DE2914005C2

DE2914005C2 - Arzneimittel zur Behandlung von Hyperglykämie, Hyperlipämie, Hypertension, inflammatorischen Erkrankungen, Schmerzen und Pyrexie durch Erregung des Zentralnervensystems und von Tumoren

Info

Publication number: DE2914005C2
Application number: DE2914005A
Authority: DE
Inventors: Takao Tokio/Tokyo Ando; Takayoshi Fujii; Fumio Tokio/Tokyo Hirose; Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Ikuzawa; Kenichi Matsunaga; Minoru Ohhara; Yoshio Funabashi Chiba Ohmura; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1978-04-06
Filing date: 1979-04-06
Publication date: 1985-03-21
Also published as: GB2018135B; AU4571979A; PH15606A; SE7902854L; FR2421616A1; PH15174A; DE2914005A1; PH15640A; GB2018135A; PH15664A; SE448602B; IT7921652A0; PH15636A; PH15576A; AU525638B2; PH15190A; SE446429B; CH638977A5; IT1115155B; FR2421616B1

Description

Die Erfindung betrifft den im Patentanspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Die in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel eingesetzten Verbindungen und ihre Herstellung sind aus »Chemical Abstracts«, Bd. 48, 2001c bis 2003h (1954), sowie teilweise aus der GB-PS 5 99 013 bekannt. Allerdings lagen bisher keine Beschreibungen der physiologischen Wirkungen dieser Verbindungen vor.

Im Rahmen der Entwicklungsarbeiten, die zu dem Anmeldungsgegenstand führten, wurde zunächst festgestellt, daß stlckstoffenthalfende Polysaccharide, die nachfolgend a!s PSK bezeichnet werden, welche unter Einsatz eines zu den Basldienpilzen gehörenden Pilzes, der zu dem Genus Corlolus gehört, erhalten worden sind, als Antltumormlttel wirksam sind. PSK sind hochpolymere Substanzen,*jie aus Zucker und Protein bestehen. Da sie aus natürlichen Quellen extrahiert werden, sind Ihre chemischen Strukturen äußerst schwer zu ermitteln, dennoch wurde eine Strukturanalyse durchgeführt, ferner wurden Untersuchungen ausgeführt, um den Wirkstoff von PSK sowie seine pharmakologlsche Wirkung zu ermltieln, d. h., um die Einheit des aktiven Ι ίο Wirkstoffs herauszufinden und diese Einheit als ganze Verbindung zu synthetisieren. Zu diesem Zweck wurden

PSK durch Enzyme oder Säure zersetzt. Dabei wurde die Erkenntnis gewonnen, daß der Grund, weshalb PSK G eine hohe anflkanzerogene Aktivität sogar bei einer oralen Verabreichung ausüben, in einer intramolekularen

?.; Bindung zwischen Zucker und Protein zu suchen ist.

j'fi Ferner wurden Im Rahmen dt= zu der Erfindung führenden Entwicklungsarbeiten Untersuchungen bezüglich

r 35 der Synthese von N-GIykoslden sowie Ihrer pharmakologlschen Aktivitäten durchgeführt, wobei man N-Glyko-

: slden besondere Beachtung schenkte, die aus einem Monosaccharld und einer Aminosäure als Modell einer

jj Kombination aus Zucker und Protein bestehen. Man ging dabei so vor, daß man zunächst eine Zuckerkompo-

, ■ nente, und zwar ein Monosaccharld, beispielsweise eine Pentose oder Hexose, wie Gluko^o. Mannose oder

■ Xylose, auswählte und als Proteinkomponente eine Aminosäure, beispielsweise Asparaginsäure, Leucin, Serin

u: oder Glycin, wählte. Als Ergebnis durchgeführter Synthesen sowie der Untersuchungen pharmakologischer

Wirkungen der Syntheseprodukte wurde festgestellt, daß

1. es bei der Synthese von N-Glykoslden von den vorstehend erwähnten Monosaccharlden und der vorstehend genannten Aminosäure notwendig war, die Carboxylgruppe der Aminosäure zu schützen, wobei es sich ferner als notwendig erwies, eine der Hydroxylgruppen der Zuckerkomponente durch ein Halogenatom zu substituieren, während die restlichen Hydroxylgruppen geschützt wurden. Ferner erwies es sich

2. als notwendig, die Reaktion In Abwesenheit von Wasser In dem Reaktionssystem auszuführen. Dies bedeutet, daß sehr aufwendige Verfahren zur Durchführung der Synthese notwendig waren, wobei die auf diese Weise synthetisierten N-Glykoslde Infolge Ihrer Hygroskopizität sehr schwierig zu handhaben waren. Ferner stellt man fest, daß Ihre Antltumoraktlvltät nicht so hoch wie erwartet war.

Außerdem wurden die folgenden Verbindungen hergestellt. Indem ein Zucker mit einer Verbindung umgesetzt wurde, die eine Amlnogruppe enthält, wobei die pharmakologlschen Eigenschaften dieser Verbindungen untersucht wurden. Es handelt sich dabei um Sulfanllamld-N-L-rhamnosld, Acetylsulfanllamid-N-D-galactosld, Glukose-1-phenylhydrazon und Glukose-1-anllld. Diese Verbindungen wurden auf Ihre Anlltumoraktlvltät, Ihre blutzuckerreduzierende Wirkung, Ihre hypotenslve Aktivität, Ihre fettsenkende Wirkung, Ihre antllnflammatorlsche Aktivität sowie auf Ihre sedatlv-analgetlsche Wirkung nach den nachfolgend Im Zusammenhang mit der Untersuchung der erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen angegebenen Methoden untersucht. Es wurden jedoch keine derartigen pharmakologlschen Wirkungen beobachtet.

wi Ferner wurde Aufmerksamkeit gewidmet Monosaccharlden aus Glukose, Mannose, Galactose, Arablnose, Xylose und Rhamnose als Zuckerkomponente, ferner der Amlnobenzoesaure als leicht .synthellslerbarer und relativ stabiler Proteinkomponente für die Synthese eines Wlrkstoffmodells. Nach einer Synthctlslerung derartiger Modellverbindungen sowie der Untersuchung Ihrer pharmakologlschen Aktivitäten wurde In überraschender Welse festgestellt, daß diese Verbindungen zusätzlich zu Ihrer ausgezeichneten Antltumoraktlvltät ausgezelch-' <>< nete und vielseitige pharmakologlsche Aktivitäten besitzen, beispielsweise eine Anlllumoraktlvltat, eine blul-

/uckcrsplcgelscnkcnde Aktivität, dnc hypotenslve Aktivität, eine fcllscnkcnde Akllvlt.1t, eine antllnflammalorlschc Aktivität, dnc sedative sowie anulgdlschc Aktivität. Als Ergebnis einer Untersuchung der Bc/.lchung zwischen den vorstehend erwähnten pharmakologlschcn

Aktivitäten und den Mop.osaccharlden, welche Modellverblndungen mit der Amlnobenzoesäure bilden, wurde rflndungsgemäß ferner die Erkenntnis gewonnen, daß alle Verbindungen, die durch Kondensation von Aminoenzoesaure mit jedem der vorstehend erwähnten Monosaccharide erhalten worden sind, die vorstehend rwähnten pharmakologlschen Eigenschaften In ausgeprägter Welse aufweisen. Die Ergebnisse toxikologischer Jntersuchungen, die zu dem Zweck durchgeführt wurden, diese Verbindungen als Arzneimittel einzusetzen, > rgaben, daß die Kondensationsprodukte von Amlnobenzoesäure mit jedem der vorstehend erwähnten Monosacharlde eine besonders niedrige Toxlzltät gegenüber Säugetieren zeigen, so daß sich diese Verbindungen als Arzneimittel verwenden lassen.

Die Ergebnisse eines Vergleichs der toxikologischen Eigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Subtanzen mit den Eigenschaften der Verbindungen, die In der DE-OS 26 27 076 sowie In »Chemotherapie von "umoren« von W. E. G. Müller, Weinheim (1975), Selten 126 bis 127, beschrieben werden, sind nachfolgend usemmengefaßt:

.) Akute Toxlzltät der Wirkstoffe, repräsentiert durch die LD₅₀ in g/kg Körpergewicht 15

Verbindung, erfindungsgemäß oraler Verabreichungsweg

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid 6,35

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid 6,35

Natrium-o-atninobenzoat-N-D-giuküsid 8,96

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 6,10

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 12,50

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid > 10,00

Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid > 7,50

Amethopterin 0,18

5-Fluoruracil 0,23 ^

6-Mercaptopurin 0,34

Cytosinarabinosid 3,2

) Wirkung auf die Synthese von Nuclelnsäure:

Die In den vorstehend erwähnten Literaturstellen beschriebenen Substanzen zeigen eine Cytotoxlzität der -·-' Inhibierung der Biosynthese von DNA, d. h., daß sie Ihre Antltumoraktlvltät durch Inhibierung der Proliferation von Krebszellen unter direkter Einwirkung auf die Krebszellen entwickeln.

Demgegenüber handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Substanzen um Derivate von Am.'nobenzoesäure, einer Komponente des Vltamln-B-Komplexes, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen keine Inhlb.erende Aktivität gegenüber der Synthese von DNA zeigen, wie sich aus folgenden experimentellen Ergebnissen ergibt:

Unter Einsatz von Ehrllch-Zellen sowie Zellen von Sarkom-180 wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Aufnahme von ' H-UrIdIn In die Zellen von RNA sowie die Aufnahme von ' H-Thymldln In die Zellen von DNA untersucht. Nach einem ersten Züchten der Zellen wurde eine vorherbestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung dem Kulturmedium zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde eine vorheibestlmmte Menge ' H-UrIdIn oder³ H-Thymldln dem Kulturmedium zugegeben.

1 Stunde nach dci Zugabe des radioaktiv-markierten Urldlns oder Thymldins wurde die Intrazellulare Radioaktivität bestimmt. Dabei stellte man fest, daß sogar In dem Falle, In welchem eine große Menge von

2 χ \0* ug/ml elntr der erflndungsgemäßen Verbindungen zugesetzt wurde, keine Veränderung der Radioaktivität auftritt. Diese Tatsache zeigt, daß alle erflndungsgemäßen Verbindungen nicht die Cytotoxlzität zeigen, welche die Inhibierung der Synthese von Nuclelnsäure begleitet.

:) In den genannten Llteraturstellen wird angegeben, daß die Königen Verbindungen Nebenreaktionen zeigen, beispielsweise eine Störung blutbildender Organe sowie eine Induktion von Leukocytopenle und Thrombopenle, während die erflndungsgemäßen Verbindungen, wie aus den folgfp.den experimentellen E/gebnlssen hervorgeht, keine Wirkung auf Leukocyten und Thrombocyten erkennen lassen:

Unter Einsatz von ICR-Mäusen und SD-Ratten als Versuchstiere, wobei täglich auf oralem Wege erzwungenermaßen eine erfindungsgemaße Verbindung 180 Tage In einer Dosierung von 5 g/kg verabreicht wurde, wurde eine hämatologlsche Untersuchung der Mäuse und Ratten durchgeführt.

Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl die Werte der WBC und Th.ombocytenzählung der behandelten Tiere die gleichen sind wie die Werte vor der Verabreichung, ohne daß dabei Irgendeine Abnormalltät festgestellt wird.

Die belllegenden Flg. 1 bis 13 zeigen jeweils die Infrarot(IR)-Spektren der entsprechenden Verbindungen >Jr. 1 bis 13 der Tabelle I. Die Wirkstoffe der erflndungsgemäßen pharmazeutischen Präparate besitzen eine Carboxylgruppe In ortho-Posltlon zur substituierten An.ilnogruppe am Benzolring. ²R bedeutet In der angegebeien Formel ein Watserstoffatom, Natrium, Kalium, V₂ Magnesium, V₂ Kalzium, Vi Aluminium oder eine victhvlKruDDe. Der Zuckeranteil des Wirkstoffs weist die Struktur eines öglledrlgen heterozy kl Ischen Ringes auf.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können wie folgt hergestellt werden:

Ein Gemisch von 4,5 bis 5 g Amlnobenzoesäure. 5 bis 6 g Monosaccharld (L-Arablnosc, D-Xylose, D-Glukose, D-Galaktose, L-Rhamnose oder D-Mannose) und 0,1 bis 0,5 g Ammonlumchlorld (Ameisensaure, Salzsäure. Essigsäure oder Magnesiumchlorid) wurde In 40 bis 90 ml 95- bis lOOWgem Äthanol oder reinem Methanol unter Rückfluß erhitzt und so zur Kondensation gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur oder an einem kühlen Ort stehengelassen und die sich abscheidenden Kristalle wurden durch Filtrieren des Reaktionsgemisches gesammelt. Diese Kristalle wurden mit Wasser, Äthanol oder Äthyläther gewaschen und dann aus Methanol, Äthanol oder einer wäßrigen Lösung von Methanol oder Äthanol umkrlstalllslert.

Zur Substitution des Wasserstoffatoms der Carboxylgruppe der so hergestellten Verbindung mit einer Base wird vorzugsweise wie folgt verfahren;

Die Verbindung, ortho-Amlnobenzoesäure-N-pyranosld, wird In einer wäßrigen äthanollschen Lösung gelöst, und der Lösung wird ein anorganisches Salz zugesetzt, das die Substitution bewirkt.

Die physikalischen Eigenschaften der nach den oben genannten Verfahren hergestellten Verbindungen (d. h. des Wirkstoffs des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates) sind In der Tabelle I gezeigt. Ihre jeweiligen IR-Spektren sind In den Flg. 1 bis 13 abgebildet. Die Verfahren zur Bestimmung der physikalischen Eigenschaften sind wie folgt:

Tabelle I Physikalische Eigenschaften der Wirkstoffe

I Verbindung	Schmelzpunkt (⁰C)	167	(Zers.)	Spezifische Drehung	Schmelzpunkt	Elcmcnlaranalyse (%) C : Il : N	UV-Absorptions- maximum (nm)
1. o-Aminobenzoesäure- N-L-arabinosid		162	(Zers.)	- 11 (10⁰C) in Äthano't	50,1 : 6,0 : 5,1 (50,2 : 6,0 : 4,9)	330, 250, 220
2. Natrium-^, imino- benzoat-N-L-arabinosid	155 bis	168	(Zers.)	-44 in Wasser	46,6 : 5,1 : 4.6 (46.6 : 5,2 : 4.5	315.246,212
3. o-Aminobenzoesäure- N-D-xylosid		170	(Zers.)	+ 11 (18° C) in Äthanol	53.4 : 5,7 : 5.0 (53,5 : 5,6 : 5,2)	330, 250, 220
35 4. Natrium-o-amino- benzoat-N-D-xylosid	160 bis	138		+ I in Wasser	49,7 : 4,8 : 4,7 (49,5 : 4,8 : 4,8)	J 10, ZHÖ, ZIJ
I 5. o-Aminobenzoesäure- I N-D-glucosid	137 bis	160		+ 68(15⁰C) in Äthanol	49,0 : 6,1 : 4.2 (49.2 : 6,0 : 4,4)	330, 250, 220
•w 6. Natrium-o-aminoben- zoat-N-D-glucosid	145 bis	152	(Zers.)	+ 6 in Wasser	46,1 / 5,2 : 4,0 (46,0:5,3 : 4.1)	318,249,215
7. o-Aminobenzoesäure- N-D-galactosid		163	(Zers.)	- 16 in Äthanol	52.3 : 6,0 : 4,8 (52,2 : 5,7 : 4,7)	330, 250, 220
8. Natrium-o-aminoben- zoai-N-D-galactosid	157 bis	166	(Zers.)	- 9 in Wasser	48,5 : 5,2 : 4.4 (48,6 : 5,0 : 4,4)	317,248.215
9. o-Aminobenzoesäure- N-L-rhamnosid	165 bis	162	(Zers.)	+ 52 in Äthanol	54,8 : 5,9 : 4.9 (55,1 : 6,0: 4,9)	330,250,219
91 10. Natrium-o-aminoben- zoat-N-L-rhamnosid	152 bis	165	(Zers.)	+ 54 in Wasser	51,0 : 5,4 : 4,9 (51,1 : 5,2: 4,6)	320,249,215
11. o-Aminobenzoesäure- N-D-mannosid	150 bis	167		- 10 in Äthanol	51,9 :5,8 : 4,7 (52,2 : 5,7 : 4.7)	333,249,218
12. Natrium-o-aminoben- zoat-N-D-mannosid	148 bis	178	- 2 in Wasser	46,1 : 5,5 : 4,0 (46,0 : 5,3 : 4J)	330,250,219
13. Methyl-o-aminobenzoat- U₁ N-D-mannosid	177 bis		-54 in Äthanol	49,1 : 6,1 : 4,3 (48,1 :6,6 : 4,0)	330,251
Anmerkung theoretische Werte fur	C. H und :		in Klammern.
			I.

Bestimmt unter Verwendung der Mlkroschmelzpunktsbestlmmungsvoirichtung der Yariaglmoto-Werke, Janan.

2. Spezifische Drehung

Bestimmt unter Verwendung eines direkt ablesbaren Polarimeter, Modell OR-50 der Yanaglmoto-Werke, Japan, bei einer Dicke von 50 mm einer wäßrigen !Hhanollschen Lösung des sauren Wirkstoffs und einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes des sauren Wirkstoffs.

3. Molekulare Zusammensetzung

Die Gfementaranalyse wurde unter Verwendung eines CHN-Coders, Modell MT-2 der Yanaglmoto-Werke, Japan, durchgeführt.

4. UV-Absorptlonsspektrum

Unter Verwendung des automatisch aufzeichnenden Spektrophotometcrs, Modell PS-3T der Hltachl-Werke, Japan, In einer wäßrigen äthanolischen Lösung des sauren Wirkstoffes und einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes des sauren Wirkstoffes des pharmazeutischen Präparats.

5. IR-Absorpilonsspektrum

Bestimmt mit der KBr-Methode unter Verwendung eines IR-Absorptlonsspektrometers, Modell DS-701G der Nippon Bunko Co., Ltd., Japan; die Bezifferung der Spektren entspricht den Nummern der Wirkstoffproben.

Im folgenden sind die physiologischen Eigenschaften des Wirkstoffs des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates In der folgenden Reihenfolge beschrieben:

1. Akute Toxlzltät,

2. Antimikrobiell Wirkung,

3. Mutagenität,

4. Intrakutanreaktion vom Spättyp und

5. Antikörperproduzierende Wirkung.

1. Akute Toxizltät

Die akute Toxlzltät des Wirkstoffs wurde durch Intraperltoneale (I. p.) und (zwangsweise) orale (p. o.) Verabreichung an ICR-JCL-Mäusen geprüft. Die Probe wurde zur Intraperltonealen Verabreichung In physiologischer Kochsalzlösung und zur oralen Gabe In destilliertem Wasser gelöst.

Die Symptome wurden bis zum 7. Tag nach Verabreichung verfolgt, und die LDj₀ der Probe wurde aus der akkumulierten Sterblichkeit bis zum 7. Tag nach der graphischen Methode von Lltchfleld-Wllcoxon ermittelt. Die Ergebnisse sind In der Tabelle Il gezeigt, aus dieser Tabelle 1st ersichtlich, daß mehr als die Hälfte der Wirkstoffe sich als äußerst sichere Wirkstoffe des pharmazeutischen Präparates qualifizieren können.

Tabelle Il

Akute Toxizität der Wirkstoffe (LD₅₀ in g/kg Kg)

Verbindung

Verabreichungsart intraperi- oral toneal

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-

glucosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-

galactosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-L-

rhamnosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid

Methyl-o-aminobenzoat-N-D-rnannosid

7,48 6,35

9,27 6,35

13,38 8,96

7,42 6,10

> 15,00 12,50

> 10,00 > 10,00

2,5 > 7,50

2. Antimikrobiell Wirkung

Der Wirkstoff wurde In destilliertem Wasser zu einer zweifachen Verdiinnungsreihe gelöst. Diese verdünnten Lösungen wurden mit dem 9fachen Volumen Agar-Mcdlum gemischt, und das Gemisch wurd« In eine Petrischale gegossen. Agar-Herzlnfuslonsmedlum wurde für Bakterien, Sabouraud's-Agar für Pilze verwendet. Nach Bestreichen mit der Vorkultur wurden die beimpften Platten für Bakterien 20 bis 24 Stunden bei 37° C und für Pilze 3 bis .' Tage bei 25° C Inkubiert und daraufhin das Wachstum überprüft. Die folgenden Mikroorganismen wurden zur Bestimmung der antlmlkroblellen Wirkung verwendet:

Pseudomonas aeruglnosa IAM 1514 Escherchla coll IFO 12734 Staphylococcus aureus 209 P Bacillus subtllls IAM 1069 Saccharomyces cerevlslae IAM 4207 Candida alblcans ATCC 752 Trlchophyton mentagrophytes IFO 6124 Asperglllus nlger IAM 3001

Als Ergebnis der oben beschriebenen Versuche wurde gefunden, daß keiner der geprüften Wirkstoffe eine Wachstumshemmung für Irgendeinen der Mikroorganismen bei einer Konzentration von 1 mg/ml zeigte.

3. Mutagenität

In einer ersten Stufe wurden die Wirkstoffe mit einem Rekombinationstest 1) und In einer zweiten Stufe mit einem Rückartungstest (Kurzzeittest) 2) geprüft.

1) Ein Stamm Bacillus subtllls M 45, mit einem Mangel der Rekombinationsreparatur, sowie ein wilder Stamm Bacillus subtllls H 17 mit erhaltener Rekombinationsreparaturaktivität wurden, ohne daß sich die Impfslrlche berührten, an den Anfang einer B-2-Agar-Kulturplatte (hergestellt durch Lösen von 10 g Fleischextrakt, 10 g Polypepton, 5 g Natriumchlorid und 15 g Agar In 1000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0) aufgeimpft. Dann wurde ein kreisförmiges Filterpapier mit einem Durchmesser von 8 mm, das 0,04 ml einer wäßrigen Lösung des Wirkstoffs (In sterilisiertem Wasser) absorbierte, auf die Oberfläche der Agar-Platte gelegt, so daß es den Anfangspunkt der oben erwähnten Impfstriche der Bakterienkultur bedeckte. Die beimpfte B-2-Agar-Kultur wurde über Nacht bei 37° C gehalten, und darin wurde die Länge def wachstumsbehlnderten Region ausgemessen. Als negative Kontrolle wurde Kanamycin, als positive Kontrolle Mitomycin C verwendet. Die Ergebnisse des Rekomblnatinnstexts sind In Tabelle III gezeigt.

2) Die Stämme TA 98 und TA lOÖ (beide Hlstldln-bedürftlg) von Salmonella typhlmurlum wurden für den Rückartungstest verwendet.

In 2 ml eines welchen Agar-Kulturmedlums (enthaltend 6 g Natriumchlorid und 6 g Agar In 1000 TiI destilliertem Wasser), den. V₁₀ seines Volumens einer wäßrigen Lösung von 0,5 mM Biotin und 0,5 mM Histidin zugesetzt worden waren, wurden 0,1 ml der Bakteriensuspension und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung des Wirkstoffs beigemischt, und das Gemisch wurde auf das Mlnlmalagar-Kulturmedlum überschichtet. Nach 2täglger Inkubation bei 37° C wurde die Anzahl der rückgearteten Kolonien gezählt. Als positive Kontrolle wurde Furylfuramid (AF-2) verwendet. Die Ergebnisse des Rückartungstests sind In Tabelle IV gezeigt.

Wie aus Tabelle III ersichtlich 1st, zeigten die Wirkstoffe eine geringe Mutagenität nur bei der hohen Konzentration von 5000 Mg/Schelbe. Aus der Tabelle IV ist ersichtlich, daß die Rate der auftretenden Mutationen durch den Wirkstoff des pharmazeutischen Präparates keinen Unterschied zu der der Kontrollen ohne Wirkstoff zeigte, selbst bei der hohen Konzentration von 5000 pg/Platte. Diese Befunde zeigen, daß der Wirkstoff bezüglich der Mutagenität unbedenklich Ist.

Tabelle III Ergebnis des Rekombinationstests Verbindung Konzentration

^g/Scheibe)

Länge der Wachstumshemmungszone

M 45 H 17 Differenz*) (mm) (mm) (mm)

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid 500 0 0 0

5,000 8 4 4

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid 500 0 0 0

5,000 7 3 4

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosid 500 0 0 0

5,000 5 2 3

Fortsetzung

Verbindung

Konzentration

(^g/Scheibe)

Länge der Wnchstumshemmungszonc

M 45 H 17 Differenz*)
(mm) (mm) (mm)

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 500 0 0 0

5,000 6 1 5

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 500 0 0 0

5,000 6 2 4

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid 500 0 0 0

5,000 7 1 6

Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid 500 0 0 0

5,000 7 3 4

Kanamycin 10 5 4 1

Mitomycin C 0,05 12 2 10

Anmerkung: DHTercnz ") von 1117.

er llcmmung.sionc von M 45 minus der Länge der Hemmungszone

Tabelle IV

Ergebnisse des Rikkartungstests

Verbindung

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid Furylfuramid

Kontrolle ohne Zusatz

Konzentration	Anzahl rückgearteter	TA 98
	Kolonien	4
(μβ/Platte)	(n/Platte)	4
	TA 100	5
5,000	59	6
5,000	166	9
5,000	151	7
5,000	151	8
5,000	61	16?
5,000	91	13
5,000	95
0,1	911
_	149

4. Intrakutanreaktion vom Spättyp

Um die Wirkungen des Wirkstoffs auf die zelluläre Immunität zu erfahren, wurde der Pfotenreaktionstest unter Verwendung von ICR-JCL-Mäusen als Versuchstiere und Schafserythrocyten als Antigen durchgeführt.

Eine Maus wurde primär durch Injektion von 0,2 ml einer 10%lgen Schafserythrocyten-Suspenslon in physlo- so logischer Kochsalzlösung In die Schwanzvene sensiblllslert, und 7 Tage nach der ersten Senslblllslerung wurden 0,05 ml einer 40&lgen Suspension von Schafserythrocyten. In physiologischer Kochsalzlösung zur zweit.-.- Senslblllslerung In die Pfote injiziert. Die dicke Pfote wurde am nächsten Tag bestimmt. Die Gabe des Wirkstoffs des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates geschah In einer Dosierung von 250 mg/kg Kg pro Tag einmal täglich über fünf aufeinanderfolgende Tage, wobei die erste Senslbillslerung in der Mitte dieses Zeitraums durchgeführt wurde.

Als Ergebnis fand man, daß die Dickenzunahme der Pfote der mit dem Wirkstoff behandelten Maus keinen signifikanten Unterschied Im Vergleich zur Zunahme bei der Gruppe der nicht mit dem Wirkstoff behandelten Mäuse zeigte.

5. Antikörperproduzierende Wirkung

Um die Wirkungen des Wirkstoffes auf die humorale Immunabwehr zu erfahren, wurde der Hämaggiutinationstest unter Verwendung von ICR-JCL-Mäusen, die mit Schafserythrocyten sensiblllslert waren, durchgeführt.

Eine Maus wurde durch Injektion von 0,2 ml einer 10961gen Suspension von Schafserythrocyten in physiologischer Kochsalzlösung In die Schwanzvene sensiblllslert, und 7 Tage nach der Senslblllsterung wurde das Mäuseblut für den Hämaggluitnatlonstest zur Bestimmung dßr antlkörperproduzierenden Wirkung gesammelt. Der

Wirkstoff wurde Imraperitoneal In einer Dosis von 250 mg/kg Kg pro Tag Ober 5 aufeinanderfolgende Tage zugeführt, wobei die Senslblllslerung in der Mitte dieses Zeltraums durchgeführt wurde. Als Ergebnis wurde gefunden, daß sich kein signifikanter Unterschied Im Agglutlnallonstlter zwischen der Gruppe der mit dem Wirkstoff behandelten Mäuse und der Konlrollgruppe ergab.

Nachfolgend sind die pharmakologlschen Eigenschaften der Wirkstoffe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates In der folgenden Reihenfolge beschrieben:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Blutzuckersenkendc Wirkung, Antlhypertensive Wirkung, Antitumorwirkung, Analgetische Wirkung, Antipyretlsche Wirkung, Antiinflammatorische Wirkung und Blutlipldsenkende Wirkung

1. Blutzuckersenkende Wirkung

Streptozotocln wurde lntraperitoneal an eine Gruppe von Wlstar-Ratten in einer Dosierung von 60 mg/kg Kg verabreicht und nach gesichertem Positivwerden des Urinzuckers der Tiere am 8. Tag wurde den Ratten außerdem reguläres Insulin zur Senkung von Urin- und Blutzucker verabreicht. Von den so behandelten Tieren wurden die mit gesicherten erhöhten ürinzuckerwerten und erhöhten Biutzuckerwenen nach einigen Tagen Insulinbehandlung als Modelltiere mit artlffriellem Diabetes mellltus verwendet. Der Wirkstoff wurde den Modelltieren oral als LOsung In destilliertem Wasser in Dosierungen von jeweils 30 und 300 mg/kg Kg zugeführt. 3 und 6 Stunden nach der Gabe wurden Blutproben gesammelt und In diesen Proben Glucose unter Verwendung eines RaBa-Klts (Chugal Pharmaceutical Co., Japan) nach einem enzymatlschen Verfahren bestimmt.

Die Ergebnisse sind In Tabelle V gezeigt. Aus dieser Tabelle Ist ersichtlich, daB der Unterschied zwischen den Blutzuckerwerten vor und nach Gabe des jeweiligen Wirkstoffs U-Wert) gOßer als der Λ-Wert der Kontrolle war.

Besonders auffällig war die blulzuckersenkende Wirkung bei Natrlum-o-amlnobcnzoat-N-L-arablnosld, Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosld, Natrium-o-amlnobenzoat-N-L-rhamnosld und Natrlum-o-amlnobenzoat-N-D-mannosid, deren J-Werte bei so niedrigen Dosierungen wie etwa 30 mg/kg Kg 150 bis 460 mg/dl betrugen.

Tabelle V

Blutzuckersenkende Wirkung Verbindung

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid

Kontrolle

2. Antlhypertensive Wirkung

Eine Lösung des Wirkstoffs In destilliertem Wasser wurde oral an Ratten mit Sponlanhypertonle jeweils In Dosen von 30 und 300 mg/kg Kg gegeben, und der Blutdruck der Tiere wurde 3 und 6 Stunden nach Verabreichung mit einem Sphygmomanometer (Ucda-Werke. Japan. Modell USM-I05R) gemessen. Die Blutdruckdlfferenz vor und nach Wirkstoffgabc wurde zur Bewertung der nntlhypertenslven Wirkung der Wirkstoffe benutzt.

Dosis	Änderung d-Wert fur	6h
	Blutzucker	-225
(mg/kg Kg)	(mg/dl)	-83
	3h	-60
30	-254	-76
300	-108	-200
30	-62	-217
300	-80	-42
30	-220	-49
300	-134	-124
30	-82	-397
300	-95	-110
30	-156	-150
300	-462	-86
30	-180	-147
300	-230	-39
30	-121
300	-166
	-36

Der Mittelwert des Blutdrucks der oben genannten Ratten mit Spontanhypertonie betrug 200 mm Hg.

Die Ergebnisse sind In der Tabelle VI gezeigt, aus Ihr Ist ersichtlich, daß alle geprüften Wirkstoffe einen klaren antlhypertenslven Effekt zeigen.

Tabelle Vl Antihypertensive Wirkung

Verbindung

nach

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosid

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid

im 98 on

Natrium-o-aminobenzoaf-N-D-mannosid Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid

300 26 21

Kontrolle

*) Anmerkung: Blutdruck war um 2 mm Hg erhöht.

3. Antltumorwlrkung

Sarcoma 180 wurde subkutan In die rechte Axilla von ICR-JCl-Mäusen In einer Menge von 1 χ 10' Zellen/Maus Implantiert, und beginnend 24 Stunden nach Implantation wurde eine wäßrige Lösung des Wirkstoffs In steriler physiologischer Kochsalzlösung jeden zweiten Tag oral In einer Dosis von 500 mg/kg Kg Insgesamt zehnmal verabfolgt. Am 25. Tag nach Implantation wurden der oder die nodulären TumoKen) exstlrplert und gewogen. *°

Das Hemmungsverhältnis (I.V.) (%) des Wirkstoffs wurde nach der folgenden Formel berechnet:

(1-7/QxIOO = LV. (%)

mit T: mittleres Gewicht der Tumoren In der behandelten Gruppe von Mäusen 45

C^- mittleres Gewicht der Tumoren der Kontrollgruppe ·.

Die Ergebnisse des Versuchs sind In Tabelle VII gezeigt, aus Ihr Ist ersichtlich, daß alle geprüften Wirkstoffe eine Antltumorwlrkung zeigen.

* Mäuse tumorlmplantlert, jedoch nicht mit Wirkstoff behandelt.

Tabelle VII Antitumorwirkung gegen Sarcoma

Dosis	Blutdnjckminderung	t	6h
	nach	9
(mg/kg Kg)	(mm Hg]	25
	3 h	16
30	13	5
300	22	5
30	16	20
300	9	16
30	8	8
300	26	19
30	9	20
300	9	14
30	13	22
300	28	14
30	12	21
300	24	2
30	18
300	26
_	-2*)

Verbindung Hemmungs- ..

verhältnis (I. V. %)

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid 44,4 Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid 18,9 «> Natrium-o-aminobenzoat-N-D-glucosiil 22,4 Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 21,6 Natrium-0-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 57,4 Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid 32,0 ⁶⁵ Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid 59,0 Anmerkung: Verabreichte Menge: IO x 5(K) mg/kg Kg p.o.

4. Analgetlsche Wirkung

Bestimmung nach der mechanischen Stimulationsmethode (durch Druckanwendung) Weibliche ICR-Mäuse mit einem Schmerzschwellenwert von 50 bis 80 mm Hg bei Belasten Ihrer Schwanzbasis mit einer Druckstimulationsvorrichtung (Natsume-Werke, Japan) nach Tagakl und Kamcyama wurden als Versuchstiere gewählt, wobei jede Gruppe 10 Tiere umfaßte.

Nach Verabreichen des Wirkstoffs wurde mit fortlaufender Zelt der Versuch durchgeführt, und der angewendete Druck und der Zeltraum, bis das Tier eine Quasl-Ruchtreaktlon zeigte, wurden zur Bewertung dar analgetischen Wirkung des Wirkstoffs bestimmt.

ίο Die Ergebnisse sind In Tabelle VIII gezeigt, aus Ihr 1st ersichtlich, daß der auf die Tiere ausgeübte Druck, bei dem diese eine Quasi-Fluchtreaktion zeigten, bei den Wlrkstoff-behandelten Tieren höher war als bei den nicht behandelten Tieren und daß der Zeltraum bis zu dem Punkt, an dem die Tiere die Reaktion zeigten, bei den Wlrkstoff-behandelten Tieren länger als bei den nlchtbehandelten Tieren war. Somit wurde die analgetlsche Wirkung des Wirkstoffs bestätigt. Bestimmung nach der chemischen Stimulationsmethode

Der Wirkstoff wurde oral an eine Gruppe von 10 weiblichen ICR-Mäusen Im Alter von 5 bis 6 Wochen verabreicht, und 30 Minuten nach Verabreichung wurde eine wäßrige 0,6%Ige Essigsäurelosung den Mäusen In slner Dosis von 0,1 ml/10 g Kg Intraperltoneal injiziert. Die Anzahl der SchmerzkrOmmungen, die die Maus 10 Minuten nach intraperitonealer Gabe über 10 Minuten zeigte, wurde aufgezeichnet. Die analgetlsche Wirkung wurde aus San Verhältnis der Hemmung der Schmerzkrümmung bewertet, das man nach der folgenden Formel erhieit:

(1 - TIQ χ 100 = Schmerzkrümmungshemmungsverhältnls (96)

mit T: mittlere Anzahl der Schmerzkrümmungen In der behandelten Gruppe

C: mittlere Anzahl der ScbTnerzkrümmungen In der Kontrollgruppe

Die Ergebnisse sind in der Tabelle IX gezeigt, aus dieser Tabelle Ist ersichtlich, daß jeder Wirkstoff des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates analgetlsche Wirkung zeigte. Der oben beschriebene Versuch wurde nach der Methode von Kostet et al (1959) durchgeführt.

Tabelle VIII

Ar.Jgetische Wirkung nach der mechanischen Stimulationsmethode

Verbindung	Quasi-Fluchtreaktion	nach
	bei Druck	(see)
	(mm Hg)	38
Natrium-o-aminobenzoat-N-L-	82
arabinosid		37
Natrium-o-aminobenzcat-N-D-	88
xylosid		36
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	88
glucosid		36
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	80
galactosid		40
Natrium-o-aminobenzoat-N-L-	79
rhamnosid		41
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	92
mannosid		35
Methyl-o-aminobenzoat-N-D-	75
mannosid		33
Kontrolle	70

Anmerkung: Verabreichte Menge: 1000 mg/kg Kg p.o.

in

Tubelle IX

Analgetische Wirkung nach der chemischen
Stimulationsmethode

Verbindung (I. V. %) ⁵

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-arabinosid 43,1

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosid 27,9

Natrium-o-amincbenzoat-N-D-glucosid 24,5 ¹⁰

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 19,8

Natriurn-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 52,1

Natrium-G-aminobenzoat-N-D-mannosid 43,4

Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid 40,5

Anmerkung: Verabreichte Menge: 100 mg/kg Kg p.o.

5. Antlpyretische Wirkung 2"

Nach der Methode vors Winter et a! (!96!) wurde eine 20*lge Bierhefesuspension einer Gi»upe von sechs Ratten subkutan Injiziert, und nach lOstüncVgem Fasten wurde der Wirkstoff den Ratten oral verabreicht und ihre rektale Temperatur gemessen.

Die antlpyretlsche Wirkung wird durch das Verhältnis der Hemmung der Blerhefe-Induzierten Pyrexle (I.V. 25 In %) zu der Zelt, wenn die antlpyretische Wirkung des Wirkstoffs Ihr Maximum aufweist, entsprechend der folgenden Formel bestimmt:

Antlpyretlsche Wirkung = I.V.(%) = - χ 100

C-C₁ 30

mit T: mittlere rektale Temperatur der Wlrkstoff-behandelten Rauen

G: mittlere rektale Temperatur der Blerhefe-gelmpften, jedoch nicht Wlrkstoff-behandelten Ratten G: mittlere rektale Temperatur der unbehandelten Ratten (Kontrolle)

Die Ergebnisse sind in Tabelle X aufgeführt, aus Ihr Ist ersichtlich, daß alle Wirkstoffe eine beträchtliche antlpyretlsche Wirkung zeigten.

:lleX

Tabelle X	Antlpyretische
Antlpyretische Wirkung	Wirkung (Pyrexie
Verbindung	unterdrückend)
	I. V. (%)
	35,7

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-	29,8
arabinosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	15,6
xylosid
Nulrium-o-aminobenzout-N-D-	40,6
glucosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	66,6
galactosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-L-	19,8
rhamnosid
Natrium-o-aminobenzoat-N-D-	25,0
mannosid
Methyl-o-aminobenzoat-N-D-
mannosid

6. Antllnflammutorlschc Wirkung a) Carrageenlnödem-hemmende Wirkung

Nach der Methode von van Arman et al (1963) wurde der Wirkstoff unter Zwang oral an Jede Ratte einer Gruppe von 10 Tieren In einer Dosis von 1000 mg/kg Kg verabreicht, und 1 Stunde nach der Verabreichung wurde 0,1 ml einer I%lgen Suspension von Carrageenln In physiologischer Kochsalzlösung In die rechte Pfote Injiziert. Das Volumen der Pfote wurde Im zeitlichen Verlauf bestimmt, und die antllnflammatorlsche Wirkung wurde ausgedrückt durch das Verhältnis der Hemmung der Carrageenln-lnduzlerten Pfotenschwellung durch ίο den Wirkstoff unter Verwendung des 1 bis 4 Stunden nach Injektion bestimmten Wertes und Berechnung nach der folgenden Formel:

(1 - TIQ χ 100 = I.V. (%) = antllnflammatorlsche Wirkung

:' mit T: Mittelwert der Pfotenvolumen der behandelten Tiere

C: Mittelwert der Pfotenvolumen der Kontrolle (nicht behandelt, geimpft)

Die Ergebnisse sind In Tabelle Xl gezeigt, aus Ihr Ist ersichtlich, daß alle geprüften Verbindungen die Hemmwirkung gegen das Carrageenln-induzlerte ödem zeigten.

-·> b) Antlgranulomwlrkung

Nach der Methode von Winter et al (1963) wurden jeweils zwei Wattebausche In die Rückenhaut jeder Ratle aus einer Gruppe von sechs Tieren symmetrisch zur Medianlinie Implantiert, wobei das Gewicht jedes Bauschchens 30 ± 1 mg betrug. Die orale Gabe von 1000 mg/kg Kg/Tag des Wirkstoffs wurde über 7 aufelnanderfolgende Tage durchgeführt. Am achten Tag wurde das In den Ratten gebildete Granulom exstlrplert und nach Trocknen gewogen. Die Antlgranulomwlrkung. ausgedrückt durch das Verhältnis der Hemmung des Granulomwachstums (I.V. %), wurde wie In 6. a) gezeigt, berechnet und eile Ergebnisse In Tabelle XI gezeigt. Aus dieser Tabelle Ist ersichtlich, daß jeder Wirkstoff die Hemmwirkung ger '.n das Granulomwachstum zeigte.

c) Antlexsudatlve Wirkung

Nach der Methode von Baris et al (1965) wurde ein Volumen Luft subkutan In den Rücken jeder Ratte einer Gruppe von 6 Tieren Injiziert, so daß eine Luftquaddel gebildet wurde, und dann wurden 0,5 ml l*lge Crotonöllösung In Sesamöl In die Quaddel Injiziert. Dann begann man mit der oralen Verabreichung von 100 mg/kg ^;i Kg/Tag des Wirkstoffs, die man über 5 Tage fortsetzte. Am 6. Tag wurde die Menge der In die Quaddel exsudlerten Flüssigkeit bestimmt, und die Antlcxsudatlonswlrkung, ausgedrückt durch das Verhältnis der Hemmwirkung gegen die ExSU(JaUOn₁ wurde, wie In 6. a) gezeigt, berechnet. Die Ergebnisse sind In Tabelle Xl gezeigt, aus ihr Ist ersichtlich, daß alle geprüften Wirkstoffe die antlexsudatlve Wirkung zeigten.

*t> d) Wirkung gegen Adjuvansarthrltls

Nach der Methode nach Fujlwara et al (1971) wurde in flüssigem Paraffin suspendiertes Mycobacterlum tuberculosis subkutan In die rechte Pfote jeder Ratte einer Gruppe von 6 Tieren gespritzt. 14 Tage nach der Injektion wurden Ratten mit einem ahnlichen Pfotenvolumen zu Gruppen von 10 Tieren zusammengefaßt und ■i> vom 15. Tag an über sieben aufeinanderfolgende Tage jeder Wirkstoff täglich oral verabreicht. Das Volumen der Ratienpfoten wurde bestimmt, und die Wirkung gegen Adjuvansarthrltls jedes Wirkstoffs wurde als Verhältnis der Hemmung der Pfotenschwellung unter Verwendung der In 6. a) aufgeführten Formel berechnet. Die Ergebnisse sind In Tabelle XI gezeigt, aus Ihr Ist ersichtlich, daß alle geprüften Wirkstoffe die Wirkung gegen Adjuvaasarthrltis zeigten.

Tabelle XI Antiinflammatorische Wirkung (I. V. %)

." Verbindung Ödem*) Granulom*) Exsudation*) Arthritis*)

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-

arabinosid

6/, Natrium-o-aminobenzoat-N-L-

rhamnosid

Nairium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid

_h, Natrium-o-aminobenzoat-N-D-

xylosid

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-gi u cos id

26,0	6,3	10,5	22,7
4,6	10,1	18,0	19,0
6,9	4.7	12,9	16,1
20.1	12.6	17,8	28,6
4.0	7.9	9,1	12,1

Fortsetzung Verbindung Odem *) Granulom ·) Exsudulion ·) Arthritis *)

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-mannosid

Methyl-o-aminobenzoat-N-D-mannosid

4,8
21,5

11,8 10,7

·) Anmerkung: Verabreichte WirkstolTmcnge K)(M) mg/kg Kg

7,1
15,4

17,8 11,5

7. Blulllpldscnkende Wirkung

Japanische männliche weiße Kaninchen wurden etwa 3 Monate mit festem Futter (CR-I), das 1% Cholesterin enthielt, gefüttert und diejenigen Tiere, bei denen ein Anstieg des Serumllpldantells gesichert wurde, wurden als Modelltiere mit experimenteller Arterlosklerose verwendet.

Eine wäßrige Lösung des Wirkstoffs In destilliertem Wasser wurde den Tieren In einer Dosis von jeweils 30 und 300 mg/kg Kg oral verabreicht. Nach der Verabreichung wurden Im zeitlichen Verlauf Blutproben aus der Ohrvene entnommen, und die Änderung des Gcsamichoiesterins (enzymatisch bestimmt), der Phosphoiipide (enzymatisch bestimmt) und des /J-Llpoprotclns (turbldometrlsch bestimmt) Im Serum wurde beobachtet.

Die Ergebnisse sind In der Tabelle XIl gezeigt. In dieser Tabelle wurden die Werte für Serumcholesterin (Mittelwert 550 mg/dl), Phosphoiipide (Mittelwert 320 mg/dl) und /i-Llpoproteln (Mittelwert 2500 mg/dl) vor der Wirkstoffgabe jeweils von den entsprechenden Werten 3 und 6 Stunden nach der Wirkstoffgabe abgezogen und jeweils nur die Differenzen aufgeführt. Daher bedeuten Minuswerte eine Abnahme und Pluswerte eine Zunahme der jeweiligen Werte aufgrund der Wirkstoffgabe. Aus der Tabelle XII Ist klar ersichtlich, daß die Wirkstoffe allgemein eine Wirkung bezüglich der Verminderung der Llpldkomponente Im Vergleich zur Kontrolle zeigten.

Tabelle XII Blutlipidsenkende Wirkung

Verbindung

Dosis (mg/kg Kg)

Phosphoiipide (mg/dl)

3 h 6 h

/MJpoprotein Cholesterin (mg/dl) (mg/dl)

3h 6h 3h 6h

-132 -175 -98 -74

-174 -158 -120 -135

-142 -169 -96 -77

-200 -203 -72 -105

-192 -113 +3 -25

-380 -194 +10 -75

-213 -179 +3 -100

-300 -202 -5 -210

-148 -197 -122 -115

-220 -284 -180 -175

-179 -181 -50 -60

-244 -320 -100 -125

-144 -127 -181 -163

-201 -139 -230 -215

0 +3 +8 -4

Im folgenden wird die Rezeptur der Wirkstoffe zur Herstellung des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates beschrieben.

Soll das pharmazeutische Präparat als entzündungshemmendes MIttel verwendet werden, so kann man es In der zur Erzielung der besten Wirkung entsprechend den Arten und den Symptomen des Leidens geeigneten Form verwenden, darüber hinaus kann der Wirkstoff auch für sich allein oder In Gemischen mit allen In pharmazeutischen Präparaten zulässigen Verdünnungsmitteln und zusammen mit anderen Präparaten verwendet werden.

Das Präparat der vorliegenden Erfindung wird oral oder parenteral verabreicht, und dementsprechend kann es In jede für die orale oder parenterale Gabe gewünschte Form gebracht werden.

Das erfindungsgemäße Präparat kann in Form einer Verabrelchungseinheit angeboten werden. Das erfindungsgemäße Präparat kann In Form von Pulver, Granulat, Tablette, Dragee, Kapsel, Suppositorium, Suspension, LOsung, emulgierbarem Konzentrat, In Ampullen gefülltes Konzentrat, InjektionslOsung und dergleichen

NstriuiTi-o-arninobfinzQät-	30	-40	-40
N-D-mannosid	300	-43	-59
Natrium-o-aminobenzoat-	30	-27	-40
N-D-glucosid	300	-33	-43
Natrium-o-aminobenzoat-	30	+ 11	-27
N-D-galactosid	300	0	-30
Natrium-o-aminobenzoat-	30	-26	-51
N-L-arabinosid	300	-74	-87
Natrium-o-aminobenzoat-	30	-23	-23
N-L-rhamnosid	300	-25	-19
Natrium-o-aminobenzoat-	30	-19	-47
N-D-xylosid	300	-23	-64
Methyl-o-aminobenzoat-	30	-24	-32
N-D-mannosid	300	-37	-39
Kontrolle	_	0	-19

13

/y it

sein. Als Verdünnungsmittel können beliebige Feststoffe, Flüssigkeiten und halbfestc Stoffe verwendet werden, beispielsweise Exzlplentlen, Füllstoffe, Binder, Netzmittel, Sprcngmltlel, oberflächenaktive Mittel, Demulzenzlen, Dispersionsmittel, Puffermittel, Duftstoffe, Konservlerungssioffc, Lösungshilfen und Lösungsmittel. Darüber hinaus können eine oder mehrere dieser Adjuvantien In Kombination oder In Gemischen verwendet werden.

Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat kann nach Jeder bekannten Methode zubereitet (rezeptlert) werden, und die Menge des In der Mischung (Zubereitung) enthaltenen Wirkstoffs liegt Im allgemeinen bei 0,01 bis 100 Gew.-96,

Das erfindungsgemäße Präparat kann oral oder parenteral an Menschen oder Tiere verabreicht werden, wird in jedoch vorzugsweise oral gegeben, worin die subilnguale Gabe eingeschlossen Ist. Die parenteral Gabe schließt die subkutane. Intramuskuläre und Intravenöse Injektion und die Infusion ein.

Die Dosierung des erfindungsgemäßen Präparates hängt von Alter, persönlichen Unterschieden und Studium der Krankheit sowie davon ab, ob das betreffende Objekt ein Mensch oder ein Tier Ist, und dementsprechend können auch andere Mengen als die folgenden gegeben werden: Im allgemeinen beträgt für den Menschen die orale Dosis 0,1 bis 1000 mg/kg Kg/Tag, vorzugsweise 1 bis 500 mg/kg Kg/Tag und die parenteral Dosis 0,01 bis 200 mg/kg Kg/Tag, vorzugsweise 0,1 bis 100 mg/kg Kg/Tag, verteilt auf 1 bis 4 F.lnzeldosen, wobei zu einer Zelt jeweils eine Einzeldosis gegeben wird.

Im folgenden wird die Rezeptur und die Herstellung des crflndungsgemäßen Präparates In Beispielen erläutert.

Beispiel 1 (Rezeptur)

10 Gew.-Teile eines der erfindungsgemäßen Wirkstoffe (Natrlum-o-amlnobenzoat-N-L-arablnosld), 15 Gew.-Teile (schweres) Magnesiumoxid und

76 Gew.-Teile Lactose wurden gleichmäßig gemischt und zu Pulver oder Granulat geformt. Das Pulver wurde In Kapseln gefüllt.

Beispiel 2 (Rezeptur)

^:' 45 Gew.-Teile eines der erfindungsgemäßen Wirkstoffe (Natrlum-o-amlnobenzoal-N-D-xylosld)

15 Gew.-Telle Stärke,

16 Gew.-Teile Lactose,

21 Gew.-Telle kristalline Zellulose, 3 Gew.-Telle Polyvinylalkohol und

30 Gew.-Teile Wasser wurden gleichmäßig gemischt, zerquetscht, konfektioniert und nach Trocknen In die Form eines Granulats gebracht.

uciSpici j vrvCZCptüF/

~⁰ Granulat wurde wie In Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, daß man Natrium-o-amlnobenzoat-N-D-glucosid anstelle von Natrium-o-aminobenzoat-N-D-xylosld verwendete, und das Gemisch von 96 Gew.-Tellcn dieses Granulats und 4 Gew.-Teilen Kalzlumstearat wurde unter Druck zu Tabletten von 10 mm Durchmesser geformt.

-»5 Beispiel 4 (Rezeptur)

94 Gew.-Telle eines der erfindungsgemäßen Wirkstoffe (Natrlum-o-amlnobenzoat-N-L-rhamnosld), 6 Gew.-Telle Polyvinylalkohol und

30 Gew.-Telle Wasser wurden gemischt, und das Gemisch wurde wie In Beispiel 2 zur Granulat verarbeitet. Zu

^s« 9C Gew.-Tellen des so hergestellten Granulats wurden 10 Gew.-Telle kristalline Zellulose gemischt, und das

Gemisch wurde unter Druck zu Tabletten von 8 mm Durchmesser geformt. Die Tabletten

wurden mit Sirup, Gelatine und gefälltem Kaliumcarbonat beschichtet, so daß man Dragees erhielt.

^ί5 Beispiel 5 (Rezeptur)

0,6 Gew.-Telle eines der erfindungsgemäßen Wirkstoffe (Natrlum-o-amlnobenzoat-N-Ü-galactosld), 2,4 Gew.-Telle eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels und 97 Gew.-Telle physiologische Kochsalzlösung wurden unter Erhitzen gemischt und das Gemisch wurde sterilisiert, so daß man eine ^M Injektionslösung erhielt.

Beispiel 6 (Herstellung von o-Amlnobenzoesäure-N-L-arablnosld und seinem Natriumsalz)

Ein Gemisch von 2,3 g Anthranilsäure, 2,5 g L-Arabmose und 0,2 g Ammoniumchiorid wurde in 30 ml Methanol unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion schieden sich beim Stehenlassen des Raktlonsgemlsches bei Raumtemperatur Kristalle ab. Die durch Filtrieren erhaltenen Kristalle wurden mit Wasser, Metha-

iiol i_nd claniTi mil Äther gewaschen, man erhielt farblose Nadeln oder PllUtchen In einer Ausheule von dl..K. Das so erhaltene Anthranllsäure-N-L-arablnosld wurde allmählich In einer wäßrigen Klgen Natrlumhydroxldlösung, die die stöchlomcirlsch berechnete Natriumhydroxidmenge enthielt, gelöst, und nach Filtrieren wurde die Lösung vnter verminderten Druck eingeengt. Die auf Zugabe eines großen Überschusses von Aceton zum Kondensat ausfallenden Kristalle wurden entwässert und getrocknet. Man erhielt farblose Kristalle des Natriumsalzes In einer Ausbeute von 100%. Die Gesamtausbeute aus Anthranilsäure betrug 61,3%.

Beispiel 7
(Herstellung von o-Amlnobenzoesilure-N-D-xylosld und seinem Natriumsalz) ^; ■■

Ein Gemisch von 2,3 g Anthranilsäure, 2,5 g D-Xyiose und 0,2 g Ammonlumchlorld wurde In 35 ml Äthanol unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck auf das halbe Volumen eingeengt, und nach Stehenlassen bei Raumtemperatur schieden sich kristalline Nadeln ab. Nach Waschen mit Wasser, Methanol und dann mit Äther wurden die Kristalle aus Äthanol umkristalli- i> slert. Man erhielt farblose Nadeln In einer Ausbeute von 74 6*. Wurde Ammoniumsulfat anstelle von Ammonlumchlorld Im oben genannten Versuch verwendet, so erzielte man ein ähnliches Ergebnis.

Das so erhaltene Anthranllsäure-N-D-xylosld wurde allmählich In einer wäßrigen l%lgen Natriumhydroxidlösung, die das Alkall In der berechneten Menge enthielt, gelöst. Nach Filtrieren und Einengen der Lösung wurde dem Kondensat ein großer Überschuß Aceton zugegeben, und man erhielt feuchte Kristalle. Nach En».- -'> wässern und Trocknen erhielt man farblose Kristalle In einer Ausbeute von 100%, bezogen auf das Anthranllsäure-N-ü.-<ylosld. Die Gesamtausbeute aus Anthranilsäure betrug 74,6% der Theorie.

Beispiel 8
(Herstellung von o-Amlnobenzoesäiire-N-D-glucosld und seinem Natrlumsalz)

Ein Gemisch von 4,6 g Anthranilsäure, 6,0 g D-Glucose und 0,5 g Ammonlumchlorld wurde In 40 ml 95%lgem Äthanol unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf etwa '/, seines Volumens eingeengt und über Nacht Im Kühlschrank stehengelassen, so daß sich Kristalle bildeten. Nach Isolieren der Kristalle durch Filtration des Reaktionsgemisches und Waschen der filtrierten Kristalle mit Wasser, Methanoi und dann mit Äther, sowie nach zweimaligem Umkristallisieren der gewaschenen Kristalle aus Methanol erhielt man farblose Kristalle In einer Ausbeute von 4,6%.

Durch Lösen der so erhaltenen Kristalle In einer wäßrigen l%lgen Natriumhydroxidlösung In stöchiometrischen Mengen und Filtrieren der Lösung, gefolgt vom Einengen des Filtrats und schließlich Zugabe eines großen Überschusses von Aceton zu dem Kondensat, erhielt man aus der acetonlschen Lösung Kristalle. Nach Entwässern und Trocknen erhielt man farblose nadelartige Kristalle in einer Ausbeute von 100% des Anthranilsäure-N-D-glucoslds. Die Gesamtausbeute aus Anthranilsäure betrug 4.6%.

Beispiel 9 *o

(Herstellung von o-Amlnobenzoesäure-N-D-galactosld und seinem Natrlmsalz)

Ein Gemisch von 2,4 g Anthranilsäure, 3,0 g D-Galactose und 0,2 g Ammoniumchlorid wurde In ?0 ml 95%igem Äthanol zum Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter ^4S vermindertem Druck auf die Hälfte seines Volumens eingeengt und bei Raumtemperatur stehengelassen, so daß sich Kristalle abschieden. Nach Filtration des Reaktionsgemisches und Waschen der Isolierten Kristalle mit Wasser, Methanol und Äther sowie Umkristallisieren aus 95%lgem Äthanol erhielt man nadelartige Kristalle in einer Ausbeute von 16,4%.

Die so erhaltenen Kristalle von Antrhanllsäure-N-D-galactosld wurden In l%lger Natriumhydroxidlösung in stöchlometrischen Mengen gelöst und nach Filtration der Lösung und Einengen des Filtrats auf die Hälfte seines Volumens wurde dem Kondensat ein großer Überschuß Aceton zugesetzt. Die so abgeschiedenen Kristalle wurden entwässert und getrocknet. Man erhielt farblose Kristalle in einer Ausbeute von 100%, bezogen auf das Anthranllsäure-N-D-galactosld, und In einer Gesamtausbeute von 16,4%, bezogen auf Anthranilsäure.

Beispiel 10
(Herstellung von o-Amlnobenzoesäure-N-L-rhamnosld und seinem Natriumsalz)

Ein Gemisch von 2,3 g Antrhanllsäure, 2,8 g L-Rhamnose und 0,2 g Ammonlumchlorld wurde in 25 ml ^w Methanol unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur stehengelassen, so daß sich Kristalle abschieden. Nach Filtrieren des Reaktionsgemisches und Waschen der gesammelten Kristalle mit Wasser, Methanol und dann Umkristallisieren der gewaschenen Kristalle aus 50%lgem Methanol erhielt man farblose nadelartige Kristalle in einer Ausbeute von 9,8%.

Das so erhaltene Anthranllsäure-N-L-rhamnosld wurde langsam In l%lger Natriumhydroxidlösung In stöchiometrischen Mengen gelöst. Nach Filtrieren der Lösung und Einengen des Flltrats auf die Hälfte seines Volumens wurde dem Kondensat ein großer Überschuß Aceton zugesetzt, so daß man Kristalle erhielt. Durch Entwässern und Trocknen der feuchten Kristalle erhielt man farblose Kristalle In einer Ausbeute von 100%,

bezogen auf das Anthranlisäurc-N-L-rhamnostd, wobei die Gesamtausbeute, bezogen auf Anthranilsäure, 9,8* betrug.

Beispiel 11

(Herstellung von Methyl-o-amlnobenzoat-N-D-mannosid)

Ein Gemisch von 1 g Methylanthranilat und 1 g D-Mannose wurde In 10 ml Äthanol In Gegenwart von 0,1 g Ammoniumchlortd für etwa eine Stunde erhitzt, so daß die Kondensation bewirkt wurde. Nach Abschluß der |° Reaktion wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur stehengelassen, so daß sich Kristalle abschieden. Die Kristalle wurden aus 95%lgen Äthanol zu farblosen Kristallen In einer Ausbeute von 60% umkristallisiert.

Beispiel 12 (Herstellung von o-Amlnobenzoesäure-N-D-mannosld und seinem Natriumsalz)

Ein Gemisch von 2 g Anthranilsäure und 3 g D-Mannose wurde in 10 ml Äthanol In Gegenwart von 0,2 g Ammoniumchlorid In einem Wasserbad bei 95 bis 96° C unter Rückfluß erhitzt. Nach einer Welle schieden sich dicke Kristalle ab. Nach Sammeln der Kristalle durch Filtration und sorgfältigem Waschen mit Wasser und Meihano! wurden die Kristalle sus Methanol zu farblosen Nadein umkrisiäliisieri. Die Ausbeute betrug 53,0%, bezogen auf Anthranilsäure.

Das so erhaltene Anthranllsäure-N-D-mannosld wurde langsam In l%lger Natriumhydroxidlösung In stöchiometrischen Mengen gelost. Etwa verbleibende unlösliche Rückstände wurden durch Filtration entfernt und die Lösung (oder das Flltrat) wurde unter vermindertem Druck eingeengt, worauf dem Kondensat ein großer Über schuß Äthanol zugesetzt wurde. Die sich abscheidenden Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, entwäs sert und getrocknet und ergaben farblose Kristalle In einer Ausbeute von 100%, bezogen auf Anthranllsäure-N-D-mannosId, und einer Gesamtausbeute von 53.0%, bezogen auf Anthranilsäure.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Palentanspruch:

Arzneimittel zur Behandlung von Hyperglykämle, Hyperllpämle, Hypertension, Inflammatorlschen Erkrankungen, Schmerzen und Pyrexis durch Erregung des Zentralnervensystems und von Tumoren enthaltend eine Verbindung entsprechend der allgemeinen Formel

ίο ²ROOC

worin ¹R einen durch Entfernen der OH-Gruppe In 1 a- oder 1 /5-Position von Arablnose, Xylose, Glukuse, Galaktose, Rhamnose oder Mannose erhaltenen Rest und ²R Wasserstoff, Natnum, Kalium, V₂ Magnesium, V₂ Kalzium, V₃ Aluminium oder eine Methylgruppe bedeuten.