DE2803681C2

DE2803681C2 -

Info

Publication number: DE2803681C2
Application number: DE2803681A
Authority: DE
Inventors: Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Masahiko Iwaki Fukushima Jp Fujii; Minoru Ohara; Akira Tokio/Tokyo Jp Kobayashi; Tuneo Urawa Saitama Jp Akatu
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1977-01-27
Filing date: 1978-01-27
Publication date: 1989-03-16
Also published as: FR2378799B1; GB1581315A; DE2803681A1; CA1086720A; SU1403990A3; AU501257B1; IT7819741A0; IT1112608B; FR2378799A1; JPS5394012A; JPS5646481B2

Description

Die Erfindung betrifft das neue Polysaccharid des Patentanspruchs 1, das im Gegensatz zu den bisher bekannten aus verschiedenen Arten von Basidiomycetes gewonnenen Antitumorstoffen, die nur eine deutliche Antitumorwirkung bei intraperiotonealer Verabreichung zeigen, auch bei oraler Verabreichung eine ausgezeichnete Antitumorwirkung entwickelt. Ferner betrifft die Erfindung ein Antitumormittel, welches das neue Polysaccharid enthält.

In den DE-A 27 13 458, 27 13 536 und 27 31 570 werden Stickstoff enthaltende Polysaccharide beschrieben, während das erfindungsgemäße Polysaccharid ein α-Glukan von D-Dextrose ist, da es keinen Stickstoff in seinem Molekül enthält.

In der GB-PS 13 31 513 werden Polysaccharidgemische beschrieben, von denen sich das erfindungsgemäße Polysaccharid einerseits durch einen höheren Reinheitsgrad und andererseits durch die ausschließliche Anwesenheit von α-glykosidisch gebundenen Zuckern unterscheidet. Ferner enthält das erfindungsgemäße Polysaccharid keinen Proteinanteil wie die aus der genannten GB-PS bekannten Polysaccharide. Wie das weiter unten folgende Beispiel 3 zeigt, ist das erfindungsgemäße Polysaccharid den aus dieser GB-PS bekannten Polysacchariden durch eine ausgeprägtere Antitumoraktivität nicht nur bei intraperitonealer, sondern auch bei oraler Verabreichung überlegen.

Bisher wurde noch nicht eine Antitumoraktivität des α-Glukans von D-Glukose, zu welchem das erfindungsgemäße Polysaccharid gehört, beschrieben. Vielmehr gibt es einen medizinischen Bericht, welcher auf die Inaktivität einiger α-Glukane von D-Glukose verweist (vgl. "Nature" 245, 1973, Seiten 40 bis 41).

Die Zeichnungen geben Infrarotabsorptions- (IR) und Kernresonanz (NMR)-Absorptionsspektren des erfindungsgemäßen Polysaccharids wieder.

Es zeigen

Fig. 1 bis 4 die IR-Spektren der aus den Pilzen der Stämme Coriolus versicolor (Fig. 1), Coriolus hirsutus (Fig. 2), Coriolus consors (Fig. 3) bzw. Coriolus pargamenus (Fig. 4) gewonnenen Polysaccharide,

Fig. 5 bis 8 die NRM-Absorptionspektren der oben genannten Substanzen sowie

Fig. 9 ein Absorptionsspektrum einer bekannten Polysaccharidsubstanz (angegeben als "PS-K"), die durch Filtrieren und Sterilisieren unter Druck, gefolgt von Sprühtrocknung des Extrakts der Basidiomyceten der Gattung Coriolus erhalten wurde und hier als Kontrolle betrachtet wird, zeigen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide, die nachfolgend als "vorliegende Substanz" bezeichnet werden, sind weiße, geschmacks- und geruchlose Pulver. Ihre Eigenschaften werden nachfolgend beschrieben.

(1) Physikalische und Chemische Eigenschaften Elementaranalyse

Die Elementaranalyse der vorliegenden Substanz erbrachte die folgende Zusammensetzung: 43,5 bis 43,3% C, 5,7 bis 6,7% H und der Rest als O.

Farbreaktionen

Die Farbreaktionstests wurden bei den wäßrigen Lösungen der vorliegenden Substanz durchgeführt und man erhielt die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse:

Tabelle 1

Aus den oben angeführten Ergebnissen der Farbreaktionen ist ersichtlich, daß die vorliegenden Substanz Saccharide enthält.

pH-Wert

1 g der vorliegenden Substanz wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung eines pH- Meters bestimmt. Er lag im Bereich von 6,5 bis 7,2.

Spezifische optische Aktivität

Eine 0,25%ige wäßrige Lösung der vorliegenden Substanz wurde hergestellt und ihre optische Aktivität gemessen und hieraus die spezifische Aktivität [α] bestimmt. Sie lag im Bereich von 70 bis 180.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Substanz lag bei Bestimmung nach einer Ultrazentrifugationsmethode im Bereich von 5000 bis 300 000, das Durchschnittsmolekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000. Die nach anderen Meßverfahren, wie etwa fraktionierte Ultrafiltration, erhaltenen Werte deuteten ebenfalls auf den Bereich von 10 000 bis 100 000 hin. Daher kann angenommen werden, daß das Durchschnittsmolekulargewicht der vorliegenden Substanz im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt.

Löslichkeit

Die vorliegende Substanz ist gut in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan.

IR-Spektrum

IR-Spektren der vorliegenden Substanz, die in einem Kaliumbromid- Pressling bestimmt wurden, sind in den Fig. 1 bis 4 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt. Es war kein signifikanter Unterschied zwischen den Proben festzustellen. Das Spektrum zeigte Absorptionen bei 3600 bis 3200 cm^-1, 2920 bis 2900 cm^-1, 1660 bis 1610 cm^-1, 1460 cm^-1, 1410 cm^-1, 1360 cm^-1, 1230 cm^-1, 1150 cm^-1, 1080 cm^-1, 1060 bis 990 cm^-1, 925 cm^-1, 840 cm^-1, 775 cm^-1 und 705 cm^-1. Die breite Absorptionsbande bei 3600 bis 3200 cm^-1, die in den Fig. 1 bis 4 zu sehen ist, muß wohl zu verschiedenen Graden Wasserstoffbrücken-gebundenen OH-Gruppen zugeschrieben werden. Dies kann beispielsweise aufgrund der Tatsache angenommen werden, daß diese breite Absorptionsbande verschwindet, wenn die Hydroxylgruppen im Saccharidteil der Probe O-methyliert werden. Eine weitere breite Absorptionsbande bei 1200 bis 1000 cm^-1 kann der unsymmetrischen Streckschwingung der C-O-C-Bindung der Pyranoseringe im Saccharidanteil zugeschrieben werden. Die Absorption bei 840 cm^-1 kann einer a-Bindung der Saccharide zugeschrieben werden. Diese Absorption ist ein Hinweis auf α-Bindung der Saccharide in der vorliegenden Substanz.

Protonen-NMR-Spektrum

Das NMR-Spektrum (100 MHz) der vorliegenden Substanz wurde unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel und Natrium-2,2-dimethyl-2-silanopentan-5- sulfonat (D. S. S.) als internen Standard bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5 bis 8 gezeigt.

Die Absorption bei 2,5 bis 6,0 ppm in den Fig. 5 bis 8 kann den Protonen im Saccharidanteil zugeschrieben werden, während die Absorption bei 5,0 ppm einer α-(1→6)-Bindung, und die bei 5,4 ppm einer α-(1→4)- und α-(1→3)-Bindung zugeschrieben werden können. Zur Kontrolle ist in Fig. 9 ein NMR- Spektrum eines bekannten Produkts gezeigt, das durch Filtrieren und Sterilisieren unter Druck, gefolgt von Sprühtrocknung eines Extrakts von Basidiomyceten der Gattung Coriolus von Polyporaceae gewonnen wurde. Ein solches Produkt wurde unter dem Namen PS-K veröffentlicht und es wird im folgenden so bezeichnet. Der wichtigste Unterschied zwischen PS-K und der vorliegenden Substanz, wie es sich bei der vergleichenden Betrachtung der in den Fig. 5 bis 8 und der Fig. 9 gezeigten Absorptionsspektren ergibt, besteht darin, daß im Fall der vorliegenden Substanz, obwohl eine von einer α-Bindung herrührenden Absorption bei 4,9 bis 6,0 ppm beobachtet wird, im Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm keine einer β-Bindung zuzuordnenden Absorption sichtbar ist. Dies weist darauf hin, daß die Saccharidkomponente der vorliegenden Substanz durchweg α-gebunden ist. In Hinsicht auf die quantitative Bestimmung der Bindungsart der Saccharide der vorliegenden Substanz kann aus einer bei 5,0 ppm beobachteten α-(1→6)-Bindung und bei 5,4 ppm beobachteten α-(1→4)- sowie α-(1→3)-Bindung eine gewisse Annahme getroffen werden, da jedoch α-(1→4)- und α-(1→4)- und α-(1→3)-Bindung bei 5,4 ppm überlappen, ist die exakte quantitative Bestimmung der jeweiligen Bindungen schwierig. Da ferner die vorliegende Substanz eine verzweigte Struktur hat, muß die genaue Strukturaufklärung der Substanz der im folgenden beschriebenen Methylierungsmethode vorbehalten bleiben.

(2) Struktureigenschaften

Zur Identifikation der Saccharidkomponente im Saccharidanteil der vorliegenden Substanz wurde eine 10 mg Probe der vorliegenden Substanz zur Methanolyse bei 100°C 16 h mit 3% Chlorwasserstoffsäure/Methanol vermischt und nach Trimethylsilierung nach üblichen Verfahren einer gaschromatografischen Analyse unterworfen. Die Ergebnisse zeigten, daß Glucose überwiegt und andere Saccharide, wie Mannose, Galactose, Xylose und Fucose nur einen geringen Anteil stellen.

Zur Sicherstellung der vorliegenden optischen Isomeren (D- oder L-Form) der Glucose als Hauptsaccharidkomponente im Saccharidanteil der vorliegenden Substanz wurden Glucosekristalle aus den Hydrolysaten der vorliegenden Substanz abgetrennt. Man fand, daß die abgetrennte Glucose einen Schmelzpunkt von 143 bis 145°C hatte und beim Mischen und Schmelzen mit einer Standard-D-Glucose keinen Schmelzpunktabfall zeigte. Damit war die Glucose im Saccharidanteil der vorliegenden Substanz als D-Glucose identifiziert.

Die Position der Glycosidverbindung wurde in der folgenden Weise bestimmt. Die Bindungsmuster für

wurden aus der Analyse der Monosaccharide bestätigt, die man nach der Periodatoxidationsmethode oder Smith'schen Zersetzungsmethode erhielt, und das Verhältnis der Häufigkeiten dieser Bindungen wurde aus Methylierungsversuchen nach der Haworth-Methode bestimmt. Die durch Hydrolyse der Methylierungsprodukte erhaltenen Saccharide wurden gaschromatografisch als Alditol-acetate und Methylglucoside identifiziert, ferner wurden zur Bestätigung die einzelnen Hydrolysate durch Säulenflüssigchromatografie isoliert und dann kristallisiert oder in kristalline Derivate umgewandelt.

Die molaren Verhältnisse der jeweiligen Bindungen in der vorliegenden Substanz sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei das molare Verhältnis der G¹→ Bindung als 1 gesetzt ist. Die molaren Verhältnisse in der Tabelle 2 wurden aus den Flächenverhältnissen der Gaschromatografie der Alditolacetate bestimmt.

Tabelle 2

Aus den Ergebnissen der obigen Tabelle kann ersehen werden, daß der Polysaccharidanteil der vorliegenden Substanz hauptsächlich aus α-(1→4)-Bindungen besteht, jedoch auch α-(1→3)-Bindungen und zahlreiche Verzweigungen im Polysaccharidanteil vorkommen. Dies kann als Hinweis genommen werden, daß die vorliegende Substanz eine Struktur aufweist, worin Seitenketten an die Glucanhauptketten mit α-(1→4)-Bindung gebunden sind, wobei Glucananteile mit α-(1→3)-Bindung von ähnlicher Struktur darin verstreut vorkommen.

Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polysaccharide beschrieben. Diese Polysaccharide, wie sie oben beschrieben sind, werden aus den Fruchtkörpern oder Mycelen der natürlich oder artifiziell kultivierten Pilze der Basidiomyceten von der Gattung Coriolus von Polyporaceae der Ordnung Aphyllophorales extrahiert.

Das zur Extraktion der erfindungsgemäßen Polysaccharide verwendete Ausgangsmaterial kann entweder aus natürlich oder künstlich kultivierten Fruchtkörpern oder Myceln bestehen, und im Fall der künstlichen Kultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums ist es möglich, alle Kulturprodukte einschließlich nicht nur der erzeugten Mycelien, sondern auch der Eluate im flüssigen Kulturmedium, als Extraktionsmaterial zu verwenden. Vom industriellen Standpunkt her ist es empfehlenswert durch Verwendung eines flüssigen Mediums alle Kulturen einschließlich der kultivierten Mycele zu verwenden. Das so erhaltene Material wird dann dem nächsten Extraktionsschritt unterzogen, kann gegebenenfalls jedoch nach einer geeigneten Trocknungsbehandlung, wie Lufttrocknung oder Gefriertrocknung, für den späteren Gebrauch aufbewahrt werden. Es wird bevorzugt, das Material vor dem Extraktionsschritt zu pulverisieren, da eine solche Behandlung den Extraktionseffekt erhöht. Die Extraktion des Materials wird unter Verwendung eines wäßrigen Lösungsmittels durchgeführt. Das hier verwendete wäßrige Lösungsmittel ist Wasser oder eine wäßrige Lösung einer geringen Menge, beispielsweise ca. 10% oder weniger, eines organischen Lösungsmittels, einer Säure oder Base, die in Wasser löslich sind. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende organische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol. Die hier verwendete Säure kann Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure und die Base Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Natriumcarbonat sein. Von diesen wäßrigen Lösungsmitteln werden Wasser und eine verdünnte Alkalilösung, insbesondere eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid der Konzentration im Bereich von 0,005 bis 2n, bevorzugt. Die Extraktion wird durchgeführt, indem man ein wäßriges Lösungsmittel, wie oben erwähnt, in einer Menge vom 5- bis 200-fachen der Menge (auf Trockenbasis) der als Extraktionsmaterial verwendeten Kultur bei einer Temperatur von gewöhnlich 50 bis 100°C über einen Zeitraum von 20 min bis 20 h verwendet. Eine Extraktionstemperatur von weniger als 50°C führt zu einer schlechten Extraktionsausbeute, so daß es im allgemeinen bevorzugt wird, die Extraktion bei einer Temperatur im Bereich von 80 bis 98°C durchzuführen. Die Anzahl der Extraktionsabläufe liegt üblicherweise unter 10, vorzugsweise bei 3 bis 8. Um einer Zersetzung von Wirksubstanzen vorzubeugen, ist es vorzuziehen, die gesamte Extraktionszeit auf weniger als 20 h zu begrenzen, unabhängig von der Anzahl der Extraktionsläufe. Andererseits ist es vom Standpunkt der Extraktionsausbeute her vorzuziehen, die Extraktion über mehr als 1 h durchzuführen. Das zur Extraktion verwendete Lösungsmittel wird aus der oben angeführten Gruppe gewählt, jedoch ist es nicht notwendig, nur eine Lösungsmittelart zu verwenden; in einigen Fällen werden sogar durch Verwendung von zwei oder mehreren Arten von Lösungsmitteln in Kombination, beispielsweise eine Kombination von Wasser und einer verdünnten Alkalilösung, bessere Ergebnisse erzielt.

Die besonders bevorzugte Extraktionsart dieser Erfindung besteht aus einer mehrstufigen Extraktion unter Verwendung einer verdünnten Alkalilösung oder einer Kombination von Wasser und einer verdünnten Alkalilösung, die durchgeführt wird, indem man allmählich die Konzentration der verdünnten Alkalilösung steigert. Diese Extraktionsmethode hat eine bedeutende Verbesserung der Extraktionsausbeute zum Ergebnis. Obwohl der Grund für diesen hohen Extraktionseffekt nicht genau bestimmt ist, nimmt man an, daß bei dieser Extraktionsart nicht nur eine bloße Elution der löslichen Substanzen aus dem Material stattfindet, sondern auch eine milde Zersetzung des Materials, welche die Extraktion der löslichen Wirksubstanzen fördert. Es wird daher angenommen, daß bei einem solchen mehrstufigen Extraktionsverfahren die Zersetzung, die die Extraktion der Wirksubstanz fördert, jedesmal stattfindet, wenn die Alkalikonzentration erhöht wird. Wird die Extraktion unter Verwendung einer von Anfang an hoch-konzentrierten Alkalilösung durchgeführt, so sinkt, obwohl die Extraktion stattfindet, die Ausbeute der gewünschten Substanz in folgenden Extraktionsgängen scharf ab. Dies hat vermutlich den Grund, daß die Fraktion (der gewünschten Substanzen), die durch die Extraktion erhalten werden sollen, aufgrund der harten Bedingungen eine umfangreiche Zersetzung erfahren, was eher zur Bildung der degenerierten oder nieder-molekularen Substanzen als der bevorzugten hoch-molekularen Polysaccharide führt.

Der nach dem oben genannten Extraktionsverfahren gewonnene flüssige Extrakt wird nach einem normalen Verfahren unter Verwendung einer Alkalie im Fall der Säureextraktion und einer Säure im Fall der Alkaliextraktion neutralisiert und einer Reinigungsbehandlung unterworfen. Die hier durchgeführte Reinigungsbehandlung soll den Extrakt von den darin enthaltenen nieder-molekularen Substanzen (Molekulargewicht kleiner als 5000) befreien und kann in Aussalzen, Dialyse, Ultrafiltration, Umkehrosmose, Gelfiltration oder Sedimentation unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels bestehen, wobei diese Techniken entweder für sich oder in Kombination angewendet werden können. Vom technischen Standpunkt wird unter Einsatz der Ultrafiltration, einer Membranseparationsmethode unter Druck, oder der Umkehrosmose, entweder für sich oder in Kombination bevorzugt, in einigen Fällen jedoch kann diese Reinigungsbehandlung nach einer vorherigen Aussalzbehandlung des Extrakts durchgeführt werden. Die Dialyse als Reinigungsbehandlung wird üblicherweise durch Verwendung einer Cellophanmembran, eines Kollodiondiaphragmas oder einer Cellulosemembran durchgeführt. Das für die Aussalzbehandlung verwendete Aussalzmittel kann Ammoniumsulfat, normales Salz, Kaliumchlorid oder Bariumcarbonat sein, wobei Ammoniumsulfat bevorzugt wird. Wird die Aussalzbehandlung durchgeführt, so wird sie gefolgt von Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Umkehrosmose oder einer ähnlichen Behandlung. Die Gelfiltration wird unter Verwendung einer mit Dextran oder Polyacrylamidgel beschickten Säule durchgeführt. In diesem Fall wird üblicherweise Sephadex® oder Biogel® verwendet. Ultrafiltration und Umkehrosmose sind beide Fraktionierungsmethoden, die unter Verwendung einer Membran unter Druck durchgeführt werden, üblicherweise von 0,4905 × 10 ^-4 bis 4.905 × 10^-4 bar (0,5 bis 5 kg/cm²) im ersten und 19.62 × 10^-4 bis 34.335 × 10^-4 bar (20 bis 55 kg/cm²) im letzteren Fall. Im Fall der Sedimentation verwendet man im allgemeinen ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Aceton. Gegebenenfalls kann zusammen mit einer oben erwähnten Behandlung auch eine Ionenaustauschbehandlung durchgeführt werden.

Die oben erwähnte Reinigungsbehandlung in dieser Erfindung ist deshalb von wesentlicher Bedeutung, weil die niedermolekulare Fraktion oder die Substanz mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000, die durch die Behandlung aus dem Extrakt freigesetzt wird, fast keine inhibitorische Wirkung gegen solide Sarcoma-180-Tumoren bei der i. p.-Verabreichung an Mäuse aufweisen und dann diese Fraktion außerdem etwas bitter ist und einen Garuch aufweist. Daher ist die Gegenwart dieser nieder-molekularen Fraktion bezüglich der pharmazeutischen Potenz der gewünschten Polysaccharidsubstanz dieser Erfindung nicht wünschenswert.

Die durch die oben genannte Reinigungsbehandlung erhaltene Flüssigkeit wird in einer Konzentration von 1 bis 20%, vorzugsweise 3 bis 10%, eingestellt und dann mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird gesammelt. Dieser Niederschlag wird dann wieder in Wasser gelöst und der Dialyse, Ultrafiltration oder Umkehrosmose unterworfen. Nach Einstellen der Konzentration auf 5 bis 10% läßt man diese Lösung über eine DEAE-Cellulose®-Säule laufen, so daß die stickstoffhaltige Komponente absorbiert und abgetrennt wird, und das erhaltene Eluat wird, gegebenenfalls nach Wiederholen dieses Arbeitsgangs, konzentriert und getrocknet. Man erhält so die gewünschte Polysaccharidsubstanz, die weiß, geschmack- und geruchlos ist.

Im folgenden wird die Antitumorwirkung der erfindungsgemäßen Polysaccharidsubstanz durch Angabe der Ergebnisse verschiedener Tierversuche beschrieben.

Akute Toxizität Akute Toxizität für Mäuse und Ratten

Für diesen Versuch wurden 4 bis 5 Wochen alte ICR-JCL-stämmige Mäuse mit einem Gewicht von 21 bis 24 g und 4 bis 5 Wochen alte Donryu-stämmige Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 150 g. Die erfindungsgemäße Substanz wurde auf die folgenden vier Arten verabreicht: intravenös (i. v.), subcutan (s. c.), intraperitoneal (i. p.) und oral (p. o.). Beobachtet wurden allgemeine Symptome, Tod und Körpergewicht über einen Zeitraum von 7 Tagen nach Verabreichung der Substanz. Nach dem Ende dieser Beobachtungsperiode wurden die Tiere getötet und autoptisch begutachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt. Weder bei Ratten noch bei Mäusen konnte selbst bei Verabreichung der Maximaldosis der Substanz der Tod herbeigeführt werden, und es war praktisch unmöglich, den numerischen Wert der LD₅₀ zu berechnen.

Tabelle 3

Antitumorwirkung

Der Antitumoreffekt der erfindungsgemäßen Substanzen wurde nach einer üblichen, unten ausgeführten Methode bestimmt.

Sarcoma-180-Tumorzellen wurden in die Peritonealhöhlen von Mäusen implantiert und nach dem Zeitraum von 7 Tagen, währenddessen ein hinreichendes Wachstum der Tumorzellen stattfand, wurden 10⁶ Zellen unter die Axillarhaut von weiteren 10 Mäusen zur Ausbildung solider Tumoren implantiert. Die pulverisierte erfindungsgemäße Substanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und den Mäusen, beginnend 24 h nach Implantation, verabreicht. Im Fall der Verabreichung i.p. wurde die Substanz in einer Dosis von 10 mg/kg oder 0,2 ml/20 g (Körpergewicht Mäuse) einmal alle 2 Tage insgesamt 10-mal verabreicht, im Fall der Verabreichung p.o. in einer Dosis 1000 mg/kg oder 0,2 ml/20 g (Körpergewicht Maus) einmal täglich insgesamt 20mal. 25 Tage nach Implantation wurden die Tumoren enukleiert und die Tumorwachstums-Hemmrate aus dem Durchschnittsgewicht der Tumoren in der behandelten Gruppe und dem Durchschnittsgewicht der Tumoren der Kontrollgruppe berechnet. Die Ergebnisse sind in der unten aufgeführten Tabelle 5 gezeigt. Die erhaltenen Testergebnisse aus den oben ausgeführten Messungen zeigen eine ausgezeichnete Antitumorwirkung der vorliegenden Substanz nicht nur bei der i.p.- Verabreichung, sondern auch bei oraler Anwendung. Die im Versuch verwendeten Proben der vorliegenden Substanz wurden aus den Extrakten der Kulturen der in der Tabelle 4 gezeigten Pilzarten hergestellt.

Tabelle 4

Antitumoreffekt in vivo gegen implantierte Tumoren in (ICR-JCL) Mäusen

Wie die obigen Versuchsergebnisse zeigen, kann die vorliegende Substanz sowohl oral als auch intraperitoneal verabreicht werden.

Eine der besonderen Eigenschaften ist, daß sie keine Allergenwirkung hat, da sie keine Proteine enthält, was eine sichere Injektion etc. zur Folge hat. Außerdem wird die Tatsache, daß die Ergebnisse der Versuche an Säugetieren auf Menschen angewandt werden können, in der Literatur deutlich aufgezeigt (Akio HOSHI und Kazuo KURETANI, Farumashia, 9, 464-468 (1973)). Entsprechend liegt im Fall der oralen Verabreichung bei der Behandlung von Karzinomen des Gastro-intestinal-trakts, wie Ösophaguskarzinom, Magenkarzinom, Colonkarzinom und Rektumkarzinom, Karzinomen der Kopf- und Halsgegend, Mammakarzinom, Bronchialkarzinom, malignen Lymphomen und anderen Tumoren bei erwachsenen Patienten die Normaldosis, obwohl sie in Abhängigkeit von der Zahl von Verabreichungen variiert, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 3 g pro Tag und für die Verwendung als Injektion beträgt die Normaldosis vorzugsweise nicht mehr als 500 mg.

Wird die Substanz für die orale Verabreichung in feste Zubereitungsformen gebracht, wie Tabletten, Körnchen, Pulver oder Kapseln, so kann die Mischung ein Bindemittel, Einschlußmittel, Formmittel, Gleitmittel, Desintegrator, Netzmittel und andere entsprechende Zusätze enthalten. Die Substanz kann auch in flüssige Zubereitungen zur Verwendung p.o. gebracht werden, wie innerliche flüssige Arzneimittel, Schüttelmixturen, Suspensionen, Emulsionen und Sirupe, oder sie kann in Form eines trockenen Produkts sein, das vor Verwendung aufgelöst wird. Solche flüssigen Zubereitungen können die normalerweise verwendeten Arten von Zusätzen oder Konservierungsstoffen enthalten.

Die Zubereitungen zur Injektion können auch einen Zusatz oder Zusätze wie Stabilisator, Puffer, Konservierungsmittel und Isotonisierungsmittel enthalten und sie können in Form von Ampullen geliefert werden, die eine Einheitsdosis der Substanz enthalten oder in Form von Behältern, die Mehrfachdosen der Substanz enthalten. Die Injektionsmischungen können in Form einer wäßrigen Lösung, Suspension, Lösung oder Emulsion in einem öligen oder wäßriger Träger hergestellt werden und die Wirksubstanz kann in Form von Pulver geliefert werden, das bei Verwendung in einem geeigneten Träger, wie pyridinfreiem sterilem Wasser, wieder gelöst wird.

Wie oben erwähnt, liefert die erfindungsgemäße Polysaccharidsubstanz einen ausgezeichneten Effekt, wenn sie als Antitumormittel zur oralen Verabreichung verwendet wird. Die vorliegende Substanz hat auch immunpotenzierende Wirkung beim Empfänger und ist zur Verhütung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie und zur Erhöhung der Empfindlichkeit bei der Radiotherapie wirksam. Ferner ist die vorliegende Substanz für die Verhinderung an Immunsuppression oder Verminderung der physischen Kraft der Patienten sowie zum Schutz des Patienten gegen virale oder bakterielle Infektionen, für die der Patient aufgrund der herabgesetzten Immunität empfänglich ist, brauchbar. Andere wichtige Effekte der vorliegenden Substanz bei oraler Verabreichung sind Verbesserung der Leberfunktion, Heilung von intestinalen Beschwerden und Diureseförderung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein CM-103-Stamm von Coriolus versicolor (FERM-P Nr. 2414) der Gattung Corilus wurde in einen konischen 200 ml-Kolben mit 30 ml eines aus 5% Glucose, 0,2% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄·7 H₂O bestehenden Mediums inokuliert und einer 10-tägigen stationären Kultur bei 25 bis 27°C unterzogen. Das auf der Oberfläche des Mediums gewachsene Mycel wurde mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und so das Impfmedium hergestellt.

20 l des aufgeschlämmten Impfmediums wurden in 1600 l eines aus 10% Glucose, 1,5% Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄·7 H₂O bestehenden Mediums in einem vertikalen 2 m³- Fermenter inokuliert und bei einer Belüftungsrate von 0,5 l pro min pro Liter Medium, einer Rührgeschwindigkeit von 150 min^-1, bei einer Temperatur von 26°C über 7 Tage kultiviert. Die so erhaltene Brühe wurde in 500 l Portionen aufgeteilt und jede Portion wurde in einem Doppeltrommeltrockner getrocknet, so daß man ungefähr 30 kg Trockenprodukt erhielt. 100 g des Trockenproduktes wurden mit 3 ml Wasser in eine 5 l-Kolben mit einem Rührer gegeben und 3 h unter ständigem Rühren bei einer Innentemperatur von 95 ± 2°C gehalten. Dann wurde die Lösung nach Abkühlen in Mycelrückstand und Extratlösung getrennt. Der Mycelrückstand wurde mit ungefähr 1 l Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung gemischt, bei einem Volumen von ca. 3,5 l.

Der Mycelrückstand wurde mit 2 l 0,1 n Natriumhydroxidlösung versetzt und in der oben beschriebenen Weise einer 2-stündigen Extraktion bei 95 ± 2°C unterworfen, gefolgt von Abkühlen, Neutralisation mit 2 n Salzsäure und Auftrennung in Extraktlösung und Mycelrückstand mit Hilfe einer Absaugfiltration. Nach der Abtrennung wurde der Rückstand mit etwa 0,5 l Wasser gewaschen und mit der Extraktlösung vermischt, so daß man 2,2 l Extraktlösung erhielt. Die gleiche Behandlung wurde jeweils mit 2 l 0,2 n, 0,3 n und 0,4 n Natriumhydroxidlösung unter Verwendung von 0,5 l Waschwasser wiederholt, wobei man ca. 7,2 l Extraktlösung erhielt.

Die so erhaltene Extraktlösung wurde unter Verwendung eines Ultrafilters Amicon®2000 Banktyp (mit einer DM-5 Membran) unter einem Betriebsdruck von 1,4715 × 10^-4 bar (1,5 kg/cm²) und bei einer Temperatur von 10°C unter Rühren und Kühlung behandelt, wobei die nieder-molekularen Substanzen und Neutralsalze eliminiert wurden, worauf man 200 ml Flüssigkeit erhielt.

Die so erhaltene Flüssigkeit wurde mit 160 g Ammoniumsulfat versetzt und der erzeugte Niederschlag wurde gesammelt. Dieser Niederschlag wurde dann in Wasser gelöst und unter Verwendung des oben genannten Amicon Ultrafilters entsalzt, wobei man 190 ml Flüssigkeit erhielt. Diese Flüssigkeit ließ man über eine DEAE-Cellulose®-Säule (OH-Form) von 10 cm Durchmesser und 100 cm Länge zur Adsorption und Entfernung der in der Flüssigkeit enthaltenen stickstoffhaltigen Stoffe laufen und eluierte mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 l Eluat. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde auf einem Rotationsverdampfer auf 180 ml eingeengt und dann nochmals über die DEAE-Cellulose-Säule geschickt. Das schließlich erhaltene Eluat wurde ein weiteres Mal mit dem Rotationsverdampfer konzentriert und gefriergetrocknet, so daß man schließlich 3,0 g der gewünschten Polysaccaridsubstanz in Pulverform erhielt.

Die Eigenschaften dieser Substanz wurden nach den folgenden Methoden bestimmt, ebenso wurden Tierversuche gemäß der unten angeführten Beschreibung mit dieser Substanz durchgeführt.

(1) Bestimmung der Eigenschaften IR-Spektrum

Ein IR-Absorptionsspektrum der erhaltenen pulverigen Substanz, bestimmt in einem Kaliumbromidpreßling, ist in Fig. 1 gezeigt. Der dabei verwendete Preßling wurde durch Vermischen von 1 g Kaliumbromid und etwa ¹/₃ bis ½ Spatel der Probe nach einem üblichen Verfahren hergestellt. Man fand eine Absorption bei 3600 bis 3200 cm^-1, 2920 bis 2900 cm^-1, 1660 bis 1610 cm^-1, 1460 cm^-1, 1410 cm^-1, 1360 cm^-1, 1230 cm^-1, 1150 cm^-1, 1080 cm^-1, 1060 bis 990 cm^-1, 925 cm^-1, 840 cm^-1, 755 cm^-1 und 705 cm^-1. Die Absorption bei 840 cm^-1 kann einer Saccharid-α-Bindung zugeordnet werden. Dies bestätigt die Tatsache, daß die vorliegende Substanz aus α-gebundenen Glucosiden besteht.

Spezifische Aktivität

Optische Aktivität wurde mit der Na_D (589 µm)-Linie bei Verwendung einer 0,25%igen wäßrigen Lösung der Probe und einer 5 cm Zelle bestimmt und aus der Drehung α die spezifische optische Aktivität [α] berechnet.

NMR-Absorptionsspektrum

Das NMR-Spektrum wurde mit DSS als internem Standard unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel aufgenommen. Die in der Tabelle aufgeführten numerischen Werte sind die Werte nach Korrektur unter der Annahme einer Lorenz-Kurve zur Elimination des Einflusses von Leichtwasserrückständen im schweren Wasser.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Substanz wurde mit der Ultrazentrifugationsmethode bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß das Molekulargewicht aller geprüften Proben im Bereich von 5000 bis 300 000 liegt. Die Messungen wurden mit Anwendung von Sedimentationsgleichgewicht und Dichtegradienten unter Verwendung eines optischen Interferenzsystems ausgewertet. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Probenkonzentration 0,3%; Lösungsmittel M/10M KCl; Temperatur 25°C; Flüssigkeitssäule 1,7 mm; Geschwindigkeit 22 000 min^-1; Meßzeit 5 h.

(2) Monosaccharidkomponenten des Polysaccharids

Die Monosaccharidkomponenten der vorliegenden Substanz wurde auf folgende Weise analysiert: 3 mg Probe wurde in eine Glasampulle gegeben und man füllte 10 ml 3%ige HCl/Methanol für die Methanolyse bei 100°C über 16 h zu. Dann wurde die Chlorwasserstoffsäure mit Silbercarbonat neutralisiert und bei Raumtemperatur filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und zur Trockne eingedampft und dann in 0,5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan gemischt und das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur zur Trimethylsilierung stehengelassen. Danach wurde das Gemisch in Chloroform gelöst und nach Entfernung des überschüssigen Reagenz durch Waschen mit Wasser wurde die erhaltene Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und gaschromatografisch analysiert. Die Ergebnisse der Analyse zeigten, daß Glucose mehr als 99% der Saccharidkomponente der vorliegenden Substanz ausmacht und daß andere Saccharide, wie Mannose, Galactose, Xylose und Fucose nur spärlich vorhanden sind.

Um zu erfahren, ob die Glucose als Hauptbestandteil des Saccharidanteils der vorliegenden Substanz in der D- oder L-Form vorliegt, wurde sie vom Hydrolysat der Substanz durch eine Säule abgetrennt und ihr Schmelzpunkt bestimmt. Er lag bei 143 bis 145°C. Diese Glucose zeigte keinen Schmelzpunktabfall, wenn sie mit einem D-Glucose-Standard gemischt und zum Schmelzen gebracht wurde. Hieraus wurde die Glucose der vorliegenden Substanz als D-Glucose identifiziert.

(3) Saccharidbindungsmuster

Das Muster der Saccharidbindung in der vorliegenden Substanz wurde nach der Methode von Haworth bestimmt. 2 g Probe wurden in 10 ml 1 n NaOH-Lösung gelöst und während das Gemisch im Stickstoffstrom unter heftigem Rühren bei 40 bis 50°C gehalten wurde, wurden 20 ml Dimethylschwefelsäure und 40 ml 30%ige Natriumhydroxidlösung über einen Zeitraum von einigen Stunden zugetropft. Nachdem man das Gemisch über Nacht stehengelassen hatte, wurde es einer ähnlichen Behandlung mit der gleichen Menge von Methylierungsmittel unterworfen. Die Reaktionslösung wurde nach der Neutralisation in fließendem Wasser dialysiert und das Dialysat unter vermindertem Druck konzentriert und 3mal der oben beschriebenen Methylierungsbehandlung unterworfen. Nach zusätzlicher Neutralisation und Dialyse wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml eines Chloroform-Methanol (10 : 1)-Gemisches gelöst und man gab ein Petrolether-Ether-Gemisch (1 : 1) zur Ausfällung der methylierten Substanz zu. Dann wurden ungefähr 20 mg der methylierten Substanz mit 1 n Schwefelsäure bei 100°C über 16 h hydrolysiert und das Hydrolysat wurde nach einem üblichen Verfahren zu Alditol-acetaten umgesetzt. Aus der Peak- Fläche der gaschromatografischen Kurve wurde das Molverhältnis bestimmt. Zur Unterscheidung zwischen 2,3,6-Tri-O-Me-G und 2,3,4-Tri-O-Me-G wurden 20 mg der methylierten Substanz der Methanolyse bei 100°C über 16 h in einem verschlossenen Röhrchen unter Verwendung von 3% HCl-Methanol der Methanolyse unterworfen. Bei der gaschromatografischen Analyse des Methanolyseprodukts wurde keine 2,3,4-Tri-O-Me-G gefunden. Zur Bestätigung dieses Befundes wurden jeweils die zersetzten Produkte gaschromatografisch unter Verwendung eines Standards identifiziert, während jedes Hydrolysat mit Hilfe einer Säulenflüssigchromatografie und jeweils entweder nach Kristallisation oder Umsetzung zu einem kristallinen Derivat isoliert wurde.

Die Eigenschaften, Strukturcharakteristika und antitumorwirkungen der so erhaltenen Polysaccharidsubstanzen dieser Erfindung sind zusammengefaßt in Tabelle 6.

Beispiel 2

Die Impfmedien aus den Stämmen Coriolus consors (FERM-P Nr. 988), Coriolus pargamenus (FERM-P. Nr. 2712) und Coriolus hirsutus (FERM-P. Nr. 2712) der Gattung Coriolus aus der Klasse der Basidiomyceten wurden in derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Pepton\|3 g
Hefeextrakt	5 g
Kaliumdihydrogenphosphat	0,1 g
Kaliumhydrogenphosphat	0,1 g
Magnesiumsulfat (Heptahydrat)	0,05 g
Glucose	20 g
Malzextrakt	10 g
Wasser	1 l
pH	6,0

Jeweils 200 ml des oben aufgeführten Mediums wurden in 400 Kulturflaschen (Volumen 1 l) pipettiert und in jedes Medium wurde 1 ml des Impfmediums inokuliert, gefolgt von einer 25tägigen Inkubation bei 25 bis 30°C und Trocknung, wobei man 980 g trockenes Mycel von Coriolus consors, 1200 g von Coriolus pargamenus bzw. 1500 g von Coriolus hirsutus erhielt.

Dann wurden 100 g der so erhaltenen trockenen Mycelien jedes Stammes und 2 l 0,4 n Natriumhydroxidlösung in einem Extraktionsgefäß mit Heiz- bzw. Kühlmantel und Rührer gegeben und einer 2stündigen Extraktion unter Rühren und Einstellung der Manteltemperatur auf eine Innentemperatur im Gefäß von 90 bis 95°C gegeben. Der erhaltene Extrakt wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann portionsweise mit 2 n Salzsäure unter Rühren versetzt und nach Einstellung des pH auf einen Wert von 7 mit einem Zentrifugenseparator in Extraktlösung und Mycelrückstand aufgetrennt.

Der Mycelrückstand wurde dann mit 2 l 0,4 n Natriumhyxdroxidlösung versetzt und einer ähnlichen 2stündigen Extraktion bei 90 bis 95°C, gefolgt von Abkühlen, Neutralisation und Zentrifugation, unterworfen, so daß man eine Extraktlösung und Mycelrückstand erhielt. Letzterer wurde einem weiteren ähnlichen, 1stündigen Extraktionsvorgang mit 0,4 n Natriumhydroxidlösung unterworfen, dann abgekühlt, neutralisiert und durch Zentrifugation in Extraktlösung Mycellösung aufgetrennt. Letztere wurde nochmals einer 1stüngigen Extraktion mit 0,4 n Natriumhydroxidlösung unterworfen, gekühlt, neutralisiert und zentrifugiert.

Die insgesamt vier Extraktionsläufe ergaben ca. 8,4 l Extraktlösung. Diese Extraktlösung wurde auf einem Volumen von 3 l eingeengt, dann in einen Celluloseschlauch zur Dialyse (Visking®-Schlauch) gegeben und einer 6tägigen Dialyse mit fließendem Leitungswasser unterworfen. Die Lösung im Schlauch wurde auf 190 ml Flüssigkeit konzentriert.

Die so erhaltene konzentrierte Flüssigkeit wurde dann mit 160 g Ammoniumsulfat versetzt und der erzeugte Niederschlag wurde gesammelt, in Wasser gelöst und einer weiteren 6tägigen Dialyse mit dem Visking®-Schlauch unterworfen. Die Lösung im Schlauch wurde auf 410 ml konzentriert.

Diese konzentrierte Flüssigkeit wurde wie in Beispiel 1 behandelt, d. h. über eine DEAE-Cellulose®-Säule zur Absorption und Entfernung der in der Flüssigkeit enthaltenen stickstoffhaltigen Komponente geführt und die erhaltene Lösung wurde mit dem Rotationsverdampfer eingeengt und getrocknet, so daß man schließlich die gewünschten Polysaccharidsubstanzen in trockener Pulverform in einer Menge von 6,0 g aus Coriolus consors (FERM-P Nr. 988), 6,5 g aus Coriolus pargamenus (FERM-P Nr. 2712) bzw. 5,5 g aus Coriolus hirsutus (FERM-P No. FERM-P Nr. 2711) erhielt. Die Eigenschaften der erhaltenen Substanzen, Ergebnisse von Tierversuchen, IR-Absorptionsspektren, NMR- Absorptionsspektren, Molekulargewicht, spezifische optische Aktivität, Saccharidkomponente und Saccharidbindungsmuster sind zusammen mit denen des Produkts aus Beispiel 1 in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Beispiel 3

Es wurden folgende Versuche a) und b) durchgeführt:

a) Versuch zur Ermittlung der Antitumoraktivität der Produkte der GB-PS 13 31 513 sowie gemäß vorliegender Erfindung durch intraperitoneale Verabreichung an Mäuse Testmethode

Eine Maus aus dem ICR-JCL-Stamm, die 20 g wog, wurde intraperitoneal mit Sarkom-180-Tumorzellen beimpft. Nach einer Woche, nachdem eine ausreichende Erhöhung der Ascitisflüssigkeit in der Maus beobachtet worden ist, wurden 1 × 10⁶ Zellen des Sarkom-Tumors der Maus subkutan auf die Achselhöhlen einer anderen Gruppe von Mäusen des gleichen Stammes transplantiert, wobei eine Gruppe aus 10 Mäusen bestand. An die Gruppe 1 wurde nur eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht, die zu Vergleichszwecken verwendet wurde. An die andere Gruppe von Mäusen wurden die zu testenden Polysaccharide verabreicht, die in der gleichen vorstehend erwähnten physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst waren, und zwar in verschiedenen Konzentrationen oder in verschiedenen Volumina, wobei die kalkulierten Dosen bei einer einzigen Verabreichung sowie die Gesamtdosen des Produktes gemäß der GB-PS 13 31 513 sowie gemäß vorliegender Erfindung in der Tabelle I zusammengefaßt sind.

Die erste Verabreichung der Polysaccharids wurde intraperitoneal 1 Woche nach der Transplantation durchgeführt, worauf die anschließenden Verabreichungen neunmal an jedem folgenden Tag wiederholt wurden. Der Tumor, der durch die transplantierten Tumorzellen auf den Mäusen gebildet wurde, wurde Tag für Tag beobachtet. 5 Tage nach der letzten Verabreichung des Polysaccharids (10. Verabreichung) wurde die durchschnittliche Körpergewichtszunahme der Mäuse einer jeden Gruppe bestimmt. Dann wurden die Mäuse getötet und autopsiert, um Nebenwirkungen zu ermitteln. Das Gewicht des aus den Mäusen herausgeschnittenen Tumors wurde bestimmt. Die Körpergewichte der einzelnen Mäuse zeigten keine merklichen Unterschiede. Es waren auch keine Nebenwirkungen zu beobachten.

Die "Hemmrate", deren Werte in den folgenden Tabellen I und II zusammengefaßt sind, wurde gemäß der folgenden Formel errechnet:

worin das durchschnittlichen Gewicht (g) des Tumors bzw. der Tumore, herausgeschnitten aus den einzelnen Mäusen der Vergleichsgruppe, bedeutet, und das durchschnittliche Gewicht (g) des bzw. der Tumore darstellt, herausgeschnitten aus den einzelnen Mäusen aus der Gruppe von Mäusen, die mit den jeweiligen Polysacchariden behandelt worden sind.

Tabelle I

Wie aus der Tabelle I hervorgeht, bewirkt das erfindungsgemäße Produkt eine Hemmrate von 100%, was mit anderen Worten bedeutet, daß es eine vollständig Antitumoraktivität bei einer einzelnen Dosis von nur 100 mg/kg Körpergewicht der Maus bewirkt (die gesamte Dosis beträgt nur 1000 mg/kg), während das Produkt gemäß der GB-PS 13 31 513 nur eine Hemmrate von 90% bei einer einzelnen Dosis von 100 mg/kg bewirkt und eine vollständige Hemmung beim erstenmal bedingt, wenn eine große Einzeldosis von 300 mg/kg (Gesamtdosis 3000 mg/kg) verabreicht wird.

Im Hinblick auf die vollständige Hemmung der Ausbreitung des transplantierten Tumors, und zwar der Sarkom-180-Zellen, ist die Aktivität des erfindungsgemäßen Produktes um das dreifache größer als diejenige des Produktes der GB-PS 13 31 513.

b) Versuch bezüglich der Antitumoraktivität des Produktes der GB-PS 13 31 513 sowie des erfindungsgemäßen Produktes durch orale Verabreichung an Mäuse Testmethode

Eine Maus des ICR-JCL-Stammes, die 20 g wiegt, wurde interaperitoneal mit Sarkom-180-Tumorzellen beimpft. Nach einer Woche, wenn eine ausreichende Vervielfältigung der Zellen festgestellt wurde, wurden 1 × 10⁶ Zellen des Sarkom-Tumors der Mäuse subkutan auf die Achselhöhlen von anderen Mäusegruppen des gleichen Stammes transplantiert, wobei eine Gruppe aus 10 Mäusen bestand. Die orale Verabreichung des erfindungsgemäßen Produktes sowie das Produkt der GB-PS 13 31 513 begann 24 Stunden nach der Transplantation. Jedes Produkt wurde täglich einmal pro Tag während 20 aufeinanderfolgender Tage in zwei Dosen von 500 und 1000 mg/kg Körpergewicht verabreicht.

Am 25. Tag nach der Transplantation wurde der Tumor aus jeder Maus herausgeschnitten und sein Gewicht bestimmt. Die Hemmrate wurde gemäß folgender Formel errechnet, wobei die Ergebnisse in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt sind:

wobei das durchschnittliche Gewicht (g) der aus den jeweiligen Vergleichsmäusen herausgeschnittenen Tumoren bedeutet (Mäuse, in welche Tumorzellen transplantiert worden sind, an die jedoch nicht das Produkt verabreicht worden ist), während das durchschnittliche Gewicht (g) der aus einer jeden Maus einer jeden Gruppe herausgeschnittenen Tumore wiedergibt, an welche das Produkt verabreicht worden ist.

Tabelle II

Aus den vorstehenden Ergebnissen, die bei einer oralen Verabreichung erzielt wurden, geht hervor, daß das erfindungsgemäße Produkt ungefähr 1,2 mal wirksamer ist als das Produkt der GB-PS 13 31 513.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist demnach zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Produkt dem aus der GB-PS 13 31 513 bekannte Produkt in überraschender Weise deutlich überlegen ist.

Claims

1. Polysaccharid mit folgenden Eigenschaften:

A) Molekulargewicht von 5.000 bis 300.000, bestimmt durch Ultrazentrifugation;
B) positive Farbreaktionen: α-Naphthol-Schwefelsäurereaktion, Indol-Schwefelsäurereaktion, Anthron- Schwefelsäurereaktion, Phenol-Schwefelsäurereaktion und Tryptophan-Schwefelsäurereaktion,
C) Elementaranalyse: 43,5 bis 45,3% Kohlenstoff, 5,7 bis 6,7% Wasserstoff und als Rest Sauerstoff,
D) spezifische optische Aktivität [α]= 70 bis 180,
E) spezifische IR-Absorption bei 840 cm^-1,
F) Verschiebungen im NMR-Spektrum bei 3,7 ± 0,1 ppm, 3,8 ± 0,1 ppm, 5,0 ± 0,1 ppm und 5,4 ± 0,1 ppm,
G) Löslichkeit: in Wasser lösliche, jedoch in Pyridin, Chloroform und Hexan unlöslich,
H) der Saccharidanteil ist im wesentlichen aus α-gebundener D-Glukose aufgebaut,
I) mit nachfolgendem Bindungsmuster im angegebenen molaren Verhältnis (bezogen auf G¹→Bindungen, bestimmt aus Methylierungsversuchen nach der Haworth- Methode) erhältlich dadurch, daß man in an sich bekannter Weise Myceln und/oder Fruchtkörper von den Pilzen Coriolus versicolor (FERM-P Nr. 2414), Coriolus consors (FERM-P Nr. 988), Coriolus hirsutus (FERM-P Nr. 2711) und Coriolus pargamenus (FERM-P Nr. 2712) mit einer 0,005 bis 2 n wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid extrahiert, wobei man die Extraktion stufenweise mit Alkalilösungen mit allmählich ansteigender Konzentration durchführt, die erhaltene Extraktionslösung nach Entfernen der niedrigmolekularen Substanz mit Molekulargewichten von weniger als 5.000 durch Ultrafiltration, Umkehrosmose oder einer Kombination dieser Maßnahmen durch Zusatz von Ammoniumsulfat sättigt, den erhaltenen Niederschlag sammelt und in Wasser löst, die erhaltene Lösung aussalzt, über eine mit Ionenaustauscher beschickte Säule zur Absorption und Entfernung der stickstoffhaltigen Substanzen leitet, die erhaltene Lösung dann konzentriert und trocknet.

2. Antitumormittel, enthaltend als Wirkstoff ein Polysaccharid gemäß Anspruch 1.