WO2000039290A2 - Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft - Google Patents

Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft Download PDF

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WO2000039290A2
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fragment
hyaluronate
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Peter-Jürgen Müller
Jörg-Hermann Ozegowski
Albert Härtl
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02001—Hyaluronate lyase (4.2.2.1)

Definitions

  • the intima On the inner wall of the artery, the intima, accumulate in humans as well
  • Mammals remove hydrophobic plaques with increasing age or with pathological conditions, which lead to hardening of the arterial walls, to lesions and to a reduction in the inner lumen by the formation of a neointima in the vessels.
  • pathological phenomena such as cardiac arrhythmias, thrombus formation and thromboses, cerebal infarcts, cerebral thromboses,
  • holoenzyme a complete enzyme (holoenzyme) and / or a novel, smaller enzyme fragment that can be produced from this enzyme in the pharmaceutical formulations according to the invention.
  • the proposed holoenzyme is a hyaluronate lyase and the fragment also has hyaluronic acid-splitting activity. This activity leads above all to a preferred breakdown of hyaluronic acid.
  • the invention relates to new enzyme fragments produced by a special enzymatic degradation process.
  • hyaluronic acid belongs to the glycosaminoglycans.
  • Glycosaminoglycans are found in the tissues of all vertebrates.
  • Hyaluronic acid is particularly present in the intercellular matrix, the skin and the cartilage, as well as in body fluids such as the synovial fluid and the aqueous humor of the eyes.
  • Hyaluronic acid has the property of binding water with the formation of viscous, hydrocoid solutions and of forming complexes that are difficult to dissolve with strongly basic proteins. It consists of glucuronic acid and acetylated glucosamine, which are connected by ß- (l-3) - glycosidic bonds. These disaccharide units are in turn connected to one another by glycosidic ⁇ - (1-4) bonds.
  • the hyaluronic acid is split by enzymes, which are summarized with the umbrella term hyaluronidases.
  • hyaluronidases describes - incorrectly in an enzymologically systematic sense - three different hyaluronic acid-cleaving enzyme types (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, (1961)).
  • endohydrolases that hydrolytically cleave the ⁇ - (1-3) bonds with the addition of water. They include the majority of hyaluronidases from higher organisms, for example those used medically Bovine testicular hyaluronidase.
  • hyaluronate glycan hydrolases EC 3.2.1.35/36
  • Another type is the endo-ß-hyaluronidase from the leech, which cleaves the ß- (l-4) -binding highly specifically. All of the enzymes mentioned are hydrolytic hyaluronidases or hyaluronidases in the narrower sense.
  • the third type of enzyme cleaves the hyaluronic acid in the ß (1-4) bonds according to an elimination mechanism with the formation of a double bond in the (4-5) position on the glucuronic acid.
  • Hyaluronate lyases are therefore not hyaluronidases.
  • Hyaluronate lyases occur in microorganisms. For example, they are found in Streptomycetes and other bacteria. Their common characteristic is their narrow specificity towards hyaluronic acid. Other glycosaminoglycans are usually split to a negligible extent (J.-H. Ozegowski et.
  • microbial hyaluronate lyases are high molecular weight proteins with molecular weights between 1 16,000 to 120,000 daltons. These high molecular hyaluronate lyases are mostly relatively sensitive to denaturing agents and extreme physiological conditions. Particularly in the preparation of pharmaceutical and veterinary formulations, there can be considerable loss of activity due to denaturing processes. In addition, the diffusion ability of the relatively large enzymes is significantly less than the diffusion ability of smaller molecules. Theoretically, this limits the diffusion and thus the promotion of penetration or diffusion of the high-molecular hyaluronate lyases (holoenzymes) into the tissues, for example also into the plaques. A lower immunogenic effect is likely.
  • Bovine testicular hyaluronidase is used to make animal and human tissues more permeable. It serves as a penetration or absorption accelerator for subcutaneously or intramuscularly administered drugs or to facilitate the perfusion of larger quantities of fluids and faster ones Regression of edema.
  • bovine testicular hyaluronidase can be used to therapeutically influence arterial vascular diseases in humans, in particular to improve the blood flow to peripheral vessels (e.g. Thurnherr and Koch, cited at Wolff: Treatment results with intravenous magnesium comp./Hylase -Mixed injections in arteriopathies of the pelvic type in stage II. Medical training, 1972, 66, 446 - 447).
  • Wolff reported that hyaluronidase from bovine testicles with the simultaneous use of magnesium ions, administered intravenously (mixed injection, three times 300 IU per week for 6 weeks), improved the blood flow to the vessels in 90% of the examined patients with stage II arteriopathy.
  • Grosshennig in: Results of the treatment of degenerative arterial vascular diseases of the lower extremities with intravenous administration of magnesium compositum "Scharffenberg” and hyaluronidase. Dtsch. Ges.-ève, 1965, 21, 869 - 872) performed a similar mixed treatment for degenerative vascular diseases of the lower extremities as well as patients with high-seated pelvic-type degenerative vascular obliterations with "impressive success.” He gave 300 IU three times a week for about 5 weeks. In some severe cases, 30 injections were made.
  • follow-up examinations were 6-8 weeks after the end of treatment no deterioration of the achieved state can be determined.
  • Gottlieb also proposed (US 3,708,575) to treat vascular diseases in humans such as cardiac arrhythmias, thromboses, cerebral infarcts, cerebral thromboses and heart attacks, in particular atherosclerosis, with this hyaluronidase or hyaluronate lyase.
  • An isotonic sterile solution for example 10,000 IU / ml, is injected intravenously, intraarterially or intrathecally.
  • the enzyme was obtained from animal material in accordance with the information in the property right (US 3,708,575). From the description of the invention it is clear that the enzyme (s) used is the use of testicular hyaluronidases.
  • hyaluronidase from bovine testicles is suitable for increasing the permeability of blood vessels to the blood stream by dissolving, breaking down or rendering atheromatous deposits and possibly constituents of blood clots and blood thrombi.
  • the constituents of the blood thrombus that may be detached could be plaque particles that have detached from the intima and on which a blood thrombus has formed.
  • hyaluronidase of animal origin in particular hyaluronidase from bovine testicles, is that the enzyme carries with it the risk of transmitting viruses, BSE (bovine spongioform encephalopathy) and other infectious material due to its origin.
  • BSE bovine spongioform encephalopathy
  • Another disadvantage is that in the production of hyaluronidase to remove impurities in the form of ingredients, in particular foreign proteins, a very large amount of cleaning is required. In order to obtain sufficient amounts of hyaluronidase, correspondingly large amounts of starting material have to be collected under conditions in which spoilage is prevented.
  • the hyaluronidase from mammalian testicles also hydrolyzes the sulfated glycosaminoglycans present in the vessel wall.
  • Dermatan sulfate or chondroitin sulfate, heparin and heparan sulfate are believed to prevent blood clots from attaching to the inner wall of the vessels due to their anticoagulant properties.
  • the hydrolysis of these compounds increases the secondary formation of blood clots at the intima and thus the testicular hyaluronidases could also have an unfavorable side effect. Sawyer et. al.
  • EU 193330 B1 describe the production and use of a special endo-ß-glucuronidase with a molecular weight of 28,500 D from a leech to stimulate the flow of physiological fluids in eye diseases.
  • This enzyme is highly specific for hyaluronic acid and differs from one Known endo-ß-glucuronidase from the leech (Hirudo medicinalis) due to its higher stability at higher temperatures and extreme pH values.
  • the aim of the present invention is to avoid the disadvantages of the previously proposed use of hyaluronidases of animal origin as a plaque-degrading enzyme by using enzymes obtained from microorganisms in suitable galenical formulations for therapy and for preventing atherosclerotic vascular changes.
  • Microbial enzymes can in principle be obtained in a simple way through the possibilities of their biotechnological production.
  • the use of the fragments is expected to be more stable in the pharmaceutical formulations, to be less immunogenic when used and to penetrate better.
  • the enzymes provided according to the invention should not negatively influence the living mammal organism when longer enzyme activities are applied over longer periods of time.
  • the enzymes are also said to cause only a limited cleavage of the sulfated glycosaminoglycans, in order on the one hand to bring about a dissolution of plaques and of constituents of blood clots that is comparable to hyaluronidase from animal testes.
  • the severely limited breakdown of the sulfated glycosaminoglycans in the intima should not lead to the increased risk of secondary blood clots forming due to the lack of sulfated glycosaminoglycans.
  • the invention is therefore based on the object of finding plaque-degrading enzymes of microbial origin which, as constituents in pharmaceutical formulations, have a comparable or better effect with hyaluronidase from bovine testicles in dissolving plaques or in reducing the inner vessel walls occupied by plaques and of components of the thrombus and blood clots when used in the blood vessel system, have a favorable effect on the course of the disease in vascular diseases, are not toxic and have no other negative effects when used in humans or animals as an injection.
  • the present invention accordingly includes pharmaceutical formulations suitable for the treatment of vascular diseases which occur directly or as a result of atheromatous plaque formation.
  • the invention also includes a new enzyme fragment, its production and use.
  • a pharmaceutical formulation which preferred one or more bacterial enzymes with the activity of a hyaluronate lyase (EC 4.2.2.1.),
  • a hyaluronate lyase EC 4.2.2.1.
  • one of the microorganisms of the genus Streptocoecus of the generally available species Streptocoecus agalactiae or Streptocoecus equisimilis when fermented into the submerged medium, contains hyaluronate lyases excreted or contains an enzyme fragment produced from the hyaluronate lyases, in vitro from the isolated plaque pads obtained from the mammalian atheromatous vessels, and from or dissolves thin plaque sections.
  • the fragments according to the invention can be produced by proteolytic digestion of the bacterial hyaluronate lyases with proteases, preferably a protease, which cleaves the C-terminal peptide bond from aromatic amino acids.
  • the hyaluronate lyase with a molecular weight of 1 16,000 daltons from Streptocoecus agalactiae is cleaved into an enzymatically active hyaluronate lyase fragment.
  • the fragment has a molecular weight of 84,000 - 86,000 daltons.
  • the fragment is distinguished by a significantly higher stability in aqueous solutions and against denaturing agents.
  • the fragment has a specific activity between 400,000 IU / mg to 800,000 IU / mg and thus has the same or even a higher specific activity than the holoenzyme with a specific activity of 400,000 IU / mg.
  • the invention accordingly relates to a pharmaceutical formulation containing a hyaluronate lyase of microbial origin as a holoenzyme, a hyaluronate-cleaving fragment thereof or a mixture of both forms, in each case in highly purified form, and at least one stabilizer and / or pharmaceutically acceptable carrier or auxiliary and optionally additionally pharmaceutically acceptable Dilution * gos u medium.
  • the pharmaceutical formulations according to the invention are primarily for the treatment of vascular diseases, such as cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarcts, cerebral thromboses, coronary thromboses and cardiac infarcts, suitable for mammals (humans and animals) due to the presence of atheromatous plaques in the blood vessels.
  • vascular diseases such as cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarcts, cerebral thromboses, coronary thromboses and cardiac infarcts
  • mammals humans and animals
  • compositions produced according to the invention are, in particular, injection preparations for intravenous or intraarterial injections, which consist of an isotonic, sterile aqueous solution of the highly purified enzyme protein of the holoenzyme and / or the fragment or a defined mixture of both active enzyme species, the enzyme activities being between 20,000 and 4,000. 000 IU / ml.
  • the enzyme proteins are advantageously used in the form of a freeze-dried solid which generally contains stabilizing additives.
  • Stabilizing additives can be, for example, sodium chloride, glucose, magnesium salts, polyvinylpyrrolidone, amino acids, albumin, in particular ovalbumin, and its hydrolysates or cereal proteins and their hydrolysates.
  • the amount of hyaluronate lyase and / or its fragment used in an injection is between 2,000 and 12,000 IU / kg body mass of the treated mammal or human.
  • the enzyme or fragment used according to the invention shows no negative
  • Holoenzyme is that due to its smaller size, it penetrates the solid layers of the plaques faster than the holoenzyme and thereby causes them to be destroyed more quickly.
  • the invention is illustrated using the example of the enzyme from the generally accessible Streptocoecus agalactiae.
  • the enzyme has the advantageous property that it is inhibited by sulfated glycosaminoglycans, such as sulfated hyaluronic acid.
  • the purification processes listed below are used to obtain the hyaluronate lyase as a highly purified enzyme for injection purposes, or to purify purified hyaluronate lyase with the specific-acting protease to form the fragment.
  • the specific-acting protease can be used, without restricting the invention, for example the acidic metalloprotease MO / 2 (DD 270924), which can be obtained from the microorganism Streptomyces hygroscopicus AP40.
  • This protease is characterized by a molecular weight of approximately 14,000 kD and an isoelectric point between 3.85 to 4.0.
  • the following detailed description of the production of the holoenzyme as well as that of the fragment, in particular the order of the purification steps, has an exemplary character and is not intended to limit the scope of protection.
  • the production of the high-purity hyaluronate lyase and the highly purified fragment in one galenical formulation suitable for injection can be carried out, for example in relation to the sequence and also the selection of the cleaning steps, in a manner which does not restrict the scope of protection of the invention, as follows.
  • the fermentation of the microorganism takes place in a stirred fermenter with constant pH at an acidity of pH 6.5 to 7.5.
  • the lactic acid formed during the fermentation is neutralized by adding dilute sodium hydroxide solution.
  • the medium consists of inorganic salts, yeast hydrolyzate, optionally casein peptone or soy peptone and glucose. After about 20 hours of fermentation, the cells are separated. The cell mass is discarded.
  • the culture filtrate is concentrated and purified in an ultrafiltration device.
  • the cut-off limit of the ultrafilter module is between 30 and 50 kD.
  • the result is a pre-cleaned enzyme solution which has to be subjected to further cleaning steps before it can be used as an injection.
  • the cleaning steps and the use of pyrogen-free additives ensure that the injection product is free of pyrogens.
  • the enzyme After increasing the ionic strength by adding ammonium sulfate to a saturation of 40%, the enzyme is adsorbed on phenylsepharose. The desorption then takes place with a neutral, buffered aqueous solution which contains 25% ammonium sulfate, based on 100% saturation. After a dialysis step, the solution is mixed with Q-Sepharose (Pharmacia) to remove impurities. This is followed by specific adsorption on a dye, for example aminophenyloxamic acid. The final cleaning together with the determination of the molecular weight can consist of molecular weight chromatography on Superdex (Pharmacia).
  • Streptocoecus equisimilis as an enzyme generator, the cleaning step by adsorption on the dye is not necessary.
  • This enzyme acts as an exoglycanase, its isoelectric point is between pH 4.5 and 4.8 and it is only inhibited to a very small extent by sulfated glycosaminoglycans.
  • the partial digestion of the holoenzyme into the fragment takes place with immobilized or also with non-immobilized specific protease.
  • An advantage of the implementation with immobilized protease is that the digestion can be carried out specifically and without contamination by the protease itself. In the case of direct reaction with added protease, an inactivation step of the protease, the separation of the protease protein and a high purification must take place after digestion.
  • the enzyme fraction can be used to produce the fragment in the following way:
  • the specifically cleaving protease MO / 2 is bound in a known manner, for example to Sepharose.
  • the immobilized protease is mixed for example at pH 7.5 and a temperature of 37 ° C.
  • the holoenzyme has a specific activity of approximately 400,000 IU / mg and the specific activity of the fragment is approximately between 400,000 to 800,000 IU / mg.
  • the stabilizers for example albumin, preferably ovalbumin and inorganic salts.
  • digestion proteases are used which cleave the C-terminal peptide bond of aromatic amino acids.
  • the metalloprotease MO / 2 is used, which is produced from the culture filtrate from Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40).
  • MO / 2 is a metalloenzyme with Co ++ in the active center (DD 270 924).
  • the proteases are preferably used in purified form.
  • the protease MO / 2 is purified, for example, by chromatography on phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S100 with an enrichment factor of 20.
  • the enzyme hydrolyzes natural polypeptides such as casein, hemoglobin, bovine serum, albumin and ovalbumin.
  • An advantage of using protease MO / 2 is that the enzyme cleaves proteins very specifically or has a very low general digestive activity towards proteins. The enzyme almost exclusively cleaves only the peptide bonds of the C-terminal residue from the aromatic amino acids. It has an esterolytic activity against N-benzoyl-L-proline nitroanilide and pronounced milk-digestion properties.
  • the protease MO / 2 is optionally bound to suitable insoluble immobilization supports and used in this form to cleave the holoenzyme.
  • suitable insoluble immobilization supports used in this form to cleave the holoenzyme.
  • the fragment is produced by partial digestion or partial proteolytic degradation of the holoenzyme with a protease which acts in a cleavage-specific manner and which cleaves the peptide bond preferably on the C-terminal side of the aromatic amino acids.
  • the highly pure enzyme solutions or the fragment-containing fractions can be used as injection preparations after concentration with partial removal of water and optionally with the addition of stabilizers, auxiliaries or pharmacologically active substances and sterile filtration.
  • the highly pure enzyme or fragment solution can also be freeze-dried after sterile filtration, for example with the addition of 5 mM magnesium chloride and 1% egg albumin.
  • the freeze-dried enzyme or fragment can be dissolved with saline as an isotonic injection.
  • the invention also relates to the use of a hyaluronate lyase of microbial origin, a hyaluronate-cleaving fragment thereof or a mixture of both forms for the treatment of vascular diseases, such as cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarcts, cerebral thromboses, coronary thromboses and cardiac infarcts, which indicate the presence of atheromatous plaques in blood vessels are attributable to mammals and humans.
  • vascular diseases such as cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarcts, cerebral thromboses, coronary thromboses and cardiac infarcts
  • Another object of the present invention relates to fragments of bacterial hyaluronate lyases with hyaluronate lyase activity.
  • Example 1 The fermentation is carried out in a stirred fermentor with a gross filling volume of 30 l.
  • the working volume is 20 1.
  • the trunk preservation is carried out with a cryopreserve (mast diagnostics).
  • a ball covered with stock material is placed in an agar slant tube with bacterial agar and brought into contact with the agar surface by movement (culture A).
  • the rolled ball is then placed in 3 ml of a heart-brain broth (culture B) for sterile control. Both cultures are cultivated as stand cultures for 24 h at 37 ° C.
  • 2 x 50 ml of a medium containing 5 g / 1 casein peptone and 10 g / 1 yeast extract (Difco) are filled into two 100 ml steep-breast bottles and sterilized at pH pH 7.0.
  • 5 ml Eagle medium is added shortly before inoculation. The inoculation is carried out by washing away the slant agar tube Culture A with the culture solution from Culture B.
  • the steep breast bottles are cultivated with shaking (150 rpm) at 37 ° C for 24 h.
  • the medium of the main culture consists of 20 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 pancreatic peptone and 25 g / 1 glucose.
  • the glucose is specially autoclaved.
  • the inoculation is carried out with one liter of the second pre-culture.
  • the fermentation parameters are 34 ° C., pH 7.0, aeration via head space (25 1 / min air) and stirring speed 150 rpm.
  • the pH is kept constant by titration with a 40% sodium hydroxide solution. Glucose is added manually so that the glucose concentration does not drop below 5 g / 1.
  • the cultivation is ended after 20 hours.
  • the proteins precipitating at this concentration are separated off by clear filtration using a filter aid and the clear concentrate is applied to a 2.5 x 20 cm phenylsepharose column previously equilibrated with 40% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5. After washing with a 35% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5, the hyaluronate lyase is eluted with a 25% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5. The eluted fractions are combined and adjusted to a saturation of 80% by adding solid ammonium sulfate. The precipitate is collected and dissolved in 100 ml of 0.03 M Tris buffer pH 8.2 and dialyzed against the same buffer.
  • the dialyzed crude hyaluronate lyase solution is then passed through an equilibrated Q-Sepharose column of 2.2 x 15 cm.
  • the hyaluronate lyase is in the run.
  • the run is saturated to 80% by adding solid ammonium sulfate.
  • the precipitated protein is collected, dissolved in 0.05 M Tris buffer pH 8.7 and freed of ammonium sulfate on a Sephadex G 10 column.
  • the solution containing hyaluronate lyase, thus equilibrated, is applied to an appropriately equilibrated affinity column (0.8 cm ⁇ 10 cm) of N- (p-aminophenyl) oxamic acid agarose and eluted with 0.1 M NaCO 3 solution pH 9.7.
  • the eluted fractions containing hyaluronate lyase are combined and precipitated by saturation to 80% with ammonium sulfate.
  • the precipitate is collected, dissolved in 1 ml 0.1 M Tris buffer pH 7.5 and applied to a Superdex 200 column (16 x 60).
  • the hyaluronate lyase protein band at 116,000 D is collected, dialyzed against 0.02 M Tris buffer pH 7.5 containing 0.005 M MgCl 2 . 10 mg hyaluronate lyase with a specific activity of 400,000 IU / mg are obtained.
  • the dialyzed hyaluronate lyase solution is added to ovalbumin in a concentration of 1% and the solution is dried lyophilically.
  • a microorganism of the species Streptocoecus ec ⁇ tisimilis is precultivated, cultivated and the enzyme is obtained in pure form.
  • the work-up step of purification over the N- (p-aminophenyl) oxamic acid agarose is omitted.
  • Fragment was precipitated by saturation on 80% ammonium sulfate, collected and purified by molecular weight chromatography. The active fragment fractions are pooled, dialyzed against 0.05 M Tris buffer and lyophilized with the addition of albumin. The fragment has a specific activity of 460,000 IU / mg.
  • 0.5 ml solution of the hyaluronate lyase fragment (Example 4) are added to 0.5 ml 0.1 M acetate buffer pH 6.0 and diluted in the form of a geometric series. Then 0.5 ml of a hyaluronic acid solution containing 0.2 mg hyaluronic acid / ml 0.1 M acetate buffer pH 6.0 is added to each dilution. This mixture is then incubated at 37 ° C for 30 minutes. The enzyme reaction is stopped by diluting each with 2ml of a 2.5%
  • Cetyltrimethylammoniumbromidants in 2% sodium hydroxide solution is added. After standing at room temperature for 20 minutes, the turbidity is measured in each dilution at 600 nm in 1 cm cuvettes and the amount of split hyaluronic acid is determined via a calibration curve. Five international units (IU) of the hyaluronate lyase fragment split 16 ⁇ g hyaluronic acid / min.
  • Holoenzyme solution drops to 60% during this period, while the activity of the fragment solution is 95% of the activity of the starting solutions.
  • the standard test approach described above is varied as follows. 300 to 500 ⁇ l of sulfated hyaluronic acid and 200 ⁇ l of hyaluronic acid are added to 1.5 to 1.8 ml of buffer and the reaction is started by adding hyaluronate lyase. The hyaluronate lyase is partially non-competitively inhibited. The Ki value is 5.5 x 10 "4 mg / ml.
  • Hyaluronate lyase shows a linear increase in absorbance at 232 nm, from whose increase the activity can be calculated.
  • An extinction coefficient of e 6.0 x 10 3 lxmor'cm "1 is used as a basis for the ⁇ 4.5 -unsaturated uronide formed (J. Ludowig: The mechanism of hyaluronidases. JBC 236, 333-339 (1991)). 2.
  • a hyaluronate lyase solution is prepared from a stock solution (50,000 U / ml) by diluting 1:50. 0.5 ml of hyaluronate lyase solution are added to 0.5 ml of 0.1 M acetate buffer pH 6.0 and diluted in the form of a geometric series. Then 0.5 ml of a hyaluronic acid solution containing 0.2 mg / ml 0.1 M acetate buffer pH 6.0 is added to each dilution. This mixture is then incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • the enzyme reaction is stopped by adding 2 ml of a 2.5% cetyltrimethylammonium bromide solution in 2% sodium hydroxide solution to each dilution. After 20 minutes at room temperature, the turbidity is measured in 1 cm cuvettes in each dilution at 600 nm and the amount of split hyaluronic acid is determined via a calibration curve. 5 international units (IU) hyaluronate lyase split 16 ⁇ g hyaluronic acid / min.
  • IU international units
  • hyaluronate lyase (holoenzyme) are dissolved in 1 ml 0.05 M phosphate buffer pH 7.0 and the temperature in the thermostat is 37 ° C. 0.25 g of a specifically cleaving protease sepharose with a proteolytic activity of 0.1 Kunitz units / mg are added to this solution. After 15 minutes, the insoluble protease sepharose is separated off and the resulting fragment is precipitated from the solution to 80% by saturation with ammonium sulfate. After 18 hours, the sediment is separated off and dissolved in 0.05 M Tris buffer pH 7.5. The fragment is purified by molecular weight chromatography on Superdex 200. The active fractions are combined, dialyzed against 0.05 M Tris buffer and lyophilized with the addition of albumin.
  • plaque pieces taken from the neointima of the internal carotid artery in humans are dissolved in solutions of hyaluronate lyase (approximately 20,000 IU in 1 ml Tris buffer , 10 mM, pH 7.0) and incubated for 12 hours at room temperature. There is a partial dissolution of the previously sharp phase boundaries of the plaque pieces and a release of suspended, finely divided material. In parallel, plaque pieces were only treated with Tris buffer. There are no signs of disintegration.
  • plaque pieces taken from the neointima of the internal carotid artery in humans were dissolved in the fragment (about 15,000 IU in 1 ml Tris buffer, 10 mM, pH 7.0). suspended and incubated for 12 hours at room temperature. There is an extensive dissolution of the previously sharp phase boundaries of the plaque pieces and a release of suspended, finely divided material. In parallel, plaque pieces were only treated with Tris buffer. There are no signs of disintegration.
  • Rabbit Ibm WHHL (Watanabe heritable hyperlipidemic). The rabbit has been bred by Y. Watanabe, Kobe University, Japan since 1981 and came in 1992 as
  • the Watanabe rabbit has an inherited hyperlipidemia caused by an inherited deficit in LDL receptors. As a result of hypercholesterolemia (> 400 mg / 100 ml plasma), all animals develop prematurely
  • Aortic arteriosclerosis Aortic arteriosclerosis.
  • the 10 rabbits were randomized according to gender and then identified with the numbers 1 to 10.
  • 4 control rabbits (1 - 4) were each given 20 ml of pyrogen-free 0.9% NaCl solution intravenously (IV) within 1 hour.
  • the 6 experimental animals (5-10) were each given 30,000 IU of highly purified hyaluronate lyase per hour with the infusion volume of 20 ml of pyrogen-free 0.9% NaCl solution. injected. This corresponds to a dosage of 10,000 IU / kg body mass
  • BM body mass
  • body temperature body temperature
  • clinical-chemical parameters cholesterol, triglycerides, and amylase
  • Hyaluronate lyase-treated changes only slightly during the treatment period from November 18, 1996 to February 3, 1997
  • the body temperature changes were in the Fluctuation range from - 0.3 to + 1.2 ° C. No noticeable differences between control and hyaluronate lyase-treated rabbits were measured.
  • the serum cholesterol values of the control animals did not change significantly as a result of the 0.9% NaCl infusions. In one before four (1/4) animals, the cholesterol concentration in the serum was halved.
  • the z. T. very high Se mtriglycerid values were between 570 and 740 mg / dl and the hyaluronate lyase-treated rabbits were between 200 and 290 mg / dl.
  • the Aa were in 2/4 control rabbits. pulmonalis heavily covered with plaques and 2/4 mild to moderate in 1/6 hyaluronate lyase rabbits, the pulmonary aorta was high, in 2/6 mild to moderate plaques and 3/6 no plaques.
  • Hyaluronate lyase-treated Watanabe rabbits showed no noticeable differences during two treatment cycles with 10 infusions each, so that it can be concluded that the infusion fluids are well tolerated.
  • a subjective assessment of the macroscopic aortic material shows that the extent of the atheromatous deposits in the 4 Watanabe rabbits treated with 0.9% NaCl solution appears to be more severe than in the 6 Watanabe rabbits treated with microbial hyaluronate lyase.
  • Highly pure concentrated enzyme solution is diluted with so much saline that the resulting solution contains 0.9% saline and 10,000 IU / ml hyaluronate lyase.
  • the solution is sterile filtered through a sterile filter with a pore size of 0.2 ⁇ m. 1 ml of this solution is filled into ampoules under sterile conditions. The ampoules are freeze-dried under sterile conditions and under sterile
  • Highly pure concentrated enzyme solution is diluted with a solution of magnesium nicotinate and magnesium adipinate (magnesium compositum "Scharffenberg") so that the resulting solution contains 25 mg magnesium nicotinate and 88 mg magnesium adipinate and 10,000 IU / ml hyaluronate lyase.
  • the solution is ampouled according to example 13.
  • a solution of a high purity hyaluronate lyase is diluted with a solution of table salt and egg albumin so that the solution is 40,000 IU / ml, 0.9% table salt and 1% egg albumin.
  • the solution is processed as described in Example 13.
  • a solution of a high-purity hyaluronate lyase is diluted with a solution of sodium chloride and soy protein hydrolyzate so that the solution is 40,000 IU / ml, 0.9% sodium chloride and 1% of a hydrolyzate made from soy protein.
  • the solution is processed as described in Example 13.
  • a solution of a highly pure fragment from the holoenzyme of Streptocoecus agalactiae is diluted with a solution of table salt and egg albumin so that the solution is 40,000 IU / ml, 0.9% table salt and 1% egg albumin.
  • the solution is processed as described in Example 13.
  • EXAMPLE 18 A highly pure concentrated solution of a fragment from Streptocoecus agalactiae is diluted with so much saline and magnesium chloride that the resulting solution contains 0.9% saline and 100,000 IU / ml lyase activity.
  • the solution is sterile filtered through a sterile filter with a pore size of 0.2 ⁇ m. 1 ml of this solution is filled into ampoules under sterile conditions. The ampoules are freeze-dried under sterile conditions and closed under sterile conditions. 1 ml of sterile distilled water is added before the injection.

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Abstract

Die Erfindung beinhaltet pharmazeutische Formulierungen, welche insbesondere geeignet sind als Injektionspräparate mit einer therapeutischen Anwendung bei Gefässkrankheiten, die als Folge von atheromatösen Ablagerungen auf den Innenwänden der Arterien auftreten. Die Injektionspräparate enthalten eine Hyaluronatlyase bakterieller Herkunft bzw. ein aus diesem Enzym hergestelltes hyaluronatspaltendes Enzymfragment. Das hyaluronatspaltende Enzymfragment der bakteriellen Hyaluronatlyase ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Es kann hergestellt werden, indem das Holoenzym mit einer spezifisch spaltenden Protease behandelt wird.

Description

Pharmazeutische Formulierung enthaltend ein Hyaluronsäure-spaltendes Enzym mikrobieller Herkunft
Auf der Arterieninnenwand, der Intima, lagern sich bei Menschen als auch bei
Säugetieren mit zunehmendem Alter oder bei pathologischen Zuständen hydrophobe Plaques ab, die zu einer Verhärtung der Arterienwände, zu Läsionen und zu einer Verringerung des Innenlumens durch Bildung einer Neointima in den Gefäßen führen. Mit den Gefäßveränderung stehen pathologische Erscheinungen, wie Herzarry hmien, Thrombusbildung und Thrombosen, zerebale Infarkte, zerebrale Thrombosen,
Bluthochdruck und eine Verminderung der Blutversorgung in engem Zusammenhang.
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Formulierungen, welche die Eigenschaft aufweisen, bei intraarterieller oder intravenöser Anwendung das Ausmaß der mit Plaques belegten Flächen der Intima zu verringern bzw. deren Auswirkung auf den
Blutdurchfluß zu vermindern. Diese Wirkung steht in einem engen Zusammenhang mit der Anwesenheit eines kompletten Enzyms (Holoenzym) und/oder ein aus diesem Enzym herstellbaren neuartigen, kleineren Enzymfragments in den erfindungsgemässen pharmazeutischen Formulierungen. Das vorgeschlagene Holoenzym ist eine Hyaluronatlyase und auch das Fragment besitzen Hyaluronsäure-spaltende Aktivität. Diese Aktivität führt vor allem zu einem bevorzugten Abbau \ on Hyaluronsäure.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung neue, durch einen speziellen enzymatischen Abbauprozeß hergestellte Enzymfragmente.
Hyaluronsäure gehört neben den Chondroitinsulfaten, dem Dermatansulfat, dem Heparin und dem Heparansulfat zu den Glycosaminoglycanen. Die genannten Glycosaminoglycane außer der Hyaluronsäure enthalten Sulfatgruppen (sulfatierte Glycosaminoglycane). Glycosaminoglycane kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure ist besonders in der interzellulären Matrix, der Haut und des Knorpelgewebes, sowie in Körperflüssigkeiten, wie der Gelenkflüssigkeit und dem Kammerwasser der Augen, vorhanden. Zusammen mit den anderen Glycosaminoglycanen ist sie in den Wänden der Blutgefäße und wahrscheinlich auch in den atheromatösen Ablagerungen bzw. Plaques auf den Arterieninnenwänden enthalten. Die Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokoUoider Lösungen zu binden und mit stark basischen Proteinen schwerlösliche Komplexe zu bilden. Sie besteht aus Glucuronsäure und acetyliertem Glucosamin, die durch ß-(l-3)- glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische ß-(l-4)-Bindungen verbunden. Die Hyaluronsäure wird durch Enzyme gespalten, die mit dem Überbegriff Hyaluronidasen zusammengefaßt werden.
Der Überbegriff Hyaluronidasen beschreibt - nicht korrekt in einem enzymologisch systematischen Sinn - drei unterschiedlich wirkende Hyaluronsäure-spaltende Enzymtypen (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, (1961)). Es sind einmal die Endohydrolasen, welche die ß-(l-3)-Bindungen hydrolytisch unter Wasseranlagerung spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die medizinisch eingesetzte Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese auch Hyaluronat-Glycanhydrolasen (E.C. 3.2.1.35/36) genannten Enzyme hydrolisieren neben der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glycosaminoglycanbindungen. Einen weiteren Typ stellt die Endo-ß-Hyaluronidase aus dem Blutegel dar, welche die ß-(l-4)-Bindung hochspezifisch spaltet. Alle die genannten Enzyme sind hydrolytische wirkende Hyaluronidasen bzw. Hyaluronidasen im engeren Sinne.
Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyasen (EC 4.2.2.1), spaltet die Hyaluronsäure in der ß(l-4)- Bindungen nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glucuronsäure. Hyaluronatlyasen sind damit keine Hyaluronidasen. Hyaluronatlyasen kommen in Mikroorganismen vor. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre enge Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glycosaminoglycane werden in der Regel in einem vernachlässigbaren Ausmaß gespalten (J.-H. Ozegowski et. al: Purification and characterization of Hyaluronidase from Streptocoecus agalactiae, Zbl. Bakt. 280, 497-506 (1994), A. Linker et al: The production of unsaturated uronides by bacterial hyaluronidases, JBC 219 13-25, (1956), T. Ohya, Y. Kaneko: Novel hyaluronidase from Streptomyces, BBA 198 (1970), 607- 609 and K. Gase, J.-H. Ozegowski, and H. Malke: The Streptocoecus agalactiae hylB gene encoding hyaluronat lyase completion of the sequence and expression analysis, BBA, 1998, 86 - 98).
Die meisten mikrobiellen Hyaluronatlyasen sind hochmolekulare Proteine mit Molmassen zwischen 1 16.000 bis 120.000 Dalton. Diese hochmolekularen Hyaluronatlyasen sind zumeist relativ empfindlich gegenüber denaturierenden Agentien und extremen physiologischen Bedingungen. Insbesondere bei der Zubereitung von pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Formulierungen kann es zu beträchtlichen Aktivitätsverlusten durch Denaturierungsvorgänge kommen. Darüber hinaus ist die Diffusionsfähigkeit der relativ großen Enzyme wesentlich geringer als die Diffusionsfähigkeit kleinerer Moleküle. Theoretisch wird hierdurch die Diffusion und damit die Penetrations- bzw. Diffusionsförderung der hochmolekulare Hyaluronat- lyasen (Holoenzyme) in die Geweben hinein, beispielsweise auch in die Plaques, eingeschränkt. Eine geringere immunogene Wirkung ist wahrscheinlich.
Es ist Stand der Technik, Proteine mit Hilfe von Proteasen innerhalb eines enzyma- tischen Prozesses zu spalten, um für Sequenzierungen - in der Regel nicht enzymatisch aktive - Proteinbruchstücke zu erhalten. Theoretisch sollte es demnach möglich sein, durch Mikroorganismen gebildeten Enzyme (Holoenzym) durch eine Teilverdauung mit spezifisch wirkenden Proteasen zu verkleinern.
Bisher sind aber keine Enzymfragmente, insbesondere keine enzymatisch aktiven Fragmente mikrobieller Hyaluronatlyasen bekannt geworden, bei denen eine Herkunft zu einer Hyaluronatlyase an Hand identischer Abschnitte in der Aminosäuresequenz erkennbar ist oder die aus ihr hergestellt werden. Es sind demnach auch keine Verfahren bekannt, mit denen aus Hyaluronatlyasen enzymatisch aktive Fragmente hergestellt werden. Hyaluronidase aus Rinderhoden werden eingesetzt, um tierisches bzw. menschliches Gewebe durchlässiger zu machen. Sie dient als Penetrations- oder Resorptionsbeschleuniger für subkutan oder intramuskulär verabreichte Arzneimittel oder zur Erleichterung der Perfusion größerer Flüssigkeitsmengen und bei der schnelleren Rückbildung von Ödemen. Gute Wirkungen wurden bereits in den 60er Jahren mit hochdosierter, intravenös verabreichter Rinderhoden-Hylase "Dessau" bei akuter Tendovaginitis und Paratenonitis crepitans, bei der intravenösen Behandlung des plantaren Fersensporns und in der Dermatologie erzielt. So kam es bei progressiver Sklerodermie, bei zirkumskripter Sklerodermie und bei Keloiden nach Hyaluronidase- Behandlung zu einer wesentlichen Verringerung der Beschwerden. In den 70er Jahren wurde versucht, die Spätfolgen des Herzinfarktes im Tiermodell mit Hyaluronidasen zu beeinflussen. Ziel der Studien war eine Verkleinerung der kardialen Nekroseareale bedingt durch die beschleunigte Gefäßneubildung nach dem Infarkt und eine Verbesserung der periphären Durchblutung.
Seit den 60er Jahren gibt es Literaturhinweise, dass Rinderhoden-Hyaluronidase zur therapeutischen Beeinflussung arterieller Gefäßerkrankungen beim Menschen, insbesondere zur Durchblutungsverbesserung der peripheren Gefäße eingesetzt werden kann (z.B.Thurnherr und Koch, zit. bei Wolff: Behandlungsergebnisse mit intra- venösen Magnesium comp./Hylase-Mischinjektionen bei Arteriopathien vom Beckentyp im Stadium II. Z. ärztl. Fortbild., 1972, 66, 446 - 447). So berichtete Wolff, dass Hyaluronidase aus Rinderhoden bei gleichzeitiger Anwendung von Magnesiumionen, intravenös appliziert (Mischinjektion, wöchentlich drei mal 300 IU über 6 Wochen), bei 90 % der untersuchten Patienten mit Arteriopathie vom Beckentyp im Stadium II, die Durchblutung der Gefäße verbessert. Grosshennig (in: Ergebnisse der Behandlung degenerativer arterieller Gefäßerkrankungen der unteren Extremitäten mit intravenösen Gaben von magnesium compositum „Scharffenberg" und Hyaluronidase. Dtsch. Ges.-wesen, 1965, 21, 869 - 872) führte eine ähnliche Mischbehandlung bei degenerativen Gefäßerkrankungen der unteren Extremitäten sowie von Patienten mit hochsitzenden degenerativen Gefäßobliterationen vom Beckentyp mit "eindrucksvollem Erfolg" durch. Er gab dreimal wöchentlich 300 IU für die Dauer von etwa 5 Wochen. In einigen schweren Fällen erfolgten insgesamt 30 Injektionen. Bei Nachuntersuchungen 6 - 8 Wochen nach Abschluß der Behandlung konnte keine Verschlechterung des erreichten Zustandes festgestellt werden.
Sehr nachteilig war sicherlich, dass die zur Verfügung stehenden Hyaluronidasen aus Rinderhoden nur in relativ geringer Aktivitäten zur Verfügung stand und somit nur geringe Enzymaktivitäten appliziert werden konnten So hatte eine einmonatige i.V., i.p. oder s.c. Gabe einer sehr geringen Hyaluronidase-Aktivität von 300 IU bei hyper- cholesterinämischen Kaninchen keinen Einfluß auf die atherosklerotischen Gefäß Veränderungen. Eine wiederholte Gabe dieser Menge über einen Zeitraum bis zu drei Monaten erniedrigte den Blutcholesterolgehalt und den Fibringehalt des Plasma, erhöhte den freien Heparingehalt des Plasmas, steigerte die vasculäre Permeabilität in Richtung Gewebe und führte auch zu einer signifikanten Abnahme der atheromatösen Gefäßplaques (A. I. Pertsovskii, S. I. KovaFchuk, V. A. Baronenko, R. N. Gold'man, S. Ya. Guz, and T. L. Fonbarova (1973): Effect of hyaluronidase on the course of experimental atherosclerosis. Kardiologija, 13, 37 - 40).
Ein Enzym, welches als Hyaluronatlyase deklariert wurde und „which appears to be a substantially homogeneous material, is particulary effective hyaluronidase because of its wide specifity" wurde von Gottlieb et al. nach GB 1,060,513 aus tierischen Geweben beschrieben. Das Enzym wurde beispielsweise in den Patenten GB 1,098.957 und in Mischung mit Hyaluronidase tierischer Herkunft in GB 1.179,787 zur Behandlung von allergischen Erscheinungen vorgeschlagen. Gottlieb schlug auch vor (US 3,708,575), Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herzarrythmien, Thrombosen, zerebrale Infarkte, zerebralen Thrombosen und Herzinfarkte insbesondere Atherosklerose mit dieser Hyaluronidase bzw. Hyaluronatlyase zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathecal injiziert. Das Enzym wurde entsprechend der Angaben in dem Schutzrecht (US 3,708,575) aus tierischem Material gewonnen. Aus der Erfindungsbeschreibung geht eindeutig hervor, dass es sich bei den eingesetzten Enzym(en) um die Anwendung von testikulären Hyaluronidasen handelt. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität, die ange- gebene weite Spezifität als auch die angewendete, nicht für die Lyasereaktion spezifische Aktivitätsbestimmungsmethode bezieht sich auf eine tierische Hyaluronidase. Entsprechend werden auch Enzyme mit der Spaltungsspezi fität einer Hyaluronatlyase aus Tierhoden nicht in der neuesten Literatur angeführt (Review: G. L. Frost, T. Csoka and R. Stern: Trends Glycosci. Glycotechnol. 8, 419 - 434).
Nach den angeführten Literaturangaben ist die Hyaluronidase aus Rinderhoden geeignet, die Durchlässigkeit von Blutgefäßen für den Blutstrom dadurch zu erhöhen, dass atheromatöse Ablagerungen und möglicherweise auch Konstituenten von Blutgerinnseln und Blutthromben gelöst, abgebaut oder durchlässig gemacht werden. Bei den Konstituenten der Blutthromben, die möglicherweise gelöst werden, könnte es sich um Plaquepartikel handeln, die sich von der Intima gelöst haben und an denen sich ein Blutthrombus gebildet hat.
Weiterhin gibt es Hinweise, dass Hyaluronidaseanwendungen die Gefäßwände zum Gewebe hin als auch möglicherweise das angrenzende Gewebe durchlässiger machen.
Nachteilig bei der Anwendung der Hyaluronidase tierischer Herkunft, insbesondere der Hyaluronidase aus Rinderhoden ist jedoch, dass das Enzym auf Grund seiner Herkunft die Gefahr einer Übertragung von Viren, von BSE (bovine spongioform encephalo- pathie) und anderem infektiösen Material in sich trägt. Weiterhin ist nachteilig, dass bei der Herstellung der Hyaluronidase zur Entfernung von Verunreinigungen in Form von Inhaltstoffen, insbesondere von Fremdproteinen, aus dem tierischen Material ein sehr großer Reinigungsaufwand betrieben werden muß. Es müssen weiterhin, um ausreichende Mengen an Hyaluronidase zu gewinnen, entsprechend große Mengen an Ausgangsmaterial unter Bedingungen gesammelt werden, bei denen ein Verderb verhindert wird.
Die Hyaluronidase aus Säugetierhoden hydrolysiert auf Grund ihrer Unspezifität auch die in der Gefäßwand vorhandenen sulfatierte Glycosaminoglycane. Vom Dermatan- sulfat oder Chondroitinsulfat, Heparin und Heparansulfat wird jedoch angenommen, dass sie das Anheften von Blutthromben an die Innenwand der Gefäße durch ihre gerinnungshemmenden Eigenschaften verhindern. Es besteht demnach die Möglichkeit, dass die Hydrolyse dieser Verbindungen die sekundäre Bildung von Blutgerinnseln an der Intima vergrößert und somit die testikulären Hyaluronidasen auch eine ungünstige Nebenwirkung besitzen könnten. Sawyer et. al. (EU 193330 Bl) beschreiben die Herstellung und Anwendung einer speziellen Endo-ß-glucuronidase mit einer Molmasse von 28.500 D aus einem Blutegel zur Stimulierung des Flußes physiologischer Flüssigkeiten bei Augenkrankheiten. Dieses Enzym ist hochspezifisch für Hyaluronsäure und unterscheidet sich von einer bekannten Endo-ß-glucuronidase aus dem Blutegel (Hirudo medicinalis) durch eine höhere Stabilität bei höheren Temperaturen und extremen pH-Werten.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nachteile der bisher vorgeschlagenen Anwendung von Hyaluronidasen tierischer Herkunft als Plaque-abbauendes Enzym dadurch zu vermeiden, dass aus Mikroorganismen gewonnene Enzyme in geeigneten galenischen Formulierung zur Therapie als auch zum Vorbeugen von atherosklerotischen Gefäßveränderungen eingesetzt werden. Mikrobielle Enzyme sind durch die Möglichkeiten ihrer biotechnischen Herstellung prinzipiell auf einfachen Weg zu gewinnen.
Es ist auch das Ziel der Erfindung, enzymatisch aktive Enzymfragmente mit einer Plaque-abbauenden Aktivität auf einfachem Weg aus geeigneten mikrobiellen Holoenzymen herzustellen und als galenischen Formulierungen anzuwenden. Von der Anwendung der Fragmente ist zu erwarten, dass sie in den pharmazeutischen Formu- lierungen stabiler sind sowie dass sie bei Anwendung weniger immunogen sind und dass sie besser penetrieren.
Weiterhin sollen die erfindungsgemäß bereitgestellten Enzyme bei der Applikation von größeren Enzymaktivitäten über längere Zeiträume den lebenden Säugerorganismus nicht negativ beeinflussen. Die Enzyme sollen auch eine nur begrenzte Spaltung der sulfatierten Glycosaminoglycanen bewirken, um einerseits eine mit der Hyaluronidase aus Tierhoden vergleichbare Auflösung von Plaques und von Konstituenten von Blutg rinnsel zu bewirken. Andererseits soll es durch den stark begrenzten Abbau der sulfatierten Glycosaminoglycane in der Intima nicht zu der durch ein Fehlen der sulfatierten Glycosaminoglycane stark gesteigerten Gefahr der Bildung sekundäre Blutgerinnsel kommen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zu Grunde, Plaque-abbauende Enzyme mikrobieller Herkunft aufzufinden, welche als Konstituenten in pharmazeutischen Formulierungen eine mit der Hyaluronidase aus Rinderhoden vergleichbare bzw. bessere Wirkung beim Auflösen von Plaques bzw. bei der Verringerung der durch Plaques belegten inneren Gefäßwände sowie von Bestandteilen der Thromben und Blutgerinnseln bei Anwendung im Blutgefäßsystem aufweisen, das Krankheitsgeschehen bei Gefäßkrankheiten günstig beeinflussen, nicht toxisch sind und keine anderen negativen Wirkungen bei der Anwendung in Mensch oder Tier als Injektionspräparat besitzen.
Es ist auch Teil der Aufgabe, die zu der Erfindung führte, ein kleineres Protein bzw. Fragment mit Hyaluronatlyaseaktivität bereitzustellen und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben. Das Fragment soll ähnliche oder gleiche enzymatischen Aktivitätseigenschaften wie ihre Holoenzyme aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet demzufolge zur Therapie von Gefäßkrankheiten geeignete pharmazeutische Formulierungen, die direkt oder als Folge der atheromatöser Plaquebildung auftreten. Weiterhin beeinhaltet die Erfindung ein neues Enzymfragment, dessen Herstellung sowie Anwendung.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass eine pharmazeutische Formulierung, die ein oder mehrere bakterielle Enzyme mit der Aktivität einer Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1.), insbesondere eine der durch die Mikroorganismen der Gattung Streptocoecus, bevorzugt der allgemein verfügbaren Arten Streptocoecus agalactiae oder Streptocoecus equisimilis bei Fermentation in das Submersmedium exkretierte Hyaluronatlyasen, enthält oder ein aus den Hyaluronatlyasen hergestelltes Enzymfragment enthält, in vitro aus den isolierten Plaquesauflagen, die aus den atheromatösen Gefäßen von Säugetieren und aus dem Menschen gewonnen wurden, Material freisetzt bzw. dünne Plaqueab- schnitte auflöst.
Weiterhin erwies es sich, dass bei oftmals wiederholten intravenösen Injektionen von vergleichsweise hohen Enzymaktivitäten enthaltenden, erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen, die die Hyaluronatlyase und/oder dasEnzymfragment enthalten, in lebende Watanabe-Kaninchen, die auf Grund eines genetischen Defektes auf der Aorta große Plaqueauflagerungen aufweisen, sich nach der Behandlung das Ausmaß der Plaqueauflagerungen in den Gefäßen auffällig verringerte hatte. Während das Gefäßinnere der unbehandelten Tiere eine mit einer dünnen weißlichen Plaques- schicht belegte Oberfläche sowie auch dickere Plaques aufwies, war das Gefäßinnere der behandelten Tiere frei von den dünneren Plaqueauflagerungen und wies die tiefrote Färbung von gesundem inneren Gefäßoberflächen auf. Die Flächenausdehnung der dickeren Plaquesauflagerungen war ebenfalls reduziert.
Es ist überraschend, das diese Wirkung nicht nur auf die Anwesenheit der Holoenzyme mit einer Molmasse im Bereich von 1 14.000 D bis 124.000 D in der pharmazeutischen Formulierung beschränkt ist, sondern besonders auch durch ein hochaktives, stabiles Fragmente der Holoenzyme mit einer Molmasse von beispielsweise 84.000 bis 86.000 D bewirkt wird. Es wurde weiterhin gefunden, dass die erfindungsgemäßen Fragmente durch eine proteolytische Verdauung der bakteriellen Hyaluronatlyasen mit Proteasen, bevorzugt einer Protease, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt werden können. In einem bevorzugten Beispiel wird die Hyaluronatlyase mit einem Molekulargewicht von 1 16.000 Dalton aus Streptocoecus agalactiae in ein enzymatisch aktives Hyaluronatlyase-Fragment gespalten. Das Fragment besitzt eine Molmasse von 84.000 - 86.000 Dalton. In seiner Spaltspezifität besteht keine Unterschiede zu der unverdauten Hyaluronatlyase (Holoenzym). Gegenüber dem Holoenzym zeichnet es sich das Fragment jedoch durch eine deutlich höhere Stabilität in wäßrigen Lösungen und gegenüber denaturierenden Agentien aus. Das Fragment besitzt eine spezifische Aktivität zwischen 400.000 IU/mg bis 800.000 IU/mg und weist damit gegenüber dem Holoenzym mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 IU/mg die gleiche beziehungsweise sogar eine höhere spezifische Aktivität auf.
Die Erfindung betrifft dementsprechend eine pharmazeutische Formulierung enthaltend eine Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft als Holoenzym, ein Hyaluronat-spaltendes Fragment davon oder eine Mischung beider Formen, jeweils in hochgereinigter Form, und zumindest einen Stabilisator und/oder pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoff sowie gegebenenfalls zusätzlich pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnun *gosumittel.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung sind in erster Linie zur Behandlung von Gefäß krankheiten, wie Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebralen Infarkten, zerebralen Thrombosen, Koronarthrombosen und kardialen Infarkten, die auf die Anwesenheit von atheromatösen Plaques in den Blutgefäßen zurückzuführen sind, in Säugetieren (Menschen und Tiere) geeignet.
Erfindungsgemäß hergestellte pharmazeutische Formulierungen sind insbesondere Injektionspräparate für intravenöse oder intraarterielle Injektionen, welche aus einer isotonischen, sterilen wässrigen Lösung des hochgereinigten Enzymproteins des Holo- enzyms und/oder des Fragmentes oder einer definierten Mischung beider aktiven Enzymspezies bestehen, wobei die Enzymaktivitäten zwischen 20.000 bis 4.000.000 IU/ml betragen. Die Enzymproteine werden vorteilhafterweise in Form eines gefriergetrockneten Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, eingesetzt. Stabiliserende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, Albumin, insbesondere Ovalbumin, und dessen Hydrolysate oder cereale Proteine und deren Hydrolysate sein. Die bei einer Injektion angewendete Menge an Hyaluronatlyase und/oder ihres Fragmentes liegt zwischen 2.000 bis 12.000 IU/kg Körpermasse des behandelten Säugetieres oder Menschen.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym bzw. das Fragment zeigt keine negativen
Auswirkungen auf den Gesundheitszustand der Versuchstiere.
Es ist naheliegend und gehört in den Schutzumfang, dass die Wirkung des vorgeschla- genen Enzyms und/oder ihres Fragments nicht nur auf die Entfernung der aktuellen
Ablagerungen beschränkt ist, sondern einen günstigen Effekt auf Kreislaufkrankheiten wie Myocardischämie, Myocardinfarkt, Koronarinfarkt, Herzrhythmusstörungen,
Atherosklerose und ähnliche Erscheinungen im Sinne einer Vorbeugung als auch einer
Therapie hat. Vorteilhaft an der erfindungsgemäßen Anwendung des Fragments im Vergleich zu dem
Holoenzym ist, dass es auf Grund seiner kleineren Größe schneller als das Holoenzym in die festen Schichten der Plaques eindringen und dadurch schneller ihre Zerstörung bewirkt. Ohne die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres Fragmentes auf einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird die Erfindung am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptocoecus agalactiae erläutert. Die gebildete Hyaluronatlyase besitzt einen isoelektrischen Punkt von etwa IP= 8,6 und eine Molmasse von etwa 1 16.000 D und wirkt als Endoglycanase. Das Enzym hat die günstige Eigenschaft, dass es durch sulfatierte Glycosaminoglycane, wie beispielsweise auch sulfatierte Hyaluronsäure, inhibiert wird. Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder gereinigte Hyaluronatlyase mit der spezifisch wirkenden Protease zu dem Fragment umgesetzt. Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease MO/2 (DD 270924) eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus AP40 gewonnen werden kann. Diese Protease ist durch eine Molmasse von etwa 14.000 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen 3,85 bis 4,0 gekennzeichnet. Auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung der Herstellung des Holoenzyms als auch die des Fragmentes, insbesondere die Reihenfolge der Reinigungsschritte, hat beispielhaften Charakter und soll nicht den Schutzumfang einschränken. Die Herstellung der hochreinen Hyaluronatlyase und des hochgereinigtes Fragments in einer galenischen Formulierung geeignet zur Injektion kann beispielhaft in Bezug auf die Reihenfolge als auch die Auswahl der Reinigungsschritte in einer nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränkenden Weise wie nachfolgend durchgeführt werden. Die Fermentation des Mikroorganismus, z.B. eines der oben genannten, erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung bei einer Azidität von pH 6,5 bis 7,5. Die während der Fermentation gebildete Milchsäure wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge neutralisiert. Das Medium besteht aus anorganischen Salzen, Hefehydro- lysat, wahlweise Kaseinpepton oder Sojapepton sowie Glukose. Nach etwa 20stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird verworfen.
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlußgrenze (cut off) des Ultrafilter-Moduls liegt zwischen 30 bis 50 kD. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden muß, bevor es als Injektionspräparat verwendet werden kann. Durch die Reinigungsschritte und der Anwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird die Pyrogen- freiheit des Injektionspräparats gewährleistet.
Nach Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40% wird das Enzym an Phenylsepharose adsorbiert. Anschließend erfolgt die Desorption mit einer neutralen gepufferten wässrigen Lösung, die 25% Ammoniumsulfat, bezogen auf 100% Sättigung, enthält. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Anschließend erfolgt eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, beispielsweise Aminophenyloxaminsäure. Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts aus einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) bestehen.
Bei Verwendung von Streptocoecus equisimilis als Enzymbildner entfällt der Reinigungsschritt durch Adsorption an den Farbstoff. Dieses Enzym wirkt als Exoglycanase, sein Isoelektrischer Punkt liegt zwischen pH 4,5 und 4,8 und es wird nur in einen sehr geringen Maß durch sulfatierte Glycosaminoglycane gehemmt.
Die Teilverdauung des Holoenzyms zu dem Fragment erfolgt mit immobilisierter oder auch mit nicht-immobilisierter spezifischer Protease. Vorteilhaft ist an der Umsetzung mit immobilisierter Protease, dass die Verdauung gezielt und ohne Kontamination durch die Protease selbst durchgeführt werden kann. Im Fall der direkten Umsetzung mit zugesetzter Protease muß nach der Verdauung ein Inaktivierungsschritt der Protease, die Abtrennung des Proteaseproteins und eine Hochreinigung erfolgen. Die Enzymfraktion kann in folgender Weise zur Herstellung des Fragmentes eingesetzt werden: Die spezifisch spaltende Protease MO/2 wird in bekannter Weise, beispielsweise an Sepharose gebunden. Die immobiliserte Protease wird beispielsweise bei pH 7,5 und einer Temperatur von 37 °C mit einer wässrigen Hyaluronatlyaselösung gemischt. Nach abgeschlossener Verdauung wird das Fragment mit Ammoniumsulfat gefällt und durch Molekulargewichtschromatografie in hochreiner Form gewonnen. Das hochgereinigte Enzym oder das Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt. Das Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg und die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt etwa zwischen 400.000 bis 800.000 IU/mg. Zur Stabilisierung werden dem Enzym bzw. Fragment mindestens einer der Stabilisatoren, beispielsweise Albumin, bevorzugt Ovalbumin und anorganische Salze zugesetzt.
Ohne die Erfindung dadurch einzuschränken, soll beispielhaft ein Weg zur Gewinnung des Fragmentes beschrieben werden. Erfindungsgemäß werden Proteasen zur Verdau- ung eingesetzt, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Metalloprotease MO/2 eingesetzt, die aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) hergestellt wird. MO/2 ist ein Metalloenzym mit Co++ im aktiven Zentrum (DD 270 924). Die Proteasen werden bevorzugt in gereinigter Form eingesetzt. Die Reini- gung der Protease MO/2 erfolgt beispielsweise durch Chromatografie an Phenylse- pharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S100 mit einem Anreicherungsfaktor von 20. Die spezifische Aktivität liegt bei 0,25 Kunitz Units/mg (U/mg), das Reaktions-maximum bei einer Azidität von pH =4,2 und das Reaktionstemperaturmaximum bei 65 °C. Das Molekulargewicht (Mm.) des Enzyms, bestimmt durch SDS Gelelektrophorese und Molekulargewichtschromatografie an Sephadex G50 superfine beträgt Mm = 14.000 bis 15.000 D. Die Protease MO/2 ist eine Endopeptidase mit einem Isoelektrischen Punkt bei IP = 3,85 und einem bei I = 3,92. Das Enzym hydrolysiert natürliche Polypeptide wie Kasein, Hämoglobin, Bovineserum, Albumin und Ovalbumin. Vorteilhaft an der Anwendung der Protease MO/2 ist, dass das Enzym Proteine sehr spezifisch spaltet bzw. eine sehr geringe allgemeine Verdauungsaktivität gegenüber Proteinen besitzt. Das Enzym spaltet fast ausschließlich nur die Peptidbindungen des C- terminalen Restes von den aromatischen Aminosäuren. Es besitzt eine esterolytische Aktivität gegenüber N-benzoyl-L-proline nitroanilid und ausgeprägte milchfällende Eigenschaften. Die Eigenschaften der Milchfällung, die an der Bildung eines langzeit- stabilen Kaseingels nachweisbar ist, vergleichbar mit dem Gel, welches bei der Milchfällung mit dem sehr spezifisch wirkenden Labenzym auftritt, sind als weiterer Hinweis auf die begrenzte, für die Erfindung sehr vorteilhafte Aktivität der Protease MO/2 zu werten, die Bindungen des Holoenzyms spezifisch zu spalten, ohne zu einem Abbau der Fragmente zu führen.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird die Protease MO/2 gegebenenfalls an geeignete unlösliche Immobilisierungssupporte gebunden und in dieser Form zur Spaltung des Holoenzyms eingesetzt. Vorteilhaft an dieser Vorgehensweise ist, das auf diese Weise der Übergang gelöster Protease in die Lösungen der Fragmente verhindert wird.
Erfindungsgemäß wird das Fragment durch Teilverdauung bzw. einem proteolytischen Teilabbau des Holoenzyms mit einer spaltspezifisch wirkenden Protease, welche die Peptidbindung bevorzugt an der C-terminalen Seite der aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt.
Die hochreinen Enzymlösungen oder die Fragment-haltigen Fraktionen können nach Konzentrierung unter teilweiser Wasserentfernung und gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder pharmakologisch aktiven Substanzen und Sterilfiltration als Injektionspräparate eingesetzt werden. Die hochreine Enzym- bzw. Frag- mentlösung kann auch nach Sterilfiltration beispielsweise unter Zusatz von 5 mM Magnesiumchlorid und 1% Eieralbumin gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Enzym bzw. Fragment kann mit Kochsalzlösung als isotonisches Injektionspräparat gelöst werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft, eines Hyaluronat-spaltendes Fragmentes davon oder einer Mischung beider Formen zur Behandlung von Gefäßkrankheiten, wie Herzrhythmusstörungen, Athero- sklerose, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen, Koronarthrombosen und kardiale Infarkte, die auf die Anwesenheit von atheromatösen Plaques in den Blutgefäßen zurückzuführen sind, in Säugetieren und Menschen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Fragmente bakterieller Hyaluronatlyasen mit Hyaluronatlyase-Aktivität.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sie sollen diese jedoch in keiner Weise limitieren.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 Die Fermentation wird in einem gerührten Fermentor mit einem Bruttofüllvolumen von 30 1 durchgeführt. Das Arbeitsvolumen beträgt 20 1. Zur Beeimpfung wird ein allgemein verfügbarer Stamm der Art Streptocoecus agalactiae eingesetzt, der in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) in Braunschweig unter der Nummer 2134τ (= ATCC 13813= NCT C8181) gehalten wird. Die Stammkonservierung erfolgt mit einer Kryokonserve (Mast-Diagnostica). Eine Kugel bedeckt mit Stamm-Material wird in ein Agarschrägröhrchen mit Keimzahlagar gegeben und durch Bewegung mit der Agaroberfläche in Berührung gebracht (Kultur A). Anschließend wird zur Sterilkontrolle die abgerollte Kugel in 3 ml einer Herz-Hirn- Bouillon gegeben (Kultur B). Beide Kulturen werden 24 h bei 37°C als Standkulturen kultiviert.
1. Vorkultur
2 x 50 ml eines Mediums, welches 5 g/1 Caseinpepton und 10 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) enthält, werden in zwei 100 ml Steilbrustflaschen gefüllt und bei pH pH 7,0 sterilisiert. Zusätzlich zu den 50 ml Kulturmedium wird jeweils 5 ml Eagle-Medium kurz vor Beimpfung zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt mit einer Abschwemmung des Schrägagarröhrchens Kultur A mit der Kulturlösung von Kultur B. Die Steilbrustflaschen werden unter Schütteln (150 rpm) bei 37°C über 24 h kultiviert.
2Norkultur
2x1 1 eines Mediums, bestehend aus 20 g/1 HefeExtrakt und 10 g/1 pankreatischem Pepton, 1 ,75 g/1 Νa-acetat, 7 g/1 Νa-hydrogencarbonat (extra gelöst), 7 g/1 Di-Νa- hydrogenphosphat x 2H2O und 3,5 g/1 Νa-Di-hydrogenphosphat wird auf pH 6,2 vor Sterilisieren mit 20% H2SO4 eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH bei etwa 7,0. Eine Lösung einer 6,0 g/1 enthaltenden Glucoselösung wird separat autoklaviert. Davon werden 100 ml vor Beeimpfen der 2. Vorkultur zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt durch Zugabe von 50 ml der 1. Vorkultur (Beimpfung mit 5% v/v). Die Kultivierung erfolgt unter langsamen Schütteln bei ca. 45 rpm bei 32°C für 24 Stunden .
Hauptkultur
Das Medium der Hauptkultur besteht aus 20 g/1 Hefe-Extrakt, 10 g/1 pankreatisches Pepton und 25 g/1 Glucose. Die Glucose wird extra autoklaviert. Die Beimpfung erfolgt mit einem Liter der 2. Vorkultur. Die Fermentationsparameter betragen 34°C, pH 7,0, Belüftung über Kopfraum (25 1/min Luft) und Rührgeschwindigkeit 150 rpm. Der pH wird durch Titration mit einer 40% Natronlaugelösung konstant gehalten. Glucose wird manuell so zugegeben, dass die Glucosekonzentration nicht unter 5 g/1 sinkt. Nach 20 Stunden wird die Kultivierung beendet.
Beispiel 2
50 1 Kulturlösung einer Feπnentation der Art Streptocoecus agalactiae mit einem Hyaluronatlyaseaktivität von 400 IU/ml werden durch Sterilfiltration in einem 0,2 μm Filter von den Lebendzellen befreit. Die klare Kulturfiltratlösung wird anschließend durch Ultrafiltration bei einem cut off von 60.000 D zu einem Kulturkonzentrat von 2 1 eingeengt. Diesen 2 1 Kulturkonzentrat werden 480g festes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die bei dieser Konzentration ausfallenden Proteine werden durch eine Klarfiltration unter Verwendung eines Filterhilfsmittels abgetrennt und das klare Konzentrat auf eine zuvor mit 40 %iger phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 equilibrierte Phenylsepharosesäule von 2,5 x 20 cm aufgetragen. Nach Wäsche mit einer 35 %igen phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5, wird die Hyaluronatlyase mit einer 25%igen phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden vereinigt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% eingestellt. Das ausgefallene Präzipitat wird gesammelt und in 100 ml 0,03 M Trispuffer pH 8,2 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert.
Anschließend wird die dialysierte Rohhyaluronatlyaselösung über eine equilibrierte Q- Sepharosesäule von 2,2 x 15 cm gegeben. Die Hyaluronatlyase befindet sich im Durchlauf. Der Durchlauf wird durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 80 % gesättigt. Das ausfallende Protein wird gesammelt, in 0,05 M Trispuffer pH 8,7 gelöst und über eine Sephadex G 10 Säule vom Ammoniumsulfat befreit. Die so equilibrierte Lösung Hyaluronatlyase haltige Lösung wird auf eine entsprechend equilibrierte Affinitätssäule ( 0,8 cm x 10 cm) von N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,1 M NaCO3 -Lösung pH 9,7 eluiert. Die eluierten Hyaluronatlyase-haltigen Fraktionen werden vereinigt und durch Sättigung auf 80 % mit Ammoniumsulfat gefällt. Das gefallene Präzipitat wird gesammelt, in 1 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,5 gelöst und auf eine Superdex 200-Säule ( 16 x 60 ) aufgetragen. Die Hyaluronatlyase-Proteinbande bei 116. 000 D wird gesammelt, gegen 0,02 M Trispuffer pH 7,5, der 0,005 M MgCl2, enthält, dialysiert. Es werden 10 mg Hyaluronatlyase mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 IU/mg erhalten. Der dialysierten Hyaluronatlyaselösung wird Ovalbumin in einer Konzentration von 1% zugesetzt und die Lösung lyophil getrocknet. Beispiel 3
Entsprechend dem Beispiel 1 und 2 wird ein Mikroorganismus der Art Streptocoecus ecμtisimilis vorkultiviert, kultiviert und das Enzym in reiner Form gewonnen. Es entfällt der Aufarbeitungsschritt der Reinigung über die N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure- Agarose.
Beispiel 4
10 mg gereinigte Protease MO/2 wird in 2 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst. Dazu wird 1 ml Bromcyan-Sepharose (Pharmacia) gegeben und 12 Stunden bei 4°C geschüttelt. Anschließend wird die nichtgekoppelte MO/2-haltige Lösung von der entstandenen MO/2-Proteasesepharose mit einer Fritte abgetrennt. Anschließend werden nichtgesättigte Bindungsstellen an der Bromcyan-Sepharose durch Umsetzung mit 2 ml 0,1 M Glycinlösung blockiert. Nach der Blockierung wird die MO/2-Sepharose mit 0,1 M Essigsäure von pH 4,5 und 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen.
10 mg Hyaluronatlyase aus Streptocoecus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g fixierter MO/2- Proteasesepharose zugesetzt, an die eine proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/g gebunden wurden. Nach 15 Minuten wird die Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80 % ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment gesammelt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molgewichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 600 000 IU/mg.
Beispiel 5
4 mg Hyaluronatlyase aus Streptocoecus agalactiae werden in 1ml 0,05 M Tris-HCl- Puffer pH 7,8 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 80 μg der Protease MO/2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/mg zugefügt und das Gemisch für 30 Minuten bei 37°C verdaut. Zum Stoppen der Reaktion werden dem Gemisch lOμl 0,1 M EDTA pH 7,0 zugesetzt. Danach wird das Gemisch auf eine 3 ml Affmitätssäule von N-(p- Aminophenyl)- oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,05 M NajCOj pH 9,7 eluiert. Das
Fragment wurde durch Sättigung auf 80% Ammoniumsulfat gefällt, gesammelt und durch Molekulargewichtschromatografie gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 460 000 IU/mg. Beispiel 6
0,5 ml Lösung des Hyaluronatlyasefragmentes (Beispiel 4) werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg Hyaluronsäure / ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2ml einer 2,5%igen
Cetyltrimethylammoniumbromidlösung in 2%iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten Stehen bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespaltener Hyaluronsäure bestimmt. Fünf internationale Einheiten (IU) des Hyaluronatlyasefragment spalten 16μg Hyaluronsäure/min.
Beispiel 7
Je 20.000 IU des Holoenzyms und des Fragments (Beispiel 4) werden in 3 ml destilliertem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden bei Raumtemperatur 24 h aufbewahrt und anschließend die Enzymaktivität gemessen. Die Aktivität der
Holoenzymlösung sinkt in diesem Zeitraum auf 60% ab, während die Aktivität der Fragmentlösung 95% der Aktivität der Ausgangslösungen beträgt.
Beispiel 8
Aktivitätsbestimmung für Hyaluronatlyase bzw. des Fragments
1. Optischer Test bei 232 nm Es werden Stammlösungen für Hyaluronsäure (HA) und sulfatierter Hyaluronsäure (mg/ml) hergestellet und bei 4 °C aufbewahrt.
Der Standardtestansatz wird wie folgt in 3 ml-Quarzküvetten (d = 1 cm) bei einer Wellenlänge von 232 nm und einer Temperatur von 26 °C durchgeführt. Zu 1,8 ml 0,1 M Azetatpuffer pH 6,0 werden 200 μl Hyaluronsäurestammlösung gegeben und die Reaktion mit 2 bis 4 U/ml (50 ml) Hyaluronatlyase gestartet. Das Endvolumen beträgt 2050 μl.
Für die Hemmversuche wird der oben beschriebene Standardtestansatz wie folgt variiert. Zu 1,5 bis 1,8 ml Puffer werden 300 bis 500 μl sulfatierte Hyaluronsäure und 200 μl Hyaluronsäure gegeben und die Reaktion durch Zugabe von Hyaluronatlyase gestartet. Die Hyaluronatlyase wird partiell nichtkompetitiv gehemmt. Der Ki-Wert beträgt 5,5 x 10"4 mg/ml.
Hyaluronatlyase zeigt eine lineare Zunahme der Extinktion bei 232 nm, aus deren Anstieg sich die Aktivität berechnen läßt. Dabei wird ein Extinktionskoeffizient von e = 6,0 x lO3 lxmor'cm"1 für das gebildete Δ4,5 -ungesättigte Uronid zugrundegelegt (J. Ludowig: The mechanism of hyaluronidases. JBC 236, 333-339 (1991)). 2. Optischer Test bei 600 nm auf Mikroplatten
Bestimmung der Lyaseaktivität nach D. Gerlach, W. Köhler "Hyaluronatlyase von Streptocoecus pyogenes. II. Charakterisierung der Hyaluronatlyase"(E.C. 4.2.2.1.) Zbl. Bakt.Hyg., I. Abt. Orig. A 221, 296-302 (1972)
Eine Hyaluronatlyase-Lösung wird aus einer Stammlösung (50.000 U/ml) durch Verdünnen 1 :50 hergestellt. 0,5 ml Hyaluronatlyaselösung werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg / ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2ml einer 2,5%>igen Cetyltrimethylammoniumbromidlösung in 2%iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespalter Hyaluronsäure bestimmt. 5 internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyase spalten 16μg Hyaluronsäure/min.
Beispiel 9
10 mg Hyaluronatlyase (Holoenzym) werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g einer spezifisch spaltenden Proteasesepharose mit einer proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/mg zugesetzt. Nach 15 Minuten wird die unlösliche Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80 % ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment abgetrennt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molgewichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert.
Beispiel 10
Zum Nachweis der Plaque-auflösenden Aktivität der Hyaluronatlyase werden etwa 0,3 mm große, aus der Neointima der Arteria carotis interna des Menschen entnommenen weißlich-gelben Gewebsstücke (Plaque-Stücken) in Lösungen von Hyaluronatlyase (etwa 20.000 IU in 1 ml Tris-Puffer, 10 mM, pH 7,0) suspendiert und für 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es tritt eine teilweise Auflösung der vorher scharfen Phasengrenzen der Plaque-Stücke sowie eine Freisetzung von suspendiertem feinverteilten Material auf. Parallel wurden Plaque-Stücke nur mit Tris-Puffer behandelt. Es treten hierbei keine Auflöseerscheinungen auf.
Beispiel 11
Versuch mit dem Fragment der Hyaluronatlyase zum Auflösen atheromatöser Gefäß- Ablagerungen humaner Herkunft:
Etwa 0,3 mm große, aus der Neointima der Arteria carotis interna des Menschen entnommenen weißlich-gelben Gewebsstücke (Plaque-Stücken) wurden in Lösung des Fragmentes (etwa 15.000 IU in 1 ml Tris-Puffer, 10 mM, pH 7,0) suspendiert und für 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es tritt eine weitgehende Auflösung der vorher scharfen Phasen-grenzen der Plaque-Stücke sowie eine Freisetzung von suspendiertem, feinverteilten Material auf. Parallel wurden Plaque-Stücke nur mit Tris-Puffer behandelt. Es treten hierbei keine Auflöseerscheinungen auf.
Beispiel 12
Einfluß der Hyaluronatlyase auf atheromatöse Gefäßablagerungen beim Watanabe-
Kaninchen Ibm:WHHL (Watanabe heritable hyperlipidemic). Das Kaninchen wird seit 1981 von Y. Watanabe, Universität Kobe, Japan gezüchtet und kam 1992 als
Auszuchtstamm zu Charles River Savo und wird seit 1994 vom Broekman-Institut in
Someren, Niederlanden, weitergezüchtet.
Das Watanabe-Kaninchen hat eine erbliche Hyperlipidämie, verursacht durch ein erblich bedingtes Defizit an LDL-Rezeptoren. Infolge der Hypercholesterinämie (>400 mg/100 ml Plasma) kommt es bei allen Tieren zu einer frühzeitigen
Aortenarteriosklerose.
14 Tage vor Versuchsbeginn wurden 10 Watanabe-Kaninchen (Ibm:WHHL; 4? und 6σ") im Alter von 9 bis 11 Monaten vom Broekman-Institut in Someren, Niederlanden, gekauft. Die Tiere wurden einzeln in Käfigen (0,5 x 1 m) bei Raumtemperaturen von 20 ± 2°C gehalten und mit Standardfutter (ssniff Kaninchen-Haltung) und Trinkwasser ad libitum versorgt.
Vor Versuchsbeginn, also vor der 1. klinisch-chemischen Untersuchung, wurden die 10 Kaninchen, nach Geschlecht getrennt, randomisiert und danach mit den Nummern 1 bis 10 gekennzeichnet.
Die Tiere erhielten 3x/Woche (montags, mittwochs und freitags) Infusionen. 4 Kontrollkanichen (1 - 4) bekamen jeweils 20 ml pyrogenfreie 0,9 %ige NaCl-Lösung innerhalb 1 Stunde intravenös (i.v.) verabreicht. Den 6 Versuchstieren (5 - 10) wurden jeweils mit dem Infusionsvolumen von 20 ml pyrogenfreier 0,9 %ige NaCl-Lösung 30 000 IU hochgereinigter Hyaluronatlyase pro Stunde i.v. injiziert. Das entspricht einer Dosierung von 10.000 IU/kg Körpermasse
Im Versuchszeitraum wurden Allgemeinverhalten, Körpermasse (KM), Körpertemperatur und klinisch-chemische Parameter (Cholesterin, Triglyceride, und Amylase) kontrolliert.
Das Allgemeinverhalten der Tiere wurde weder durch die Behandlungen mit 0,9 %iger NaCl-Lösung noch mit Hyaluronatlyase erkennbar beeinträchtigt. Die Körpermassen der ausgewachsenen Watanabe-Kaninchen, Kontrollen oder
Hyaluronatlyase-behandelte, veränderten sich im Behandlungszeitraum vom 18.11.96 bis 3.2.97 nur unwesentlich
Die Kö ertemperaturänderungen, gemessen vor und nach jeder Infusion, lag im Schwankungsbereich von - 0,3 bis + 1,2 °C. Auffällige Unterschiede zwischen Kontroll- und Hyaluronatlyase-behandelten Kaninchen wurden nicht gemessen. Die Serumcholesterin-Werte der Kontrolltiere veränderten sich durch die 0,9 %ige NaCl-Infusionen nicht wesentlich. Bei einem vor vier (1/4) Tieren kam es zur Halbierung der Cholesterin-Konzentration im Serum.
Die Hyaluronatlyase-Behandlung führte ebenfalls zu keinen auffälligen Verschiebungen der Serumcholesterin-Konzentrationen
Unter der Infusions-Behandlung nahmen bei allen Tieren die z. T. sehr hohen Se mtriglycerid-Werte ab. Nach der 20. Infusion lagen die Werte für die Kontrollen zwischen 570 und 740 mg/dl und für die Hyaluronatlyase-behandelten Kaninchen zwischen 200 und 290 mg/dl.
Bei (2/4) Kontroll-Kaninchen waren die Aortenbögen hochgradig atheromatös und bei 2/4 mittel- bis hochgradig. Bei 2/6 Hyaluronatlyase- behandelten Kaninchen waren die Aortenbögen mittelgradig und bei 4/6 gering- bis mittelgradig atheromatös.
Bei 2/4 Kontrollkaninchen war die A. thoracica hochgradig atheromatös und bei 2/4 mittelgradig atheromatös belegt. Bei 4/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen war die A. thoracica geringgradig atheromatös und bei 2/6 waren kaum erkennbar Beläge. Bei 2/4 Kontrollkaninchen war die Aorta abdominalis hochgradig und bei 2/4 gering- bis mittelgradig atheromatös. Bei 2/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen waren mittelgradige und bei 4/6 schwach - bis geringgradige atheromatöse Beläge erkennbar.
Bei 2/4 Kontrollkaninchen waren die Aa. pulmonalis hochgradig mit Plaques belegt und bei 2/4 gering- bis mittelgradig Bei 1/6 Hyaluronatlyase-Kaninchen waren die Aorta pulmonalis hochgradig, bei 2/6 gering- bis mittelgradig mit Plaques belegt und bei 3/6 keine Plaques vorhanden.
Allgemeinverhalten, Körpetmassen-Entwicklung, Körpertemperatur vor und nach den
Infusionen und klinisch-chemische Parameter von 0,9% NaCl-Lösung- und
Hyaluronatlyase-behandelten Watanabe-Kaninchen wiesen während zweier Behandlungszyklen mit je 10 Infusionen keine auffälligen Unterschiede auf, so dass auf eine gute Verträglichkeit der Infusionsflüssigkeiten geschlossen werden kann.
Eine subjektive Bewertung des makroskopischen Aortenmaterials ergibt, dass die atheromatösen Beläge im Ausmaß bei den 4 mit 0,9 %>iger NaCl-Lösung behandelten Watanabe-Kaninchen hochgradiger erscheinen als bei den 6 mit mikrobieller Hyaluronatlyase-behandelten Watanabe-Kaninchen.
Beispiel 13
Hochreine konzentrierte Enzymlösung wird mit soviel Kochsalzlösung verdünnt, dass die entstandene Lösung 0,9% an Kochsalz und 10.000 IU/ml Hyaluronatlyase enthält. Die Lösung wird durch einen Sterilfilter mit einer Porenweite von 0,2 μm sterilfiltriert. Von dieser Lösung wird unter sterilen Bedingungen je 1 ml in Ampullen gefüllt. Die Ampullen werden unter Sterilbedingungen gefriergetrocknet und unter sterilen
Bedingungen geschlossen. Vor der Injektion werden 1 ml steriles destilliertes Wasser zugegeben. Beispiel 14
Hochreine konzentrierte Enzymlösung wird mit einer Lösung von Magnesiumnikotinat und Magnesiumadipinat (Magnesium compositum „Scharffenberg") so verdünnt, dass die entstandene Lösung 25 mg Magnsiumnikotinat und 88 mg Magnesiumadipinat und 10.000 IU/ml Hyaluronatlyase enthält. Die Lösung wird entsprechend Beispiel 13 ampulliert.
Beispiel 15
Eine Lösung einer hochreinen Hyaluronatlyase wird mit einer Lösung von Kochsalz und Eieralbumin so verdünnt, dass die Lösung 40.000 IU/ml, 0,9% an Kochsalz und 1% an Eieralbumin ist. Die Lösung wird wie in Beispiel 13 beschrieben, weiter verarbeitet.
Beispiel 16
Eine Lösung einer hochreinen Hyaluronatlyase wird mit einer Lösung von Kochsalz und Sojapro teinhydrolysat so verdünnt, dass die Lösung 40.000 IU/ml, 0,9% an Kochsalz und 1% an einem aus Sojaprotein hergestellten Hydrolysat ist. Die Lösung wird wie in Beispiel 13 beschrieben, weiter verarbeitet.
Beispiel 17
Eine Lösung eines hochreinen Fragmentes aus dem Holoenzym von Streptocoecus agalactiae wird mit einer Lösung von Kochsalz und Eieralbumin so verdünnt, dass die Lösung 40.000 IU/ml, 0,9% an Kochsalz und 1% an Eieralbumin ist. Die Lösung wird wie in Beispiel 13 beschrieben, weiter verarbeitet.
Beispiel 18 Eine hochreine konzentrierte Lösung eines Fragmentes aus Streptocoecus agalactiae wird mit soviel Kochsalzlösung und Magnesiumchlorid verdünnt, dass die entstandene Lösung 0,9%) an Kochsalz, und 100.000 IU/ml Lyaseaktivität enthält. Die Lösung wird durch einen Sterilfilter mit einer Porenweite von 0,2 μm sterilfiltriert. Von dieser Lösung wird unter sterilen Bedingungen je 1 ml in Ampullen gefüllt. Die Ampullen werden unter Sterilbedingungen gefriergetrocknet und unter sterilen Bedingungen geschlossen. Vor der Injektion wird 1 ml steriles destilliertes Wasser zugegeben.

Claims

Patentansprüche:
1. Pharmazeutische Formulierung enthaltend eine Hyaluronatlyase bakterieller Herkunft als Holoenzym, ein hyaluronatspaltendes Fragment davon oder eine Mischung beider Formen, und zumindest einen Stabilisator und/oder pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoff.
2. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptocoecus stammt.
3. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronatlyase aus dem Mikroorganismus Streptocoecus agalactiae stammt.
4. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Hyaluronatlyase in Form des Holoenzyms einen isoelektrischen Punkt im Bereich von IP=8,6 und eine Molmasse im Bereich von 116 kD besitzt.
5. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fragment der Hyaluronatlyase eine Molmasse im Bereich von 84 bis 86 kD aufweist.
6. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 für die Behandlung von Gefäßkrankheiten ausgewählt aus der Gruppe Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen, Koronarthrombosen und kardiale Infarkte.
7. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 enthaltend ein hyaluronatspaltendes Fragment einer Hyaluronatlyase erhältlich aus bakterieller Hyaluronatlyase mittels einer enzymatischen partiellen Hydrolyse durch eine Protease, die die Peptidbindung des C- terminalen Restes von aromatischen Aminosäuren spaltet.
8. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Injektionspräparat für intravenöse oder intraarterielle Injektionen vorliegt.
9. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft und/oder ihres Fragments zwischen 20.000 bis 4.000.000 IU/ml beträgt.
10. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Injektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und etwa 1% (w/w) Albumin und/oder dessen Hydrolysate.
11. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Injektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und Magnesiumsalze.
12. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 umfassend eine gereinigte wäßrige Injektionslösung enthaltend Hyaluronatlyase und/oder ihr Fragment und Glukose.
13. Enzymfragment der bakterielle Hyaluronatlyase, dadurch gekennzeichnet, daß es Hyaluronatlyaseaktivität aufweist.
14. Enzymfragment gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptocoecus stammt.
15. Enzymfragment gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronatlyase aus dem Mikroorganismus Streptocoecus agalactiae stammt.
16. Enzymfragment gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer bakteriellen Hyaluronatlyase durch enzymatische partielle Hydrolyse mittels einer Protease, die die Peptidbindung des C-terminalen Restes von aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt wird.
17. Enzymfragment gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt wird, indem eine bakterielle Hyaluronatlyase der enzymatischen partiellen Hydrolyse durch eine Protease in Träger-immobilisierter Form unterworfen wird.
18. Enzymfragment gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt wird, indem eine bakterielle Hyaluronatlyase der enzymatischen partiellen Hydrolyse durch die Metalloprotease MO/2 in Träger-immobilisierter Form unterworfen wird.
19. Enzymfragment nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt wird, indem eine Hyaluronatlyase aus Streptokokken einer enzymatischen partiellen Hydrolyse durch die Metalloprotease MO/2 bei einer Azidität im pH-Bereich von pH 6,5- pH 8,0 und Temperaturen im Bereich von 25°C bis 45°C unterworfen wird.
20. Enzymfragment nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt wird, indem eine Hyaluronatlyase aus Streptocoecus agalactiae, mit einer Molmasse von etwa 1 15.000 - 120.000 D, einer enzymatischen partiellen Hydrolyse unterworfen wird.
21. Enzymfragment nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Molmasse von etwa 84.000 - 86.000 Dalton aufweist.
22. Enzymfragment nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es eine spezifische Aktivität von 400.000 bis 800.000 IU/mg aufweist.
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