DE1245037B - Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und LipopolysaccharidenInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden, die frei von Verunreinigungen durch Eiweißstoffe sind, aus Bakterien, Hefen, Pilzen, Protozoen und höheren Parasiten.
- Es ist bekannt, daß man aus Bakterien Antigene isolieren kann, indem man die Bakterien z. B. mit einem Phenol-Wasser-Gemisch aufschließt und die in die wäßrige Phase übergegangenen Antigene durch fraktionierte Fällung mit organischen Lösungsmitteln gewinnt. Der so erhaltene Niederschlag muß durch Behandlung mit Puffer, durch Elektrophorese oder Dialyse weiter gereinigt werden (vgl. zum Beispiel Arch. exper. Path. u. Pharmacol., 217, S. 293 [1953]; Angew. Chem., 66, S. 407 [1954Ç).
- In der deutschen Patentschrift 918 405 wird zwar berichtet, daß man nach dem dort angegebenen Verfahren die Polysaccharide in reiner, proteinfreier Form aus gramnegativen und grampositiven Bakterien, aus Pilzen und anderen Mikroorganismen isolieren kann; eigene Versuche haben jedoch gezeigt, daß sich das Verfahren nur zur Isolierung von Antigenen aus gramnegativen Bakterien eignet und daß weiterhin die Antigene nicht proteinfrei sind. In der Patentschrift wird das Verfahren auch nur durch ein Beispiel für ein gramnegatives Bakterium (E. Coli) belegt, und in der Literatur ist das Verfahren auch stets nur für gramnegative Bakterien beschrieben (vgl. zum Beispiel Naturf. 70, S. 148 [1952]; Angew.
- Chem., 66, S. 407 [1954]; Annales de l'Institute Pasteur, 98, S. 789 [1960]).
- Es wurde nun gefunden, daß man auf überraschend einfache Weise antigene Polysaccharide und Lipopolysaccharide aus allen Bakterien, Hefen, Pilzen, Protozoen und höheren Parasiten gewinnen kann, wenn man diese mit flüssigen Dialkylsulfoxiden, vorzugsweise mit Dimethylsulfoxid, behandelt und die in das Dialkylsulfoxid übergegangene Antigene anschließend nach bekannten Methoden fraktioniert fällt.
- Die Behandlung der Mikroorganismen mit dem Dialkylsulfoxid geschieht vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, insbesondere im Bereich von etwa 60 bis 100 C. Es ist vorteilhaft, ein möglichst wasserfreies Dialkylsulfoxid zu verwenden. Die zur Extraktion der Antigene notwendige Behandlungsdauer kann zwischen einigen Stunden und etwa 20 Tagen schwanken.
- Als flüssige Dialkylsulfoxide kommen neben dem Dimethylsulfoxid z. B. in Frage: Diäthylsulfoxid, Dipropylsulfoxide, Dibutylsulfoxide, Dipentylsulfoxide, sowie »gemischte« Sulfoxide wie Methyläthylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, oder Methyldecylsulfoxid. Die Verwendung von Dimethylsulfoxid ist des- halb besonders empfehlenswert, weil es am leichtesten zugängig ist und weil die Extraktion mit diesem am besten geht. Zur fraktionierten Fällung der Antikörper aus dem Dialkylsulfoxid eignen sich insbesondere Alkohole, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Ketone und Äther. In einigen Fällen ist es notwendig, die erhaltenen Niederschläge zur Reinigung der Antikörper noch umzufällen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bislang bekannten Verfahren den Vorteil, daß es sehr einfach und mit wenigen Operationen durchzuführen ist und daß es sich für die Isolierung von Antigenen aus allen Mikroorganismen, ausgenommen Viren, eignet. Ein weiterer großer Vorteil ist der, daß die so erhaltenen Antigene frei von Eiweißstoffen erhalten werden, welche bei der klinischen Anwendung der Substanzen möglicherweise unerwünschte anaphylaktische Nebenwirkungen zeigen können.
- Die antigenen Polysaccharide und Lipopolysaccharide dienen in der Medizin zur Immunisierung und zu diganostischen Zwecken.
- Beispiel 1 a) 10 g getrocknete Trichomonas vaginalis werden bei 65"C im Wasserbad in 100 ml Dimethylsulfoxid unter Rühren 24 Stunden extrahiert. Anschließend wird die Suspension durch eine Fritte G 5 filtriert.
- Der Extrakt wird auf etwa -20"C abgekühlt und mit der 10flachen Menge Alkohol-Äther (1:1) versetzt.
- Die Polysaccharide fallen als weiße Flocken aus. Sie werden abzentrifugiert, mit Alkohol und Äther gewaschen, in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
- Man erhält 0,4 bis 0,6 g Rohprodukt. Dieses wird in 5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung unter Rühren mit 5 mol wassergesättigtem n-Butanol versetzt. Der entstandene Niederschlag, der unter anderem Nucleoprotein enthält, wird abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit der 10fachen Menge Alkohol-Äther (1:1) versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0,18 g an Polysacchariden. Das Material ist in der Dünnschichtchromatographie (System: Pyridin zu Essigsäure zu H2O = 4: 1: 10, einheitlich und zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. b) Die Substanz wird in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 y/ml verdünnt. 0,1 ml der Lösung, intrakutan gespritzt, ruft bei Patienten, die eine Trichomonaden-Infektion haben, eine Spätreaktion hervor. Bei gesunden Menschen tritt keine Reaktion ein. Das Serum von erkrankten Patienten zeigt eine Präzipitin-Reaktion in der Verdünnung 1: 500.
- Beispiel 2 a) Candida albicans wird gefriergetrocknet. 10 g der getrockneten Zellen werden mit 100 ml Dimethylsulfoxid unter Rühren 72 Stunden bei 90"C extrahiert.
- Nach Filtrieren wird die Lösung mit der 10flachen Menge Aceton verdünnt. Der weiße, flockige Niederschlag wird gesammelt und noch dreimal aus Dimetbylsulfoxid-Aceton umgefällt. Man erhält 1 bis 1,5 g eines dünnschichtchromatographisch einheitlichen Materials (System: Pyridin zu Essigsäure zu H2O = (4:1:10), welches mit Ninhydrin nicht reagiert. b) Mäuse, die dreimal innerhalb einer Woche je 50 g dieses Polysaccharides subkutan erhalten haben, überleben eine intravenöse Gabe von 106 Candidaalbicans-Zellen. Alle nicht vorbehandelten Tiere sterben innerhalb von 2 Tagen.
- Beispiel 3 a) 10 g getrocknete Mycobacteria tuberculosis H 37 Rv werden mit 100 ml Dimethylsulfoxid 7 Tage bei 100 C extrahiert. Es wird filtriert, und das Filtrat wird mit der 10fachen Menge Chloroform-Amylalkohol-Metanol (1 : 2: 7) versetzt. Der entstandene braune, flockige Niederschlag wird gesammelt und mehrmals nacheinander mit Aceton, Alkohol und Äther gewaschen. Man erhält 0,3 g einer dünn- schichtchromatographisch einheitlichen (System: Pyridin zu Essigsäure zu Diäthylcarbinol zu H2O = (21:1 : 0,5: 8), nicht mit Ninhydrin reagierenden Substanz. b) Die erhaltene Substanz wird in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Bei der Zugabe von 0,5 ml Wasser entsteht eine milchige Trübung, die durch Zusatz von 0,1 01o Tween 800 (Detergenz der Fa. Atlas-Goldschmidt GmbH, bestehend aus einem Polyäthylensorbitmonooleat) wieder verschwindet. Anschließend bleibt die Lösung auch bei beliebiger Verdünnung mit Wasser klar. Dieser Lösung, emulgiert mit Paraffinöl und gespritzt in tuberculin-negative Meerschweinchen, entwickelt eine positive Tuberculin-Reaktion, 10 Tage nach der intrakutanen Verabreichung.
- Beispiel 4 1 kg Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 10 kg DMSO aufgeschlämmt und 3 Tage bei 60"C gerührt. Anschließend wird filtriert und das Filtrat mit Aceton Diäthyläther 10:1 gefällt, bis kein weiterer Niederschlag mehr entsteht. Der Niederschlag wird so lange aus DMSO und Aceton Diäthyläther umgefällt, bis der Stickstoffgehalt des Niederschlages (bestimmt nach K j e l d a h l) unter 0,20/, gesunken ist. Der Niederschlag, der aus reinem Zymosan besteht, wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6 g.
Claims (2)
- Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von antigenwirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden in proteinfreier Form aus Bakterien, Hefen, Pilzen, Protozoen und höheren Parasiten, d adurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen mit flüssigen Dialkylsulfoxiden, vorzugsweise Dimethylsulfoxid, extrahiert und aus den Extrakten die antigen-wirksamen Polysaccharide nach an sich bekannten Methoden isoliert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion der Mikroorganismen mit den flüssigen Dialkylsulfoxiden bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise zwischen etwa 60 und 100"C, ausführt.
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DESCH37589A Pending DE1245037B (de) | 1965-08-21 | 1965-08-21 | Verfahren zur Herstellung von antigen-wirksamen Polysacchariden und Lipopolysacchariden |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE1245037B (de) |
| FR (2) | FR1505419A (de) |
| GB (1) | GB1083277A (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3048699A1 (de) * | 1980-12-23 | 1982-07-08 | Chisato Tokyo Maruyama | "immuntherapeutisches mittel, geeignet gegen turmoren, enthaltend ein lipopolysaccharid als einen aktiven bestandteil" |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931715A (ja) * | 1982-08-17 | 1984-02-20 | Toyama Chem Co Ltd | 制癌性物質ｔｆ−５００の製造法 |
-
1965
- 1965-08-21 DE DESCH37589A patent/DE1245037B/de active Pending
-
1966
- 1966-06-14 GB GB26424/66A patent/GB1083277A/en not_active Expired
- 1966-08-19 FR FR73609A patent/FR1505419A/fr not_active Expired
- 1966-11-15 FR FR83600A patent/FR6865M/fr not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3048699A1 (de) * | 1980-12-23 | 1982-07-08 | Chisato Tokyo Maruyama | "immuntherapeutisches mittel, geeignet gegen turmoren, enthaltend ein lipopolysaccharid als einen aktiven bestandteil" |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR6865M (de) | 1969-04-14 |
| GB1083277A (en) | 1967-09-13 |
| FR1505419A (fr) | 1967-12-15 |
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