-1 und Elastase
Neutrophilenelastase (0,45 mg/ml) und pankreatische Elastase (1 mg/ml) wurden mit einem vierfachen molaren Überschuss entweder an Wildtyp-PAI-1 (Spuren 2 und 4) oder PI-Ala-PAI-1 (Spuren 3 und 6) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, woraufhin die Proben auf einem 12,5% SDS-Gel elektrophoretisch behandelt und mit Coomassie Blau gefärbt wurden.
Endozytose von ¹²⁵I-Neutrophilenelastase durch Typ II-Pneumozyten
Typ-II-Pneumozyten in 12-Well-Platten (0,5–1 × 10⁶ Zellen/Well) wurden zweimal in serumfreiem Medium gewaschen und für 30 Minuten in serumfreiem Medium + 1,5% BSA inkubiert. ¹²⁵I-Elastase von Neutrophilen (5 nM) wurde jeder Gruppe in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 mM des Rezeptor-assoziierten Proteins ("RAP") zugegeben, welches die Bindung aller Liganden an das LDL-Rezeptor-verwandte Protein (LRP) hemmt. Die Zellen wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, bevor die P1-Ala-PAI-1-Mutante oder α1AT ("α1") (25 nM) den Vertiefungen zugegeben wurde. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden zweimal unter Verwendung von PBS gewaschen und für 5 Min. in serumfreiem Medium inkubiert, das 0,5 mg/ml Trypsin und Proteinase K und 0,5 mM EDTA enthielt. Die Zellen wurden zentrifugiert, und die Radioaktivität im Zellpellet wurde als ein Maß der internalisierten Elastase ausgezählt.
Ergebnisse
Während wtPAI-1 die pankreatische Elastase (5) nicht hemmte, war dies bei P1-Ala-mutiertem PAI-1 der Fall, obschon bei geringerer Potenz als bei α1AT. Was die Neutrophilenelastase betraf, hemmte sowohl Wildtyp- als auch mutierter PAI-1 die enzymatische Aktivität, wobei die Mutante eine etwa vierfach größere inhibitorische Kapazität zeigte.
SDS-PAGE (6) von Gemischen aus Elastase mit wtPAI-1 oder P1-Ala-PAI-1 ergaben das Vorhandensein der Elastase und des Inhibitors, wenn wtPAI-1 verwendet wurde, ohne Nachweis einer Komplexbildung. Im Gegensatz dazu bildete P1-Ala-PAI-1 Komplexe mit der Elastase. Die Dubletts zeigen gespaltene Produkte auf, die nach wie vor gehemmt sind.
Was die Internalisation (Clearance) von Elastase betrifft, so förderte, geschweige denn hemmte, α1AT die Internalisation nicht. RAP wies keine Wirkung auf diese Inhibition auf. Im Gegensatz dazu verursachte P1-Ala-PAI-1 einen deutlichen Anstieg der Elastase-Internalisation, welche sensitiv gegenüber dem LRP-Inhibitor war (7). Es wurde gefolgert, dass die PAI-1-Mutante eine Endozytose und Aufnahme durch die LDLverwandten Clearance-Rezpetoren stimulierte.
BEISPIEL II
PAI-1 und Vitronektin fördern die zelluläre Clearance von Thrombin durch LDL-Rezepetor-verwandte Proteine 1 und 2 (siehe: Stefansson et al., J. Biol. Chem. 271: 8215–8229 (5. Apr. 1996)
Mit der folgenden Studie wurde die zellvermittelte Endozytose als einem potenziellen Mechanismus zur Regulierung der Mengen an extravaskulärem Thrombin und zur Bestimmung dessen ausgewertet, ob PAI-1, Vn und Rezeptoren der LDLR-Familie in diesem Prozess eine Rolle spielen.
I. Materialien und Methoden
Proteine
Menschliches α-Thrombin wurde erhalten von Dr. F. Church (University of North Carolina, Chapel Hill, NC) oder bezogen von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). Menschliches HCII wurde erhalten von Dr. F. Church. Menschliches ATIII wurde erhalten von Dr. K. Ingham (American Red Cross, Rockville, MD). Menschliches α₁AT wurde bezogen von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Menschliches Fibrinogen wurde bezogen von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-argininchlormethylketon (PPACK) wurde bezogen von Calbiochem (La Jolla, CA). Menschliches 39 kDa-Rezeptor-assoziiertes Protein (RAP) wurde exprimiert und gereinigt, wie beschrieben (Williams, S. E. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 9035–9040). Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandtes Protein (LRP-1) wurde gereinigt, wie beschrieben (Ashcom, J. D., et al. (1990) J. Cell. Biol. 110: 1041–1048). Glykoprotein 330/(LRP-2) wurde gereinigt, wie zuvor beschrieben (Kounnas, W. S. et al. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 737: 114–124). Natives menschliches Vn wurde bereitgestellt von Dr. D. Mosher (University of Wisconsin, Madison, WI). Harnstoff-denaturiertes menschliches Vn (konformationell verändert) wurde bereitgestellt von Dr. T. J. Podor (McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada). Menschliches uPA wurde bereitgestellt von Dr. J. Henkin (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Bakteriell exprimiertes menschliches PAI-1 wurde bezogen von Molecular Innovations (Royal Oak, MI). Eine mutierte Form von PAI-1 mit einer GIn₁₂₃-zu-Lys-Substitution, die es zur Bindung an Vn unfähig macht (Lawrence, et al., (1994) supra), wurde hergestellt, wie beschrieben (Kvassman, J. D. et al. (1995) Fibrinolysis 9: 215–221).
Die Radioiodierung der Proteine wurde unter Verwendung von IODO-GEN (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) vorgenommen. Die Komplexe von Thrombin und verschiedenen Inhibitoren wurden durch Inkubieren des ¹²⁵I-Thrombus mit jedem Inhibitor in einem Molverhältnis von 2:1 für 30 Min bei 25°C vorgenommen, gefolgt von einer Absorption des freien Thrombin durch Chromatographie an einer ATIII-Sepharose-Säule (2 mg ATIII/ml Harz). Um das Aktivzentrum-inhibitierte Thrombin herzustellen, wurde ¹²⁵I-Thrombin (100 nM) mit PPACK (5 mM) für 30 Min. bei 25°C in TBS inkubiert. Die Komplexe wurden auf die Thrombin-Aktivität durch Inkubation mit einer Fibrinogenlösung (1 mg Fibrinogen/ml in TBS, 5 mM CaCl₂) bei 25°C für 30 Min. und Analysieren der Fibrinbildung getestet.
Antikörper
Die Kaninchen-Antiseren gegen LRP-1 (rb777 und rb810), LRP-2 (rb239 oder rb784) und ein synthetisches Peptid entsprechend den 11 C-terminalen Resten der cytoplasmatischen Domäne von LRP-1 (rb704) sind zuvor beschrieben worden (Kounnas, W. S. et al. (1994) Ann. NYAcad. Sci. 737: 114–124; Kounnas, M. Z. of al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 12420–12423; Strickland, D. K. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266: 13364–13369). Der Rezeptor-spezifische IgG wurde ausgewählt aus den LRP-1- und LRP-2-Seren durch Chromatographie auf Säulen mit entweder LRP-1- oder LRP-2-Sepharose (1–2 mg Rezeptor/ml Harz). Kontroll-Kaninchen-IgG wurde aus Nicht-Immunseren ausgereinigt. Das IgG aus jedem Präparat wurde mittels Affinitätschromatographie auf Protein-G-Sepharose gereinigt und an eine Säule von RAP-Sepharose (2 mg RAP/ml Harz) absorbiert. Kaninchen-anti-murines PAI-1-Serum stammte von Molecular Innovations (Royal Oak, MI).
Zellen
Ratten-Prä-Typ-II-Pneumozyten (Mallampalli R. K. et al., (1992) In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 181–187) wurden in Waymouth's Medium (Gibco), ergänzt mit 10% Kälberserum (Hyclone, Logan, UT), Penicillin und Streptomycin gezüchtet.
Festphasen-Bindungsassays
Festphasen-Bindungsassays wurden wie beschrieben durchgeführt (Williams, S. E., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 9035–9040). ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplexe (1 nM) wurden in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen an unmarkiertem Komplex oder RAP in mit LRP-1, LRP-2 oder BSA (3 μg/ml) beschichteten Mikrotiter-Wells inkubiert. Das Programm "Ligand" wurde zur Analyse der Kompetitionsdaten und zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten (K₄) für Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen verwendet.
Endozytose und Abbau von Thrombin und uPA
Typ-II-Pneumozyten wurden in die Vertiefungen von 12-Well-Platten (1–2,5 × 10⁵ Zellen/Well) ausgesät und 18 Stunden lang bei 37°C, 5% CO₂ in Waymouth's Medium, enthaltend 10% Kälberserum, gezüchtet. Vor Zugabe der ¹²⁵I-Thrombin-Inhibitor-Komplexe wurden die Zellen zweimal in serumfreiem Waymouth's Medium gewaschen und für 30 Min. in Medium, das 1,5% BSA, 20 mM Hepes, pH 7,4, Nutridoma-Serumsubstitut, Penicillin und Streptomycin (Assaymedium) enthielt, inkubiert. ¹²⁵I-Komplexe in Assaymedium wurden den Zellschichten zugegeben und für 4–6 Stunden bei 37°C inkubiert. Wo angegeben, wurde unmarkiertes Thrombin:PAI-1 (800 nM), RAP (1 μM) oder IgG (150 μg/ml) 30 Min. vor Zugabe des ¹²⁵I-Liganden hinzugefügt und während des Assays vorhanden gehalten. Die Quantifizierung der Menge an endozytosiertem und abgebautem Liganden wurde vorgenommen, wie beschrieben (Stefansson, S. et al. (1995) J. Cell. Sci. 108: 2361–2369). Kurz gesagt wurde im Anschluss an die Inkubationsperiode das Medium von den Zellen entfernt und mit 10% Trichloressigsäure ausgefällt. Die lösliche Radioaktivität wurde als den abgebauten Liganden darstellend angenommen. Die Zellschichten wurden zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in serumfreiem Medium, das Trypsin und Proteinase K (0,5 mg/ml) und 0,5 mM EDTA enthielt, für 2–5 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 6000 × g für 2 Minuten zentrifugiert, und die Radioaktivität im Zellpellet wurde als die Menge an endozytosiertem Liganden darstellend angenommen.
Um die Wirkungen von Wildtyp- und mutiertem PAI-1 auf die Clearance (Endozytose und Abbau) des exogen zugegebenen ¹²⁵I-Thrombin auszuwerten, wurden die Zellen in Medium gezüchtet, das 10% Serum wie oben beschrieben enthielt. Die gewaschenen Monoschichten wurden dann entweder mit Wildtyp-PAI-1 (10 nM) oder mutiertem PAI-1 (10 nM) für 20 Min. bei 37°C inkubiert. ¹²⁵I-Thrombin (10 nM) oder ¹²⁵I-uPA (10 nM) wurde zugegeben und für 4–6 Stunden bei 37°C inkubiert. Wo angegeben, wurde RAP (1 μM) für 30 Min. vor Zugabe der Liganden inkubiert.
Zur Auswertung der Wirkungen von nativem gg. konformationell verändertem Vn auf die Clearance von exogen zugegebenem PAI-1 und aktivem ¹²⁵I-Thrombin, wurden die Zellen in serumfreiem Medium für 18 Stunden bei 37°C auf Gewebekulturplatten gezüchtet, die mit 0,1% Gelatine beschichtet waren. Das Medium wurde entfernt und das Assaymedium für 1 Stunde bei 37°C zur Blockierung der nicht-besetzten Bindungsstellen mit BSA zugegeben. Die Zellmonoschichten wurden entweder mit nativem (50 nM) oder konformationell verändertem Vn (50 nM) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellmonoschichten wurden dann zweimal mit Assaymedium gewaschen, um ungebundenen Vn zu entfernen. Wildtyp-PAI-1 (10 nM) wurde zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. ¹²⁵I-Thrombin (10 nM) oder ¹²⁵I-uPA (10 nM) wurde zugegeben und für 4–6 Stunden bei 37°C inkubiert.
II. Ergebnisse
Eine wirksame Endozytose und Abbau von aktivem Thrombin hängt von PAI-1 ab.
Wurde die Endozytose und der Abbau von exogen zugegebenem aktivem gg. Aktivzentrum-inhibiertem ¹²⁵I-Thrombin verglichen, so war das aktive Thrombin wirksamer endozytosiert und abgebaut (8–9). In Anbetracht der Tatsache, dass die Clearance zweier anderer Proteinasen, tPA und uPA, als durch Komplexbildung mit PAI-1 verstärkt nachgewiesen wurde, wurde die Möglichkeit, das PAI-1 die Clearance von aktivem Thrombin in den kultivierten Prä-Typ-II-Pneumozytenzellen vermittelte, untersucht. Die Vorbehandlung der Zellschichten mit PAI-1-Antikörpern führte zur Hemmung sowohl der Endozytose als auch des Abbaus von aktivem ¹²⁵I-Thrombin, wohingegen Kontroll-Kaninchen-IgG eine vernachlässigbare Wirkung auf beide Prozesse zeigte ( 8–9). Diese Daten zeigen, dass aktives Thrombin endozytosiert und abgebaut wird, und legen nahe, dass PAI-1 beteiligt ist.
Thrombin im Komplex mit PAI-1 wird wirksamer endozytosiert und abgebaut im Vergleich zu Komplexen mit ATIII, HCII oder α₁AT
Die relative Wirksamkeit der Zell-vermittelten Clearance von ¹²⁵I-Thrombin im Komplex mit verschiedenen Serpinen wurde unter Verwendung der Prä-Typ-II-Pneumozyten-Zelllinie untersucht. Wie in 10–11 gezeigt, wurden ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplexe endozytosiert (Panel A) und abgebaut (Panel 8) bei sechsfach größeren Mengen (n = 2) als Komplexe von Thrombin und den Serpinen ATIII, HCII und α₁AT oder von Thrombin und dem synthetischen Peptid-Inhibitor PPACK.
Mitglieder der Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-Familie vermitteln die Endozytose und den Abbau von Thrombin:PAI-I-Komplex
In Anbetracht dessen, dass PAI-1 die zelluläre Clearance von aktivem uPA über die Mitglieder der LDLR-Familie erleichtert, wurde die potenzielle Rolle dieser Rezeptoren in der Clearance von Thrombin:PAI-1 mit Thrombin untersucht. Die Prä-Typ II-Pneumozyten-Zelllinie war zuvor als zwei Mitglieder der LDLR-Familie, LRP-1 und LRP-2, exprimierend gezeigt worden (Stefansson, supra). Wie in 12–13 gezeigt, hemmten Antagonisten der LRP-1- und LRP-2-Funktion, nämlich das 39 kDa-Rezeptor-assoziierte Protein (RAP), und Antikörper entweder zu LRP-1 oder LRP-2 jeweils die Endozytose und den Abbau des ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplexes. Der Umfang der RAP-Inhibition war ähnlich dem unter Verwendung einer Überschussmenge an unmarkiertem Thrombin:PAI-Komplex, was nahelegt, dass Mitglieder der LDLR-Familie die Endozytose und den Abbau von Thrombin:PAI vermittelten.
Die Ergebnisse zeigen, dass zumindest zwei Mitglieder der LDLR-Familie, LRP-1 und LRP-2, eine Endozytose und den Abbau von ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1 vermitteln können. Die Unmöglichkeit der Kombination beider LRP-Antikörper zur Hemmung der Endozytose und des Abbaus im selben Umfang wie RAP (12–13) legt nahe, dass eine zusätzliche LDLR-Familie, die durch die Prä-Typ-II-Pneumozyten exprimiert wird, zum Endozytosieren von Thrombin:PAI-1 fähig ist.
Thrombin:PAI-1-Komplex bindet LRP-1 und LRP-2 im Festphasen-Assay
Festphasen-Bindungsassays unter Verwendung von gereinigten Komponenten wurden zur Bestimmung dessen vorgenommen, ob Thrombin:PAI-1 zur direkten Bindung an LRP-1 und LRP-2 fähig war. Wie in 14–15 gezeigt, band ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Komplex an mit einem von beiden Rezeptoren beschichtete Mikrotiter-Wells. Durch Anpassung der homologen Ligandenverdrängungs-Daten an ein Modell einer einzelnen Klasse von Zentren wurden die Dissoziationskonstanten (K_d) von 3,3 nM (n = 3) und 13 nM (n = 2) für die Bindung von ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1 an LRP-1 bzw. LRP-2 abgeleitet. RAP wurde als um die Bindung von ¹²⁵I-Komplex an beide Rezeptoren konkurrierend befunden. Thrombin oder PAI-1 alleine konkurrierte nicht wirksam um die ¹²⁵I-Thrombin:PAI-1-Bindung an einen der Rezeptoren (K₁'s > 700 nM).
Die Ergebnisse zeigen, dass Thrombin:PAI-1-Komplex mit hoher Affinität an LRP-1 und LRP-2 bindet. Die Tatsache, dass PAI-1 an beide Rezeptoren bindet, jedoch zum Konkurrieren um die Thrombin:PAI-1-Bindung unfähig ist, legt nahe, dass der Komplex eine zusätzliche Rezeptor-Bindungsstelle besitzt, die weder auf Thrombin noch PAI-1 alleine vorhanden ist.
Die Bindungsfähigkeit von PAI-1 an Vn erleichtert eine wirksame Clearance von Thrombin
Da gezeigt worden war, dass Vn die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 fördert, wurden Untersuchungen zur Bestimmung dessen vorgenommen, ob solch ein Mechanismus an der Prä-Typ-II-Pneumozyten-Clearance von Thrombin beteiligt war. In serumhaltigem Medium gezüchtete Prä-Typ-II-Pneumozytenschichten wurden entweder mit Wildtyp-PAI-1 oder einem mutierten PAI-1 inkubiert, welcher zur Bindung von Vn unfähig ist, doch zum Wildtyp-PAI-1 hinsichtlich seiner Bindungsfähigkeit an Heparin oder Hemmfähigkeit von uPA identisch ist (Lawrence, D. A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15223–15228). Wie in 16 und 18 gezeigt, förderte die Einbeziehung von Wildtyp-PAI-1 eine höhere Endozytose und Abbau von ¹²⁵I-Thrombin im Vergleich zu mutiertem PAI-1. Im Gegensatz dazu war die Endozytose von ¹²⁵I-uPA im selben Grad durch entweder Wildtyp- oder mutierten PAI-1 erhöht (17 und 19). Die RAP-Behandlung blockierte die durch Wildtyp-PAI-1 geförderte Endozytose sowohl von Thrombin als auch uPA. Die Ergebnisse zeigten, dass die PAI-1-Bindung von Serumabgeleitetem Vn für die Clearance von Thrombin wichtig ist. Die vorliegenden Erfinder glauben, dass die Clearance von freiem Thrombin eine Komplexbildung mit PAI-1 erfordert, ein Prozess, der als durch Vn in starkem Maße beschleunigt bekannt ist. Die geringe Menge der durch mutierten PAI-1 geförderten Thrombin-Clearance war wahrscheinlich auf die Fähigkeit zur Bildung eines Komplexes mit Thrombin, wenn auch unzureichend, in Abwesenheit von Vn zurückzuführen. Da Heparin ebenfalls die Komplexbildung stimuliert, wenn auch weniger wirksam als Vn (Gebbink, R. K. et al. (1993) Biochemistry 32, 1675–1680), können die in der Zellkultur vorhandenen Proteoglycane auf eine Beschleunigung der Komplexbildung anstelle von Vn hinwirken. Da PAI-1 uPA mit hoher Affinität ohne das Erfordernis von Vn bindet, stand nicht zu erwarten, dass die uPA-Clearance (17 und 19) von der Komplexbildungsfähigkeit von PAI-1 mit Vn abhängig war.
Um zu zeigen, dass die PAI-1-Mutation die Fähigkeit seines Komplexes mit Thrombin, an LRPs zu binden, nicht beeinflusste, wurden Komplexe von ¹²⁵I-Thrombin entweder mit Wildtyp-PAI-1 oder mutiertem PAI-1 in vitro gebildet. Wie in 20–21 gezeigt, wurden beide Typen von Komplexen durch die Prä-Typ-II-Pneumozyten ohne weiteres endozytosiert (20) und abgebaut (21). Sowohl Endozytose als auch Abbau wurden durch RAP inhibiert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Komplexe von Thrombin und entweder Wildtyp- oder mutiertem PAI-1 gleichermaßen durch LRP-Rezeptoren erkannt werden. Wurde daher freies ¹²⁵I-Thrombin den Zellen wie in 16–19 präsentiert, so war eine Komplexbildung mit PAI-1:Vn für eine effiziente Komplexbildung zwischen Thrombin und PAI-1 erforderlich, was zu einer schnellen LRP-vermittelten Endozytose und Abbau führte.
PAI-1-geförderte Endozytose und Abbau von Thrombin wird durch natives, nicht jedoch durch konformationell verändertes Vn verstärkt
Es ist bekannt, dass natives Vn die Bildung des Thrombin:PAI-1-Komplexes beschleunigt, konformationell verändertes Vn dagegen nicht (Naski et al., supra). Um zu bestimmen, ob der konformationelle Zustand des Vn die PAI-1-vermittelte zelluläre Clearance von Thrombin beeinflusste, wurde in Studien die Clearance von ¹²⁵I-Thrombin in Gegenwart von PAI-1 und entweder nativem oder konformationell verändertem Vn untersucht. Wie in 22 und 24 gezeigt (unter Verwendung von in Abwesenheit von Serum gezüchteten Zellen, um ein Aussetzen dem Serum-Vn auszuschalten), erhöhte exogenes natives Vn die ¹²⁵I-Thrombin-Clearance. Konformationell verändertes Vn war im Fördern der Clearance von ¹²⁵I-Thrombin nicht wirksamer als PAI-1 alleine. Da von Glykosaminoglykanen gezeigt wurde, dass sie die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 fördern, können Proteoglykane zu der geringen Menge der Thrombin-Clearance beigetragen haben, die mit PAI-1 alleine oder PAI-1 plus konformationell verändertem Vn beobachtet wurde. Im Vergleich war die durch Komplexierung mit PAI-1 vermittelte ¹²⁵I-uPA-Clearance nicht durch natives oder konformationell verändertes Vn beeinflusst (23 und 25).
III. Erörterung
Basierend auf diesen Befunden wurde gefolgert, dass die Clearance von aktivem Thrombin durch Prä-Typ-II-Pneumozyten durch die Komplexbildung mit PAI-1 und die anschließende Wechselwirkung des Komplexes entweder mit LRP-1 oder LRP-2 vermittelt wird. Die Rolle des nativen Vn in diesem Prozess ist entscheidend, vermutlich aufgrund der Tatsache, dass es die Bildung des Thrombin:PAI-1-Komplexes erhöht, welche ansonsten ineffizient ist.
Vn bindet sowohl PAI-1 als auch Thrombin. Diese Bindungswechselwirkungen führen offensichtlich zu einer wirksameren Interaktion zwischen PAI-1 und Thrombin. Es ist nicht bekannt, ob Vn mit PAI-1 und Thrombin im Anschluss an ihre Wechselwirkung assoziiert bleibt. Vn bildet einen ternären Komplex entweder mit an ATIII, HCII, Proteinase-Nexin I oder α₁AT-gebundenem Thrombin (Pittsburgh III, C. R. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 15610–15615; Rovelli, G. et al. (1990) Eur. J. Biochem. 192: 797–803; Tomasini, B. R. et al. (1989) Biochemistry 28, 7617–7623). Allerdings dissoziiert der PAI-1:Vn-Komplex im Anschluss an die Wechselwirkung entweder mit uPA oder tPA. Die obigen Experimente werteten nicht aus, ob Vn zusammen mit dem Thrombin:PAI-1-Komplex endozytosiert wurde. Andere Studien zeigen, dass aktives Thrombin, nicht jedoch inaktiviertes Thrombin, die zelluläre Clearance von ¹²⁵I-nativem Vn förderte. (Panetti, T. S. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 11988–11993). Da inaktives Thrombin keine Serpine bindet, aktives Thrombin dagegen schon, mutmaßten die Autoren, dass eine Wechselwirkung zwischen Thrombin und irgendeinem endogenen Inhibitor die native Vn-Clearance erleichterte. Dies stimmt mit den vorliegenden Befunden überein, nach denen (a) aktives Thrombin wirksamer gecleart wird als inaktiviertes Thrombin, und (b) PAI-1-Antikörper die Clearance von aktivem Thrombin hemmte. Die Ergebnisse weisen auf die Möglichkeit hin, dass ein ternärer Komplex von Thrombin:PAI-1 und Vn gecleart werden kann. Die Tatsache, dass RAP die Thrombin-Clearance im selben Maße blockiert wie überschüssiges unmarkiertes Thrombin zeigt, dass LRP-Rezeptoren primär für die Vermittlung des Clearance-Prozesses verantwortlich sind.
Ein aus dieser Studie sich abzeichnendes Hauptkonzept besteht darin, dass PAI-1 den Thrombin-Katabolismus vermittelt, wirft aber die Frage auf, wann und wo dies in vivo erfolgen könnte. Während PAI-1 uPA und tPA bei Ratenkonstanten einer zweiten Ordnung von 10⁷ M^–1sek^–1 inhibiert, beträgt die Ratenkonstante der zweiten Ordnung für die Inhibition von Thrombin etwa 10.000-mal weniger. Die physiologische Relevanz der PAI-1-Inhibition von Thrombin ist möglicherweise nicht unmittelbar offensichtlich, bis bedacht wird, dass Cofaktoren wie Heparin und Vn die Fähigkeit von PAI-1 enorm erhöht, Thrombin zu hemmen. Zum Beispiel ist in Gegenwart von Vn die Ratenkonstante der zweiten Ordnung für die Inhibition von Thrombin durch PAI-1 um mehr als zwei Größenordnungen erhöht. Diese Wirkung macht PAI-1:Vn zu einem 10–20-mal besseren Inhibitor von Thrombin als ATIII (in Abwesenheit von Heparin). Im Blut dagegen, wo die Konzentration von ATIII 10.000-mal höher ist als die von PAI-1, ist PAI-1 als ein wichtiger Inhibitor von zirkulierendem Thrombin eher unwahrscheinlich. An extravaskulären Stellen wie in den Rücksprüngen eines fibrinhaltigen Thrombus vermuten die vorliegenden Erfinder, dass PAI-1 als ein physiologischer Inhibitor von Thrombin wirken kann. Fibrin wird für einen Sequestrierer von Thrombin gehalten, indem es dieses vor zirkulierenden Inhibitoren bis zur Lyse des Gerinnsels durch Plasmin schützt. Das dadurch freigesetzte Thrombin wäre zur Steuerung von Ereignissen nach Auflösung des Gerinnsels verfügbar, wie etwa der Mitogenese und Chemotaxis von an der Clot-Rekonstruktion und Gewebereparatur beteiligten Zellen. PAI-1, das von (a) Blutplättchen abstammt oder (b) durch Zellen synthetisiert wird, die in ein Gerinnsel eindringen oder an den Begrenzungen des Gerinnsels vorliegen, und entweder von Blutplättchen oder Blut stammendes Vn könnten Thrombin inaktivieren und seine Clearance durch LRP-exprimierende Zellen (z.B. glatte Muskelzellen, Makrophagen, Fibroblasten) fördern. Dies könnte der Mechanismus für die Negativregulation der Wirkungen des Thrombins nach der Gerinnung sein.
BEISPIEL III
Wechselwirkung verschiedener Konformer von PAI-1 mit Vitronektin (Vn)
Die Erfinder untersuchten die Bindung von 6 unterschiedlichen konformationellen Formen des PAI-1 an sowohl natives als auch Harnstoff-behandeltes Vn. Die Ergebnisse zeigen, dass lediglich die aktive Form von PAI-1 an Vn mit hoher Affinität bindet und legen nahe, dass die Vn-Bindungsdomäne von PAI-1 sensitiv gegenüber der Konformation von PAI-1 und daher seinem Aktivitätszustand ist. Die Befunde legen nahe, dass das Bindungsepitop auf PAI-1 eine solche Sensitivität entwickelt haben kann, um die Ansammlung von inaktivem PAI-1 an Stellen von subzellulärer Bindung zu verhindern.
Materialien
Entweder aktives (> 95%) oder latentes (> 95%) gereinigtes PAI-1 wurde erhalten von Molecular Innovations (Royal Oak, MI). Die PAI-1-Mutante Q123K wurde zuvor be schrieben und wurde bis zur Homogenität in entweder der aktiven oder der latenten Konformation gereinigt, wie beschrieben (Kounnas, M. Z. et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 12420–12423). Gereinigtes Vn, sowohl nativ (Naski, M. C. et al. (1993) supra) ("nVn") als auch Harnstoff-gereinigt ("dVn"), wurde erhalten von Dr. D. Mosher bzw. Dr. T. Podor. Rekombinanter hochmolekularer uPA wurde erhalten von Dr. J. Henkin von Abbott Laboratories, und tPA (Activase) stammte von Genentech. Schweinepankreas-Elastase stammte von Elastin Products, und Rinder-β-Trypsin und β-Anhydrotrypsin wurden mittels herkömmlicher Methoden präpariert. Das synthetische Peptid aus acht Resten Ac-Thr-Val-Ala-Ser-Ser-Ser-Thr-Ala entsprechend der PAI-1-reaktiven Schleife von P₁₄ bis P₇, Reste 333–340 der SEQ ID NR: 3, wurde von der University of Michigan Biomedical Research Core Facilities synthetisiert.
Generierung von gespaltenen und komplexierten Formen von PAI-1
An der P4-Position der reaktiven Schleife gespaltener PAI-1 (Lawrence, D. A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 27657–27662) wurde durch Behandlung von 4,6 μM aktivem PAI-1 mit einem 1/10 molaren Äquivalent von Elastase für 30 Min. bei 23°C in Trisgepufferter Salzlösung, pH 7,5 (TBS), gefolgt von der Behandlung der Probe mit 1 mM (Endkonzentration) PMSF zur Inaktivierung der Elastase, erzeugt. PAI-1-Komplexe mit uPA und tPA wurden durch Inkubation von 1,5 molaren Äquivalenten beider Enzyme mit 4,6 μM aktivem PAI-1 für 30 Min. bei 23°C in TBS gebildet, gefolgt von der Inaktivierung des restlichen Enzyms durch 1 mM (Endkonzentration) APMSF. Nach der Inkubation entweder mit PMSF oder APMSF wiesen alle Proben keine nachweisbare enzymatische Aktivität auf und ergab die SDS-PAGE-Analyse lediglich Spurenmengen an nicht-umgesetztem PAI-1 in jeder Probe. Es wird angenommen, dass dieser restliche nicht-umgesetzte PAI-1 die geringe Menge an latentem PAI-1 repräsentiert, der im aktiven PAI-1-Präparat enthalten ist. Komplexe mit Rinder-β-Trypsin wurden durch Umsetzen von 26 μM aktivem PAI-1 mit 13 μM Trypsin in 25 mM Natriumphosphat, 125 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM CaCl₂, pH 6,6, für 30 Min. bei 23°C gebildet, woraufhin der verbliebene aktive PAI-1 durch Chromatographie auf uPA-Agarose entfernt wurde. Die SDS-PAGE-Analyse ergab, dass die Komplexe keinen nachweisbaren ungespaltenen PAI-1 und etwa 20% freien gespaltenen PAI-1 enthielten. Der PAI-1-Peptidkomplex wurde durch Inkubieren von 6,4 μM aktivem PAI-1 mit 200 μM Peptid in 01 M HEPES, 0,1 M NaCl, 1% PEG-8000, 0,1% Tween-80, pH 7,4, bei 25°C erzeugt, bis keine nachweisbare PAI-1-inhibitorische Aktivität verblieb. Das freie Peptid wurde dann durch Chromatographie auf Heparin-Sepharose entfernt. Die Bildung des PAI-1-Peptid-Komplexes wurde durch Wärmedenaturierung, Massenspektralanalyse und durch SDS-PAGE mit und ohne tPA bestätigt. Letztere Analyse ergab, dass das Peptidvereinigte PAI-1 ein Substrat für tPA darstellte und etwa 15% latenten PAI-1 enthielt, was mit vorangegangenen Studien übereinstimmte.
Assay auf die Bindung unterschiedlicher konformationeller PAI-1-Formen an Vn
Die PAI-1-Bindung an immobilisiertes Vn wurde wie zuvor beschrieben bestimmt ((Lawrence, DA, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15223–15228)). Kurz gesagt wurde Vn bei 1 μg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) über Nacht auf Immulon 2 (Dynatech)-Mikrotiterplatten in einem Volumen von 100 μl bei 4°C geschichtet, und alle anschließenden Schritte wurden bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Platten wurden mit PBS, gefolgt von dH₂O, gewaschen, durften für 15 Min. lufttrocknen und wurden dann mit 200 μl an 3% Rinderserumalbumin in PBS für 30 Minuten blockiert. Als nächstes wurden die PAI-1-enthaltenden Proben in einem Endvolumen von 100 μl hinzugefügt und die Inkubation für eine Stunde fortgesetzt. Gebundener PAI-1 wurde dann mit affinitätsgereinigtem, biotinyliertem Kaninchen-Anti-PAI-1-Antikörper nachgewiesen (Sherman, P. M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 7588–7595) und an alkalische Phosphatase unter Verwendung des Substrats p-Nitrophenylphosphat, Dinatrium (Sigma) bei einer Konzentration von 4 mg/ml in 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂ Streptavidin-konjugiert. Für die Analyse der PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexbindung an Vn wurde 1 μM (Endkonzentration) an Anhydrotrypsin in alle Wells während des PAI-1-Inkubationsschritts eingebracht. Die Konzentration an Anhydrotrypsin war 20-mal höher als die höchste Konzentration des getesteten PAI-1, und 10-mal höher als der berichtete K_d für die Wechselwirkung von PAI-1 und Anhydrotrypsin.
ERGEBNISSE
26 zeigt, dass das reine aktive PAI-1 an beide Formen von Vn mit hoher Affinität bindet. Allerdings ist der K_d für dVn nahezu 10-mal geringer als der für nVn (150 pM im Vergleich zu 1,4 nM). Im Gegensatz dazu bindet reines latentes PAI-1 an beide Formen von Vn bei viel geringerer Affinität (K_d > 225 nM). Diese Ergebnisse bestätigen die Behauptung, dass lediglich aktiver PAI-1 an Vn mit hoher Affinität bindet und widerspre chen dem Vorschlag, dass beide Formen von PAI-1 an Vn mit gleicher Affinität binden. Die relativen berechneten K_d's bilden die Daten in 14 und stimmen ebenfalls mit den zuvor berichteten Werten überein. Folglich liegt der berichtete K_d von 50–190 nM viel näher bei der aktuellen Schätzung. (Die K_d-Werte müssen Schätzwerte sein, da die Bindung bei den getesteten Konzentrationen nicht gesättigt war.) Für die latente PAI-1-Bindung an entweder nativen Vn oder dVn betrug der K_d > 225 nM (26).
Die Beobachtung, dass latenter PAI-1 an Vn mit viel geringerer Affinität als aktiver PAI-1 bindet, legt nahe, dass die mit der Umwandlung zur latenten Form verbundene Konformationsänderung für die verminderte Affinität verantwortlich sein kann. Die vorliegenden Erfinder und ihre Kollegen (Lawrence et al. 1994, supra) hatten vorgeschlagen, dass die Stabilisierung von PAI-1 durch Vn erfolgt, wenn die Vn-Bindung an Strang 1 des β-Faltblatts A die Mobilität des β-Faltblatts A einschränkt, die zur Insertion des PAI-1-RCL während der Transformation zur latenten Konformation erforderlich ist. Dieses Modell stimmt mit der Beobachtung überein, dass die Rekonstitution des Serpin-β-Faltblatts A aus einem fünfsträngigen, primär parallelen β-Faltblatt zu einem sechssträngigen, antiparallelen β-Faltblatt durch Insertion des RCL in das β-Faltblatt A als Strang 4 eine umfangreiche Neuanordnung der β-Stränge 1, 2 und 3 des Faltblatts A erfordert (Stein, P. et al. (1991) Mol. Biol. 221: 615–621). Die Beschränkung dieser Neuanordnung durch Vn könnte die Schleifen-Insertion verzögern und so die Umwandlung des PAI-1 zur latenten Form. Die Erfinder sagten voraus, dass die Neuanordnung des Faltblatts A außerdem das Vn-Bindungsepitop auf PAI-1 modifizieren würde. Dieser Vorschlag wurde durch die in 14 gezeigten Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass latenter PAI-1, der ein reorganisiertes β-Faltblatt A aufweist, beide Formen von Vn mit einer deutlich reduzierten Affinität im Vergleich zu aktivem PAI-1 bindet.
Die vorliegenden Erfinder und Kollegen untersuchten die Bindung von vier zusätzlichen Formen von PAI-1 sowohl an natives als auch an dVn, und entsprechend von latentem PAI-1, wobei von jedem dieser Konformer angenommen wird, dass sein β-Faltblatt A in sechssträngiger Form vorliegt. Zu diesen zählen:

(1) PAI-1 in einem stabilen Komplex entweder mit uPA oder tPA, welcher zuvor als an der P1-Position des RCL gespalten und das RCL in das β-Faltblatt A inseriert gezeigt wurde;
(2) gespaltener PAI-1, der unkomplexiert ist, doch ein rekonstitutiertes β-Faltblatt A aufweist; und
(3) mit einem synthetischen RCL-Peptid vereinigter PAI-1, welcher ein intaktes RCL aufweist, das nicht in das β-Faltblatt A inseriert ist, doch aufgrund der Insertion des synthetischen Peptids zur Bildung des Strangs 4 des Faltblatts A ein rekonstituiertes Faltblatt A aufweist (Kvassman, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 27942–27947).

Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt und weisen nach, dass ebenso wie latenter PAI-1 keiner der anderen PAI-1-Konformer an nVn mit hoher Affinität band (geschätzte relative K_ds > 100 nM). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dVn erzielt.
Die sowohl für tPA-PAI-1- als auch uPA-PAI-1-Komplexe mit beiden Formen von Vn beobachtete relativ geringe Affinität stimmt mit vorherigen Berichten überein, dass tPA PAI-1 von löslichem Vn dissoziieren kann (Declerck et al., 1988, supra) und dass PAI-1 von ECM durch Behandlung mit uPA entfernt werden kann (Mimuro et al., 1987, supra). Interessanterweise zeigt PAI-1 im Komplex mit dem synthetischen RCL-Peptid dieselbe reduzierte Affinität für Vn wie die anderen Konformer. Dies zeigt an, dass die Spaltung des RCL nicht für den Verlust der Bindungsaffinität erforderlich ist, die Reorganisation des β-Faltblatts A jedoch notwendig ist, da im PAI-1-Peptid-Komplex das natürliche RCL intakt bleibt (Kvassman, 1995, supra). Zusammengefasst legen die Ergebnisse nahe, dass das Vn-Bindungsepitop von PAI-1, welches Strang 1 des β-Faltblatts A umfasst, gegenüber Konformationsänderungen im β-Faltblatt A sensitiv ist.
Um zu bestätigen, dass es sich um die Neuanordnung des Faltblatts A handelt, die für den Verlust der Affinität verantwortlich ist, und nicht schlicht die Verbindung von PAI-1 mit einem Enzym, wurde die relative Bindungsaffinität von PAI-1 im Komplex entweder mit Trypsin oder Anhydrotrypsin getestet. PAI-1 ist ein effizienter Inhibitor von Trypsin und bildet SDS-stabile, RCL-inserierte Komplexe genau wie mit uPA oder tPA. Im Gegensatz dazu bindet Anhydrotrypsin an die PAI-1-RCL in einer nicht-kovalenten Bin dung, die nicht zur Spaltung des RCL oder seine Insertion in das β-Faltblatt A führt. Diese Ergebnisse sind in 28 gezeigt und ergeben, dass ebenso wie uPA und tPA die PAI-1-Trypsin-Komplexe eine sehr geringe Affinität für Vn aufweisen. Allerdings bindet PAI-1 in Verbindung mit Anhydrotrypsin an Vn mit im wesentlichen derselben Affinität wie aktives PAI-1 alleine. Dies zeigt, dass es nicht die Bindung eines Enzyms an die RCL ist, das zum Verlust der Vn-Affinität führt, sondern die Spaltung des RCL und anschließende Insertion der Schleife in das β-Faltblatt A. Die Ergebnisse lassen stark vermuten, dass die Reorganisation des β-Faltblatts A zur Verminderung der PAI-1-Affinität für Vn führt.
Derzeit gibt es lediglich eine Region auf PAI-1, von der eine Wechselwirkung mit Vn gezeigt wurde (Lawrence et al. 1994, supra; Van Meijer et al. (1994) FEBS Lett. 352: 342–346; Padmanabhan, J. et al. (1995) Thromb. Haemost 73: 829–834), wobei unsere Daten nahelegen, dass diese Stelle ihre Affinität für Vn auf die Neuanordnung des β-Faltblatts A hin verliert. PAI-1 kann jedoch zwei unabhängige Bindungsstellen für Vn aufweisen, eine mit hoher Affinität, die lediglich auf aktivem PAI-1 exprimiert wird, und eine mit geringer Affinität, die auf allen Konformationen vorhanden ist. Zwar ist eine völlige Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten unmöglich, doch wenn letzteres wahr wäre, so würden Mutationen, die eine Stelle beeinflussen, nicht notwendigerweise die andere Stelle beeinflussen. Wenn umgekehrt die verschiedenen Formen von PAI-1 mit Vn durch dieselbe, obschon konformationell veränderte Stelle interagieren, dann könnte eine einzelne Punktmutation in PAI-1 die Bindung bei sowohl hoch- als auch geringaffinen Interaktionen beeinflussen. Demgemäß wurde die PAI-1-Punktmutation Q123K, die eine stark reduzierte Affinität für Vn aufweist, ausgereinigt und die aktiven und latenten Formen aufgetrennt und auf die Vn-Bindung untersucht (29). Ein Vergleich der Bindung von aktivem und latentem Q123K-PAI-1 an nVn mit der Bindung von aktivem und latentem wtPAI-1 ergab, dass sowohl die aktiven als auch die latenten Formen der Mutante an nVn mit geringerer Affinität relativ zu ihrem wtPAI-1-Gegenstück binden. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn dVn verwendet wurde. Dies legt nahe, dass sowohl die hoch- als auch geringaffinen Wechselwirkungen dasselbe oder zumindest überlappende Bindungsepitop(e) auf PAI-1 verwenden, da sie in einem ähnlichen Umfang durch die Q123K-Mutation beeinflusst werden. Diese Mutation weist keine Auswirkung auf die inhibitorische Aktivität von PAI-1 oder auf ihre Affinität für Heparin-Sepharose auf, was aufzeigt, dass die Auswirkungen der Mutation lokal sind und keine wesentlichen globalen Veränderungen in die PAI-1-Struktur einführen. Im Vergleich der Oberflächenzugänglichkeit von Q123K an einem Modell von aktivem PAI-1 zu ihrer Zugänglichkeit in der latenten Struktur zeigt sich, dass in latentem PAI-1-Q123 durch umgebende Reste teilweise verdeckt wird im Vergleich zu seiner Exponiertheit in der aktiven Form. Dies stimmt mit dem Verlust an Affinität für Vn überein, der mit latentem PAI-1 beobachtet wird, und unterstützt die Vorstellung, dass PAI-1 lediglich ein Bindungsepitop für Vn enthält, welches konformationell sensitiv ist.
Jüngere Untersuchungen des Serpin-Mechanismus der Hemmung zeigen, dass sie einem vielstufigen Prozess folgt, der eine exponierte RCL erfordert (Shore et al. 1994, supra; Lawrence et al., 1995, supra; Fa, M. et al. (1995) Biochem. 34: 13833–13840; Wilczynska, M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 29652–29655). Auf die Bindung mit einer Ziel-Proteinase hin wird die Serpin-RCL an ihrer P1–P1'-Bindung gespalten, gefolgt von einer schnellen Insertion der RCL in das β-Faltblatt A, das den stabilen Serpin-Proteinase-Komplex ergibt. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass das PAI-1-Vn-Bindungsepitop an der Kante des β-Faltblatts A gegenüber dieser Konformationsänderung im β-Faltblatt A sensitiv ist, ebenso wie gegenüber ähnlichen Änderungen in Verbindung mit der Umwandlung von PAI-1 zur latenten Form oder Spaltung in der RCL durch eine Nicht-Zielproteinase. Diese Sensitivität kann einen Weg zur Gewährleistung der Expression der PAI-1-Aktivität an spezifischen Wirkstellen bereitstellen. Zum Beispiel wird angenommen, dass Vn zur Lokalisierung von PAI-1 an der ECM dient, wo es die lokale proteolytische Aktivität reguliert (Mimuro et al., 1987, supra). In dieser Situation mag es von Vorteil sein, lediglich funktionell aktivem PAI-1 die Bindung an Vn zu gestatten. Auf einer Zelloberfläche kann ein inaktiver Ligand internalisiert und abgebaut werden. Diese Art von Regulierung ist aber möglicherweise weniger wirksam als die weniger dynamische ECM. Um daher zu verhindern, dass Vn mit inaktiven Formen des Inhibitors gesättigt wird, kann sich ein System entwickelt haben, das sensitiv gegenüber der Konformation von PAI-1 ist, die eng an seinen Aktivitätszustand geknüpft ist.
BEISPIEL IV
PAI-1 verhindert die Integrin-Vitronektin-Rezeptor-(α_vβ₃-vermittelte Zellmigration durch Blockierung der RGD-Zellbindungsstelle auf Vitronektin
Die PAI-1-Bindungsstelle auf Vn wurde vor kurzem an den ersten 50 Aminosäure-Resten lokalisiert. Diese Region enthält auch die RGD-(Arg-Gly-Asp)-Zellbindungsstelle. Um zu bestimmen, ob diese Bindungsstellen überlappen, wurden Kompetitionsstudien zwischen gereinigtem VnR und PAI-1 vorgenommen. Die Kompetition von aktivem wtPAI-1 wurde mit zwei verschiedenen PAI-1-Mutanten verglichen. Eine davon, Q123K-PAI-1, weist eine einzelne Aminosäure-Substitution auf, die die inhibitorische Aktivität nicht beeinflusst, doch seine Affinität für Vn um etwa 2 Größenordnungen reduziert. Die zweite, P1-Ala-PAI-1, weist ebenfalls eine einzelne Substitution auf (R346A), die ihre Fähigkeit zur Hemmung von PAs zerstört, doch keinen Einfluss auf die Vn-Bindung zeigt.
Materialien und Methoden
Aktive Formen von wtPAI-1 und den PAI-Mutanten wurden wie beschrieben hergestellt (Kvassman, J. et al., Fibrinolysis 9: 120–125 (1995)). Natives Vn (Molecular Innovations) wurde auf Mikrotiter-Wells aufgetragen (1 μg/ml) für 2 Stunden bei 37°C, gefolgt von einer Blockierung mit 2% BSA in 50 mM Tris, pH 7,5, enthaltend 100 mM NaCl und 5 mM CaCl₂ (Bindungspuffer). Vitronektin-Rezeptor (VnR) (α_vβ₃-Integrin) wurde aus menschlicher Placenta wie beschrieben ausgereinigt (Smith, J. W. et al., J. Biol. Chem. 265: 11008–11013 (1990). Radiomarkierter VnR (2,5 nM) durfte an Mikrotiter-Wells in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von entweder Wildtyp-PAI-1, Q123K-PAI-1 oder P1-Ala-PAI-1 binden. Die Proben wurden wie beschrieben prozessiert (Stefansson, et al., 1995, supra). Die Ergebnisse (in 30 gezeigt) wurden unter Verwendung des Programms "Grafit" aufgetragen und stellen drei im Duplikat durchgeführte Experimente dar.
Im in 31 und 32 gezeigten Experiment durfte ¹²⁵I-VnR (5 nM) an natives Vn ( 31) oder Fibronektin (32), aufgeschichtet auf Mikrotiterplatten in Gegenwart von wtPAI-1 (500 nM) und P1-Ala-PAI-1 (500 nM) binden, wobei ungebundener PAI-1 entfernt und uPA (400 nM) hinzugefügt wurde, wo angegeben. Ein für Integrin-α_vβ₃ spezifischer mAb, LM609 (50 μg/ml) wurde als einer positiven Kontrolle für die Hem mung der Bindung entsprechend inkubiert. Die Proben wurden inkubiert und wie oben beschrieben entwickelt (für 30). Die Ergebnisse stellen 2 Experimente dar, wobei jedes im Duplikat vorgenommen wird.
In der in 33–34 dargestellten Studie wurde Kaninchen-SMC unter Verwendung einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung (Sigma) abgelöst. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium resuspendiert, das entweder wtPAI-1, Q123K-PAI-1 oder P1-Ala-PAI-1 enthielt (75 nM Endkonzentration) und durften für 30 Min. bei 37°C binden. Die Platten wurden gewaschen und unter Verwendung von 2% Kristallviolett gefärbt. Die Zellen wurden auf zwei zufälligen Feldern in den Duplikat-Wells gezählt. Die Ergebnisse repräsentieren 4 im Duplikat vorgenommene Experimente.
In der nächsten Studie wurden Transwells mit Vn beschichtet und wie oben für 30 beschrieben blockiert. Kaninchen-SMC wurden unter Anwendung einer milden Trypsinbehandlung abgelöst, in 0,5 mg/ml Trypsininhibitor gewaschen und durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen durften binden und sich auf der oberen Kammer in serumfreien Medium (0,5–1 Stunde) ausbreiten, bevor PAI-1 (500 nM) zugegeben wurde. Nach 30-minütiger Inkubation wurde Serum zugegeben, und die Wells wurden für 3–4 Stunden inkubiert. Migrierte Zellen wurden gefärbt und gezählt.
Ergebnisse
Sowohl aktiver wtPAI-1 als auch P1-Ala-PAI-1 wurden als wirksame Kompetitoren um die Bindung von gereinigtem ¹²⁵I-VnR an natives Vn befunden (K_i betrug etwa 4 nM, 30). Im Gegensatz dazu war Q123K-PAI-1 ein schwacher Kompetitor um die VnR-Bindung, was eine geschätzte K_i von größer 100 nM ergab. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die hohe Affinität von PAI-1 für Vn, und nicht die Fähigkeit von PAI-1, die PAs zu hemmen, für die Inhibition der VnR-Bindung an Vn verantwortlich ist.
Weder der wtPAI-1 noch die beiden unterschiedlichen PAI-1-Mutanten beeinflussten die Bindung von ¹²⁵I-VnR an Fibronektin, was die Spezifität der Wechselwirkung für Vn aufzeigt.
PAI-1 vollzieht grundlegende Konformationsänderungen auf die Hemmung einer Proteinase hin (Shore of al. 1995, supra), was zum Verlust seiner hohen Affinität für Vn führt. Daher stünde von PAs zu erwarten, dass sie die Fähigkeit von PAI-1 regulieren, die RGD-Stelle auf Vn zu blockieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Kompetitionsassays mit und ohne uPA vorgenommen. uPA in 2-facher molarer Menge blockierten die Hemmung der ¹²⁵I-VnR-Bindung an Vn durch wtPAI-1 vollständig ( 31–32). Diese Befunde stimmen mit der Beobachtung überein, dass der PAI-1:uPA-Komplex eine beträchtlich geringere Affinität für Vn aufweist als der VnR, was dem VnR die Verdrängung des PAI-1:uPA-Komplexes ermöglicht. Wie erwartet, verminderte P1-Ala-PAI-1 die Hemmung der VnR-Bindung in Gegenwart von uPA nicht, was mit dem Fehlen von Reaktivität mit uPA der Mutante übereinstimmt.
Ein für Integrin-α_vβ₃ spezifischer mAb, LM609, hemmte die Bindung von ¹²⁵I-VnR an Vn im selben Maße wie PAI-1, was aufzeigte, dass (a) das VnR-Präparat primär α_vβ₃ enthielt, und (b) PAI-1 die Bindung von α_vβ₃ an Vn spezifisch blockierte (31–32).
Um zu testen, ob PAI-1 in ähnlicher Weise die Wechselwirkungen von Zellen mit Vn hemmen konnte, wurden Adhäsions- und Migrations-Assays mit glatten Gefäßmuskelzellen (SMC) vorgenommen. Sowohl aktiverwtPAI-1 als auch P1-Ala-PAI-1 hemmte die Adhäsion von SMC an Vn (33–34). Im Gegensatz dazu hemmte Q123K-PAI-1 die Adhäsion nicht, was darauf hinweist, dass die Bindung von PAI-1 an Vn, und nicht die Fähigkeit von PAI-1 zur Hemmung von PAs, für das Blockieren der Zellbindung verantwortlich war. Weiterhin verhinderte die Zugabe von uPA zu an Vn gebundenen wtPAI-1 die Inhibition der Zellbindung, wohingegen uPA keine Auswirkung auf die Inhibition der SMC-Bindung durch P1-Ala-PAI-1 zeigte.
Interessanterweise hemmte zwar PAI-1 die Adhäsion von SMC, der mAb zu α_vβ₃ jedoch nicht, was zeigt, dass SMCs weitere Integrine aufweisen müssen, die eine Rolle bei der Bindung an Vn spielen, und dass PAI-1 den Zugang zu all diesen Adhäsionsmolekülen blockiert. In Übereinstimmung mit den unter Verwendung von gereinigtem VnR erzielten Ergebnissen zeigte PAI-1 keine Wirkung auf die SMC-Adhäsion an Fibronektin.
Aktiver wtPAI-1 und R346A-PAI-1 hemmten ebenso die SMC-Migration, wie in mit Vn beschichteten Transwells gemessen. Diese Inhibition war ähnlich der durch LM609 bewirkten Inhibition. Die Q123K-PAI-1-Mutante hemmte die Migration nicht. Wie bei der Zellbindung kehrte die Einbeziehung von uPA die Inhibition durch wtPAI-1, nicht jedoch durch P1-Ala-PAI-1, um.
Verwundungszustände wurden in vitro unter Verwendung eines mit Rasiermesser geschnittenen Monoschichtmodells simuliert. Die Migrations- und Adhäsionseigenschaften der Typ-II-Pneumozyten an einer Vn-beschichteten Oberfläche wurden mikroskopisch beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die PAI-1-Mutante mit geringer Affinität für Vn keine Wirkung auf die Zellmigration zeigte. Wildtyp-PAI-1 hemmte die Migration. Die Gegenwart der P1-Ala-PAI-1-Mutante verhinderte nicht nur die Migration, sondern führte tatsächlich zu Löchern in der Monoschicht selbst, was eine Ablösung der Zellen von der Platte anzeigte. Der Anti-Vn-Antikörper zeigte ähnliche Wirkungen. Im Gegensatz dazu wies Wildtyp-PAI-1, der normalerweise an die Vn-Bindungsstelle bindet, eine intermediäre Wirkung bei Verdünnung der Monoschicht aufgrund der Inhibition der Migration auf, doch ohne den reinen Effekt der Löcher, die durch die P1-Ala-Mutante bewirkt wurden.
Diskussion
Vn weist bekannte grundlegende Wirkungen auf die Eigenschaften von PAI-1 auf. Über die Stabilisierung von PAI-1 in der aktiven Konformation hinaus (Declerck, P. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 55: 457–473 (1993)). Vn verändert auch die Spezifität von PAI-1, was es zu einem effizienten Inhibitor von Thrombin macht (Naski et al., supra) und die Clearance von Thrombin durch zelluläre Rezeptoren vermittelt (siehe oben). Basierend hierauf kommen die vorliegenden Erfinder zu dem Schluss, dass Thrombin, ein bekanntes Mitogen und Chemoattraktanz (Bar-Shavit, R. et al., Cell Regul. 1: 453–463 (1990)) die Zellmigration durch Entfernen von PAI-1 von Vn fördert. Andere haben gezeigt, dass sowohl Elastase als auch Cathepsin G, das durch aktivierte Neutrophile erzeugt wird, wirksam PAI-1 von der Matrix entfernen kann (Wu, K. et al. Blood 86: 1056–1061 (1995)). Da PAI-1 ein Substrat für diese letzteren Proteinasen ist, wären lediglich katalytische Mengen erforderlich, um PAI-1 zu inaktivieren. Dies könnte zum Teil für die bemerkenswerte Migrationsfähigkeit dieser Zellen verantwortlich sein.
Zusammengefasst zeigen die oben Befunde auf, dass eine breite Vielfalt von Proteinasen, selbst solche, die nicht Ziele für PAI-1 sind, zum Wechselwirken mit PAI-1 und Exponieren der RGD-Integrin-Bindungsstelle auf Vn fähig sind. Diese allgemeine Modifikationsfähigkeit vieler abweichender Proteinasen der zellulären Adhäsionseigenschaften durch einen gemeinsamen Mechanismus legt nahe, dass die bekannte Beziehung zwischen erhöhter Zellmigration und Proteinase-aktivität bei einer breiten Vielfalt von invasiven zellulären Prozessen zumindest teilweise durch proteolytische Wechselwirkung mit PAI-1 vermittelt ist. Die vorliegenden Erfinder kommen außerdem zu dem Schluss, dass die Rolle von Proteinasen in der zellulären Migration möglicherweise nicht nur einfach die eines generalisierten Matrixabbaus ist, sondern vielmehr die Erzeugung von Zellbindungsstellen durch eine spezifische Wechselwirkung mit PAI-1.
BEISPIEL V
Charakterisierung der Bindung verschiedener konformationeller Formen von PAI-1 an Vitronektin
Die Erfinder untersuchten die Bindung verschiedener konformationeller Formen von PAI-1 sowohl an natives Vn (nVn) als auch Harnstoff-gereinigtes Vn (uVn) unter Verwendung eines Festphasen-Bindungsassays und stellten fest, dass aktiver PAI-1 an uVn mit etwa 6-fach höherer Affinität als an nVn bindet. Im Gegensatz dazu zeigten inaktive Formen des PAI-1 (latent, Elastase-gespalten, synthetisches Reaktivschleifen-Peptid, vereinigt oder komplexiert mit PAs) stark reduzierte Affinitäten für beide Formen von adsorbiertem Vn zeigte, wobei die relativen Affinitäten um mehr als 2 Größenordnungen reduziert waren. Strukturell weichen diese inaktiven Konformationen alle von aktivem PAI-1 durch Insertion eines zusätzlichen Strangs in das β-Faltblatt A ab, was nahelegt, dass die Neuanordnung von Faltblatt A für die reduzierte Vn-Affinität verantwortlich ist. Dies wird weiter durch die Beobachtung gestützt, dass mit b-Anhydrotrypsin assoziierter PAI-1 (welcher keine Neuanordnung des β-Faltblatts A vollzieht) keine Abnahme der Affinität zeigte, wohingegen an b-Trypsin komplexierter PAI-1 (welcher eine Faltblatt A-Neuanordnung vollzieht) eine reduzierte Affinität für Vn ähnlich den PAI-1:PA-Komplexen zeigt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Wechselwirkung zwischen PAI-1 und Vn vom konformationellen Zustand beider Proteine ab hängt, und legen nahe, dass die Vn-Bindungsstelle an PAI-1 für Strukturänderungen in Verbindung mit dem Verlust der inhibitorischen Aktivität sensitiv ist.
Wie oben beschrieben, wurde von PAI-1, der an Vn in der extrazellulären Matrix gebunden war, die Blockierung der Bindung an Integrine gezeigt (Stefansson, S. et al. (1996) Nature 383: 441–443) und uPAR (Deng, G. et al. (1996) J. Cell. Biol. 134: 1563–1573) an Vn, wobei diese Wechselwirkung die Zelladhäsion und Migration an Vn hemmte. Die präzise Natur der PAI-1/Vn-Wechselwirkung war Gegenstand einer beträchtlichen Debatte. Unter Verwendung von Festphasen-Bindungsassays zur Quantifizierung dieser Wechselwirkung schlugen mehrere der oben erwähnten Studien vor, dass lediglich aktiver PAI-1 an Vn bindet; andere berichteten jedoch keinen offensichtlichen Unterschied in der Bindung von aktivem und latentem PAI-1 (Salonen et al., supra; Kost et al., supra). Außerdem liegt die berichtete Dissoziationskonstante für die PAI-1-Bindung an immobilisierten Vn im Bereich von 0,3 nM bis 190 nM. Die Vn-Bindungsdomäne innerhalb von PAI-1 ist an einer Region auf der Oberfläche von PAI-1 lokalisiert, die b-Strang 1A enthält. Die Vn-Bindungsstelle für PAI-1 scheint an der Somatomedin-B-Domäne am N-Terminus von Vn lokalisiert zu sein, obschon andere Berichte vorschlugen, dass PAI-1 an den C-Terminus von Vn zwischen den Resten 348 und 370 (Kost et al., supra) oder an eine Stelle nahe dem Zentrum von Vn zwischen Aminosäuren 115 und 121 bindet (Mimuro et al., Biochemistry 32: 2314–2320 (1993)).
Die vorliegenden Erfinder postulierten, dass eine entscheidende Abhängigkeit der PAI-1/Vn-Wechselwirkung auf die PAI-1- und/oder Vn-Konformation diese widersprüchlichen Berichte erklären könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden die folgenden Studien vorgenommen, worin die Bindung von PAI-1 in sechs verschiedenen Konformationen an immobilisierten nVn und uVn untersucht wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die beiden Formen von Vn an PAI-1 bei deutlich verschiedenen Affinitäten binden und dass die Vn-Bindungsdomäne auf PAI-1 sehr sensitiv gegenüber der PAI-1-Konformation ist. Möglicherweise vollzog sich eine evolutionäre Selektion der PAI-1-Struktur, um eine wirksame Entfernung von inaktivem PAI-1 an Stellen von subzellulärer Bindung zu ermöglichen.
Experimentelle Verfahrensweisen
Materialien. Gereinigte PAI-1, entweder aktiv (> 95%) oder latent (> 95%), wurden erhalten von Molecular Innovations (Royal Oak, MI). Um jeglichen in den latenten Präparaten vorhandenen aktiven PAI-1 auszuschalten, wurde latenter PAI-1 mit einem 1/100 molares Äquivalent von Elastase für 30 Min. bei 23°C in Tris-gepufferter Salzlösung, pH 7,5, (TBS), gefolgt durch Inaktivierung der Elastase mit 1 mM (Endkonzentration) PMSF, behandelt. Gereinigtes nVn wurde bezogen von Dr. D. Mosher, und uVn wurde entweder erhalten von Dr. T. Podor oder bezogen von Calbiochem. Rekombinanter hochmolekularer uPA wurde erhalten von Dr. J. Henkin von Abbott Laboratories, und tPA (Activase) stammte von Genentech. Schweinepankreas-Elastase stammte von Elastin Products, und Rinder-b-Trypsin und b-Anhydrotrypsin waren wie zuvor beschrieben. Die acht synthetischen Peptid-Reste Ac-Thr-Val-Ala-Ser-Ser-Ser-Thr-Ala entsprechend der PAI-1-reaktiven Schleife von P₁₄ bis P₇, Reste 333 bis 340, wurden von der University of Michigan Biomedical Research Core Facilities synthetisiert.
Die Erzeugung der gespaltenen und komplexierten Formen von PAI-1 wurde erreicht, wie in Beispiel III, supra, beschrieben.
Die PAI-1-Bindung an Vn wurde entweder funktionell bestimmt, wie beschrieben in Beispiel III, oder in einem Vn-spezfischen ELISA, wie zuvor beschrieben (Lawrence et al., 1994, supra). Kurz gesagt wurde Vn bei 1 μg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) über Nacht auf Immulon 2 (Dynatech)-Mikrotiterplatten in einem Volumen von 100 μl bei 4°C geschichtet, und alle anschließenden Schritte wurden bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Platten wurden mit PBS, gefolgt von dH₂O, gewaschen, durften 15 Min. lang lufttrocknen und wurden dann mit 200 μl an 3% Rinderserumalbumin in PBS für 30 Minuten blockiert. Als nächstes wurden PAI-1-Proben in TBS, enthaltend 100 μl/ml BSA und 0,01% Tween 80, in einem Endvolumen von 100 μl zugesetzt und die Inkubation für eine Stunde fortgesetzt, woraufhin der ungebundene PAI-1 weggewaschen wurde. Während dieser Inkubationsperiode sollten < 15% des aktiven PAI-1 sich zur latenten Form umgewandelt haben, da wir die t_1/2 für diese Umwandlung mit ~8 Stunden bei 25°C in Abwesenheit von Vn bestimmt haben (Daten nicht gezeigt). Im funktionellen Assay wurde die PAI-1-Bindung durch Umsetzen des gebundenen PAI-1 mit 0,7 nM uPA für 30 Minuten bestimmt, gefolgt von der Zugabe des chromogenen Substrats S-2444 (Kabi), wie beschrieben von Lawrence et al. (J. Biol. Chem. 265: 20293–20301 (1990)). Der gebundene PAI-1 wurde dann aus dem Verlust der uPA-amidolytischen Aktivität erreicht. Der K_ds für die Festphasen-Bindung von PAI-1 an immobilisiertes Vn wurde unter Anwendung der folgenden Form der standardmäßigen Bindungsgleichung aus dem GraFit-Programm (Erithacus Software) berechnet: y = [L]Kap/(Kd + ...[L]) Gleichung 1worin y die Menge an gebundenem PAI-1 ist, L freier PAI-1 ist und "Kap" die Vn-Kapazität für die PAI-1-Bindung ist.
Der Vn-abhängige ELISA-Assay wurde wie oben vorgenommen, außer, dass gebundener PAI-1 mit affinitätsgereinigtem, biotinyliertem Kaninchen-Anti-PAI-1-Antikörper und an alkalische Phosphatase konjugiertem Streptavidin unter Verwendung des Substrats p-Nitrophenylphosphat, Dinatrium (Sigma) bei einer Konzentration von 4 mg/ml in 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂, nachgewiesen wurde. Um die nicht-spezfüsche Bindung zu kontrollieren, wurden alle Assays gleichzeitig auf Platten analysiert, die mit BSA alleine beschichtet waren, und parallel prozessiert. Die Hintergrundbindung an BSA wurde von allen Proben vor der Datenanalyse substrahiert. Zur Untersuchung der PAI-1-Anhydrotrypsin-Komplexbindung an Vn wurde 1 μM (Endkonzentration) an Anhydrotrypsin in alle Wells während des PAI-1-Inkubationsschritts aufgenommen. Diese Konzentration an Anhydrotrypsin war 20-mal höher als die höchste Konzentration des getesteten PAI1, und zehnmal höher als der berichtete K_d für die Wechselwirkung von PAI-1 und Anydrotrypsin (17). Für die Datenanalyse der ELISA-Experimente wurde der K_d für aktives PAI-1 mit obiger Gleichung 1 bewertet, indem angenommen wurde, dass gebundener PAI-1 als ein Prozentsatz der maximalen Bindung proportional zum tatsächlich gebundenen PAI-1 war und dass freier PAI-1 etwa gleich dem zugesetzten PAI-1 war. Für die untersuchten inaktiven PAI-1-Proben konnte kein Wert für K_d festgestellt werden, da keine dieser Proben eine Sättigung bei den getesteten Konzentrationen erreichte.
Kompetitive Inhibition der PAI-1-Bindung an immobilisierten Vn durch Lösungsphasen-Vn
Mikrotiterplatten wurden mit nVn beschichtet und mit BSA wie oben blockiert. Als nächstes wurde entweder natives oder Harnstoff-gereinigtes Vn der Platte zugegeben und dreifach in TBS reihenverdünnt, das 100 μg/ml BSA und 0,01% Tween 80 enthielt, woraufhin aktiver PAI-1 zu einer Endkonzentration von 2 nM (Endvolumen 100 μl) zugegeben wurde. Die Proben durften 1 Stunde lang bei 23°C reagieren, wurden dann gewaschen, und gebundener PAI-1 wurde wie im obigen ELISA-Assay bestimmt. Die IC₅₀-Werte für die Inhibition durch Lösungsphasen-Vn wurden unter Anwendung eines vier-Parameter-logistischen Fits aus dem GraFit-Programm (Erithacus Software) berechnet. Der K_d für die Lösungsphasen-Wechselwirkungen von PAI-1 mit Vn wurde durch Analyse der Kompetitionsdaten mittels zuvor beschriebener Methoden bestimmt (Olsen, S. T. et al. (1991) Arch. Biochem. Biophys. 286, 533–545). Gemäß dieser Analyse ist die Konzentration von an den Kompetitor Vn in Lösung gebundenem PAI-1 gleich der Differenz zwischen, der in Gegenwart des Kompetitors verwendeten PAI-1-Gesamtkonzentration und der PAI-1-Gesamtkonzentration, die einen äquivalenten Sättigungsgrad des immobilisierten Vn in Abwesenheit des Kompetitors ergab. Letzterer wurde auf der Grundlage des Fits der Bindungsdaten in Abwesenheit des Kompetitors Vn (37) mittels Gleichung 1 errechnet. Die Kenntnis der Konzentration des an Kompetitor Vn in Lösung gebundenen PAI-1 erlaubte die Berechnung der Konzentrationen an freiem PAI-1 und freiem Kompetitor Vn für die Lösungsinteraktion, aus der der K_d errechnet wurde. Eine sinnvolle Übereinstimmung wurde erhalten für K_d-Werte, die bei Kompetitor-Vn-Konzentrationen bestimmt wurden, die signifikante Verdrängungsmengen des PAI-1 vom immobilisierten Vn ergaben (> 15%).
Ergebnisse und Diskussion
Der Ausgangspunkt für die Debatte in der Literatur betreffend die Wechselwirkung zwischen Vn und PAI-1 kann die konformationelle Variabilität beider Proteine sein. Diese Studie untersuchte die Bindung von alternativen Konformationen von PAI-1 an sowohl natives als auch Harnstoff-gereinigtes Vn direkt. Zuvor beschrieben wir einen funktionellen Assay für die PAI-1-Bindung an Vn, worin von aktivem PAI-1 eine spezifische Bindung an Oberflächen-adsorbiertes nVn in einer dosisabhängigen und gesättigten Weise gezeigt wurde. Dieser Assay wurde zum Vergleich der Bindung von aktivem wtPAI-1 an beide Formen von immobilisiertem Vn verwendet (35). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Harnstuff-gereinigter als auch nativer Vn eine ähnliche Bindungskapazität für aktiven PAI-1 aufweisen und dass aktiver PAI-1 an beide Formen mit hoher Affinität bindet. Der berechnete K_d für das immobilisierte uVn ist etwa 6-mal geringer als für immobilisiertes nVn (127 ± 20 pM im Vergleich zu 825 ± 190 pM). Diese Differenz kann die verschiedenen konformationellen Zustände der beiden Vn-Präparate widerspiegeln, da nVn vorwiegend monomer ist, wohingegen uVn ein Disulfid-verknüpftes Multimer ist. Die Beobachtung, dass PAI-1 eine höhere Affinität für immobilisiertes multimeres Vn als für immobilisiertes monomeres Vn aufweist, stimmt mit dem Ergebnis überein, dass aus Plasma isolierter PAI-1 hauptsächlich mit einer hochmolekularen Form von Vn komplexiert ist, obschon der Großteil von Vn in Plasma monomer ist.
Um daher zu sehen, ob multimeres Festphasen-Vn auch PAI-1 mit höherer Affinität als monomeres Lösungsphasen-Vn band, wurden kompetitive Inhibitionsassays sowohl mit nVn als auch uVn vorgenommen, die um die PAI-1-Bindung an immobilisierten nVn konkurrierten. Diese in 36 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass sowohl uVn als auch nVn um die PAI-1-Bindung an immobiliserten nVn konkurrieren. Dies legt nahe, dass PAI-1 an dieselbe Stelle sowohl auf nVn als auch uVn dann bindet, wenn der Vn entweder in Lösung oder immobilisiert vorliegt. Außerdem ist Lösungsphasen-uVn ein wirksamerer Kompetitor um die PAI-1-Bindung (IC₅₀ = 65 mM) als der Lösungsphasen-nVn (IC₅₀ = 375 nM). Dieser annähernd 6-fache Unterschied ist ähnlich dem in 35 gezeigten und gibt an, dass uVn, entweder in Lösung oder immobilisiert, eine höhere Affinität für PAI-1 aufweist als bei nVn der Fall. K_d-Werte von ± 1,4 nM und 125 ± 12 nM für die Wechselwirkung von PAI-1 mit Lösungsformen von uVn bzw. nVn wurden aus diesen Daten errechnet. Dies gibt an, dass PAI-1 an immobilisierten Vn bei einer signifikant höheren Affinität bindet als an Lösungsphasen-Vn, indem er einen etwa 150-fach höheren K_d für die Lösungsphasen-Interaktion mit beiden Formen von Vn aufweist. Diese erhöhte Bindung an immobilisierten Vn kann aus der unterschiedlichen Konformation resultieren, die von Vn bei Adsorption an eine Oberfläche bekannt ist (Stockmann, A. et al., J. Biol. Chem. 268: 22874–22882 (1993); Preissner, K. T. et al., J. Biol. Chem. 265: 18490–18498 (1990)).
Um die Bindung alternativer konformationeller Formen von PAI-1 zu untersuchen, wurde ein auf ELISA basierender Assay ähnlich dem oben beschriebenen Festphasen-Assay vorgenommen, außer, dass PAI-1 mit einem Anti-PAI-1-Antikörper nachgewiesen wird, was die Analyse von inaktiven Konformationen von PAI-1 gestattet. 37 zeigt die Bindung von aktivem und latentem PAI-1 an Oberflächen-adsorbiertes Harnstoff-gereinigtes und natives Vn. Die Analyse der Bindung von aktivem PAI-1 an die beiden Formen von immobilisiertem Vn ergibt berechnete K_ds von 150 ± 16 pM mit uVn und 1300 ± 200 pM mit nVn. Diese Werte sind ähnlich den unter Verwendung des PAI-1-funktionellen Assays berechneten Werten (35), was darauf hinweist, dass der indirekte Antikörper-Assay auch für die Auswertung der PAI-1-Bindung an immobilisiertes Vn geeignet ist. Im Gegensatz zu aktivem PAI-1 bindet latenter PAI-1 an beide Formen von immobilisiertem Vn mit viel geringerer Affinität. In diesem Fall konnte kein K_d bestimmt werden, da keine sättigbare PAI-1-Bindung bei den getesteten Konzentrationen erhalten wurde. Nehmen wir jedoch an, dass latenter PAI-1 mit derselben Stöchiometrie wie aktiver PAI-1 bindet, so können wir einen Minimalwert für K_d von > 225 nM (der höchsten getesteten Konzentration) in beiden Fällen schätzen (37). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, dass lediglich aktiver PAI-1 an Vn mit hoher Affinität bindet, und widersprechen dem Vorschlag anderer, dass beide Formen von PAI-1 Vn mit gleicher Affinität binden.
Die für die Bindung von aktivem PAI-1 an immobilisierten Vn errechneten K_ds waren ähnlich den zuvor berichteten Werten. 127 pM gg. 300 pM (Seilffert et al., 1991, supra) bei uVn, und 825 pM gg. 4,4 nM (Lawrence et al., J. Biol. Chem., 1994, supra) bei nVn. Ein früherer Bericht, der einen niedrigeren Affinitäts-K_d von 55–190 nM für diese Wechselwirkungen unter Verwendung eines ähnlichen Assays errechnete, berücksichtigte nicht das Vorhandensein sowohl des aktiven als auch latenten PAI-1 im Präparat und hat möglicherweise in erster Linie die Bindung von latentem PAI-1 gemessen (Salonen et al., supra). In Übereinstimmung mit dieser Interpretation ist der berichtete K_d von 190 nM ähnlich unserem geschätzten K_d-Minimum für die latente PAI-1-Bindung entweder an natives oder uVn (K_d > 225 nM) (37). Salonen et al., bemerkten auch eine hochaffine Bindungsstelle mit "niedriger Kapazität" (K_d < 100 pM) die möglicherweise den aktiven PAI-1 in ihrem Präparat verkörperte.
Die Beobachtung, dass latenter PAI-1 an Vn mit viel geringerer Affinität als aktiver PAI-1 bindet, legt nahe, dass die mit der Umwandlung zur latenten Form verbundene Konformationsänderung für die verminderte Affinität verantwortlich sein kann. Wir schlugen früher vor (Lawrence et al., supra), dass die Stabilisierung von PAI-1 durch Vn dann erfolgt, wenn die Vn-Bindung an Strang 1 des β-Faltblatts A die Mobilität des β-Faltblatts A einschränkt, die für die Insertion des PAI-1-RCL während der Transformation zur latenten Konformation erforderlich ist. Dieses Modell ist verträglich mit der Beobachtung, dass die Umwandlung des Serpin-β-Faltblatts A von einem fünfsträngigen zu einem sechssträngigen antiparallelen β-Faltblatt durch Einführung des RCL als Strang 4 des β-Faltblatts A eine umfassende Neuanordnung der b-Stränge 1, 2 und 3 erfordert. Die Einschränkung dieser Neuanordnung durch Vn könnte die Schleifen-Insertion verzögern und so die Umwandlung von PAI-1 zur latenten Form. Ebenfalls im Einklang mit diesem Modell steht die offensichtliche Modifikation der Vn-Bindungsstelle an PAI-1 nach der RCL-Insertion, wie durch die verminderte Affinität des latenten PAI-1 für Vn angezeigt (37).
Als nächstes zu untersuchen war die Bindung des nativen und uVn an PAI-1 in Komplexierung an tPA oder uPA, gespalten durch Elastase oder inaktiviert durch Insertion eines synthetischen RCL-Peptids. Von jedem dieser Konformer wird angenommen, dass er sein β-Faltblatt A in der sechssträngigen Form, ähnlich der Struktur des latenten PAI-1, aufweist. Die Ergebnisse sind in 38 gezeigt. Wie auch latenter PAI-1 band keine dieser RCL-inserierten Formen von PAI-1 an immobilisierten nVn mit hoher Affinität, wobei alle geschätzte K_ds > 112–225 nM aufweisen (die höchsten getesteten Konzentrationen). Ähnliche Ergebnisse wurden mit immobilisiertem uVn erzielt. Die sowohl für tPA-PAI-1- als auch uPA-PAI-1-Komplexe mit beiden Formen von Vn beobachtete geringe Affinität stimmt mit früheren Berichten überein, dass tPA den PAI-1 von Lösungsphasen-Vn dissoziiert und dass PAI-1 von extrazellulärer Matrix durch Behandlung mit uPA entfernt werden kann (Mimuro et al., 1987, supra). Zu beachten ist, dass PAI-1 im Komplex mit dem synthetischen RCL-Peptid eine verminderte Affinität für Vn ähnlich zu den anderen Schleifen-inserierten Formen zeigt. Dies zeigt, dass es sich nicht um den Verlust eines exponierten RCL handelt, der zur Herabsetzung der Bindungsaffinität für Vn führt, da im PAI-1-Peptid-Komplex das natürliche RCL intakt und völlig zugänglich bleibt. Vielmehr scheint es die Reorganisation des β-Faltblatts A zu sein, die zu verminderter Affinität führt.
Um zu bestätigen, dass die Neuanordnung des Faltblatts A (und nicht nur einfach die Verbindung von PAI-1 mit einem Enzym) für den Verlust der Affinität verantwortlich war, wurde die relative Bindungsaffinität von PAI-1 im Komplex mit entweder Trypsin oder Anhydrotrypsin getestet. PAI-1 ist als ein wirksamer Inhibitor von Trypsin bekannt und bildet SDS-stabile, RCL-inserierte Komplexe, ebenso wie bei uPA oder tPA. Im Gegensatz dazu bindet Anhydrotrypsin an das PAI-1-RCL in einer nicht-kovalenten Bindung, die nicht zur Spaltung des RCL oder seiner Insertion in das β-Faltblatt A führt. Wie auch uPA und tPA, wiesen die PAI-1-Trypsin-Komplexe eine sehr geringe Affinität für immobilisierten nVn auf (39). Allerdings band PAI-1 in Verbindung mit Anhydrotrypsin an immobilsierten nVn mit nahezu derselben Affinität wie aktiver PAI-1 alleine. Dies bestätigt, dass es nicht nur einfach die Verbindung eines Enzyms mit dem RCL ist, die zu einem Verlust an Vn-Affinität führt, sondern vielmehr die Enzym-induzierte Insertion des RCL in das β-Faltblatt A.
Wie in anderen obigen Abschnitten erörtert, ergeben jüngere Studien, dass der Serpin-Mechanismus der Inhibition ein komplizierter Prozess ist, der ein exponiertes RCL erfordert. Auf Bindung mit einer Ziel-Proteinase hin wird das Serpin-RCL an seiner P₁–P_1'-Bindung gespalten, und wird das RCL in das β-Faltblatt A eingebaut, was den stabilen Serpin-Proteinase-Komplex ergibt. Hierbei ist gezeigt worden, dass die PAI-1-Vn-Bindungsstelle an der Kante des β-Faltblatts A sensitiv gegenüber dieser Konformationsänderung im β-Faltblatt A war, wie auch gegenüber ähnlichen mit der Umwandlung von PAI-1 zur latenten Form verbundenen Änderungen oder der Spaltung im RCL durch eine Nicht-Ziel-Proteinase. Diese Sensitivität kann einen Weg bieten, um die Expression der PAI-1-Aktivität an spezifischen Wirkstellen zu gewährleisten. So glaubt man beispielsweise von Vn, dass es PAI-1 an der extrazellulären Matrix lokalisiert, wo es die lokale proteolytische Aktivität reguliert (Mimuro et al., supra) und die Zelladhäsion und Migration blockiert. Unter diesen Bedingungen wäre es von Vorteil, lediglich funktionell aktivem PAI-1 die Bindung an Vn zu ermöglichen. An einer Zelloberfläche kann ein inaktiver Ligand internalisiert und abgebaut werden. Diese Art von Regulation ist aber möglicherweise an der weniger dynamischen extrazellulären Matrix nicht glei chermaßen wirksam. Es wird daher vorgeschlagen, dass, um Vn vor einer Sättigung durch inaktive Formen von PAI-1 zu schützen, ein System während der Evolution selektiert worden ist, das für den Konformationszustand von PAI-1 sensitiv ist, der wiederum eng an seinen Aktivitätszustand geknüpft ist.
BEISPIEL VI
Serpin PAI-1 hemmt die Zellmigration durch Blockierung der Integrin-Bindung an Vn
Die folgende Studie zeigt, dass Vn die SMC-Migration signifikant erhöht und dass der spezifische VnR für die Zellmotilität erforderlich ist. Ebenfalls gezeigt werden (a) die Überlappung der Bindungsstelle von Vn mit der Bindungsstelle für PAI-1, und (b) die Blockierung der SMC-Migration durch die aktive Konformation von PAI-1. Diese Wirkung erforderte eine hochaffine Bindung an Vn und war nicht abhängig von der Fähigkeit von PAI-1, Pas zu hemmen. Die Komplexbildung zwischen PAI-1 und PAs führte zum Verlust der PAI-1-Affinität für Vn und stellte die Zellmigration wieder her. Diese Ergebnisse zeigen eine direkte Verknüpfung zwischen den PAs und der Integrin-vermittelten Zellmigration und zeigen, dass PAI-1 die Zell-Matrix-Wechselwirkungen durch Regulierung der Zugänglichkeit der spezifischen Zellbindungsstellen kontrollieren kann. Folglich ist die Lokalisation der PA-Aktivität an Stellen von fokalem Kontakt offensichtlich nicht dazu da, eine proteolytische Kaskade, die zu einer generalisierten Matrixzerstörung führt, einzuleiten, sondern ist vielmehr zur Exponierung kryptischer Zellbindungsstellen, die für die SMC-Migration vonnöten sind, erforderlich.
METHODEN
A. PAI-1-Kompetition der ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn
Aktive Formen von wtPAI-1 (von Molecular Innovations) und PAI-1-Mutanten wurden hergestellt, wie beschrieben von Kvassman et al., supra. Vn wurde auf Platten aufgetragen, wie in Beispiel III beschrieben. Radiomarkierter VNR (2,5 nM) durfte an Vn in Gegenwart zunehmender Konzentrationen von wtPAI-1 oder PAI-1-Mutanten binden. Für die Analyse (mit und ohne uPA) durften 500 nM PAI-1 an Vn wie oben binden, woraufhin ungebundener PAI-1 entfernt wurde und 5 nM ¹²⁵I-VNR entweder alleine oder in Gegenwart von 1 mM uPA oder 50 mg/ml LM609 (Chemicon) zugesetzt wurden. Die Assays wurden wie beschrieben ausgeführt und analysiert.
B. Bindung und Migration von Kaninchen-SMC an Vn
(Siehe Beispiel IV für Beschreibung und Bindungsmethoden.) Gewaschene Zellen wurden in serumfreiem Medium ± 500 nM an wtPAI-1, Q123K-PAI-1 oder R346A-PAI-1 entweder alleine oder mit 1 mM uPA, oder mit LM609 (5 μg/ml) alleine resuspendiert. Die Zellen durften an Vn-beschichtete Platten (1 mg/ml) für 30 min binden, wurden dann zweimal mit TBS gewaschen, in Methanol/Essigsäure (75/25 v/v) fixiert und mit 2% Krisallviolett gefärbt. Die Extinktion der gefärbten Zellen wurde unter Verwendung eines Sony CCD/RGB-Farbvideosystems mit Image-1-Software (Universal Imaging) gemessen. Die Zellbindung an Vn alleine wurde mit 100% festgestellt, und die Bindung jeder experimentellen Bedingungen wurde als ein Verhältnis zu diesem Wert berechnet. Die Analyse bekannter, ähnlich behandelter Zellzahlen ergab, dass die Extinktion über den Bereich der untersuchten Zellen linear war. Migrationsassays wurden auf Transwells^® (3 mm Porengröße), beschichtet mit Vn, vorgenommen. SMCs durften sich anlagern und für 45 bis 60 min auf der oberen Kammer in serumfreiem Medium ausbreiten. Als nächstes wurden 0,5 μg/ml an LM609, oder 1 μM wtPAI-1, oder PAI-1-Mutanten mit oder ohne 2 mM uPA in 0,5% BSA, 1 mM CaCl₂, 0,5 mM MnCl₂ und Nutridoma^® (Boehringer-Mannheim) zugesetzt. Nach 4–5 Stunden wurde die obere Zellschicht mit einem Baumwolltupfer entfernt und die Zellen auf der Unterseite der Transwells fixiert, gefärbt und wie oben analysiert, wobei die Menge der mit Vn alleine beobachteten Zellmigration als 100% festgelegt wurde. Die Migration auf Matrigel^® mit und ohne Vn war wie oben, außer dass Transwells^® zunächst mit Matrigel^® (1:20-Verdünnung) in serumfreiem Medium über Nacht bei 4°C beschichtet wurden, gefolgt von Waschen mit PBS und Blockieren mit 1% BSA in PBS. Die Transwells wurden dann inkubiert ± Vn (0,2 mg/ml), gefolgt von Waschen mit PBS vor der Zugabe der Zellen. Die Migration wurde nach 14–16-stündiger Inkubation bestimmt.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die Wechselwirkung zwischen Zellen und ihren Substraten ist ein wichtiger Regulator der zellulären Funktion. Während der Wundheilung zeigen migrierende Zellen eine erhöhte Expression der Vn-Rezeptor-(VNR)-Integrine, einschließlich derer, die vorübergehend an der Wanderungsfront von Zellen exprimiert werden, die in ein Fibringerinnsel eindringen (Vassalli, J.-D. et al., (1991) J. Clin. Invest. 88: 1067–1072). Ebenso ist auch Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) an der Wamderungsfront migrierender Keratinozyten während der Frühstadien der Reepithelisation lokalisiert, und migrierende Gefäßzellen zeigen eine erhöhte Expression von uPA und seinem Rezeptor (uPAR), welche sich an fokalen Kontakten lokalisieren. Vn erhöht diese Colokalisation und beschleunigt auch die Bindung des VNR mit Vinculin an fokalen Kontakten. Daher zeigen während der Wundheilung die Zellen ein ähnliches Expressionsmuster für uPA und α_vβ₃, und zwar sowohl zeitlich als auch räumlich, was eine mögliche Verknüpfung zwischen diesen beiden Systemen vermuten lässt. In vivo sind uPA und sein Inhibitor PAI-1 wichtige Regulatoren der Gefäßwundheilung. An uPA defiziente Mäuse sind vor Neointima-Bildung nach einer Gefäßverletzung geschützt. Allerdings zeigen PAI-1-Nullmäuse eine übermäßige Intimaverdickung aufgrund von SMC-Migration und Vermehrung, wobei eine Überexpression von PAI-1 die Neointimabildung auf Mengen ähnlich denen bei uPA-Nullmäusen vermindert. Die traditionelle Interpretation dieser Daten ist die, dass PAs zur Einleitung einer proteolytischen Kaskade an der Zell-Substratum-Grenzfläche erforderlich sind, die zu einer für die Zellmigration und Invasion erforderlichen Matrixzerstörung führt (Declerck et al., 1988, supra). Im vorliegenden Beispiel jedoch werden Ergebnisse erhalten, die eine subtilere Rolle der PAs während der Wundheilung nahelegen und die erstmals eine direkte Verknüpfung zwischen PAs und den VNR-Integrinen nachweisen.
Die PAI-1-Bindungsstelle wurde vor kurzem an den ersten 50 Resten von Vn lokalisiert, einer Region, die auch die RGD-Zellbindungsstelle enthält. Um zu bestimmen, ob diese Bindungsstellen überlappen, wurde Kompetitionsstudien zwischen gereinigtem radiomarkiertem VNR und PAI-1 um die Bindung an Vn vorgenommen. Wildtyp-PAI-1 (wtPAI-1) konkurrierte wirksam mit ¹²⁵I-VNR um die Bindung an immobilisiertes Vn ( 40). Ein mutierter PAI-1 (R346A), der normalerweise an Vn bindet, doch nicht die PAs hemmt, inhibierte die Bindung von ¹²⁵I-VNR an Vn identisch zu wtPAI-1 (Ki ~ 4 nM). Eine zweite PAI-1-Mutante (Q123K) jedoch, die normalerweise die PAs hemmt, doch eine signifikant reduzierte Affinität für Vn aufweist, war ein relativ schwacher Inhibitor der ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PAI-1-Bindung an Vn zur Blockierung der VNR-Bindung ausreichend war. Keine der PAI-1-Varianten zeigte irgendeine Wirkung auf die Bindung von ¹²⁵I-VNR an Fibronektin, was darauf hinwies, dass die Wechselwirkung für Vn spezifisch ist, und dass der Verlust der VNR-Bindung nicht auf Wechselwirkungen zwischen PAI-1 und dem VNR zurückzuführen ist.
PAI-1 vollzieht grundlegende Konformationsänderungen auf die Reaktion mit einer Proteinase hin. Diese Strukturänderung führt zu einem Verlust der hohen Affinität für Vn und einer schnellen Clearance des PAI-1:Proteinase-Komplexes durch Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie. Um daher die Möglichkeit zu untersuchen, dass PAs die Integrinbindung durch Herabsetzung der Affinität von PAI-1 für Vn regulieren könnten, wurden Kompetitionsassays in Gegenwart und Abwesenheit von uPA vorgenommen. In Gegenwart eines zweifachen molaren Überschusses von uPA war die Fähigkeit von wtPAI-1, die ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn zu hemmen, weitgehend vernichtet (41). Diese Daten stimmen mit einer signifikant reduzierten Affinität für Vn des PAI-1:uPA-Komplexes überein, was dem VNR-Rezeptor die Verdrängung des inaktiven Komplexes ermöglicht. Im Gegensatz dazu verminderte uPA die Inhibition der ¹²⁵I-VNR-Bindung an Vn durch R346A-PAI-1 nicht. Dies zeigt, dass uPA die VNR-Bindung durch Bildung eines Komplexes mit wtPAI-1 erhöht und dies nicht an einer Proteolyse entweder des VNR oder des Vn liegt. Ein monoklonaler Antikörper zu α_vβ₃ (LM609) hemmte ebenfalls die Bindung von ¹²⁵I-VNR an Vn im selben Umfang wie PAI-1 (41), was bestätigte, dass dieses VNR-Präparat primär α_vβ₃ enthielt und dass PAI-1 die Bindung dieses Integrins an Vn blockiert.
Um zu sehen, ob PAI-1 die Wechelswirkung der zellulären Integrine mit Vn in ähnlicher Weise hemmen kann, wurden Bindungs- und Migrations-Assays unter Verwendung von SMC vorgenommen. Sowohl aktiver wtPAI-1 als auch R346A-PAI-1 hemmte die SMC-Bindung an Vn (42A). Im Gegensatz dazu zeigte Q123K-PAI-1 keine Auswirkung auf die Zellbindung, was anzeigte, dass die Inhibition der Zellbindung durch PAI-1 auf seine Fähigkeit zur Bindung von Vn und nicht auf seine inhibitorische Aktivität gegenüber PAs zurückzuführen ist. Weiterhin kehrte die Hinzufügung von uPA zu wtPAI-1 und Vn die Inhibition der Zellbindung um, wohingegen uPA keine Auswirkung auf die Inhibition der SMC-Bindung durch R346A-PAI-1 zeigte. Interessantennreise ist PAI-1 zur Hemmung der Bindung von SMC an Vn fähig, LM609 dagegen nicht. Dies lässt vermuten, dass SMC weitere Integrine aufweisen, die die Bindung an Vn durch die RGD-Integrin-Bindungsstelle vermitteln können, und dass PAI-1 den Zugang zu diesen Integrinen ebenfalls blockiert. In Übereinstimmung mit dieser Interpretation blockierte ein synthetisches RGD-enthaltendes Peptid ebenfalls die SMC-Bindung an Vn.
PAI-1 hemmte auch die Migration von SMC durch Vn-beschichtete Transwells^®. Wie bei der Zellbindung beobachtet, verhinderten sowohl aktiver wtPAI-1 als auch R346A-PAI-1 die Zellmigration, wohingegen aktiver Q123K-PAI-1 keine Auswirkung zeigte ( 42B). Die Einbeziehung von uPA negierte die Inhibition der Migration durch wtPAI-1, doch nicht durch R346A-PAI-1. Dies bewies, dass, wie bei der Bindung, die Inhibition der Zellmigration auf die Fähigkeit des PAI-1 zur Bindung an Vn und nicht seine inhibitorische Aktivität gegenüber PAs zurückzuführen war. LM609, welches die Bindung nicht verhinderte, hemmte die Migration, was bestätigte, dass SMCs α_vβ₃ für die Motilität benötigen. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen überein, dass migrierende Gefäßzellen eine erhöhte Expression sowohl von uPA als auch von VNR zeigen, und dass SMC eine erhöhte Migration auf Vn im Vergleich zu anderen Matrixproteinen zeigen.
Die oben dargestellten Ergebnisse legen nahe, dass die SMC-Migration während der normalen Wundheilung sowohl die zelluläre Expression von α_vβ₃ als auch das Vorhandensein von Vn in der Matrix erfordern und dass PAI-1 als ein wichtiger Regulator dieses Prozesses wirken kann. Allerdings sind subzelluläre Matrices in vivo viel komplexer, da sie Collagene, Glykosaminoglykane und weitere Proteine wie Laminin enthalten. Um daher die Rolle von PAI-1 und Vn in der zellulären Bindung und Migration auf solch eine heterogene Matrix zu untersuchen, und um zu sehen, ob PAI-1 diesen Prozess regulieren könnte, wurden Bindungs- und Migrationsassays an einer komplexen Basismembranmatrix, die von murinen Sarkomzellen stammte (Matrigel^®), in Gegenwart oder Abwesenheit von Vn vorgenommen. Anders als die Zellbindung an gereinigtes Vn, wies PAI-1 keine Auswirkung auf die Bindung an Matrigel selbst in Gegenwart von Vn auf. Dies zeigt, dass andere in der Matrix vorhandene Proteine die Zellbindung fördern, und dass, wie mit Fibrionektin zu erkennen war, PAI-1 keine Auswirkung auf diese Bindung ausübte. PAI-1 wirkte sich auch nicht auf die SMC-Migration durch Matrigel-beschichtete Transwells in Abwesenheit von hinzugefügtem Vn aus. Allerdings erhöhte die Adsorption von Vn an das Matrigel die SMC-Migration deutlich (43). Dies stimmt mit früheren Berichten überein, die zeigten, dass Vn die Migration sowohl von SMC (Lawrence et al., 1995, supra; Wilczynska et al., supra) als auch primären Keratinozyten (Aertgeers, K. et al. (1995) Nature Structural Biology 2, 891–897) signifikant erhöhte und legt nahe, dass das Vorhandensein von Vn in einer exponierten Matrix oder einem Fibrin-Clot die Zellmigration stimulieren könnte. Obschon weiterhin PAI-1 und LM609 keine Auswirkung auf die Zellbindung an Vn-enthaltendes Matrigel zeigten, waren sie zur Hemmung der Zellmigration auf dieser komplexen Matrix fähig (43). Wie mit gereinigtem Vn, zeigte der Q123K-PAI-1 keine Auswirkung auf die Zellmigration, und die Addition von uPA kehrte die Inhibition durch wtPAI-1 um. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die SMC-Migration auf einer komplexen Matrix durch Adsorption von Vn erhöht wird, und dass diese Induktion α_vβ₃-abhängig ist. PAI-1 kann diese Induktion durch Blockieren der α_vβ₃-Bindung verhindern, und PAs können die Induktion durch Umkehrung des PAI-1-Blocks fördern. Dies legt nahe, dass die Bindung von Plasma-Vn an eine exponierte Matrix nach einer Verletzung in vivo auf eine Beschleunigung der Zellmigration während der Wundheilung hinwirken kann, und dass PAI-1 ein wichtiger Regulationsfaktor dieses Prozesses sein kann. Was diese Hypothese stützt, ist, dass die Behandlung von Matrigel-beschichteten Transwells mit Rinderserum die SMC-Migration in einer PAI-1-inhibierbaren Weise erhöhte. Diese Ergebnisse stimmen auch mit der Beobachtung überein, dass PAI-1-Nullmäuse eine erhöhte SMC-Migration und Vermehrung zeigen, wohingegen bei uPA-Nullmäusen die SMC-Migration vermindert ist (Carmeliet, P. et al., Fibrinolysis 10 (Ergänz. 3): 19 (Zusammenf. 57) (1996)).
Die Spezifität der Inhibition der Integrinbindung an Vn durch aktiven PAI-1 veranschaulicht weiter die einzigartige funktionelle Interdependenz, die zwischen PAI-1 und Vn vorliegt. Über die Stabilisierung des PAI-1 in der aktiven Konformation hinaus, verändert Vn außerdem die Spezifität von PAI-1, was ihn zu einem wirksamen Inhibitor von Thrombin macht und seine Clearance durch Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie fördert. Dies legt nahe, dass Thrombin, ein bekanntes Mitogen und chemotaktisches Molekül, auch die Zellmigration durch Entfernung von PAI-1 von Vn fördern könnte. Außerdem haben mehrere Studien gezeigt, dass sowohl Elastase als auch Cathepsin G, das durch aktivierte Neutrophile produziert wird, wirksam PAI-1 von der Matrix entfernen kann. Da PAI-1 ein Substrat für diese Enzyme ist, sind lediglich katalytische Mengen zur Inaktivierung von PAI-1 erforderlich. Zusammengefasst zeigen diese Befunde, dass eine breite Vielfalt von Proteinasen zur Wechselwirkung mit PAI-1 und Exponierung der RGD-Integrin-Bindungsstelle auf Vn fähig sind. Dieses generelle Modifikationsvermögen zellulärer adhäsiver Eigenschaften durch viele abweichende Proteinasen mittels eines gemeinsamen Mechanismus lässt annehmen, dass die bekannte Korrelation zwischen einer erhöhten Zellmigration und der Proteinase-Aktivität zumindest teilweise durch eine proteolytische Wechselwirkung mit PAI-1 bei einer breiten Vielzahl von invasiven zellulären Prozessen vermittelt sein kann. Sie legt auch nahe, dass die Rolle einiger Proteinasen in der zellulären Migration möglicherweise nicht die ist, einen generalisierten Matrixabbau zu bewirken, sondern vielmehr in der Exposition kryptischer Zellbindungsstellen durch inaktivierenden PAI-1 besteht.
BEISPIEL VII
PAI-1 und Mutanten in der Zellbindung, Migration, Angiogenese und Clearance
Die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Substraten stellen einen wichtigen Regulator der Zellfunktion dar. Signale von der extrazellulären Matrix werden an Zelloberflächen-Adhäsionsproteine, wie etwa die Mitglieder der Integrin-Familie, übertragen. Integrine binden an immobilisierte Matrixproteine und sind dabei behilflich, die zelluläre Antwort zu spezifischen Oberflächenumgebungen durch Vermittlung einer Adhäsion und/oder Migration zu lenken. Die Zellmigration stellt einen wichtigen Schritt in vielen physiologischen Prozessen wie der Wundheilung und der Angiogenese dar und ist außerdem ein wichtiger Faktor in pathologischen Situationen wie der Tumorentwicklung und Metastase. Unter normalen Bedingungen ist die Zellmigration ein streng kontrollierter Prozess, der von der Koordination vieler Faktoren abhängt (Lauffenburger, D. A. et al., Cell 84: 359–369 (1996)). Nach einer Verletzung besteht die frühe Matrix einer Wunde primär in einem vernetzten Fibrinnetzwerk, das mit signifikanten Mengen an Vitronektin verbunden ist. Während der Wundheilung zeigen migrierende Zellen, z.B. glatte Muskelzellen (SMC), Endothelzellen und Keratinozyten, eine erhöhte Expression der Vitronektin-Rezeptor-(VNR)-Integrine einschließlich α_vβ₃ und α_vβ₅ (Liaw, L. et al., J. Clin. Invest. 95: 713–724 (1995); Liaw et al., Circ. Res. 77: 665–672 (1995); Brooks et al., 1994, supra; Brooks, P. C. et al., Cell 79: 1157–1164 (1994)). Vom Integrin α_vβ₃ wurde außerdem gezeigt, dass es vorübergehend an der Wanderungsfront der Zellen exprimiert wird, die in einen Fibrin-Clot eindringen (Clark R. A. F. et al., Am. J. Pathol. 148: 1407–1421 (1996)). Diese Verbindung zwischen der VNR-Expression und zellulären Migration hat zu der Annahme geführt, dass das α_vβ₃-Integrin für die Zellmotilität wichtig ist.
Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass α_vβ₃ für die Bindung von glatten Muskelzellen an Vn nicht erforderlich ist, für die Zellmotilität jedoch erforderlich ist (Beispiel VI). Es wurde außerdem gezeigt, dass die α_vβ₃-Bindungsstelle auf Vn mit der Bindungsstelle für PAI-1 überlappt und dass die aktive Konformation von PAI-1 die Bindung und Migration von vaskulären SMCs auf Vn blockiert. Diese Wirkung hängt nicht von der Fähigkeit der PAI-1 ab, Plasminogen-Aktivatoren (PAs) zu hemmen, erfordert jedoch ein hochaffine Bindung an Vn. Die Komplexbildung zwischen PAs und PAI-1 führt zu einem Verlust der PAI-1-Affinität für Vn und stellt die Zellbindung und Migration wieder her. Diese Daten zeigen, dass PAI-1 die Zell-Matrix-Wechselwirkungen durch Regulation der Zugänglichkeit der spezifischen Zellbindungsstellen kontrollieren kann, und legen nahe, dass die Lokalisation der PA-Aktivität an Stellen von fokalem Kontakt nicht in der Auslösung einer proteolytischen Kaskade besteht, die zu einem generalisierten Matrixabbau führt, sondern vielmehr der Exponierung kryptischer Zellbindungsstellen an Vn, die für die Migration glatter Muskelzellen erforderlich ist, dient.
44 und 45 zeigen, dass die SMC-Migration durch die Konzentration von Vn, welches an die Transwell-Migrationskammer adsorbiert ist (44), beeinflusst wird, und dass PAI-1 ein wirksamerer Inhibitor der SMC-Migration bei geringerer Vn-Beschichtungskonzentration ist (45). Da von Vn in Plasma angenommen wird, dass es an die extrazelluläre Matrix auf eine Verletzung hin bindet, wurden Experimente vorgenommen, um zu testen, ob Vn aus Serum ähnliche Wirkungen zeigte. In 47 ist die Migration von SMC auf Transwell-Filtern gezeigt, die zunächst mit Matrigel beschichtet und dann entweder gereinigtem nativem Vn oder Rinderserum ausgesetzt wurden. In Übereinstimmung mit unseren zuvorigen Beobachtungen migrierte SMC auf Matrigel in Gegenwart von Vn schneller. Das Serum stimulierte auch die Migration von SMC, die durch die Zugabe von PAI-1 inhibiert waren. Dies zeigt, dass Serum-Vn dieselbe Fähigkeit wie gereinigtes natives Vn zur Beschleunigung der SMC-Migration aufweist und dass PAI-1 ebenfalls zur Hemmung dieser Wechselwirkung fähig ist.
Die Fähigkeit von PAI-1 zur Blockierung der Bindung von zellulären Integrinen an Vn ist möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass PAI-1 eine größere Affinität für Vn aufweist als Integrine. In 47 ist ein Vergleich der Fähigkeit von PAI-1 zur Hemmung der SMC-Bindung in Vergleich zu einem Peptid, das die RGD-Sequenz ent hält, und zu einem mAb zu α_vβ₃ (LM609) gezeigt. Das RGD-enthaltende Peptid, nicht jedoch ein entsprechendes RGE-enthaltendes Peptid, hemmten die gesamte SMC-Bindung an Vn. Der Antikörper LM609 hemmte die SMC-Bindung nicht, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass diese Zellen andere Vn-spezifische Integrine besitzen. PAI-1 konnte, ebenso wie das RGD-enthaltende Peptid, die gesamte SMC-Bindung an Vn hemmen. Allerdings wies es eine ähnliche Wirksamkeit bei einer etwa 100-mal geringeren Konzentration auf.
In Prozessen wie der Wundheilung und Angiogenese wirkt SMC im Einklang mit Endothelzellen in der Versiegelung einer Wunde und der Erzeugung eines funktionierenden Kapillargefäßes. Um die Verwendung von PAI-1 bei diesen Prozessen auszuwerten, wurden Studien zur Untersuchung der Wirkung von PAI-1 auf die Endothelzellbindung an Vn unter Verwendung von Rinderaorta-Endothelzellen (BAE) vorgenommen. 48 und 49A–49B zeigen, dass PAI-1 zur Hemmung der Bindung von BAE an Vn im selbem Maße wie das RGD-enthaltende Peptid unfähig war. Eine mögliche Erklärung ist die, dass Endothelzellen mit anderen RGD-bindenden Integrinen, die zur Erkennung anderer Stellen auf Vn fähig sind, distal von der normalen Zellbindungsstelle und der PAI-1-Bindungsstelle liegen. Über die Blockierung der SMC-Migration in vitro hinaus, blockierte PAI-1 auch die Zytokin-induzierte Angiogenese in vivo (50A–50C). Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung der stabilisierten 14-1B-Mutante erhalten, welche vier Aminosäure-Substitutionen im Vergleich zum Wildtyp aufweist (N150H, K154T, Q319L, M354I). Diese Ergebnisse zeigen, dass diese stabilisierten PAI-1- und weitere PAI-1-Mutanten die Angiogenese in der Hühner-Chorioallan-toinmembran (CAM) hemmten. Zumindest ein Teil der Hemmung ist auf die Blockier-ung der Vn-Zugänglichkeit zurückzuführen.
Abgesehen von der PAI-1-vermittelten Inhibition der Zellbindung und Migration, welche von einer hochaffinen Bindung an Vn abhängt, nützen weitere Anwendungen der PAI-1-Mutanten die hohe Affinität aus, die PAI-1 für Clearance-Rezeptoren auf eine Komplexbildung mit Proteinase hin aufweisen. PAI-1-Proteinase-Komplexe zeigen eine höhere Affinität für die Clearance-Rezeptoren LRP und gp330 als andere getestete Serpin-Enyzmkomplexe auf. In 51 ist der Zell-vermittelte Abbau der ¹²⁵I-Neutrophilenelastase durch die PAI-1-Elastase-Inhibitor-Mutante (R346A) im Vergleich zum natürli chen Proteinase-Inhibitor α1-Proteinase-Inhibitor gezeigt. Dieser erhöhte Abbau erfolgt über Endosome und Lysosome, da er durch Chloroquin inhibiert ist.
Da Neutrophilenelastase vorzugsweise an der C-terminalen Seite von Valin spaltet, untersuchten die vorliegenden Erfinder, ob die Wirksamkeit der Elastase-Inhibition durch PAI-1 durch Einführung eines Valin-Rests in die Bindung am reaktiven Zentrum verbessert werden könnte. Außerdem war eine Ausschaltung von Valin an Position 343 erwünscht, einer Elastase-sensitiven Stelle in wtPAI-1, die zur Inaktivierung von PAI-1 führt. In 52 ist eine Vergleich der Inhibition von Elastase durch verschiedene PAI-1-Mutanten und durch α1-Proteinase-Inhibitor gezeigt. Wie aus dieser Figur ersehen werden kann, ist das PAI-1-enthaltende Valin bei 346 (R346V) und Alanin an Position 343 (V343A) ein wirksamerer Inhibitor der Elastase als andere getestete PAI-1-Mutanten.
Nachdem diese Erfindung nun umfassend beschrieben worden ist, wird für Fachleute des Gebiets erkennbar sein, dass dieselbe innerhalb eines breiten Bereichs von gleichwertigen Parametern, Konzentrationen und Bedingungen ausgeführt werden kann, ohne vom Geiste und Umfang der Erfindung abzuweichen und ohne eines übermäßigen Experimentierens zu bedürfen.
Zwar wurde diese Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungen dafür beschrieben, doch wird klar sein, dass sie weiter modifizierbar ist. Diese Anmeldung soll jegliche Variationen, Anwendungen oder Adaptionen der Erfindung abdecken, die generell den Prinzipien der Erfindung folgen und die solche Abweichungen von der vorliegenden Beschreibung umfassen, die innerhalb bekannter und üblicher Praxis im Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, liegen und die auf die wesentlichen, hierin dargestellten Merkmale, wie im Rahmen der im Anhang folgenden Ansprüche definiert, anwendbar sind.
SEQUENZLISTE

Claims

Protein-Mutante von PAI-1-Protein, deren Wildtyp-Sequenz SEQ ID NO: 3 oder –2 bis 379 von SEQ ID NO: 2 ist, welche Mutante Neutrophilenelastase oder andere Elastase-artige Proteinasen hemmt und welche mindestens zwei Aminosäure-Substitutionen aufweist (a) an Position 343 von SEQ ID NO: 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Asp, Gly, Leu und Ile; und (b) an Position 346 von SEQ ID NO: 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Val, Asp, Phe und Gly.
Protein-Mutante nach Anspruch 1, welche die Elastaseaktivität hemmt, so dass nicht mehr als etwa zehn Mol der Protein-Mutante zur Hemmung von 1 Mol der Elastase erforderlich sind.
Protein-Mutante nach Anspruch 1, welche von SEQ ID NO: 3 durch eine Einzelsubstitution von Val an Position 346 und eine Einzelsubstitution von Ala an Position 343 abweicht.
Protein-Mutante nach Anspruch 3, worin die Aminosäure, die an Position 343 substituiert: (a) die Protein-Mutante resistent gegenüber einer Spaltung durch Elastase an Stellen C-terminal zur Position 343 macht, und (b) eine Seitenkette aufweist, welche die Bindung der Protein-Mutante an die Elastase zur Bildung eines PAI-1-Mutante-Elastase-Komplexes nicht beeinträchtigt.
Protein-Mutante nach Anspruch 1 oder 2, welche außerdem zwischen ein und vier der folgenden zusätzlichen Aminosäure-Substitutionen in SEQ ID NO: 3 aufweist: (a) His an Position 150; (b) Thr an Position 154; (c) Leu an Position 319; und (d) Ile an Position 354.
Protein-Mutante nach Anspruch 1, 2 oder 5, welche außerdem eine oder mehrere der folgenden Substitutionen in SEQ ID NO: 3 aufweist: (a) Arg an Position 333; und (b) Arg an Position 335; (c) Gly an Position 331; (d) Ile an Position 372; (e) Leu an Position 91.
Protein-Mutante nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche resistent gegenüber einer Inaktivierung durch die folgenden Proteinasen ist: Elastase, ein Plasminogenaktivator, Plasmin, Thrombin, Cathepsin G, Chymase, Gelatinase A, Gelatinase B, Stromelysin und Collagenase.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Hemmung der Elastaseaktivität in einem Individuum nützlich ist, umfassend: (a) eine Protein-Mutante nach einem der Ansprüch 1 bis 7; und (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 zur Verwendung in der Behandlung von Emphysem, akutem Atemnotsyndrom, akutem entzündlichem Lungentrauma, angeborenem Alpha-1-Antitrypsinmangel, zystischer Fibrose, atopischer Dermatitis, Pancreatitis, periodontaler Erkrankung, Arthritis oder HIV-Infektion.
Nukleinsäure-Molekül, das eine PAI-1-Protein-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 10, welches SEQ ID NO: 1 oder der codierende Abschnitt davon ist und welches mindestens zwei Nukleinsäure-Substitutionen an Positionen umfasst, welche Aminosäuren 343 und 346 in SEQ ID NO: 3 oder –2 bis 379 von SEQ ID NO: 2 codieren.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit einem Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 10 oder Anspruch 11.
Antikörper, welcher für ein Epitop einer PAI-1-Protein-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 7 spezifisch ist, welches Epitop auf Wildtyp-PAI-1 nicht vorhanden ist.