DE2911353C2 - - Google Patents

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Yoshimasa Nakano
Hirotsugu Kaise
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Description

Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung, 3-O-(β-D- Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine antikomplementäre Aktivität und sind brauchbare Arzneimittel für autoimmune Krankheiten, Kollagenerkrankungen und rheumatische Krankheiten. Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, welche die neue Verbindung enthalten.
Zahlreiche Verbindungen, die zu den aktiven Bestandteilen der erfindungsgemäßen antikomplementären Mittel eine Beziehung haben, sind bekannt. Zum Beispiel wird Glycyrrhizin (Yasuhiro Ariga, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada, "Abridgements of Lecture Programs on Seminar of Plasmin Research Association", Seite 65 (1977); Koretsugu Arimoto, Kaneyuki Mineta, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada, "Proceedings of the 14th Symposium on Complements", Seiten 79 bis 82 (1977)) und 3-O-(6-O-Methyl-β-D-glucuronopyranosyl)- sojasapogenol B (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, "Chem. Pharm. Bull", 22, Seite 1339 (1974); Ibid., 24, Seite 121 (1976)) etc. beschrieben. Die letztere Verbindung hat eine steroidartige Struktur und entwickelt eine ähnliche Aktivität wie Steroide. Sie zeigt z. B. eine Inhibierungsaktivität gegenüber Plasmin, Urokinase, Kallikrein, Thrombin und Komplemente. Andererseits sind die physiologischen Aktivitäten dieser letzteren Verbindung bisher nicht berichtet worden. Dagegen haben die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, die in den erfindungsgemäßen Mittel verwendet werden, eine antikomplementäre Aktivität, die überraschend überlegen gegenüber der von Glycyrrhizin ist und die gegenüber 3-O-(6-O-Methyl- β-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B ganz unerwartet ist, wie aus den nachfolgend beschriebenen, pharmakologischen Versuchen hervorgeht.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Sojasapogenolderivat und dessen Salze mit hoher antikomplementärer Aktivität zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch das 3-O-(β-Glucuronopyranosyl)- sojasapogenol B der Formel (I)
gelöst.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können verwendet werden, um pathologische Reaktionen, bei denen die Wirkung eines Komplements erforderlich ist, zu erleichtern oder zu verhindern, und um immunologische Erkrankungen, wie rheumatische Arthritis, systemisches Lupuserythem, Glomerulonephritis, autoallergische hämolytische Anämie, Plättchenkrankheiten, Vasculitis und dergleichen therapeutisch zu behandeln. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung könnten auch zur Therapie von nicht-immunologischen Krankheiten, wie krampfartige nächtliche Hämoglobin­ urie, angeborenes angioneurotisches Ödem und Entzündungszustände, die durch bakterielle oder lysosomale Enzyme bei den jeweiligen komplementären Komponenten hervorgerufen wurden, z. B. bei einer Entzündung im Anschluß an einen Koronaverschluß, angewendet werden. Sie sind auch geeignet für die Behandlung von Transplantatzurückweisungen und als Blutkultur und Transportmedien. Schließlich können sie auch für die therapeutische Behandlung von disseminierten intravaskulären Koagulationen verwendet werden.
3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B gemäß der Erfindung zeigt eine kräftige antikomplementäre Aktivität. Deshalb kann man von dieser erfindungsgemäßen Verbindung erwarten, daß sie eine zu starke Aktivierung von Komplementen bei solchen Krankheiten, die als "Immunkomplex-Krankheiten" oder "autoimmune Erkrankungen" bezeichnet werden, z. B. Nephritis, rheumatische Erkrankungen, systemische Lupuserythematosie und dergleichen, inhibiert und daß es zur Prophylaxe und Therapie bei solchen Erkrankungen wirksam ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf verschiedene Weise hergestellt werden.
Zum Beispiel kann man die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) isolieren und einfach reinigen, indem man ein bekanntes, Saponin enthaltendes pflanzliches Material, wie Sojabohnen, das Verbindungen mit einer 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)- sojasapogenol-Gruppe als Teilstruktur enthält, einer chemischen Behandlung und gewünschtenfalls einer physikalischen Behandlung unterwirft. Zum Beispiel kann man die Verbindung der Formel (I) herstellen, indem man zunächst Sojasaponin B aus Sojabohnen abtrennt und dann diese Verbindung nach dem nachfolgenden Reaktionsschema 1 behandelt.
Die Abtrennung von Sojasaponin B kann mittels bekannter Abtrennverfahren und -vorrichtungen durchgeführt werden. Ge­ eignete chemische Behandlungen sind z. B. Hydrolyse, Alkoholyse, Verätherung oder Acylierung. Beispiele für geeignete physikalische Behandlungen sind Lösungsmittelextraktion, Lösungsmittelverdünnung, Flüssigchromatografie, Gaschromatografie oder Umkristallisieren.
Die Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden, indem man Sojasaponin B(II), das nach dem Verfahren von Kitagawa et al (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, "Chem. Pharm. Bull." 22, Seite 1339 (1974); Ibid. 24, Seite 121 (1976)) erhalten wurde, einer Alkoholyse mit einem niedrigen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol oder Hexanol in Gegenwart einer Säure unterwirft und wobei sich 3-O-(6-O-Alkyl-β-D-glucuronopyranosyl)- sojasapogenol B (Formel III)) bildet, das dann hydrolysiert wird (Reaktionsschema 1). Der Ausdruck "Sojasapogenin B" bedeutet hier eine Mischung von Sojasaponin I, II und III, das Sojasaponin als ein Aglycon enthält, wie in der vorerwähnten Literatur beschrieben.
In der Formel (III) bedeutet R eine Niedrigalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Es können verschiedene üblicherweise bei einer Alkoholyse verwendete Säuren für die Alkoholyse von Sojasaponin B verwendet werden. Beispiele hierfür sind Säuren wie Halogenwasser­ stoffsäuren, z. B. Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff, Schwefelsäure oder Salpetersäure, starke organische Säuren, wie Trichloressigsäure oder Trifluoressigsäure, und Lewissäuren, wie Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Titantetrachlorid und Titantetrabromid.
Die Alkoholyse wird zwischen Raumtemperatur und 150°C, insbesondere zwischen etwa 50 bis 100°C während 1 bis 6 Stunden durchgeführt.
Das Verfahren zum Isolieren der durch die Formel (III) wiedergegebenen Verbindungen aus der Reaktionsmischung ist nicht besonders begrenzt und verschiedene bekannte Verfahren, bei denen die physikochemischen Eigenschaften der gebildeten Substanzen angewendet werden, einschließlich der, die zum Abtrennen von Sojasaponin B angewendet werden, können verwendet werden. Beispiele für diese Verfahren sind z. B. die Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen den Produkten und den Verunreinigungen, ein Verfahren, bei dem man die Unterschiede bei der Affinität an Adsorbentien, wie Aktivkohle, Kieselgel oder Ionenaustauschharze nutzt oder ein Verfahren, bei dem man den Unterschied im Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Flüssigphasen ausnutzt und auch eine Kombination dieser Verfahren.
Zum Beispiel wird das Alkoholisat mit Wasser unter Ausbildung eines Niederschlags vermischt, der dann einer Kieselgel- Säulenchromatografie unterworfen wird, und stufenweise mit einem Eluiermittel, z. B. einer Mischung aus Chloroform und Äthanol, eluiert wird, wobei man die Verbindungen der Formel (I) isoliert.
Die Hydrolyse der durch Formel (III) angegebenen Verbindung kann im allgemeinen in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators unter den üblichen Hydrolysebedingungen für Ester durchgeführt werden. Bei dieser Umsetzung können übliche Katalysatoren verwendet werden. Beispiele für geeignete Katalysatoren sind Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, anorganische basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat oder Kaliumhydrogencarbonat. Als Katalysatoren bevorzugt werden anorganische basische Verbindungen.
Jedes übliche inerte Lösungsmittel kann bei der obigen Reaktion verwendet werden. Geeignete Beispiele für inerte Lösungsmittel schließen Wasser, niedrige Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Propanol, Äther, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder eine Mischung davon ein. Die Hydrolysereaktion wird zwischen Raumtemperatur und 150°C, insbesondere 50 bis 100°C, während etwa 1 bis 6 Stunden durchgeführt.
Die durch die Formel (I) wiedergegebenbe erfindungsgemäße Verbindung kann aus Produkten der Teilhydrolyse von Sojasaponin B(II) gewonnen werden, wobei die Hydrolyse in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem oder mehreren der vorher erwähnten Lösungsmittel durchgeführt wird, und zwar in Gegenwart von Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, starken anorganischen Säuren, wie Schwefelsäure oder Salpetersäure, oder starken organischen Säuren, wie Trichloressigsäure und Trifluoressigsäure. Der Ausdruck "Teilhydrolyse" wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Hydrolyse, in welcher keine Abspaltung von Aglycon aus dem Ausgangssaponin B eintritt.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung aus dem Teilhydrolysat kann nach dem vorher erwähnten Isolationsverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man das Teilhydrolysat mit n-Butanol extrahieren, um die wasserlöslichen Komponenten zu entfernen und das Teilhydrolysat wird dann einer Kieselgel-Säulenchromatografie unterworfen, wobei die jeweiligen Komponenten abgetrennt werden und die Fraktion, die 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B entspricht, wird aus einem geeigneten Lösungsmittel kristallisiert, z. B. einer Mischung aus Chloroform und Aceton (1 : 1 Vol/Vol). Die Teilhydrolyse wird zwischen Raumtemperatur und 150°C, vorzugsweise 50 bis 100°C, etwa 1 bis 6 Stunden durchgeführt.
Alternativ kann man auch die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) durch einen von den vorliegenden Erfindern neu isolierten Mikroorganismus herstellen. Der Mikroorganismus wird nachfolgend ausführlich beschrieben:
I. Auftreten
Dieser Stamm wurde aus Boden bei Tokushima City, Tokushima, Japan, isoliert.
II. Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien
Die Kulturcharakteristika dieses Stammes auf verschiedenen Medien basieren auf visuellen und mikroskopischen Beobachtungen (Fig. 1) und sind die folgenden:
A. Visuelle Beobachtung (1) Malzextraktagarmedium
Wachstum schnell und unregelmäßig. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist hellbraun bis dunkelbraun. Die Kolonie ist flach und die Conidienbildung gut. Die Farbe der Hyphen ist biskuit bis hellbraun und man beobachtet ausgeschiedene flüssige Tröpfchen. Kein lösliches Pigment wird gebildet.
(2) Kartoffelglucosemedium
Das Wachstum ist sehr schnell und bei einer Kultivierung bei 27°C während 30 Tagen erreicht die Kolonie eine Größe von 70 mm. Der periphere Teil der Kolonie breitet sich dentritisch aus und anhaftende weiße Hyphen werden beobachtet. Eine große Anzahl flüssiger Tröpfchen ist vorhanden. Man beobachtet kaum eine Sporenbildung. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist hell-bernstein. Kein lösliches Pigment wird geformt.
(3) Czakep's Dox Agar-Medium
Das Wachstum ist schlecht.
(4) Synthetisches Mucor-Agar-Medium
Das Wachstum ist schlecht.
(5) Hafermehl-Agar-Medium
Das Wachstum ist sehr gut, so daß nach 2 Wochen die Petri-Schale bedeckt ist. Von Beginn der Kultivierung tritt eine außerordentlich starke Hyphen-Bildung ein, und auch die Conidien-Bildung ist sehr schnell. Die Farbe der Kolonie wechselt von weiß bis dunkelbraun mit Fortschreiten der Kultivierung. Große Menge flüssiger Tröpfchen erscheinen an den Hyphen. Kein lösliches Pigment wird gebildet.
III. Morphologische Eigenschaften
Diese können aus der Fig. 1 ersehen werden. Die Phialophoren sind einfach verzweigt und stehen aufrecht. Die Phialophorspitzen sind etwas stabartig aufgeschwollen. Diese Schwellung ist nicht so groß wie die, die man bei Stämmen von Stachybotrys echinata IFO 7525 und 8856 beobachtet. Dieser Stamm zeigt eine Hyphen-Breite von 4,0 bis 4,5 µm, was etwas größer ist als die Phialophore. Die Phialophoren, die sich aufrecht mit den Fußzellen aus vegetativen Hyphen oder Lufthyphen verzweigen, haben zwei bis drei Septen und haben eine Größe von 40-80 × 3,0-3,5 µm. Die Zellwand der Phialophore ist nicht stachelig sondern glatt. Von den geschwollenen Anteilen an den Spitzen der Phialophoren bilden sich 3 bis 6 Phialide. Weiterhin haben die sphärischen bis subkugelförmigen Phialosporen einen stacheligen Vorsprung einer Größe von 4,3-5,2 × 3,0-4,2 µm und bilden sich kontinuierlich basipetal an den Spitzen der Phialiden, wodurch eine Kette von 24 bis 70 Conidien gebildet wird. Die Phialiden haben eine obklavate Form und eine Größe von 6,9-10,7 × 3,5-4,7 µm. Die Phialophoren und Phialiden sind farblos und die Phialide hat eine kaffeebraun bis schwarze Farbe.
Der taxonomische Zustand des vorliegenden Stammes mit den vorerwähnten mikrobiologischen Eigenschaften ist von G. L. Barron in "The Genera of Hyphomycetes from Soil", The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1968). J. C. Gilman, "A Manual of Soil Fungi", The Iowa State University Press, Ames, Iowa (1971) und von J. A. von Arx, "The Genera of Fungi Sporelating in Pure Culture", Verlag von J. Cremer 3301 Lehre (1970) untersucht worden. Nach dem taxonomischen System von Saccardo gehört der vorliegende Stamm zur Klasse Hyphomycetes, Familie Dematiaceae, Genus Stachybotrys. Mit anderen Worten stimmen die Eigenschaften des vorliegenden Stammes, die durch die Abwesenheit von Ascocarps und anderen Geschlechtsorganen gekennzeichnet ist, die Bildung von dunkelbraunen Phialosporen aus Phialiden und das Ansammeln der entstandenen Phialosporen in Halbkreisform an den oberen Enden der Phialide gut mit den Eigenschaften des Genus Stachybotrys überein.
Die verschiedenen Eigenschaften des vorliegenden Stammes sind unter Berücksichtigung der oben erwähnten Nachschlagewerke und der Literaturhinweise, wie G. R. Bisby, Trans. Brit. Mycol. Soc., 26, 133-143 (1943), R. K. Zuck, Mycologia, 38, 69-76 (1946), G. L. Barron, Can. J. Bot., 39, 153-157 (1961) und bei einem Vergleich mit Stämmen, die im Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) hinterlegt sind, identifiziert worden.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß der vorliegende Stamm zum Genus Stachybotrys (genus Memmoniella) gehört. Genauer gesagt enthält der vorliegende Stamm keine Ascocarps und andere Geschlechtsorgane und dunkelbraune Phialosporen, die kontinuierlich aus den Phialiden gebildet sind. Es werden lange Sporenketten gebildet. Die Eigenschaften des vorliegenden Stammes T-791 stimmen mit den von genus Stachybotrys (genus Memmoniella) überein.
Die verschiedenen Eigenschaften des vorliegenden Stammes sind aufgrund der vorerwähnten Nachschlagewerke und Literaturhinweise, wie R. K. Zuck, Mycologia, 38, 69-76 (1946) und G. Smith, Trans. Brit. Mycol. Soc., 45, 387-394 (1962) untersucht worden und mit den Stammtypen, die bei IFO aufbewahrt werden, verglichen worden. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Stamm T-791 zu dem von Höhnel bezeichneten Memmoniella echinata gehört, weil kontinuierlich Phialosporen basipetal aus Phialiden gebildet werden. Aus den Berichten von R. K. Zuck und G. Smith wird jedoch angenommen, daß der vorliegende Stamm T-791 ein Stamm ist, der analog Stachybotrys echinata ist. Es wurde daher mit Stachybotrys echinata IFO 7525 und IFO 8856 verglichen.
Morphologisch gesehen stellt man keine stachelartigen Ausbuchtungen, die für die beiden Stämme spezifisch sind, an den Zellwänden der Phialosporen beim vorliegenden Stamm T-791 fest. Bei den verglichenen Stämmen blähen sich die Spitzen der Phialophoren auf das 2- bis 3-fache der Hyphen-Breite auf, während man beim vorliegenden Stamm keine merkliche Aufblähung feststellt. Die beiden Vergleichsstämme zeigen ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, insbesondere auf Kartoffelglucose-Agar-Medium, und bilden kreisförmige, etwas erhöhte Kolonien, an denen Hyphen stark haften. Weiterhin beobachtet man eine deutlich sichtbare Conidienbildung. Dagegen zeigt der vorliegende Stamm ein dentritisches unregelmäßiges Wachstum, wie bereits vorher erwähnt, und eine schlechte Hyphen-Bildung und eine schlechte Conidien-Bildung wird festgestellt. Aus diesen erwähnten mikrobiologischen Unterschieden geht hervor, daß es sich bei dem vorliegenden Stamm um einen neuen Stamm handelt, der als Stachybotrys sp. T-791 bezeichnet wird.
Die vorher und nachfolgend angegebenen Farbbezeichnungen stimmen überein mit dem Verfahren, das in "Color Harmony Manual", Container Corporation of America (1958) beschrieben wird.
IV. Physiologische Eigenschaften
Stachybotrys sp. T-791 ist ein aerober Stamm und hat folgende physiologische Eigenschaften:
Proben des neuen Stammes Stachybotrys sp. T-791 sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (No. 8-1, Inage Higashi 5-chome, Chibashi, Chiba, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3803 und auch beim American Type Culture Collection (12 301 Parklawn Drive Rockcille, Maryland, USA 20852) unter der Hinterlegungsnummer ATCC 20 513 hinterlegt worden.
Die Zubereitung der erfindungsgemäßen Verbindung durch den Mikroorganismus vom Stamme des vorher beschriebenen Stachybotrys wird in folgender Weise durchgeführt.
Zunächst wird der Mikroorganismus in einem Medium, welches übliche Nährquellen und Additive enthält, kultiviert. Stickstoffquellen, die üblicherweise in dem Kultursubstrat verwendet werden, enthalten z. B. Sojapulver, Sojabohnenöl, Maismeische, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Hafermehl, Malzextrakt, hydrolysiertes Casein, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Glyzerin, Maltose, Stärke, Lactose, Saccharose und Melasse. Beispiele für Additive zum Kulturmedium schließen anorganische Salze, wie Kalziumcarbonat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat und Phosphorsäure, ein. Gewünschtenfalls kann das Kulturmedium auch noch kleinere Mengen an Metallsalzen von Eisen, Kupfer, Mangan und Zink enthalten. Die Kultivierung wird auf einem üblichen wäßrigen Medium, das die oben erwähnten Substrate enthält, unter Anwendung einer Oberflächenkultur-Methode oder einer Eintauchkultivierung unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Eintauchkultivierung unter Belüftung und Rühren wird bevorzugt. Die Kultivierung kann vorteilhaft bei einer Temperatur von 15 bis 38°C, vorzugsweise 20 bis 32°C während etwa 3 bis 7 Tagen unter üblichen Belüftungsbedingungen und unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes des Kulturmediums von 3,5 bis 11,5, vorzugsweise 4,5 bis 9,5, vorgenommen werden.
Nach der Kultivierung wird die gebildete Substanz aus der Kulturbrühe gewonnen. Die Isolierung kann in der vorher angegebenen Weise erfolgen.
Die erfindungsgemäße, so erhaltene Verbindung bildet mit verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren basischen Verbindungen Salze, die in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sind.
Beispiele für basische Verbindungen, die verwendet werden können für die Salzbildung, sind anorganische basische Verbindungen, z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Natriumhydrogencarbonat und organische basische Verbindungen, wie Piperazin, Morpholin, Piperidin, Äthylamin, Dimethylamin und Triäthylamin.
Die Verbindungen der Formel (I) können als Nephritis-Behandlungsmittel verwendet werden und bei deren Verwendung für diesen Zweck werden sie zu pharmazeutischen Zusammensetzungen zusammen mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert.
Hinsichtlich der Verwendung des therapeutischen Mittels als antikomplementäres Mittel besteht keine besondere Begrenzung und das therapeutische Mittel kann auf dem Wege verabreicht werden, für den die jeweilige Form des therapeutischen Mittels bestimmt ist. Zum Beispiel kann man Tabletten, Pillen, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate und Kapseln oral verabreichen. Die injizierbaren Zubereitungen werden intravenös verabreicht und zwar entweder allein oder zusammen mit üblichen Hilfsmitteln, wie Glucose und Aminosäuren. Gewünschtenfalls kann das therapeutische Mittel auch intramuskulär, intrakutan, subkutan, intraperitoneal oder rektal verabreicht werden.
Die Dosis des Nephritis-Behandlungsmittels wird je nach dem Anwendungszweck oder den Symptomen gewählt. Im allgemeinen beträgt die Dosis für die erfindungsgemäßen Verbindungen etwa 0,5 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben antikomplementäre Aktivitäten und sind brauchbar als therapeutische Mittel bei autoimmunen Erkrankungen, Collagen-Erkrankungen und rheumatischen Erkrankungen.
Die Ergebnisse von Untersuchungen über die pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen werden nachfolgend gezeigt.
(1) Geprüfte Verbindung
  • A. 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B (Erfindung)
  • B. Glycyrrhizin (Vergleich)
(2) Antikomplementäre Aktivität
Die antikomplemtäre Aktivität der geprüften Verbindungen wurde gemessen und bestätigt nach dem Prüfverfahren gemäß Meneki Kagaku (Immunchemie), Yuichi Yamamura et al. (Ed.), Seiten 830-834, Asakura Shoten, Tokyo, Japan, (1973).
Ein Reagenzglas wurde mit 0,5 ml einer wäßrigen Dispersion jeder der Prüfverbindungen gefüllt und 0,5 ml sensibilisierter Erythrocyten (EA), enthaltend 1 × 10⁸ Zellen/ml, 1 ml einer 5-fach verdünnten Lösung einer Veronal-Pufferlösung, enthaltend isotonische Gelatine (diese 5-fach verdünnte Lösung wird als GVB++ der Einfachheit halber bezeichnet) und 0,5 ml des Komplementserums (Meerschweinchenkomplement), 150-fach mit GVB++ verdünnt, wurden zugegeben. Die Mischung wurde 60 Minuten bei 37°C gehalten. Dann wurden 5 ml einer eiskalten physiologischen Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde zentrifugiert. Die Adsorption der überstehenden abgetrennten Lösung wurde bei OD₄₁₃ gemessen und der Grad, in dem die Testverbindung die Hämolyse von sensibilisierten Erythrocyten hemmte, wurde bestimmt. Die 50 %ige Hämolysehemmungs-Aktivitätszahl (γ/ml), die nach dem obigen Verfahren gemessen wurde, wird für jede der geprüften Verbindungen in Tabelle 1 gezeigt.
(3) Akute Toxizität
Die akute Toxizität (LD₅₀ mg/kg) der geprüften Verbindungen wurde bei Mäusen durchgeführt, indem man die Verbindung A intraperitoneal und die Verbindung B intravenös verabreichte.
Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 geht hervor, daß die akute Toxizität (LD₅₀) der erfindungsgemäßen Verbindung in einer Größenordnung liegt, die die Verwendung als Arzneimittel ermöglicht.
(4) Therapeutische Wirkung bei einer nephrotoxinartigen Nephritis
Ratten-Nephrotoxin (nachfolgend mit "NT" abgekürzt) wurde wie folgt erhalten:
Rattennierenrinde wurde mit der gleichen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogenisierte Mischung wurde mit Freund's Complete Adjuvant im Volumenverhältnis 1 : 1 vermischt. 2 ml der erhaltenen Mischung wurden einem Kaninchen (Körpergewicht 3100 g) zur Immunisierung des Kaninchens intramuskulär injiziert. Nach 1 ½ Monaten wurde Blut aus dem Herzen des Kaninchens entnommen und das Serum gewonnen. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56°C inaktiviert, dann mit einer 40 %igen gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung ausgesalzen und fraktioniert. Die γ-Globulin (IgG) Fraktion wurde gesammelt, wobei man NT erhielt.
Die therapeutische Bewertung wurde durchgeführt, indem man männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 150 bis 160 g mit jeweils drei Wiederholungen für jede zu prüfende Verbindung verwendete. Die zu prüfende Verbindung wurde intraperitoneal einmal alle 24 Stunden 7 Tage lang verabreicht. Eine Stunde nach der Verabreichung der zu prüfenden Verbindung am 3. Tag wurde NT zugegeben. Das NT wurde intravenös in einer Menge von 1 ml in die Schwanzvene einer jeden Ratte injiziert. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.
Das Niveau des Proteinharnstoffs (Gesamtmenge des ausgeschiedenen Urins innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden) wurde durch Trübungsmessung gemessen unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kontrolle mittels Sulfosalicylsäure.
Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Proteinharnstoffniveau (mg/Tag)
Die Anzahl der Tage wird von der Zeit der Verabreichung der zu prüfenden Verbindung berechnet, was 1 Stunde vor der Anwendung von NT erfolgte.
Das Proteinharnstoffniveau bei einer gesunden Ratte beträgt 0,5 bis 5 mg/Tag. Übersteigt das Proteinharnstoffniveau diesen Bereich, insbesondere wenn das Proteinharnstoffniveau größer als 10 mg/Tag ist, kann man mit Sicherheit sagen, daß eine Nephritis eingetreten ist. Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 wird ersichtlich, daß eine Nephritis bei der Kontrollgruppe auftrat und bei den Fällen, bei denen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, ist die Menge an Proteinharnstoff vom Tag der Verabreichung von NT bis zum Tage 10 nach der Verabreichung im wesentlichen die gleiche wie bei einer gesunden Ratte. Das heißt, daß durch die Verabreichung der Verbindungen gemäß der Erfindung eine primäre und sekundäre Immunreaktion inhibiert wird.
(5) Therapeutische Wirkung bei heymannartiger Nephritis
Bei diesem Versuch wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 180 bis 200 g verwendet. Rattennierenrinde wurde extrahiert und mit einer gleichen Volumenmenge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogene Lösung wurde mit 1500 xg 1 Stunde lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Verfahren von T. S. Edington et al, Journal of Experimental Medicine, 127, 555 (1968), gereinigt und mit Freund's Complete Adjuvant 37 Ra im Volumenverhältnis von 0,4 : 1 vermischt. Die Mischung wurde dann intraperitoneal isologen Ratten in einer Menge von 0,5 ml/Ratte injiziert. Dann wurde die gleiche Menge dieser Mischung alle 2 Wochen verabreicht bis das Proteinharnstoffniveau 100 mg/Tag überstieg (diese Zeit betrug etwa 6 bis 8 Wochen).
Jede der zu prüfenden Verbindungen wurde intraperitoneal den unter einer heymannartigen Nephritis leidenden Ratten verabreicht (Körpergewicht 300 bis 350 g) und zwar 7 Tage lang 1 mal täglich, und die Mengen an Proteinharnstoff (mg/Tag) wurden in der vorher angegebenen Weise gemessen. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Proteinharnstoffniveau (mg/Tag)
Zwei bis drei Wochen nach Beginn der Versuchsserie hatte das Körpergewicht der Ratten auf 400 bis 500 g zugenommen und es lagen normale Proteinharnstoffniveaus, die 5 bis 15 mg/Tag betragen, vor. Aus der Tabelle 4 wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Heymann-artige Nephritis heilen können.
Zur ausführlichen Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) und deren Salze in den folgenden Beispielen beschrieben und in den Referenzbeispielen wird die Herstellung von Nephritis-Behandlungsmitteln erläutert, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) und deren Salze als aktiven Bestandteil enthalten.
Beispiel 1
(a) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 1,5 ml 15 n Schwefelsäure wurde die Lösung 3,5 Stunden unter Rückfluß behandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete, der gesammelt und ausreichend mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde auf einer Kieselgelsäule adsorbiert und mit einem Gemisch aus Chloroform/Äthanol abwechselnd (20 : 1 V/V, 200 ml; 10 : 1 V/V, 150 ml; 5 : 1 V/V, 200 ml und 2 : 1 V/V, 200 ml) entwickelt, wobei man 71 mg 3-O-(6-O-Methyl-β-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.
3-O-(6-O-Methyl-β-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B (71 mg) das so erhalten worden war, wurde in 2 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 2 ml 1 n einer wäßrigen NaOH-Lösung gegeben und anschließend wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Vermischen des Reaktionsgemisches mit kaltem Wasser und der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 1 mit 1 n wäßriger HCl-Lösung wurde das Gemisch mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Beim Umkristallisieren des Rückstandes aus einer Mischung von Chloroform/Aceton (1 : 1 V/V) erhielt man 50 mg 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B.
Schmelzpunkt: 231-232°C (Zersetzung)
Elementaranalyse für C₃₆H₅₈O₉:
Berechnet, %:C 68,11, H 9,21; Gefunden, %:C 67,85, H 9,08.
Dünnschichtchromatografie über Kieselgel F₂₅₄
  • 1. Chloroform-Methanol-Wasser (65 : 35 : 8 V/V/V), Rf = 0,38.
  • 2. Isopropanol-2 n wäßrige Ammoniaklösung (100 : 15 V/V), Rf = 0,21.
Löslichkeit: Sehr löslich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, n-Butanol, wäßriger Alkalilösung, Pyridin, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; löslich in Aceton, Äthylacetat und Methyläthylketon und schwach löslich in Benzol, Chloroform, Diäthyläther, n-Hexan und Petroläther.
(b) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30 ml in mit HCl gesättigtem Äthanol gelöst und die Lösung wurde 3 Stunden rückflußbehandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete der gesammelt und mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde dann über einer Kieselgelsäule chromatografisch gereinigt (Eluiermittel: Chloroform/Äthanol 20 : 1 V/V, 200 ml; 10 : 1 V/V, 150 ml; 5 : 1 V/V, 200 ml und 2 : 1 V/V, 200 ml), wobei 75 mg 3-O-(6-O-Äthyl-β-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B erhalten wurden.
Die so erhaltene Verbindung wurde mit 2 ml Äthanol und 2 ml einer 1 n wäßrigen KOH-Lösung vermischt und die Mischung wurde 2 Stunden unter Rückfluß gehalten.
Das Reaktionsgemisch wurde mit kaltem Wasser vermischt und der pH-Wert wurde auf etwa 1 mit einer 1 n wäßrigen HCl-Lösung eingestellt und anschließend wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde aus einer Mischung von Chloroform und Aceton (1 : 1 V/V) umkristallisiert, wobei man 45 mg 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.
Schmelzpunkt: 231 bis 232°C (Zersetzung)
Beispiel 2
Sojasaponin B (1 g) wurde in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 5 ml einer 15 n wäßrigen Schwefelsäurelösung vermischt und anschließend 2,5 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule absorbiert und mit einer Mischung aus Chloroform/ Äthanol (20 : 1, 10 : 1 und 2 : 1 V/V) entwickelt, wobei man 350 mg 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.
Schmelzpunkt: 231 bis 232°C (Zersetzung).
Beispiel 3
In einen 500 ml Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums der nachfolgenden Zusammensetzung gegeben und Stachybotrys sp. T-791 wurde bei 25°C und einem pH von 5,5 4 Tage lang unter Schütteln kultiviert.
Glyzerin0,5% Stärke1,0% Saccharose0,2% Sojabohnenpulver0,5% Pepton0,1% Malzextrakt0,2% MgSO₄0,3% HCl0,05%
In einem 30-Liter-Glasfermentator wurde 20 l eines Kulturmediums der obigen Zusammensetzung vorgelegt und ein Kolben der entstandenen Keimkultur wurde in dem Kulturmedium 5 Tage bei 28°C unter Rühren mit 300 min-1 und einem Belüftungsgrad von 1 l pro Liter Kulturmedium pro Minute kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit 8000 min-1 zentrifugiert, wobei man die Mikrobenzellen entfernte und der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mittels konzetrierter Salzsäure auf etwa 1 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wurde auf der Zentrifuge gesammelt und mit Methanol extrahiert. Die Methanolfraktion wurde auf einer Säule mit Aktivkohle (500 ml) absorbiert, nachdem sie unter vermindertem Druck konzentriert worden war. Die Säule wurde mit einer wäßrigen 30%igen Acetonlösung eluiert und dann mit einer wäßrigen 50%igen Lösung. Die Fraktion aus der wäßrigen 50%igen Acetonlösung wurde gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule aufgenommen und entwickelt, unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform und Aceton (2 : 1 bzw. 1 : 1 V/V) als Eluiermittel. Außerdem wurde eine Fraktion, enthaltend 3-O-(β-D- Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B [entsprechend der Fraktion mit dem Rf-Wert von 0,38, die erhalten wurde, indem Kieselgel F₂₅₄-DC Platten unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform-Methanol-Wasser 65 : 35 : 8 V/V/V) entwickelt worden waren] als Eluat gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Das Konzentrat wurde wiederum auf einer Kieselgelsäule adsorbiert und mit einer Mischung aus Chloroform-Aceton abwechselnd (2 : 1 und 1 : 1 V/V) entwickelt und die Fraktion, die der vorher erwähnten entsprach, wurde gesammelt und anschließend zur Trockene konzentriert. Beim Umkristallisieren des Rückstandes aus einer Mischung aus Chloroform-Aceton (1 : 1 V/V) wurden 36 mg 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)- sojasapogenol B erhalten.
Schmelzpunkt: 231 bis 232°C (Zersetzung).
Beispiel 4
Natriumsalz der erfindungsgemäßen Verbindung500 mg Glucose250 mg Destilliertes Wasser zum injizierenbis zu einem Gesamtvolumen von 5 ml
Das Natriumsalz und die Glucose wurden in destilliertem Wasser für Injektionszwecke gelöst und die Lösung wurde in eine 5 ml Ampulle gegeben. Die Luft wurde durch Stickstoff verdrängt und die Ampulle 15 Minuten zur Sterilisierung der Lösung auf 121°C erhitzt. Man erhielt eine injizierbare Zubereitung.
Beispiel 5
Erfindungsgemäße Verbindung500 mg halbsynthetische Glyceridbasebis zu einer Gesamtmenge von 2000 mg
Die erfindungsgemäße Verbindung wurde zu der halbsynthetischen Glyceridbase gegeben und das Ganze wurde bei 50°C vermischt und suspendiert. Die Mischung wurde in eine Form gegeben und ohne Hilfe abkühlen gelassen. Das Produkt wurde aus der Form entnommen, wobei man ein Suppositorium erhielt.
Beispiel 6
Erfindungsgemäße Verbindung150 g Avicel® 40 g Maisstärke 30 g Magnesiumstearat  2 g Hydroxypropylmethylzellulose 10 g Polyäthylenglykol  3 g Kastoröl 40 g Methanol 40 g
Die erfindungsgemäße Verbindung B, Avicel®, Maisstärke und Magnesiumstearat wurden vermischt und zerkleinert und dann in einer üblichen Tablettiervorrichtung (10 mm Radius) für eine Zuckerbeschichtung tablettiert. Die erhaltenen Tabletten wurden mit einem überzugsbildenden Mittel aus Hydroxypropylmethylzellulose, Polyäthylenglykol 6000, Kastoröl und Methanol unter Ausbildung von überzogenen Tabletten beschichtet.

Claims (4)

1. 3-O-(β-D-Glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B der Formel (I) und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze.
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Stachybotrys sp. T-791 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, anorganische Salze und Spurenmineralien enthält, bei einem pH von 4,5 bis 9,5, bei einer Temperatur von 20° bis 30°C kultiviert und das erhaltene Produkt der Formel (I) aus der Kulturbrühe gewinnt und gegebenenfalls in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Sojasaponin aus Sojabohnen abtrennt und das Sojasaponin mit einem C₁-C₆-Alkohol in Gegenwart einer Säure bei Raumtemperatur bis 150°C während 1 bis 6 Stunden zu 3-O-(6-O-Alkyl-β-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B alkoholisiert und das Produkt anschließend in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators bei Raumtemperatur bis 150°C hydrolisiert, oder daß man Sojasaponin B in Wasser oder in einem wäßrigen Lösungsmittel in Gegenwart eines Halogenwasserstoffs, einer starken anorganischen Säure oder einer starken organischen Säure bei Raumtemperatur bis 150°C teilhydrolisiert und aus dem Teilhydrolisat eine Verbindung der Formel (I) gewinnt.
4. Arzneimittel mit antikomplementärer Aktivität bei Lebewesen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines Sojasapogenolderivates der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder ein annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
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