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Procédé de préparation d'une substance ayant une activité carcinostatique et à partir de microorganismes du genre Fusobacterium.
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C. I. : Demande de brevet déposée au Japon le 17 août 1982 sous le NO 142439/82.
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La présente invention concerne un procède nouveau pour produire une substance carcinostatique et, plus particulièrement, elle concerne un procédé nouveau de production d'une substance carcinostatique possédant les propriétés plus loin ou un sel d'une telle substance, qui consiste à soumettre des organismes appartenant au genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialkylsulfoxyde et à obtenir une substance TF-500 ou un sel de celle-ci à partir de l'extrait résultant.
Depuis quelques années, on a utilisé de façon poussée à titre de remède pour des patients souffrant de divers types de cancer, un remède consistant à rehausser la fonction immunoologique de l'hôte et à obtenir un effet carcinostatique avec l'assistance de la fonction immuno1ogique.
La Demanderesse a examiné pharmacologique des composants obtenus par le traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde des organismes appartenant au genre Fusobacterium isolés de la cavité buccale pour trouver qu'un composant spécifique obtenu de l'extrait possède une activité carcinostatique ;
que ledit composant présente une activité carcinostatique indirecte en augmentant l'activité antitumorale chez l'hôte ou l'immunité de l'hôte et en utilisant l'assistance de l'immunité et que ledit composant présente une très faible toxicité, et elle a étudié des procédés pour préparer ce produit et c'est ainsi que la présente invention a été La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé qui consiste à soumettre des organismes appartenant au genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialky1-su1foxyde et obtenir une substance carcinostatique de l'extrait D'autres buts de l'invention ressortiront de la description suivante.
Comme organismes utilisés dans l'invention, on peut employer toutes les bactéries produisant la substance TF-500 et appartenant au genre Fusobacterium et, par exemple, on
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utilise de préférence les organismes du genre Fusobacterium nucleatum. Plus précisément, on utilise Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077 ; ATCC 31647) et des souches que l'on considère comme ayant lesdites propriétés dans le cadre des connaissances générales de microbiologie, à savoir les souches mutantes spontanées ou artificiellement modifiées.
Les propriétés de Fusobacterium nucleatum Tuf-031 sont comme suit l Forme 1 des cellules : fusiforme (figure 1) 2 Polymorphisme des cellules : absent 3 Motilité : absente 4 Spores : absents 5 Coloration Gram : Gram-négative 6 Résistance aux acides : négative immunostimulanteII Conditions de croissance dans un milieu de culture
1 Plaquette agar-agar TF-a et milieu de culture penché
Forme externe : une forme ronde
Dimension : environ 1 mm
Protubérance : forme hémisphérique
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Structure : analogue à une goutte de rosée Surface : lisse Bords : lisses Couleur : blanc jaunâtre laiteux Transparence : opaque Milieu de culture liquide TF-a Degré de croissance : vigoureux Turbidité : coagulum Précipité : néant
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Croissance de surface : néant, pas de croissance à une profondeur d'environ 5 mm
Gaz :
néant III Propriétés physiologiques
1 Production de gaz sulfhydrique : +
2 Réduction de nitrates :-
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3 Production d'acide butyrique : + 4 Production d'indole : + 5 Unease 6 Catalase :- 7 Hydrolyse de l'amidon :- 8 Comportement à l'oxygène : anaérobie 9 Production d'ammoniac : + la Production d'anhydride carbonique : + Il Intervalles pour croissance : pH 5, 0 5 température 12 Production de gaz à partir de saccharides L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), sucre de malt (-), saccharose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), (-), amidon (-) On peut par exemple effectuer le procède de production de la substance carcinostatique TF-500 de la façon suivante :
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Culture des bactéries appartenant à
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Fusobacterium nucleatum Filtration --) Fluide surnageant Organismes dialkyl-sulfoxyde Insolubles Extrait Solvant organique) hydrophile (acide) Précipité 1 Déprotéinisation et/ou Ultrafiltration /l Substance carcinostatique TF-500
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On va expliquer ci-après le procède de production indique.
(1) Culture de bactéries On effectue la culture des bactéries du genre Fusobacterium par un procède classique de culture anaérobie de bactéries. En d'autres termes, on règle à pH de 5 à 8, 5, de prefsrance, de 6, 5 à 7, 5 d'un milieu de culture contenant une source d'azote telle que des extraits de cerveau et de coeur bovins, diverses peptones ou similaire ; une source de vitamines telle
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qu'un extrait de levure ou similaire ; un sel minéral tel que le chlorure de sodium ou similaire ; une source de carbone comme le glucose, le lactose ou similaire ;
un agent réducteur tel que la L-cystine, le sulfite de sodium, le thioglycolate de sodium ou similaire, en utilisant une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium et on inocule le milieu de culture avec les bactéries, après quoi on effectue une culture à constant ou une culture sous agitation dans des conditions anaérobies à de préférence, pendant 1 à 5 jours, de préférence 4 jours. En particulier, il est souhaitable d'employer le milieu de culture décrit dans le Tableau 1 (qu'on appellera ci-après milieu de culture TF). Cependant, l'infusion cerveau-coeur qui est un extrait du cerveau et du coeur bovins n'est pas toujours nécessaire comme source d'azote et peut être remplacée par une infusion de coeur qui est un extrait de coeur bovin, un extrait de boeuf, un extrait de poisson, une liqueur de macération du mais etc.
Parmi les diverses peptones, la protêose-peptone et la phytone-peptone ne sont pas toujours nécessaires et la trypticase-peptone peut être remplacée par une polypeptone.
Quand on n'utilise pas d'agar-agar, il est souhaitable d'effectuer une culture sous agitation.
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:-Tableau 1
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<tb>
<tb> Constituants <SEP> du
<tb> milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> TF-a <SEP> TF-b <SEP> TF-c <SEP> TF-d <SEP> TF-e <SEP> TF-f
<tb> (g/l)
<tb> Trypticase- <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17
<tb> peptone
<tb> Phytone- <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> peptone
<tb> Protéose- <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> - <SEP> - <SEP> peptone
<tb> Infusion <SEP> cer- <SEP> 35 <SEP> 17,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> veau-coeur
<tb> Infusion <SEP> de <SEP> 25 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 15
<tb> coeur
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> levure
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> 7,5 <SEP> 7,5 <SEP> 7,5 <SEP> 7,5 <SEP> 7,5 <SEP> 7,
5
<tb> sodium
<tb> Glucose <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Lactose <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> L-Cystine <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> Sulfite <SEP> de <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> sodium
<tb> Thioglycolate <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> de <SEP> sodium
<tb> Agar-agar <SEP> Oou <SEP> Oou <SEP> Oou <SEP> 0 <SEP> ou <SEP> 0 <SEP> ou <SEP> 0 <SEP> ou <SEP>
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> Hydrogènophosphate <SEP> - <SEP> - <SEP> 2.5 <SEP> 2.5 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 5
<tb> dipotassique
<tb>
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(II)
Collectage des organismes de la culture On soutire un fluide surnageant de la culture obtenue comme ci-dessus pour collecter les organismes. Pour l'enlèvement du fluide surnageant, on peut utiliser un procède classique, par exemple la centrifugation et la filtration en utilisant un adjuvant de filtrage tel que la"Celite" (marque déposée de Johns-Manville, USA). On lave les organismes obtenus avec une solution de sel physiologique et on sèche de façon classique, par exemple par lyophilisation, ou on lave avec une solution de sel physiologique et ensuite avec un solvant organique hydrophile tel que l'ethanol, ou similaire, en un temps bref et ensuite on sèche de façon usuelle, par exemple par séchage l'air ou similaire, pour obtenir les organismes séchés. Si nécessaire, on pulvérise les organismes sèches pour obtenir une poudre sèche.
(III) Procédé d'extraction Aux organismes séchés obtenus ci-dessus on ajoute un dialkyl-sulfoxyde, par exemple le diméthyl-suifoxyde, le di- êthyl-suifoxyde etc, de préférence le diméthyl-suifoxyde raison de la 50 ml par gramme des organismes sèches. On effectue le traitement d'extraction avec agitation à ambiante jusqu'à pendant une durée de 30 minutes à plusieurs jours, de préférence environ 650C pendant 3 à 5 heures. On retire ensuite les insolubles par une technique classique telle que la décantation, la centrifugation, la filtration ou similaire.
A l'extrait obtenu on ajoute un solvant organique hydrophile, par exemple une cétone telle que l'acétone, la diêthylcétone, la mêthylêthylcétone ou similaire, ou un alcool tel que le méthanol, l'êthanol, l'isopropanol ou similaire, en une quantité de plus de 5 fois celle de l'extrait (volume/ volume) à une basse température. De préférence, on ajoute le solvant organique hydrophile dans des conditions acides, par exemple on ajoute l'acétone ensemble avec l'acide chlorhydrique et on laisse le mélange au repos à environ 40C pendant une durée de plusieurs heures à plusieurs jours.
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On sépare le précipite d'une façon classique et on le soumet ensuite à un traitement de déprotéinisation ou d'ultrafiltration isolement ou à une combinaison des deux, Quand on lave les organismes avec une solution de sel physiologique et ensuite on sèche par lyophilisation, on peut supprimer le traitement de déprotéinisation ou d'ultrafiltration pour obtenir une substance carcinostatique TF-500 ou un sel de cette dernière.
(IV) Dêprotêinisation, ultrafiltration et collectage de la substance recherchée.
On soumet le précipité obtenu ci-dessus à un traitement de déprotéinisation suivi d'un traitement d'ultrafiltration, ou seulement à un traitement de déprotéinisation ou un traitement d'ultrafiltration, pour obtenir une substance carcinostatique TF-500 ou un sel de celle-ci.
Pour le traitement de dêprotêinisation, on peut utiliser des procèdes connus. Quand on effectue la déprotéinisation par un traitement avec une enzyme protéolytique, on dissout ou on met en suspension le précipité ainsi obtenu dans l'eau ou une solution-tampon, on ajoute une enzyme protéolytique à la solution ou suspension résultante et on effectue le traitement par l'enzyme d'une façon usuelle.
En ce qui concerne les enzymes protéolytiques, on peut utiliser la pronase, la papaïne, la trypsine, la chémotrypsine etc. On préfère la pronase et la trypsine. Il est recommandé qu'avant ou pendant le traitement à l'enzyme, la solution aqueuse soit réglée et maintenue à un pH de 7 à 8. Dans ce but on peut employer de l'hydroxyde de sodium ou de potassium, du carbonate de sodium ou d'ammonium, de l'hydrogêno-carbonate de sodium etc. Pour empêcher la putréfaction du mélange de réaction pendant le traitement à l'enzyme il est souhaitable d'ajouter ure petite quantité d'un solvant organique tel que le chloroforme, le toluène ou similaire. On utilise normalement l'enzyme en une proportion d'environ 1 4 % par rapport au poids de la poudre (solide) devant être soumise au traitement
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par l'enzyme.
On effectue habituellement ce traitement à l'enzyme à une température de 30 à pendant 1 72 heures, de préférence 24 à 48 heures. On peut également l'effectuer en ajoutant d'abord, par exemple, environ 1 en poids d'une enzyme à une poudre (solide) et en soumettant cette poudre (solide) à un traitement a pendant 1 24 heures, puis on ajoute de nouveau 1 en poids de l'enzyme en vue d'un traite- l'acetonement supplémentaire à l'enzyme.
Après ce traitement a l'enzyme, on élimine éventuellement les produits insolubles par une technique telle que la
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centrifugation, la filtration etc, après quoi on recueille une substance carcinostatique TF-500 de la portion soluble dans l'eau ainsi obtenue.
Le collectage de TF-500 de la portion soluble dans
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l'eau peut se faire d'abord par au moins un fractionnement selon le pH, une précipitation partir d'un solvant organique hydrophile ou un fractionnement avec une matière échangeuse etc, puis par ultrafiltration (le traitement peut être répété deux reprises).
Plus précisément, on obtient séparée ala substance carcinostatique TF-500 en réglant le pH de la portion soluble dans l'eau à une valeur qui est, de préférence, inférieure à 2, 5 (si nécessaire on peut ajouter
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de l'acide trichloracétique), en enlevant le précipité résultant, en ajoutant à la portion soluble un solvant organique hydrophile tel que l'methanol de sorte que sa concentration devient de 30 à 80 %, de préférence de 60 à 80 % en volume, en collectant le précipité qui est la fraction de résultantla substance recherchée, en traitant ultérieurement, si néces- saire, ce précipité avec une résine échangeuse d'anions tel que "Dowex 1" (marque déposée), "Amberlite IRA-400" (marque déposée).
"DEAE-Sephadex" (marque déposée), "DEAE-Cellulose" (marque déposée) ou similaire (ce traitement pouvant être effectué plusieurs fois) pour recueillir les fractions non-adsorbées et ensuite en concentrant et en relarguant une solution aqueu- se du précipité obtenu ou les fractions obtenues par ultrafil- tration (seuil de coupure de poids moléculaire nominal :
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50. 000-200. 000) par exemple en utilisant une Membrane d'Ultrafiltration UK-50 (seuil de coupure de poids moléculaire nominal 50. une Membrane d'Ultrafiltration UK-200 (seuil de coupure de poids moléculaire nominal : 200. 000) ou similaire (les Membranes d'Ultrafiltration UK-50 et UK-200. sont des marques déposées de membranes d'ultrafiltration de Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et en séchant le produit concentre et relargué.
Une solution aqueuse à 0, 2% de ce TF-500 (poids moléculaire/volume) est transparente.
Comme expliqué plus haut, au lieu du traitement de déprotêinisation suivi d'un traitement d'ultrafiltration, on peut effectuer seulement le traitement de déprotéinisation ou le traitement d'ultrafiltration.
La substance carcinostatique TF-500 ainsi obtenue possède les propriétés suivantes et peut être convertie en un sel pharmaceutiquement acceptable par un procédé classique. Les sels pharmaceutiquement acceptables sont notamment les sels de métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium, etc.. elles sels de métaux alcalino-terreux tels que les sels de magnésium, de calcium, etc.
Les propriétés de la substance carcinostatique TF-500 sont : (a) Poudre de couleur blanc grisâtre-brun clair.
(b) Elle possède une activité carcinostatique et immunostimulante.
(c) Elle est soluble dans l'eau mais insoluble dans le méthanol, l'ëthanol, le benzène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et l'ëther (d) Elle n'a pas de point de fusion précis et commence à se décomposer la décomposition très forte au dessus de ! (e) Son spectre d'absorption IR obtenu par le procédé au KBr comprend des bandes d'absorption au voisinage de 3S00-3200, 2920, 2850, HOO, 970 et 840-800 cm-.
(f) Le spectre d'absorption U. V de sa solution aqueuse à pH 7, 0
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montre une forte absorption sur le bord d'absorption et un pic d'absorption au voisinage de 246-280 nm.
(g) La réponse à la réaction de Molish est positive de même qu'à la réaction au phénol-acide sulfurique, la réaction l'anthrone-acide sulfurique, la réaction l'indole-acide chlorhydrique et la reaction de Lowry-Folin, mais la réponse est négative à la réaction la ninhydrine.
(h) Valeurs d'analyse élémentaire : C : 38-47%, H : 5-7%, N : 1-4% (i) La teneur en saccharides déterminée par le procédé au phénol et à l'acide sulfurique est d'environ 12 à 30 % en poids exprimée en glucose, et la teneur en protéines née par le procédé Lowry-Folin est d'environ 10% en poids ou moins exprimée en albumine de sérum bovin.
Les activités pharmacologiques de la substance carcinostatique TF-500 sont comme suit : (1) Effet de la substance TF sur la viabilité des cellules (titrage de formation de Colonies) En se basant sur le procédé de Kim. J. H. et al. cancer Res. 25, 698 (1965) , on cultive les cellules HeLa S-3 dans MEM d'Eagle additionné de sérum de veau à 10 % pendant 3 a jours à après quoi on enlève la culture et on ajoute à l'aide d'une pipette à la couche cellulaire obtenue, pour former une suspension une solution de PBS (-) (solution aqueuse contenant 8, 0 g/l de chlorure de sodium, 0, 2 g/l de chlorure de potassium, 1, disodique et 0, de dihydrogënophosphate de potassium) contenant 0, 01 % en poids d'acide êthylênediaminetétraacêtique et 0, 1 en poids de trypsine.
On dilue la suspension cellulaire ainsi obtenue avec MEM Eagle additionné de sérum de veau à 20 % de sorte que le produit renferme 300 cellules par ml. On cultive un ml de cette suspension cellulaire à pendant 24 heures dans un incubateur à CO et on ajoute à la culture résultante la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 1 ci-après de sorte que la concentration devient
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250, 500, 1000 On effectue deux essais dont l'un comporte l'addition de sérum volume/volume) à la culture et dont l'autre ne comporte pas d'addition de sérum.
traitement pendant 24 heures, on lave les cellules avec la culture exempte de sérum et on ajoute aux cellules la culture additionnée de sérum de veau à 20 %, après quoi on cultive les cellules pendant 6 jours dans un incubateur à la culture, on fixe les cellules à et on les colore avec une solution de coloration Giemsa et on compte les colonies résultantes pour déterminer la viabilité des cellules.
Les résultats obtenus apparaissent dans le Tableau 2 dans lequel on détermine la viabilité des cellules par l'équation suivante : Nombre de colonies dans le groupe traité Viabilité des cellules - 100 Nombre de colonies dans le groupe non traité Tableau 2
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<tb>
<tb> 000),Concentration <SEP> de <SEP> Viabilité <SEP> des <SEP> cellules <SEP> (%)
<tb> la <SEP> substance <SEP> carcinostatique
<tb> (#g/m#) <SEP> milieu <SEP> de <SEP> cul-milieu <SEP> de <SEP> culture
<tb> turne <SEP> sans <SEP> sérum <SEP> avec <SEP> sérum
<tb> a <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 250 <SEP> 103, <SEP> 8 <SEP> 103, <SEP> 2
<tb> 500 <SEP> 100, <SEP> 2 <SEP> 98, <SEP> 5
<tb> 1000 <SEP> 55, <SEP> 2 <SEP> 97, <SEP> 1
<tb>
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(II) Activité immuno-stimulante On utilise pour chaque groupe trois souris de la souche ICR (femelles, âgées de 6 semaines).
On administre par voie i. p. la substance à tester aux souris en une quantité
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de 5 g, g et 500g/kg. 24 heures après l'administration, on injecte par voie i. v. dans la queue de chaque souris 0, 2 ml d'une suspension de carbone qu'on en mélangeant ml d'encre à dessin Perikan NOl7 Noir (produit de Günther-Wagner Co., Ltd) avec 2 ml d'une solution de sel physiologique contenant 3% en poids de gélatine, et !, 5, 10 et 15 minutes après l'injection, on prélevé un échantillon de sang de 0, 02 ml de l'orbite en utilisant un capillaire d'hématocrite enduit d'héparine et aussitôt après on dilue et on hémolyse avec 1, 6 ml d'une solution aqueuse à 0, 1 % en poids de carbonate de sodium.
On soumet cette suspension à une colorimétrie 675 nm et on détermine l'indice phagocytotique, à savoir la valeur K, à partir de l'équation de Halpern et al.
Aux souris du groupe témoin on administre 0, 2 ml de la solution de sel physiologique. log Co C K = o équation dans laquelle du carbone dans le sang au temps tos C = concentration de carbone dans le sang au temps t.
Les résultats sont donnés dans le Tableau 3.
Tableau 3
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<tb>
<tb> 50 <SEP> Dose <SEP> (/lg/kg) <SEP> Valeur <SEP> moyenne <SEP> de <SEP> K
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 0418 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 0089
<tb> 50 <SEP> 0, <SEP> 0560 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 0016
<tb> 500 <SEP> 0, <SEP> 0561 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 027
<tb> Témoin <SEP> 0, <SEP> 0276 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 0020
<tb>
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Note : La substance carcinostatique obtenue dans l'exemple est utilisée.
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(III) Activité antitumorale a des cellules de Sarcome- 180 On transplante par voie sous-cutanée les cellules de Sarcome-180 aux souris de la souche ICR (femelles âgées de 6 semaines) dans l'aisselle à raison de 1 x cellules par souris.
Ultérieurement, on dissout chacune des substances à tester dans une solution aqueuse à 5 % de glucose et on administre par voie i. v. 0, 2 ml de chacune des solutions résultantes aux souris une fois par jour aux et douzième jours partir de la transplantation des cellules de carcinome.
On administre au groupe témoin 0, 2 ml d'une solution aqueuse à 5 % de glucose de la même façon que ci-dessus. Les résultats sont donnes dans le Tableau 4.
Tableau 4
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<tb>
<tb> 1Dose <SEP> Poids <SEP> moyen <SEP> Nécrose <SEP> hémorragi- <SEP> T/C*3
<tb> (mg/kg) <SEP> de <SEP> la <SEP> tumeur <SEP> que <SEP> de <SEP> la <SEP> tumeur <SEP> (%)
<tb> + <SEP> E. <SEP> T. <SEP> (jour <SEP> 14) <SEP> (jour <SEP> 14)
<tb> (g)
<tb> 0, <SEP> 5*1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 5/5 <SEP> 53
<tb> 1,0#1 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 4/5 <SEP> 56
<tb> 0,5*2 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 3/5 <SEP> 63
<tb> 1, <SEP> 0*2 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 3/5 <SEP> 79
<tb> Témoin <SEP> 6,4 <SEP> ¯ <SEP> 2,7 <SEP> 0/5 <SEP> 100
<tb>
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Notes : x on utilise la substance carcinostatique obtenue dans l'exemple x 2 on utilise la substance carcinostatique obtenue dans l'exemple 2.
Poids moyen de la tumeur'chez les souris du groupe ayant reçu la substance x T/C (%) 100 Poids moyen de la tumeur chez les souris du groupe témoin
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(IV) Toxicité La valeur DOL50 pour des souris (souche ICR, femelles âgées de 6 semaines, administration i. v.) de TF-500 est supérieure à 10 mg/kg.
Il est évident des tests pharmacologiques ci-dessus que la substance TF-500 selon l'invention est un agent carcinostatique utile et on peut s'attendre une activité contre diverses maladies cancéreuses.
La substance TF-500 ou son sel pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé (e) (e) sous la forme de divers produits pharmaceutiques, tels que des médicaments pourvoie orale, des injections, des suppositoires etc.
Quand on les utilise sous forme de médicaments pour voie orale, les produits peuvent contenir divers excipients et peuvent être sous forme de gélules, poudre ou granulés. Quand on les utilise en injections, on peut prévoir des injections sous-cutanées, intramusculaires et intraveineuses et on peut les utiliser sous forme d'une suspension, d'une solution ou d'une poudre dissoute dans une solution saline physiologique ou une solution contenant du glucose ou un anesthésique local au moment de l'emploi.
Le dosage de TF-500 ou de son sel pharmaceutiquement acceptable est déterminé selon l'état du malade bien qu'en il soit recommandé de l'administrer à un adulte à raison de 0, 001 à 0, 1 mg/kg, une ou plusieurs fois par jour et, en ce qui concerne la méthode d'administration, on préfère la voie orale, souscutanée, intramusculaire ou intraveineuse ou encore une injection localisée dans la partie malade.
L'invention sera maintenant décrite en détail en se référant aux exemples, exemples de préparation et aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une micro-photographie montrant la forme de Fusobacterium nucleatum Tuf-031 dans l'invention ; la figure 2 représente un spectre d'absorption IR
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de TF-500 obtenu dans l'exemple 1 dont il sera question cidessous ; la figure 3 représente un spectre d'absorption U. V. de ladite substance ; la figure 4 représente un spectre d'absorption I. R. de TF-500 obtenu dans l'exemple 2 ci-après ; la figure 5 représente un spectre d'absorption U. de cette substance ; la figure 6 représente un spectre d'absorption 1. de TF-500 obtenu dans l'exemple 3 ci-après ; la figure 7 représente un spectre d'absorption U. de ladite substance ; la figure 8 représente un spectre d'absorption 1.
R. de TF-500 obtenu dans l'exemple 4 ci-après et la figure 9 représente un spectre d'absorption U. V. de cette substance.
Exemple 1 (1) Dans un bocal de fermentation d'une contenance de 90 litres (type MSJ-U, fabriqué par Marubishi Rika Kenkyusho) on place 70 litres du milieu de culture TF-f contenant il g de trypticase-peptone, 1050 g d'une infusion de coeur, 210 g d'un extrait de levure, 525 g de chlorure de sodium, 840 g de glucose, 700 g de lactose, 7 g de sulfite de sodium, 35 g de thioglycolate de sodium et 175 g d'hydrogénophosphate dipotassique et on règle le milieu de culture à pH 7, 5 à l'aide d'une solution aqueuse tëtranormale d'hydroxyde de sodium. On stérilise le milieu de culture pendant 15 minutes à Après refroidissement du milieu de culture, on fait passer de l'azote gazeux à travers celui-ci à un débit de 250 ml/mn pendant 1 heure.
On inocule ce milieu de culture avec environ 900 ml d'une solution précultivée de Fusobacterium nucleatum Tuf-031 (FERM-5077, ATCC-31647) préalablement en la cultivant dans un milieu de culture TF-f ayant la même composition que ci-dessus. On cultive les cellules pendant 4 jours à avec agitation (90 t/mn) tout en introduisant de l'azote ga-
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zeux à un débit de 2S0 ml/mn.
(2) On soumet une portion de 12 litres de la culture g ainsi obtenue à une centrifugation (4 x t/mn, la minutes) pour recueillir les organismes et on lave les organismes avec 1 litre d'une solution physiologique de sel et ultérieurement on dégraisse et on lave avec 1 litre d'ethanol et 1 litre d'acétone dans cet ordre, puis on sèche et on obtient 14, 2 g d'organismes. On met en suspension les organismes dans 300 ml de dimêthyl-suifoxyde et on soumet a sous agitation pendant 4 heures tout en chauffant la suspension à 6SoC. On filtre la suspension par aspiration et on obtient un filtrat. On ajoute à ce filtrat 2 litres d'acétone et 8 ml d'acide chlorhydrique puis on laisse le mélange au repos pendant 2 jours pour lui permettre de déposer et vieillir le précipité On recueille le précipité par g centrifugation (4 x t/mn, la minutes) (748 mg).
(3) On dissout les 748 mg du précipité ainsi obtenu dans 15 ml d'eau et on règle le pH de la solution résultante à 7, 8-8, 0 avec du carbonate d'ammonium. On ajoute à cette solution deux portions de 7, 5 mg de E" (marque déposée de Kaken Kagaku ; 1. 000. 000 d'unités de tyrosine/g) à un intervalle de 30 minutes et on ajoute ensuite plusieurs gouttes de toluène quoi on soumet le mélange un traitement par enzyme à pendant 24 heures. A ce mélange traité on ajoute de l'acide chlorhydrique pour régler le pH à puis on ajoute de l'methanol de manière que la concentration d'methanol soit de 80 % en volume. On soumet le mélange 3 résultant à une centrifugation (4 x t/mn, la minutes) et on recueille le précipité (288, 6 mg).
(4) On dissout les 288, 6 mg de ce précipité dans sa ml d'eau et on concentre la solution résultante ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane d'Ultrafiltration UK-50 et on ajoute 4S ml d'eau à cette solution concentrée, après quoi on concentre de nouveau la solution diluée ml par ultrafiltration avec la Membrane UK-50. On filtre la solution
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concentrée travers un filtre (marque déposée d'un filtre à membrane fabriqué par Millipore Ltd, Japon) ayant un diamètre de pore de 0, 2 micron, puis on lyophilise pour obtenir 264 mg de la substance carcinostatique TF-500 lyophilisée.
La substance possède les propriétés plus haut et le spectre d'absorption I. R. de la figure 2 et le spectre d'absorption U. de la figure 3.
Exemple 2 (1) A partir de 70 litres de la culture obtenue dans la partie (1) de l'exemple on recueille des organismes par filtration a Super Cel" (marque déposée de Johns-Manville, USA) et on lave le mélange des organismeset de"Hyflo Super Cel"avec 20 litres d'une saline physiologique, puis on dégraisse et on lave avec 3 litres d'éthanol et 3 litres cet ordre nir 3, 2 kg de ce mélange On met en suspension une portion de 320 g de ce mélange dans 400 ml de diméthyl-sulfoxyde et on soumet la suspension résultante à une extraction avec agitation pendant 4 heures tout en chauffant à Ultérieurement, on filtre la suspension par aspiration pour recueillir le filtrat et on ajoute 2, 5 litres d'acétone et 10 ml de HCI concentré, après quoi on laisse au repos le mélange résultant à pendant 2 jours pour déposer et faire vieillir le précipité.
On recueille le précipité par centrifugation (4 x t/mn, 10 minutes) (94 mg).
(2) Dans 50 ml d'eau on dissout les 94 mg du précipité ainsi obtenu et on concentre la solution résultante ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane d'Ultrafiltration UK-50 et on ajoute 4S ml d'eau à la solution concentrée ainsi obtenue, après quoi on concentre de nouveau la solution ainsi diluée ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane d'Ultrafiltration UK-50.
On filtre la solution ainsi concentrée travers un filtre"Millipore"ayant un diamètre de pores de 0, 2 microns
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, et ensuite on lyophilise pour obtenir 62, 6 mg de la substance t carcinostatique TF-500 lyophilisée.
La substance TF-500 ainsi obtenue possède les propriétés plus haut et son spectre I. R. est tel qu'intiqué à la figure 4 alors que son spectre U. V. apparaît à la figure 5.
Exemple 3 (1) On soumet une portion de 7, 2 litres de la culture obtenue dans paragraphe (1) de l'exemple 1 une centrifuQ galion (5 x t/mn, la minutes) pour recueillir les organismes et on les lyophilise. On met en suspension une portion de 3, 5 g des organismes ainsi lyophilises dans 100 ml d'une solution saline physiologique et on règle le pH de la suspension resultante 8, 0 avec une solution aqueuse binormale d'hydroxyde de sodium, on agite pendant 3 heures, puis on laisse au repos pendant 24 heures et ensuite on soumet à une 3 centrifugation (5 x minutes) pour enlever le surnageant. Au précipite obtenu on ajoute 100 ml de solution de sel physiologique et on règle à 8, 0 le pH du mélange tant avec une solution aqueuse binormale d'hydroxyde de sodium.
On agite le mélange pendant 2 heures et on soumet ensuite à la 3 centrifugation (5 x t/mn, la minutes) pour enlever le surnageant. Ultérieurement, on lave le précipite obtenu avec trois portions de 50 ml d'ethanol, une portion de 50 ml d'acétone et une portion de 50 ml d'éther dans cet ordre (on effectue l'élimination des fluides de lavage par centrifugation (la minutes ; 5 x t/mn)) et ensuite on sèche pour obtenir des secs. On pulvérise les organismes pour obtenir une poudre. A cette poudre on ajoute 70 ml de dimêthyl-sulfoxyde et on soumet le mélange à une extraction avec agitation à pendant 4 heures, puis à une filtration par succion pour recueillir le filtrat.
A ce filtrat on ajoute 536 ml d'acétone et 1 ml de HCl concentré, puis on laisse le mélange au repos à
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pendant 24 heures pour déposer et faire vieillir le précipite.
On recueille le précipité par centrifugation (5 x t/mn, 10 minutes) (269 mg).
(2) Aux 269 mg de ce précipité on ajoute 2, 7 ml d'eau et on règle le mélange pH 8, 0 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium, puis on ajoute de l'eau pour régler le volume final à 4 ml. A ce mélange on ajoute 2, 7 mg de E" (1. de tyrosine/g) et on soumet le mélange résultant à un traitement par enzyme à 370C pendant 1 heure. On ajoute 2, 7 mg de"Pronase plusieurs gouttes de toluène et on soumet ce mélange à un traitement enzymatique à pendant 24 heures. On élimine les insolubles du mélange ainsi traité par centrifugation (5 x t/mn, la minutes) et on ajoute à cette solution du HCI binormal pour régler le pH à 0, puis on ajoute de l'methanol de manière que la concentration d'éthanol soit de 80 % en volume. On recueille ce 3 précipité par centrifugation (5 x t/mn, la minutes) (78, 5 mg).
(3) Aux 78, 5 mg du précipité ainsi obtenu on ajoute 20 ml d'eau et on règle le pH à 7 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium. On concentre le mélange 5 ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à la solution concentrée ainsi obtenue, puis on concentre de nouveau la solution ainsi diluée 5 ml en utilisant pour l'ultrafiltration la Membrane UK-50.
A la solution concentrée ainsi obtenue on ajoute 45 ml d'eau et on concentre à 5 ml par ultrafiltration avec la Membrane UK-50. On filtre ce concentre travers un filtre à membrane ayant un diamètre de pores de 0, 2 micron ("TM-4", Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et ensuite on lyophilise pour obtenir 65 mg de la substance carcinostatique lyophilisée TF-500.
La substance TF-500 ainsi obtenue possède les propriétés citées plus haut, un spectre d'absorption I. R. selon la figure 6 et un spectre d'absorption U. selon la figure 7.
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Exemple 4 (1) On traite par centrifugation une portion de la litres de la culture obtenue dans la partie (1) de l'exemple 1 Q (5 x t/mn, la minutes) pour collecter les organismes.
Aux organismes on ajoute 500 ml d'une solution de sel physiologique et on agite le mélange pendant 30 minutes, puis on effectue une nouvelle centrifugation (5 x t/mn, la minutes) pour recueillir le précipite. On répète cette opération deux fois. On ajoute au précipite ainsi obtenu 500 ml de la solution saline physiologique, on agite pendant 30 minutes, puis on règle le pH à 8, 0 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium et on agite pendant 30 minutes. On effectue une centrifugation (5 x t/mn, la minutes), on dégraisse et on lave avec 500 ml de solution saline physiologique. On Q effectue une nouvelle centrifugation (5 x t/mn ; minutes) pour obtenir le précipité.
On lave ce précipite avec une portion de 500 ml de la solution saline physiologique, une portion de 300 ml d'ethanol et une portion de 300 ml d'acétone, dans cet ordre) des fluides de lavage se fait par centrifugation t/mn, 10 et on sèche pour obtenir des organismes séchés. On pulvérise les organismes secs en une poudre et on ajoute à la poudre 160 ml de dimethylsulfoxyde, puis on extrait le mélange résultant avec agitation à pendant 4 heures. Ultérieurement, on filtre le mélange par succion et on obtient un filtrat auquel on ajoute 1, 2 litre d'acétone et 4, 2 ml de HCI puis on laisse le mélange au repos à pendant 24 heures pour déposer et faire vieillir le précipité. On soumet le précipite une centrifugation (5 x t/mn, la minutes) pour recueillir le précipité (246 mg).
(2) Aux 246 mg de ce précipité on ajoute 5 ml d'eau et on règle à 7, 8 le pH de ce mélange l'aide d'une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium. A ce mélange on ajoute 5 mg de E" (1. 000. 000 d'unités de tyrosine/g) et on traite le mélange par enzyme à pendant 30 minutes, après quoi on ajoute au mélange une solution aqueuse normale d'hydroxyde
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de sodium pour régler le pH à 7, 8 et on ajoute de nouveau 5 mg de"Pronase plusieurs gouttes de toluène. On soumet le mélange à un traitement par enzyme à pendant 24 heures. A ce mélange traité on ajoute du HCI normal pour régler le pH à et on laisse le mélange au repos pendant 2 heures, puis on effectue une centrifugation (5 x t/mn, iO minutes) pour obtenir le liquide surnageant.
A ce surnageant on ajoute de l'ethanol de manière que la concentration d'ethanol soit de 80 % en volume. On laisse au repos le mélange pendant 2 heures et on t effectue une centrifugation (5 x t/mn, la minutes) pour recueillir le précipité déposé (98 mg).
(3) Aux 98 mg de ce précipité on ajoute 20 ml d'eau et on règle le pH à 7 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium. On concentre le mélange résultant à 5 ml en utilisant pour l'ultrafiltration la Membrane UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à la solution concentrée ainsi obtenue et on concentre la solution ainsi diluée à 5 ml à l'aide de la Membrane UK-50. On filtre le concentré obtenu à travers un filtre à membrane ayant un diamètre de pores de 0, 2 micron ("TM-4"de Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et ensuite on lyophilise pour obtenir 83 mg de la substance carcinostatique lyophilisée TF-500.
La substance TF-500 ainsi obtenue possède les propriétés indiquées plus haut, son spectre I. R. est indiqué sur la figure 8 et son spectre U. V. est indiqué sur la figure 9.
Exemple de préparation : On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un pH de 7, 0 à 7, 5 et contenant la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple et on lyophilise pour obtenir une composition lyophilisée de substance carcinostatique TF-500 à une dose unitaire de 0, ou 1 mg. Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocalne 0, 5 %, une solution aqueuse de glucose à 0, 5 % ou une solution simi-
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laire et on l'utilise pour injection.
Exemple de préparation 2 : On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un pH de 7, 0 à 7, 5 contenant la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 2, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de substance TF-500 à une dose unitaire de 0, 5 ou 1 mg. Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocalne 0, 5 %, une solution aqueuse de glucose à 0, 5 % ou une solution similaire et on l'utilise pour injection.
Exemple de préparation 3 : On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un pH de 7, 0 à 7, 5 contenant la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 3, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de substance TF-500 à une dose unitaire de 0, 5 ou 1 mg. Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocaine à 0, 5 %, une solution aqueuse de glucose à 0, 5 % ou une solution similaire et on l'utilise pour injection.
Exemple de préparation 4 : On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un pH de 7, 0 à 7, 5 contenant la substance TF-500 de l'exemple 4, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de TF-500 à une dose unitaire de 0, 5 ou 1 mg. Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocalne 0, 5 %, une solution aqueuse de glucose à 0, 5% une solution similaire et on l'utilise pour injection.