DE10103271A1

DE10103271A1 - Pharmazeutische Formulierungen zur Erweichung von Bindegewebe, insbesondere zur Formkorrektur von Bindegewebe und Bindegewebestrukturen

Info

Publication number: DE10103271A1
Application number: DE10103271A
Authority: DE
Inventors: Joerg-Hermann Ozegowski; Peter-Juergen Mueller; Albert Haertl; Waltraud Hertel
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Z&Z Service GmbH
Priority date: 2001-01-23
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2002-07-25
Also published as: WO2002059289A1

Abstract

Aufgabe war es, einen aufwandgering herstellbaren sowie möglischt universell für viele kosmetische bzw. medizinische Behandlungen verwendbaren, hochaktiven und sehr gut bioverträglichen Wirkstoff mit möglichst kurzer Behandlungszeit zur Erweichung von Bindegewebe zu schaffen, welcher frei von potenziell pathogenen Material tierischer Herkunft ist und keine negativen Wirkungen bei der Anwendung als parenterales oder epikutanes Injektionspräparat, in einer Katheterflüssigkeit oder als topisch epidermale Formulierung, beispielsweise in Verbindung mit einem Pflaster, besitzt. DOLLAR A Erfindungsgemäß enthalten die Formulierungen das mikrobielle Enzym Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1) und/oder ein Enzymfragment desselben mit einer Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5000000IU/ml sowie gegebenenfalls pharamazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel. DOLLAR A Die pharmazeutischen Formulierungen sind insbesondere zur Anwendung im medizinischen und veterinärmedizinischen Bereich sowie in der Kosmetik vorgesehen, um ohne operativen Eingriff Formkorrekturen von Bindegewebe bzw. Bindegewebsstrukturen bei Mensch oder Säugetier zu bewirken (z. B. medikamentöse Korrektur von Ohrformen, Ballondilatation von verengten Arterien, Cellulite- und Narbenbehandlung).

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Formulierungen zur Erweichung von Bindegewebe (Textus connectivus) bei Mensch oder Säugetier. Mit diesen pharmazeutischen Formulierungen ist insbesondere eine bleibende Formkorrektur des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur bei Mensch oder Säugetier ohne erforderlichen operativen Eingriff vorgesehen. Die Anwendungsgebiete liegen im medizinischen und veterinärmedizinischen Bereich sowie in der Kosmetik. Beispielsweise kann die Erfindung bei der medikamentösen Korrektur von Ohrformen, bei der Reduzierung des Ausmaßes von Narben, bei der Ballondilatation von verengten Arterien oder bei der Cellulitebehandlung Verwendung finden.

Gründe für eine human- oder veterinärmedizinische Behandlung mit dem Ziel, eine bleibende Formkorrektur zu erreichen, können beispielsweise in der Korrektur einer Formabweichung des Erscheinungsbildes bzw. der Form innerer Organe und Strukturen vom Durchschnitt der normalen Formenvielfalt liegen. Dabei kann die zu korrigierende Formabweichung sowohl im Bereich der normalen Formenvielfalt liegen als auch infolge einer Krankheit oder Verletzung entstanden sein. Derartige Formkorrekturen können auch andere Behandlungsmaßnahmen unterstützen.

Erscheinungen, die sich im Rahmen der normalen Formenvielfalt bewegen, sind häufig abstehende und deformierte Ohren sowie übermäßige Faltenbildung, welche durch die in der Unterhaut vorhandenen Bindegewebestrukturen verändert werden sollen. Auch bei der Zucht von Tieren existieren allgemein anerkannte Merkmale, wie hängende oder aufrechtstehende Ohren, welche im Fall einer Abweichung als korrekturbedürftig empfunden werden.

Des weiteren können Formkorrekturen mit kosmetischer Relevanz u. a. im Ergebnis gutartiger Bindegewebewucherungen, wie Keloide und Narben, durchgeführt werden. Narben entstehen beispielsweise nach Verletzungen oder werden durch Akne hervorgerufen. Insbesondere hypertrophe Narbenbildung wird als sehr unangenehm empfunden, so dass derartige Korrekturen das Wohlbefinden und die Lebensqualität des Menschen wesentlich erhöhen können sowie zu einem sichereren Auftreten in der Öffentlichkeit beitragen.

Die für Cellulite charakteristischen Unebenheiten der Hautoberfläche sind auf die das Fettgewebe stabilisierenden, netzförmig verknüpften Bindegewebestränge zurückzuführen, welche auf Grund ihrer größeren Zugfestigkeit zu den sichtbaren Einziehungen des Fettgewebes und zu Dellen in der Oberhaut führen. Die genannten Erscheinungen stellen bei normaler Ausprägung zwar keinen Krankheitszustand dar, werden aber von den Betroffenen subjektiv als nachteilig betrachtet.

Die Formkorrektur von elastischen Knorpeln, beispielsweise der Ohren, oder von lockerem Bindegewebe ist bekannt und wird ohne Operationen nur durch langeinwirkenden mechanischen Druck erreicht. So können die Ohrmuschelform sowie die Stellung der Ohrmuscheln zum Kopf bei Säuglingen mit Hilfe von Druckverbänden korrigiert werden. Druckverbände werden auch angewendet, um Narbenwulste zu verkleinern.

In anderen Fällen können durch eine aktive Formkorrektur von Bindegewebestrukturen lebensbedrohende Krankheitszustände auf eine nachhaltige Weise beseitigt werden. Dies ist z. B. bei der Erweiterung des verringerten Innenlumens von verengten Arterien mit einem Ballonkatheter und nachfolgenden Einsetzen eines Stents der Fall. Bei Anwendung dieser Methode kommt es häufig zur Bildung von Expansionsrissen in der Aderwand, die im Lauf einiger Monate durch einen Wachstumsreiz die Bildung einer Neointima auslösen, die den Stent überwuchert. Dadurch entsteht an derselben Stelle, an welcher die primäre Verengung aufgeweitet wurde, eine neue sekundäre Verengung. Grund für die Rissbildung ist die Sprödigkeit der Aderwand, die durch den Ballonkatheter nicht gedehnt, sondern gesprengt wird.

Kosmetisch relevantes bzw. subjektiv als unvorteilhaft empfundenes Aussehen eines Menschen kann damit zusammenhängen, dass das mit dem Bindegewebe in enger Verbindung stehende Fettgewebe bzw. das Haut- und Fettgewebe durch das Bindegewebe in einer ungünstigen Form festgehalten wird. Im Bindegewebe, wie auch ganz allgemein in der intrazellulären Matrix, sind Glycosaminoglycane vorhanden. Sie erzeugen auf Grund ihrer negativen Ladungen den Turgor des Gewebes, und die Festigkeit des Bindegewebes steht mit ihnen in engem Zusammenhang.

So treten besonders bei Frauen häufig mit Cellulite bezeichnete, sichtbare Unebenheiten der Oberhaut an Körperstellen auf, die vorwiegend mit dickeren Schichten von Fettgewebe bedeckt sind. Es gibt zahlreiche Versuche, das Ausmaß von Cellulite durch mechanische, kosmetische oder auch medikamentöse Behandlungen zu verringern. Die Behandlungen haben generell das Ziel, den Fettabbau zu stimulieren bzw. die Fettbildung zu inhibieren. Hierzu wird in DE 197 18 848 A1 eine kosmetische Komposition vorgeschlagen, die Molke, Meersalz und Orangenöl enthält.

Im WO 99/47112 wird eine Behandlung mit Niacinamid zum Abbau von Fettüberschuss vorgeschlagen. In den Patentschriften JP 9.221.406, US 5.972.340, US 5.591.437 und US 5.705.170 werden pharmazeutische Formulierungen auf Pflanzenbasis angegeben, die einen lokalen Fettabbau bewirken sollen und gleichzeitig Cellulite bekämpfen. Das US 5.945.109 setzt kosmetische Produkte ein, die Aromatase bzw. eine -inhibierende bzw. eine Antiöstrogen-Wirkung haben. Im FR 2.761.888 wird der Fettaufbau durch einen Glukose-6-phosphatdehydrogenaseinhibitor verringert. Die Patentschrift US 5.523.090 gibt Xanthin, Inositolphosphat und alpha-Hydroxysäuren sowie die US 5.667.793 Xanthin in Verbindung mit pflanzlichen Extrakten enthaltende kosmetische Präparaten an, um den lokalen Fettabbau zu stimulieren. Nach dem US 5.587.396 wird sowohl der Wasserverlust durch die Haut reduziert als auch die Inhibition der Fettsynthese durch pharmazeutische Formulierungen, die Milchsäure, Retinoide wie Vitamin A, Palmitat und Cerebroside enthalten, gefördert. Eine kosmetische Komposition, die Inositolphosphat und Phytinsäure enthält, wird im US 5.536.499 beschrieben. Das US 5.529.769 schlägt eine Behandlung mit Betulinsäure und Ascorbinsäure zur Verhinderung von Cellulite vor.

Narben sollen nach US 4.694.021 in topisch angewendeten kosmetischen Produkten durch Harnstoff und gemäß US 5.789.445 durch Benzoylperoxid erweicht werden. US 5.873.728 schlägt 9-cis Retinsäureester und -amide für die Behandlung von Akne Velaris, cystische Akne, Hyperpigmentation, Psoriasis, dermale und epidermale Hypoplasia und Keratosen, Hautfalten sowie eine Vielfalt von weiteren pathologischen Zuständen der Haut vor.

In neuerer Zeit gewinnen auch enzymatische Medikamente an Bedeutung. In der Patentschrift US 4.645.668 wird die Injektion einer pharmakologisch zulässigen Lösung eines oder mehrerer der Enzyme, wie Kollagenase, Elastase, Papain, Plasminogen- Aktivator, Mastzellen-Protease oder lysosomale Hydrolasen, in Kombination mit dem Enzym Hyaluronidase (E. C. 3.1.2.35/36) publiziert. Die angegebene Hyaluronidase wird ausnahmslos aus Testis von Säugetieren gewonnen. Es wird eine Wirkung gegen Cellulite, Hautfalten und neoplastische Fibrosis angegeben. Über Hyaluronidase ist bekannt, dass es als "spreading enzyme" die Ausbreitung von anderen Verbindungen, darunter auch von Verdauungsenzymen im Bindegewebe fördert. Die Verdauungsenzyme sollen vor allem Kollagen abbauen. Kollagen ist in der interzellulären Matrix aller Bindegewebe vorhanden. Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht ganz korrekt drei unterschiedlich wirkende hyaluronsäurespaltende Enzymtypen (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, welche die β-(1-3)-Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Die Hyaluronat- Glycanhydrolasen (E. C. 3.2.1.35/36) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glycosaminoglycane. Einen weiteren Typ stellt die Endo-β-Hyalufonidase aus dem Blutegel dar, welche die β-(1-4)-Bindung hochspezifisch spaltet.

Hyaluronidasen aus Tierhoden werden eingesetzt, um tierisches bzw. menschliches Gewebe durchlässiger zu machen. Hyaluronidase aus Rinderhoden dient als Resorptionsbeschleuniger subkutan verabreichter Arzneimittel und zur schnelleren Rückbildung von Ödemen. Gute Wirkungen wurden bereits in den 60er Jahren mit hochdosierter, intravenös verabreichter Rinderhoden-Hyaluronidase "Dessau" bei akuter Tendovaginitis und Paratenonitis crepitans, bei der intravenösen Behandlung des plantaren Fersensporns und in der Dermatologie erzielt. So kam es bei progressiver Sklerodermie, bei zirkumskripter Sklerodermie und bei Keloiden nach Hyaluronidase-Behandlung zu einer wesentlichen Verringerung der Beschwerden.

Im EP 0 193 330 B1 beschreiben die Erfinder die Herstellung und Anwendung einer speziellen Endo-β-glucuronidase mit einer Molmasse von 28.500 D aus einem Blutegel zur Stimulierung des Flusses physiologischer Flüssigkeiten bei Augenkrankheiten. Dieses Enzym ist spezifisch für Hyaluronsäure und unterscheidet sich von einer bekannten Endo β-glucuronidase aus dem Blutegel (Hirudo medicinalis) durch eine höhere Stabilität bei höheren Temperaturen und extremen pH-Werten.

Bei den zuletzt genannten Verfahren werden Hyaluronidase (E. C. 3.1.2.35/36) angewendet, welches saure Glycosaminoglycane nach einem hydrolytischen Mechanismus spaltet. Das Enzym wird aus Säugetieren, insbesondere aus den Testes von Rindern, gewonnen.

Nachteilig ist bei ihrer Anwendung, dass eine generelle Gefahr der Übertragung von infektiösen Material aus den Tieren besteht.

Seit den 60er Jahren gibt es Literaturhinweise, dass Rinderhoden-Hyaluronidase zur therapeutischen Beeinflussung arterieller Gefäßerkrankungen beim Menschen, insbeson dere zur Durchblutungsverbesserung der peripheren Gefäße eingesetzt werden kann (z. B. Thurnherr und Koch, zitiert bei Wolff: Behandlungsergebnisse mit intravenösen Magne sium comp./Hylase-Mischinjektionen bei Arteriopathien vom Beckentyp im Stadium II. Z. ärztl. Fortbild., 66, 1972, 446-447).

In den 70er Jahren wurde versucht, die Spätfolgen des Herzinfarktes im Tiermodell mit Hyaluronidasen zu beeinflussen. Ziel der Studien war eine Verkleinerung der kardialen Nekroseareale bedingt durch die beschleunigte Gefäßneubildung nach dem Infarkt und eine Verbesserung der periphären Durchblutung.

Gottlieb (US 3.708.575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen, wie Herz arrythmien, Thrombosen, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen und Herzinfarkte, insbesondere von Atherosklerose, mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU per Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathecal injiziiert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicher weise wird das Enzym im Titel der Patentschrift als Glucuronoglycosaminoglycan- Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung eindeutig hervorgeht, dass es sich um eine Hyaluronidase aus Rinderhoden handelt. Ein Enzym mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase, da dieses Enzym unspezifische Wirkung besitzt. Auch die angewendete Aktivitätsbestimmungs methode bezieht sich auf eine Vorschrift zur Hyaluronidasebestimmung.

Hyaluronidase aus tierischem Material wurde auch in Formulierungen zur Senkung nasaler Allergien (GB 1.098.957) und Bekämpfung von Allergien und Autoimmunkrankheiten (GB 1.179.787) vorgeschlagen. Das Enzym wurde nach GB 1.060.513 aus tierischen Hoden hergestellt und als "Hyaluronatlyase" bezeichnet. Nach dem damaligen Erkenntnisstand (H. Greiling, H. W. D. Stuhlsatz, T. Eberhard: Z. Physiol. Chemie, 1965, 340, 243 sowie GB 1.060.513) zitierten Stand der Wissenschaft handelt es sich aber bei dem aus tierischen Material gewonnenen hyaluronsäurespaltenden Enzymen um eine hydrolytisch wirkende Hyaluronidase und nicht, wie behauptet, um eine Hyaluronatlyase. Außerdem wurde das Holoenzym einer mikrobiellen Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae als Penetrationsverstärker von Arzneimitteln und kosmetisch wirksamen Substanzen vorgeschlagen (WO 0.038.732 A1). Ein Enzymfragment einer mikrobiellen Hyaluronatlyase wird in DE 19.860.542 A1 beschrieben.

Bekannt ist weiterhin, dass durch die Injektion des Enzyms Hyaluronidase eine schnelle und reversible Beeinflussung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels des Ohres, welches teilweise aus elastischen Knorpel besteht, bewirkt wird. Nach Fixierung in eine bestimmte Form oder Lage wird eine irreversible Formveränderung der Ohrmuschelform oder der Ohrenstellung des Menschen erreicht (Dr. H. Sudhoff, HNO-Klinik der Ruhr- Universität Bochum im St. Elisabeth-Krankenhaus Bochum).

Nachteilig bei der medizinischen Anwendung der Hyaluronidase tierischer Herkunft; wie beispielsweise bei der Veränderung der Stellung der Ohrmuschel, ist jedoch, dass das Enzym auf Grund seiner tierischen Herkunft die Gefahr einer Übertragung von Viren und anderem infektiösen Material in sich trägt. Da handelsübliche Hyaluronidase meistens aus tierischem Material (Rinderhoden) gewonnen wird, besteht die Gefahr einer BSE- Infektion. Weiterhin ist nachteilig, dass bei der Herstellung der Hyaluronidase zur Entfernung von Verunreinigungen in Form von Inhaltstoffen aus dem tierischen Material ein relativ großer Reinigungsaufwand betrieben werden muss.

Darüber hinaus wird Hyaluronidase aus tierischem Gewebe durch körpereigene sulfatierte Mukopolysaccharide und im Serum enthaltene unspezifische Inhibitatoren inaktiviert. Dadurch wird die Wirkung der Hyaluronidasen tierischen Ursprungs sehr begrenzt.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, einen aufwandgering herstellbaren sowie möglichst universell für viele kosmetische bzw. medizinische Behandlungen verwendbaren, hochaktiven und sehr gut bioverträglichen Wirkstoff mit möglichst kurzer Behandlungszeit zur Erweichung von Bindegewebe zu schaffen, welcher frei von poten ziell pathogenen Material tierischer Herkunft ist und keine negativen Wirkungen bei der Anwendung als parenterales oder epikutanes Injektionspräparat, in einer Katheterflüssig keit oder als topisch epidermale Formulierung, beispielsweise in Verbindung mit einem Pflaster, besitzt.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass je nach Art der zu verformenden Bindegewebe anwendungsspezifische pharmazeutische Formulierungen vorgeschlagen werden, die das mikrobielle Enzym Hyaluronatlyase als Holoenzym (E. C. 4.2.2.1) und/oder ein Enzymfragment derselben mit einer Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5.000.000 IU/ml sowie gegebenenfalls pharmazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel, wie auch Stabilisatoren und/oder Hilfsstoffe, enthalten. Diese Formulierungen können entsprechend der zweckbestimmten Verwendung bei den zu verformenden Bindegewebestrukturen auf sehr unterschiedliche Weise, insbesondere in Form eines Injektionspräparats, einer Katheterlösung oder topisch/epidermal wirkend, zur Anwendung kommen und sind deshalb für viele medizinische bzw. kosmetische Behandlungen einsetzbar.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Ergebnis, dass die pharmazeutischen Formulierungen, welche das besagte mikrobielle Enzym enthalten, eine an sich bekannte Wirkung von Hyaluronidase tierischer Herkunft aufweisen, Bindegewebe zu erweichen bzw. sein Turgor zu verringern, indem die Formulierungen entsprechend der räumlichen Lage und des Ausmaßes der zu behandelnden Bindegebestrukturen je nach Anwendung entweder unmittelbar dem Bindegewebe oder dessen Umgebung zugeführt werden.

Damit sind diese Formulierungen, die keine Hyaluronidase enthalten, ebenfalls für die Verwendung geeignet, Bindegewebe und Bindegewebestrukturen unter dem Einfluss von Kräften ohne erforderliche operative Einwirkung formen zu lassen.

Vorteilhaft ist dabei, dass keine hyaluronsäurespaltenden Enzyme aus tierischen Quellen sowie andere Enzyme, wie beispielsweise Kollagenasen oder Protease angewendet werden und dass das mikrobielle Enzym auf biotechnisch/fermentativen Weg gewonnen werden kann und somit keinerlei potenziell pathogenes Material tierischer Herkunft enthält.

Überraschend wurde ferner festgestellt, dass die pharmazeutischen Formulierungen mit Hyaluronatlyase eine noch höhere Wirkung bei der Erweichung des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur aufweist als vergleichbare Wirkstoffe, die auf Hyaluronidasen aus Rinderhoden bestehen. Darüber hinaus wird die Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten Hyaluronatlyase bzw. ihres Fragments nicht durch körpereigene Inhibitoren beeinflusst, wie das bei Hyaluronidasen der Fall ist.

Eine vorteilhafte Möglichkeit der Zuführung des Enzyms besteht darin, eine Formulierung in Form einer Injektionslösung in das Bindegewebe zu injizieren. Beispielsweise können eine oder mehrere bzw. einer Vielzahl von Injektionen in das Bindegewebe oder in die Nachbarschaft der zu erweichenden Bindegewebestruktur gesetzt werden. Es wurde gefunden, dass durch viele intrakutane oder subkutane flache Injektionen des Enzyms in das Hautgewebe und in die Unterhaut ein wirksame Erweichung des darunter liegenden Bindegewebes erreicht werden kann.

Bei einer anderen vorteilhaften Anwendung wird eine Formulierung in Form einer Katheterlösung in das Lumen von Körperhöhlen und Organöffnungen eingeführt. Dort kann sie verbleiben oder sie wird als Spülflüssigkeit wieder nach außen befördert. Überraschend wurde auch gefunden, dass bei der Erweichung von nahe der Oberhaut gelegenen Bindgeweben, die beispielsweise bei der Ausprägung von Cellulite, Narben und Hautfalten von Bedeutung sind, eine Formulierung in der Form wirksam zur Anwendung kommen kann, welche das Enzym bzw. Enzymfragment topisch/epidermal auf die Ober haut aufbringt. Bei dieser Anwendung penetriert die Hyaluronatlyase oder ihr Fragment durch die Epidermis und erweicht die darunter gelegenen Bindegewebestrukturen. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass das Enzymfragment eine noch bessere Wirkung bei der Erweichung von oberhautnahen Bindegewebebereichen bewirkt als das gleichaktive Holoenzym.

Das Enzymfragment kann in weiteren Formulierungen zusammen mit anderen Wirkstoffen und/oder Arzneimitteln und/oder Substanzen mit kosmetischer Relevanz angewendet werden, wobei die an sich bekannte Verwendung des Holoenzyms Hyaluronatlyase, eine Beschleunigung des Transports von Arzneimitteln durch die Haut zu bezwecken (WO 0.038.732 A1), jedoch nicht zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zählt.

Eine weitere vorteilhafte Anwendung der Erfindung sind Formulierungen als wässrige Lösung, als mit einem Hydrokolloid angedickte wässrige Lösung, als Paste, als Salbe, als Gel oder als Schaum. Das Enzym bzw. dessen Fragment kann auch in Verbindung mit einer flexiblen Trägerschicht z. B. in Form eines Pflasters oder einer Binde auf die betreffende Hautpartie aufgebracht werden.

Die relativ aufwandgeringe Herstellung der in den erfindungsgemäßen Formulierungen eingesetzten hochreinen Hyaluronatlyase bzw. des Enzymfragments kann beispielhaft in nachfolgend genannter und die Verwendung sowohl hinsichtlich der Reihenfolge als der Auswahl der Reinigungsschritte die Anwendung der Erfindung nicht einschränkender Weise durchgeführt werden:
Die Fermentation des Mikroorganismus erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH- Konstanthaltung. Nach etwa 20-stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird verworfen. Das Kulturflitrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen wird, bevor sie beispielsweise als Katheterlösung verwendet werden kann. Durch die Reinigungsschritte und der Anwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird eine Pyrogenfreiheit des Präparates gewährleistet. Das Enzym wird an Phenylsepharose adsorbiert; anschließend erfolgt eine Desorption. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Daran schließt sich eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, beispielsweise Aminophenyloxaminsäure, an. Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) erfolgen.

Die Enzymfraktion kann in folgender Weise zur Herstellung des Fragmentes eingesetzt werden:
Eine spezifisch spaltende Protease wird in an sich bekannter Weise, beispielsweise an Sepharose gebunden. Als spezifisch wirkende Protease kann beispielsweise die Protease MO/2 (DD 270 924) eingesetzt werden. Die immobilisierte Protease wird z. B. bei pH 7,5 und einer Temperatur von 37°C mit einer wässrigen Hyaluronatlyaselösung gemischt. Nach abgeschlossener Verdauung wird das Fragment mit Ammoniumsulfat gefällt und durch Molekulargewichtschromatografie in hochreiner Form gewonnen.

Das hochgereinigte Enzym bzw. Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt. Das gereinigte und konzentrierte Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg; die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt im Bereich zwischen 400.000 IU/mg und 800.000 IU/mg.

Die hochreine Enzymlösung bzw. fragmenthaltigen Fraktionen können, wie bereits erwähnt, nach Konzentrierung unter teilweiser Wasserentfernung und gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder pharmakologisch aktiven Substanzen und Sterilfiltration als Injektions- oder Katheterlösung eingesetzt werden, wobei die hochreine Enzym- bzw. Fragmentlösung nach Sterilfiltration beispielsweise unter Zusatz von 5 mM Magnesiumchlorid und 1% Eieralbumin auch gefriergetrocknet werden kann. Das gefriergetrocknete Enzym bzw. Fragment kann mit Kochsalzlösung als isotonische Katheterlösung gelöst werden.

Für topisch/epidermale Anwendungen wird das gefriergetrocknete Enzym vorzugsweise in eingedickten wässrigen Lösungen zusammen mit Gelbildnern oder Hydrokolloiden oder als Paste, Salbe, Creme bzw. als Gel oder Schaum in an sich bekannter Art verwendet. Diese können neben der Verwendung des Fragments auch Arzneimittel oder sonstige Wirkstoffe enthalten.

Die bezweckte Erweichung des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur stellt sich dar als ein Abfall des Turgors im Gewebe, verbunden mit einem verringerten mechanischen Widerstand gegenüber einer Krafteinwirkung. Diese verformenden Kräfte werden zielgerichtet auf die angestrebte Formänderung eingesetzt, wobei die Kräfte je nach Behandlungsart entweder kurzzeitig, im Bereich von Stunden oder auch langfristig bis zu mehreren Wochen kontinuierlich oder fluktuierend einwirken. In der Praxis kommen hier vorteilhaft Druck- bzw. elastische Verbände, wie auch unter mechanischer Spannung stehende Klebestreifen etc. zur Anwendung. Beispielsweise können hervorstehende Narben mit Pflastern auf oder sogar unter das Höhenrelief der umgebenden Körperoberfläche gedrückt werden.

Arterien, die mit einem Ballonkatheter gedehnt werden sollen, werden insbesondere durch Injektion von der äußeren Aderwand mit Hyaluronatlyase behandelt. Anschließend erfolgt die Ballondilatation auf an sich bekannte Weise, wobei die Behandlung durch das Setzen eines Stents abgeschlossen werden kann. Vorteilhaft können durch diese Behandlung der medikamentösen Erweichung mit anschließender Dehnung Risse in den Aderwänden als Ursache für das schnelle Wiederzuwachsen der gedehnten Stelle bzw. des gesetzten Stents vermieden werden (avgl. Zeichnung).

Das Enzym bzw. Enzymfragment kann über Öffnungen, Poren oder Kavernen in festen Oberflächen aufgenommen werden, welche die formenden Kräfte auf die Haut bewirken, indem die Festigkeit dieser Oberflächen größer ist als die Druckfestigkeit des zu behandelnden Gewebes.

Bei Katheterlösungen für die Ballondilatation wird das Enzym bzw. Enzymfragment über die der Arterienwand zugewandte Oberfläche des Ballons vor der Druckausübung zugeführt. Katheterlösungen werden auch angewandt, wenn an Körperhohlräume angrenzende Bindegewebe zu erweichen und ihre Form zu korrigieren sind.

Bei der Cellulitebehandlung erfolgt eine Dehnung der Bindegewebestränge vor allem durch Druck des Fettgewebes auf das Bindegewebenetz. Die dehnende Wirkung kann durch Maßnahmen, wie Massage, aktive oder passive Muskelbewegungen, Sport u. a., unterstützt werden.

Die Erfindung soll nachstehend anhand mehrerer Ausführungsbeispiele erläutert werden. Die Zeichnung (Ausführungsbeispiel 9) zeigt die Dehnbarkeit eines durch eine erfindungs gemäße Formulierung behandelten sowie eines unbehandelten Blutgefäßes mit jeweils einem Außendurchmesser von 4 mm, die mit einem Ballonkatheter aufgeweitet wurden. Die Funktionen verkörpern dabei die Abhängigkeit der Dehnung in mm vom Ballon druck (atm) des Ballonkatheters.

Ausführungsbeispiel 1

Die Fermentation wird in einem gerührten Fermentor mit einem Bruttofüllvolumen von 30 l durchgeführt. Das Arbeitsvolumen beträgt 20 l. Zur Beimpfung wird ein allgemein verfügbarer Stamm der Art Streptococcus agalactiae eingesetzt. Die Stammkonservierung erfolgt mit einer Kryokonserve (Mast-Diagnostica). Eine Kugel, bedeckt mit Stammmate rial, wird in ein Agarschrägröhrchen mit Keimzahlagar gegeben und durch Bewegung mit der Agaroberfläche in Berührung gebracht (Kultur A). Anschließend wird zur Sterilkon trolle die abgerollte Kugel in 3 ml einer Herz-Hirn-Bouillon gegeben (Kultur B). Beide Kulturen werden 24 h bei 37°C als Standkulturen kultiviert.

Erste Vorkultur

2 × je 50 ml eines Kulturmediums, welches 5 g/l Caseinpepton und 10 g/l Hefe-Extrakt (Difco) enthält, werden in zwei 100 ml Steilbrustflaschen gefüllt und bei pH 7,0 sterilisiert. Zusätzlich zu den 50 ml Kulturmedium wurden jeweils 5 ml Eagle-Medium kurz vor Beimpfung zugesetzt.

Die Beimpfung erfolgt mit einer Abschwemmung des Agarschrägröhrchen Kultur A mit der Kulturlösung von Kultur B. Die Steilbrustflaschen werden unter Schütteln (150 rpm) bei 37°C über 24 h kultiviert.

Zweite Vorkultur

2 × je 1 l eines Kulturmediums, bestehend aus 20 g/l Hefe-Extrakt, 10 g/l pankreatischem Pepton, 1,75 g/l Na-acetat, 7 g/l Na-hydrogencarbonat (extra gelöst), 7 g/l Di-Na-hydro genphosphat × 2H₂O und 3,5 g/l Na-Di-hydrogenphosphat, werden auf pH 6,2 vor Sterili sieren mit 20% H₂SO₄ eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH bei etwa 7,0.

Eine Lösung mit 6,0 g/l Glucoselösung wird separat autoklaviert. Davon werden 100 ml vor Beimpfen der zweiten Vorkultur zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt durch Zugabe von 50 ml der ersten Vorkultur (Beimpfung mit 5% v/v). Die Kultivierung erfolgt unter langsamem Schütteln bei ca. 45 rpm bei 32°C für 24 Stunden.

Hauptkultur

Das Medium der Hauptkultur besteht aus 20 g/l Hefe-Extrakt, 10 g/l pankreatisches Pepton und 25 g/l Glucose. Die Glucose wird extra autoklaviert. Die Beimpfung erfolgt mit einem Liter der zweiten Vorkultur. Die Fermentationsparameter betragen 34°C, pH 7,0, Belüftung über Kopfraum (25 l/min Luft) und Rührgeschwindigkeit 150 rpm. Der pH-Wert wird durch Titration mit einer 40% Natronlaugelösung konstant gehalten. Glucose wird manuell so zugegeben, dass die Glucosekonzentration nicht unter 5 g/l sinkt. Nach 11 Stunden wird die Kultivierung abgebrochen.

Ausführungsbeispiel 2

50 l Kulturlösung einer Fermentation der Art Streptococcus agalactiae mit einem Hyaluronatlyase-Aktivität von 400 IU/ml werden durch Sterilfiltration in einem 0,2 µm Filter von den Lebendzellen befreit. Die klare Kulturfiltratlösung wird anschließend durch Ultrafiltration bei einem cut off von 60.000 D zu einem Kulturkonzentrat von 2 l einge engt. Diesen 2 l Kulturkonzentrat werden 480 g festes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die bei dieser Konzentration ausfallenden Proteine werden durch eine Klarfiltration unter Verwendung eines Filterhilfsmittels abgetrennt und das klare Konzentrat auf eine zuvor mit 40%iger phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 equilibrierte Phenylsepha rose-Säule von 2,5 × 20 cm aufgetragen. Nach Wäsche mit einer 35%igen phosphat gepufferten Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 wird die Hyaluronatlyase mit einer 25%igen phosphatgepufferten Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden vereinigt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% eingestellt. Das ausgefallene Präzipitat wird gesammelt sowie in 100 ml 0,03 M Trispuffer pH 8,2 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Anschließend wird die dialysierte Rohhyaluronatlyaselösung über eine equilibrierte Q-Sepharosesäule von 2,2 × 15 cm gegeben. Die Hyaluronatlyase befindet sich im Durchlauf. Der Durchlauf wird durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 80% gesättigt. Das ausfallende Protein wird gesammelt, in 0,05 M Trispuffer pH 8,7 gelöst und über eine Sephadex G 10-Säule vom Ammoniumsulfat befreit. Die so equilibrierte hyaluronatlyasehaltige Lösung wird auf eine entsprechend equilibrierte Affinitätssäule (0,8 cm × 10 cm) von N-(p-Amino phenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,1 M NaCO₃ -Lösung pH 9,7 eluiert. Die eluierten hyaluronatlyasehaltigen Fraktionen werden vereinigt und durch Sättigung auf 80% mit Ammoniumsulfat gefällt. Das gefallene Präzipitat wird gesammelt, in 1 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,5 gelöst und auf eine Superdex 200-Säule (16 × 60) aufgetragen. Die Hyaluronatlyase-Proteinbande bei 116.000 D wird gesammelt und gegen 0,02 M Trispuffer pH 7,5, welcher 0,005 M MgCl₂ enthält, dialysiert. Es werden 10 mg Hyaluronatlyase mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 IU/mg erhalten. Der dialysierten Hyaluronatlyase lösung wird Ovalbumin in einer Konzentration von 1% zugesetzt und die Lösung lyophil getrocknet.

Durch unterschiedlichen Wassergehalt werden Enzymlösungen zwischen 20.000 IU/ml und ca. 4.000.000 IU/ml erhalten.

Das Holoenzym besitzt einen isoelektrischen Punkt im Bereich von IP = 8,6 und eine Molmasse im Bereich von 116 kD.

Ausführungsbeispiel 3

10 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Phosphat puffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g fixierter MO/2-Proteasesepharose zugesetzt, an die eine proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/g gebunden wurden. Nach 15 Minuten wird die Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80% ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment gesammelt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molge wichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hatte eine spezifische Aktivität von 600 000 IU/mg.

Ausführungsbeispiel 4

4 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Tris-HCL- Puffer pH 7, 8 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C gebracht. Dieser Lösung werden 80 µg der Protease MO/2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Kunitz- Einheiten/mg zugefügt und das Gemisch für 30 Minuten bei 37°C verdaut. Zum Stoppen der Reaktion werden dem Gemisch 10 µl 0,1 M EDTA pH 7,0 zugesetzt. Danach wird das Gemisch auf eine 3 ml Affinitätssäule von N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose auf getragen und mit 0,05 M Na₂CO₃ pH 9,7 eluiert. Das Fragment wurde durch. Sättigung auf 80% Ammoniumsulfat gefällt, gesammelt und durch Molekulargewichtschromatografie gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 460 000 IU/mg.

Ausführungsbeispiel 5

Aktivitätsbestimmung für Hyaluronatlyase bzw. des Fragments:

a) Optischer Test bei 232 nm

Es wird eine Stammlösungen für Hyaluronsäure (30 mg/100 ml) hergestellt und bei 4°C aufbewahrt.

Der Standardtestansatz erfolgt in 3 ml-Quarzküvetten (d = 1 cm) bei einer Wellenlänge von 232 nm und einer Temperatur von 26°C. Zu 1,8 ml 0,1 M Azetatpuffer pH 6,0 werden 200 µl Hyaluronsäure-Stammlösung gegeben und die Reaktion mit 2 bis 4 U/ml (50 ml) Hyaluronatlyase gestartet. Das Endvolumen beträgt 2050 µl.

Hyaluronatlyase zeigt eine lineare Zunahme der Extinktion bei 232 nm, aus deren Anstieg sich die Aktivität berechnen lässt.

Dabei wird ein Extinktionskoeffizient von ε = 6,0 × 10³ l × mol^-1cm^-1 für das gebildete Δ^4,5- ungesättigte Uronid zugrundegelegt (J. Ludowig: The mechanism of hyaluronidases. JBC 236, 333-339 (1991)).

b) Optischer Test bei 600 nm auf Mikroplatten

Bestimmung der Lyaseaktivität nach D. Gerlach, W. Köhler "Hyaluronatlyase von Streptococcus pyogenes. II. Charakterisierung der Hyaluronatlyase" (E. C. 4.2.99.1.) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 221, 296-302 (1972).

Eine Hyaluronatlyase-Lösung wird aus einer Stammlösung (50.000 U/ml) durch Verdün nen 1 : 50 hergestellt. 0,5 ml Hyaluronatlyaselösung werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg/ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2 ml einer 2,5%igen Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung in 2%iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1 cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespaltener Hyaluronsäure bestimmt. 5 internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyase spalten 16 µg Hyaluronsäure/min.

Ausführungsbeispiel 6

10 mg Hyaluronatlyase des Holoenzyms werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C gebracht. Dieser Lösung werden 0,25 g einer spezifisch spaltenden Proteasesepharose mit einer proteolytischen Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/mg zugesetzt. Nach 15 Minuten wird die unlösliche Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80% ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment abgetrennt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molge wichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert.

Ausführungsbeispiel 7

Weiße Neuseeländer-Kaninchen (Charles River Deutschland) werden einzeln in Käfigen (0,5 × 1 m) bei Raumtemperaturen von 20°C plus/minus 2°C gehalten und mit Standard futter (ssniff Kaninchen-Haltung) und Trinkwasser ad libitum versorgt.

Die Tiere erhalten insgesamt sechs s. c. Injektionen in die Ohren. Die Injektionen wurden dreimal pro Woche (montags, mittwochs und freitags) gesetzt. Der Injektionsbereich wird mit Farbe markiert. Die Tiere bekamen in das rechte Ohr (Kontrollohr) 0,45 ml 0,9%ige NaCl-Lösung und in das linke Ohr (Therapieohr) 0,45 ml Hyaluronatlyase-Lösung injiziert. In das Therapieohr werden mit jeder Injektion eine Aktivität von 10.000 IU pro kg Körpergewicht injiziert. Das Injektionsvolumen wird alternierend in das Innen- und Außenohr ähnlich einer Perlschnur und jeweils in mehreren Depots quer zum Ohr gespritzt. Die Enzymlösung wird unmittelbar vor der Injektion hergestellt. Das Allgemeinverhalten und die Ohrknorpelspannung werden von zwei Personen beurteilt. Die Beurteilung findet vor jeder Injektion bis zum 13. Tag nach der letzten Injektion statt.

Das Allgemeinverhalten der Tiere wird erfahrungsgemäß durch die wiederholte Behand lungen mit 0,9%iger NaCl-Lösung und 10.000 IU/kg Körpergewicht nicht erkennbar beeinträchtigt. Im Injektionsbereich werden kaum lokale Reaktionen beobachtet. Vereinzelt kann es zu geringfügige Blutungen oder leichter Rötung der Haut im Injektionsbereich kommen.

Nach der zweiten Injektion ist ein Nachlassen der Knorpelspannung im Vergleich zum Kontrollohr festzustellen. Diese Schwäche in der Ohrknorpelspannung besteht bis etwa zum 13. Tag nach der letzten Injektion. Sie ist erkennbar an einem deutlich verringerten Widerstand der Injektionsstelle gegenüber dem Abknicken des Ohres.

Bei einem der Versuchstiere wird das Ohr in geknickter Anordnung durch einen Verband mit Heftpflaster fixiert. Das Ohr verbleibt drei Wochen in der geknickten Lage. Nach Entfernung des Verbandes verbleibt das behandelte Ohr in der geknickten Lage.

Ausführungsbeispiel 8

Die Katheterlösung besteht aus einer isotonischen wässrigen Lösung, welcher hochgereinigtes Enzymprotein des Holoenzyms und/oder des Fragmentes oder definierte Mischungen beider aktiven Enzymspezies in solchen Mengen zugesetzt werden, dass die Enzymaktivitäten zwischen 5.000 bis 1.000.000 IU/ml betragen. Die Enzymproteine werden vorteilhafter Weise in Form eines gefriergetrockneten Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, eingesetzt. Stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, Albumin und dessen Hydrolysate oder Gelatine und seine Hydrolysate sein.

Ausführungsbeispiel 9

Einem geschlachteten Hausschwein wird ein Herzkranzgefäß mit einem Außendurch messer von 4 mm entnommen und das Blutgefäß von Geweberesten befreit. Das Blutgefäß wird in Stücke von jeweils 5 cm geschnitten. Anschließend wurden alle Gefäßstücke in physiologischer Kochsalzlösung eine Stunde gelagert. Zur enzymatischen Behandlung wurde ein Gefäßstück mit 0,5 ml einer Lösung von Hyaluronatlyase mit einer Aktivität von 100.000 IU/ml gefüllt, verschlossen und unter physiologischer Kochsalzlösung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kontrolle verblieb in physiologischer Kochsalzlösung. Mit einem medizinischen Ballonkatheter mit einer Ballonlänge von 4 cm und einem Durchmesser im gefalteten Zustand von etwa 4 mm, versehen mit einer Vorrichtung zur Druckmessung, wurden von den Gefäßstücken die Dehnung (Durchmesser in mm) in Abhängigkeit vom Ballondruck (atm) bestimmt. In der Zeichnung ist die Dehnbarkeit in Abhängigkeit vom Ballondruck bei einem durch eine erfindungsgemäße Formulierung behandelten sowie einem unbehandelten Gefäßstück dargestellt.

Claims

1. Pharmazeutische Formulierungen zur Erweichung von Bindegewebe, insbesondere zur Formkorrektur von Bindegewebe und Bindegewebestrukturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierungen das mikrobielle Enzym Hyaluronatlyase (E. C. 4.2.2.1) und/oder ein Enzymfragment desselben mit einer Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5.000.000 IU/ml sowie gegebenenfalls pharmazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel, wie auch Stabilisatoren und/oder Hilfsstoffe, enthalten.

2. Pharmazeutische Formulierungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronatlyase und/oder deren Enzymfragment aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt aus Streptococcus agalactiae, durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.

3. Pharmazeutische Formulierungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronatlyase und/oder deren Enzymfragment aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus equisimilis gewonnen wird.

4. Pharmazeutische Formulierungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das niedermolekulare Fragment der Hyaluronatlyase eine Molmasse im Bereich von 84 kD bis 86 kD aufweist.

5. Pharmazeutische Formulierungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese als eine isotonische, sterile Injektionslösung vorliegt und durch parenterale oder epicutane Injektionen in das zu erweichende Bindegewebe oder in die Nähe des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur eingebracht werden kann.

6. Pharmazeutische Formulierungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese als isotonische und sterile Katheterlösung vorliegen, die durch das operativ geöffnete Innere eines Hohlorgans oder durch natürliche Organöffnungen in die Umgebung des zu erweichenden Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur zugeführt werden kann.

7. Pharmazeutische Formulierungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur topisch/epidermalen Anwendung, beispielsweise in fester Form, als wässerige Lösung, als eine mit einem Hydrokolloid oder Gelbildner angedickte wässerige Lösung, als Paste, als Salbe, als Creme, als Gel bzw. als Schaum, vorliegen.

8. Pharmazeutische Formulierungen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese als eine wässrige Injektionslösung vorliegen, die für über die zu behandelnde Hautfläche verteilte epikutane Injektionen in das Hautgewebe vorgesehen ist.

9. Pharmazeutische Formulierungen gemäß Ansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Aufnahme durch eine flexible Trägerschicht vorgesehen sind, welche als Pflaster oder Binde eingesetzt werden kann.

10. Pharmazeutische Formulierungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu deren Herstellung gefriergetrocknetes Enzym bzw. Enzymfragment in wässrigen Lösungen gelöst wird.