FR2569724A1

FR2569724A1 - Procede pour la preparation d'acide hyaluronique

Info

Publication number: FR2569724A1
Application number: FR8513137A
Authority: FR
Inventors: Hiroshi Morita; Masahiro Fujii
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1984-09-04
Filing date: 1985-09-04
Publication date: 1986-03-07
Anticipated expiration: 2005-09-04
Also published as: DE3531612A1; FR2616802B1; FR2569724B1; US5071751A; FR2616802A1; DE3531612C2

Abstract

SELON L'INVENTION, ON FOURNIT UN PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'ACIDE HYALURONIQUE, AVEC UNE PRODUCTIVITE GRANDEMENT AMELIOREE ET A UN COUT TRES FAIBLE, PAR INCUBATION D'UN MICRO-ORGANISME PRODUISANT DE L'ACIDE HYALURONIQUE DANS UN MILIEU DE CULTURE FORME PAR ADDITION D'UN SERUM SANGUIN OU D'UNE ENZYME BACTERIOLYTIQUE ETOU D'UN AGENT TENSIOACTIF, ET PAR ACCUMULATION ET ISOLEMENT DE L'ACIDE HYALURONIQUE.

Description

2.569724

L'invention concerne un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique avec un micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique (appelé ci-après "microbe produisant de l'acide hyaluronique"). Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique, comprenant l'incubation d'un micro-organisme

produisant de l'acide hyaluronique dans un milieu de cultu-

re contenant du sérum sanguin, une enzyme bactériolytique, un agent tensio-actif, ou une enzyme bactériolytique plus un agent tensio-actif, pour produire et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture; et l'isolement de

cet acide.

L'acide hyaluronique existe dans les tissus conjonc-

tifs, tels que les articulations, les corps vitreux, les cordons ombilicaux, les cartilages, la peau et les crêtes des volatiles, et il remplit d'importantes fonctions telles

que le maintien de la souplesse et de la structure des tis-

sus et la régulation métabolique des cellules. L'acide hya-

luronique est un polymère de masse moléculaire très élevée,

dans une large gamme, et sa solution présente une visco-

élasticité et une fonction de rétention d'eau importantes.

I1 trouve donc une large gamme d'applications dans les cos-

métiques, en médecine pour les blessures, dans les lotions

occulaires et comme médicament pour l'arthrite.

L'acide hyaluronique a été obtenu commercialement jusqu'à maintenant par un procédé d'extraction à partir de crêtes de volatiles, de corps vitreux d'yeux de bovins,

de cordons ombilicaux, de cartilages de cétacés ou simi-

laires. Mais, l'acide hyaluronique obtenu à partir de corps vivants par le procédé d'extraction, se présente sous la

- forme d'un complexe avec une protéine ou un mucopolysaccha-

ride tel que la chondroitine et nécessite donc des opéra-

tions de séparation et de purification compliquées. Etant donné que dans la plupart des cas il est présent sous la forme d'un mélange avec l'hyalurodinase, il en résulte des inconvénients, à savoir qu'un tel acide hyaluronique peut

être décomposé au cours de l'extraction et de la purifica-

tion, ce qui réduit sa masse moléculaire et a également pour conséquence une diminution de sa viscosité et de son pouvoir de rétention d'eau. A cet égard, on a essayé de préparer l'acide hyaluronique par le procédé de culture décrit dans la demande de brevet japonais publiée No

56692/1983. Cependant, l'inconvénient de ce procédé rési-

de dans une faible productivité d'acide hyaluronique.

La Demanderesse a effectué de nombreuses recherches

pour résoudre le problème ci-dessus, inhérent à la prépa-

ration de l'acide hyaluronique. A la suite de ces recher-

ches, elle a trouvé que l'utilisation d'un milieu de cul-

ture contenant du sérum sanguin ajouté en plus ou d'un mi-

lieu de culture contenant une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensio-actif ajoutés lors de l'incubation d'un micro-organisme produisant l'acide hyaluronique, augmente considérablement la productivité d'acide hyaluronique, ce

qui constitue le point de départ de l'invention.

Tel qu'il ressort de la description précédente,

l'invention a pour objet de fournir un procédé pour la pré-

paration d'acide hyaluronique avec une productivité stable

et considérablement augmentée, à un moindre coût.

Selon un de ses aspects, l'invention fournit un pro-

cédé pour la préparation d'acide hyaluronique comprenant

les opérations qui consistent à faire incuber un micro-or-

ganisme capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture contenant du sérum sanguin ajouté au milieu pour obtenir et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hyaluronique à

partir du milieu.

Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit

un procédé pour la préparation d'acide hyaluronique compre-

nant les opérations qui consistent à incuber un micro-or-

ganisme capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture contenant une enzyme bactériolytique et/ ou un agent tensioactif ajoutés au milieu pour obtenir et accumuler l'acide hyaluronique dans le milieu de culture,

et à isoler l'acide hyaluronique à partir du milieu.

Comme micro-organisme produisant de l'acide hyalu-

ronique, utilisable dans le procédé de 1l'invention, on

peut mentionner par exemple Streptococcus pyogenes, Strep-

tococcus equi, Streptococcus equisimilis, Strepcococcus dysgalactiae, Streptococcus zooepidemicus et Pasteurella multocida. Dans le procédé de l'invention, on peut utiliser au choix un sérum sanguin de bovin, un sérum sanguin de

cheval, un sérum sanguin de porc, un sérum sanguin de ché-

vre, un sérum sanguin de mouton, un sérum sanguin de vo-

laille ou un sérum sanguin humain. Comme sérum sanguin de bovin, on peut utiliser un sérum sanguin prélevé chez un

foetus, un veau mort-né, un veau, une vache et un taureau.

Au lieu de sérum sanguin, on peut utiliser le sang complet

d'un bovin, d'un cheval, d'un-porc, d'une chèvre, d'un mou-

ton, d'un volatile ou d'un être humain. Au lieu de sérum

sanguin, on peut également utiliser un constituant diffé-

rencié du sérum sanguin de tout animal mentionné ci-dessus

ou d'un être humain. La quantité de sérum sanguin à ajou-

ter au milieu de culture est comprise de préférence entre 0,3 et 5,0 % en volume, elle est avantageusement de 1,5 %

en volume.

Comme enzyme bactériolytique utilisable dans le pro-

cédé de l'invention, on peut avoir recours à toutes les en-

zymes provoquant une bactériolyse, mais on préfère en par-

ticulier une lysozyme. La quantité d'enzyme bactériolytique à ajouter au milieu de culture n'est pas particulièrement limitée, mais elle est de préférence de 100 à 2 500 unités,

avantageusement de 300 à 2 000 unités, et plus particulié-

rement de 500 à 1 000 unités, par litre de milieu de cultu-

re. L'addition d'une quantité trop faible d'enzyme bacté-

riolytique se traduit par-une production et une accumula-

tion trop faibles d'acide hyaluronique. L'addition d'une quantité trop élevée d'enzyme bactériolytique se traduit par une bactériolyse trop importante au point d'empêcher

1 a prolifération du ricroorganisre produisant de l'acide hyaluroni-

que.

En ce qui concerne le moment de l'addition de l'en-

zyme bactériolytique dans le milieu de culture, on préfère effectuer cette addition dans des conditions aseptiques après stérilisation d'un milieu de culture auquel on doit ajouter l'enzyme, par exemple, selon le procédé de stérili-

sation à la vapeur sous pression, suivie d'un refroViisse-

ment à une température de 45 C ou moins.

Comme exemples d'agent tensioactif utilisable dans

le procéde de l'invention, on citera le bromure de cetyltri-

méthylammonium, le chlorure de décylpyridinium, le Tween 80 (marque déposée d'un tensioactif fabriqué par Kao Kagaku Kabushiki Kaisha), le Tween 90 (agent tensioactif du même fabricant), le lauryl sulfate de sodium, le Triton X-100 (marque déposée d'un agent tensioactif fabriqué par Rohm

& Haas Co.), le Span 80 (marque déposée d'un agent tensio-

actif fabriqué par Kao Kagaku Kabushiki Kaisha), le Span 90 (agent tensioactif du même fabricant), le Nonion (marque déposée d'un agent tensioactif fabriqué par Nippon Oil and Fats Co., Ltd) et le sulfosuccinate de diéthylhexyle. La

quantité d'agent tensioactif à ajouter au milieu de cultu-

re est de préférence comprise entre 0,5 et 10 g, avantageu-

sement entre 0,5 et 3 g, et plus particulièrement entre 1,0

et 2,0 g, par litre de milieu de culture. On ajoute l'a-

gent tensioactif au milieu de culture avant la stérilisa-

tion du milieu de culture avec de la vapeur sous pression.

Dans le procédé de l'invention, un milieu de cultu-

re avant l'addition du sérum sanguin, ou de l'enzyme bacté-

riolytique et/ou de l'agent tensioactif, peut être tout milieu de culture utilisé ordinairement pour l'incubation d'un micro-organisme produisant de l'acide hyaluronique, et peut contenir, par exemple, de 2,0 à 3,0 % de glucose,

0,3 % de phosphate acide mono-potassique, 0,2 % de phos-

phabe bipotassique, 0,01 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'un agent antimousse, et peut avoir un pH de 6,0 à 8,5 par exemple, ou il peut

contenir 2,0 % de glucose, 0,3 % de phosphate acide mono-

potassique, 0,2 % de phosphate bipotassique, 0,01 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium et 0,5 % d'un agent antimousse et avoir un pH de 6,0 à 8,5 par exemple. (Tout pourcentage indiqué ici et ultérieurement désigne un

pourcentage en poids/volume dans lequel le poids et le vo-

lume sont respectivement exprimés en termes de gramme et de

litre, sauf mention contraire).

Dans le procédé pour la préparation d'acide hyaluro-

nique selon l'invention, on stérilise un milieu de culture ne contenant pas de sérum sanguin, par exemple, selon le procédé de stérilisation sous pression de vapeur, et on refroidit à une température de 45 C ou moins, puis on peut, dans des conditions aseptiques, ajouter le sérum sanguin au milieu de culture mentionné ci-dessus. On inocule ensuite un microorganisme produisant de l'acide hyaluronique dans le milieu de culture résultant. On agite alors le milieu de culture par insufflation d'air ou on laisse au repos à une température de 25 à 40 C de préférence, en particulier de 35 C, et à un pH ajusté de préférence entre 6,5 et 8,0,

avantageusement vers 7,0, pendant de 1 à 2 jours pour ef-

fectuer l'incubation, après quoi on ajoute au milieu de culture un constituant de saccharide en une quantité de 3 %, puis on incube de nouveau pendant de 10 heures à 2 jours

pour produire et accumuler l'acide hyaluronique.

On peut également stériliser selon le procédé de stérilisation à la vapeur sous pression, puis refroidir à une température de 45 C ou moins, un milieu de culture ne contenant ni enzyme bactériolytique, ni agent tensioactif ou un milieu de culture contenant un agent tensioactif, mais pas d'enzyme bactériolytique, après quoi, dans des conditions aseptiques, on ajoute une enzyme bactériolytique

au milieu de culture, et on inocule un micro-organisme pro-

duisant de l'acide hyaluronique dans le milieu de culture

résultant, toujours dans des conditions aseptiques. Lors-

qu'on ne doit pas ajouter d'enzyme bactériolytique, on

stérilise un milieu de culture contenant un agent tensio-

actif, par exemple, selon le procêde de stérilisation à

la vapeur sous pression mentionné ci-dessus, et on refroi-

dit à une température de 45 C ou moins, puis dans des conditions aseptiques on inoculeunmicroorganisme produisant de l'acide hyaluronique dans le milieu de culture. On agite ensuite le milieu de culture par insufflation d'un courant d'air ou on laisse au repos à une température comprise de préférence entre 25 et 40 C, en particulier entre 30 et 35 C et à un pH réglé de préférence entre 6,5 et 8,0, et

en particulier de 7,0, pendant de 1 ou 2 jours, pour effec-

tuer l'incubation, après quoi on ajoute encore au milieu de culture un constituant de saccharide en une quantité de 3 % et on incube pendant de 1 à 2 jours pour obtenir et

accumuler l'acide hyaluronique.

On sépare ensuite le micro-organisme du milieu de culture par centrifugation ou filtration et on libère le

filtrat résultant des substances de faible masse molécu-

laire par ultrafiltration ou dialyse. Au filtrat ainsi li-

béré des substances de faible masse moléculaire, on peut ensuite ajouter un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol

de manière à précipiter un produit brut d'acide hyaluroni-

que. On redissout dans l'eau l'acide hyaluronique précipi-

té. Puis, à la solution résultante, on ajoute du bromure de cétyltriméthylammonium pour effectuer une précipitation

différentielle avec le bromure de cétyltriméthylammonium.

Pour purifier l'acide hyaluronique résultant, on applique

ensuite un procédé de purification connu, tel que la chro-

matographie par échange d'ion ou la chromatographie par

permeation de gel.

L'utilisation d'un milieu de culture auquel on a ajouté du sérum sanguin ou un milieu de culture contenant

une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensioactif, se-

lon le procéde de l'invention, permet d'augmenter la produc-

tivité d'acide hyaluronique, par exemple de 4 à 5 fois,

par litre de milieu de culture, par rapport au procédé d'in-

cubation effectué en utilisant un milieu de culture ordi-

naire ne contenant ni sérum sanguin, ni enzyme bactério-

lytique, ni agent tensioactif (voir les exemples de com-

paraison). En outre, étant donné qu'on ne constate prati-

quement pas de variation de qualité d'un lot à l'autre de l'enzyme bactériolytique et de l'agent tensioactif à uti- liser, l'acide hyaluronique peut toujours être préparé avec une qualité et une productivité constantes. C'est ainsi que l'invention fournit un procéde qui fait date,

pour la préparation d'acide hyaluronique. La teneur en im-

puretés dans l'acide hyaluronique préparé selon le procédé de l'invention est si faible que le produit du procédé de l'invention représente la qualité la plus élevée d'acide hyaluronique. Ce qui permet d'utiliser avantageusement

cet acide dans des applications pharmaceutiques et cosmé-

tiques.

Tel que décrit ci-dessus, le procédé pour la prépa-

ration d'acide hyaluronique selon l'invention est un pro-

cédé capable de produire un acide hyaluronique très pur,

d'une manière stabilisée, avec une productivité élevée.

Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus-

tration de l'invention, par rapport aux exemples de compa-

raison, mais ne limitent aucunement le but de l'invention.

Streptococcus equi utilisé dans l'invention, a été obtenu auprès du "Medical Science Research Institute", rattaché au Medical Department of Tokyo University, et

Streptococcus zooépidemicus a été obtenu auprès du "Natio-

nal Institute of Animal Health of Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries" du Japon. Ils ont fait l'objet d'un dépôt auprès de l'Autorité de dépôt internationale Fermentation Research Institute et ont reçu respectivement

les numéros FERM BP-879 et FERM BP-878.

Exemple 1 et Exemple de comparaison 1 Dans des conditions aseptiques, on ajoute 22,5 ml

de sérum sanguin d'un veau nouveau-né à 1,5 litre d'un mi-

lieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,3 % de phos-

phate acide monopotassique, 0,2 % de phosphate dipotassi-

que, 0,011 Z de thiosulfate de sodiumi 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium et

1,0 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0. Dans le mi-

lieu de culture résultant, on inocule 100 ml d'un milieu de culture, préalablement prépare, de Streptococcus equi et on incube le microorganisme sous un courant d'air de 0,7 vol/vol/minute, en agitant avec un agitateur à 300 tours/mn, à une température de 35 C pendant 40 heures, tout en maintenant automatiquement le pH à une valeur de

7,0. Au milieu de culture, on ajoute ensuite 25 9 de glu-

cose dans des conditions aseptiques, puis on incube pen-

dant 10 heures. Au milieu de culture, on ajoute alors 1,6 litre d'eau désionisée, puis on sépare le micro-organisme par centrifugation. Au produit surnageant, ainsi obtenu, on ajoute de l'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le

pH à une valeur de 5,5. On concentre la solution résultan-

te sur un ultrafiltre à fibres creuses jusqu'à obtention

de 0,75 1 et on dialyse contre une eau désionisée. On pu-

rifie la solution résultante selon les procédés connus:

successivement précipitation différentielle avec de l'al-

cool éthylique, traitement avec du chlorure de cétylpyri-

dinylammonium et chromatographie avec de la Cellulofine

(marque déposée) échangeuse d'ion pour obtenir 8,7 g d'u-

ne poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié.

La quantité de produit est de 5,8 g par litre de milieu de culture. La teneur en protéine de l'hyaluronate de sodium purifié est de 0,05 % en poids. On mesure la masse moléculaire de l'hyaluronate de sodium purifié par chromatographie par permeation de gel avec du Sepharose 6B (marque déposée) fabriqué par Pharmacia Finechemicals Co., et on trouve 2 x 106 daltons. On injecte par voie intraveineuse une solution saline physiologique contenant 1 % en poids d'hyaluronate de sodium à un lapin qui ne

montie toutefois aucune réaction pyrogène.

Dans un exemple de comparaison 1, on incube un micro-organisme produisant de l'acide hyaluronique dans

les mêmes conditions et selon le mode opératoire de l'exem-

ple 1, si ce n'est qu'on utilise un milieu de culture dans lequel le constituant sérum n'est pas ajouté. On soumet le milieu de culture résultant au même traitement et on purifie selon l'exemple 1 pour obtenir 0,9 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 0,6 g par litre de milieu de culture.

Exemple 2

Dans une mini-cuve de fermentation d'un volume in-

terne de 3,0 litres, on introduit 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de

levure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopo-

tassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thio-

sulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium hepta-

hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et

0,5 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0, et on stéri-

lise avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 minutes, puis on refroidit à la température ambiante. Au milieu de culture résultant, on ajoute 0,75 mg (675 unités)

de lysozyme de blanc d'oeuf dans des conditions aseptiques.

Dans le milieu de culture, on inocule ensuite 0,1 litre

du milieu de culture de Streptococcus zooepidemicus préa-

lablement préparé et on incube le micro-organisme dans un courant d'air de 0,7 vol/vol/minute, en agitant avec un agitateur à 300 tours/mn à 35 C pendant 24 heures, en ajustant automatiquement le pH à 7,0. Apres quoi, dans des conditions aseptiques, on ajoute au milieu de culture

ml d'une solution aqueuse de glucose à 50 %. On pour-

suit l'incubation dans les conditions d'incubation mention-

nées ci-dessus, pendant 26 heures. Au milieu de culture résultant, on ajoute 3,2 litres d'eau désionisée, puis on agite et on centrifuge pour séparer le micro-organisme. On concentre le produit surnageant ainsi obtenu à 1,6 litre sur un ultra-filtre à fibres creuses et on dialyse contre de l'eau désionisée. A la solution résultante, on ajoute de

l'acétate de sodium de manière à avoir une teneur en acéta-

te de sodium de 0,5 %, et 5 litres d'éthanol pour précipi-

ter les polysaccharides comprenant l'acide hyaluronique

qu'on isole ensuite par centrifugation.

On dissout les polysaccharides isolés, contenant l'acide hyaluronique, dans 0,5 litre d'eau désionisée et a la solution résultante on ajoute 0, 23 litre d'une solution aqueuse de bromure de cétyltriméthylammonium à 4 %, puis on sépare le précipité formé. On disperse le précipité dans 40 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium ayant une concentration de 0, 3 mole/litre et on sépare par centrifugation. A la solution surnageante, on

0 ajoute 120 ml d'éthanol et on sépare le précipité formé.

On dissout le précipité dans de l'eau désionisée et on purifie par chromatographie d'échange d'ion pour obtenir

7,8 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium puri-

fié.On obtient ainsi 5,2 g de produit par litre de milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,05 Z en poids. La viscosité intrinsèque [n] de l'hyaluronate de sodium purifié, mesurée au moyen

d'un viscosimètre Ubbelohde est de 17,3 dl/g. La masse mo-

léculaire est donc de 1 005 000 daltons.

Exemple 3

Dans une mini-cuve de fermentation d'un volume inter-

ne de 3,0 litre, on introduit 1,5 litre d'un milieu de cul-

ture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de le-

vure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopotas-

sique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thio-

sulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium hepta-

hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 Z de chlorure de manganèse (II), 0,5 % d'huile de soja et 1,5 g de Tween 80 (Marque déposée) en

tant qu'agent tensioactif, ayant un pH de 7,0, et on stéri-

lise avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 minutes, puis on refroidit à la température ambiante. Dans des conditions aseptiques, on inocule ensuite 0,1 litre d'un milieu de culture de Streptococcus equi, préalablement prépare, dans le milieu de culture résultant et on incube le micro-organisme dans les mêmes conditions d'incubation

et selon le même procédé d'incubation que dans l'exemple 2.

On soumet ensuite le milieu de culture au même traitement de purification que dans l'exemple 2 pour obtenir 6,1 g d'une poudre blanche d'hyalorunate de sodium. La quantité

de produit correspond à 4,1 g par litre de milieu de cultu-

re. L'hyalorunate de sodium purifié a une teneur en protéi-

ne de 0,03 % en poids. La viscosité intrinsèque [n] mesu-

rée au moyen d'un viscosimètre Ubbellohde est de 12,0 dl/g.

On confirme ainsi que la masse moléculaire du produit est

de 628 000 daltons.

Exemple 4

On ajoute 0,7 g de Tween 80 (marque déposée) en tant qu'agent tensioactif à 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait de levure, 1,5 % de peptone, 0,3 % de phosphate acide monopotassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 % de thiosulfate de sodium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II), 0,001 % de chlorure de manganèse (II) et 0,5 % d'huile de soja et ayant un pH de 7,0. On verse alors le milieu de culture dans une mini-cuve de fermentation ayant un volume interne de 3,0 litreset on stérilise avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 minutes, puis on refroidit à la température ambiante. Dans des conditions aseptiques on ajoute alors au milieu de culture 0,4 mg (360 unités) de lysozyme de blanc d'oeuf. Puis on inocule 0,1 litre d'un

milieu de culture de Streptococcus zooepidemicus, préala-

blement prépare, dans le milieu de culture résultant et on

incube le micro-organisme dans les mêmes conditions et se-

lon le même procédé d'incubation que dans l'exemple 2. On

soumet ensuite le milieu de culture résultant au même trai-

tement de purification que dans l'exemple 2 pour obtenir

8,0 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié.

La quantité de produit est de 5,3 9 par litre de milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,04 % en poids. La viscosité intrinsèque [n] du produit, mesurée au moyen d'un viscosimètre Ubbellohde est de 15,0 dl/g. Ceci confirme une masse moléculaire de

837 000 daltons pour le produit.

Exemple de comparaison 2 Dans une mini-cuve de fermentation ayant un volume interne de 3,0 litres, on introduit 1,5 litre d'un milieu de culture contenant 2,0 % de glucose, 0,5 % d'un extrait

de levure, 1,5 Z de peptone, 0,3 % de phosphate acide mono-

potassique, 0,2 % de phosphate dipotassique, 0,011 Z de

thiosulfate de sodium, 0,01 Z de sulfate de magnésium hepta-

hydraté, 0,002 % de sulfite de sodium, 0,001 % de chlorure de cobalt (II); 0,001 Z de chlorure de manganèse (II) et

0,5 % d'huile de soja, et ayant un pH de 7,0 et on stérili-

se avec de la vapeur sous pression à 120 C pendant 15 mi-

nutes, puis on refroidit à la température ambiante. On ino-

cule ensuite 0,1 litre d'un milieu de culture de Streptococ-

cus zooepidemicus, préalablement prépare, dans le milieu de culture et on incube le micro-organisme dans les mêmes

conditions d'incubation et selon le même procédé d'incuba-

tion que dans l'exemple 2. On soumet ensuite le milieu de

culture au même traitement de purification que dans l'exem-

ple 2 pour obtenir 1,5 g d'une poudre blanche d'hyaluronate de sodium purifié. La quantité de produit est de 1,0 g par litre de milieu de culture. L'hyaluronate de sodium purifié a une teneur en protéine de 0,03 % en poids. Sa viscosité

* intrinsèque [n], mesurée au moyen d'un viscosimètre Ub-

bellohde est de 12,0 dl/g. Ceci confirme une masse molécu-

laire de 628 000 daltons pour le produit.

R E V E N D I CATI 0 N S

1 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que comprenant les opérations qui consistent à incuber un

micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluroni-

que dans un milieu de culture contenant un sérum sanguin

ajouté au milieu, pour obtenir et accumuler l'acide hyalu-

ronique dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hya-

luronique à partir de ce milieu.

2 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sé-

rum sanguin est choisi parmi un sérum sanguin de bovin, un sérum sanguin de cheval, un sérum sanguin de porc, un sérum sanguin de chèvre, un sérum sanguin de mouton, un

sérum sanguin de volatile et un sérum sanguin d'être humain.

3 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on uti-

lise du sang complet comme sérum sanguin, le sang complet étant choisi parmi du sang de bovin, du sang de cheval, du sang de porc, du sang de chèvre, du sang de mouton, du

sang de volatile et du sang humain.

4 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on uti-

lise un constituant différencié du sérum sanguin, ce cons-

tituant étant différencié à partir d'un élément choisi parmi un sérum sanguin de bovin, un sérum sanguin de cheval, - un sérum sanguin de porc, un sérum sanguin de chèvre, un sérum sanguin de mouton, un sérum sanguin de volatile et

un sérum sanguin d'être humain.

- Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni- que selon la revendication 1, caractérisé en ce que le

micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluroni-

que est inoculé dans le milieu de culture dans lequel on

a ajouté un sérum sanguin, et le milieu de culture résul-

tant est agité par insufflation d'un courant d'air ou mis en contact avec de l'air pour effectuer une incubation, tout en maintenant la température d'incubation entre 25 et C et un pH de 6,5 à 8,0, de manière à produire et àaccumuler l'acide hyaluronique.

6 - P rocédé pour la préparation d'acide hyaluro-

nique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluroni- que est choisi parmi Streptococcus equi, Streptococóus

zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi-

similis et Streptococcus dysgalactiae.

7 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que comprenant les opérations qui consistent à incuber un

micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluroni-

que dans un milieu de culture contenant une enzyme bactério-

lytique et/ou un agent tensioactif ajoutés au milieu de manière à produire et à accumuler l'acide hyaluronique

dans le milieu de culture, et à isoler l'acide hyaluroni-

que à partir du milieu.

8 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on uti-

lise une lysozyme comme enzyme bactériolytique.

9 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 7, caractérisé en ce que le

micro-organisme capable de produire de l'acide hyaluroni-

que est inoculé dans le milieu de culture auquel on a ajou-

té une enzyme bactériolytique et/ou un agent tensioactif,

et le milieu de culture résultant est agité par insuffla-

tion d'air ou mis en contact avec de l'air pour effectuer

une incubation, tout en maintenant la température d'incu-

bation entre 25 et 40 C et le pH entre 6,5 et 8,0, de ma-

nière à produire et accumuler l'acide hyaluronique.

10 - Procédé pour la préparation d'acide hyaluroni-

que selon la revendication 7, caractérisé en ce que le mi-

cro-organisme capable de produire de l'acide hyaluronique

est choisi; parmi Streptococcus equi, Streptococcus zooepi-

demicus, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus equisimilis

et Streptococcus dysgalactiae.

ll - Procédé selon la revendication 6 ou la revendi-

cation 10, caractérisé en ce que le micro-organisme est

choisi parmi Streptococcus equi FERM BP 879 et Streptococ-

cus zoopidemicus FERM BP 878.