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Die Erfindung betrifft neue pharmazeutische Präparationen, welche das Aktivierungspeptid von Protein C, gegebenenfalls in Mischung mit Protein C oder aktiviertem Protein C, enthalten.
Protein C ist ein Vitamin-K-abhängiges Glykoprotein, das in der Leber synthetisiert wird und im Plasma in einer Konzentration von etwa 4 g/ml als inaktives Zymogen zirkuliert. Es wird an der Gefässwandoberfläche (Endothel) in eine aktive Serinprotease, aktiviertes Protein C, durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex übergeführt. Es ist bekannt, dass aktiviertes Protein C profibn- nolytische Eigenschaften hat. Es wirkt auch antikoagulatorisch, weil es sowohl Faktor Va, den Cofaktor für Faktor-Xa-induzierte Prothrombinaktivierung (Thrombinbildung), als auch Faktor Villa, den Cofaktor für die Faktor IXa-induzierte Faktor X-Aktivierung, durch Proteolyse abbaut.
Das Protein C-Zymogen zirkuliert im Plasma vor allem in einer zweikettigen Form, die eine schwere und eine leichte Kette enthält, welche mittels Disulfid miteinander verbunden sind. Die Aktivierung von Protein C ist mit der Abspaltung der NH2-terminaten 12 Aminosäuren der schweren Kette des Moleküls verbunden. Die Abspaltung erfolgt zwischen Arg 1 2-LyS13 der schweren Kette, so dass das Aktivierungspeptid von Protein C freigesetzt wird, welches die folgende Aminosäurese- quenz (als SEQ.ID.NR. 1 bezeichnet) aufweist: NH2-Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COOH.
Patienten, die einen Protein C-Mangel aufweisen oder welchen Protein C fehlt, haben eine starke Neigung zur Thrombosebildung oder zur Bildung von Blutgerinnseln. Babys, die mit einem vollständigen Mangel an Protein C geboren sind, weisen eine massive disseminierte intravaskuläre Blutgerinnung (disseminated intravascular coagulation, DIC) und nekrotisches Syndrom auf, die ohne Behandlung in den ersten Lebenswochen zum Tod führen können.
Aktiviertes Protein C hat Antikoagulationseigenschaften und es zeigte sich, dass es Tiere gegen die koagulopathischen und tödlichen Wirkungen von Endotoxin-Schock schützt. Taylor et al., J Clin Invest. 79. 918-925 (1987).
Insbesondere ist es aktiviertes Protein C, das die arterielle thrombolytische Okklusion oder Thromboembolie inhibieren kann. (Vgl. z. B. U.S. Patent Nr. 5,084,274 von Griffin et al.). Das nicht- aktivierte Zymogen hat diese Wirkung nicht. Beispielsweise wurden in Gruber et al., Blood 73 :639- 642 (1989) die antithrombotischen Eigenschaften von aktiviertem Human-Protein C in vivo an einem Pavian-Modell zur Thrombus-Bildung an Gefässprothesen-Transplantaten untersucht.
Thrombotische Okklusion wurde bei Tieren, welchen aktiviertes Protein C infundiert worden war, verhindert, jedoch nicht bei jenen (Kontroll)-Tieren, welchen Protein C oder Kochsalzlösung verab- reicht worden war.
Kurzlich wurde ein Ca2+-abhängiger monoklonaler Antikörper, HPC-4, welcher ein Epitop im Aktivierungsbereich von Protein C speziell erkennt, beschrieben. Vgl. beispielsweise U. S. Patent Nr. 5,202,253 von Esmon et al. Dieser Antikörper, welcher ein Epitop erkennt, das die Reste 6-17 am NH2-Terminus der schweren Kette von Protein C, d. h. den Aktivierungsbereich, überspannt, bindet an Protein C, jedoch nicht an aktiviertes Protein C. Die Aminosäuresequenz (SEQ.ID.NR. 2) des Peptids, das spezifisch von diesem HPC-4-Antikörper erkannt wird, ist:
EMI1.1
Es zeigte sich, dass die Verabreichung von HPC-4 an Tiere in vivo die Aktivierung von Protein C blockiert und dies zur Verringerung des Blutverlusts während chirurgischer oder anderer Vor- gänge nützlich sein kann. Vgl. z. B. WO 94/02172.
Die Verwendung von Protein C oder aktiviertem Protein C in einer pharmazeutischen Präpara- tion hat eine antinozizeptive Wirkung, wie im Europäischen Patent Nr. 0 471 660 beschrieben
Es zeigte sich nun, dass nicht nur Protein C, sondern überraschenderweise auch das Aktivie- rungspeptid von Protein C eine antinozizeptive und entzündungshemmende Wirkung aufweist und in Zusammensetzungen und Verfahren zur Erleichterung oder Behandlung von mit dem entzündli- chen Prozess verbundenen Schmerzen nützlich sein kann.
Das Ziel dieser Erfindung ist es, eine therapeutische Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C zu ermöglichen, insbesondere durch Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C bei der Herstellung einer pharmazeutischen Präparation, die eine antinozizeptive Wirkung hat.
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Nozizeptiv kann als Verletzung erleidend, wie durch ein rezeptives Neuron für schmerzhafte Emp- findungen, definiert werden. Nozizeptoren sind Rezeptoren, die durch Verletzung stimuliert werden, beispielsweise ein Rezeptor für Schmerzen. Mit antinozizeptiv ist ein Mittel gemeint, das eine von einer Verletzung oder einer Gewebsschädigung, beispielsweise Entzündung, stammende Schmerzreaktion verringert oder eliminiert.
Die Erfindung beruht auf der neuen und unerwarteten Feststellung, dass die durch entzündliche Vorgänge induzierte erhöhte Schmerzempfindlichkeit durch das Aktivierungspeptid von Protein C verringert werden kann. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Aktivierungspeptid von Protein C, welches vom NH2-Terminus der schweren Kette abgespaltet wird, wenn Protein C durch Thrombin-Thrombomodulin aktiviert wird, eine zentrale Rolle bei den zuvor erwähnten antinozizep- tiven Wirkungen von Protein C spielt.
Es hat sich gezeigt, dass die Schmerzschwelle nach Verabreichung eines Antikörpers, der für das Aktivierungspeptid spezifisch ist, d. h. eines solchen, der die Aktivierung von Protein C verhin- dern kann und keine Reaktivität gegenüber aktiviertem Protein C hat, z. B. Antikörper HPC-4, we- sentlich gesenkt wird. So hat es sich gezeigt, dass das Aktivierungspeptid von Protein C an der Vermittlung der neuen antinozizeptiven und entzündungshemmenden Wirkungen von Protein C spezifisch beteiligt ist.
Die antinozizeptive Wirkung endogener Peptide des #-Endorphin-Typs und davon abgeleitete Sequenzen (Met-Enkephalin und Leu-Enkephalin) bei Tieren und die schmerzstillende Wirkung bei Menschen sind wohlbekannt.
Die unerwartete antinozizeptive Wirkung des Aktivierungspeptids von Protein C kann durch Verabreichung in Mischung mit Peptiden vom endogenen #-Endorphin-Typ verbessert werden.
Alternativ können Fusionspeptide, die die Sequenz sowohl des Aktivierungspeptids von Protein C als auch eines Peptids des endogenen #-Endorphin-Typs umfassen, verabreicht werden, um zu einer verbesserten antinozizeptiven Wirkung zu führen. Vorzugsweise werden die einzelnen Pepti- de und/oder die Fusionspeptide, vorzugsweise über chemische Synthesetechniken, die auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt sind, hergestellt.
Es versteht sich, dass die Peptide genau die beschriebene Aminosäuresequenz oder Analoga und Derivate davon enthalten können, solange ihre Effizienz in einem Tiermodell für Hyperalgesie bewiesen ist.
Infolge des proteolytischen Abbaus im Blutkreislauf haben intravenös verabreichte Peptide oft eine relativ kurze biologische Halbwertszeit. Die Halbwertszeit kann durch Einschliessen der Pepti- de in Liposome für die Verabreichung verbessert werden. Eine zusätzliche Wirkung der Verabrei- chung der Peptide in liposomalen Mikrokapseln schafft eine deutlich erhöhte Affinität für neuronale Rezeptoren und Durchgang durch die Blut-Gehirn-Barriere in das Gehirn (und seine Schmerzre- zeptoren). Dies ist ein direktes Ergebnis des Einschliessens allgemein hydrophiler Peptide in einem lipophilen Träger (Liposom). Beide Wirkungen - der verringerte proteolytische Abbau und die er- höhte Lipophilität - verlängern und verbessern weiter die antinozizeptive Wirkung der Peptide, der Peptidmischungen und fusionierter Peptide.
Das Verhältnis von Peptid zu Lipid liegt bei einer solchen Liposomenpräparation im Bereich von etwa 1:100 bis 1:1(Gew./Gew.), wobei das bevorzugte Verhältnis im Bereich von etwa 1:100 bis 1:5 (Gew./Gew.) liegt.
Die Mikroverkapselung der Peptide und/oder von Protein C und/oder von aktiviertem Protein C ermöglicht auch die Formulierung einer Präparation, die auch auf oralem Weg verabreicht werden kann.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C bei der Her- stellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere für die Behandlung von durch akute oder chronische entzündliche Prozesse verursachten Schmerzen. Solche Schmerzen kön- nen die Folge entzündlicher Prozesse sein, die von posttraumatischen oder postoperativen Zu- ständen herrühren oder durch primäre oder sekundäre maligne Erkrankungen verursacht sind.
Das Aktivierungspeptid von Protein C kann insbesondere verwendet werden, um eine Präpara- tion zur Verwendung bei der Behandlung von durch rheumatoide Arthritis, Myositis, Gastritis, Kolitis oder Entzündungen im Urogenitaltrakt induzierten oder im Rahmen akuter oder chronischer Trans- plantatabstossungen auftretender Schmerzen zu erhalten.
Weiters ist das Aktivierungspeptid von Protein C imstande, die Adhäsion von Leukozyten an
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den Gefässwänden zu verhindern und das Wandern der Leukozyten durch permeabilisierte Gefäss- wände zu hemmen. Das Aktivierungspeptid von Protein C scheint die Aktivierung der Leukozyten zu verringern und die Komplementaktivierung zu verhindern.
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Aktivierungspeptids von
Protein C bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung akuter oder chronischer entzündlicher Erkrankungen. Solche entzündliche Erkrankungen können posttraumatisch, postoperativ oder im Rahmen primärer oder sekundärer maligner Erkrankungen auftreten.
Eine pharmazeutische Präparation, die eine therapeutisch wirksame Menge des Aktivierungs- peptids von Protein C enthält, ist besonders geeignet für die Behandlung entzündlicher Erkrankun- gen, wie rheumatoider Arthritis, Myositis, Gastritis oder Kolitis, für die Behandlung von Entzündun- gen im Urogenitaltrakt sowie für die Behandlungen von entzündlichen Prozessen, die mit akuten oder chronischen Transplantatabstossungen verbunden sind.
Die erfindungsgemässe pharmazeutische Präparation enthält vorzugsweise das Aktivierungs- peptid von Protein C, das aus einer biologischen Quelle, wie Plasma oder einer Plasmafraktion, oder aus einem Kulturmedium von Zellen, die natürlicherweise Protein C erzeugen oder es als Fol- ge rekombinanter DNA-Techniken erzeugen, gereinigt sein kann. Solche Präparationen werden zur
Inaktivierung jeglicher möglicherweise in der biologischen Quelle vorhandener Viren behandelt.
Hitzebehandlung ist als Mittel zur Virusinaktivierung bevorzugt, beispielsweise durch Verwendung des Verfahrens gemäss EP-B-0 159 311 oder EP-A-0 519 901, welches eine Kombination von Hitzebehandlung und einer Behandlung mit einem Tensid zur Inaktivierung jeglicher Viren be- schreibt.
Alle diese Präparationen können natürlich auch andere Ingredienzien, wie Protein C oder akti- viertes Protein C, andere Blutproteine oder pharmazeutisch aktive Substanzen, sowie pharmazeu- tisch geeignete Träger, Verdünnungsmittel oder Puffersubstanzen enthalten.
Das Aktivierungspeptid von Protein C zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann durch Spaltung von Protein C, das aus einer biologischen Quelle - wie oben erwähnt - gereinigt worden oder chemisch synthetisiert worden ist, erhalten werden. Die Aktivierung von Protein C kann in vitro unter Verwendung eines Aktivators, z. B. immobilisierten Thrombins, durchgeführt werden. Das Aktivierungspeptid von Protein C kann aus der Mischung von aktiviertem Protein C und dem Aktivierungspeptid von Protein C, das aus der Aktivierung stammt, abgetrennt werden und zu einer pharmazeutisch akzeptablen Präparation formuliert werden, oder als Mischung des aktivierten Protein C und des Aktivierungspeptids formuliert werden.
Die Erfindung beinhaltet auch die Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C für die Erzeugung einer kombinierten pharmazeutischen Präparation, einschliesslich mindestens eines antiphlogistischen und/oder mindestens eines analgetischen Mittels. Alternativ kann das Aktivie- rungspeptid von Protein C bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ver- wendet werden, die auch ein Peptid vom #-Endorphin-Typ, z.B. Met-Enkephalin oder Leu-Enke- phalin, enthält. Es hat sich gezeigt, dass solche pharmazeutischen Kombinationspräparate syner- gistische Wirkungen aufweisen ; eine verstärkte antinozizeptive Wirkung haben.
Die Erfindung betrifft weiters die Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C zum Er- halt von Präparationen zur Normalisierung erhöhter vaskulärer Permeabilität, zur Verhinderung von Permeabilitätsdefekten der Gefässwand und zur Stimulierung der #-Adrenoceptoren.
Fig. 1 ist ein Schaubild, welches die Schmerzschwelle im Rattenpfoten-Modell, ohne Verab- reichung von Carrageenan (Linie a); nach Verabreichung von Carrageenan (Linie b) und nach Verabreichung von Carrageenan und verschiedenen Dosen von Protein C (Linie c) gemessen, zeigt.
Fig. 2 ist ein Schaubild, welches die antinozizeptive Wirkung im Rattenpfoten-Modell in dosis- abhängiger Weise von Protein C und eine abgeschwächte Dosis-Reaktion in Anwesenheit des Antikörpers HPC-4 zeigt.
Fig. 3 ist ein Schaubild, welches die antinozizeptive Wirkung im Rattenpfoten-Modell in dosis- abhängiger Weise von dem Aktivierungspeptid von Protein C und eine abgeschwächte Dosis- Reaktion in Anwesenheit des Antikörpers HPC-4 zeigt.
Fig. 4 ist ein Schaubild, welches die Wirkung von Protein C auf durch Histamin induzierte ver- besserte vaskuläre Permeabilität bei Meerschweinchen zeigt.
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Fig. 5 ist ein Schaubild, welches die Wirkung von Protein C auf durch Thrombin induzierte verbesserte vaskuläre Permeabilität bei Meerschweinchen zeigt.
Fig. 6 ist ein Schaubild, welches die Wirkungen von Formulierungspuffer auf durch Thrombin induzierte verbesserte vaskuläre Permeabilität bei Meerschweinchen zeigt.
BEISPIELE:
Die Herstellung von Protein C und des Aktivierungspeptids von Protein C, sowie die Beurtei- lung ihrer antinozizeptiven und anderen Aktivitäten sind im folgenden Abschnitt beschrieben.
Ebenso beschrieben ist die Testung von HPC-4, als repräsentativer Ca2+-abhängiger Antikörper mit
Spezifität gegenüber der Aktivierungsregion von Protein C, als Antagonist der antinozizeptiven und anderer Aktivitäten von Protein C und/oder des Aktivierungspeptids von Protein C.
BEISPIEL 1: Herstellung von Protein C
Hochreines Protein C wurde aus einer rohen Protein C-Fraktion hergestellt, die aus kommer- ziell erhältlichem Prothrombinkomplex-Konzentrat erhalten worden war. Der Reinigungsprozess wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper-Affinitätschromatographie durchgeführt. Mono- klonale anti-Protein C-Antikörper wurden auf folgende Weise hergestellt:
BALB/C-Mäuse wurden mit 100 g menschlichem Protein C in zweiwöchigen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Nach sechs Wochen wurden weitere 50 g des menschli- chen Protein C injiziert und drei Tage später die Fusion vorgenommen.
Die Myelom-Zellinie (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 107 Zellen) wurde mit 1,7 x 108 Milzzellen der Maus vermischt und die
Fusion nach modifizierter Köhler & Milstein-Methode unter Verwendung von PEG 1500 durchge- führt (Köhler G., Milstein C., Nature 256 (1975), 495-497).
Positive Klone, getestet mittels ELISA, wurden zweimal subkloniert Aszitesproduktion erfolgte durch Injektion von 5 x 106 Hybridomzellen je BALB/C-Maus zwei Wochen nach Pristan-Behand- lung.
Das Immunglobulin wurde aus Aszites durch Ammoniumsulfatpräzipitation, anschliessende Chromatographie auf QAE-Sephadex und schliesslich Chromatographie auf Sephadex G200 gerei- nigt. Um das Risiko einer Übertragung muriner Viren zu reduzieren, wurde der Antikörper vor der Immobilisierung noch einem Virusinaktivierungsschritt unterworfen, z. B. wie in EP-B-0 159 311 oder EP-A-0 519 901 geoffenbart. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper wurden an CNBr- Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt. Für die Reinigung des Protein C mittels Affinitätschroma- tographie wurden folgende Puffer verwendet:
Adsorptionspuffer : 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0. 25 mM NaCI und 5 mM Benzamidin ; fer : mM Tris, 1 M NaCI, 2 mM Benzamidin, 2 mM EDTA, pH 7,4; Elutionspuffer: 3 M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCI, 0,5 mM Benzamidin, 2 mM EDTA.
BEISPIEL 2 : Affinitätschromatographische Reinigung
Das Prothrombinkomplex-Konzentrat wurde im Adsorptionspuffer von Beispiel 1 gelöst, wobei etwa 10 g Prothrombinkomplex-Konzentrat für eine 20 ml monoklonale Antikörpersäule verwendet wurden. Danach wurde das gelöste Prothrombinkomplex-Konzentrat filtriert, bei 20. 000 U/min 15 min lang zentrifugiert und durch ein 0,8 m-Filter sterilfiltriert. Das sterilfiltrierte und gelöste Pro- thrombinkomplex-Konzentrat wurde mit einer Flussrate von 10 ml/h auf die Säule aufgetragen.
Danach wurde die Säule mit dem Waschpuffer aus Beispiel 1 proteinfrei gewaschen, das gebun- dene Protein C wurde mit dem Elutionspuffer aus Beispiel 1 bei einer Flussrate von 5 ml/h eluiert, und die eluiertes Protein C enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und gepoolt. Das eluierte Protein C wurde gegen einen Puffer dialysiert (0,2 M Tris, 0,15 M Glycin und 1 mM EDTA, pH 8,3).
Die Protein C-Antigen-Konzentration wurde unter Verwendung der von Laurell beschriebenen Methode bestimmt, und die Protein C-Aktivität wurde unter Verwendung von Protac-Aktivierung bestimmt.
Das so erhaltene Protein C-Eluat wurde dann auf folgende Weise zu einer pharmazeutisch applizierbaren Präparation fertiggestellt:
Das Eluat wurde zuerst einem Ultrafiltrations- und einem Diafiltrationsschritt unterworfen. Die Diafiltration erfolgte mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der pro Liter 150 mmol NaCI und 15 mmol Trinatriumcitrat.2H20 enthielt. Das Filtrat wurde dann gefriergetrocknet und durch eine einstündige Dampfbehandlung bei 80 C 5 C und 1375 #35 mbar virusinaktiviert.
Das lyophilisierte, virusinaktivierte Material wurde sodann in einer sterilen isotonen NaCI- Lösung gelöst, und mittels lonenaustauschchromatographie auf einer Q-Sepharose-Säule wurden
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in der Präparation etwaig vorhandene Antikörper oder Serumamyloid P entfernt. Die gereinigte Lösung wurde durch einen zusätzlichen Ultrafiltrations- und Diafiltrationsschritt konzentriert. Nach diesem Schritt wurden zur erhaltenen Lösung pro Liter 10 g Albumin, 150 mmol NaCI und 15 mmol Trinatriumcitrat zugegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,5. Es konnten weder Maus-Im- munglobulin noch die Faktoren 11 VII, IX and X nachgewiesen werden. Danach wurde die Lösung sterilfiltriert, abgefüllt und lyophilisiert. Die spezifische Aktivität betrug 14 Einheiten Protein C/mg.
Eine Einheit Protein C-Aktivität ist definiert als die Protein-C-Aktivität in 1 ml Normalplasma und wird gegen den ersten internationalen Standard von Protein C kalibriert. Als Aktivitätstest wurde ein amidolytischer Test verwendet, wobei das Protein C mit dem Schlangengift Protac (von Penta- pharm gekauft) aktiviert worden war.
BEISPIEL 3 : Herstellung von aktiviertem Protein C
Die Aktivierung des gereinigten Protein C erfolgte dadurch, dass 70 ml Thrombin (500 NIH Ein- heiten/ml, entsprechend etwa 2000 NIH Einheiten/mg Protein) an CNBR Sepharose 4B (Pharma- cia) gekoppelt wurden, worauf Protein C mit dem Thrombingel in einem Verhältnis von etwa 6 Einheiten Protein C zu 1 Einheit Thrombin bei 37 C gemischt und unter kontinuierlichem Schütteln 3 h in Reaktion belassen wurden. Die Protein C-Aktivität wurde anschliessend mit chromogenem Substrat (S2366) bestimmt. Das aktivierte Protein C wurde anschliessend sterilfiltriert und durch Abfüllung und Lyophilisation zu einer pharmazeutischen Präparation fertiggestellt.
BEISPIEL 4: Antinozizeptive Wirkung
Die antinozizeptive Wirkung wurde unter Verwendung des Modells der entzündeten Rattenpfo- te nachgewiesen, indem die Schmerzschwelle bestimmt wurde, die durch lokale Verabreichung von Carrageenan in die Rattenpfote mit und ohne Gabe von Protein C induziert wurde.
Es zeigte sich, dass eine durch lokale Verabreichung von Carrageenan (i. pl.) induzierte Ent- zündung die Bradykinin-Sensibilität der Nozizeptoren der Haut bei der Ratte erhöht. Vgl. Kirchhoff et al., Neuroscience Lett. 111 :206-210 Eine subkutane Verabreichung von Carrageenan in die Rattenpfote erzeugt ein entzündliches Odem das durch Infiltration von Neutrophilen, Plas- maextravasation, Freisetzung und Synthese von Histamin, Bradykininen und Prostaglandin E2 ge- kennzeichnet ist. 1d
An sich ist das Rattenpfoten-Modell ein anerkanntes Modell für den Entzündungsvorgang und kann verwendet werden, um die damit verbundenen nozizeptiven Wirkungen zu untersuchen.
1d Somit ist das Rattenpfoten-Modell ein anerkanntes Modell zur Beurteilung der antinozizeptiven Wirkungen von Protein C und/oder des Aktivierungspeptids von Protein C gemäss der vorliegenden Erfindung.
Die Schmerzschwelle wurde analog der von Randall und Selitto beschriebenen Methode ge- messen (Randall LO und Selitto JJ : A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue, Arch. Int. Pharmacodyn. 111,409-419, 1957). Dazu wurde ein Quecksilbermanometer mit einer 10 ml Spritze verbunden, deren Kolben mit einem kurzen, geschossförmigen Zapfen ausge- rüstet war. Durch diese Spritze wurde steigender Druck auf die Rattenpfote ausgeübt (20 mmHg/ Sekunde). Die Schmerzschwelle wurde angegeben als jener Druck in mmHg, der notwendig ist, um eine Fluchtreaktion auszulösen.
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 350 g wurden ver- wendet. Die Entzündung wurde mittels 3 mg Carrageenan (Sigma Chemical Co., Kat. Nr. C-1013), aufgelöst in 100 1 isotoner Kochsalzlösung (0,9%), durch intraplantare (i. pl.) Injektion in die Rat- tenpfote erzeugt.
Die Schmerzschwelle wurde vor der Injektion (Kontrollwert) und stündlich bis zu 6 Stunden nach der Injektion von Carrageenan gemessen. Die Schmerzschwelle, die nach der Injektion von Carrageenan gemessen wurde, wurde ausgedrückt in Prozent des Kontrollwertes.
Soferne nicht anders angegeben, wurde Protein C intravenös in eine Schwanzvene unmittelbar nach der Injektion von Carrageenan injiziert. Das Injektionsvolumen betrug 2 ml/kg.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 schematisch dargestellt. Die Schmerzschwelle (ausgedruckt in Prozent des Kontrollwertes) ist auf der Ordinate und die Dosis von Protein C (in Einheiten pro kg) auf der Abszisse logarithmisch angegeben. Die Linien (a) und (b) entsprechen den Schmerz- schwellen, die ohne bzw. mit Carrageenan-Einfluss gemessen wurden. Die Kurve (c) zeigt, dass die unter Carrageenan-Einfluss reduzierte Schmerzschwelle durch Gabe von Protein C angehoben wird (antinozizeptiver Effekt). Aus Kurve (c), die den Dosisbereich von 8 E/kg (10 Tiere), 25 E/kg
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(15 Tiere), 80 E/kg (20 Tiere) und 250 E/kg (20 Tiere) bis 800 E/kg umfasst, ist ersichtlich, dass Protein C eine signifikante, dosisabhängige antinozizeptive Wirkung hat (p < 0,01 für 80 Einheiten/kg, p < 0,001 für 250 und 800 Einheiten/kg).
Diese antinozizeptive Wirkung von Protein C ist auch bei subkutaner Verabreichung nachweisbar. Weiters konnte nachgewiesen werden, dass eine aktiviertes Protein C und das Aktivierungspeptid von Protein C enthaltende Präparation ebenfalls eine dosisabhängige antinozizeptive Wirkung aufweist.
BEISPIEL 5 :
Es wurde weiters nachgewiesen, dass die intravenöse Verabreichung des nicht-selektiven #-Adrenozeptorblockers Propanolol die antinozizeptive Wirkung von Protein C aufhebt. Die Protein C-antagonisierende Wirkung von Propanolol wurde im Dosisbereich von 0,03 bis 1 mg/kg i.v beobachtet (vgl. Tabelle 1).
TABELLE 1
EMI6.1
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> Propanolol <SEP> auf <SEP> durch
<tb>
<tb> Protein <SEP> C <SEP> induzierte <SEP> Antinozizeption
<tb> Schmerzschwelle <SEP> * <SEP> n
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> allein <SEP> 21 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 15
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> (800 <SEP> E/kg) <SEP> 60 <SEP> 6 <SEP> % <SEP> 15
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> + <SEP> 28#5% <SEP> 10
<tb>
<tb> Propanolol <SEP> (1 <SEP> mg/kg)
<tb>
* (Die Ergebnisse sind in % der Schmerzschwelle ausgedrückt, 3 h nach Carrageenan-Verabreichung im Modell der Rattenpfote gemessen, wie oben beschrieben.)
Dieser Antagonismus ist jedoch nicht auf Propanolol beschränkt. Wie in Tabelle 2 für Pindolol gezeigt, antagonisieren auch andere #-Blocker dosisabhängig die Wirkung von Protein C.
TABELLE 2
EMI6.2
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> Pindolol <SEP> auf <SEP> durch
<tb>
<tb> Protein <SEP> C <SEP> induzierte <SEP> Antinozizeption
<tb> Schmerzschwelle <SEP> * <SEP> n
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> allein <SEP> 22 <SEP> #1,3% <SEP> 10
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> 65 <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP> 10
<tb>
<tb> (800 <SEP> E/kg)
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> + <SEP> 24#2,0 <SEP> % <SEP> 5
<tb>
<tb> Pindolol <SEP> (0,3 <SEP> mg/kg)
<tb>
* (Die Ergebnisse sind in % der Schmerzschwelle ausgedrückt, 3 h nach Carrageenan-Verab- reichung im Modell der Rattenpfote gemessen, wie oben beschrieben.)
Nach Ausschaltung des sympathischen Nerventonus durch chemische Sympathektomie mit Reserpin (7,5 mg/kg i.p., 18 bis 24 h) und alpha-Methyl-p-tyrosin (250 mg/kg i.p, 5 h) ist Protein C noch immer stark antinozizeptiv wirksam.
Aber auch an diesen sympathektomierten Tieren anta- gonisiert Pindolol den Effekt von Protein C völlig (Tabelle 3). Somit kann eine Beteiligung des präsynaptischen Sympathikus an der Wirkung von Protein C ausgeschlossen werden. Folglich ist die Wirkung von Protein C auf eine direkte Wirkung an postsynaptischen #-Adrenozeptoren zu- rückzuführen.
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TABELLE 3
EMI7.1
<tb> Ergebnisse <SEP> bei <SEP> mit <SEP> Reserpin <SEP> und
<tb>
<tb> alpha-Methyl-p- <SEP> Tyrosin <SEP> behandelten <SEP> Tieren
<tb> Schmerzschwelle <SEP> n
<tb>
<tb> NaCI <SEP> Kontr. <SEP> 61,0 <SEP> 6,8 <SEP> % <SEP> 5
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> allein <SEP> 34,0 <SEP> 10,3 <SEP> % <SEP> 5
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> (800 <SEP> E/kg) <SEP> 106,7 <SEP> #18,1 <SEP> % <SEP> 5
<tb>
<tb> Carrageenan <SEP> + <SEP> Protein <SEP> C <SEP> + <SEP> 33,3 <SEP> #4,6 <SEP> % <SEP> 5
<tb>
<tb> Pindolol <SEP> (1 <SEP> mg/kg <SEP> i.v.)
<tb>
* (Die Ergebnisse sind in % der Schmerzschwelle ausgedrückt, 3 h nach Carrageenan-Verab- reichung im Modell der Rattenpfote gemessen, wie oben beschrieben.)
Der Effekt von Protein C ist durch #-Sympathomimetika nachahmbar.
Beispielsweise führt Fe- noterol, entweder mit 5 mg/kg zu Versuchsbeginn oder mit 3 mg/kg zum Zeitpunkt "3 h" i.v. injiziert, zu einer deutlichen antinozizeptiven Wirkung. Somit kann man schliessen, dass die Stimulierung postsynaptischer #-Adrenozeptoren eine antinozizeptive Wirkung hervorruft.
Man nimmt an, dass die biochemische Wirkung der mutmasslichen #-sympathomimetischen Ef- fekte von Protein C durch Bindung an adrenerge #-Rezeptoren und durch Stimulierung des memb- rangebundenen Enzyms Adenylcyclase, welches die intrazelluläre Bildung von cAMP aus ATP katalysiert, hervorgerufen wird. cAMP aktiviert Protein-phosphokinasen, die ihrerseits durch Phos- phorylierung inaktive in aktive Enzyme überführen. Auf diese Weise werden z.B. Lipolyse und Gly- kogenolyse durch #-sympathomimetische Stimulierung gesteigert.
Die physiologischen Auswirkungen von Protein C aufgrund seiner #-sympathomimetischen Wir- kung sind vielfältig. Die Erhöhung von cAMP in den Thrombozyten führt zur Hemmung der Throm- bozytenfunktion und verhindert die Bindung von Thrombin an die Oberfläche von Thrombozyten.
Somit kann Protein C zum Einsatz kommen, um thrombozytenabhängige Blutgerinnselbildungen, insbesondere im arteriellen Gefässsystem durch Bindung an die thrombozytären #-Adrenozeptoren zu verhindern. Die #-adrenozeptor-stimulierende Wirkung von Protein C führt zu einem positiven inotropen Effekt am Herzen und wirkt auf die glatte Muskulatur (z. B. auf die Bronchiolen) erschlaf- fend. So kann aufgrund der #-sympathomimetischen Wirkung am Gefässsystem Protein C zur Be- handlung von peripheren Gefässerkrankungen eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass die intrakoronare Gabe von aktiviertem Protein C bei Hunden zu einer Steigerung des koronaren Blutflusses aufgrund der vasodilatatorischen Wirkung führt. Diese vasodilatatorische Wirkung von Protein C kann zur Behandlung der Hypertonie nützlich sein.
Entzündungshemmende Eigenschaf- ten können auch auf die #-sympathomimetische Wirkung von Protein C zurückzuführen sein. Die #-sympathomimetische Wirkung von Protein C führt zu einer Hemmung der Histaminfreisetzung in der Lunge. Aufgrund der #-sympathomimetischen Wirkung von Protein C kann Protein C als Toko- lytikum verwendet werden
BEISPIEL 6 : Wirkung des Antikörpers HPC-4 auf antinozizeptive Effekte
Es wurde eine Dosis-Reaktions-Kurve bestimmt für i.v. verabreichtes Protein C und Protein C (i.v.), dem eine Lösung von 1 mg/kg Antikörper HPC-4 (i.v.) unmittelbar folgte. Die Versuche wur- den im wesentlichen wie in Beispiel 4 angegeben durchgeführt.
Wie voranstehend besprochen und in U S. Patent Nr. 5 202 253 geoffenbart, welches durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen ist, ist HPC-4 ein Calcium-abhängiger monoklonaler Anti- körper, welcher eine Dodecapeptidsequenz spezifisch erkennt, die im Aktivierungsbereich von
EMI7.2
NR. 2). Der Antikörper wurde von seinen Erfindern bei der Amencan Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer HB-9892 am 2 November 1988 hinterlegt und ist bei ATCC erhältlich.
Dieser Antikörper bindet an das Aktivierungspeptid von Protein C (SEQ.ID.NR. 1), bindet nicht an aktiviertes Protein C und kann die Aktivierung von Protein C durch Thrombin-thrombomodulin verhindern Ausserdem wurde in WO 94/02172 eine therapeutische Verwendung von HPC-4 in vivo geoffenbart, welche vorsieht, dass der in vivo verabreichte Antikörper die Aktivierung von Protein C
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blockieren kann. Mit HPC-4 behandelte Hausschweine, welche danach einer Transplantat- Entnahme eines Teils der Hautschicht zur Erzeugung einer mikrovaskulären Wunde unterzogen wurden, erlitten im Vergleich zu mit Kochsalz behandelten Kontrolltieren einen signifikant geringe- ren Blutverlust.
Die Ergebnisse der antagonistischen Wirkung von HPC-4 auf die antinozizeptive Wirkung von Protein C in Versuchen unter Verwendung des Modells der Rattenpfote sind in Fig. 2 gezeigt. Die verarbreichte Dosis des Protein C in I.E. pro kg Körpergewicht ist auf der X-Achse aufgetragen. Die Y-Achse gibt die Schmerzschwelle an (wie oben). Die Dosis des Protein C ist als Punkt (.) ange- geben ; die Dosis von Protein C + HPC-4 ist als Rhombus (#) angegeben. Jeder Punkt repräsen- tiert den Durchschnitt von fünf mit Carrageenan behandelten Tieren.
Natriumchlorid-Kontrollen (kein Carrageenan verabreicht) repräsentieren negative Kontrollen, die keinen Schmerz zeigen, aufgrund von 13 Tieren (X# S-). x
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist die Dosis-Reaktions-Kurve von Protein C um einen Faktor von etwa 9 nach rechts verschoben, wenn HPC-4 mit dem Protein C verabreicht wird. Bei aktiviertes Protein C enthaltenden pharmazeutischen Präparationen verhindert HPC-4 die antinozizeptive Wir- kung nur, wenn freies Aktivierungspeptid (SEQ.ID.NR. 1) zusammen mit aktiviertem Protein C zugesetzt wird.
Die Balken unten im Schaubild (zwischen 15 - 20% Schmerzschwelle) repräsentieren Tiere, die in Abwesenheit von Protein C mit Carrageenan behandelt wurden.
Somit ist es klar, dass das Aktivierungspeptid von Protein C eine antinozizeptive Wirkung auf- weist.
BEISPIEL 7 : Herstellungdes Aktivierungspeptids von Protein C
Das Aktivierungspeptid von Protein C mit der Aminosäuresequenz NH2-Asp-Thr-Glu-Asp-Gln- Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-COOH (SEQ.ID.NR.1) wurde durch Festphasensynthese gemäss dem Verfahren von L. A. Carpino, J. Org Chem. 37 :3404 unter Verwendung der FMOC- Technik mit 9-Fluoren-methyloxy-carbonyl (FMOC) -Gruppen und Aktivierung mit Benzotnazol-1-yl- oxy-tris-pyrrolidinphosphonium-hexafluorophosphat (gemäss J. Martinez et al., J. Med. Chem.
28 :1874 (1988), J. Coste et al., Tetrahedron Letters 31 :205 und C.E. Olsen et al., Tetra- hedron Letters 32:7617 (1991)) synthetisiert. Die Peptidkette wurde schrittweise mittels eines Milligen 9050 Pep-Synthesizers synthetisiert. Danach wurde das Peptid geschnitten, um die FMOC-Gruppe zu entfernen, und unter Verwendung der Reversphasenchromatographie auf Nukleosil 115 C18 (5 ) gereinigt und mit einem Acetonitril/Wasser-Gradienten von 0 bis 70% Acetonitril in 30 min eluiert. Das Eluent enthielt 0,1% Trifluoressigsäure; die Fliessgeschwindigkeit betrug 1,5 ml pro min. Die das Aktivierungspeptid enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und getrocknet.
Die Identität des Peptids wurde mit dem automatisierten Edman-Abbau auf einem Applied Bio- systems 477A Protein Sequencer (P. Edman, Acta Chem. Scand 4:283-293 (1950), P. Edman, Acta Chem. Scand. 7 :700-701 P. Edman, Acta Chem. Scand. 10 :761-768 P. Edman et al., Eur Th. Biochem. 1 :80-91 und P. Edman et al., in Protein Seauence Determina- tion (S.B. Needleman, Hrsg. S. 232-279 (1975) Springer, Berlin, Heidelberg, New York) bestätigt.
Eine weitere Charakterisierung der Reinheit und Identität des Peptids erfolgte mittels 2 s 2Cf-Plas- ma-Desorptionsmassenspektrometrie gemäss dem Verfahren von D.F. Torgerson et al., Biochem.
Biophvs. Res. Commun. 60 :616 Die Molmasse von 1067,31 konnte unter Verwendung dieses Verfahrens verifiziert werden.
BEISPIEL 8 :
Peptide mit der Aminosäuresequenz von #-Endorphin (NH2-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu- Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly- Glu-COOH) (SEQ.ID.NR. 3), Met-Enkephalin (NH2-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COOH) (SEQ.ID.NR. 4) und Leu-enkephalin (NH2-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH) (SEQ.ID.NR. 5) wurden synthetisiert, gereinigt und charakterisiert, wie in Beispiel 7 beschrieben. Ausserdem wurden Fusionspeptide, die die Aminosäuresequenz des Aktivierungspeptids von Protein C, an #-Endorphin gebundenes Peptid, Met-enkephalin oder Leu-enkephalin enthielten, ebenfalls chemisch wie oben synthetisiert.
BEISPIEL 9 : Mikroverkapselung von Peptiden
Die wie in Beispiel 7 und 8 beschrieben synthetisierten Peptide wurden mittels der folgenden
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Vorgangsweise in Mikrokapseln gehüllt:
Eine Mischung aus 50 mol% 1,2-Di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 20 mol% 1,2-Di- palmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerin und 30 mol% Cholesterin wurde in Chloroform gelöst. Die Lipidkonzentration betrug 10 mg/ml. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck bei einer Temperatur von 30 C entfernt. Nach dem vollständigen Entfernen des Lösungsmittels wurde das Vakuum 30 min lang auf 30 mbar gehalten und weitere 6 h lang auf 0,1 mbar. Der resultierende Phospholipidfilm wurde bei Raumtemperatur durch Zugabe eines Puf- fers (20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7,4) hydratisiert.
Die so erhaltene Phospholipidsuspension wurde mit einem Peptid (z.B. SEQ.ID.Nr. 1 oder SEQ.ID.NR. 1 in Mischung mit oder fusioniert mit SEQ.ID.NR. 3-5) vereinigt, um eine 0,1 mg Peptid und 1,0 mg Lipid enthaltende Mischung herzustellen. Die Mischung wurde lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde wiederum in Wasser suspendiert, um eine Dispersion multilamellarer Vesikel zu bilden. Diese Dispersion wurde durch zwei übereinanderliegende 100 nm Polycarbonat-Filter mittels eines 10 ml-Thermo Barrel Extruders, Lipex Biomembranes Inc. Vancouver, Kanada, extru- diert. Die extrudierte Lösung enthielt Liposome mit Peptid, und freies Peptid. Freies Peptid wurde durch Chromatographie auf Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia) unter Verwendung eines Puffers enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,4, entfernt.
Die im Leervolumen enthaltenen Fraktionen enthielten das Liposome enthaltende Peptid und wurden gepoolt und lyophilisiert.
Die mikroverkapselte Peptidpräparation zur Verwendung in vivo wurde in 0,9% (Gew./Vol ) NaCI-Lösung dispergiert.
Eine solche Präparation enthält etwa 1-1000 g Phospholipid und etwa 1-1000 g Peptid Vor- zugsweise enthalten mikroverkapselte Peptidpräparationen zur Anwendung in vivo etwa 10- 1000 g Phospholipide zusammen mit etwa 1-100 g Peptid. Somit liegt das Verhältnis von Peptid zu Lipid im Bereich von etwa 1 :100 1 :1 wobei das bevorzugte Verhältnis im Bereich von etwa 1:100 bis 1:5 (Gew. /Gew.) liegt.
BEISPIEL 10 : Antinozizeptive Wirkung des Skyibirtunhdprpiyid von Protein C
Die antinozizeptiven Wirkungen des wie in Beispiel 7 hergestellten Aktivierungspeptids von Protein C (SEQ.ID.NR. 1) wurden im wesentlichen wie in Beispielen 4 und 6 beschrieben be- stimmt. Bei den Testtieren wurde das Peptid i.v. an Ratten in einer Konzentration von jeweils zwischen 3,125 g/kg und 50 g/kg in einem konstanten Injektionsvolumen von 2 ml/kg gleichzeitig mit intraplantarer (i.pl.) Verabreichung von Carrageenan in die Rattenpfote zur Herbeiführung einer Entzündungsreaktion und Schmerz verabreicht. In einer zweiten Gruppe von Versuchstieren wurde der Antikörper HPC-4 (1 mg/kg) unmittelbar nach der i.v.-Verabreichung des Peptids (SEQ.ID.NR.
1) i.v. verabreicht. Die antinozizeptiven Wirkungen der Peptid-(SEQ.ID.NR.1)-Verabreichung und deren Antagonismus durch den Antikörper HPC-4, die 6 h später gemessen wurden, sind in Fig. 3 gezeigt.
In Fig. 3 sind die Tiere, die nur das Peptid (SEQ.ID.NR. 1) erhielten, durch (A) repräsentiert, und jene, die das Peptid (SEQ.ID.NR. 1) und HPC-4 erhielten, durch (#) repräsentiert. Die X-Achse gibt die Menge des Peptids (SEQ.ID.NR. 1), in g/kg verabreicht, an. Die Y-Achse gibt die Schmerzschwelle in % an.
Jeder Punkt ist mit Standardabweichungen repräsentiert. Die Testgruppen waren wie folgt: (1) Drei (3) mg/100 1 Carrageenan wurden sechs Stunden vor i.v.-Verabreichung der folgen- den Mengen des Peptids (SEQ.ID.NR. 1) i.pl. verabreicht :
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Die Ergebnisse sind als volle Dreiecke (#)# S. A. aufgetragen.
(2) Drei (3) mg/100 1 Carrageenan wurde i.pl. gleichzeitig mit den folgenden Mengen des Pep- tids verabreicht, gefolgt von einer i.v.-Verabreichung von 1 mg/kg Antikörper HPC-4:
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Die Ergebnisse sind als volle Quadrate (3) # S. A. aufgetragen.
Die Kontrollgruppen waren wie folgt: (3) Unterer Balken: 3 mg/100 f Carrageenan (i.pl.) (25 Tiere) (4) Oberer Balken: 100 1 0,9% NaCI (i.pl.) (25 Tiere)
Aus obigem geht deutlich hervor, dass das Aktivierungspeptid von Protein C (SEQ.ID.NR. 1) eine antinozizeptive Wirkung hat, die vom Antikörper HPC-4 antagonisiert wird.
BEISPIEL 10 : Auswirkungen von Protein C auf die Gefässpermeabilität
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Beispiele 4 und 5 zeigen, dass die Schmerzschwelle der Ratte angehoben wurde, wenn Protein C dem Tier intravenös verabreicht wurde, was anzeigt, dass die Tiere weniger empfänglich für durch intraplantare Injektion von Carrageenan induzierten Schmerz wurden. Ausserdem wurden bei Verabreichung von Protein C an die Tiere die Anzeichen einer Entzündung, wie Odem, verringert.
Zusätzlich zeigte Beispiel 5, dass die antinozizeptiven und entzündungshemmenden Wirkungen von Protein C durch Antagonisten, wie Pindolol oder Propanolol, die beide #-Adrenoceptor-blockie- rende Arzneistoffe sind, beinahe eliminiert werden. Anderseits wurden die Wirkungen von Protein C durch das #-sympathomimetische Mittel Fenoterol nachgeahmt. Somit scheint Protein C die Sti- mulierung von #-Adrenozeptoren in vivo zu vermitteln, was eine weitere Verwendung als blutdruck- senkende Therapie durch Induktion der Dilatation der peripheren Gefässe oder eine Asthma-Thera- pie durch Dilatation der glatten Muskulatur der Bronchien anzeigt. Ausserdem kann Protein C zur Induktion positiver inotroper und chronotroper Effekte auf das Herz nützlich sein.
Bei den Rattenpfotenuntersuchungen zeigten die Ergebnisse einer histologischen Untersu- chung der Rattenpfoten nach Protein-C-Verabreichung an die Ratte eine reduzierte Anzahl peri- vaskulärer Leukozyten im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Somit scheint Protein C eine Wir- kung auf die Gefässpermeabilität zu haben, was die Wanderung von Leukozyten durch das Blutge- fäss in den perivaskulären Bereich ermöglicht.
Die Wirkung von Protein C auf kapillare Undichtheit bei Meerschweinchen wurde untersucht, um die Wirksamkeit von Protein C durch Antagonisierung verbesserter Gefässpermeabilität in nar- kotisierten Meerschweinchen zu bestätigen. Die Untersuchung wurde folgendermassen durchge- führt:
Nach intravenöser Verabreichung von Evans Blue erhielten narkotisierte Meerschweinchen entweder ein Protein-C-Konzentrat oder einen Formulierungspuffer. Danach wurden die-Versuchs- tiere mit Histamin oder Thrombin intrakutan zur Herbeiführung einer verbesserten Gefässperme- abilität, oder, als Kontrolle, mit Kochsalzlösung behandelt. Die Tiere wurden danach auf das Auftre- ten einer Entfärbung der resultierenden Quaddeln visuell untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 (Histaminbehandlung, Protein C oder Kochsalzlösung), Fig. 5 (Thrombinbehandlung, Protein C oder Kochsalzlösung) und Fig. 6 (Thrombinbehandlung, Puffer oder Kochsalzlösung) dargestellt.
Bei diesen Untesuchungen wurde eine farblose Quaddel als negative Beobachtung (d. h., keine Störung der Permeabilität) verzeichnet, wogegen eine Blaufärbung der Haut an der Injektionsstelle als positive Beobachtung (d. h., erhöhte Gefässpermeabilität) definiert wurde. Der Prozentsatz positiver Quaddeln innerhalb der gesamten, durch dieselbe Substanz erzeugten Quaddeln und somit innerhalb jeder Gruppe behandelter Tiere (n = 12 pro Behandlungsgruppe) wurde berechnet.
Die Ergebnisse in Fig. 4 geben den Prozentsatz (%) positiver (blau gefärbter) Quaddeln nach intrakutaner Injektion verschiedener Histaminmengen (auf der Y-Achse gezeigt) an. o und 0 zeigen die Wirkungen von i.v. verabreichter Kochsalzlösung (n = 12) bzw. i.v.-Verabreichung von 800 1.E. Protein C/kg Körpergewicht (n = 12).
Die Ergebnisse in Fig. 5 zeigen den Prozentsatz (%) positiver Quaddeln nach intrakutaner In- jektion verschiedener Thrombinmengen (auf der X-Achse gezeigt) an. # und 8 zeigen die Wirkun- gen von i.v. verabreichter Kochsalzlösung (n = 12) bzw. i.v.-Verabreichung von 800 1.E. Protein C/kg Körpergewicht (n = 12) an.
Die Ergebnisse in Fig. 6 zeigen den Prozentsatz (%) positiver Quaddeln nach intrakutaner In- jektion verschiedener Thrombinmengen (auf der X-Achse gezeigt) an. # und X repräsentieren i.v.- Kochsalzlösung (n = 12) bzw. i.v.-Puffer (n = 12).
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vorbehandlung mit Protein C wirksam war zur Verhinderung der Auswirkungen von sowohl Histamin als auch Thrombin auf die erhöhte Endothel-Permeabilität.
Es gab eine Verschiebung der jeweiligen Dosis-Reaktions-Kurven nach rechts um die Faktoren 4 im Fall von Histamin (Fig. 4) und 9 im Fall von Thrombin (Fig. 5). Der Formulierungspuffer, der in einem Volumen und einer Konzentration analog zur Dosis von Protein C gegeben wurde, hatte keine Auswirkung auf die Dosis-Reaktions-Kurve von Thrombin (Fig. 6).
SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION: (i) ANMELDER: IMMUNO Aktiengesellschaft
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(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERWENDUNG VON PROTEIN C (
TEM PROTEIN C ZUR HERSTELLUNG EINER PHARMAZEUT
RATION (ii) ANZAHL DER SEQUENZEN : (iv) KORRESPONDENZADRESSE: (A) ADRESSAT- SONN, PAWLOY, WEINZINGER & WOLFRAM (B) STRASSE: RIEMERGASSE 14 (C) STADT: WIEN (D) LAND:ÖSTERREICH (F) POSTLEITZAHL.1010 (v) COMPUTER-LESBARE FORM: (A) MEDIUMTYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IMB PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE : Windows 3,1, Word Windows 6,Oa (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION.
(A) TELEFON : International(+43 1) 512 84 05
National (01) 512 84 05 (B) TELEFAX : (+43 1) 512 98 05
National (01) 512 98 05 (2) INFORMATION ZU SEQ.ID.NR. 1 : (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA: (A) LANGE: 12 Aminosäuren (B) TYP : Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (ix) MERKMAL (A) NAME/SCHLÜSSEL.
Peptid (B) LAGE- 1..12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG- SEQ.ID.NR 1
Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gin Val Asp Pro Arg
1 5 10 (2) INFORMATION FUR SEQ ID NR. 2: (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA: (A) LANGE : 12Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (D) TOPOLOGIE. linear (ii) MOLEKÜLTYP Peptid (ix) MERKMAL- (A) NAME/SCHLÜSSEL Peptid (B) LAGE 1 .12
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(x1) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID.NR. 2
Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu lle Glu Gly Lys
1 5 10 (2) INFORMATION FÜR SEQ.ID NR 3: (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA- (A) LANGE- 31 Aminosäuren (B) TYP Aminosäure (D) TOPOLOGIE.linear (ii) MOLEKÜLTYP.
Peptid (ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL Peptid (B) LAGE. 1..31 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.ID.NR. 3
Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gin Thr Pro Leu
1 5 10
Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala lle ll Lys Asn Ala Tyr Lys
15 20 25
Lys Gly Glu
30 (2) INFORMATION FÜR SEQ.ID NR 4: (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA: (A) LÄNGE : 5Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (D) TOPOLOGIE linear (ii) MOLEKÜLTYP. Peptid (ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL Peptid (B) LAGE 1.5 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.ID NR 4
Tyr Gly Gly Phe Met
1 5 (2) INFORMATION FÜR SEQ.ID.NR. 5.
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA (A) LANGE: 5 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (D) TOPOLOGIE linear (11) MOLEKULTYP: Peptid (ix) MERKMAL (A) NAME/SCHLUSSEL. Peptid
<Desc/Clms Page number 13>
(B) LAGE: 1..5 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.ID.NR. 5
Tyr Gly Gly Phe Leu
1 5
PATENTANSPRÜCHE: 1. Verwendung des Aktivierungspeptids von Protein C für die Herstellung einer Zusammen- setzung zur Behandlung und Verhinderung von Schmerzen.