NO327283B1 - Serinproteaser fra torsk og deres farmasoytiske og kosmetiske anvendelser. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens felt

Foreliggende oppfinnelse angår i sitt videste aspekt feltet behandling og forhindring av sykdommer og det kosmetiske felt, spesielt den farmasøytiske og kosmetiske anvendelsen av serinproteaser avledet fra fisk. Spesifikt blir det fremskaffet farmasøytisk eller kosmetisk aktive sammensetninger omfattende som aktiv komponent trypsin og/eller chymotrypsin fremskaffet fra atlantisk torsk, og serinproteaser relatert til slike enzymer.

Teknisk bakgrunn og kjent teknikk

US patent nr. 4.801.451 og 4.963.491 beskriver en blanding av exo- og endopeptidaser isolert fra antarktisk krill ( Euphasia superba) og anvendelsen av denne blandingen som en renseoppløsning. US pantet nr. 4.801.451 beskriver anvendelsen av slike enzymer for å fjerne fremmed materiale og dødt vev fra sår. Internasjonal patentsøknad WO 85/04809 beskriver anvendelsen av krillenzymer som et fordøyelsesfremmende middel. EP A1 0170115 beskriver anvendelsen av krillenzymer for å løse opp levret blod.

Imidlertid beskriver alle disse referansene urene eller dårlig karakteriserte materialer. En renset peptidase eller blanding av rensede peptidaser er ønskelige for å fremskaffe et farmasøytisk anvendelig produkt. Videre er det ikke funnet noen beskrivelse hvor en renset peptidase eller blanding av rensede peptidaser er nyttige for behandling av for eksempel artritis, betente ledd, bursitis, osteoartitis, reumatoid artritis, septisk artritis, årebetennelse, eksem, utslett, psoriasis eller infektiøse sykdommer.

Internasjonal patentsøknad WO 96/24371 beskriver anvendelsen avet krillavledet multifunksjonelt proteolytisk enzym og en familie krepsdyr- og fiskavledede proteolytiske enzymer som har betydelig strukturell likhet med det multifunksjonelle enzymet avledet fra antarktisk krill. Foreliggende søknad angår også metoder for rensing av det multifunksjonelle enzymet og farmasøytiske, kosmetiske og andre anvendelser av det multifunksjonelle enzymet. Betydelige likheter i struktur med det multifunksjonelle enzymet avledet fra antarktisk krill er definert i foreliggende søknad som minst 70% homologi med den krillavledede multifunksjonelle hydrolasen. Trypsin og chymotrypsin som kan fremskaffes fra torsk, som beskrevet heri har mindre enn 70% homologi med det krillavledede multifunksjonelle enzymet. I tillegg er torskavledede trypsiner og chymotrypsiner ikke multifunksjonelle enzymer. Deres hovedaktivitet er den til henholdsvis trypsinproteaser og chymotrypsinproteaser.

Et hovedmål ved foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe anvendelsen av de torskavledede trypsiner og chymotrypsiner i farmasøytiske sammensetninger eller medikamenter for lokal og topikal anvendelse for å behandle indre sykdommer og forstyrrelser og kosmetisk anvendelse av slike enzymer. Den topikale anvendelse for behandling av lokale, endre forstyrrelser, uten at enzymet må penetrere gjennom åpne sår eller slimhinner, ble funnet å være overraskende effektivt som beskrevet i de vedlagte eksemplene. Dette er i motsetning til læren av relatert anvendelse av andre enzymer hvorfor eksempel enzymet krill multifunksjonell hydrolase blir injisert for behandling av forskjellig lokal smerte. Et annet mål ved foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av de torskavledede trypsiner og chymotrypsiner for anvendelse i farmasøytiske sammensetninger eller medikamenter for transport av andre proteinbaserte og ikke proteinbaserte aktive forbindelser gjennom huden for lokal og topikal applikasjon for å behandle indre sykdommer eller forstyrrelser. Det har blitt funnet at slike serinproteaser er farmasøytisk meget aktive mot forskjellige sykdommer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse angår et første aspekt en fisk serinprotease fra torsk for anvendelse som et medikament. I denne sammenheng omfatter spesielt nyttige proteinaser trypsin og chymotrypsin avledet fra atlantisk torsk.

Ifølge et videre aspekt angår foreliggende oppfinnelse anvendelsen av en fisk serin proteinase fra torsk i fremstilling av et medikament for behandling og/eller forhindring aven sykdom hos et menneske eller dyr, hvor nevnte sykdom er valgt blant smerte, akutt inflammasjon, kronisk betennelse, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis, reumatoid artristis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erythematosus, årebetennelse, tenditt, utslett, psoriasis, akne, eksem, seboretisk eksem i ansiktet, eksem på hendene, ansiktet og halsen, forhudsinfeksjoner, fotsopp, fistulaeinfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr, kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemorroider, sår, sårinfeksjoner, brannsår, fungal infeksjon og en immunologisk forstyrrelse som omfatteren autoimmun sykdom.

Ifølge enda et aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fjerning av død eller avskallende hud fra ellers frisk hud ved anvendelse av en proteinase ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ifølge et ytterligere aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse anvendelsen av en serinproteinase fra fisk i fremstillingen avet medikament for behandling og/eller forhindring aven sykdom hos et menneske eller dyr, hvor nevnte sykdom er valgt blant gruppen bestående av smerte, akutt inflammasjon, kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursit, osteoartitis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse, tendinitt, utslett, psoriasis, eksem, facial seborrheisk eksem, eksem på hendene, ansiktet, hodebunnen eller halsen, forhudsinfeksjoner, fotsopp, fistulainfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr, kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemoroider, sår, sårinfeksjoner, brannsår, en fungal infeksjon og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer.

Ifølge et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse farmasøytiske og kosmetiske sammensetninger omfattende en fisk serinproteinase som kan fremskaffes fra torsk.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av trypsiner fra torsk eller andre relaterte trypsiner eller serinproteinaser slik som chymotrypsiner avledet fra dyr, spesielt akvatiske dyr slik som fisk inkludert torsk, i et flertall av medisinske og kosmetiske sammenhenger.

Som benyttet heri blir uttrykket "enzym" benyttet for å indikere et aktivt enzym dersom ikke annet er spesifisert. Som benyttet heri indikerer også uttrykket "trypsin eller andre relaterte peptidaser" pepsidaser av trypsintypen (EC 3.4.21.4) og alle andre pepsidaser som har 90% eller mer sekvenshomologi med trypsinene fra atlantisk torsk (Asgeirsson et al, Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Gudmondsdottir et al, Eur. J. Biochem. 217:1091-1097, 1993). Som benyttet heri betyr uttrykket "chymotrypsin eller andre relaterte peptidaser" alle peptidaser av chymotrypsintype (EC 3.4.21.1) og alle peptidaser som har 90% eller mer sekvenshomologi med chymotrypsiner A og B fra atlantisk torsk (Asgeirsson og Bjarnarson, Comp. Biochem. Physiol. 327-335-94, 1991; Gudmondsdottir et al, Biochem. etBiophys. Acta 1219:211- 214, 1994).

Spesielt er enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige for behandling av smerte, betennelse, akutt eller kronisk betennelse, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse, eksem, utslett, psoriasis, kviser, sår og kandidiasis. I nyttige utførelsesformer blir trypsin eller chymotrypsin fra torsk eller en blanding avdisse enzymene administrert lokalt og topikalt på det påvirkede stedet i en farmasøytisk sammensetning omfattende den rensede peptidase eller blanding av rensede peptidaser og en farmasøytisk akseptabel fortynner eller bærer, fortrinnsvis, men ikke begrenset til, en hydrogel. I tillegg er enzymene nyttige for behandling av virale infeksjoner, inkludert colitis, magesår, hemoroider, korneale arr, dentale plaque og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer.

Enzymer som er hovedsakelig strukturelt tilsvarende trypsin- og chymotrypsinenzymene som er avledet fra torsk, har samme anvendelse som torskeenzymene.

Spesielt er disse trypsin- og chymotrypsinenzymene nyttige for behandling av artritis, betente ledd, bursitis, osteroartritis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis og årebetennelse. I slike behandlinger blir trypsin eller chymotrypsin eller en blanding av begge enzymer administrert lokalt og topikalt ved stedet for artritis eller inflammasjon i en farmasøytisk sammensetning omfattende trypsinene eller chymotrypsinene eller begge enzymer og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner, fortrinnsvis, men ikke begrenset til, en hydrogel. I tillegg er trypsin- og chymotrypsinenzymene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttig for behandling av virale infeksjoner slik som herpesutbrudd, fungale, bakterielle eller parasittiske infeksjoner, inkludert kolitis, magesår, hemorider, corneale arr, dentale plaque, kviser, sår, candidiasis og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer.

Spesielt angår foreliggende oppfinnelse de medisinske, farmasøytiske og kosmetiske anvendelsene av trypsiner avledet fra atlantisk torsk og andre dyr. Disse er tre hoved isoenzymer av trypsin fra atlantisk torsk som har blitt renset og karakterisert. De har blitt kalt trypsin I, II og III (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94,1989). Trypsinene fra torsk har den aminoterminale sekvensen l-V-G-G-Y-Q/E-C-E/T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S, mens mammalske trypsiner slik som bovin trypsin har den aminoterminale sekvensen l-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S. Alle tre isoformene av trypsin fra torsk har en tilsvarende molekylvekt på omkring 24 kDa.

Foreliggende oppfinnelse angår også de medisinske, farmasøytiske og kosmetiske anvendelsene av chymotrypsiner avledet fra atlantisk torsk og andre dyr. Der er to hovedtyper isoenzymer av chymotrypsin i atlantisk torsk som har blitt renset og karakterisert. De har blitt betegnet chymotrypsin A ob B (Asgeirsson og Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B: 327-335-94, 1991). Chymotrypsinene fra torsk har den todelte aminoterminale sekvensen i en av dets aktive former C-G-R/S-P-A-l-S/Q-P-V/Q-IA/-T-G-Y(A-kjeden) og l-V-N-G-E-E-A-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q (B-kjeden), mens mammalske chymotrypsiner slik som bovin chymotrypsin A har de følgende aminoterminale sekvensene C-G-V-P-A-l-Q-P-V-L-S-G-L (A-kjeden) og l-V-N-G-E-E-A-P-G-S-W—W-Q-V-S-L-Q-D (B-kjeden). Begge isoformene av chymotrypsin fra torsk haren tilsvarende molekylvekt på omkring 26 kDa.

Trypsiner og chymotrypsiner fra torsk blir isolert og renset fra torskeinnvoller bortsett fra lever, milt og rogn. Oppfinnerne har funnet fremgangsmåtene beskrevet nedenfor nyttige foren produksjon av trypsin og chymotrypsin fra torsk i kommersiell skala. Enzymene blir ekstrahert fra hele eller malte innvoller ved vandig ekstraksjon med forsiktig omrøring ved et hvilket som helst forhold mellom innvoller og vann, fortrinnsvis et forhold (ve kt/ve kt) fra 1:1 til 1:10 av innvoller til vann. Etter separering av råekstraktoppløsningen og innvoller blir ekstraktet klarnet ved sedimentering eller filtrering. Den klarnede oppløsningen blir konsentrert fortrinnsvis ved ultrafiltrering og/eller eventuelt ionebytting og så fortrinnsvis mikrofiltrert for å oppnå en sann oppløsning med lav biobyrde som passer for kromatografi i pakket kolonne som kan omfatte flere trinn. Deretter blir trypsin fra torsk renset ved affinitetskromatografi fortrinnsvis ved aminobenzamidin affinitetskromatrografi og chymotrypsin ved hydrofob interaksjonskromatografi fortrinnsvis ved Phenyl Sepharose kromatografi.

Som benyttet her referer kommersiell skala produksjon av trypsin og chymotrypsin fra torsk til fremgangsmåter som er pålitelige og robuste og tillater produksjon av batcher i størrelsesorden 1 til 10 gram eller mer, slik som 10 til 100 g eller mer.

Den foretrukne fremgangsmåten for påføring av de rensede enzymene eller blandingen av rensede enzymer er i et preparat av hydrogel og vann inneholdende 0 til 85% (vol/vol) aven polyvalent alkohol (polyol) slik som glyserol. En passende konsentrasjon av trypsinaktivitet er 0,1 til 10000 enzymenheter av aktivitet for CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA(karbobenzoksy Gly-pro-Arg-paranitoranalid) per 100 milliliter av det endelige hydrogelpreparatet og den passende konsentrasjonen av chymotrypsinaktivitet er 0,1 til 10000 enzymenheter overfor succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA per 100 milliliter endelig hydrogelpreparat.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en farmasøytisk sammensetning omfattende trypsin fra torsk og relaterte peptidaser og en farmasøytisk akseptabel fortynner eller bærer.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også (a) midler som angår visse betingelser ved anvendelse av effektive mengder av de rensede enzymene beskrevet ovenfor, (b) sammensetninger eller stoffer for anvendelse i slike fremgangsmåter, (c) farmasøytiske sammensetninger inneholdende effektive mengder av enzymer for anvendelse i slike fremgangsmåter, og (d) anvendelser av enzymer eller enzymsammensetninger for fremstilling av et medikament for anvendelse i slike fremgangsmåter. Midlene er for: behandling eller profylaktisk forhindring av en indikasjon valgt blant gruppen omfattende smerte, betennelse, akutt eller kronisk betennelse, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus og årebetennelse, hvor fortrinnsvis mengden er en mengde som er effektiv for behandling eller forhindring;

behandling eller profylaktisk forhindring av dermatologiske tilstander slik som for eksempel kviser, utslett, psoriasis eller eksem, inkludert facial seborreisk eksem eller eksem på hender, ansikt, hodebunn eller hals, hemorroider og liknende, hvor fortrinnsvis mengden administrert av trypsinene fra torsk eller relaterte peptidaser er en mengde som er effektiv for behandling eller forhindring aven dermatologisk tilstand;

behandling eller profylaktisk forhindring av sårinfeksjoner og væskende sår (ved påføring på såret en mikrobielt infeksjonsforhindrende effektiv mengde av enzymet), hvor såret etter behandling kan være hovedsakelig fritt for nekrotisk vev;

fjerning av dødt eller avskallende hud fra ellers sunn hud for å forbedre hudens utseende, hvor fortrinnsvis mengden administrert av enzymet er en mengde som er effektiv for fjerning avdød hud;

behandling eller profylaktisk forhindring av cystisk fibrose, cancer, for eksempel ved administrering av en mengde enzym som er effektiv til forhindring eller inhibering aven tumor eller en tumormetastase, aterosklerose, astma, septisk sjokk, toksisk sjokk syndrom, vevsadhesjon slik som seneskjede, abdominal postkirurgisk eller vevsadhesjon, reperfusjonsskade, malaria, immunforstyrrelser slik som en autoimmun sykdom, apoptosis, kolitis og enteritt,

slik som Crohns sykdom, hvor fortrinnsvis mengden administrert av trypsin fra torsk eller beslektede peptidaser, er effektiv for behandling eller forhindring;

behandling eller profylaktisk forhindring aven mikrobiobiell infeksjon, for eksempel en viral infeksjon slik som en herpesinfeksjon (foreksempel HSV-2, HSV-2, herpes zoster eller genital herpes infeksjon), HIV, hepatitis, influensa, coronavirus, cotomegalovirus, rhinovirus eller papillomavirus infeksjon; en infeksjon som forårsaker en gastrointestinal sykdom slik som magesår eller diare; en fungal infeksjon slik som systemisk, hud, oral, vaginal eller øsofagal fungal infeksjon, inkludert for eksempel gjørinfeksjon, inkludert en fungal negleinfeksjon og candidainfeksjon; mikrobiale infeksjoner inkludert infeksjoner av Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia spp., syfilis og E. Coli-infeksjoner og bakterielle infeksjoner som forårsaker schanker; opportunistiske mikrobielle infeksjoner hos pasienter med svekket immunsysem hvor fortrinnsvis den administrerte mengden av trypsin fra torsk er en mengde som er effektiv fot å behandle eller forhindre infeksjoner eller har en inhiberende effekt mo celle-celle- eller celle-virus-adhesjon;

fjerning av dentale plaque, hvor fortrinnsvis den administrerte mengden er en mengde som er effektiv for fjerning av plaque; og

lysering av levret blod, hvor fortrinnsvis den administrerte mengden er en mengde som er effektiv for lysering av levret blod.

Fremgangsmåten omfatter administrering aven sammensetning omfattende trypsiner og/eller chymotrypsiner fra torsk eller relaterte peptidaser som beskrevet ovenfor. Sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet for fjerning avdøde eller divergente celler.

Oppfinnelsen fremskaffer topikale kosmetiske og medisinske sammensetninger omfattende det rensede trypsin eller chymotrypsin fra torsk eller andre relaterte peptidaser beskrevet ovenfor; og del-, krem- eller stikkpillesammensenting. Oppfinnelsen fremskaffer også (a) midler for behandling eller profylaktisk forhindring av et syndrom relatert til celle-celle- eller celle-virus-adhesjon, omfattende administrering av en antiadhesjons effektiv mengde av trypsin eller chymotrypsin fra torsk, eller relaterte peptidaser som er effektive for å fjerne eller inaktivere en cellulær eller viral akseptor- eller reseptor-adhesjonskomponent som er involvert i celle-celle- eller celle-virus-adhesjon, (b) sammensetninger eller stoffer for anvendelse i slike fremgangsmåter, (c) farmasøytiske sammensetninger inneholdende effektive mengder av enzymer for anvendelse i slike fremgangsmåter, og (d) anvendelser av slike enzymsammensetninger for fremstilling avet medikament for anvendelse i slie fremgangsmåter. Generelt omfatter syndromet innflammasjon, artritis, betente ledd, årebetennelse, eksem, utslett, psoriasis, kviser, sår, kandidiasis og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer, sjokk, tumormetastase r, transplantasjons awisningsreaksjoner eller mikroielle infeksjoner.Fortrinnsvis er (a) syndromet valgt blant gruppen omfattende mikrobiell infeksjon, immunforstyrrelse, cystisk fibrose, aterosklerosis, cancer, astma, septisk sjokk, toksisk sjokk syndrom, conjunctivitis, reperfusjonsskade og smerte, og (b) en celleoverflatereseptor, assisiert med celle-celle- eller celle-virusadhesjonssyndrom valgt blant de følgende som trypsin fra torsk har blitt vist å spalte, omfattende DCD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11a/CD18, blir fjernet eller inaktivert ved det administrerte enzymet. Fortrinnsvis blir en mikrobiell infeksjon behandlet eller forhindret og den mikrobielle infeksjonene er herpes-, HIV-, hepatitis eller papillomainfeksjon; en infeksjon som forårsaker kolitis eller diare; en Candida-infeksjon, slik som oral, vaginal eller øsofagial Candidainfeksjon, en forkjølelse- eller influensa infeksjon, en Staphylococcus-, Streptococcus-, Klebsielle-, Pseudomonas-, Haeophilus- eller E-coli-infeksjon; en primær eller sekundær infeksjon av lepra; eller en infeksjon som forårsaker konjunkivitis eller tuberkulose.

Ifølge en utførelsesform fremskaffer foreliggende oppfinnelse midler for hemming eller profylaktisk forhindring av overføringen aven patogen mikrobe ved administreringen av trypsin- eller chymotrypsinenzymer fra torsk. Fortrinnsvis blir trypsin- og/eller chymotrypsinenzymer påført på den delen av kroppen som omfatter den primære inngangsporten for overføringen for den aktuelle mikroben. I en utførelsesform blir en spray, salve eller vask påført på en kroppsåpning som for eksempel er involvert i seksuell aktivitet for å forhindre HIV- eller hepatitisoverførsel. I en annen foretrukket utførelsesform blir trypsin fra torsk eller relaterte peptidaser tilført til de øvre luftveier for eksempel via en aerosol, for å hemme eller forhindre overførselen avet vanlig forkjølelsesvirus, slik som rhinovirus eller et coronavirus.

Ifølge ett aspekt vedrører fremgangsmåten ekstrakorporal behandling av et vev, kroppsvæske eller sammensetning av celler for å fjerne

celleadhesjonskomponenter for å redusere immunawisning av vev, kroppsvæske eller sammensetning av celler som blir transplantert fra et individ til et annet. Ifølge et annet aspekt fjerner eller inaktiverer slik behandling celleadhesjonskomponentene som er til stede i det behandlede vevet, kroppsvæsken eller sammensetningen av celler, som er involvert i en mikrobiell infeksjon.

Ved behandling eller profylaktisk forhindring av septisk sjokk eller toksisk sjokk syndrom ved administrering av trypsiner fra torsk eller relaterte peptidaser, omfatter passende administrasjonsveier systemisk administrasjon. For vaginale infeksjoner assosiert med sjokk kan vaginale spylinger, kremer, geler eller stikkpiller bli benyttet som en administrasjonsmetode.

Ved behandling eller profylaktisk forhindring av smerte, inflammasjon, akutt eller kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse ved administrering av trypsiner fra torsk eller relaterte peptidaser, vil passende administrasjonsveier uten begrensninger omfatte kremer, geler eller stikkpiller, spesielt, men ikke begrenset til, hydrogeler inneholdende glyserol eller andre polyoler.

Ved behandling eller profylaktisk behandling av utslett, psoriasis, eksem, inkludert facial seborrheisk eksem eller eksem på hendene, ansiktet, hodebunnen eller halsen, forhudsinfeksjoner, fotsopp, fistulainfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr og kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemorroider og liknende, sår, sårinfeksjoner, brannsår, fjerning avdød eller avskallende hud fra ellers frisk hudfor å forbedre utseendet av huden, en fungal infeksjon slik som en systemisk infeksjon, hudinfeksjon, oral infeksjon, vaginal eller øsofagal infeksjon, inkludert for eksempel gjærinfeksjon, inkludert en fungal negleinfeksjon og Candida-infeksjoner og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer ved administrasjon av trypsiner eller chymotrypsiner fra torsk og peptidaser relatert til disse enzymene, omfatter passende administrasjonsveier kremer, geler eller stikkpiller, spesielt, men ikke begrenset til, hydrogeler inneholdende glyserol eller andre polyoler.

Følgelig er det et mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en sammensetning for behandling av smerte, inflammasjon, akutt eller kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse, utslett, psoriasis, eksem, inkludert facial seborrheisk eksem eller eksem på hendene, ansiktet, hodebunnen eller halsen, forhurdsinfeksjoner, fotsopp, fistulainfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr og kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemorroider og liknende, sår, sårinfeksjoner, brannsår, fjerning av død eller avskallende hud fra ellers frisk hudfor å forbedre utseendet av huden, en fungal infeksjon slik som en systemisk infeksjon, hudinfeksjon, oral infeksjon, vaginal eller øsofagal infeksjon, inkludert for eksempel gjærinfeksjon, inkludert en fungal negleinfeksjon og Candida-infeksjoner og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer. Et annet mål er å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning for anvendelse for behandling av nevnte sykdommer. Et tredje mål er å fremskaffe en fremgangsmåte for påføring av nevnte sammensetning for behandling av nevnte sykdommer, inkludert dosenivåer for eksterne og topikale påføringer. Oppfinnelsen er således basert på sammensetninger omfattende enzymer hvor tidligere ingen enzymer har blitt benyttet eller et bedre enzym hvor enzymer har blitt benyttet.

Målene ovenfor blir oppnådd ved anvendelse aven sammensetning inneholdende en effektiv mengde av trypsin og/eller chymotrypsin fra torsk som er i stand til å lette smerte, inflammasjon, artritis, opphovning, ødem, proriasis, eksem, dermatitt, utslett og/eller andre symptomer på sykdommene nevnt i den introduserende delen. Enzymene fra torsk kan bli fremskaffet med høyt utbytte og på en relativt enkel måte fra innvoller fra torsk. Det har blitt funnet at enzymer fra torsk kan bli renset i kommersiell skala på en relativt enkel måte med fornuftige utbytter. Det rensede trypsin fra torsk inneholder tre hoved isoenzymer av enzymet og chymotrypsin fra torsk inneholder to hoved isoenzymer. Ett eller alle isoenzymene kan bli benyttet for oppfinnelsens formål.

Det har nå blitt etablert at trypsin og chymotrypsin enzymer fra torsk effektivt fjerner eller inaktiverer visse celleoverflate adhesjonsmolekyler, bakterielle enterotoksiner, cytokiner, inflammatoriske mediatorerog matriks metalloproteinaser (MMPs) slik som CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11a/CD18, TNF-alfa, IL-1 og MNP-9, uten å påvirke cellenes levedyktighet. Dette fenomenet ved spalting eller inaktivering av adhesjonssetet av cytokiner, inflammatoriske mediatorerog matriks metalloproteinaser er antatt å fremskaffe minst en delvis forklaring på effektiviteten til trypsinene og chymotrypsinene fra torsk mot mange, men sannsynligvis ikke alle, av indikasjonene mot hvilke trypsiner og chymotrypsiner fra torsk er effektive (se Cytokines, Eds. Mire-Slui og Thrope, Academic press, 1998, s. 350).

Trypsiner og chymotrypsiner fra torsk synes i mange henseender å være mer effektive enn andre konvensjonelle proteaser. Når et panel av 13 av de mest effektive proteasene i denne sammenheng ble sammenlignet med effektiviteten mot 16 av de ovenfor nevnte visse celleoverflate adhesjonsmolekylene, bakterielle toksiner, cytokiner, inflammatoriske mediatorerog MMPs, så vel som deres sensivitet overfor serum in hi be ring, ble trypsin og chymotrypsin fra torsk funnet å være det aller mest aktive. Proteasene ble gitt 2 poeng for høy til meget høy aktivitet, 1 poeng for moderat aktivitet og Opoeng for meget lav til ingen aktivitet (motsatte poeng for seruminhibitorisk aktivitet for proteasene). På basis avdette poengskjemaet skåret trypsin fra atlantisk torsk 30 poeng og chymotrypsin fra atlantisk torsk skåret 29 poeng, mens den kjente multifunksjonelle proteasen fra krill skåret 16 poeng. Bovine trypsin og chymotrypin proteaser ble funnet å ha mangler i så henseende. Videre er trypsiner og chymotrypsiner fra torsk 2 til 20 ganger mer aktive enn deres bovine motparter når konvensjonelle små kromogene substrater blir benyttet for å sammenligne deres aktiviteter (Asgeirsson et al, Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Asgeirsson og Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327.335-94, 1991).

Innvoller fra torsk er nyttige kilder for trypsin- og chymotrypsinenzymer fra torsk ifølge foreliggende oppfinnelse, foreksempel kan enzymene bli ekstrahert på kommersiell basis fra frosne innvoller fra torsk som beskrevet ovenfor. Den klarnede og konsentrerte ekstraktoppløsningen kan eventuelt bli fraksjonert ved kommersiell skala ione bytte kromatografi, fortrinnsvis først et kationbytte kromatografisk trinn fulgt av et an ion bytte krom atog råfisk trinn for å binde og derved fjerne relaterte serin proteaser slik som elastase og serin kollagenase. I et påfølgende og siste trinn blir trypsin fra torsk renset ved kommersiell skala affinitetskromatografi, fortrinnsvis ved bruk av p-aminobenzamidin affinitets kolonnekromatografi og chymotrypsin ved hydrofob interaksjon kolonnekromatografi fortrinnsvis ved bruk av Phenyl Sepharose.

Trypsinet fra torsk som blir benyttet i oppfinnelsen, kan bli desorbert fra affinitetsmatriksen ved å benytte betingelser som vil destabilisere interaksjonene mellom enzymet og affinitetsliganden. Slike betingelser inkluderer høy saltkonsentrasjon fulgt av lav pH, fortrinnsvis i 30% eller mer glyserol. Kolonneeluenten blir tillatt å strømme opp i en nøytraliserende buffer for å stabilisere trypsinet fra torsk etter syreelueringstrinnet (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Chymotrypsinet fra torsk benyttet i oppfinnelsen kan bli frigitt fra Phenyl Sepharose-kolonnen bed å benytte betingelser som vil destabilisere interaksjonen mellom enzymet og den hydrofobe interaksjonsliganden. Slike betingelser omfatter høyt glyserolinnhold i vann eller buffer, fortrinnsvis 50% eller mer glyserol i vann eller buffer (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 99B:327-335-94, 1991). Ved disse fremgangsmåtene kan trypsin og chymotrypsin fra torsk bli isolert med en renhet i overkant av omkring 90%. Det kan således bli fremskaffet en Trypsinfraksjon fra torsk inneholdende tre hovedformer eller isoenzymer av trypsin fra torsk som manifestert ved SDS-elektroforese som gir ett bånd, isoelektrisk fokusering viser tre bånd og kromatofokuseringskromatografi gir tre topper assosiert med de tre trypsin isoformene (fig. 1). Minst fire isoenzymer av trypsin IV er i tillegg inkludert i trypsinfraksjonen dersom det ikke blir benyttet anionbyttekromatografi. Disse kan bli separert som subfraksjoner med påfølgende mono-Q eller DEAE anionbytte kromatografi.

Serinproteasene fra andre kilder enn atlantisk torsk kan bli sammenlignet med isolerte trypsin enzymer fra atlantisk torsk med hensyn på molekylvekt, isoelektrisk punkt, aminosyresekvens, temperatur- eller pH-stabilitet, proteolytisk spesifisitet og kinetiske parametere, eller andre egenskaper for trypsinenzymene fra atlantisk torsk eksemplifisert i eksemplene (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Aktiviteten til trypsin fra torsk kan bli målt ved anvendelse avtyrosin arginin metyl esterase (TAME) som substrat. Det isolerte trypsin fra torsk fra affinitetskolonnerensingen (90-100%renhet) vil fortrinnsvis ha en spesifikk aktivitet på minst 140 U/mg ved 25 °C og pH 8,1, sammenlignet med 60 U/mg for multifunksjonell hydralase fra krill. Trypsinaktiviteten kan også bli målt ved bruk av Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nitoranilid (Cbz-GPR-pNA9) som substrat for å gi en spesifikk aktivitet på fortrinnsvis minst omkring 100 U/mg. Videre, når Bz-Arg-pNA blir benyttet som substrat blir katalytiske effektivitetskonstanter (kkai/Km) på 52, 20 og 7 s"<1>mM"<1> oppnådd for henholdsvis trypsin I, II og III fra torsk sammenlignet med 3 s"<1>mM"<1> for bovin trypsin (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Tilsvarende forskjeller blir sett for chymotrypsin fra torsk og bovin chymotrypsin (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 99B:327-335-94, 1991).

Molekylvekten til trypsinene fra torsk er omkring 24 kDa, mens deres isoelektriske punkter er 6,6, 6,2 og 5,5 for henholdsvis trypsin I, II og III, og enda lavere for trypsin IV isoenzymene. Aminosyresekvensen til isoenzymene av trypsin fra torsk kan bli uttrykt med de følgende sekvensene som inneholder punktvariabiliteten på grunn av de multiple isoformene:

hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre eller ingen aminosyre, og trypsin I fra torsk har amonosyreresten K i posisjon 9, mens trypsinene II og II inneholder R i denne posisjonen (Gudmondsdottir et al, 1993 og ikkepubliserte data).

Generelt vil trypsin isoenzymene fra torsk være tilstrekkelig stabile slik at minst omkring 50% av TAME-aktiviteten blir opprettholdt etter inkubasjon ved 5 °C i 18 timer ved pH 7,0 i en bufferoppløsning inneholdende 10 mM kalsiumklorid. Imidlertid er kun omkring 10 % av TAME-aktiviteten opprettholdt etter inkubering ved 5 °C i 18 timer ved pH 2.0 (fig. 2).

pH-optimum for trypsinene fra torsk for TAME som substrat er fortrinnsvis mellom omkring 7,0 og 8,7, mer foretrukket omkring 8,0 (fig. 3). Ved anvendelse av TAME som substrat er kM ved omkring pH 8,1 og 25 °C i nærvær av 10mM kalsiumklorid er fortrinnsvis omkring 0,029mM, 0,021mM og 0,049mM for henholdsvis trypsin I, II og III fra torsk. Fortrinnsvis har trypsin fra torsk et temperaturmaksimum for aktivitet for TAME som substrat mellom 50 og 60 °C (fig- 4).

Trypsin og chymotrypsin enzymer fra torsk ifølge oppfinnelsen blir administrert topikalt, oralt, rektalt, vaginalt, ved installasjon (for eksempel inn i urintrakten eller inn i fistulas), ved den pulmonare vei, for eksempel ved anvendelse aven aerosol, ved applikasjon av dråper til øyet eller systemisk slik som parenteralt, inkludert for eksempel intramuskulært, subkutant, intraperitonealt, intraarterielt eller intravenøst. Enzymene fra torsk blir administrert i oppløsning eller kombinert med en farmasøytisk akseptabel bærer eller hjelpestoff ifølge standard farmasøytisk prosedyre. For oral modus for administrasjon blir enzymene fra torsk benyttet i form av tabletter, kapsler, piller, tyggegummi, trokéer, pulvere, siruper, eliksirer, vandige oppløsninger og suspensjoner og liknende. For parenteral administrasjon blir vanligvis sterile oppløsninger av torskeenzymet fremstilt og pH-verdiene til oppløsningen blir passende justert og buffret. For intravenøs anvendelse må den totale konsentrasjonen av oppløste stoffer bli kontrollert for å gjøre preparatet isotont. For okular administrasjon kan salver eller dryppbare væsker bli gitt ved okulære leveringssystemer som er kjent innen teknikken som applikatorer eller øyedryppere. For pulmonar administrasjon vil fortynnere og/eller bærere bli valgt slik det passer for å tillate dannelsen aven aerosol. For topikal administrasjon blir trypsinenzymer fra torsk typisk administrert i en hydrogel inneholdende 0 til 85% glyserol slik som omkring 20% til 30% glyserol og muligens opp til 85% glyserol.

Tor topikal behandling varierer en passende dose avtrypsinenzym fra torsk per applikasjon fra omkring 0,01 ug/cm<2> til omkring 1 mg/cm<2>, fortrinnsvis fra omkring 0,1 ug/cm2 til omkring 0,01 mg/cm<2> (ved anvendelse av for eksempel omkring 0,01 mg/ml enzymgel). For systemisk behandling vil doseringer generelt bli valgt for å opprettholde et serumnivå av trypsinenzymene fra torsk mellom omkring 0,1mg/100 ml og omkring 100mg/100ml, fortrinnsvis mellom omkring 0,5 mg/100ml og omkring 2,0 mg/100ml. Ifølge et alternativt mål for foretrukne mengder for systemisk administrasjon vil fortrinnsvis fra omkring 0,1 mg/kg til omkring 10mg/kg, mer foretrukket omkring 1 mg/kg, bli benyttet. For vaginal og urintrakt behandling vil passende mengder for spyling hhv. installasjon av trypsinenzymene fra torsk generelt ha konsentrasjoner fra omkring 1 ^g/ml til omkring 15 mg/ml, fortrinnsvis fra omkring 100 ^g/ml til omkring 3 mg/ml. For alle behandlinger vil enzymsammensetningen generelt bli anvendt fra omkring 1 til omkring 10 ganger per dag, fortrinnsvis fra omkring 2 til omkring 5 ganger per dag. Disse verdiene vil naturligvis variere med et antall faktorer omfattende typen og alvoret av sykdommen og alderen, vekten og medisinske tilstanden til pasienten, noe som er velkjent for fagmannen innen det medisinske feltet. Det er antatt at betydelig høyere doser kan bli benyttet uten betydelige negative effekter.

For sårheling blir trypsinenzymet fra torsk fortrinnsvis påført oftere enn kun første gang såret blir forbundet. Fortrinnsvis blir trypsin fra torsk påført i det minste hver gang sårforbindingen blir skiftet. Trypsinene fra torsk kan også bli påført minst omtrent annenhver dag, mer foretrukket hver dag eller noen få ganger daglig. For dermatologiske situasjoner slik som eksem, psoriasis og liknende blir hydrogel inneholdende trypsin- og/eller chymotrypsinenzym fra torsk fortrinnsvis påført hver dag, mer foretrukket to ganger daglig. For akutt eller kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursitis, osteoartritis og liknende blir trypsinenzymene fra torsk fortrinnsvis påført hverdag eller mer foretrukket to ganger daglig.

Som illustrert i mange av de kliniske eksemplene nedenfor er enzym hydrogel fra torsk ifølge foreliggende oppfinnelse effektiv for å behandle eller forhindre inflammatoriske tilstander. Typisk blir inflammasjoner redusert til akseptable nivåer innen 2 til 3 dager fra start av behandlingen. Eksemplene viser også at enzymene er effektive for å lette smerte. Smertelettelse blir ofte rapportert innen 20 minutter til 2 timer etter start av behandlingen. Smertelettelse var ikke ledsaget av tap av følelse i det behandlede vevet. Mer fullstendig smertelettelse, slik at pasienten kun lider av mild smerte eller en følelse av ømhet, ble ofte erfart innen en dag fra starten av behandlingen.

Generelt vil enzymene fra torsk ifølge foreliggende oppfinnelse bli administrert i en effektiv mengde. En effektiv mengde er en mengde som er effektiv til enten (1) å redusere symptomene på sykdommen man søker å behandle, (2) indusere en farmakologisk endring som er relevant for å behandle sykdommen som søkes behandlet, (3) inhibere eller forhindre infeksjon eller reinfeksjon av et infektivt middel, eller (4)forhindre forekomsten aven ikkeinfeksiøs sykdom (foreksempel en sykdom som kan behandles ved blokkering avet celleadhesjonsfenomen). For sårbehandling ifølge ett aspekt forhindrer en effektiv mengde som inkluderer en mengde som hvis den blir påført regelmessig, opptredenen av infeksjon. Ifølge et annet aspekt, for sårbehandling, inkluderer en effektiv mengde en mengde som er effektiv til å redusere gjennomsnittstiden det tar for at et sår heler.

Tallrike fremgangsmåter for bestemmelse av prosent homologi av proteiner er kjent i teknikken. En foretrukket fremgangsmåte er å benytte versjon 6.0 av GAP dataprogram for å gjøre sekvenssammenligninger. Programmet er tilgjengelig fra Genetics Computer Group ved University of Wisconsin, og benytter tilpasningsmetoden til Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 ( 1979) som revidert av Smith og Waterman, Adv. Appl. Math., 2, 482 ( 1981). En annen tilgjengelig fremgangsmåte benytter FASTA-dataprogrammet.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli ytterligere illustrert i de følgende eksemplene og figurene hvor: fig. 1 viser et kromatofokuseirngskromatograf av trypsinfraksjonen fra atlantisk torsk fra aminomenzamidin affinitetskolonne rensetrinnet. Fraksjonen eluertfra para-aminobenzamidinkolonnen ble gelfiltrert å en SephadexG-25 kolonne ekvilibrert med 25 mM monoetanolamin/eddiksyre pH 9,4 inneholdende 10 mM kalsiumklorid og deretter satt på en kolonne av PBE-94 ionebyttemateriale (Pharmacia) ekvilibrert i samme buffer. Kolonnen ble så eluert med Polybuffer 94 (justert til pH 5,5 med eddiksyre) inneholdende 10 mM kalsiumklorid. Affinitet for substratet TAME (fylte sirkler), absorbans ved 280 nm (åpne sirkler) og pH (åpne "diamanter") ble overvåket. Den først eluerte fraksjonen ble kalt trypsin I, den andre fraksjonen trypsin II og den tredje fraksjonen trypsin III;

fig. 2 illustrerer effekten av pH på stabiliteten til trypsin fra atlantisk torsk renset ved para-aminobenzamidin som målt ved gjenværende TAME-aktivitet etter inkubering ved forskjellige pH-verdier og to forskjellige tidsperioder. Prøvene av trypsin fra atlantisk torsk ble inkubert ved 5 °C i 30 minutter (åpne sirkler) og 18 timer (fylte kvadrater)ved varierende pH-verdier. Gjenværende aktivitet for substratet TAME ble deretter målt ved pH 8,1 og 25 °C;

fig. 3 viser pH-avhengigheten til aktiviteten til trypsin fra atlantisk torsk renset ved paraaminobenzamidine som målt ved anvendelse av TAME som substrat. De benyttede bufferne som ble benyttet ved en endelig konsentrasjon på 0,1 M

var acetat (pH 3,0 - 5,9), hepes/GCI (pH 6.0-8,0) og glysinat (pH 8,3-9,0), alle inneholdende 10 mM kalsiumklorid, og

fig. 4 viser temperaturavhengigheten til aktiviteten for trypsin I sammenlignet med aktiviteten til bovin trypsin målt ved anvendelse av TAME som substrat. Enzymene ble tilsatt til en forhåndsvarmet termostatregulert kuvette og etter en kort ekvilibreringsperiode ble den gjennomsnittlige hydrolyseraten målt i løpet av de følgende 3 minuttene.

Eksempel 1

Fremstilling av en blanding proteaser fra torsk

Omkring 100 kg frosne torskeinnvoller ble tint og tilsatt et fire ganger volum av kaldt drikkevann i en ekstraksjonstank og pH ble justert til pH 8 til 9 med en natriumhydroksydoppløsning. Blandingen ble omrørt i omkring 2-6 timer ved 0 - 5 °C. Etter en kort periode med ubearbeidet sedimentering (omkring 30 minutter) ble det vandige ekstraktet tappet av de gjenværende uoppløselige innvollene med en pumpe og oppsamlet i en sedimenteringstank. Det vandige ekstraktet ble tillatt å stå i den avkjølte sedimenteringstanken for å sette seg i omkring 24 til 60 timer. Supernatanten ble dekantert av fra sedimenteringstanken til en lagringstank ved bruk aven pumpe. Supernatanten ble konsentrert 10 til 20 ganger ved ultrafiltrering og diafiltrert til et akseptabelt nivå ionestyrke med konduktivitet under omkring 3 mS/cm. Omkring 10-15 liter ultrafiltrert og diafiltrert proteinkonsentrat ble oppnådd.

Eksempel 2

Rensing av trypsin fra torsk fra konsentrert ekstrakt fra torskeinnvoller Omkring 10 liter av det ultrafiltrerte og diafiltrerte konsentratet som fremstilt i eksempel 1 ble satt på en kontinuerlig forbundet serie på omkring 1 liters pakkede kromatografikolonner, den første inneholdende en CM hurtig gjennomstrømnings kationbytteresin (Pharmacia, Sverige), den andre med en DEAE hurtig gjennomstrømnings anoion bytte resi n (Pharmacia, Sverige) og den tredje med en p-aminobenzamidin affinitetsligand koblet til en se pha rose resi n (Pharmacia, Sverige). Kolonnen ble preekvilibrert med omkring 10 kolonnevolumer av en 25mM trisbuffer med pH 7,8, inneholdende 2,5 mM kalsiumklorid (buffer A). Konsentratet ble pumpet inn på kolonnene med en strømningshastighet på omkring 100 ml per minutt. Når påsettingen av konsentratoppløsningen var fullført ble gjenværende materiale vasket ut av det kontinuerlige kolonnesystemet med omkring 8 liter buffer A.

Etter denne vasken var fullført ble p-aminobenzamidin affinitetskolonnenkoblet fra de andre kolonnene og vasket med omkring 5 volumer aven høysalt oppløsning av25 mM trisbuffer pH 7,5 inneholdende 0,5 M NaCI og 2,5 mM kalsiumklorid. Trypsinet fra torsk ble så desorbert fra affinitetsliganden og eluert ut av kolonnen med en syreoppløsning av 25 mM eddiksyre pH 3,2 inneholdende 10 mM kalsiumklorid og 30% glyserol. Trypsinfraksjonen fra torsk ble oppsamlet i en neøtraliserende buffer av200 mM tris pH 8,5 inneholdende 30 % glyserol.

Preparatet av renset trypsin fra torsk var homogen ifølge SDS PAGE elektroforese og FPLC Mono Q kromatografi og viste tre trypsin isoenzymbånd ved isoelektrisk fokusering. Enzympreparatet hadde en spesifikk aktivitet på omkring 100 U/mg ved anvendelse av Cbz-GPR-pNA som substrat som tidligere beskrevet. Det rensede preparatet ble filte rste ril ise rt gjennom et 0,22 mikron filter og lagret frosset ved omkring -20 °C.

Eksempel 3

Alternativ rensing i kommersiell skala av trypsin fra torsk fra konsentrert ekstrakt fra torskeinnvoller

Omkring 10 liter av det ultrafUtrerte og diafiltrerte konsentratet som fremstilt i eksempel 1 ble satt på en p-aminobenzamidin affinitetsligand koblet til en sepharoseresid (Pharmacia, Sverige). Kolonnen ble preekvilibrert med omkring 10 kolonnevolumer 25 mM Tris-buffer pH 7,8, inneholdende 2,5 mM kalsiumklorid (buffer A). Konsetratet ble pumpet til kolonnen ved en strømningsrate på omkring 100 ml per minutt. Etter at påsettingen av konsentratoppløsningen var fullstendig ble gjenværende materiale vasket ut av kolonnen med omkring 8 liter buffer A.

Affinitetskolonnen ble deretter vasket med omkring 5 volumer høysaltoppløsning av25 mM Trisbuffer pH 7,5 inneholdende 0,5 M NaCI og 2,5 mM kalsiumklorid. Trypsinene fra torsk ble så desorbertfra affinitetsliganden og eluert av kolonnen med en syreoppløsning av 25 mM eddiksyre pH 3,2 inneholdende 10 mM kalsiumklorid og 30 % glyserol. Trypsinfraksjonen fra torsk ble oppsamlet i en nøytraliserende buffer av200 mM tris pH 8,5 inneholdende 30 % glyserol og inneholdende omkring 5-6 g trypsin.

Preparatet av renset trypsin fra torsk var homogen ifølge SDS PAGE elektroforese og viste tre trypsin isoenzymbånd ved isoelektrisk fokusering. En mindre fraksjon (<5%) kunne bli separert ved påfølgende FPLC Mono Q-kromatografi og ble identifiser som minst fire ytterligere isoenzymer; trypsin Iva, Ivb, Ivc og Ivd. Enzympreparatet hadde en spesifikk aktivitet på omkring 100 U/mg ved anvendelse avCbz-GPR-pNA som substrat som tidligere beskrevet. Det rensede preparatet ble filtersterilisert gjennom et 0,22 mikron filter og lagret frosset ved omkring -20 °C.

Eksempel 4

Fremstilling av et hydrogel preparat av trypsiner fra torsk

Det rensede trypsinpreparatet fra torsk fra eksempel 2 ble blandet med en hydrokolloidgel omfattende en vandig gel inneholdende 0,8 % w/v Carbomer 940, 30% glyserol og 0,08 % paraoksybensoat. Trypsinpreparatet fra torsk ble blandet i 1:1 forhold med hydrogelen for å gi en endelig konsentrasjon på 1 enzymenhet per mg (U/mg) av den endelige gel-enzym-blandingen (enzym-hydrogel-salven), hvor ensymenheten blir bestemt ved anvendelse avCbz-GPR-pNA som substrat som tidligere beskrevet. Den resulterende enzym-hydrogel-salven inneholdt således omkring 0,01 mg/ml, eller 1 U/ml, av trypsiner fra torsk, Carbomer 940, 20 % glyserol og 0,04 % paraoksybenzoat. I den videre beskrivelsen blir denne hydrogelsalven referert til som Penzym 100.

Eksempel 5

Behandling av osteoartritis med Penzym 100.

Sytten individer med osteoartritis, noen med akutte eller meget alvorlige symptomer, ble behandlet med enzymhydrogelen (Penzym 100) fra eksempel 4. Enzymgelen ble påført en til to ganger daglig, alltid en gang om kvelden før leggetid og i de fleste tilfeller også om morgenen. Omkring 5 milliliter av enzymgelen ble påført på det berørte området slik som hvert kne eller hofte eller begge hender. Større mengder kan bli påført i alvorlige tilfeller. Gelen ble tillatt å tørke i omkring 10 til 30 minutter, avhengig av påført mengde, tilgjengelig tid og behovene og kravene til pasientene. Denne tørkingen kan akselereres ved anvendelse av en luftblåseanordning, slik som en hårtørrer. Alle disse pasientene erfarte bedring i symptomene innen en uke, de fleste av den innen 2 til 4 dager. Pasient nr. 71 var ikke i stand til å gå opp trapper før behandling, men hadde ingen problemer med dette etter behandlingen. Disse resultatene er oppsummert i den følgende tabell 5.1.

Noen få pasienter (nr. 19 og 21) har vært i stand til å avbryte behandlingen og synes således å ha fått permanent eller langtids bedring fra sykdommen, men de fleste holdt symptomene under kontroll med konstant eller intermitterende bruk av Penzym 100.

Eksempel 6

Behandling av pasienter som lider av tendinitis

Åtte individer med tendinitis, noen med meget alvorlige symptomer som forårsaker problemer med nattesøvnen, ble behandlet med enzymhydrogelsalve (Penzyme 100) fra eksempel 4. Enzymgelen ble påført topikalt på det påvirkede området to ganger daglig omkring 5 til 10 ml på hvert påvirket område avhengig av områdets størrelse, den tilgjengelige tid og behovet og kravet til pasienten. Alle disse erfarte bedring i symptomene innen to uker, de fleste av dem innen 2 til 4 dager, mens andre tok lengre tid, spesielt de med tendinitis i albuen (tennisalbue eller golfspillers albue). Disse resultatene er oppsummert i den følgende tabell 6.1:

Alle disse pasientene har hatt gleden av en permanent bedring i tilstanden og har avbrutt behandlingen.

Eksempel 7

Behandling av fibromyalgi

To pasienter som lider av alvorlig fibromyalgi ble behandlet med enzymhydrogelsalven (Penzym 100) fra eksempel 4. Enzymgelen ble påført topikalt på det påvirkede området to ganger per dag, 5 til 10 ml på hvert påvirkede område avhengig av områdets areal. Gelen fikk tørke i 10 til 30 minutter, avhengig av den påførte mengden, tilgjengelig tid og behovene og kravene til pasienten. Begge pasientene (Nr. 78, K-50 og nr. 92, K-53) erfarte bedring fra symptomene innen tre uker. Begge benytter enzymgelbehandlingen når smerte igjen opptrer.

Eksempel 8

Behandling av reumatoid artritis

Fem pasienter med reumatoid artritis, noen med meget alvorlige symptomer, ble behandlet med enzymgelsalven (Penzym 100) fra eksempel 4. Enzymgelen ble påført topikalt på det påvirkede området vanligvis minst to ganger daglig, omkring 3 til 5 milliliter på hvert påvirkede område avhengig av størrelsen av arealet. Gelen ble tillatt å tørke i omkring 15 minutter avhengig av tykkelsen på den påførte gelen. Denne tørkeperioden kan bli forkortet ved anvendelse aven luftblåsende anordning slik som en hårtørker. Alle fem pasientene erfarte bedring fra symptomene innen 5 dager. Disse resultatene er oppsummert i den følgende tabell 8.1:

Pasient nr. 61 kunne ikke komme ut av sengen om morgenen og kle seg uten assistanse før hun startet behandlingen, men var fullt i stand til å gjøre så alene etter behandlingen. Pasient nr. 94 hadde smerte i brystet under pusting på grunn av komplikasjoner med pleural effusjon. Hun ble lettet for disse symptomene etter 3 dagers behandling med Penzym 100. Alle disse pasientene holder symptomene under kontroll med konstant eller intermitterende anvendelse av enzymgelbehandlingen.

Eksempel 9

Behandling av flebit

Fem pasienter med forskjellige former for flebit, slik som tromboflebit, flebotrombosis, kronisk postflebit syndrom og åreknuteri leggene, noen med meget alvorlige symptomer som forårsaker smerte med søvnproblemer, ble behandlet med enzymhydrogelsalven (Penzym 100) fra eksempel 4. Enzymgelen ble påført topikalt på leggen minst to ganger daglig, dvs. om kvelden og i de fleste tilfellene også om morgenen, omkring 5 milliliter på hver legg. Gelen fikk tørke i omkring 15 minutter. Alle fem pasientene erfarte bedring i symptomene innen få uker. Disse resultatene er oppsummert i den følgende tabell 9.1:

Pasient nr. 2 ble diagnostisert med kronisk postflebit syndrom. Pasient nr. 68 sover ikke skikkelig om natten på grunn av smerte dersom kun ikke påfører kremen før sengetid. Alle disse pasientene holder symptomene under kontroll med konstant eller intermitterende anvendelse av enzymgelbehandlingen.

Eksempel 10

Behandling av psoriasis

Seks pasienter med psoriasis, noen kroniske tilfeller med meget alvorlige symptomer, ble behandlet med enzymhydrogelen ifølge eksempel 4, men i de fleste tilfellene av psoriasis ble det benyttet en hydrogelsammensetning betegnet Penzym 200 med den doble konsentrasjonen av trypsin fra torsk, eller 2 U/ml, da Penzym 100 (1U/ml trypsin fra torsk) ga heller sakte og i noen tilfeller usikre resultater. Pasienter hevdet store forbedringer i behandlingen med gelen inneholdende det høye innholdet av trypsin fra torsk (Penzym 200) sammenlignet med gelen med lavere trypsininnhold (Penzym 100). En kombinasjon av trypsin fra torsk og chymotrypsin fra torsk, med en konsentrasjon på 1 U/ml av hvert enzym, betegnet Penzym 200-C, ble også testet og ga resultater tilsvarende dem for Penzym 200. Enzymgelen ble påført en til to ganger dagli, alltid om kvelden før sengetid, hvoretter enzymgelen fikk sitte på huden over natten, og noen ganger også om morgenen etter bading, men etter påkledning. Gelen blir påført som et tynt lag eller film og tar omkring 5 minutter å tørke. Alle seks pasienter erfarte bedring fra symptomene innen 2 uker. Behandlingen ble i noen tilfeller støttet med konvensjonelle selvhjelpsmetoder slik som soling og behandling med UV-lys. Resultatene er oppsummert i den følgende tabell 10.1.

Pasient nr. 3 hadde lidd av kronisk og meget alvorlig psoriasis siden 5-årsalder. Hun har prøvd alle tilgjengelige behandlinger med begrenset resultat. Behandlingen med Penzym 200 har gitt langtidsbedring fra symptomene for henne. Hun hevder at bedringen fra symptomene var merkbare etter kun 4 dager og total bedring ble oppnådd innen 2-3 ukers behandling med en påføring per dag før sengetid.

Pasient nr. 69, også med alvorlig kronisk psoriasis, har erfart permanent forsvinning av noen flekker. Alle disse pasientene holder symptomene under kontroll med konstant eller intermitterende enzymgelbehandling.

Eksempel 11

Behandling av kviser og byller

To individuelle pasienter (pasient nr. 25, K-16 og nr. 63, M-17) som lider av kviser og som en lider av byller (nr. 64, M-22), ble behandlet med trypsinhydrogelsalve (Penzym 100) ifølge eksempel 4. Enzymgelen ble påført topikalt på det påvirkede området (ansiktet) en gang daglig, omkring 5 milliliter hver gang. Gelen fikk tørke i omkring 15 minutter hvoretter den fikk forbli på huden, Alle tre individene erfarte total bedring fra symptomene innen to uker og benytter kun enzymgelbehandlingen sporadisk når symptomene starter å opptre.

Eksempel 12

Behandling av eksem, dermatitt og andre hudtilstander Atten pasienter som lider av eksem, dermatitt og forskjellige andre hudsykdommer ble behandlet med trypsinhydrogelsalven (Penzym 100) ifølge eksempel 4. Enzymgelen ble påført en gang daglig (sporadisk to ganger), vanligvis om kvelden før leggetid. Gelen ble påført som et tynt lag eller film. Tørking skjedde etter omkring 5 til 10 minutter. En større mengde kan bli påført i alvorlige tilfeller. Denne tørkingen kan ble akselerert ved bruk av en luftblåsende anordning slik som en hårtørker. Alle disse pasientene erfarte bedring fra symptomene innen en uke, de fleste av dem innen 2 til 4 dager. Resultatene er oppsummert i den følgende tabell 12.1.

Noen av pasientene (nr. 40, 41, 48, 66, 50, 20, 46, 87, 87, 100) har vært i stand til å avbryte behandlingen og synes således å kunne nyte permanent eller langtidsbedring fra sykdommen, mens andre holder symptomene under kontroll med konstant eller intermitterende bruk av Penzym 100.

Eksempel 13

Sårheling

To individer (pasient nr. 44, M-4 og 85, M-9) med brannsår ble behandlet med trypsinhydrogelsalven (Penzym 100) ifølge eksempel 4. To andre pasienter (nr. 62, K-47 og 96, M-70) ble behandlet for postoperative sår som ikke ville gro. Enzymgelen ble påført topikalt minst to ganger per dag og tillatt å være videre på det påvirkede området. Alle fire individene erfarte god og komplikasjonefri heling av sine sår innen en til tre uker.

Eksempel 14

Behandling med chymotrypsin fra torsk

For hvert av eksemplene 5 til 13 ble trypsin enzym hydrogelen fra torsk erstattet med chymotrypsin enzym hydrogel fra torsk eller en hydrogel inneholdende en blanding av trypsin og chymotrypsin fra torsk.

Claims (26)

1. En fisk serin proteinase som kan fremskaffes fra torsk, for anvendelse som et medikament.

2. En proteinase ifølge krav 1 som er valgt blant gruppen trypsin, chymotrypsin og en hvilken som helst blanding derav.

3. En proteinase ifølge krav 1 eller 2 som ikke er multifunksjonell.

4. En proteinase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 som er avledet av atlantisk torsk.

5. En proteinase ifølge krav 1 som er et trypsin avledet av atlantisk torsk.

6. En proteinase ifølge krav 5 som er valgt blant gruppen omfattende trypsin I, trypsin II, trypsin III, trypsin IVa, trypsin IVb, typsin IVc og trypsin IVd.

7. En proteinase ifølge krav 4 som er valgt blant gruppen omfattende chymotrypsin A og chymotrypsin B.

8. En proteinase ifølge krav 1 som er et trypsin som har minst 90% aminosyrehomologi med en hvilken som helst av trypsin I, trypsin II, trypsin III, trypsin IVa, trypsin IVb, trypsin IVc og trypsin IVd isolert fra atlantisk torsk.

9. En proteinase ifølge krav 1 som er et chymotrypsin som har minst 90% aminosyrehomologi med en hvilken som helst av chymotrypsin A og chymotrypsin B isolert fra atlantisk torsk.

10. En proteinase ifølge krav 1 for anvendelse for behandling og/eller forhindring av en sykdom hos et menneske eller dyr, hvor nevnte sykdom er valgt blant gruppen bestående av smerte, akutt inflammasjon, kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursit, osteoartitis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse, tendinitt, utslett, psoriasis, eksem, facial seborrheisk eksem, eksem på hendene, ansiktet, hodebunnen eller halsen, forhudsinfeksjoner, fotsopp, fistulainfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr, kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemoroider, sår, sårinfeksjoner, brannsår, en fungal infeksjon og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer.

11. En fremgangsmåte for fjerning av død eller avskallende hud fra ellers frisk hud ved anvendelse av en proteinase ifølge krav 1.

12. Anvendelse av en fisk serinproteinase som kan fremskaffes fra torsk i fremstilling av et medikament for behandling og/eller forhindring av en sykdom hos et menneske eller dyr, hvor nevnte sykdom er valgt blant gruppen bestående av smerte, akutt inflammasjon, kronisk inflammasjon, artritis, betente ledd, bursit, osteoartitis, reumatoid artritis, juvenil reumatoid artritis, septisk artritis, fibromyalgi, systemisk lupus erytematosus, årebetennelse, tendinitt, utslett, psoriasis, eksem, facial seborrheisk eksem, eksem på hendene, ansiktet, hodebunnen eller halsen, forhudsinfeksjoner, fotsopp, fistulainfeksjoner, infiserte topikale sår, navleinfeksjoner hos nyfødte, rynker, arr, kelloider, byller, vorter og allergisk kløe, hemoroider, sår, sårinfeksjoner, brannsår, en fungal infeksjon og immunforstyrrelser inkludert autoimmune sykdommer.

13. Anvendelse av en fisk serinproteinase fra som kan fremskaffes fra torsk for fjerning avdød eller avskallende hud fra ellers frisk hud.

14. Anvendelse av en fisk serinproteinase som kan fremskaffes fra torsk for fremstilling av et medikament for behandling eller forhindring av en sykdom forårsaket av en patogen organisme valgt blant gruppen bestående av et virus, en bakterie, en fungus, en parasitt, og en protozo, hvor sykdommen er valgt fra gruppen av herpes virus infeksjon inkludert HSV-1, HSV-2, herpes zoster eller genital herpes infeksjon, HIV, hepatitis, influensa, coronavirus, cytomegalovirus, rh i novi rus eller papilloma virusinfeksjon; en infeksjon som forårsaker gastrointestinal sykdom, slik som ulcus eller diare; en fungal infeksjon slik som systemisk, hud, oral, vaginal eller øsofagal fungal infeksjon, inkludert for eksempel gjærinfeksjon, inkludert en fungal negleinfeksjon og candidainfeksjoner; mikrobielle infeksjoner i øyet, infeksjon av Staphylococcus spp., Streptococcus ssp., Klebsiella ssp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus ssp., Chlamudia ssp., syfilis og E.coli infeksjoner og bakterielle infeksjoner som forårsaker blød changer.

15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 14 hvor fisk serinproteinasen er en proteinase ifølge et hvilket som helst av kravene 2-9.

16. En farmasøytisk sammensetning omfattende en fisk serinproteinase som kan fremskaffes fra torsk.

17. En sammensetning ifølge krav 17 hvor serinproteinasen fra fisk er en proteinase ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 11.

18. En sammensetning ifølge krav 16 eller 17 som er en sammensetning for topikal anvendelse.

19. En sammensetning ifølge krav 18 som er en hydrogel.

20. En sammensetning ifølge krav 19 som ytterligere omfatteren polyvalent alkohol inkludert glyserol.

21. En sammensetning ifølge krav 16 omfattende en ytterligere farmasøytisk aktiv forbindelse.

22. En kosmetisk sammensetning omfattende en fisk serinproteinase som kan fremskaffes fra torsk.

23. En sammensetning ifølge krav 22 hvor fisk serinproteinasen er en proteinase ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 11.

24. En sammensetning ifølge krav 22 som er en hydrogel.

25. En sammensetning ifølge krav22 som ytterligere omfatteren polyvalent alkohol inkludert glyserol.

26. En sammensetning ifølge krav 22 som omfatteren ytterligere kosmetisk aktiv forbindelse.