DD296081A5 - Verfahren zur herstellung antibiotischer verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung antibiotischer Verbindungen. Es handelt sich dabei um die Desxylosylderivate der antibiotischen Verbindungen BU-3608, BU-3608 C, D und E. Die erfindungsgemaesz erhaeltlichen Verbindungen koennen als Antifungus-Mittel eingesetzt werden.{Verfahren; Herstellung; antibiotische Verbindungen; Antifungus-Mittel; Desxylosyl-Derivate; Zwischenprodukte}

Description

CONHCHCO₂H CH₃

R¹ und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R² fur eine D-Xylosylgruppe steht, in einer Mineralsaure bei geeignetem pH-Wert der Lösung eine bestimmte Zeit auf eine Temperatur erhitzt, die ausreicht, um die ß-D-Xylosylgruppe abzuspalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung, worin R¹ und R³ beide ein Wasserstoffatom bedeuten, oder ein pharmazeutisch vertragliches Salz davon herstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung, worin R¹ ein Wasserstoffatom und R³ eine Methylgruppe bedeuten, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon herstellt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung, worin R¹ eine Methylgruppew und R³ ein Wasserstoffatom bedeuten, oder ein pharmazeutisch vertragliches Salz davon herstellt.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Bei den erfindungsgemaß erhältlichen Verbindungen handelt es sich um Desxylosylderivate des antibiotischen BU-3608-Komplexes Diese Verbindungen stellen antifungale Wirkstoffe dar bzw besitzen eine gegen Pilze gerichtete Aktivität und können als Ausgangsverbindungen zur Herstellung der entsprechenden N-Alkylderivate verwendet werden, welche sich durch eine erhöhte Wasserloslichkeit auszeichnen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Fermentation sowie die Isolierungs- und Reinigungsverfahren fur die Antibiotika BU-3608, BU-36088 und BU-3608C sind ausführlich in der Europaischen Patentanmeldung EP-A-88101410 beschrieben Die Isolierungs- und Reinigungsverfahren fur die Antibiotika BU-3608D und BU-3608 E sind in der Europaischen Patentanmeldung EP-A-89110234 beschrieben Auf diese

Anmeldungen wird hiermit Bezug genommen Die Strukturen der oben aufgeführten Antibiotika entsprechen den nachstehend bezeichneten Formeln la bis Ie

R¹ I

CONHCHCO₂H

H-, C

la Ib Ic Id Ie

BU-3608, R¹ = CH₃, R² = D-Xylosyl, R³ = CH₃ BU-3608B, R¹ = CH₃, R² = H, R³ = CH₃ BU-3608C, R¹ = CH₃, R² = D-Xylosyl, R³ = H BU-3608D, R¹ = H, R² = D-Xylosyl, R³ = CH₃ BU-3608E, R¹ = H, R² = D-Xylosyl, R³ = H

Die Verbindung BU-3608 besitzt jedoch nur eine geringe Wasserloslichkeit

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung war es, neue Zwischenprodukte bereitzustellen, aus denen Derivate der Verbindungen des BU-3608 Komplexes hergestellt werden konnen, welche eine erhöhte Wasserloslichkeit aufweisen

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Desxylosyl-Derivaten der verschiedenen Komponenten des antibiotischen BU-3608-Komplexes bereitzustellen

Gelost wird diese Aufgabe durch Bereitstellung eines Herstellungsverfahren fur Desxylosyl-Derivate von BU-3608C (lila), BU-3608D (III b) und BU-3608E (lllc), sowie der pharmazeutisch vertraglichen Salze davon

lila	R1 =	CH3, R3	= H
IUb	R1 =	H, R3 =	CH3
lllc	R1 =	H, R3 =	H

Die Antibiotika BU-3608, BU-3608 B, BU-3608C, BU 3608Dund BU-3608 E werden als Ausgangsverbindungen fur die Herstellung des erfindungsgemaß erhältlichen Verbindungen eingesetzt und konnen durch Kultivieren eines ein Antibiotikum produzierenden Stammes von Actinomadura hibisca sp nov hergestellt werden Die Actinomadurahibisca Stamme Nr P157-2 und Q278-4 wurden bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) hinterlegt Diesen Stammen wurden die Nummern ATCC 53557 bzw ATCC 53646 zugeteilt Ein Mutantenstamm, der aus dem Stamm P157-2 durch Behandeln mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) erhalten wurde, produziert die D- und E-Komponentn in größeren Anteilen als sowohl der P157-2-Stamm oder der Q278-4-Stamm Dieser als A2660 bezeichnete Mutantenstamm wurde ebenfalls bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC 53762 BU-3608 B ist das Desxylosyl-Derivat von BU-3608

BU-3608B, Desxylosyl-BU-SöOSC, D und E kann man herstellen, indem man BU-3608, BU-3608C, D bzw E in Chlorwasserstoffsaure solange erhitzt, bis dieXylosegruppe abgespalten wird und den pH-Wert der Losung derart einstellt, daß das gewünschte Produkt ausfallt

Die Aminogruppe von BU-3608, BU-3608C, D und E und die entsprechenden Desxylosyl-Derivate kann man mittels reduktiver Alkylierung alkylieren, wobei man zuerst die antibiotische Ausgangsverbindung mit einem Aldehyd oder einem Keton zu einem Imin umsetzt und anschließend das so gebildete Imin reduziert Die Kondensation und Reduktion kann man in dem gleichen Reaktionsgefaß in einer Stufe oder in zwei Stufen durchfuhren Die primäre Amingruppe von BU-3608C, E oder die Desxylosyl-Derivate kann man in ein tertiäres Amin mit zwei identischen Alkylgruppen überfuhren, indem man mit mindestens zwei Äquivalenten der Carbonylverbindung, bezogen auf das Antibiotikum, behandelt und anschließend reduziert Em tertiäres Amin mit zwei verschiedenen Alkylsubstituenten kann man erhalten, indem man eine bestimmte Menge eines ersten Carbonylreaktanden einsetzt, um die pnmare Amingruppe in ein sekundäres Amin zu überfuhren, das man dann mit einer zweiten unterschiedlichen Carbonylverbindung zum gewünschten tertiären Amin umsetzt Der Carbonylreaktand kann ein Aldehyd oder ein Keton mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sein, beispielsweise Formaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd und Aceton Die Reduktion des Imins kann man herbeifuhrn, indem man Reduktionsmittel zur Anwendung bringt, beispielsweise Metallhydride, wie Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid und Lithiumaluminiumhydrid Die Umsetzung fuhrt man in einem polaren organischen Losungsmittel oder einer Mischung davon aus, wozu beispielsweise zahlen Wasser, Acetonitril, niedrige Alkanole und Dimethylsulf oxid Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt und kann von Raumtemperatur bis zu etwa 100⁰C reichen Es hat sich herausgestellt, daß die bei Raumtemperatur durchgeführte Alkylierungsreaktion nach 24h beendet ist Die optimalen Reaktionsbedingungen hangen natürlich von der Art und der Reaktivität der eingesetzten Reaktanten ab

Man kann die Aminogruppen auch dadurch alkylieren, daß man mit einem Alkylhalogenid umsetzt. Verbindungen mit einer quaternaren Ammoniumgruppe kann man durch erschöpfendes Alkylieren der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (III) oder (II), worin Y fur NR³R⁴ steht, erhalten Mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren erhalt man Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (II)

R¹ CONHCHCO₁H

R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet oder R' eine Methylgruppe darstellt, wobei in letzterem Fall die sich ergebende Alanylgruppe eine D-Alanylgruppe ist, R² ein Wasserstoffatom oder eine ß-D-Xylosylgruppe bedeutet und Y fur NR³R" oder N⁺R³R⁴R⁵X" steht, worin R³, R⁴ und R⁵ gleiche oder verschiedene C,_5-Alkylreste bedeuten und X" ein Anion darstellt, und der pharmazeutisch vertraglichen Salze dieser Verbindungen Mit ß-D-Xylosyl wird dabei das folgende Fragment bezeichnet

OH

Die Löslichkeit der verschiedenen Antibiotika wurde in phosphatgepufferten Kochsalzlosungen (PBS) bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt PBS(-) bezeichnet eine Losung, die pro Liter 0,2KCI, 0,2g KH₂PO₄,8g NaCI und 1,15g Na₂HPO₄ enthalt, PBS(+) enthalt außerdem 100mg MgCI₂ 6H₂O und 100mg CaCI₂

Verbindung des	Löslichkeit ^g/ml)	PBS(+)
Beispiels	PBS<-)	42
5	330	122
6	>2100	>2000
7	1800	3
8	3100	32
9	73
10	>2700

Die Löslichkeit von BU-3608 betragt im Vergleich dazu 16 bis ^g/ml bzw 9 bis 23 Mg/ml in PBS(-)- bzw PBS(+)-Losungen Somit besitzen die erfmdungsgemaß erhaltlichen Verbindungen der allgemenen Formel (II) eine wesentlich bessere Wasserloslichkeit als BU-3608

Die nachstehenden Ausfuhrungen befassen sich mit den biologischen Eigenschaften der erfindungsgemaß erhältlichen Verbindungen

Die Antifungusaktivitaten repräsentativer erfindungsgemaß erhältlicher Verbindungen wurden sowohl in vitro als auch in vivo untersucht Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) gegen verschiedene Pilze wurden mittels der Senen-Agarverdunnungsmethode unter Verwendung von Sabouraud-Dextrose-Agar bestimmt Es wurden somit etwa 0,003 ml der Pilzsuspension mit einem Gehalt von 10⁶ Zellen/ml auf die Oberflache von Agarplatten aufgetragen, welche die untersuchten Antibiotika enthielten Die MHK-Werte wurden aufgezeichnet, nachdem die Kulturen 44 h bei 28⁰C inkubiert worden waren Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I In-vitro-Antifungusaktivitat

Verbindung vom	C albicans	C neoformans	MHK^g/ml)	T mentagrophtes
Beispiel	3,1	1,6	A fumigatus	>100
3	6,3	1,6	> 100	6,3
5	3,1	1,6	6,3	25
6	6,3	1,6	12,5	25
7	3,1	0,8	12,5	6,3
8	6,3	1,6	6,3	12,5
9	12,5	12,5	25	>50
10		>100

Die In-vivo-Aktivitat der erfindungsgemaß erhältlichen Verbindungen wurde gegenüber Candida albicans A9540-Infektion bei Mausen getestet Die Testorganismen wurden 18h bei 28°C in YGP-Medium (Hefeextrakt, Glukose, Pepton, K₂HPO₄, MgSO₄) kultiviert und dann in Kochsalzlosung suspendiert Männliche ICR-Mause mit einem Gewicht von 20 bis 24g wurden intravenös mit etwa der 10fachen mittleren letalen Dosis des Testpilzes infiziert Das Antibiotikum wurde in verschiedenen Dosishohen an Gruppen von jeweils 5 Mausen unmittelbar nach der Fungusinfektion intravenös verabreicht Diejenige Dosis, die 50% der Tiere vor einer Infektion (PD50, mg/kg) schützt, wurde aus den Uberlebensraten berechnet, aufgezeichnet am Tag 20 nach der Pilzchallenge Alle Kontrolliere starben innerhalb von 7 bis 15 Tagen nach der Infektion Die PDso-Werte fur die Verbindungen der Beispiele 5,7 und 8 betragen 14mg/kg (toxisch, 11 mg/kg bzw 3,5mg/kg

Erfindungsgemaß ist es somit möglich, Pilzinfektionen zu behandeln, wobei man an den Wirt, der mit einem Pilz infiziert ist, eine wirksame Antifungusmenge einer erfindungsgemaß erhältlichen Verbindung verabreicht Zur Behandlung von Pilzinfektionen bei Tieren und Menschen konnen die erfindungsgemaß erhältlichen Antibiotika auf jede anerkannte Verabreichungsart in einer antifungal wirksamen Menge verabreicht werden Dazu zahlen die intravenöse, intramuskuläre, orale, intranasale und fur Oberflacheninfektionen die topische Verabreichung Zu den Präparaten fur eine parenterale Verabreichung zahlen sterile wäßrige oder nicht-waßrige Losungen, Suspensionen oder Emulsionen Dese konnen auch in Form steriler fester Zusammensetzungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlosung oder jedem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Anwendung gelost werden konnen Eine orale Formulierung kann in Form von Tablette, Gelatinekapseln, Pulvern, Pastillen, Sirupen und dergleichen vorliegen Fur emetopische Verabreichung kann man die Verbindung in Lotionen, Salben, Gele, Cremes, Tinkturen und dergleichen inkorporieren Einheitsdosisformen kann man herstellen, indem man Methoden zur Anwendung bringt, die dem Fachmann fur die Herstellung pharmazeutischer Formulierungen im allgemeinen gut bekannt sind

Es ist ersichtlich, daß bei der Behandlung eines Wirtes, der mit einem Fungus infiziert ist, welcher auf die erfindungsgemaß erhältlichen Antibiotika anspricht, die aktuell bevorzugte Verabreichungsart und Dosierung in die Befugnis des verabreichenden Arztes gestellt ist, welcher fur die Behandlung von Pilznfektionen bzw viralen Infektionen ausgebildet ist Der Verabreichungsweg und die Dosierung hangen natürlich auch von dem verursachenden Organismus, seiner Sensitivitat bezüglich des Antibiotikums, der Schwere und dem Ort der Infektion sowie den Charakteristika des Patienten ab, wozu beispielsweise das Alter, das Korpergewicht, die Ausscheidungsrate, parallele Medikationen und der allgemeine physische Zustand zahlen

Ausfuhrungsbeispiele

Beispiel 1

Fermentation von Actinomadura hibisca-Stamm P157-2

a) Schragagar

Actinomadura hibisca-Stamm P157-2 wurde auf einem Agarslant gezogen, der wie folgt zusammengesetzt war 0,5% lösliche Starke (Nichiden Kagaku Co ), 0,5% Glukose, 0,1 % Fischmehlextrakt (Mikuni Kagaku), 0,1 % Hefeextrakt (Oriental Yeast Co ), 0,2% NZ case (Sheffield), 0,1 % CaCO₃, 0,2% NaCI, 1,6% Agar Die Kultur wurde 7 Tage bei 28°C inkubiert

b) Impfkultur

Ein Teil des mikrobiellen Wachstums wurde von der Schragkultur in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 100ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung enthielt 1,0% Glukose, 2,0% lösliche Starke (Nichiden Kagaku Co), 0,5 NZ-Amin-A (Sheffield), 0,5% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co ) und 0,1 % CaCO₃ Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Stenlisierung auf 7,2 eingestellt Die Impfkultur wurde 4 Tage auf einem Drehschuttier bei 200 Umdrehungen/min und bei 28°C inkubiert.

c) Raschenfermentation

5ml des mikrobiellen Wachstums wurden von der Impfkultur in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 100ml eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung enthielt 3,0% Glukose, 3,0% Sojabohnenmehl (Nikko Seiyu Co ), 0,5% Pharmamedia (Traders Protein), 0,1 % Hefeextrakt (Oriental Yeast Co) und 0,3% CaCO₃. Die Fermentation wurde wahrend eines Zeitraums von 5 bis 6 Tagen auf einen Drehschuttier bei einer Temperatur von 28°C durchgeführt Die Antibiotikaproduktion in der Fermentationsbruhe wurde mittels der Bruhenverdunnungsmethode unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Indikatororganismus η Sabouraud-Dextrose-Bruhe überwacht, UV-Assay bei 500 nm in 0,01 N NaOH-MeOH (1.1)-Losung wurde auch eingesetzt Die Antibiotikaproduktion erreichte ein Maximum bei 650μg/ml am Tag 5

d) Tankfermentation

3I der Im pfkultur wurden eingesetzt, um 120I des sterilen Produktionsmediums zu inokulieren, das in einem 200ITankfermentor -vorhanden war. DieZusammensetzung des Produktionsmediums ist diegleiche wie-diejenige des bei der Flaschenfermentation eingesetzten Mediums Der Tank wurde bei einer Temperatur von 28°C gehalten, wobei mit 250 UpM gerührt wurde Die Beluftungsrate betrug 120 l/min Nach 96stundiger Fermentation wurde eine antibiotische Wirksamkeit von 500 μ9/ιτιΙ erzielt, der pH-Wert der Brühe betrug 7,9

Beispiel 2 Isolierung und Reinigung der Antibiotika

Eine ausführliche Beschreibung der Verfahren fur die Isolierung und Reinigung der Antibiotika BU-3608, BU-3608B und BU-3608C ist in der EP-A-88101410 enthalten Die Isolierung und Reinigung der D- und Ε-Komponenten ist in der EP-89110234 beschrieben

Auf diese Anmeldungen wird hiermit ausdrucklich Bezug genommen Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der verschiedenen Komponenten des antibiotischen Komplexes ist nachstehend beschrieben Die geerntete Brühe (pH 7,8) wurde zentrifugiert und der Überstand wurde mit 6N HCI auf pH 2,0 angesäuert, um bio-inaktive Feststoffe auszufallen Nach Entfernung des Prazipitats wurde das Filtrat mit 6 N NaOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt Die Losung wurde vorsichtig 30min bei Raumtemperatur gerührt Der entstehende dunkelrote Feststoff wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet Dieser Feststoff wurde in einer 3.1 4-Mischungvonn-Butanol/Methanol/1 % NaCI gelost Die Mischung wurde 30min gerührt Die untere wäßrige Schicht wurde abgetrennt, erneut mit einer frischen oberen Schicht gewaschen, auf einen pH-Wert von 2,0 mit 6 N HCI angesäuert und dann mit n-Butanol extrahiert Der n-Butanolextrakt wurde mit Wasser gewaschen, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert und ergab das semi-reine BU-3608-Hydrochlorid Eine Losung dieses Feststoffs in n-Butanol wurde mit alkalischem Wasser (pH 9,0) geschüttelt Die wäßrige Schicht wurde auf pH 2,0 angesäuert und mit Methylacetat gewaschen Die Extraktion mit n-Butanol und die anschließende Verdampfung des Losungsmittels ergab eine reinere Probe von BU-3608 HCI Dieses Material wurde dann einer Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie (ODS-60,350/250 Mesh, Yamamura Chemical Lab., Säule 4,5 χ 90cm) unterworfen Die Probe wurde in Wasser gelost und auf die Säule aufgegeben, die zuvor mit einer Mischung aus Acetonitril-0,15% KHaPO₄ (pH 3,5) = 17 83 (V/V) aquilibnert worden war Die Säule nacheinander mit jeweils 51 einer Acetonitril-0,15% KH₂PO4-Mischung mit den folgenden Verhaltnissen gewaschen 17 83,18 82,19 81,20 80 Anschließend wurde diese Säule mit derselben Losungsmittelmischung bei einem Verhältnis 22 78 entwickelt Das Eluat wurde in 100ml Fraktionen gesammelt, die mittels eines Mikroplattenassays überwacht wurden, und zwar unter Verwendung von C. albicans A9540 und Dunnschichtchromatographie (S1O2, Methylacetat-n-Propanol-28%-Ammoniumhydroxid = 45 105 60V/V) DiejenigenFraktionen,diedieHauptmengeanhomogenerVerbindungenthielten, wurden vereinigt und weiter gereinigt, so daß sie BU-3608 ergaben

In den oben beschriebenen Verfahren zur Durchfuhrung der Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie wurden die Fraktionen, die vor und nach der homogenen BU-3608 Hauptfraktion eluierten, vereinigt Das vereinigt Eluat wurde unter Verwendung von HP-20-Harz entsalzt, um einen BU-3608 B enthaltenden Feststoff und einen BU-3608 C enthaltenden Feststoff zu erhalten Der BU-3608 B enthaltende Feststoff wurde in Wasser gelost und auf eine Säule von ODS-60 (Yamamura Chem Lab 8,0 χ 90cm) aufgegeben, die zuvor mit einer 22 78 (V/V) Mischung von Acetonitril-0,15% KH₂PO₄ (pH 3,5) gründlich gewaschen worden war Dieselbe Losungsmittelmischung wurde eingesetzt, die beladene Säule zu eluieren Die Fraktion wurden gesammelt und mittels HPLC untersucht Die BU-3608 B enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und mittels HP-20 Harz-Chromatographie entsalzt, wobei unreines BU-3608, reines BU-3608 und BU-3608B erhalten wurde BU-3608B wurde mittels praparativerHPLCunterVerwendungeinerMikrosorbShortOneC₁₈-Saule(4,6mml D x 100mm,3pm,Ratnin-lnstrumentCo) gereinigt Die Elution erfolgte mit einer 29 71 (V/V)-Mischung von Acetonitril-0,15%KH₂PO₄(pH3,5)eluiertwurde HPLC wurde zur Überwachung des Eluats eingesetzt, BU-3608C enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert Die erhaltene wäßrige Losung wurde mittels HP-20-Chromatographie entsalzt und ergab fast reines BU-3608C und fast reines BU-3608

In dem oben beschriebenen Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie-Verfahren wurden die vor BU-3608 C eluierenden Fraktionen getrennt gesammelt und vereinigt Die vereinigten schwachorange gefärbten Fraktionen wurden unter Verwendung ι von Diaion HP-20-Chromatographie entsalzt Der so erhaltene Feststoff war mit den D- und Ε-Komponenten verhältnismäßig stark angereichert, enthielt jedoch immer noch eine große Menge der C-Komponente. Die vereinigten Feststoffe wurden auf eine Säule von Umkehrphasen-Sihkagel (ODS-60, Yamamura Chem Lab ,08,Ox 90cm) und mit einer 21.79-Mischung aus Acetonitnl-0_/15%KH₂PO4(pH3,5)eluiert Das Eluatwurde mittels HPLC unter Verwendung einer Mikrosorb-Short-One-C₁₈-Saule' (Ramm Instrument Co ,4,6mm I D x 100mm,3μιη) untersucht, eine7.17-Mischung aus Acetonitril-0/15% KH₂PO₄ (pH3,5) wurde als mobile Phase bei einer Flußrate von 1,2 ml/min eingesetzt Detektiert wurde mittels UV-Absorption bei 254 nm Zuerst eluierte BU-3608E und dann BU-3608D Die BU-3608E enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und mittels HP-20-Chromatographie entsalzt, wobei sich fast homogenes BU-3608E HCI ergab Eine wäßrige Losung von BU-3608E HCI wurde mit 0,1 N NaOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt, um reines BU-3608E in der zwitterionischen Form abzuscheiden In ähnlicher Weise wurde BU-3608D als Zwitterion erhalten

Beispie! 3

Herstellung von Desxylosyl-BU-3608E (HIc)

Eine Losung von BU-3608-E-Hydrochlond (97 mg) in 2 N HCI (12 ml) wurde 70min in einem verschlossenen Rohrchen auf 115⁰C erhitzt Die erhaltene Losung wurde durch Zugabe von 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und dann zentrifugiert Der so erhaltene Feststoff wurde mit Isopropanol und Aceton gewaschen, wobei sich 87 mg von Desxylosyl-BU-3608E ergaben Fp 205-209⁰C (Zers ), UV A_max 0,01 N NaOH

nm (ε) 235,2 (23600), 319,2 (11100), 498,4 (10800)

Beispiel 4 Herstellung von Desxylosyl-BU-3608C (IUa)

Das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3608-C-Hydrochlorid wiederholt, um die Titelverbindung bereitzustellen Fp. 208-215°C(Zers)

Beispiel 5

Herstellung von N-Methyl-BU-3608B (II, R²= H, R¹= R³= R⁴= CH₃)

Eine Mischung aus BU-3608 (540mg) in 2 N HCI (60ml) wurde 70min in einem verschlossenen Rohrchen auf 115⁰C erhitzt und dann abgekühlt Das erhaltene feste Material wurde abzentifugiert (3000UpM) in H2O suspendiert, der pH-Wert wurde durch Zugabe auf 6 N NaOH auf 11,7 eingestellt Die Losung (60ml) wurde zu 300ml Aceton gegeben Das resultierende BU-3608B wurde als Feststoff gesammelt Der Feststoff wurde in 20 ml H₂O gelost 1 N HCI wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 8,3 einzustellen Anschließend wurde mit 20 ml CH₃CN verdünnt Wäßriges HCHO (37%, 0,8ml) und NaBH₃CN 120mg) wurden nacheinander bei Raumtemperatur zu der Losung gegeben Die Losung wurde bei Raumtemperatur wahrend eines Zeitraums von 15h gerührt Das Losungsmittel wurde zu gerührtem Acton zugetropft Der sich bildende Feststoff wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet, wobei 440mg N-Methyl-BU-3608-B-Natnumsalz erhalten wurden Ein Teil dieses Salzes (50mg) wurden in H₂O gelost, die Losung wurde mit 1 N HCI auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt Der erhaltene Feststoff wurde mit H₂O gewaschen und lyophilisiert, wobei 33 mg der zwitterionischen Form erhalten wurden, Fp 211-215⁰C (Zers ). UV\_max°'^01NNaOHnm (ε) 240,8 (19700), 319,2 (13400),499,2 (13100)

Beispiel 6

Herstellung von N,N-Dimethvl-desxylosyl-BU-3608E (II, R¹= R²= H, R³= R⁴= CH₃) Eine Losung von Desxylosyl-BU-3608E (52,9mg in H₂O(5ml, pH 8,4) wurde mit 5ml CH₃CN verdünnt 0,2 ml wäßriges HCHO und 30 mg NaBH₃CN wurden nacheinander bei Raumtemperatur zu der Losung gegeben, die erhaltene Losung wurde 14 h bei Raumptemperatur gerührt Das Losungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der wäßrige Ruckstand (pH 11,3) wurde zu gerührtem Aceton hinzugetropft Das gesammelte Prazipitat wurde in H₂O gelost und der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt, wobei ein Feststoff erhalten wurde, der nacheinander mit H₂O, Isopropanol und Aceton gewaschen wurde Nach Trocknen wurden 28,7 mg von N,N-Dimethyldesxylosyl-BU-3608E erhalten mit Fp 205-208⁰C (Zers ) UVA_max^001NNaOHnm (ε) 232,8 (34000),319,2 (157001,497,6 (14900)

Beispiel 7

Herstellung von N.N-Dimethyl-BU-3608E (II, R¹ = H, R² = D-Xylosyl, R³= R⁴= CH₃) Zu einer Losung von BU-3608E (485mg) in einer Mischung aus 40ml H₂O und40ml CH₃CN wurden bei pH 8,0 nacheinander wäßriges HCHO (37%, 1,6ml) und NaBH₃CN (240mg) bei Raumptemperatur hinzugefugt Die Losung wurde 15h bei Raumtemperatur gerührt, das Losungsmittel wurde im Vakuum entfernt Der in 50ml H₂O geloste Ruckstand wurde nach Einstellen des pH-Wertes auf 11,0 zu 300 ml gerührtem Aceton hinzugetropft Das resultierende Prazipitat wurde gesammelt, in H₂O gelost, und der pH-Wert wurde mit 6N HCI auf 2,0 eingestellt Die Losung wurde durch Passieren über HP-20 entsalzt Der pH-Wert der das Produkt enthaltenden Losung wurde auf 5,5 eingestellt, um einen Feststoff auszufallen, der gesammelt mit H₂O und Aceton gewaschen und getrocknet wurde Es wurden 364mg N,N-Dimethyl-BU-3608E erhalten, Fp 214-218°C (Zers ) UVX_m3„°'^01NNaOHnm (ε) 223,6 (32900), 319,2 (15500), 497,6 (15100) Analyse fur C₄₀H₄₄N₂Oi₈ 1,5H₂O

berechnet C 55,36 H 5,46 N 3,23

gefunden C 55,26 H 5,45 N 3,19

Beispiel 8 Herstellung von N-Methyl-BU-3608 (II, R¹ = R³ = R⁴ = CH₃, R^z = D-Xylosyl)

Zu einer gerührten Losung von BU-3608-Natriumsalz (550 mg) in 50%igem wäßrigen CH₃CN (55 ml) wurden HCHO (37%, 0,75 ml) und NaBH₃CN (150mg) hinzugegeben Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 18h geiuhrt Nach Konzentrieren wurde das wäßrige Konzentrat verdünnt (200ml), bis zu einem pH Wert von 3,0 angesäuert und an HP-20 (300 ml) einer Saulenchromatographie unterzogen Nach Waschen mit Wasser und nach anschließendem Eluieren mit 60%igem wäßrigen Aceton (pH 3,0) wurde das rotgefarbte Eluat im Vakuum konzentriert Der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt, um N-Methyl-BU-3608 zu prazipitieren, das abfiltriert wurde (425mg), Fp 190-195⁰C (Zers ) IR(KBr)cm"¹ 3400,1605,1450,1295

UVAma^^^^nm (ε) 220 (33700), 278 (26800),488 (11400), SI-MS m/z 855 (M + H)⁺

Beispiel 9 Herstellung von N-Propyl-BU 3608 (II, R¹ = R³ = CH₃, R² = D-Xylosyl, R⁴ = (CH₂I₂CH₃)

Das im Beispiel 8 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3608-Natriumsalz (200mg), Propionaldehyd (1 ml) und NaBH₃CN (200mg) wiederholt, wobei N-Propyl-BU-3608 (127mg) erhalten wurde; Fp 187-192°C (Zers ) IR(KBr)Cm"¹.3380,1605,1450,1295,1255, UVX_max ^50%MOHnm (ε) 223 (33000), 278 (27500),488 (11700), SI-MS m/z 883 (M + H)⁺

Beispiel 10 Herstellung des quaternaren Ammoniumderivats von BU-3608 (II; Y = N(CH₃)₃CI)

140mg BU-3608-Natnumsalz wurden mit 1,5ml Methyliodid und 200mg Kaliumbicarbonat in 5ml Dimethylsulfoxid und 20ml Methanol bei Raumtemperatur wahrend eines Zeitraums von 43h behandelt Die Mischung wurde konzentriert, mit 20ml 0,5N NaOH verdünnt und 30min bei 70⁰C gehalten Der pH-Wert der Losung wurde auf 3,0 eingestellt Die Losung wurde dann auf eine HP-20-Saule (150 ml) gegeben, um sie zu entsalzen Das dieTitelverbindung enthaltende Eluat wurde verdampft, wobei ein roher Feststoff des quaternaren Ammoniumderivats von BU-3608 (144mg) erhalten wurde Der rohe Festtoff wurde durch Umkehrphasen-Silikagel-Chromatographie(02,O χ 45CmImItCH₃CN-O,!5%KH₂PO₄,pH3,0(20 80)Elutiongereinigt DasEluat wurde mittels HPLC untersucht Die das reine quaternare Derivat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mittels HP-20-Chromatographie (150 ml) entsalzt, wobei die reine Titelverbindung erhalten wurde (71 mg) Fp 205-210⁰C (Zers ) IR(KBr)cm"¹ 3400,1620,1600,1440,1 255 OVK_mJ°^%Me0Hnm (ε) 276(22300), 498 (9800) SI-MS m/z 860 (M⁺) Bruttoformel. C₄₂H₄₉N₂O₁₈CI

Beispiel 11

Herstellung von Desxylosyl-BU-3608D (HI b)

Das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von BU-3608-D-Hydrochlorid wiederholt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde Fp 205-211⁰C (Zers )

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel

   CONHCHCOjH
   CH,

   \ NHR^J

   R¹ ein Wasserstoffatom und R³ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeuten, oder R¹ fur CH₃ steht und die sich ergebende Alanylgruppe dann eine D-Alanylgruppe ist und R³ ein Wasserstoffatom darstellt,

   und der pharmazeutisch vertraglichen Salze davon, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel