DE2009342C3

DE2009342C3 - Verwendung von Glycerin-alkyläther-(l)-phosphorsäure-(3)-monocholinestern

Info

Publication number: DE2009342C3
Application number: DE2009342A
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1970-02-27
Filing date: 1970-02-27
Publication date: 1980-12-18
Also published as: FR2081546B1; GB1334137A; ZA711243B; FR2081546A1; DE2009342A1; NL7102494A; DE2009342B2; BE763579A

Description

der Formel I bei der Steigerung der natürlichen Resistenz des Organismus verwenden lassen. Diese Resistenzsteigerung zeigt isch in einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen sowie gegenüber Tumoren, ferner in der Potenzierung der Antigenität schwacher, ansonsten tolerierter Immunogene. Darüber hinaus können die Verbindungen der Formel I auch als Hilfsstoffe zur Zellanlockung in vivo und zur Gewinnung von hochaktiven immunkompetenten Zellen verwendet werden.

Die Darstellung der Verbindungen der Formel I ist literaturbekannt und kann z. B. nach dem von D. Arnold, H. U. Weltzien und O. Westphal in Liebigs Ann. Chem, 709 (1967), 234, beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Synthese verläuft entsprechend dem nachfolgenden Reaktionsschema, ausgehend von 1,3-Benzylidenglycerin über Glycerin-benzyIäther-(2), Alkylierung, Umsetzung des Glycerindiäthers mit Phosphorsäure-mono-2-bromäthylester-dichlorid und Einführung des Trirnethylaminrestes ium Glycerinalkyläther-ilJ-benzyläther-(2)-phosphorsäure-eholinester, aus dein dann durch Hydrogenolyse die Benzylschutzgruppe entfernt wird, wie im folgenden näher erläutert wird.

CH₂-O

CHOH CH-C₆H₅

CH₂-O

CH₂-O—Alkyl
CH-Ο—Bz

-► I

CH₂

-» CH-Ο—Bz CH-C₆H
CH₂ O

CH₂-OH
CH-Ο—Bz
CH₂-OH

CH₂-Ο—Alkyl
CH-Ο—Bz

CH₂-OH

CH-O-PO₂-CH₂-CH₂-N(CH₃I₃

Alkyl = Allcylrest mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen Bz = CH₂—C₆H₅, Benzylgruppe.

Die Verbindungen der Formel I besitzen ein asymmetrisches Kohlenstoffatom, sie können daher in zwei stereoisomeren Formen auftreten. Die Herstellung dti^- stereoisomeren Verbindungen kann durch entsprechende Abwandlung des obigen Reaktionsschemas, d. h. Verwendung optisch aktiver Verbindungen, oder durch nachträgliche Spaltung des Reaktionsendproduktes in die optischen Antipoden erfolgen.

Die Herstellung der Verbindungen wird anhand des in der Literatur bisher noch nicht beschriebenen Octadecyl-lysolecithins erläutert.

Herstellungsbeispiel

25 Glycerin-octadecyläther-ilJ-phosphorsäure-p)-moiiocholinester

a) GIycerin-octadecyläther-(l)-benzyläther-(2)

14 g (0,07 Mol) Glycerin-benzyIäther-(2) werden in 500 ml absolutem Xylol gelöst, 1,62 g (0,07 MoI) Natrium zugegeben und das Gemisch allmählich auf 100⁰C erhitzt Nach 6 Stunden, nachdem eine dicke Natriumalkoholat-Suspension entstanden ist, werden 34 g (0,09

j5 Mol) n-Octadecyljodid zugegeben und weitere 6 Stunden bei 90⁰C gerührt Die Lösung wird zunächst klar, doch beginnt nach einiger Zeit allmählich Natriumjodid auszufallen. Nach Abkühlen und Zugabe von 500 ml Wasser wird Hie organische Phase

•to abgetrennt Aus ihr werden alle Bestandteile abdestilliert, die bei 0,1 Torr bis zu 180°C flüchtig sind. Es verbleiben 29,2 g Rohprodukt. Diese werden in drei Portionen an je 120 g Kieselgel mit Äther/Petroläther (1 :1) als Lauf mittel Chromatographien. Ausbeute an reinem Diäther: 8,2 g (entsprechend 19% der Theorie) als farblose wachsartige Substanz mit Fp. 45°C (Rf = 0,37).

Analyse für C₂₈H₅₀O₃(+34,7).

-,ο Ber. C 77,36 H 11,59
Gef. C 77,03 H 11,27

CH₂-O—Alkyl
CH- Ο— Bz

CH₂-O-PO₂-CH₂-CH₂-Br
Cl

CH₂-Ο—Alkyl
CH-Ο—Bz

CH₂--Ο—PO₂ CH₂- -CH₂---Br
OH

b) Glycerin-octadecyläther-(l)-benzyläther-(2)-phosphorsäure-(3)-monocholinester-

6,8 g (0,016 Mol) Glycerin-octadecyläther-OJ-benzyläther-(2) werden in 60 ml absolutem Chloroform gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur mit 4,0 g (0,017 Mol) Phosphorsäure-mono-(2)-bromäthyIester-dichlorid und 3,8 g (0,065 Mol) Triäthylamin in 60 ml Chloroform langsam zugetropft. Nach eintägigem Stehen bei Raumtemperatur wird die rotbraune Lösung zur Hydrolyse mit 8 ml Wasser 2 Stunden lang kräftig gerührt. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und anschließend mit 300 ml absolutem Petroläther (60-70⁰C) extrahiert. Man saugt von den ungelöst gebliebenen Ammoniumsalzen ab, dampft das

Flitrat ein, löst den Rückstand in 100 ml Chloroform und schüttelt 5 Minuten mit 2OmI gesättigter wäßriger Bariumacetatlösung kräftig durch. Die Reinigung des Bariumsalzes erfolgt an 200 g Kieselgel mit Chloroform/Methanol (9 :2) als Laufmittel, wobei das Hauptprodukt als farblose gummiartige Substanz anfüllt (Rf=0,58). Nach Umfallen mit Aceton aus Äther (beide absolut) erhält man 6,2 g reines Bariumsalz. Dieses wird nun in 150 ml absolutem Methanol (etwa 50-60" warm) 15 Minuten mit 10 ml luftgetrocknetem Kationenaustauscherharz in der Η-Form geschüttelt, wobei allmählich Lösung eintritt Nach Absaugen und Abziehen des Lösungsmittels erhält man 5,8 g freies Bromäthylphosphat als farbloses öl. Dieses kocht man anschließend mit 300 ml einer 12,5%igen methanolischen Trimethylaminlösung 6 Stunden am Rückfluß. Das nach dem Eindampfen erhaltene feste Lecithinbromid (7,0 g) wird dann in 200 ml Methanol mit 2,8 g Silberacetat 30 Minuten bei Raumtemperatur heftig gerührt. Dabei entsteht ein wachsartiges rohes Lecithin, aus dem die letzten Spuren von Süberacetat nur durch Chromatographie an 200 g Kieselgel mit Chlorcvorm/Methanol/ Wasser (65 :25 :4) als Laufmittel entfernt werden können (R_F=03). Nach Umfallen mit Aceton aus wenig Chloroform erhält man schließlich das reine Produkt als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 40% der Theorie (über beide Stufen).

Analyse für C₃₃HmO₇NP (617,9).

Ber. C 64,15 H 10,44 N 2,27 P 5,01 jo

Gef. C 63,40 H 10,26 N 232 P 5,07

c) Glycerin-octadecyläther-( 1 )-phosphorsäure-(3)-monochoiinester

35

1,0 g (1,62 mMol) Glycerin-ocatadecyläther-OJ-benzyläther-(2)-phosphorsäure-(3)-monochoIinester werden mit 250mg Palladium-Mohr in 150ml absolutes Methanol 7 Stunden bei 40° C und unter Normaldruck hydriert. Anschließende Chromatographie an 100 g Kieselgel mit Chlorofoi m/Methanol/Wasser im Volumenverhältnis von 65 :25 :4 liefert das reine Ätherlysolecithin als farbloses Pulver mit einem Rf-Wert von 0,2. Die Ausbeute beträgt 0,64 g entsprechend 75% der Theorie.

Analyse für C₂₆H₅₈O₇N P (527,7).
Ber. C 59,17 H 11,08 N 2,65 P 5,87
Gef. C 57,69 H 11,26 N 2,48 P 5,60

Vergleichsbeispiele zur natürlichen
Resistenzsteigerung

1. Die Erhöhung der Widerstandsfähigkeit
gegenüber Infektionen

wurde durch Bestimmung der Oberlebenszeit von Mäusen nach Infektion mit pathogenen Keimen in Anlehnung an die von H. G. Howard, D. R. Rowley and A. C. Wardlaw in Nature, 179 (1957), 317, beschriebene Versuchsanordnung geprüft. Tiere, denen vor der inträperitonealen Infektion mit E. eesli 145 Ätherlysölecithine der Formel I i. p. gegeben worden waren, zeigten eine iwei- bis dreifach längere Überlebenszeit als die unbehandelten Kontrolltiere. Der Grund für die Resistenzsteigerung kann in einer erhöhten Phagozytose gesehen werden. Tiere, die mit Ätherlysolecilhinen vorbehandelt waren, zeigten eine erhöhte Aufnahme von Keimen in das Zytoplasma der Phagozyten (Makro-

50

55 und Mikrophagen), Sowohl die Zahl der phagozytwrenden Zellen als auch die pro Zelle aufgenommene Anzahl an Bakterien waren auf das Mehrfache gesteigert. Diese Befunde konnten sowohl in vivo als auch in vitro erhoben werden.

Die Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Tumoren konnte am Beispiel von Impftumoren nachgewiesen werden, Der sog. Mäuse-Ehrlich-Ascitestumor ist ein bei allen Mäusestämmen anwachsender intraperitonealer Impftumor, der nach etwa 10 bis 14 Tagen zum Tode aller geimpften Tiere führt. Werden die Tiere aber mit Ätherlysolecithinen der Formel I vorbehandelt, so konnte das Anwachsen des Tumors bei 50% der Versuchstiere vollständig verhindert werden, d. h. der übertragene Tumor wurde vernichtet Bei den restlichen 50% der Tiere wurde eine Verlängerung der Überlebensrate auf das Zwei- bis Dreifache beobachtet

2. Die Potenzierung der Antigenität schwacher Immunogene.

die gleichfalls als eine Steigsruig der natürlichen Resistenz betrachtet werden kann, wurde wie folgt geprüft:

a) Die Prüfung erfolgte in Anlehnung an die Methode von Dresser (Immunology, 9 [1965], 261). Die Grundlage der Versuchsanordnung besteht in der Induktion von Toleranz durch ein lösliches Protein. In dieser Versuchsanordnung wird die Fähigkeit von Substanzen untersucht, im Organismus die Immunantwort gegenüber dem äußerst schwachen immunogenen bovinem Gammaglobulin (BGG) so zu verstärken, daß Antikörper gegen dieses Protein einwandfrei nachgewiesen werden können. Mäuse erhalten hierbei eine intraperitoneale Injektion von abzentrifugiertem aggregatfreien BGG in einer Dosis von 5 mg. Normalerweise sind bei dieser Dosis nach 8 bis 10 Tagen keine Antikörper nachweisbar. Die Tiere sind also nicht immunisiert. Sie sind unter diesen Bedingungen unfähig, gegsn das BGG eine Immunantwort zu geben. Gibt man dagegen das BGG in Kombination mit einem Adjuvans, so wird die vorübergehende Toleranzausbildung verhindert und die Tiere bilden nun Antikörper gegen das sonst tolerogene BGG. 10 bis 12 Tage nach Gabe des tolerogenen Proteins wird den Tieren erneut BGG eingespritzt, das mit Jod-125 markiert ist. Sind die Tiere tolerant, so wird das markierte Antigen wie eigenes Gammaglobulin langsam abgebaut.

Sind die Tiere dagegen immun, so kommt es zu einer sog. Immunelimination, d. h., das markierte Antigen wird wesentlich schneller aus dem Kreislauf entfernt. Als Maß für die gebildeten Antikörper dient daher die Eliminationsgeschwindigkeit von mit Jod-125 markiertem BGG.

Bei der Prüfung des Octadecyläther-Iysolecithins konnte festgestellt werden, daß gegenüber einer lediglich mit Kochsalz vorinjizierten Kontrollgruppe die mit BGG und Ätherlysolecithin behandelten Tiere das Tracer-Protein zehn- bis einhundertmal schneller aus dem Kreislauf eliminieren.

b) Eine weitere immunologische Bestimmungsmethöde für Antikörper, mit deren Hilfe die Potenzierung der Antigenität schwacher Immuncgene bestimmt werden kann, beruht darauf, daß das Antigen (BGG) an Erythrozyten gekoppelt wird und die so behandelten Zellen mit dem Serum in einer geometrischen Verdünnungsreihe während 20 Stunden bei 4° C inkubiert werden. Ist das Serum antikörperhaltig, so werden die Erythrozyten agglutiniert. Die höchste

Serumverdünnung, bei der dieses Phänomen noch zu beobachten ist. wird als Antikörper bezeichnet.

Auch mit dieser, wesentlich ungenaueren Methode ließ sich die erfindungsgemäße Verwendung bestätigen.

Die Verbindungen der Formel I können auf übliche Weise appliziert werden. Besonders geeignet ist die intraperitoneale Injektion. Die Dosis kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und kann etwa 0,5 bis etwa 10 mg/kg betragen.

3. Vergleichende Untersuchungen über die Wirksamkeit von 1 -DL-Octadecyl^hydroxy-Phosphory!-
cholin bei einem Myelom

Es wurde die Antitumorwirksamkeit von

1. Bakterien Calmette Guerin (BCG)
vergleichend mit

2. l-DL-Octadecyl^-hydroxy-phosphorylcholin

und unbehandelten Tieren bei dem Myelom X5563 in C3H Mäusen geprüft.

Je 10 Tiere erhielten 7 Tage vor der Tumorinplanta-

tion intraperitoneal entweder 1 χ 10⁷ lebende Bakterien Calmette Guerin injiziert oder das Äther-Lysolecithin am I. bzw. 5. Tag nach der Tumorinplantation in einer Dosierung von 50 μg pro Tier oral. Dieses Verfahren ist bei Tumorversuchen mit Mykobakterien einerseits und Lysolecithinen andererseits üblich.

34 Tage nach der Inokulation des Myeloms wurde folgender Endstand festgehalten:

Es überlebten in den Gruppen

iinbehandelte Kontrolle	!Tier
Tiere mit BCG	4 Tiere
Tiere mit Äther-Lysolecithin
am Tag 1	8 Tiere
Tiere mit Äther-Lysolecithin
am Tag 5	7 Tiere

In den mit BCG vorbehandelten Tieren traten im Vergleich zu den Lysolecithm-Gruppen die lumoren 10 Tage früher auf und wuchsen doppelt so schnell.

Das Versuchsergebnis ist eindeutig und reproduzierbar.

Claims

Patentansprüche:

1. Verwendung von Glycerin-alky!äther-(l)-phosphorsäure-(3)-monocho!inester der allgemeinen Formel

CH₂-O-R

CHOH in

CH₂- O— PO,—CH,- CH₂-N(CH₃J₃ (I)

O₁-,

15

in der R einen Alkylrest mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen bezeichnet, bei der Steigerung der natürlichen Resistenz des Organismus.

2. Verwendung eines Glycerin-alkyläther-(l)-phosphorsäure-(3)-monochoIinesters der allgemeinen Forme! Ϊ, worin R einen Alkylrest mit 18 Kohlenstoffatomen bezeichnet, gemäß Anspruch 1.

3. Glycerin-octadecylätherf 1 )-phosphorsäure(3)-monocholinester.

25

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Glycerinalkyläther-OJ-phosphorsäure-ßJ-monocholin- jo estern (Äther-Lysolecithinen) der allgemeinen Formel

CH₂-O-R

CHOH

CH₂-O-PO₂-CH₂-CH₂-N(Ch₃)., (I)

O₁-,

40

in der R einen Alkylrest mit mindestens 12, vorzugsweise 18, Kohlenstoffatomen bezeichnet, bei der Steigerung der natürlichen Resistenz des Organismus.

Über die lebende Zelle, die kleinste Einheit des Organismus, sind bisher eine Vielzahl von Untersuchungen durchgeführt worden. Man kennt sehr genau den morphologischen Aufbau der Zelle und weiß im wesentlichen über die Bedeutung und Funktionsweise der einzelnen subzellulären Strukturen Bescheid. Auch die Zellmembran ist schon Gegenstand eingehender v> Untersuchungen gewesen. Man hat bestimmte Vorstellungen über deren Feinbau und zahlreiche Membranfunktionen, wie aktiver oder passiver Transport, behinderte oder erleichterte Diffusion, Gegenstromeffekte, Pumpeffekte, Erregungsvorgänge, Signalverar- y, beitung u. dgl. sind schon gründlich studiert worden. Um so verwunderlicher ist es, daß bisher den Grenzflächeneigenschaften der Membranen so wenig Beachtung geschenkt worden ist, obwohl leicht einzusehen ist, daß viele, wenn nicht sogar der überwiegende Teil der ho Membranfunktionen entscheidend von der Grenzflächenaktivität der Membranen beeinflußt werden. Der Gedanke, daß in der Änderung der Grenzflächenaktivität der zentrale Steuerungs- und Regelmechanismus zu sehen ist. ist gar nicht so abwegig, wenn man sich vor <,-, Augen hält, daß durch Grenzflächenaktivitätsänderungen nicht nur die Permeabilität der Membranen, sondern auch die dort auftretenden elektrischen Potentialschwellen beeinflußt werden. Beiücksichtigt man ferner, daß die Permeabilität der Membran für die Richtung, Menge und Art der hindurchzutransportierenden Stoffe verantwortlich ist und daß das Membranpotential eine wichtige Rolle in der Signalübermittlung im Organismus spielt — wobei nicht zu vergessen ist, daß Potentialdifferenzänderungen an Membranen letztlich auf deren Permeabilitätsänderungen beruhen — so könnte man den Schluß ziehen, daß es möglich sein müßte, durch Beeinflussung der Aktivitäten der Membrangrenzflächen gezielte biologische Wirkungen hervorzurufen.

Es würde jedoch in der Fachwelt als abwegig angesehen, die Beeinflussung der Grenzfiächenaktivitäten mit Hilfe von oberflächenaktiven Stoffen bewirken zu wollen, denn es ist bekannt, daß oberflächenaktive oder grenzflächenaktive Stoffe im allgemeir.en hochgiftige Substanzen darstellen. Stoffe dieser Art erniedrigen bereits in Konzentrationen, die weit unter dem Dosisbereich liegen, der zur Erzielung einer biologischen oder pharrnakodynamischen Wirkung ausreicht, die Grenzflächenaktivität der Membran so weit, daß deren Desintegration eintritt Das heißt grenzflächenaktive Stoffe wirken im allgeminen zytolytisch, sie zerstören die Membran und vernichten dadurch die Zelle. Die zytolytische Wirkung wird dabei um so größer sein, je stärker die grenzflächenaktiven Stoffe resorbiert, d. h. an die Membran angelagert, und je weniger und je langsamer sie metabolisiert werden.

Lysolecithine, das sind Acylglycerinphosphorsäurecholinester, besitzen gleichfalls grenzflächenaktive Eigenschaften und man weiß, daß sie in höheren Konzentrationen zytolytisch, z. B. hämolytisch, wirken. Trotzdem liegt die letale Dosis der Lysolecithine relativ hoch, was darauf zurückzuführen ist, daß Lysolecithine im Organismus außerordentlich rasch u. a. durch Reacylierung zu Lecithinen oder durch Desacylierung zu Glycerylphosphorylcholin metabolisiert werden. Um so erstaunlicher ist es, daß Äther-Lysolecithine der Formel I, die auch oberflächenaktiv sind und die sich von den Lysolecithinen durch den Ersatz der Acylgruppe durch eine Alkylgruppe unterscheiden und daher nicht oder doch wesentlich schwieriger metabolisierbar sein sollten, gleichfalls relativ ungiftig sind. Sie zeigen dosisabhängige pharmakodynamische Wirkungen bereits in einem Dosisbereich, der erheblich unter dem Wert der Dosis letalis liegt. Als oberflächenaktive Stoffe verändern die Verbindungen der Formel I gleichfalls die Membrangrenzflächenaktivität und sie eignen sich daher in ausgezeichneter Weise zur Beeinflussung und Steuerung der Grenzflächeneigenschaften von Membranen.

Aus der Veröffentlichung »Moderne Arzneimittel« von I. B. Hellwig, Stuttgart, 1967, ist bereits eine Anzahl von Verbindungen bekannt, denen eine zytologische oder hämolytische Wirkung nachgesagt wird und die daher als unspezifische Reizkörper angesehen werden könnten. Von diesen Verbindungen ist aber nicht bekanntgeworden, daß sie beispielsweise in der Tumorbehandlung eingesetzt werden können, im Gegenteil, bei einigen dieser Verbindungen gellen Tumoreals Kontraindikationen.

Es sind bereits in Liebigs Ann. Chem., 709 (1967), 234 — 239, Verbindungen beschrieben worden, die im Bereich der hier wiedergegebenen Formel liegen. Über ihre Wirksamkeit zur Steigung der natürlichen Resistenz ist aber nichts ausgesagt.

Es wurde nun gefunden, daß sich Äther Lysolecithine