DE3531612C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Her­ stellung von Hyaluronsäure mit einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen (nachfolgend kurz als "Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe" bezeichnet).

Hyaluronsäure existiert in Bindegeweben wie beispielsweise Gelenken, Glaskörpern, Nabelschnüren, Knorpeln, Häuten und Geflügelkämmen als deren Bestandteil, der wichtige Funk­ tionen innehat wie die Gewährleistung der Flexibilität und der Struktur von Geweben und der Stoffwechselregulierung von Zellen. Hyaluronsäure ist ein sehr großes hochmole­ kulargewichtiges polymeres, und eine Lösung davon weist eine hohe Viskoelastizität und eine wasserhaltende Funk­ tion auf. Demzufolge hat Hyaluronsäure eine Vielzahl von Anwendungen in der Kosmetik und in Arzneimitteln für Wun­ den, Augenwässern und Arzneimitteln für Arthritis gefunden.

Hyaluronsäure wurde bisher kommerziell nach einem Verfah­ ren erhalten, bei dem es aus Geflügelkämmen, Glaskörpern von Rinderaugen, Nabelschnüren, Walknorpeln und derglei­ chen extrahiert wurde. Aus lebenden Körpern nach dem Extraktionsverfahren gewonnene Hyaluronsäure liegt jedoch in Form eines Komplexes mit einem Protein oder einem Mucopolysaccharid wie beispielsweise Chondroitin vor, und muß daher komplizierten Arbeitsschritten zur Abtrennung und Reinigung unterzogen werden. Da sie ferner in den meisten Fällen in Form einer Mischung mit Hyaluronidase vorliegt, erwies es sich als nachteilig, daß eine derar­ tige Hyaluronsäure während der Extraktion und der Reini­ gungsstufen unter Verminderung ihres Molekulargewichts ab­ gebaut werden kann, wodurch in der Folge ihre Viskosität und ihre Fähigkeit, Wasser zu halten, vermindert werden. Angesichts dieser Nachteile wurde in der offengelegten japanischen-Patentanmeldung Nr. 56 692/1983 ein Versuch be­ schrieben, Hyaluronsäure nach einem Kultivierverfahren herzustellen. Ein kritischer Punkt dieses Verfahrens ist es jedoch, daß seine Leistungsfähigkeit im Hinblick auf die Erzeugung von Hyaluronsäure gering ist.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zu­ grunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure auf biotechnologischem Wege mit einer stabilen und stark erhöhten Leistungsfähigkeit bei niedrigen Kosten anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure gemäß Patentanspruch 1.

Zweckmäßige Ausgestaltungen davon sind Gegenstand der Ansprüche 2 und 3.

Nachfolgend wird die Erfindung näher erläutert.

Als Hyaluronsäure erzeugende Mikroben, die in dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können beispielsweise erwähnt werden Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Strepto­ coccus dysgalactiae, Streptococcus zooepidemicus und pasteurella multocida.

Als Serum kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren irgend­ eines der Seren Rinderblutserum, Pferdeblutserum, Schweineblutserum, Ziegenblutserum, Schafblutserum, oder Geflügelblutserum verwendet werden. Als Rinderblutserum kann ein Blutserum verwendet werden, das von einem Fötus, einem neugeborenen Kalb, einem Kalb, einer Kuh oder einem Bullen gewonnen wurde. Anstelle des Blutserums kann auch Gesamtblut von einem Rind, einem Pferd, einem Schwein, einer Ziege, einem Schaf oder einem Geflügel verwendet wer­ den.

Die Menge des dem Kulturmedium zuzusetzenden Blut­ serums liegt vorzugsweise im Bereich von 0,3 bis 5,0 Volumen-%, insbesondere bei 1,5 Volumen-%.

Als bakteriolytisches Enzym können in dem erfindungsge­ mäßen Verfahren alle bakteriolytisch aktiven Enzyme ver­ wendet werden, wobei jedoch Lysozym besonders bevorzugt ist. Die Menge des zu dem Kulturmedium zugesetzten bakte­ riolytischen Enzyms ist keinen speziellen Einschränkungen unterworfen, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 100 bis 2500 Einheiten, besonders bevorzugt von 300 bis 2000 Einheiten, und ganz besonders bevorzugt von 500 bis 1000 Einheiten, jeweils pro Liter Kulturmedium. Eine zu geringe Menge des zugesetzten bakteriolytischen Enzyms führt dazu, daß nur eine geringe Menge von Hyaluronsäure gewonnen und angesammelt wird. Eine zu große Menge des zugesetzten bak­ teriolytischen Enzyms führt in nachteiliger Weise zu einer derart starken Bakteriolyse, daß das Wachstum der Hyalu­ ronsäure erzeugenden Mikrobe gestört wird.

Was den Zeitpunkt der Zugabe des bakteriolytischen Enzyms zu dem Kulturmedium betrifft, so ist es bevorzugt, die Zu­ gabe unter aseptischen Bedingungen nach der Sterilisation eines Kulturmediums, zu dem das Enzym zugesetzt werden soll, durchzuführen, beispielsweise nach einer Sterilisa­ tion nach dem Druckdampf-Sterilisierverfahren, und einem anschließenden Abkühlen auf eine Temperatur von 45°C oder weniger.

Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die in dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetylpyridiniumchlorid, Tween 80 (Handelsname), Tween 90 (Handelsname), Natriumlaurylsulfat, Triton X-100 (Handelsname), Span 80 (Handels­ name), Span 90 (Handelsname) und Diethylhexylsulfosuccinat. Die Menge des zu dem Kulturmedium zuzusetzenden oberflächenaktiven Mittels be­ trägt vorzugsweise 0,5 bis 10 g, bevorzugt 0,5 bis 3 g, und besonders bevorzugt 1,0 bis 2,0 g, jeweils pro Liter des Kulturmediums. Das oberflächenaktive Mittel wird zu dem Kulturmedium vor der Sterilisierung des Kulturmediums mit Druckdampf zugesetzt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kulturmedium, dem anschließend das Blutserum, das Blut oder das bakteriolytische Enzym und/oder das oberflächenaktive Mittel zugesetzt wird, irgendein üblicherweise für die Inkubation einer Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe verwendetes Kulturmedium sein, das beispielsweise 2,0 bis 3,0% Glucose, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Kaliummonohydrogenphos­ phat, 0,01% Natriumthiosulfat, 0,01% Magnesiumsulfat­ heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobalt(II)­ chlorid, 0,001% Mangan(II)chlorid und 0,5% eines Ent­ schäumungsmittels enthält, und das beispielsweise einen pH-Wert von 6,0 bis 8,5 aufweist, oder ein Medium, das 2,0% Glu­ cose, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Kaliummono­ hydrogenphosphat, 0,01% Natriumthiosulfat, 0,01% Magne­ siumsulfat-heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit und 0,5% eines Entschäumungsmittels enthält und einen pH-Wert von bei­ spielsweise 6,0 bis 8,5 aufweist (dabei bedeutet die Angabe % wie auch in der nachfolgenden Beschreibung Gewicht pro Volumen, wobei das Gewicht und das Volumen als Gramm und Liter ausgedrückt werden, es sei denn, die nach­ folgende Beschreibung definiert % anders).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure wird ein Kulturmedium, das kein Blutserum enthält, sterilisiert, beispielsweise nach dem Druckdampf- Sterilisierverfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der das Blutserum zu dem er­ wähnten Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen zuge­ setzt werden kann. Anschließend wird eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe auf das erhaltene Kulturmedium überge­ impft. Das Kulturmedium wird dann durch Durchblasen von Luft bewegt oder bei Raumtemperatur 1 bis 2 Tage bei einer Temperatur von vorzugsweise 25°C bis 40°C, besonders bevorzugt bei 35°C, stehengelassen und zwar bei einem kontrol­ lierten pH-Wert von vorzugsweise 6,5 bis 8,0, besonders bevor­ zugt von etwa 7,0, um die Inkubation zu bewirken, woran sich die weitere Zugabe eines Saccharid-Bestandteils in einer Menge von 3% und eine weitere Inkubation für einen Zeitraum von 10 Stunden bis 2 Tagen anschließt, um Hyalu­ ronsäure zu gewinnen und anzusammeln.

Alternativ dazu wird ein Kulturmedium, das weder ein bak­ teriolytisches Enzym noch ein oberflächenaktives Mittel enthält oder ein Kulturmedium, das ein oberflächenaktives Mittel und kein bakteriolytisches Enzym enthält, sterili­ siert, beispielsweise nach dem Druckdampf-Sterilisier­ verfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der ein bakteriolytisches Enzym zu dem Kul­ turmedium unter aseptischen Bedingungen zugesetzt wird, woran sich das Überimpfen einer Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe auf das erhaltene Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen anschließt. Wenn kein bakteriolytisches Enzym zugesetzt werden soll, wird ein ein oberflächenaktives Mittel enthaltendes Kulturmedium sterilisiert, beispiels­ weise nach dem erwähnten Druckdampf-Sterilisierverfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe auf das Kul­ turmedium unter aseptischen Bedingungen übergeimpft wird. Das Kulturmedium wird dann durch Durchblasen eines Luft­ stroms bewegt oder stehengelassen, vorzugsweise bei einer Temperatur von 25°C bis 40°C, besonders bevorzugt von 30°C bis 35°C, und bei einem kontrollierten pH-Wert von vorzugsweise 6,5 bis 8,0, besonders bevorzugt von 7,0, und zwar für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen, um die Inkubation zu be­ wirken. Daran schließt sich eine weitere Zugabe eines Saccarid-Bestandteils in einer Menge von 3% zu dem Kul­ turmedium und eine weitere Inkubation für 1 bis 2 Tage zur Gewinnung und Ansammlung von Hyaluronsäure an.

Danach wird das Kulturmedium durch Zentrifugentrennung oder Filtration von der Mikrobe befreit, und das erhaltene Filtrat wird durch Ultrafiltration oder Dialyse von Substanzen mit niederem Molekulargewicht befreit. Anschlie­ ßend kann ein Alkohol wie beispielsweise Methanol oder Ethanol zu dem von Substanzen mit niederem Molekulargewicht befreiten Filtrat zugesetzt werden, um ein rohes Hyaluron­ säureprodukt auszufällen. Die ausgefällte Hyaluronsäure wird dann in Wasser wieder aufgelöst. Danach wird Cetyl­ trimethylammoniumbromid zu der erhaltenen Lösung zuge­ setzt, um eine differenzierte Ausfällung mit dem Cetyltri­ methylammoniumbromid zu bewirken. Anschließend wird ein bekanntes Reinigungsverfahren wie beispielsweise eine Ionenaustausch-Chromatographie oder eine Gel-Permeations­ chromatographie zur Reinigung der erhaltenen Hyaluronsäure verwendet.

Indem man gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kultur­ medium verwendet, das als Zusatz ein Blutserum, Blut oder ein bakteriolytisches Enzym und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird die Ausbeute an Hyaluronsäure pro Liter Kulturmedium, verglichen mit einem Inkubationsver­ fahren, das unter Verwendung eines üblichen Kulturmediums, das keinen der genannten Zusätze enthält, durchgeführt wird, erheblich verbessert, beispielsweise um das 4- bis 5fache (vgl. Vergleichsbeispiele). Da es außerdem so gut wie keine Qualitätsabweichungen zwischen verschiedenen Proben des zu verwendenden bakteriolytischen Enzyms und des oberflächenaktiven Mittels gibt, kann Hyaluronsäure stets in konstanter Qualität und mit konstanter Ausbeute hergestellt werden. Somit schafft die vorliegende Erfin­ dung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure. Der Gehalt an Verunreinigungen in der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Hyaluronsäure ist so außerordentlich gering, daß das Produkt des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens eine Hyaluronsäure der höchsten Qualitätsstufe ist. Sie kann daher in vorteilhafter Weise für Anwendungen auf pharmazeutischem und kosmetischem Gebiet verwendet werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Er­ findung im Vergleich mit Vergleichsbeispielen.

Streptococcus equi FERM BP-879, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Hyaluronsäure erzeu­ gende Mikrobe verwendet wurde, wurde vom Medical Science Research Institute, das mit dem Medical Department der Tokyo University verbunden ist, erhalten, und Streptococ­ cus zooepidemicus FERM BP-878 wurde vom National Institute of Animal Health des Ministeriums für Landwirt­ schaft, Forstwesen und Fischereiwesen von Japan erhalten.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

22,5 ml eines Blutserums aus einem neugeborenen Rind wur­ den unter aseptischen Bedingungen zu 1,5 l eines Kultur­ mediums zugesetzt, das 2,0% Glucose, 0,3% Kaliumdihydro­ genphosphat, 0,2% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011% Natriumthiosulfat, 0,01% Magnsiumsulfat-heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit und 1,0% Sojaöl enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies. 100 ml eines im voraus hergestellten Kulturmediums von Streptococcus equi wurden auf das erhal­ tene Kulturmedium übergeimpft, und die Mikrobe wurde mit einem Luftstrom mit einer Begasungsrate von 0,7 vvm bei einer Rührergeschwindigkeit von 300 U/min bei einer Tem­ peratur von 35°C 40 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert automatisch auf 7,0 eingeregelt wurde. Danach wurden zu dem Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen 25 g Glu­ cose zugesetzt, woran sich eine weitere 10stündige Inku­ bation anschloß. 1,6 l eines ionenausgetauschten Wassers wurden anschließend zu dem erhaltenen Kulturmedium zuge­ setzt, woran sich eine Zentrifugenabscheidung zur Entfer­ nung der Mikrobe anschloß. Zu dem auf diese Weise erhal­ tenen Überstand wurde verdünnte Salzsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,5 einzustellen. Die erhaltene Lösung wurde mit Hilfe eines Hohlfaser-Ultrafilters auf ein Volumen von 0,75 l konzentriert und gegen ionenausgetauschtes Wasser dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde nach bekannten Ver­ fahren gereinigt; und zwar nacheinander durch differen­ zierende Fällung mit Ethylalkohol, Behandlung mit Cetyl­ pyridinylammoniumchlorid und durch Chromatographie mit Ionenaustausch-Cellulofine (Handelsname), wobei 8,7 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten wurden.

Die Menge des Produkts betrugt 5,8 g pro Liter des Kultur­ mediums. Der Proteingehalt des gereinigten Natriumhyalu­ ronats betrugt 0,05 Gew.%. Das Molekulargewicht des gerei­ nigten Natriumhyaluronats wurde durch Gel-Permeations­ chromatrographie mit Sepharose 6B (Handelsbezeichnung) bestimmt und zu 2·10⁶ Dalton ermittelt. Eine physiologische Koch­ salzlösung, die 1 Gew.% Natriumhyaluronat enthielt, wurde intravenös einem Kaninchen injiziert, das jedoch keinerlei pyrogene Reaktion zeigte.

In einem als Vergleichsbeispiel 1 durchgeführten Durchgang wurde eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe unter den gleichen Bedingungen in dem gleichen Verfahren wie in Bei­ spiel 1 inkubiert, mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium verwendet wurde, bei dem gegenüber Beispiel 1 der Serums­ bestandteil weggelassen worden war. Das erhaltene Kultur­ medium wurde der gleichen Behandlung und Reinigung wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei 0,9 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten wurden. Die Menge des Produkts betrug 0,6 g pro Liter des Kultur­ mediums.

Beispiel 2

1,5 l eines Kulturmediums, das 2,0% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,5% Pepton, 0,3% Kaliumdihydrogenphos­ phat, 0,2% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011% Natrium­ thiosulfat, 0,01% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobalt(II)chlorid, 0,001% Mangan­ (II)chlorid und 0,5% Sojabohnenöl enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfermenter mit einem Innenvolumen von 3,0 l gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. 0,75 mg (675 Einhei­ ten) Eialbumin-Lysozym wurden unter aseptischen Bedingun­ gen zu dem erhaltenen Kulturmedium zugesetzt. Anschließend wurden 0,1 l eines im voraus hergestellten Kulturmediums von Streptococcus zooepidemicus auf das Kulturmedium überge­ impft, und die Mikrobe wurde unter einem Luftstrom von 0,7 vvm bei einer Rührergeschwindigkeit von 300 U/min bei 35°C 24 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert automatisch auf 7,0 eingeregelt wurde. Danach wurden 100 ml einer 50%igen wäßrigen Glucoselösung unter aseptischen Bedingungen zu dem Kulturmedium zugesetzt. Die Inkubation wurde unter den obigen Inkubationsbedingungen 26 Stunden fortgesetzt. Zu dem erhaltenen Kulturmedium wurden 3,2 l eines ionenausge­ tauschten Wassers zugesetzt, wonach gerührt wurde und eine Zentrifugenabscheidung zur Entfernung der Mikrobe durchge­ führt wurde. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde mit Hilfe eines Hohlfaser-Ultrafilters auf 1,6 l konzen­ triert und gegen ionenausgetauschtes Wasser dialysiert. Zu der erhaltenen Lösung wurde Natriumacetat zugesetzt, so daß ein Natriumacetat-Gehalt von 0,5% erhalten wurde, woran sich die Zugabe von 5 l Ethanol zur Ausfällung von Polysacchariden einschließlich Hyaluronsäure anschloß, die anschließend durch Zentrifugenabscheidung isoliert wurden.

Die isolierten Polysaccharide, die Hyaluronsäure enthiel­ ten, wurden in 0,5 l ionenausgetauschtem Wasser aufgelöst, und es wurden 0,23 l einer 4%igen wäßrigen Cetyltri­ methylammoniumbromidlösung zu der erhaltenen Lösung zuge­ setzt, woran sich die Abtrennung eines gebildeten Nieder­ schlags anschloß. Der Niederschlag wurde in 40 ml einer wäßrigen Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,3 mol/l dispergiert, woran sich eine Zentrifugenab­ scheidung anschloß. Zu der überstehenden Lösung wurden 120 ml Ethanol zugesetzt, woran sich die Abtrennung eines gebildeten Niederschlags anschloß. Der Niederschlag wurde in ionenausgetauschtem Wasser aufgelöst, durch Ionenaus­ tausch-Chromatographie gereinigt und es wurden 7,8 g eines weißen Pulvers von gereinigtem Natriumhyaluronat erhalten. Die Menge des Produkts betrug 5,2 g pro Liter des Kultur­ mediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat hatte einen Pro­ teingehalt von 0,05 Gew.%. Die Grenzviskosität (η) des gereinigten Natriumhyaluronats betrug, gemessen mit einem Ubbelohde-Viskometer, 17,3 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekulargewicht 1 005 000 Dalton betrug.

Beispiel 3

1,5 l eines Kulturmediums, das 2,0% Glucose, 0,5% Hefe­ extrakt, 1,5% Pepton, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011% Natriumthio­ sulfat, 0,01% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobalt(II)chlorid, 0,001% Mangan­ (II)chlorid, 0,5% Sojabohnenöl und 1,5 g Tween 80 (Han­ delsbezeichnung) als oberflächenaktives Mittel enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfer­ menter mit einem Innenvolumen von 3,0 l gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Anschließend wurden 0,1 l eines vorher hergestellten Kul­ turmediums von Streptococcus equi auf das erhaltene Kul­ turmedium unter aseptischen Bedingungen übergeimpft, und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen und nach dem gleichen Inkubationsverfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Danach wurde das Kulturmedium der gleichen Rei­ nigungsbehandlung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 6,1 g eines weißen Pulvers von Natriumhyaluronat erhalten. Die Menge des Produkts betrug 4,1 g des Kultur­ mediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat wies einen Pro­ teingehalt von 0,03 Gew.% auf. Die Grenzviskosität (η) betrug, gemessen mit einem Ubbelohde-Viskometer, 12,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekularge­ wicht 628 000 Dalton betrug.

Beispiel 4

0,7 g Tween 80 (Handelsname) als oberflächenaktives Mittel wurden zu 1,5 l eines Kulturmediums zugesetzt, das 2,0% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,5% Pepton, 0,3% Kaliumdi­ hydrogenphosphat, 0,2% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011% Natriumthiosulfat, 0,01% Magnesiumsulfat-hepta­ hydrat, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobalt(II)chlorid, 0,001% Mangan(II)chlorid und 0,5% Sojabohnenöl enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies. Das Kulturmedium wurde an­ schließend in einen Kleinfermenter mit einem Innenvolumen von 3,0 l gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, woran man auf Raumtemperatur abkühlen ließ. 0,4 mg (360 Einheiten) Eialbumin-Lysozym wurden dann zu dem Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Anschließend wurden 0,1 l eines vorher hergestellten Kul­ turmediums von Streptococcus zooepidemicus auf das Kultur­ medium übergeimpft und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen und nach dem gleichen Inkubations­ verfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Anschließend wurde das erhaltene Kulturmedium der gleichen Reinigungsbehand­ lung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 8,0 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten. Die Menge des Produkts betrug 5,3 g pro Liter des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat wies einen Proteingehalt von 0,04 Gew.% auf. Die Grenzviskosi­ tät (η) betrug, gemessen mit einem Ubbelohde-Viskometer, 15,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekular­ gewicht 837 000 Dalton betrug.

Vergleichsbeispiel 2

1,5 l eines Kulturmediums, das 2,0% Glucose, 0,5% Hefe­ extrakt, 1,5% Pepton, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011% Natriumthio­ sulfat, 0,01% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobalt(II)chlorid, 0,001% Mangan­ (II)chlorid und 0,5% Sojabohnenöl enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfermenter mit einem Innenvolumen von 3,0 l gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Anschließend wurden 0,1 l eines vorher hergestellten Kulturmediums von Streptococcus zooepidemi­ cus auf das Kulturmedium übergeimpft, und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen und nach dem gleichen Inkubationsverfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Danach wurde das Kulturmedium der gleichen Reinigungsbe­ handlung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 1,5 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten. Die Menge des Produkts betrug 1,0 g pro Liter des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat hatte einen Proteingehalt von 0,03 Gew.%. Die Grenzviskosität (η) betrug, gemessen mit einen Ubbelohde-Viskometer, 12,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekular­ gewicht 628 000 Dalton betrug.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure durch Inkubieren eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, in einem Kulturmedium und Isolieren der gebildeten Hyaluronsäure aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium eingesetzt wird, in dem zusätzlich entweder
a) Rinderblutserum, Pferdeblutserum, Schweineblutserum, Zieqenblutserum, Schafblutserum oder Geflügelblutserum oder
b) Rinderblut, Pferdeblut, Schweineblut, Ziegenblut, Schafblut oder Geflügelblut oder
c) ein bakteriolytisches Enzym und/oder ein oberflächenaktives Mittel
enthalten ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als bakteriolytisches Enzym Lysozym eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus, der in der Laqe ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, der Stamm Streptococcus equi FERM BP-879 oder Streptococcus zooepidemicus FERM BP-878 eingesetzt wird.