DE60014659T2

DE60014659T2 - Pharmazeutische- und kosmetischezusammensetzungen enthaldend serinproteasen aus kabeljau und deren pharmazeutische und kosmetische verwendung

Info

Publication number: DE60014659T2
Application number: DE60014659T
Authority: DE
Inventors: Jon Bragi Bjarnason
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2020-06-16
Also published as: EP1202743A2; US6846485B2; DK1202743T3; PL202532B1; JP2003502071A; AU779700B2; PL352318A1; ES2231200T3; WO2000078332A2; WO2000078332A3; RU2264824C2; DE60014659D1; AU4947800A; ATE278417T1; KR100699084B1; US20020141987A1; MXPA01013246A; NO20016159D0; NO20016159L; PT1202743E

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ihrem weitesten Aspekt auf das Gebiet der Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten und auf den Kosmetikbereich, insbesondere die pharmazeutische und kosmetische Verwendung von Serinproteinasen, die aus Fisch gewonnen werden. Insbesondere werden hier pharmazeutisch oder kosmetisch aktive Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil Trypsin und/oder Chymotrypsin, die aus dem atlantischen Kabeljau isoliert sind, und Serinproteinasen, die mit solchen Enzymen in Verbindung stehen, bereitgestellt
TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK
Die U.S. Patentnummern 4.801.451 und 4.963.491 geben eine Mischung aus Exo- und Endopeptidasen, die aus antarktischem Krill (Euphasia superba) isoliert werden, und die Verwendung dieser Mischung als Reinigungslösung an. Die U.S.-Patentnummer 4.801.451 gibt die Verwendung solcher Enzyme zum Entfernen abgestorbener Haut oder Fremdpartikeln von Wunden an. Der Internationale Patentantrag WO 85/04809 gibt die Verwendung von Krill-Enzymen als ein die Verdauung förderndes Mittel an. EP-A1-0170115 gibt die Verwendung von Krill-Enzymen zum Auflösen von Blutgerinnseln an.
Jedoch beziehen sich sämtliche dieser Referenzen auf unreine oder wenig charakterisierte Materialien. Eine gereinigte Peptidase oder Mischung von gereinigten Peptidasen ist wünschenswert, um pharmazeutisch nutzbare Mittel bereitzustellen. Außerdem wurde keine Angabe gefunden, bei der gereinigte Peptidasen oder eine Mischung von gereinigten Peptidasen für die Behandlung von Erkrankungen wie z. B. Arthritis, Gelenkentzündung, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, septische Arthritis, Phlebitis, Ekzem, Ausschlag, Psoriasis oder Infektionskrankheiten nutzbar sind.
Der internationale Patentantrag WO 96/24371 gibt die Verwendung von aus Krill gewonnenen multifunktionalen proteolytischen Enzymen und eine Gruppe von aus Schalentieren und Fischen gewonnenen proteolytischen Enzymen an, die eine grundsätzliche strukturelle Ähnlichkeit zu aus antarktischem Krill gewonnenen multifunktionalen Enzymen aufweisen. Dieser Antrag bezieht sich ebenfalls auf Methoden der Reinigung von multifunktionalen Enzymen und auf pharmazeutische, kosmetische und andere Anwendungen multifunktionaler Enzyme.
Grundsätzliche strukturelle Ähnlichkeiten aus antarktischem Krill gewonnener multifunktionaler Enzyme werden in diesem Antrag als mindestens 70%ige Übereinstimmung mit den aus Krill gewonnenen multifunktionalen Hydrolasen definiert. Aus Kabeljau gewonnenes Trypsin und Chymotrypsin, wie hier angegeben, stimmt in weniger als 70% mit den aus Krill gewonnenen multifunktionalen Enzymen überein. Außerdem handelt es sich bei den aus Kabeljau gewonnenen Trypsinen und Chymotrypsinen um keine multifunktionalen Enzyme. Ihre bekannteste Aktivität ist jeweils die von Trypsin-Proteasen und Chymotrypsin-Proteasen.
Das wichtigste Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von aus Kabeljau gewonnenen Trypsinen und Chymotrypsinen in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Medikamenten für lokale und topische Anwendung für die Behandlung von inneren Erkrankungen und Störungen sowie für die kosmetische Verwendung solcher Enzyme. Die topische Verwendung für die Behandlung lokaler innerer Störungen, ohne dass das Enzym in offene Wunden oder Schleimhautgewebe eindringen muss, erwies sich als überraschend wirksam, wie in den beiliegenden Beispielen beschrieben wird. Dies steht im Gegensatz zu Lehrinhalten nach dem Stand der Technik für die verwandte Verwendung von anderen Enzymen, wobei z.B. die multifunktionale Hydrolase des Krill-Enzyms für die Behandlung lokaler Schmerzen injiziert wird. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von aus Kabeljau gewonnenen Trypsinen und Chymotrypsinen für die Anwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Medikamenten für den Transport von anderen protein- oder nichtproteinaktiven Verbindungen durch die Haut bei der lokalen und topischen Anwendung für die Behandlung von inneren Krankheiten und Störungen. Es wurde festgestellt, dass solche Serinproteinasen pharmazeutisch ausgesprochen aktiv gegen eine Vielzahl von Krankheiten sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine Fisch-Serinproteinase für die Verwendung als Medikament. In diesem Zusammenhang besonders nutzbare Proteinasen einschließlich Trypsinen und Chymotrypsinen, die aus Kabeljau, wie etwa dem Atlantischen Kabeljau, gewonnen werden.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Fisch-Serinproteinasen bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung bei einem Menschen oder Tier. Erkrankungen oder Störungen, welche behandelt oder verhindert werden können, schließen Schmerzen, akute Entzündung, chronische Entzündung, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, septische Arthritis, Fibromyalgie, systemischen Lupus erythematosus, Phlebitis, Tendinitis, Ausschlag, Psioriasis, Akne, Ekzem, faziales seborrhoisches Ekzem, Ekzem der Hände, des Gesichts oder des Halses, Vorhautinfektionen, Fußpilz, Fistelinfektionen, infizierte topische Ulzera, Nabelinfektionen bei Neugeborenen, Falten, Narben, Keloiden (Narbengeschwüre), Beulen, Warzen und allergischen Juckreiz, Hämorrhoiden, Wunden, Wundinfektionen, Brandwunden, eine Pilzinfektion und eine immunologische Erkrankung, einschließlich einer Autoimmunerkrankung ein.
In noch weiteren Aspekten sieht die Erfindung die Verwendung einer Fisch-Serinproteinase bei der Herstellung eines Medikaments zum Entfernen abgestorbener oder sich ablösender Haut von ansonsten gesunder Haut und die Verwendung von Fisch-Serinproteinase bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und Verhinderung einer Erkrankung, bei deren Entstehung eine Rezeptor-vermittelte Bindung beteiligt ist, vor.
In noch weiteren Aspekten bezieht sich die Erfindung auf pharmazeutische und kosmetische Zusammensetzungen, die als Bestandteil eine Fisch-Serinproteinase enthalten, und auf eine Methode zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung beim Menschen oder Tier, wobei die Methode die Verabreichung an den genannten Menschen oder das genannte Tier einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Fisch-Serinproteinase umfasst.
Entsprechend der Erfindung ist auch ein Verfahren für die Herstellung einer gereinigten Zubereitung in kommerziellem Umfang von Kabeljau-Trypsin-Isoenzymen vorgesehen, umfassend die Schritte der (i) Vorbereitung eines wässrigen Extrakts von Kabeljau-Eingeweiden (ii), Unterziehung des wässrigen Extrakt eines oder mehreren Chromatographie-Schritten, einschließlich eines Schrittes der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines p-Aminobenzamidin-Liganden und (iii) die Desorbierung und Eluierung der Trypsin-Bindung zum p-Aminobenzamidin-Affinitätsliganden und einer gereinigten Zubereitung in kommerziellem Umfang von Kabeljau-Trypsin.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von aus Kabeljau gewonnenen Trypsinen oder anderen verwandten Trypsinen oder Serinproteinasen, wie Chynotrypsinen, die aus Tieren, insbesondere Wassertieren, wie Fischen einschließlich Kabeljau, gewonnenen werden, in einer Vielzahl von medizinischen und kosmetischen Zusammenhängen vor.
Der Begriff „Enzym" wird hier, wenn nicht anderweitig angegeben, verwendet, um ein aktives Enzym zu bezeichnen. Auch der Begriff „Trypsin und andere verwandte Peptidasen" bezeichnet hier Peptidasen vom Trypsin-Typ (EC 3.4.21.4) und alle Peptidasen die 90 % oder mehr Sequenzübereinstimmung mit den Trypsinen des atlantischen Kabeljaus aufweisen (Asgeirsson et al. Eur. J. Biochem. 180:85–94, 1989; Gudmundsdottir et al., Eur. J. Biochem. 217:1091–1097, 1993). Auch der Begriff „Chymotrypsin und andere verwandte Peptidasen" bezeichnet hier Peptidasen vom Chymotrypsin-Typ (EC 3.4.21.4) und alle Peptidasen die 90 % oder mehr Sequenzübereinstimmung mit den Chymotrypsinen A und B des atlantischen Kabeljaus aufweisen (Asgeirsson und Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B: 327-335-94. 1991; Gudmundsdottir et al., Biochim et Biophys. Acta 1219:211-214, 1994).
Insbesondere die Enzyme, die entsprechend der Erfindung für die Behandlung von Schmerzen, akuten oder chronischen Entzündungen, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, septische Arthritis, Fibromyalgie, systemischen Lupus eyrthematosus, Phlebitis, Ekzem, Ausschlag, Psoriasis, Akne, Wunden und Candidiasis anwendbar sind. In anwendbaren Ausführungsbeispielen werden Kabeljau-Trypsin oder Kabeljau-Chymotrypsin oder eine Mischung dieser Enzyme in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die gereinigte Peptidase oder eine Mischung aus gereinigter Peptidase und einpharmazeutisch geeignetes Lösungs- oder Trägermittel enthält, in erster Linie, aber nicht darauf beschränkt, Hydrogel, lokal oder topisch auf die betroffene Stelle verabreicht.
Außerdem sind die Enzyme anwendbar für die Behandlung von Virusinfektionen wie einer Herpesinfektion, von Pilzen, Bakterien oder Parasiten verursachten Infektionen, einschließlich Colitis, Ulkus, Hämorrhoiden, Hornhautvernarbung, Zahnbelag und Immunstörungen einschließlich Autoimmunerkrankungen.
Enzyme, die strukturell den Kabeljau gewonnenen Trypsinen und Chymotrypsin-Enzymen ähneln, haben die selbe Nutzbarkeit wie die Kabeljau-Enzyme.
Besonders sind diese Trypsin- und Chymotrypsin-Enzyme anwendbar für die Behandlung von Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis und Phlebitis. Bei solchen Behandlungen werden die Trypsine oder Chymotrypsine oder eine Mischung beider Enzyme in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Trypsine oder Chymotrypsine oder beide Enzyme und ein pharmazeutisch geeignetes Lösungs- oder Trägermittel enthält, in erster Linie, aber nicht darauf beschränkt, Hydrogel lokal oder topisch auf die betroffene Stelle der Arthritis oder Entzündung verabreicht.
Außerdem sind die Enzyme anwendbar für die Behandlung von Virusinfektionen wie Herpesinfektion, von Pilzen, Bakterien oder Parasiten verursachten Infektionen, einschließlich Colitis, Ulkus, Hämorrhoiden, Hornhautvernarbungen, Zahnbelag, Akne, Wunden, Candidiasis und Immunstörungen einschließlich Autoimmunerkrankungen.
Insbesondere betrifft die Erfindung die medizinischen, pharmazeutischen und kosmetischen Anwendungen von Trypsinen, die aus atlantischem Kabeljau oder anderen Tieren gewonnen werden. Es gibt drei besonders wichtige Isoenzyme von Trypsin in atlantischem Kabeljau, die gereinigt und charakterisiert wurden. Sie wurden Trypsin I, II und III genannt (Asgeirsson et al. Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Die Kabeljau-Trypsine haben die Aminosäuresequenz I-V -G-G- Y -Q/E-C-E/T -K/R-H-S-Q-A-H-QV -S-I-N, während die Säugetier-Trypsine wie etwa Rindertrypsine die Aminosäuresequenz I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S aufweisen.
Alle drei Isoformen des Kabeljau-Trypsins haben eine ähnliche Molekularmasse von ungefähr 24kDa.
Die Erfindung betrifft auch die medizinischen, pharmazeutischen und kosmetischen Anwendungen von Chymotrypsinen, die aus atlantischem Kabeljau oder anderen Tieren gewonnen werden. Es gibt drei besonders wichtige Isoenzyme von Chymotrypsin in atlantischem Kabeljau, die gereinigt und charakterisiert wurden.
Sie wurden als Chymotrypsin A und B bezeichnet (Asgeirsson und Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 996:327-335-94, 1991) Die Kabeljau-Chymotrypsine haben die duale Aminosäuresequenz einer ihrer aktiven Formen C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I/V-T-G-Y (A Kette) und I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q (B Kette), während Säuretier-Chymotrypsine wie etwa Rinder-Chymotrypsin A die Aminosäuresequenzen C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L (A Kette) und I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D (B Kette) aufweisen. Beide Isoformen des Kabeljau-Chymotrypsins haben eine ähnliche Molekularmasse von ungefähr 26 kDa.
Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine werden aus Kabeljau-Eingeweiden, außer Leber, Milz und Rogen, isoliert und gereinigt. Die Erfinder haben die Methoden, die oben beschrieben wurden, als anwendbar für die in kommerziellem Umfang erfolgende Herstellung von Kabeljau-Trypsinen und Chymotrypsinen erkannt. Die Enzyme werden durch wässrige Extraktion bei leichtem Rühren bei jedem Verhältnis von Eingeweiden mit Wasser aus den ganzen oder zerkleinerten Eingeweiden extrahiert, zu bevorzugen ist ein Verhältnis (w/w) von Innereien zu Wasser zwischen 1:1 und 1:10. Nach der Abtrennung der rohen Extraktlösung und der restlichen Innereien wird das Extrakt durch die Sedimentation oder Filtration geklärt. Die geklärte Lösung wird vorzugsweise durch Ultrafiltration und/oder optional Ionenaustausch konzentriert und dann vorzugsweise mikrogefiltert, um eine echte Lösung mit geringer biologischer Belastung zu erhalten, die geeignet für Säulenchromatographie mit gepackten Säulen ist, die verschiedene Schritte umfassen kann. Anschließend wird das Kabeljau-Trypsin durch Affinitätschromatographie, vorzugsweise durch Aminobenzamidin-Affinitätschromatographie, und Chymotrypsin durch Hydrophobe Interaktionschromatographie, vorzugsweise durch Phenyl-Sepharose Chromatographie, gereinigt.
Hier bezieht sich die Herstellung in kommerziellem Umfang von Kabeljau-Trypsin und Chymotrypsinen auf zuverlässige und wirksame Verfahren, die die Herstellung von Partien in der Größenordnung zwischen 1 und 10 g oder mehr, sowie 10 – 100 g oder mehr erlauben.
Das bevorzugte Anwendungsverfahren gereinigter Enzyme oder einer Mischung gereinigter Enzyme erfolgt in einer Zubereitung aus Hydrogel und Wasser mit 0–85% (vol/vol) eines polyvalenten Alkohols (Polyol) wie etwa Glycerol. Eine geeignete Konzentration von Trypsin-Aktivität liegt zwischen 0.1 bis 10.000 Enzymeinheiten [Aktivität) für CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (Carbobenzoxy Gly-Pro Arg-para Nitroanalid) pro 100 Milliliter der endgültigen Hydrogel-Zubereitung und die angemessene Konzentration von Chymotrypsin-Aktivität liegt zwischen 0.1 bis 10.000 Enzymeinheiten [Aktivität] für Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA pro 100 Milliliter der endgültigen Hydrogel-Zubereitung.
Die Erfindung sieht auch eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die Kabeljau-Trypsine und verwandte Peptidasen und ein pharmazeutisch geeignetes Lösungs- oder Trägermittel beinhaltet.
Die Erfindung sieht weiterhin (a) Mittel vor, die für bestimmte Erkrankungen gedacht sind, wobei wirkungsvolle Mengen von gereinigten Enzymen wie oben und (b) Zusammensetzungen oder Substanzen für die Verwendung bei diesen Verfahren verwendet werden, sowie (c) pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirkungsvolle Mengen von Enzymen für die Verwendung bei diesen Verfahren enthalten und (d) Verwendungen von Enzymen oder Enzym-Zusammensetzungen für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei solchen Verfahren.
Die Mittel sind für die Behandlung oder vorbeugende Verhinderung einer Indikation, aus der Gruppe bestehend aus Schmerzen, Entzündung, akute oder chronische Entzündung, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, septische Arthritis, Fibromyalgie, systemischen Lupus erythematosus und Phlebitis bestimmt, wobei die Menge vorzugsweise einer wirksamen Menge für die Behandlung oder Verhinderung entspricht;
die Behandlung oder vorbeugende Verhinderung von Hauterkrankungen wie z.B. Akne, Ausschlag, Psoriasis oder Ekzem, einschließlich fazialem seborrhoischem Ekzem oder Ekzem der Hände, des Gesichts, der Kopfhaut oder des Halses, Hämorrhoiden und ähnlichen Erkrankungen, wobei vorzugsweise die Menge der Kabeljau-Trypsine und der verwandten Peptidasen, die verabreicht werden, einer wirkungsvollen Menge für die Behandlung und Verhinderung von Hauterkrankungen entspricht;
die Behandlung oder vorbeugende Verhinderung von Wundinfektionen und die Abdauungsbehandlung von Wunden (Debridement) (durch Auftragen auf die Wunde einer wirksamen Menge von Enzym für die Vermeidung einer mikrobiellen Infektion oder durch die Verbesserung der Wundheilung durch Auftragen einer wirksamen Menge von Enzym für die Bakterienhemmung), wenn die Wunde behandelt wird soll diese im Wesentlichen frei von abgestorbenem Gewebe sein, indem abgestorbene oder sich ablösende Haut von ansonsten gesunder Haut entfernt wird, um das Aussehen der Haut zu verbessern, wobei die Menge des verabreichten Enzyms vorzugsweise eine wirkungsvolle Menge für die Entfernung abgestorbener Haut darstellt;
die Behandlung oder vorbeugende Verhinderung von Mukoviszidose, Krebs, z. B. durch die Verabreichung einer wirkungsvollen Menge für die Tumorbehandlung oder einer Menge von Enzym, die die Metastasenbildung verhindert oder hemmt, Arteriosklerose, Asthma, septischer Schock, toxisches Schocksyndrom, Gewebeadhäsionen wie etwa Sehnenscheiden, abdominale, postoperatorische oder Gelenkadhäsionen, Reperfusionsschaden, Malaria, Immunstörungen wie eine Autoimmunerkrankung, Apoptose, Colitis und Enteritis, wie Morbus Chron, wobei die Menge der verabreichten Kabeljau-Trypsine und verwandten Peptidasen wirksam für die Behandlung und Verhinderung dieser Erkrankungen ist;
die Behandlung oder vorbeugende Verhinderung einer mikrobiellen Infektion, z.B. eine Virusinfektion wie eine Herpesvirusinfektion (z.B. HSV-1, HSV-2, Herpes zoster oder genitaler Herpes), einer HIV, Hepatitis, Influenza-, Coronavirus, Zytomegalie-Virus-, Rhinovirus- oder Papillomavirusinfektion; einer Infektion, die eine Erkrankung des Magendarmtraktes hervorruft, wie beispielsweise einen Ulcus oder Durchfall, eine Pilzinfektion, wie beispielsweise eine systemische Pilzinfektion, eine Pilzinfektion der Haut, des Mundes, der Vagina oder des Ösophagus, einschließlich beispielsweise einer Hefepilzinfektion, einschließlich einer Pilzinfektion der Nägel und Candidainfektionen, mikrobiellen Infektionen des Auges, die vorzugsweise mit okularer Verabreichung behandelt werden, Infektionen durch Staphylococcus spp, Streptococcus spp., Klebsiella spp, Pseudomonas spp, Neisseria gonorrhea, Haemophilus spp., Chlamydia spp. Syphilis und Infektionen durch E.coli sowie bakterielle Infektionen, die einen weichen Schanker verursachen, opportunistische Infektionen bei Patienten mit einer Schwächung des Immunsystems, wobei die verabreichte Menge des Kabeljau-Trypsins eine wirksame Menge für die Behandlung oder Verhinderung mikrobieller Infektionen darstellt oder eine Hemmwirkung gegen Zelle-Zelle oder Zell-Virus-Adhäsion besitzt;
Entfernung von Zahnbelag, wobei die Menge des verabreichten Enzyms vorzugsweise eine für die Entfernung von Zahnbelag wirkungsvolle Menge darstellt, und
Auflösung von Blutgerinnseln, wobei die Menge des verabreichten Enzyms vorzugsweise eine für die Auflösung von Blutgerinnseln wirkungsvolle Menge darstellt.
Das Verfahren besteht aus der Verabreichung einer Zusammensetzung, die Kabeljau-Trypsine und/oder Chymotrypsine, wie oben beschrieben, enthält. Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch dazu verwendet werden, abgestorbene oder abweichende Zellen zu entfernen.
Die Erfindung sieht topische, kosmetische und medizinische Zusammensetzungen vor, die aus gereinigtem Kabeljau-Trypsin, -Chymotrypsin oder anderen verwandten Peptidasen, wie oben beschrieben, bestehen, und Gel, Creme oder Zäpfchen-Zusammensetzungen.
Die Erfindung sieht ebenso (a) Mittel für die Behandlung und vorbeugende Verhinderung von mit Zell-Zell oder Zell-Virus-Adhäsion assozierten Syndromen, vor, das die Verabreichung einer für die Anti-Adhäsion wirkungsvollen Menge von Kabeljau-Trypsinen oder Chymotrypsinen oder verwandten Peptidasen zur Entfernung oder Deaktivierung eines Zell- oder Virus-Akzeptors oder eines Rezeptor-Adhäsions-Bestandteils, der an der Zelle-Zelle oder Zelle-Virus-Adhäsion beteiligt ist, vorsieht (b) Zusammensetzungen oder Substanzen für die Verwendung bei solchen Verfahren, (c) pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirkungsvolle Mengen an Enzym für die Verwendung bei solchen Verfahren enthalten und die (d) Verwendung von Enzym-Zusammensetzungen für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei solchen Verfahren. Im Allgemeinen betrifft dieses Syndrom Entzündungen, Arthritis, Gelenkentzündung, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, septische Arthritis, Phlebitis, Ekzem, Ausschlag, Psoriasis, Akne, Wunden, Candidiasis und Immunstörungen, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Schock, Tumormetastasen, Transplantabstoßung oder mikrobielle Infektionen. Vorzugsweise (a) wird das Syndrom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mikrobieller Infektion, Immunstörung, Mukoviszidose, Arteriosklerose, Krebs, Asthma, septischer Schock, toxisches Schocksyndrom, Konjunktivitis, Reperfusionsschaden und -schmerzen, und (b) ein Zell-Oberflächenrezeptor, in Verbindung mit einem Zelle-Zelle oder Zelle-Virus Adhäsionssyndrom, ausgewählt aus den folgenden, die Kabeljau-Trypsin gezeigt hat, spalten zu können, bestehend aus CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11 a/CD18, wird durch das verabreichte Enzym entfernt oder deaktiviert. Vorzugsweise eine mikrobielle Infektion wird behandelt oder verhindert und die mikrobielle Infektion ist Herpes, HIV, Hepatitis oder Papillomavirusinfektion, eine Infektion, die Kolitis oder Durchfall auslöst, eine Candidainfektion, wie etwa eine orale, vaginale oder ösophageale Candidainfektion, eine Erkältung oder Grippeinfektion, eine durch Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus oder E.Coli ausgelöste Infektion, eine primäre oder sekundäre Infektion von Lepra, oder eine Infektion, die Konjunktivitis oder Tuberkulose auslöst In einem Ausführungsbeispiel sieht die Erfindung ein Mittel für die Hemmung oder vorbeugende Verhinderung der Übertragung eines pathogenen mikrobiellen Organismus durch die Verabreichung von Kabeljau-Trypsin oder Chymotrypsin-Enzymen vor. Vorzugsweise wird das Kabeljau-Trypsin und/oder Chymotrypsin an dem Körperteil angewendet, der den primären Übertragungsweg für den betreffenden mikrobiellen Organismus darstellt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Spray, eine Salbe oder Waschung auf eine Körperöffnung angewendet, die bei sexueller Aktivität beteiligt ist, um zum Beispiel die Übertragung von HIV oder Hepatitis zu verhindern. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden das Kabeljau-Trypsin oder verwandte Peptidasen auf die oberen Atemwege, zum Beispiel durch Aerosol, angewendet um die Übertragung eines normalen Erkältungsvirus, wie etwa den Rhinovirus oder Coronavirus zu hemmen oder zu verhindern.
Bei einem Aspekt verringert das Verfahren der äußerlichen Behandlung eines Gewebes, einer Körperflüssigkeit oder Zellzusammensetzung zur Entfernung von Zell-Adhäsions-Komponenten, die Immunabstoßung des Gewebes, der Körperflüssigkeit oder Zellzusammensetzung, die von einer Person in eine andere transplantiert wird. Bei einem anderen Aspekt entfernen oder deaktivieren solche Behandlungen die Zell-Adhäsions-Komponenten, die auf dem behandelten Gewebe, der Körperflüssigkeit oder Zellzusammensetzung, die von einer mikrobiellen Infektion betroffen ist, gefunden werden.
Bei der Behandlung oder vorbeugenden Verhinderung eines septischen Schocks oder eines toxischen Schocksyndroms durch die Verabreichung von Kabeljau-Trypsin oder verwandten Peptidasen schließen die angemessenen Verabreichungswege die systemische Verabreichung ein. Bei vaginalen Infektionen in Verbindung mit Schock können Vaginalspülungen, Cremes, Gels oder Zäpfchen als Verabreichungsart verwendet werden.
Bei der Behandlung oder vorbeugenden Verhinderung von Schmerzen, Entzündungen, akuten oder chronischen Entzündungen, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Fibromyalgie, systemischem Lupus eyrthematosus, Phlebitis durch die Verabreichung von Kabeljau-Trypsin oder verwandten Peptidasen, schließen angemessene Verabreichungswege ohne Beschränkung Cremes, Gels oder Zäpfchen, insbesondere aber nicht ausschließlich Hydrogels, die Glycerol oder andere Polyole enthalten, ein.
Bei der Behandlung oder vorbeugenden Verhinderung von Ausschlag, Psioriasis, Akne, Ekzem, einschließlich fazialem seborrhoisches Ekzem oder Ekzem der Hände, des Gesichts, der Kopfhaut oder des Halses, Vorhautinfektionen, Fußpilz, Fistelinfektionen, infizierter topischer Ulzera, Nabelinfektionen bei Neugeborenen, Falten, Narben, Keloiden (Narbengeschwüre), Furunkeln, Warzen und allergischem Juckreiz, Hämorrhoiden und ähnlichen Wunden, Wundinfektionen, Brandwunden, zur Entfernung von abgestorbener oder sich ablösender Haut von ansonsten gesunder Haut, zur Verbesserung des Aussehens der Haut, eine Pilzinfektion, wie beispielsweise eine systemische Pilzinfektion, eine Pilzinfektion der Haut, des Mundes, der Vagina oder des Ösophagus, einschließlich beispielsweise einer Hefepilzinfektion, einschließlich einer Pilzinfektion der Nägel und Candidainfektionen, sowie Immunstörungen einschließlich Autoimmunerkrankungen, durch Verabreichung von Kabeljau-Trypsinen, Chymotrypsinen oder mit diesen Enzymen verwandte Peptidasen, schließen angemessene Verabreichungswege Cremes, Gels, Zäpfchen, insbesondere aber nicht ausschließlich Hydrogels, die Glycerol oder andere Polyole enthalten, ein.
Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung für die Behandlung von Schmerzen, akuter Entzündung, chronischer Entzündung, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Fibromyalgie, systemischem Lupus erythematosus, Phlebitis, Ausschlag, Psioriasis, Akne, Ekzem, einschließlich faziales seborrhoisches Ekzem oder Ekzem der Hände, des Gesichts, der Kopfhaut oder des Halses, Vorhautinfektionen, Fußpilz, Fistelinfektionen, infizierter topischer Ulzera, Nabelinfektionen bei Neugeborenen, Falten, Narben und Keloiden (Narbengeschwüren), Furunkeln, Warzen und allergischem Juckreiz, Hämorrhoiden und Ähnliches, Wunden, Wundinfektionen, Brandwunden, die Entfernung abgestorbener oder sich ablösender Haut von ansonsten gesunder Haut, zur Verbesserung des Hautaussehens, eine Pilzinfektion, wie beispielsweise eine systemische Pilzinfektion, eine Pilzinfektion der Haut, des Mundes, der Vagina oder des Ösophagus, einschließlich beispielsweise einer Hefepilzinfektion, einschließlich einer Pilzinfektion der Nägel und Candidasuperinfektionen, sowie Immunstörungen einschließlich Autoimmunerkrankungen vorzusehen. Ein anderes Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Zubereitung einer Zusammensetzung, die für die Behandlung der genannten Erkrankungen verwendet wird. Ein drittes Ziel ist die Bereitstellung einer Methode für die Anwendung der genannten Zusammensetzung für die Behandlung der besagten Erkrankungen, einschließlich Dosierungsmengen für die äußerliche und topische Anwendung. Die Erfindung basiert daher auf Zusammensetzungen, die Enzyme enthalten, bei denen vorher keine Enzyme verwendet wurden oder ein besseres Enzym, wenn bereits Enzyme verwendet wurden.
Die oben genannten Ziele werden erreicht durch die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine wirkungsvolle Menge von Kabeljau-Trypsin und/oder Chymotrypsin enthält, welche in der Lage ist Schmerzen, Entzündungen, Arthritis, Schwellungen, Ödeme, Psoriasis, Ekzeme, Dermatitis, Ausschlag und/oder andere Symptome der im einleitenden Teil genannten Erkrankungen zu lindern. Die Kabeljau-Enzyme können mit großem Ertrag und auf relativ einfache Weise aus Kabeljau-Eingeweiden gewonnen werden. Es wurde festgestellt, dass Kabeljau-Enzyme auf relativ einfache Weise mit ausreichenden Erträgen in kommerziellem Umfang gereinigt werden können. Die gereinigten Kabeljau-Trypsine enthalten drei wichtige Isozyme des Enzyms und Kabeljau-Chymotrypsin enthält zwei wichtige Isozyme. Ein oder alle Isozyme können für die Zwecke dieser Erfindung verwendet werden.
Es steht nun fest, dass die Kabeljau-Trypsin und Chymotrypsin Enzyme der Erfindung bestimmte Zelladhäsionsmoleküle, bakterielle Enterotoxine, CD4, CD8, CD54 (1CAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11 a/CD18, TNF-alfa, IL-1 und MMP-9 wirkungsvoll entfernen oder deaktivieren, ohne die Zellentwicklungsfähigkeit anzugreifen.
Es wird angenommen, dass dieses Phänomen der Abspaltung oder Deaktivierung von Zytokinen, Entzündungsmediatoren und Matrixmetalloproteinasen zumindestens eine Teilerklärung für die Wirksamkeit der Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine gegen viele, obwohl vielleicht nicht alle, der Indikationen, gegen die Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine wirksam sind, bietet. TNF-Alpha ist sowohl bei Arthritis, Psioriasis, Krebs und Entzündungen beteiligt (siehe Cytokines, Eds. Mire-Slui and Thrope, Academic press,.1998, S 350).
Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine erweisen sich in vielen Hinsichten als wirksamer als andere gewöhnliche Proteasen. Beim Vergleich einer Serie der 13 in dieser Hinsicht aktivsten Proteasen in Bezug auf ihre Aktivität gegen 16 der vorher genannten Zelladhäsionsmoleküle, bakteriellen Enterotoxine, Zytokine, Entzündungsmediatoren und MMPs, so wie ihre Empfindlichkeit auf Serum-Hemmung, haben sich die Atlantischen Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine als die aktivsten erwiesen. Die Proteasen erhielten 2 Punkte für hohe bis sehr hohe Aktivität, 1 Punkt für niedrige bis mäßige Aktivität und 0 Punkte für sehr niedrige bis keine Aktivität (gegenläufige Punktzahlen für Serum-Hemmungs-Aktivität für die Proteasen). Auf der Basis dieses Punktesystem erhielt das Trypsin vom Atlantischen Kabeljau 30 Punkte und das Chymotrypsin vom Atlantischen Kabeljau 29 Punkte, während die bekannte multifunktionale Krill-Protease 16 Punkte erreichte. Die Trypsin- und Chymotrypsin-Proteasen vom Rind haben sich in dieser Hinsicht nicht bewährt. Außerdem sind Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine 2 bis 20-fach aktiver als ihre Entsprechungen vom Rind, wenn gewöhnliche kleine chromogene Substrate verwendet werden, um die Aktivität zu vergleichen (Asgeirsson et al. Eur. J.Biochem. 180::85--94, 1989; Asgeirsson und Bjarnason., Comp. Biochem. Physiol. 998:327-335-94, 1991)
Kabeljau-Eingeweide sind brauchbare Quellen für die Enzyme Kabeljau-Trypsin und Chymotrypsin der Erfindung. Die Enzyme können zum Beispiel wie oben beschrieben in kommerziellem Umfang aus gefrorenen Kabeljau-Eingeweiden extrahiert werden. Die geklärte und konzentrierte Extraktlösung kann optional durch Ionenaustausch-Chromatographie in kommerziellem Umfang fraktioniert werden, vorzugsweise durch einen ersten Kationenaustausch-Chromatographie Schritt gefolgt von einem Anionenaustausch-Chromatographie-Schritt, um assoziierte Serinproteasen wie Elastase und Serincollagenase zu binden und dadurch zu entfernen. In einem anschließenden letzten Schritt wird das Kabeljau-Trypsin durch Affinitätschromatographie vorzugsweise durch die Verwendung einer p-Aminobenzamidin-Affinitätschromatographie und Chymotrypsin durch Hydrophobe Interaktionschromatographie, vorzugsweise durch Anwendung einer Phenyl-Sepharose Chromatographie in kommerziellem Umfang gereinigt.
Das Kabeljau-Trypsin, das bei der Erfindung verwendet wird, kann von der Affinitätsmatrix durch den Einsatz von Bedingungen, die die Interaktion zwischen den Enzymen und dem Affinitätsligand destabilisieren wird, desorbiert werden.
Diese Bedingungen umfassen einen hohen Salzwert gefolgt von niedrigerem pH in vorzugsweise 30% oder mehr Glycerol. Der Eluent der Säule kann in eine neutralisierte Pufferlösung fließen, um das Kabeljau-Trypsin nach dem Schritt der Säureelution zu stabilisieren (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Das Kabeljau-Chymotrypsin, das bei der Erfindung verwendet wird, kann von der Phenyl-Sepharose-Säule durch den Einsatz von Bedingungen, die die Interaktion zwischen den Enzymen und dem Hydrophobieinteraktions--Ligand destabilisieren, gelöst werden. Zu diesen Bedingungen ist ein hoher Glycerolgehalt in Wasser oder Pufferlösung, vorzugsweise 50 % oder mehr Glycerol in Wasser oder Pufferlösung (Asgeirsson and Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 998:327-335-94, 1991) zu zählen Durch diese Verfahren können Kabeljau-Trypsin und Chymotrypsin-Enzyme mit einem Reinheitsgrad von mehr als 90 % isoliert werden. Die so erhaltene Fraktion des Kabeljau-Trypsins enthält drei wichtige Formen oder Isozyme des Kabeljau-Trypsins wie durch SDS-Elektrophorese, welche ein Band aufweist, isoelektrische Fokussierung, die drei Bänder aufweist, und Chromatofokussierung, welche drei Peaks aufweist, die den drei Trypsin-Isoformen entsprechen, gezeigt wird (1). Mindestens vier Isozyme des Trypsin IV werden zusätzlich in die Trypsinfraktion eingeschlossen, wenn keine Anionenaustauschchromatographie verwendet wird. Diese können durch eine anschließende Mono-Q oder DEAE-Anionenaustauschchromatographie als Subfraktionen abgetrennt werden.
Die Serinproteasen, die aus anderen Quellen als dem Atlantischem Kabeljau stammen, können mit isoliertem Trypsin aus Atlantischem Kabeljau hinsichtlich Molekulargewicht, isolektrischem Punkt, Aminosäuresequenz, Temperatur oder pH-Stabilität, Temperatur oder pH-Maximum, proteolytische Eigenschaft und kinetische Parameter oder für andere Eigenschaften des Trypsins vom Atlantischem Kabeljau, verglichen werden, wie in den Beispielen erläutert wird (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Die Aktivität von Kabeljau-Trypsin kann gemessen werden, indem Tyrosin-Arginin-Methylester (TAME) als Substrat verwendet wird. Das isolierte Kabeljau-Trypsin aus der Reinigung über Affinitätssäulen (90–100 % Reinheit) weist vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens 140 U/mg bei 25 °C und einen pH-Wert von 8,1 auf. Die multifunktionale Krillhydrolase zeigt verglichen dazu 60 U/mg. Die tryptische Aktivität kann auch durch die Verwendung von Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide (Cbz-GPR-pNA) als Substrat gemessen werden, wobei sich eine spezifische Aktivität von mindestens ca. 100 U/mg ergibt. Außerdem werden bei Verwendung von Bz-Arg-pNA als Substrat für Kabeljau-Trypsin I, II und III, jeweils verglichen mit 3 s^–1mM-1 für Rinder-Trypsin, katalytische Wirkungskonstanten (Kcat/Km) von 52.20 und 7 s^–1mM^–1 erreicht. Ähnliche Unterschiede werden auch bei Kabeljau-Chymotrypsin und Rinder-Chymotrypsinen festgestellt (Asgeirsson and Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 998:327-335, 1991)
Das Molekulargewicht von Kabeljau-Trypsin beträgt ungefähr 24kDa, wobei die isoelektrischen Punkte für Trypsin I, II und III jeweils 6.6., 6.2. und 5.5. betragen, und damit einen Wert aufweisen, der sogar niedriger als bei Trypsin IV-Isozymen liegt. Die Aminosäuresequenz der Isozyme von Kabeljau-Trypsin kann durch die folgende Sequenz, die eine Abweichung des Punktes aufgrund multipler Isoformen enthält, ausgedrückt werden:
Hierbei steht X für jede Aminosäure oder Nichtaminosäure, wobei Kabeljau-Trypsin I einen Aminosäurerest K in Position 9 besitzt, währen die Trypsine II und III in dieser Position ein R aufweisen (Gudmundsdottir et al. 1993 und unveröffentlichte Unterlagen).
Im Allgemeinen erweisen sich die Kabeljau-Trypsin-Isoenzyme als ausreichend stabil, so dass mindestens ungefähr 50 % der TAME-Aktivität nach der 18-stündigen Inkubation bei 5°C mit einem pH-Wert von 7.0 in einer Pufferlösung, die 10 mM Kalziumchlorid enthält, erhalten bleibt. Jedoch bleibt nach einer 18-stündigen Inkubation bei 5°C bei einem pH-Wert von 2.0 (2) nur ca. 10 % der Aktivität erhalten.
Das pH-Optimum der Kabeljau-Trypsine für TAME als Substrat liegt vorzugsweise zwischen 7.0 und 8.7, wobei ein Wert von ungefähr 8.0 (3) zu bevorzugen ist. Wird TAME als Substrat verwendet, dann ist der Km bei einem pH-Wert von ungefähr 8.1 und einer Temperatur von 25 °C beim Vorliegen von 10mM Kalziumchlorid vorzugsweise ungefähr 0.029 mM und 0.049 mM jeweils für Kabeljau-Trypsin I, II und III. Vorzugsweise weist Kabeljau-Trypsin ein Aktivitäts-Temperaturmaximum für TAME als Substrat zwischen 50 und 60 °C. (4) auf.
Die Kabeljau-Trypsine und Chymotrypsine der Erfindung werden topisch, oral, rektal, vaginal, durch Instillation (zum Beispiel in den Urinaltrakt oder in Fisteln), über die Lungenwege, z. B. durch Aerosol, oder durch die Verabreichung von Augentropfen, oder systemisch, wie parental , einschließlich zum Beispiel intramuskulär, subkutan, intraperitonal, intraarteriell oder intravenös verabreicht. Die Kabeljau-Enzyme werden in Lösung oder zusammen mit einem pharmazeutisch-geeigneten Trägermittel oder Exipienten entsprechend standardmäßig pharmazeutischer Praxis verabreicht. Für die orale Verabreichung werden die Kabeljau-Enzyme in der Form von Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten, Kaugummi, Pastillen, Pulver, Sirup, Elixier, wässrigen Lösungen und Suspensionen und ähnlichem verwendet. Für parentale Verabreichung werden gewöhnlich sterile Lösungen der Kabeljau-Enzyme zubereitet und die pH-Werte der Lösungen werden entsprechend angepasst und gepuffert. Für die intravenöse Anwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Substanz kontrolliert werden, damit die Zubereitung isotonisch wird. Für die okulare Verabreichung können Salben oder tropfbare Flüssigkeiten, die durch okulare Darreichungsmethoden, die im Fachgebiet als Applikatoren oder Augentropfer bekannt sind, verabreicht werden, verwendet werden. Für die pulmonare Verabreichung können Verdünnungsmittel und/ oder Trägermittel ausgewählt werden, die dazu geeignet sind, Aerosol zu bilden.
Für die topische Verbreichung werden die Kabeljau-Trypsine in der Regel in einem Hydrogel aufgetragen, das 0 – 85 % Glycerol enthält, wie z.B. ca. 20 bis 30 % Glycerol und wenn möglich bis zu 85% Glycerol.
Für topische Behandlungen liegt die angemessene Dosierungsmenge von Kabeljau-Trypsin pro Anwendung zwischen 0.1 μg/cm² und ca. 0.01 mg/cm² (wobei zum Beispiel ca. 0.01 mg/ml Enzymgel verwendet wird). Für systemische Behandlungen werden die Dosierungen in der Regel gewählt, um ein Serumniveau von Kabeljau-Trypsin zwischen ungefähr 0.1 mg/100 ml und ca. 100 mg/100ml zu erhalten, der Wert liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 0.05 mg/100ml und ca. 2.0 mg/100 ml. Bei einer Variante werden Größenwerte von bevorzugten Mengen für die systematische Verabreichung zwischen vorzugsweise 0.01 mg/kg bis ungefähr 10mg/kg verwendet, eher zu bevorzugen sind Größenwerte von ungefähr 1 mg/kg. Für Behandlungen des Vaginal- und Urinaltraktes werden in der Regel geeignete Lösungen für Spülung/Instillation von Kabeljau-Trypsin Enzymen mit Konzentrationen von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 15 mg/ml eingesetzt, vorzugsweise zwischen ungefähr 100 μg/ml bis ugefähr 3mg/ml. Für alle Behandlungen wird die Enzymzusammensetzung in der Regel zwischen 1 bis ca. 10-mal täglich angewendet, zu bevorzugen ist eine Anwendung zwischen 2 und 5-mal täglich. Diese Werte variieren natürlich aufgrund einer Zahl von Faktoren, wie Art und Schwere der Krankheit, das Alter, Gewicht und die Beschwerden des Patienten, wie durch eine Person mit ausreichenden medizinischen Fachkenntnissen beurteilt werden kann. Man glaubt, das im Wesentlichen höhere Dosen ohne grundsätzliche Nebenwirkungen verwendet werden können.
Für Wundheilung werden Kabeljau-Trypsine vorzugsweise öfter angewendet als nur zum Zeitpunkt der ersten Wundversorgung. Vorzugsweise wird das Kabeljau-Trypsin wenigstens immer beim Wechseln des Wundverbands angewendet. Die Kabeljau-Trypsin Enzyme können wenigstens jeden zweiten Tag, vorzugsweise jeden Tag oder einige Male pro Tag verwendet werden. Bei dermatologischen Beschwerden, wie Ekzem, Psoriasis und ähnliches, wird das Kabeljau-Trypsin und/oder Chymotrypsin-Enzym-Hydrogel vorzugsweise jeden Tag, noch besser zweimal täglich angewendet. Bei akuten und chronischen Entzündungen, Arthritis, Gelenkentzündungen, Bursitis, Osteoarthritis und ähnliches werden Kabeljau-Trypsin-Enzyme vorzugsweise jeden Tag, noch besser zweimal pro Tag angewendet.
Wie in vielen der unten angegebenen klinischen Beispielen gezeigt wird, ist das Kabeljau-Enzym-Hydrogel der Erfindung wirksam, um entzündliche Beschwerden zu behandeln oder zu verhindern. Üblicherweise werden Entzündungen innerhalb von 2 oder 3 Tagen ab dem Beginn der Behandlung auf vertretbare Niveaus gemindert. Die Bespiele zeigen auch, dass die Enzyme wirksam sind, um Schmerzen zu lindern. Schmerzlinderung wird oft innerhalb von 20 min bis 2 Stunden ab dem Beginn der Behandlung berichtet. Schmerzlinderung wird nicht von Gefühlsverlust in dem behandelten Gewebe begleitet. Vollständigere Schmerzlinderung, dergestalt, dass der Patient nur geringe Schmerzen oder ein Spannungsgefühl spürt, wird oft innerhalb eines Tages ab Beginn der Behandlung wahrgenommen.
Im Allgemeinen werden Kabeljau-Enzyme nach der Erfindung in einer wirksamen Menge verabreicht. Eine wirksame Menge ist eine Menge, die wirksam ist, entweder (1) die Symptome der Krankheit, die behandelt werden soll, zu mindern, (2) eine pharmakologische Veränderung hervorzurufen, die maßgeblich ist, die Krankheit, die behandelt werden soll, zu behandeln, (3) eine Infektion zu hemmen oder zu verhindern, oder die Neuinfektion durch einen Infektionserreger, oder (4) das Auftreten einer Nicht-Infektionskrankheit zu verhindern (zum Beispiel eine Krankheit, die durch die Blockierung der Zelladhäsion behandelt werden kann). Für die Wundbehandlung schließt bei einem Aspekt die wirksame Menge eine Menge ein, die wenn sie regelmäßig angewendet wird, das Auftreten einer Infektion verhindert.
Bei einem anderen Aspekt für die Wundheilung schließt eine wirksame Menge eine Menge ein, die wirksam ist, die für die Wundheilung benötigte Durchschnittszeit zu verringern. Verschiedene Verfahren für die Bestimmung der prozentualen Homologie der Proteine sind medizinisch bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Verwendung der Version 6.0. des GAP-Computerprogramms für die Durchführung des Sequenzvergleichs. Das Programm ist über die Genetics Computer Group der University of Wisconsin erhältlich und verwendet das Alignment-Verfahren von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970) in der revidierten Fassung von Smith und Waterman, Adv. Appl. Math., 2.482 (1981). Ein weiteres brauchbares Verfahren verwendet das FASTA-Computerprogramm Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele und Zeichnungen weiter erläutert.
1 zeigt einen Chromatofokussierung-Chromatograph der Fraktion vom Atlantischen Kabeljau-Trypsins des Aminobenzamidin-Affinitätssäulen-Reinigungs-Schritts.
Die aus der para-Aminobenzamidin-Säule eluierte Fraktion wurde auf der Sephadex G-25 Säule gelgefiltert, in 25 mM Monoethanolamin/Essigsäure pH 9.4. mit einem Gehalt von 10mM Kalziumchlorid equilibriert und anschließend auf eine Säule aus PBE-94 Ionenaustauschmaterial (Pharmacia) angewendet, die in der selben Pufferlösung equilibriert wurde. Die Säule wurde dann mit Polybuffer 94 (mit Essigsäure auf den pH-Wert 5.5 eingestellt) mit einem Gehalt von 10mM Kalziumchlorid eluiert. Die Aktivität für das TAME -Substrat (gefüllte Kreise), Absorptionsvermögen bei 280 nm (leere Kreise) und pH (leere Rauten) wurde überprüft. Die zuerst eluierte Fraktion wurde Trypsin I genannt, die zweite Fraktion Trypsin II und die dritte Fraktion Trypsin III.
2 zeigt die Wirkung von pH auf die Stabilität des durch para-Aminobenzamidin gereinigten Trypsins des Atlantischen Kabeljaus, wie diese durch die verbleibende TAME-Aktivität nach der Inkubation bei verschiedenen pH-Werten und zwei verschiedenen Zeiträumen gemessen wurde. Die Proben des Atlantischen Kabeljau-Trypsins wurden 30 min (leere Kreise) und 18 Stunden (gefüllte Quadrate) bei 5 °C bei verschiedenen pH-Werten inkubiert. Die verbleibende Aktivität für TAME als Substrat wurde anschließend bei einem pH-Wert von 8.1 und einer Temperatur von 25 °C gemessen.
3 zeigt die Abhängigkeit des pH-Werts von der Aktivität des Atlantischen Kabeljau-Trypsins, das mit para-Aminobenzamidin gereinigt wurde, wie die Messung durch die Verwendung von TAME als Substrat ergeben hat. Die mit einer abschließenden Konzentration von 0.1. M verwendeten Pufferlösungen waren Azetat (pH 3.0–5.9), Hepes/HCl (pH 6.0–8.0) und Glycinat (pH 8.3–9.0), alle mit einem Gehalt von 10 mM Kalziumchlorid, und
4 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Aktivität von Atlantischem Kabeljau-Trypsin im Vergleich zur Aktivität von Rinder-Trypsin gemessen durch Verwendung von TAME als Substrat. Die Enzyme wurden in eine vorgeheizte, temperaturgeregelte Küvette gegeben und nach einer kurzen Equilibrierungszeit wurde die Durchschnittsrate der Hydrolyse während der folgenden 3 min bestimmt.
BEISPIEL 1
Zubereitung einer Mischung von Proteasen aus Kabeljau
Ungefähr 100 kg gefrorener Kabeljau-Eingeweide wurden aufgetaut und zum vierfachen Volumen von kaltem Trinkwasser in einen Extraktionstank gegeben, der pH-Wert wird mittels einer Natriumhydroxidlösung (Natronlauge) auf 8 – 9 eingestellt. Die Mischung wurde ca. 2–6 Stunden bei einer Temperatur zwischen 0 und 5 °C gerührt. Nach einer kurzen Zeitspanne der einfachen Sedimentation (ungefähr 30 min) wurde der wässrige Extrakt aus den zurückbleibenden unlösbaren Eingeweide mit einer Pumpe ausgespült und in einem Sedimentationsbehälter gesammelt. Der wässrige Extrakt verblieb ca. 24 bis 60 Stunden in dem gekühlten Sedimentationstank, um zu sedimentieren. Der Supernatant wurde vom Supernatantbehälter in einen Vorratsbehälter umgefüllt Der Supernatant war durch Ultrafiltration 10 bis 20fach konzentriert und durch Diafiltration auf ein geeignetes Niveau der Ionenstärke bei einer Leitfähigkeit von weniger als 3mS/cm gebracht worden. Dadurch erhielt man ca. 10 – 15 Liter ultragefiltertes und diagefiltertes Proteinkonzentrat.
BEISPIEL 2
Reinigung von Kabeljau-Trypsin aus konzentriertem Kabeljaueingeweide-Extrakt
Bei Beispiel 1 erhielt man ca.10 Liter ultragefiltertes und diagefiltertes Konzentrat und dieses wurde auf eine durchgängig kontinuierliche Serie von ungefähr 1 Liter gepackter Chromatographiesäule angewendet, wobei die erste einen schnell fließenden CM Kationenaustauschharz (Pharmacia, Schweden), die zweite eine schnell fließendes DEAE -Anionenaustauschharz (Pharmacia, Schweden) und die dritte einen p-Aminobenzamidin-Affinitätsligand in Verbindung mit einem Sepharoseharz (Pharmacia, Schweden) enthielt. Die Säulen wurden durch ungefähr 10 Säulenvolumen mit 25 mM Tris-Pufferlösung mit dem PH-Wert 7.8 und einem Gehalt von 2.5 mM Kalziumchlorid (Puffer A) vorequilibriert. Das Konzentrat wurde bei einer Flussrate von ungefähr 100 ml pro Minute auf die Säulen gepumpt. Nachdem die Aufbringung der konzentrierten Lösung auf die Säulen abgeschlossen war, wurde überschüssiges Material aus dem durchgängigen Säulensystem mit ungefähr 8 Litern der Pufferlösung A ausgewaschen.
Nach dem Abschluss dieses Waschschrittes wurde die p-Aminobenzamidinaffinitätssäule von den anderen Säulen getrennt und mit ungefähr 5 Säulenvolumen einer High-Salt-Lösung aus 25 mM Tris-Pufferlösung mit dem pH Wert 7,5 und einem Gehalt von 0,5 M NaCl und 2,5 mM Kalziumchlorid gewaschen. Die Kabeljau-Trypsine wurden dann vom Affinitätsliganden desorbiert und mit einer Säurelösung aus 25mM Essigsäure mit einem pH-Wert von 3.2, einem Gehalt von 10 mM Kalziumchlorid und 30 Glycerol aus der Säule eluiert. Die Kabeljau-Trypsin-Fraktion wurde in einer neutralisierenden Pufferlösung aus 200 mM Tris mit dem pH-Wert 8,5 und einem Gehalt von 30 % Glycerol gesammelt.
Die gereinigte Kabeljau-Trypsin Zubereitung wurde durch eine SDS Page Elektrophorese und FPLC Mono-Q-Chromatographie homogen und zeigte die drei Trypsin-Isozym-Bänder bei isoelektrischer Fokussierung. Die Enzymzubereitung verfügte über eine spezifische Aktivität von ungefähr 100 U/mg, wobei wie vorher beschrieben, ein Cbz-GPR-pNA als Substrat verwendet wurde. Die gereinigte Zubereitung wurde durch einen 0,22 Mikronfilter filtersterilisiert und bei ca. – 20 °C gefroren gelagert.
BEISPIEL 3
Alternative Reinigung von Kabeljau-Trypsin aus konzentriertem Kabeljaueingeweide-Extrakt in kommerziellem Umfang
Ungefähr 10 Liter ultrafiltriertes und diagefiltertes Konzentrat, das wie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde auf einen p-Aminobenzamidin-Affinitätsliganden, der mit einem Sepharoseharz (Pharmacia Schweden) gekoppelt war, angewendet.
Die Säule wurde mit ungefähr 10 Säulenvolumen aus 25 mM Tris-Pufferlösung mit dem PH-Wert 7.8 und einem Gehalt von 2.5 mM Kalziumchlorid (Puffer A) vorequilibriert. Das Konzentrat wurde mit einer Flussrate von ungefähr 100 ml pro Minute auf die Säulen gepumpt. Nachdem die Aufbringung der konzentrierten Lösung auf die Säule abgeschlossen war, wurde überschüssiges Material aus der Säule mit ungefähr 8 Litern des Puffers A ausgespült.
Die Affinitätssäule wurde anschließend mit ca. 5 Säulenvolumen einer High-Salt-Lösung aus 25 mM Tris-Pufferlösung mit einem pH Wert von 7,5 und einem Gehalt von 0,5 M NaCl und 2,5 mM Kalziumchlorid gewaschen. Die Kabeljau-Trypsine wurden dann mit einer Säurelösung aus 25mM Essigsäure mit einem pH-Wert von 3.2. und einem Gehalt von 10 mM Kalziumchlorid und 30 % Glycerol vom Affinitätsliganden desorbiert und aus der Säule eluiert. Die Kabeljau-Trypsin-Fraktion wurde in einer neutralisierenden Pufferlösung aus 200 ml Tris mit einem pH-Wert von 8,5 und einem Gehalt von 30 % Glycerol gesammelt und enthielt annäherungsweise 5 – 6 g Trypsin.
Die gereinigte Kabeljau-Trypsin Zubereitung wurde durch eine SDS-Page-Elektrophorese homogen und zeigte die drei Trypsin-Isozym-Bänder bei isoelektrischer Fokussierung. Eine kleinere Fraktion (<5%) konnte durch anschließende FPLC-Mono-Q-Chromatographie abgetrennt werden und wurde als mindestens vier zusätzliche Isozyme identifiziert; Trypsin IV a, IV b, IVc und Ivd. Die Enzymzubereitung wies eine spezifische Aktivität von ungefähr 100 U/mg auf, wobei, wie vorher beschrieben, ein Cbz-GPR-pNA als Substrat verwendet wurde. Die gereinigte Zubereitung wurde durch einen 0,22 Mikronfilter filtersterilisiert und bei ungefähr –20 °C gefroren gelagert.
BEISPIEL 4
Zubereitung einer Hydrogel-Zubereitung aus Kabeljau-Trypsin
Die gereinigte Kabeljau-Trypsin-Zubereitung aus Beispiel 2 wurde mit einem aus einem wässrigen Gel mit 0,8% w/v Carbomer 940, 30% Glycerol und 0,08% Paraoxybenzoat bestehenden Hydrokolloidgel vermischt. Die Kabeljau-Trypsin-Zubereitung wurde in einem Verhältnis von 1:1 mit dem Hydrogel vermischt, um so eine endgültige Konzentration von einer Enzymeinheit pro mg (U/mg) der endgültigen Gel-Enzym-Mischung zu ergeben (die Enzym-Hydrogel-Salbe), die Enzymeinheit wird dabei, wie vorher beschrieben, durch die Verwendung von Cbz-GPR-pNA als Substrat bestimmt. Auf diese Weise enthält die sich ergebende Hydrogelsalbe ungefähr 0,01 mg/ml oder 1 U/ml der Kabeljau-Trypsin-Enzyme, 0,4% Carbomer 940, 20 % Glycerol und 0,04 Paraoxybenzoat. Nachfolgend wird diese Enzym-Hydrogelsalbe als Penzyme 100 bezeichnet.
BEISPIEL 5
Behandlung von Osteoarthritis mit Penzyme 100
Siebzehn Versuchpersonen mit Osteoarthritis, einige mit akuten oder sehr schweren Symptomen, wurden mit der Enzym-Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde einmal oder zweimal täglich angewendet, immer einmal am Abend vor dem Schlafengehen und in vielen Fällen auch morgens. Ungefähr 5 Milliliter des Enzymgels wurden auf jede der betroffenen Bereiche, wie jedes Knie, Hüfte oder beide Hände angewandt. Eine Anwendung größerer Mengen waren in schweren Fällen möglich. Das Gel wurde ungefähr 10 bis 30 min, jeweils abhängig von der angewendeten Menge sowie der zur Verfügung stehende Zeit und den Belangen und Bedürfnissen des Patienten trocknen gelassen. Die Trocknung kann durch die Verwendung einer Glasvorrichtung, wie etwa einem Haartrockner, beschleunigt werden. Alle diese Patienten nahmen ein Nachlassen der Symptome innerhalb einer Woche wahr, bei den meisten trat die Linderung innerhalb von 2 bis 4 Tagen ein. Patient Nr. 71 war vor der Behandlung nicht in der Lage Treppen zu gehen, nach der Behandlung bestand dieses Problem nicht mehr. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 5.1. zusammengefasst:
Tabelle 5.1. Behandlung von Osteoarthritis mit Penzyme 100
Einige der Patienten (Nr. 19 und 21) konnten mit der Behandlung aufhören und schienen eine dauerhafte oder langfristige Linderung der Krankheit erfahren zu haben, aber die meisten halten ihre Symptome mit ständiger oder in Abständen erfolgender Anwendung von Penzyme 100 unter Kontrolle.
BEISPIEL 6
Behandlung von Patienten, die unter Tendinitis leiden
Acht Versuchpersonen mit Tendinits, darunter einige mit akuten oder sehr schweren mit nächtlichen Schlafstörungen verbundenen Symptomen wurden mit der Enzym-Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde einmal oder zweimal täglich topisch auf den betroffenen Bereichen angewendet, und zwar jeweils ungefähr 5 – 10 Milliliter auf jeden betroffenen Bereich, abhängig von der Größe des Bereichs. Das Gel wurde jeweils abhängig von der angewendeten Menge, der zur Verfügung stehenden Zeit und den Belangen und Bedürfnissen des Patienten, ungefähr 10 bis 30 min trocknen gelassen. All diese Patienten nahmen ein Nachlassen der Symptome innerhalb zweier Wochen war, die meisten innerhalb von 2 bis 3 Tagen, aber bei anderen, vor allem solchen mit Ellbogen-Tendinitis (Tennisarm oder Golferarm) dauert ein Nachlassen der Symptome länger. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 6.1. zusammengefasst:
Tabelle 6.1. Behandlung von Patienten, die unter Tendinitis leiden
Alle diese Patienten nahmen ein dauerhaftes Nachlassen der Beschwerden wahr und haben mit der Behandlung aufgehört.
BEISPIEL 7
Behandlung von Fibromyalgie
Zwei Versuchpersonen mit schwerer Fibromyalgie wurden mit der Enzym-Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde einmal oder zweimal täglich topisch auf den betroffenen Bereichen angewendet, und zwar ungefähr 5 – 10 Milliliter auf jeden betroffenen Bereich, abhängig von der Größe des Bereichs. Das Gel wurde jeweils abhängig von der angewendeten Menge, der zur Verfügung stehenden Zeit und den Belangen und Bedürfnissen des Patienten. ungefähr 10 bis 30 min trocknen gelassen. Beide Patienten (Nr. 78 F-50 und Nr. 92 F-53) nahmen ein Nachlassen der Beschwerden innerhalb von drei Wochen wahr. Beide nutzen die Enzymgel-Behandlung, wenn die Schmerzen erneut auftreten.
BEISPIEL 8
Behandlung rheumatoider Arthritis
Fünf Versuchpersonen mit rheumatoider Arthritis, darunter einige mit sehr schweren Symptomen, wurden mit der Enzym-Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde topisch auf den betroffenen Bereichen angewendet, in der Regel zumindest zweimal täglich mit ungefähr 3 – 5 Milliliter auf jeden betroffenen Bereich, abhängig von der Größe des Bereichs. Das Gel wurde jeweils abhängig von der Dicke der anwendeten Gelschicht ungefähr 15 Minuten trocknen gelassen. Die Trockenzeit kann durch die Verwendung einer Glasvorrichtung, wie etwa einem Haartrockner, verkürzt werden. Alle fünf Patienten nahmen innerhalb von fünf Tagen ein Nachlassen der Symptome wahr. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 8.1. zusammengefasst:
Tabelle 8.1. Behandlung rheumatoider Arthritis
Die Patientin Nr. 61 konnte vor Beginn der Behandlung morgens nicht ohne Hilfe aufstehen und sich anziehen, nach der Behandlung war sie in der Lage dazu. Patient Nr. 94 hatte aufgrund einer Komplikation durch Pleuraergüsse beim Atmen Schmerzen in der Brust. Sie spürte 3 Tage nach Beginn der Behandlung mit Penzyme 100 ein Nachlassen dieser Symptome. Alle dieser Patienten konnten diese Symptome durch ständige und in Abständen erfolgender Behandlung mit Enzymgel unter Kontrolle halten.
BEISPIEL 9
Behandlung von Phlebitis
Fünf Versuchspersonen mit verschiedenen Formen von Phlebitis, wie Thrombophlebitis (oberflächliche Venenentzündung), Phlebothrombose (Tiefe Venenthrombose), chronischem postthrombotischen Syndrom, Krampfadern, in allen Fällen in den Waden, einige mit sehr schweren Symptomen, die Schmerzen mit Schlafschwierigkeiten verursachen, wurden mit der Enzym-Hydrogel-Salbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde topisch auf die Wade mindestens einmal täglich aufgetragen, d.h. abends und in einigen Fällen auch morgens ungefähr 5 Milliliter auf jede Wade. Das Gel wurde 15 Minuten trocknen gelassen. Alle fünf Patienten nahmen innerhalb von ein paar Wochen ein Nachlassen der Symptome wahr. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 9,1. zusammengefasst:
Tabelle 9.1. Behandlung von Phlebitis
Beim Patienten Nr. 2 wurde ein chronisches postthrombotisches Syndrom diagnostiziert. Die Patientin Nr. 68 kann nachts aufgrund der Schmerzen nicht richtig schlafen, wenn sie das Gel nicht vor dem Schlafengehen aufträgt. Alle diese Patienten halten die Symptome durch ständige oder in Abständen erfolgender Behandlung mit Enzymgel unter Kontrolle.
BEISPIEL 10
Behandlung von Psoriasis
Sechs Patienten mit Psoriasis, darunter einige chronische Fälle mit schweren Symptomen, wurden mit dem Enzym-Hydrogel aus Beispiel 4 behandelt, aber in den meisten dieser Fälle von Psoriasis wurde eine mit Penzyme 200 bezeichnete Hydrogelzusammensetzung mit doppelter Kabeljau-Trypsinkonzentration oder 2 U/ml verwendet, weil mit Penzyme 100 (1 U/ml Kabejau-Trypsin) ziemlich langsame und in einigen Fällen unsichere Ergebnisse erzielt wurden. Die Patienten behaupteten bedeutende Verbesserungen bei der Behandlung mit dem durch einen höheren Kabeljau-Trypsin Gehalt gekennzeichneten Gel (Penzyme 200) verglichen mit dem Gel mit niedrigerem Trypsin-Gehalt (Penzyme 100) wahrgenommen zu haben. Eine Kombination von Kabeljau-Trypsin und Kabeljau-Chymotrypsin mit einer Konzentration von 1 U/ml jedes Enzyms, bezeichnet als Penzyme 200-C, wurde ebenfalls getestet und ergab ähnliche positive Ergebnisse wie Penzyme 200. Das Enzymgel wurde ein bis zweimal pro Tag angewendet, immer einmal am Abend vor dem Schlafengehen, danach wurde das Enzymgel übernacht auf der Haut belassen und in einigen Fällen erfolgte eine erneute Anwendung morgens nach dem Baden oder Duschen und vor dem Anziehen. Das Gel wird als dünne Schicht oder Film aufgetragen und benötigt ca. 5 Minuten zum Trocknen. Alle sechs Patienten nahmen innerhalb von zwei Wochen ein Nachlassen der Symptome wahr. Die Behandlung wurde in einigen Fällen durch konventionelle Selbsthilfeverfahren, wie Sonnenbaden oder UV-Licht-Behandlung ergänzt; Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 10.1. zusammengefasst:
Tabelle 10.1. Behandlung der Psoriasis
Die Patientin Nr. 3 litt seit ihrem 5. Lebensjahr an chronischer und sehr schwerer Psoriasis. Sie hatte alle verfügbaren Behandlungsmethoden mit nur eingeschränkten Ergebnissen versucht. Die Behandlung mit Penzyme 200 hat ihr die einzige langfristige Linderung der Symptome verschafft. Ihren Angaben nach war das Nachlassen der Symptome nach ungefähr 4 Tagen wahrnehmbar und eine vollständige Linderung trat nach 2 bis 3 Behandlungswochen mit einer einmal täglich erfolgenden Anwendung jeweils vor dem Schlafengehen ein.
Der Patient Nr. 69, der ebenfalls unter einer schweren chronischen Psoriasis litt, hat ein dauerhaftes Verschwinden einiger der betroffenen Stellen wahrgenommen. Alle diese Patienten halten die Symptome durch ständige oder in Abständen erfolgender Behandlung mit Enzymgel unter Kontrolle.
BEISPIEL 11
Behandlung von Akne und Furunkeln
Zwei Versuchspersonen (Patienten Nr. 25, F-16 und Nr. 63, M-17), die unter Akne litten, sowie eine, die unter Furunkeln litt (Nr. 64, M-22), wurde mit der Trypsin-Hydrogel-Salbe aus Beispiel 4 behandelt (Penzyme 100). Das Enzymgel wurde topisch auf dem betroffenen Bereich (Gesicht) einmal täglich angewendet, ungefähr 5 Milliliter bei jeder Anwendung. Das Gel wurde ungefähr 15 Minuten trocknen gelassen und dann auf der Haut belassen. Alle drei Versuchspersonen nahmen eine vollständige Linderung der Symptome innerhalb von zwei Wochen war und verwendeten die Enzymgel-Behandlung nur gelegentlich, wenn die Symptome sich wieder zeigten, erneut.
BEISPIEL 12
Behandlung von Ekzem. Dermatitis und anderen Hauterkrankungen
Achtzehn Patienten, die unter Ekzem, Dermatitis und verschiedenen anderen Hauterkrankungen litten, wurden mit der Kabeljau-Trypsin Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Das Enzymgel wurde einmal täglich normalerweise abends vor dem Schlafengehen angewendet (gelegentlich zweimal). Das Gel wurde in einer dünnen Schicht oder einem Film aufgetragen Die Trocknung erfolgte innerhalb ungefähr 5 – 10 Minuten. Größere Mengen konnten in schweren Fällen angewendet werden. Die Trocknung kann durch die Verwendung einer Glasvorrichtung, wie etwa einem Haartrockner, beschleunigt werden. Alle diese Patienten nahmen ein Nachlassen der Symptome innerhalb einer Woche war, die meisten innerhalb von 2 bis 4 Tagen. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 12.1. zusammengefasst:
Tabelle 12.1. Behandlung von Ekzem. Dermatitis und anderen Hauterkrankungen
Einige der Patienten (Nr. 40, 41, 48, 66, 50, 20, 46, 87, 97, 100) konnten die Behandlung abbrechen und schienen eine dauerhafte oder langfristige Linderung der Krankheit erfahren zu haben, aber die meisten halten ihre Symptome mit ständiger oder in Abständen erfolgender Anwendung von Penzyme 100 unter Kontrolle.
BEISPIEL 13
Wundheilung
Zwei Versuchspersonen (Patienten Nr. 44, M-4 und 85, M-9) mit Verbrennungen wurden mit der Kabeljau-Trypsin Hydrogelsalbe (Penzyme 100) aus Beispiel 4 behandelt. Zwei weitere Patienten (Nr. 62, F-47 und 96, M-70) wurden wegen schlechtheilenden postoperativen Wunden behandelt. Das Enzymgel wurde mindestens zweimal täglich topisch auf die Wunden aufgetragen und auf der betroffenen Stelle belassen. Alle vier Versuchspersonen erlebten eine gute und komplikationsfreie Heilung ihrer Wunden innerhalb von drei Wochen.
BEISPIEL 14
Behandlung mit Kabeljau-Chymotrypsin
Für jedes der Beispiele 5–13 wird das Trypsin Enzymhydrogel durch ein Kabeljau-Chymotrypsin Enzymhydrogel oder Hydrogel, das eine Mischung von Kabeljau-Trypsin und Kabeljau-Chymotrypsin enthält, ersetzt.
Abbildungen S. 31 – 34
esterase activity = Esteraseaktivität
fraction number = Anzahl der Fraktionen
relative activity = Relative Aktivität
Temperature = Temperatur

Claims

Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann, zur Verwendung als ein Medikament.
Proteinase nach Anspruch 1, die aus der Gruppe bestehend aus einem Trypsin, einem Chymotrypsin und jeder Mischung davon ausgewählt ist.
Proteinase nach Anspruch 1 oder 2, die nicht multifunktionell ist.
Proteinase nach einem der Ansprüche 1–3, die aus dem atlantischen Kabeljau gewonnen wird.
Proteinase nach Anspruch 1, bei der es sich um ein Trypsin aus dem atlantischen Kabeljau handelt.
Proteinase nach Anspruch 5, die aus der Gruppe bestehend aus Trypsin I, Trypsin II, Trypsin III, Trypsin IV a, Trypsin IV b, Trypsin IV c und Trypsin IV d ausgewählt ist.
Proteinase nach Anspruch 4, die aus der Gruppe bestehend aus Chymotrypsin A und Chymotrypsin B ausgewählt. ist.
Proteinase nach Anspruch 1, bei der es sich um ein Trypsin handelt, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch ist mit einem Beliebigen aus Trypsin I, Trypsin II, Trypsin III und Trypsin IV, die aus dem atlantischen Kabeljau isoliert sind.
Proteinase nach Anspruch 1, bei der es sich um ein Chymotrypsin handelt, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch ist mit einem Beliebigen aus Chymotrypsin A und Chymotrypsin B, die aus dem atlantischen Kabeljau isoliert sind.
Proteinase nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Medikament zum Behandeln und/oder Verhindern einer Erkrankung bei einem Menschen oder einem Tier, wobei die Krankheit aus der Gruppe bestehend aus Schmerzen, akuter Entzündung, chronischer Entzündung, Arthritis, Gelenkentzündung, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Fibromyalgie, systemischem Lupus erythematodes, Phlebitis, Tendinitis, Ausschlag, Psoriasis, Akne, Ekzem, fazialem seborrhoischem Ekzem, Ekzem der Hände, des Gesichts oder des Halses, Vorhautinfektionen, Fußpilz, Fistelinfektionen, infizierten topischen Ulzera, Nabelinfektionen bei Neugeborenen, Falten, Narben, Kolloiden, Beulen, Warzen und allergischem Juckreiz, Hämorrhoiden, Wunden, Wundinfektionen, Brandwunden, einer Pilzinfektion und einer immunologischen Erkrankung, einschließlich einer Autoimmunerkrankung, ausgewählt ist.
Verfahren zum Entfernen abgestorbener oder sich ablösender Haut von ansonsten gesunder Haut durch Verwendung einer Proteinase nach Anspruch 1.
Verwendung einer Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann, bei der Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern einer Erkrankung bei einem Menschen oder einem Tier, wobei die Krankheit aus der Gruppe bestehend aus Schmerzen, akuter Entzündung, chronischer Entzündung, Arthritis, Gelenkentzündung, Bursitis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, septischer Arthritis, Fibromyalgie, systemischem Lupus erythematodes, Phlebitis, Tendinitis, Ausschlag, Psoriasis, Akne, Ekzem, fazialem seborrhoischem Ekzem, Ekzem der Hände, des Gesichts oder des Halses, Vorhautinfektionen, Fußpilz, Fistelinfektionen, infizierten topischen Ulzera, Nabelinfektionen bei Neugeborenen, Falten, Narben, Kolloiden, Beulen, Warzen und allergischem Juckreiz, Hämorrhoiden, Wunden, Wundinfektionen, Brandwunden, einer Pilzinfektion und einer immunologischen Erkrankung, einschließlich einer Autoimmunerkrankung, ausgewählt ist.
Verwendung einer Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann, zum Entfernen abgestorbener oder sich ablösender Haut von ansonsten gesunder Haut.
Verwendung einer Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann, bei der Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern einer Erkrankung, die durch einen pathogenen Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Virus, einem Bakterium, einem Pilz, einem Parasiten und einem Protozoon verursacht wird, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Herpesvirusinfektion (einschließlich einer Infektion durch HSV-1, HSV-2, Herpes zoster oder genitaler Herpes), einer HIV-, Hepatitis-, Influenza-, Coronavirus-, Zytomegalovirus-, Rhinovirus- oder Papillomavirusinfektion; einer Infektion, die eine Erkrankung des Magendarmtraktes hervorruft, wie beispielsweise einen Ulkus oder Durchfall; einer Pilzinfektion, wie beispielsweise einer systemischen Pilzinfektion, einer Pilzinfektion der Haut, des Mundes, der Vagina oder des Ösophagus, einschließlich beispielsweise einer Hefepilzinfektion, einschließlich einer Pilzinfektion der Nägel und Candidainfektionen; mikrobiellen Infektionen des Auges, Infektionen durch Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spe., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia spp., Syphilis und Infektionen durch E.coli und bakteriellen Infektionen, die einen weichen Schanker verursachen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12–14, wobei die Fisch-Serinproteinase eine Proteinase nach einem der Ansprüche 2–9 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Fisch-Serinproteinase eine Proteinase nach einem der 2–11 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, bei der es sich um eine Zusammensetzung für den topischen Gebrauch handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der es sich um ein Hydrogel handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, des Weiteren umfassend einen mehrwertigen Alkohol, einschließlich Glyzerin.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend eine weitere pharmazeutisch aktive Verbindung.
Kosmetische Zusammensetzung umfassend eine Fisch-Serinproteinase, die aus Kabeljau gewonnen werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die Fisch-Serinproteinase eine Proteinase nach einem der 2–11 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, bei der es sich um ein Hydrogel handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, des Weiteren umfassend einen mehrwertigen Alkohol, einschließlich Glyzerin.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, umfassend eine weitere, kosmetisch aktive Verbindung.