CH640868A5

CH640868A5 - 3-0-(beta-d-glucoronpyranosyl)-sojasapogenol b, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten.

Info

Publication number: CH640868A5
Application number: CH285979A
Authority: CH
Inventors: Masanao Shinohara; Yoshimasa Nakano; Hirotsugu Kaise; Taketoshi Izawa; Wasei Miyazaki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1978-03-31
Filing date: 1979-03-28
Publication date: 1984-01-31
Also published as: DE2911353A1; ZA791061B; US4217345A; DK126679A; BE875105A; BE875106A; DK162102B; IT7948551A0; AT369426B; CA1128498A; SU1074408A3; NO790994L; FR2421179A1; ATA236079A; GB2020290A; JPS54130551A; NO154584C; AU527201B2; JPS5822120B2; PH16275A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung, 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B und deren Salze und Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemässen Verbindungen haben eine antikomplementäre Aktivität und sind brauchbare Arzneimittel für autoimmune Krankheiten, Collagenerkrankungen und rheumatische Krankheiten.

Zahlreiche Verbindungen, die zu den aktiven Bestandteilen der erfindungsgemässen antikomplementären Mittel eine Beziehung haben, sind bekannt. Zum Beispiel wird Gly-cyrrhizin (Yasuhiro Ariga, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada, «Abridgements of Lecture Programs on Seminar of Plasmin Research Association», Seite 65 (1977); Koretsugu Arimoto, Kaneyuki Mineta, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada, «Proceedings of the 14th Symposium on Compléments», Seiten 79 bis 82 (1977) und 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronopyranosyl)-soja-sapogenol B (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, «Chem. Pharm. Bull.», 22, Seite 1339 (1974); Ibid., 24, Seite 121 (1976) usw. beschrieben. Die letztere Verbindung hat eine steroidartige Struktur und entwik-kelt eine ähnliche Aktivität wie Steroide. Sie zeigt z.B. eine Inhibierungsaktivität gegenüber Plasmin, Urokinase, Kalli-krein, Thrombin und Komplemente. Anderseits sind die physiologischen Aktivitäten dieser letzteren Verbindung bisher nicht berichtet worden. Dagegen haben die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, die in den erfindungsgemässen Mitteln verwendet werden, eine antikomplementäre Aktivität, die überraschend überlegen gegenüber der von Glycyrrhizin ist und die gegenüber 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyranosyI)-sojasapogenol B ganz unerwartet ist, wie aus den nachfolgend beschriebenen, pharmakologischen Versuchen hervorgeht.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Sojasapoge-nolderivat und dessen Salze mit antikomplementärer Aktivität zu zeigen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung eines Sojasapogenolderivates und dessen Salze mit hoher antikomplementärer Aktivität zu zeigen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen zu zeigen, die ein Sojasapogenol-derivat der Formel (I) oder dessen Salze enthalten.

Die Erfindung betrifft ein neues Sojasapogenolderivat der Formel (I)

COOH

r—0

OH

HO

OH

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Die Erfindung betrifft auch pharmazeutisch annehmbare Salze des Sojasapogenolderivates der Formel (I), die durch Umsetzung des Sojasapogenolderivates mit geeigneten basischen Verbindungen erhalten werden.

Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von Sojasa-pogenolderivaten der Formel (I), wie nachfolgend noch ausführlich beschrieben wird.

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge an Sojasapogenolderivat der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Erzielung einer antikomplementären Aktivität bei Lebewesen enthalten.

Fig. 1 ist eine Mikrofotografie von Stachybotrys sp. T-791.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können verwendet werden, um pathologische Reaktionen, bei denen die Wirkung eines Komplementes erforderlich ist, zu erleichtern oder zu verhindern, und um immunologische Erkrankungen, wie rheumatische Arthritis, systemisches Lupuserythem, Glomerulonephritis, autoallergische hämolytische Anämie, Plättchenkrankheiten, Vasculitis u.dgl. therapeutisch zu behandeln. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss der Erfindung könnten auch zur Therapie von nichtimmunologischen Krankheiten, wie krampfartige nächtliche Hämoglobinurie, angeborenes anioneurotisches Ödem und Entzündungszustände, die durch bakterielle oder lysosomale Enzyme bei den jeweiligen komplementären Komponenten hervorgerufen wurden, z.B. bei einer Entzündung im An-schluss an einen Koronaverschluss, angewendet werden. Sie sind auch geeignet für die Behandlung von Transplantatzurückweisungen und als Blutkultur und Transportmedien. Schliesslich können sie auch für die therapeutische Behandlung von disseminierten intravaskulären Koagulationen verwendet werden.

In den letzten Jahren wurden intensive Forschungen über die theoretische Analyse des Komplementsystems und dessen Wirkung auf Menschen und Tiere durchgeführt, und es wird allgemein anerkannt, dass gewisse Verbindungen eine antikomplementäre Aktivität haben und dann eine therapeutische Wirkung auf verschiedene der vorher angegebenen Symptome ausüben. Zum Beispiel wird in US-PS 4 021 544 folgendes dargelegt:

«Der Ausdruck <Komplement> betrifft eine Komplexgruppe von Proteinen in Körperflüssigkeiten, die bei der Zusammenwirkung mit Antikörpern oder anderen Faktoren eine wichtige Rolle als Mittler von Immun-, allergischen, im-munochemischen und/oder immunopathologischen Reaktionen dienen. Die Reaktionen, an denen ein Komplement teilnimmt, finden im Blutserum oder in anderen Körperflüssigkeiten statt, und sie gelten deshalb als humorale Reaktionen.»

«Beim menschlichen Blut sind im Komplementsystem mehr als 11 Proteine vorhanden. Diese Komplementproteine werden durch den Buchstaben C und durch die Zahlen Cl, C2, C3 usw. bis C9 bezeichnet. Das Komplementprotein Cl ist eigentlich eine Anordnung von Untereinheiten, die mit Clq, Clr und Cls bezeichnet werden. Die den Komplementproteinen zugeordneten Zahlen geben die Sequenz an, in welcher sie aktiv werden, mit der Ausnahme des Komplementproteins C4, das nach Cl und vor C2 wirkt. Die Zahlenzuordnung für die Proteine im Komplementsystem wurde vorgenommen bevor man die Reaktionsfolge vollständig erkannt hatte. Eine detaillierte Beschreibung des Komplementsystems und dessen Rolle in den Körperprozessen wird z.B. in <Bull. World Health Org.>, 39, 935-938 (1968); Scientific American), 229 (Nr. 5), 54-66 (1973); Medicai World News>, 11. Oktober 1974, Seiten 53-58, 64-66; <Harvey Lectures), 66, 75-104 (1972); <The New England

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Journal of Medicine), 287,489-495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972); <The John Hopkins Med. J.>, 128, 57-74 (1971) und <Federation Proceedings), 32,134-137 (1973) gegeben.»

«Das Komplementsystem kann man in drei Untersysteme aufteilen: (1) Eine Erkennungseinheit (Clq), die es ermöglicht, dass eine Kombination mit einem Antikörpermolekül, das einen fremden Eindringling aufgespürt hat, stattfindet; (2) eine Aktivierungseinheit (Clr, Cls, C2, C4, C3), die eine Stelle an der benachbarten Membrane bereitet; und (3) eine Angriffseinheit (C5, C6, C7, C8 und C9), die ein Loch in der Membrane bildet. Die Membran-Angriffseinheit ist unspezifisch, sie zerstört Eindringlinge nur, weil sie in deren Nachbarschaft erzeugt wird, und um eine Zerstörung in den eigenen Zellen des Gasttieres zu minimalisieren, muss seine Aktivität rechtzeitig begrenzt sein. Diese Limitierung wird zum Teil durch einen spontanen Zerfall des aktivierten Komplements bewirkt und zum Teil durch Einwirkung von Inhibitoren und abbauenden Enzymen. Die Kontrolle des Komplements ist jedoch nicht vollständig, und manchmal wird in den Zellen des Gasttieres oder Menschen eine Zerstörung vorgenommen. Die Immunität ist deshalb ein zweiseitiges Messer.»

«Die Aktivierung des Komplementsystems beschleunigt auch die Blutgerinnung. Diese Wirkung tritt durch die komplementvermittelte Freigabe eines Gerinnungsfaktors aus den Plättchen ein. Das biologisch aktive Komplementfragment und Komplexe wirken zusammen bei den Reaktionen, welche die Zellen des Gastträgers (Tier oder Mensch) schädigen und diese pathogenen Reaktionen können die Entwicklung von Immunkomplexerkrankungen bewirken. Bei einigen Formen der Nephritis zerstört das Komplement die Basismembran der Niere, und dadurch tritt Protein aus dem Blut in den Urin ein. Zu dieser Kategorie von Krankheit gehört die disseminierte Lupuserythematosie und zu diesen Symptomen gehören Naphritis, viscerale Läsionen und Hautausschläge. Bei der Behandlung von Diphtherie oder Tetanus durch Injektionen von grossen Mengen Antitoxin tritt manchmal eine Serumerkrankung, eine Immunkomplexerkrankung, ein. Auch rheumatische Arthritis schliesst einen Immunkomplex ein. Ähnlich wie bei der disseminierten Lupuserythematosie liegt hier eine autoimmune Erkrankung vor, bei welcher die Krankheitssymptome durch pathologische Wirkungen des Immunsystems auf das Gewebe des Trägers verursacht werden. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass das Komplementsystem bei Entzündungen, Koagulationen, Fibrinolyse, Antikörper-Antigen-Reaktionen und anderen metabolischen Verfahren eine Rolle spielt.»

«In Gegenwart von Antikörper-Antigen-Komplexen nehmen die Komplementproteine an einer Reihe von Reaktionen teil, bei denen irreversible Membranzerstörungen eintreten können, wenn sie in der Nähe von biologischen Membranen auftreten. Obwohl das Komplement ein Teil des Selbstverteidigungsmechanismus des Körpers gegenüber Infektionen bildet, wird durch das Komplement auch eine Entzündung und Gewebeschädigung bei dem immunopatholo-gischen Prozess bewirkt. Die Art gewisser Komplementproteine, Vermutungen, wie die Komplemente an biologische Membrane gebunden sind, und die Art wie die Komplemente eine Membranstörung bewirken, wird in <Annual Review in Biochemistry), 38, 389 (1969) beschrieben.»

«Es wurde berichtet, dass die bekannten Komplementinhibitoren, Epsilon-Aminocapronsäure, Suramin-natrium und Transexamsäure mit Erfolg bei der Behandlung von angeborenen angioneurotischen Ödemen eingesetzt wurden, einer Krankheit, die aus der angeborenen Deffizienz oder einem Funktionsmangel des Seruminhibitors der aktivierten ersten Komponente des Komplements (Cl-Inhibitor) resultiert <The New England Journal of Medicine), 286, 808-812 (1972); <Allergol>, Et. <Immunipath> II, 163-168 (1974); <J. Allergy Clin. Immunol.), 53, Nr. 5,298-302 (1974); und <An-nals of Internal Medicine), 84, 580-593 (1976).»

3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B gemäss der Erfindung zeigt eine kräftige antikomplementäre Aktivität. Deshalb kann man von dieser erfindungsgemässen Verbindung erwarten, dass sie eine zu starke Aktivierung von Komplementen bei solchen Krankheiten, die als «Immunkomplex-Krankheiten» oder «autoimmune Erkrankungen» bezeichnet werden, z.B. Nephritis, rheumatische Erkrankungen, systemische Lupuserythematosie u.dgl., inhibiert und dass es zur Prophylaxe und Therapie bei solchen Erkrankungen wirksam ist.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können auf verschiedene Weise hergestellt werden.

Zum Beispiel kann man die erfindungsgemässe Verbindung der Formel (I) isolieren und einfach reinigen, indem man ein bekanntes, Saponin enthaltendes pflanzliches Material, wie Sojabohnen, das Verbindungen mit einer 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol-Gruppe als Teilstruktur enthält, einer chemischen Behandlung und gewünschtenfalls einer physikalischen Behandlung unterwirft. Zum Beispiel kann man die Verbindung der Formel (I) herstellen, indem man zunächst Sojasaponin B aus Sojabohnen abtrennt und dann diese Verbindung nach dem nachfolgenden Reaktionsschema 1 behandelt.

Die Abtrennung von Sojasaponin B kann mittels bekannter Abtrennverfahren und -Vorrichtungen durchgeführt werden. Geeignete chemische Behandlungen sind z.B. Hydrolyse, Alkoholyse, Verätherung, Acylierung u.dgl. Beispiele für geeignete physikalische Behandlungen sind Lösungsmittelextraktion, Lösungsmittelverdünnung, Flüssig-chromatografie, Gaschromatografie, Umkristallisieren u.dgl.

Die Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden, indem man Sojasaponin B (II), das nach dem Verfahren von Kitagawa et al (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, «Che. Pharm. Bull.», 22, Seite 1339 (1974); Ibid. 24. Seite 121 (1976) erhalten wurde, einer Alkoholyse mit einem niedrigen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol, Hexa-nol u.dgl., in Gegenwart einer Säure unterwirft und wobei sich 3-0-(6-0-Alkyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B (Formel (III)) bildet, das dann hydrolysiert wird (Reaktionsschema 1). Der Ausdruck «Sojasapogenin B» bedeutet hier eine Mischung von Sojasaponin I, II und III, das Sojasaponin als ein Aglycon enthält, wie in der vorerwähnten Literatur beschrieben.

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Reaktionsschema 1

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0) Ut >, tH

O U •Ü

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Sojasaponin B

Alkoholyse

•OH

(III)

Hydrolyse (Entesterung)

V (I)

In der Formel (III) bedeutet R eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Es können verschiedene üblicherweise bei einer Alkoholyse verwendete Säuren für die Alkoholyse von Sojasaponin B verwendet werden. Beispiele hierfür sind Säuren wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Chlorwasserstoff, Bromwasser-stofFu.dgl., starke anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salpetersäure u.dgl., starke organische Säuren, wie Trichlor-essigsäure, Trifluoressigsäure u.dgl., Lewissäuren wie Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Titatetrachlorid, Titan-tetrabromid u.dgl.

Die Alkoholyse kann vorzugsweise zwischen etwa Raumtemperatur und etwa 150 °C, insbesondere zwischen etwa 50 bis 100 °C während 1 bis 6 Stunden durchgeführt werden.

Das Verfahren zum Isolieren der durch die Formel (III) wiedergegebenen Verbindungen aus der Reaktionsmischung ist nicht besonders begrenzt und verschiedene bekannte Verfahren, bei denen die physikochemischen Eigenschaften der gebildeten Substanzen angewendet werden, einschliesslich der, die zum Abtrennen von Sojasaponin B angewendet werden, können verwendet werden. Beispiele für diese Verfahren sind z.B. die Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen den Produkten und den Verunreinigungen, ein Verfahren, bei dem man die Adsorptionskraftunterschiede ausnutzt und die Affinität für gewöhnliche Adsorbentien, wie Aktivkohle, XAD-2, Kieselgel, Ionenaustauschharze, Sephadex u.dgl., oder ein Verfahren, bei dem man den Unterschied im Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Flüssigphasen ausnutzt und auch eine Kombination dieser Verfahren.

Zum Beispiel wird das Alkoholisat mit Wasser unter Ausbildung eines Niederschlags vermischt, der dann einer 40 Kieselgel-Säulenchromatografie unterworfen wird, und stufenweise mit einem Eluiermittel, z. B. einer Mischung aus Chloroform und Äthanol, eluiert wird, wobei man die Verbindungen der Formel (I) isoliert.

Die Hydrolyse der durch Formel (III) angegebenen Ver-45 bindung kann im allgemeinen in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators unter üblichen Hydrolysebedingungen für Ester durchgeführt werden. Bei dieser Umsetzung können übliche Katalysatoren verwendet werden. Beispiele für geeignete Katalysatoren sind Mineral-50 säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure u.dgl., anorganische basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Kalium-hydrogencarbonat u.dgl. Als Katalysatoren bevorzugt wer-55 den anorganische basische Verbindungen.

Jedes übliche inerte Lösungsmittel kann bei der obigen Reaktion verwendet werden. Geeignete Beispiele für inerte Lösungsmittel schliessen Wasser, niedrige Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol u.dgl., Äther, wie Dioxan, 60 Tetrahydrofuran u.dgl., Dimethylsulfoxid, Dimethyl-formamid u. dgl. oder eine Mischung davon ein. Die Hydrolysereaktion wird vorzugsweise zwischen Raumtemperatur und 150 °C, insbesondere 50 bis 100 °C, während etwa 1 bis 6 Stunden durchgeführt.

65 Die durch die Formel (I) wiedergegebene erfindungsge-mässe Verbindung kann aus Produkten der Teilhydrolyse von Sojasaponin B (II) gewonnen werden, wobei die Hydrolyse in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und ei

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nem oder mehreren der vorher erwähnten Lösungsmittel durchgeführt wird, und zwar in Gegenwart von Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure u.dgl., starken anorganischen Säuren, wie Schwefelsäure, Salpetersäure u.dgl., oder starken organischen Säuren, wieTrichloressigsäure, Trifluoressigsäure u.dgl. Der Ausdruck «Teilhydrolyse» wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Hydrolyse, in welcher keine Abspaltung von Aglycon aus dem Ausgangssaponin B eintritt.

Die Isolierung der erfindungsgemässen Verbindung aus dem Teilhydrolysat kann nach dem vorher erwähnten Isolationsverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man das Teilhydrolysat mit n-Butanol extrahieren, um die wasserlöslichen Komponenten zu entfernen und das Teilhydrolysat wird dann einer Kieselgel-Säulenchromatografie unterworfen, wobei die jeweiligen Komponenten abgetrennt werden und die Fraktion, die 3-0-(ß-D-Glucuropyranosyl)-sojasapogenol B entspricht, wird kristallisiert aus einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. einer Mischung aus Chloroform und Aceton (1:1 Vol/Vol). Die Teilhydrolyse wird im allgemeinen zwischen Raumtemperatur und 150 °C, vorzugsweise 50 bis 110 °C, etwa 1 bis 6 Stunden durchgeführt.

Alternativ kann man auch die erfindungsgemässe Verbindung der Formel (I) durch einen von den vorliegenden Erfindern neu isolierten Mikroorganismus herstellen. Der Mikroorganismus wird nachfolgend ausführlich beschrieben.

I. Auftreten

Dieser Stamm wurde aus Boden bei Tokushima City, Tokushima, Japan, isoliert.

II. Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Die Kulturcharakteristika dieses Stammes auf verschiedenen Medien basieren auf visuellen und mikroskopischen Beobachtungen (Fig. 1) und sind die folgenden:

A. Visuelle Beobachtung

(1) Malzextraktagarmedium:

Wachstum schnell und unregelmässig. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist tan (Tan, 3ie) bis dunkelbraun (Dk Brown, 3pn). Die Kolonie ist flach und die Conidienbil-dung gut. Die Farbe der Hyphen ist biskuit (Biscuit, 2ec) bis tan (Tan, 3ie) und man beobachtet ausgeschiedene flüssige Tröpfchen. Kein lösliches Pigment wird gebildet.

(2) Kartoffelglucosemedium:

Das Wachstum ist sehr schnell, und bei einer Kultivierung bei 27 °C während 30 Tagen erreicht die Kolonie eine Grösse von 70 mm. Der periphere Teil der Kolonie breitet sich dentrisch aus und anhaftende weisse Hyphen werden beobachtet. Eine grosse Anzahl flüssiger Tröpfchen ist vorhanden. Man beobachtet kaum eine Sporenbildung. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist hell-bernstein (Lt Amber, 3ie). Kein lösliches Pigment wird geformt.

(3) Czakep's Dox Agar-Medium:

Das Wachstum ist schlecht.

(4) Synthetisches Mucor-Agar-Medium:

Das Wachstum ist schlecht.

(5) Hafermehl-Agar-Medium:

Das Wachstum ist sehr gut, so dass nach 2 Wochen die Petri-Schale bedeckt ist. Von Beginn der Kultivierung tritt eine ausserordentlich starke Hyphen-Bildung ein, und auch die Conidien-Bildung ist sehr schnell. Die Farbe der Kolonie wechselt von weiss bis dunkelbraun (Dk Brown, 3 pn) mit Fortschreiten der Kultivierung. Grosse Mengen flüssiger

Tröpfchen erscheinen an den Hyphen. Kein lösliches Pigment wird gebildet.

III. Morphologische Eigenschaften s Diese können aus der Fig. 1 ersehen werden. Die Phialo-phoren sind einfach verzweigt und stehen aufrecht. Die Phi-alophorspitzen sind etwas stabartig aufgeschwollen. Diese Schwellung ist nicht so gross wie die, die man bei Stämmen von Stachybotrys echinata IFO 7525 und 8856 beobachtet, io Dieser Stamm zeigt eine Hyphen-Breite von 4,0 bis 4,5 um, was etwas grösser ist als die Phialophore. Die Phialophoren, die sich aufrecht mit den Fusszellen aus vegetativen Hyphen oder Lufthyphen verzweigen, haben zwei bis drei Septen und haben eine Grösse von 40-80 c 3,0-3,5 |im. Die Zellwand i5 der Phialophore ist nicht stachelig, sondern glatt. Von den geschwollenen Anteilen an den Spitzen der Phialophoren bilden sich 3 bis 6 Phialide. Weiterhin haben die sphärischen bis subkugelförmigen Phialosporen einen stacheligen Vorsprung einer Grösse von 4,3-5,2 x 3,0-4,2 jxm und bilden 20 sich kontinuierlich basipetal an den Spitzen der Phialiden, wodurch eine Kette von 24 bis 70 Conidien gebildet wird. Die Phialiden hat eine obklavate Form und eine Grösse von 6,9-10,7 x 3,5-4,7 um. Die Phialophoren und Phialiden sind farblos und die Phialide hat eine Kaffee (Coffee, 3 pn) 25 bis schwarze Farbe.

Der taxonomische Zustand des vorliegenden Stammes mit den vorerwähnten mikrobiologischen Eigenschaften ist von G.L. Barron in «The Genera of Hyphomycetes from Soil», The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1968). 30 J. C. Gilman. «A Manual of Soil Fungi», The Iowa State University Press, Ames, Iowa (1971) und von J. A. von Arx, «The Genera of Fungi Sporelating in Pure Culture», Verag von J. Cremer 3301 Lehre (1970), untersucht worden. Nach dem taxonomischen System von Saccardo gehört der vor-35 liegende Stamm zur Klasse Hyphomycetes, Familie Demati-aceae, Genus Stachybotrys. Mit anderen Worten stimmen die Eigenschaften des vorliegenden Stammes, die durch die Abwesenheit von Ascocarps und anderen Geschlechtsorganen gekennzeichnet ist, die Bildung von dunkelbraunen 40 Phialosporen und Phialiden und das Ansammeln der entstandenen Phialosporen in Halbkreisform an den oberen Enden der Phialide gut mit den Eigenschaften des Genus Stachybotrys überein.

Die verschiedenen Eigenschaften des vorliegenden Stam-45 mes sind unter Berücksichtigung der oben erwähnten Nachschlagewerke und der Literaturhinweise, wie G.R. Bisby, Trans. Brit. Mycol. Soc., 26,133-143 (1943), R.K. Zuck, Mycologia, 38, 69-76 (1946), G.L. Barron, Can. J. Bot., 39, 153-157 (1961) und bei einem Vergleich mit Stämmen, die so im Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) hinterlegt sind, identifiziert worden.

Als Ergebnis wurde gefunden, dass der vorliegende Stamm zum Genus Stachybotrys (genus Memmoniella) gehört. Genauer gesagt enthält der vorliegende Stamm keine 55 Ascocarps und andere Geschlechtsorgane und dunkelbraune Phialosporen, die kontinuierlich aus den Phialiden gebildet sind. Es werden lange Sporenketten gebildet. Die Eigenschaften des vorliegenden Stammes T-791 stimmen mit den von genus Stachybotrys (genus Memmoniella) überein. 6o Die verschiedenen Eigenschaften des vorliegenden Stammes sind aufgrund der vorerwähnten Nachschlagewerke und Literaturhinweise, wie R.K. Zuck, Mycologia, 38,69-76 (1946) und G. Smith, Trans. Brit. Mycol. Soc., 45, 387-394 (1962) untersucht worden und mit den Stammtypen, die bei 65 IFO aufbewahrt werden, verglichen worden. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass der Stamm T-791 zu dem von Höh-nel bezeichneten Memmoniella echinata gehört, weil kontinuierlich Phialosporen basipetal aus Phialiden gebildet

werden. Aus den Berichten von R. K Zuck und G. Smith wird jedoch angenommen, dass der vorliegende Stamm T-791 ein Stamm ist, der analog Stachybotrys echinata ist. Er wurde daher mit Stachybotrys echinata IFO 7525 und IFO 8856 verglichen.

Morphologisch gesehen stellt man keine stachelartigen Ausbuchtungen, die für die beiden Stämme spezifisch sind, an den Zellenwänden der Phialosporen beim vorliegenden Stamm T-791 fest. Bei den verglichenen Stämmen blähen sich die Spitzen der Phialophoren auf das 2- bis 3-fache der Hyphen-Breite auf, während man beim vorliegenden Stamm keine merkliche Aufblähung feststellt. Die beiden Vergleichsstämme zeigen ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, insbesondere auf Kartoffelglucose-Agar-Medium, und bilden kreisförmige, etwas erhöhte Kolonien, an denen Hyphen stark haften. Weiterhin beobachtet man eine deutlich sichtbare Conidienbildung. Dagegen zeigt der vorliegende Stamm ein dentritisches unregelmässiges Wachstum, wie bereits vorher erwähnt, und eine schlechte Hyphen-Bildung, und eine schlechte Conidien-Bildung wird festgestellt. Aus diesen erwähnten mikrobiologischen Unterschieden geht hervor, dass es sich bei dem vorliegenden Stamm um einen neuen Stamm handelt, der als Stachybotrys sp. T-791 bezeichnet wird.

Die vorher und nachfolgend angegebenen Farbbezeichnungen stimmen überein mit dem Verfahren, das in «Color Harmony Manual», Container Corporation of America (1958) beschrieben wird.

IV. Physiologische Eigenschaften

Stachybotrys sp. T-791 ist ein aerober Stamm und hat folgende physiologischen Eigenschaften:

Stachybotrys sp. T-791

pH Temperatur

Wachstumsbedingungen 3,5-11,5 15-38°C

optimale Wachstumsbedingungen 4,5- 9,5 20-30°C

Proben des neuen Stammes Stachybotrys sp. T-791 sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Japan (No. 8-1, Inage Higashi 5-chome, Chibashi, Chiba, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3803 und auch beim American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive Rockcille, Maryland, USA 20852) unter der Hinterlegungsnummer ATCC 20513 hinterlegt worden.

Die Zubereitung der erfindungsgemässen Verbindung durch den Mikroorganismus vom Stamme des vorher beschriebenen Stachybotrys wird in folgender Weise durchgeführt.

Zunächst wird der Mikroorganismus in einem Medium, welches übliche Nährquellen und Additive enthält, kultiviert. Stickstoffquellen, die üblicherweise in dem Kultursubstrat verwendet werden, enthalten z. B. Sojapulver, Soja-bohnenöl, Maismeische, Hefeextrakt, hetrocknete Hefe, Hafermehl, Malzextrakt, hydrolysiertes Casein, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Glyzerin, Maltose, Stärke, Lactose, Saccharose und Melasse. Beispiele für Additive zum Kulturmedium schliessen anorganische Salze, wie Kalziumcar-bonat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat und Phosphorsäure, ein. Gewünschtenfalls kann das Kulturmedium auch noch kleinere Mengen an Metallsalzen von Eisen, Kupfer, Mangan und Zink enthalten. Die Kultivierung wird auf einem üblichen wässrigen Medium, das die oben erwähnten Substrate enthält, unter Anwendung einer Oberflächenkultur-Methode oder einer Eintauchkultivierung unter Belüf640 868

tung und Rühren durchgeführt. Eintauchkultivierung unter Belüftung und Rühren wird bevorzugt. Die Kultivierung kann vorteilhaft bei einer Temperatur von 15 bis 38 °C, vorzugsweise 20 bis 32 °C während etwa 3 bis 7 Tagen unter üblichen Belüftungsbedingungen und unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes des Kulturmediums von 3,5 bis 11,5, vorzugsweise 4,5 bis 9,5, vorgenommen werden.

Nach der Kultivierung wird die gebildete Substanz aus der Kulturbrühe gewonnen. Die Gewinnungsmethode ist nicht besonders beschränkt, und man kann zahlreiche Verfahren anwenden, bei denen man die physikochemischen Eigenschaften der gebildeten Substanzen anwendet. Die Gewinnung kann z.B. dadurch erfolgen, dass man die Unterschiede der Löslichkeit zwischen dem Produkt und den Verunreinigungen ausnutzt oder Unterschiede in der Absorptionskraft und Affinität an übliche Adsorbentien, wie Aktivkohle, XAD-2, Kieselgel, Ionenaustauschharze, Sephadex u.dgl., oder indem man den Unterschied des Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Flüssigphasen ausnutzt, oder man wendet eine Kombination solcher Methoden an.

Die erfindungsgemässe, so erhaltene Verbindung bildet mit verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren basischen Verbindungen Salze, die in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sind.

Beispiele für basische Verbindungen, die verwendet werden können für die Salzbildung, sind anorganische basische Verbindungen, z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat u.dgl., und organische basische Verbindungen, wie Piperazin, Morpholin, Piperidin, Äthyl-amin, Dimethylamin, Triäthylamin u.dgl.

Die Verbindungen der Formel (I) können als Nephritis-Behandlungsmittel verwendet werden und bei deren Verwendung für diesen Zweck werden sie zu pharmazeutischen Zusammensetzungen zusammen mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert. Geeignete Träger sind z.B. Verdünnungsmittel oder Exzipientien, wie Füllstoffe, Extender, Bindemittel, Befeuchtungsmittel, Zerfallmittel, oberflächenaktive Mittel und Schmiermittel, die üblicherweise, je nach der Dosierungsform, bei der Herstellung solcher Arzneimittel verwendet werden.

Es können zahlreiche Dosierungsformen für die therapeutischen Mittel als Behandlungsmittel für Nephritis, je nach dem Zweck der Therapie, ausgewählt werden. Typische Dosierungsformen sind Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate, Kapseln, Suppositorien und injizierbare Zubereitungen (Lösungen, Emulsionen, Suspensionen u.dgl.).

Beim Formen von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemässen Verbindungen als aktive Bestandteile enthalten, zu Tabletten kann ein grosser Bereich von bekannten Trägern verwendet werden. Geeignete Träger schliessen Exzipientien, wie Lactose, weissen Zucker, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Kalzium-carbonat, Kaolin, kristalline Zellulose und Kieselsäure; Bindemittel, wie Wasser, Äthanol, Propanol, Sirup, Glucose, Stärkelösungen, Gelatinelösungen, Carboxymethylzellulose, Schellack, Methylzellulose, Kaliumphosphat und Polyvinyl-pyrrolidon; Zerfallmittel, wie trockene Stärke, Natriumal-ginat, Agarpulver, Laminarienpulver, Natriumhydrogencarbonat, Kalziumcarbonat, Tween, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglycerid, Stärke und Lactose; Zerfallinhibitoren, wie weissen Zucker, Stearinsäureglycerinester, Kakaobutter und hydrierte Öle; Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumbasen und Natriumlaurylsulfat; Befeuchtungsmittel, wie Glycerin und Stärke; Adsorbentien, wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloidale Kieselsäure; und Schmiermittel, wie Talkum, Stearinsäuresalze,

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

640 868

Borsäurepulver, Macrogol und festes Polyäthylenglykol ein.

Beim Verformen zu pharmazeutischen Zusammensetzungen in Pillenform kann eine Vielzahl von üblichen Trägern, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Beispiele für geeignete Träger sind Exzipientien, wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter, gehärtete Pflanzenöle, Kaolin und Talkum; Bindemittel, wie Gummiarabi-cumpulver, Tragacanthpulver, Gelatine, Äthanol; und Zerfallmittel, wie Laminarien und Agar. Gewünschtenfalls können die Tabletten beschichtet sein und zu zuckerbeschichteten Tabletten, gelatinebeschichteten Tabletten, enterisch beschichteten Tabletten, filmbeschichteten Tabletten oder Tabletten, die mit zwei oder mehr Überzügen versehen sind, beschichtet werden.

Beim Verformen der pharmazeutischen Zusammensetzung zu Suppositorien kann eine Vielzahl von Trägern der bekannten Art verwendet werden. Beispiele für geeignete Träger sind Polyäthylenglykol, Kakaobutter, höhere Alkohole, Ester von höheren Alkoholen, Gelatine und halbsynthetische Glyceride.

Wird die pharmazeutische Zusammensetzung zu einer injizierbaren Zubereitung formuliert, so wird die erhaltene Lösung oder Suspension vorzugsweise sterilisiert und hinsichtlich Blut isotonisch gemacht. Beim Formulieren der pharmazeutischen Zusammensetzung zu einer Lösung oder Suspension können alle üblicherweise verwendeten Verdünnungsmittel verwendet werden. Beispiele für übliche Verdünnungsmittel sind Wasser, Äthylalkohol, Propylenglykol, äth-oxylierter Isostearylalkohol, Polyoxyäthylensorbitol und Sorbitester. Natriumchlorid, Glukose oder Glyzerin können als therapeutisches Mittel zugegeben werden, z.B. bei einem Behandlungsmittel gegen Nephritis in einer Menge, die ausreicht, um eine isotonische Lösung herzustellen. Weiterhin können als therapeutische Mittel übliche Auflösungshilfeh, Puffer, Schmerzmittel und Konservierungsmittel und gewünschtenfalls Färbungsmittel, Parfüms, Geschmacksstoffe, Süssstoffe und andere Arzneimittel enthalten.

Die Menge, in welcher die erfindungsgemässen Verbindungen als aktiver Bestandteil in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht werden, damit diese für eine Nephritisbehandlung geeignet ist, ist nicht besonders beschränkt und kann in einem weiten Bereich variieren. Eine geeignete therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemässen Verbindung liegt im allgemeinen bei 1 bis etwa 70 Gew.-% (vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%), bezogen auf die gesamte Zusammensetzung.

Hinsichtlich der Verwendung des therapeutischen Mittels als antikomplementäres Mittel besteht keine besondere Begrenzung, und das therapeutische Mittel kann auf dem Wege verabreicht werden, für den die jeweilige Form des therapeutischen Mittels bestimmt ist. Zum Beispiel kann man Tabletten, Pillen, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate und Kapseln oral verabreichen. Die injizierbaren Zubereitungen werden intravenös verabreicht und zwar entweder allein oder zusammen mit üblichen Hilfsmitteln, wie Glucose und Aminosäuren. Gewünschtenfalls kann das therapeutische Mittel auch intramuskulär, intrakutan, subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Suppositorien werden rektal verabreicht.

Die Dosis des Nephritis-Behandlungsmittels wird je nach Anwendungszweck, den Symptomen u.dgl. gewählt. Im allgemeinen beträgt die Dosis für die erfindungsgemässen Verbindungen etwa 0,5 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag.

Die erfindungsgemässen Verbindungen haben antikomplementäre Aktivitäten und sind brauchbar als therapeutische Mittel bei autoimmunen Erkrankungen, Collagen-Erkrankungen und rheumatischen Erkrankungen.

Die Ergebnisse von Untersuchungen über die pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemässen Verbindungen werden nachfolgend gezeigt.

5 (1) Geprüfte Verbindung

A. 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B (Erfindung)

B. Glycyrrhizin (Vergleich)

10 (2) Antikomplementäre Aktivität

Die antikomplementäre Aktivität der geprüften Verbindungen wurde gemessen und bestätigt nach dem Prüfverfahren gemäss Meneki Kagaku (Immuno Chemistry), Yuichi Yamamura et al., Ed. Seiten 830-834, Asakura Shoten, To-15 kyo, Japan, (1973).

Ein Reagenzglas wurde mit 0,5 ml einer wässrigen Dispersion jeder der Prüfverbindungen gefüllt und 0,5 ml sensibilisierter Erythrocyten (EA), enthaltend 1 x 108 Zellen/ ml, 1 ml einer 5fach verdünnten Lösung einer Veronal-Puf-2o ferlösung, enthaltend isotonische Gelatine (diese 5fach verdünnte Lösung wird als GVB++ der Einfachheit halber bezeichnet) und 0,5 ml des Komplementserums (Meerschweinchenkomplement), 150fach mit GVB+ + verdünnt, wurden zugegeben. Die Mischung wurde 60 Minuten bei 37 °C ge-25 halten. Dann wurden 5 ml einer eiskalten physiologischen Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde zen-trifugiert. Die Adsorption der überstehenden abgetrennten Lösung wurde bei OD^ gemessen und der Grad, in dem die Testverbindung die Hämolyse von sensibilisierten Ery-3o throcyten hemmte, wurde bestimmt. Die 50%ige Hämolyse-hemmungs-Aktivitätszahl (Y/ml), die nach dem obigen Verfahren gemessen wurde, wird für jede der geprüften Verbindungen in Tabelle 1 gezeigt

35 (3) Akute Toxizität

Die akute Toxizität (LD50 mg/kg) der geprüften Verbindungen wurde bei Mäusen durchgeführt, indem man die Verbindung A intraperitoneal und die Verbindung B intravenös verabreichte.

40 Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

45 geprüfte antikomplementäre akute Toxität

Verbindung Aktivität ( /ml) LD50 (mg/kg)

A 5 über 300

B 500-1000 über 300

50

Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 geht hervor, dass die akute Toxizität (LD50) der erfindungsgemässen Verbindung in einer Grössenordnung liegt, die die Verwendung als Arzneimittel ermöglicht.

55

(4) Therapeutische Wirkung bei einer nephrotoxinartigen Nephritis

Ratten-Nephrotoxin (nachfolgend mit «NT» abgekürzt) wurde wie folgt erhalten:

60 Rattennierenrinde wurde mit der gleichen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogenisierte Mischung wurde mit Freund's Complete Adjuvant (ein Produkt der Difco Company) im Volumenverhältnis 1:1 vermischt. 2 ml der erhaltenen Mischung wurden einem Ka-65 ninchen (Körpergewicht 3100 g) zur Immunisierung des Kaninchens intramuskulär injiziert. Nach 11/2 Monaten wurde Blut aus dem Herzen des Kaninchens entnommen und das Serum gewonnen. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56 °C

9

640 868

inaktiviert, dann mit einer 40%igen gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung ausgesalzen und fraktioniert. Die y-Globulin (IgG) Fraktion wurde gesammelt, wobei man NT erhielt.

Die therapeutische Bewertung wurde durchgeführt, indem man männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 150 bis 160 g mit jeweils drei Wiederholungen für jede zu prüfende Verbindung verwendete. Die zu prüfende Verbindung wurde intraperitoneal einmal alle 24 Stunden 7 Tage lang verabreicht. Eine Stunde nach der Verabreichung der zu prüfenden Verbindung am 3. Tag wurde NT zugegeben. Das NT wurde intravenös in einer Menge von 1 ml in die Schwanzvene einer jeden Ratte injiziert. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.

Das Niveau des Proteinharnstoffs (Gesamtmenge des ausgeschiedenen Urins innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden) wurde durch Trübungsmessung gemessen unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kontrolle mittels Sulfosalicylsäure.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2 Proteinharnstoffniveau (mg/Tag)

geprüfte Verbindung

Tag 1

4

7

10

Kontrolle

1

14

17

22

32

2

20

25

27

37

3

12

19

20

31

Durchschnitt

15

20

23

33

erfindungsgemäs-

1

1,9

1,2

0,9

7

se Verbindung

2

5,3

2,9

1,8

13

(3 mg/Körper)

3

2,5

2,7

1,1

9

Durchschnitt

3,2

2,3

1,3

9,7

Die Anzahl der Tage wird von der Zeit der Verabrei-

chung der zu prüfenden Verbindung berechnet, was 1 Stunde vor der Anwendung von NT erfolgte.

Das Proteinharnstoffniveau bei einer gesunden Ratte beträgt 0,5 bis 5 mg/Tag. Übersteigt das Proteinharnstoffniveau diesen Bereich, insbesondere wenn das Proteinharnstoffniveau grösser als 10 mg/Tag ist, kann man mit Sicher-5 heit sagen, dass eine Nephritis eingetreten ist. Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 wird ersichtlich, dass eine Nephritis bei der Kontrollgruppe auftrat und bei den Fällen, bei denen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, ist die Menge an Proteinharnstoff vom Tag der Ver-lo abreichung von NT bis zum Tag 10 nach der Verabreichung im wesentlichen die gleiche wie bei einer gesunden Ratte. Das heisst, dass durch die Verabreichung der Verbindungen gemäss der Erfindung eine primäre und sekundäre Immunreaktion inhibiert wird.

15

(5) Therapeutische Wirkung bei heymannartiger Nephritis

Bei diesem Versuch wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 180 bis 200 g verwendet. Rat-tennierenrinde wurde extrahiert und mit einer gleichen Volu-20 menmenge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogene Lösung wurde mit 1500 G 1 Stunde lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Verfahren von T.S. Edington et al, Journal of Expérimental Medicine, 127, 555 (1968) gereinigt und mit Freund's 25 Complete Adjuvant 37 Ra (ein Produkt der Difco Company) im Volumenverhältnis von 0,4:1 vermischt. Die Mischung wurde dann intraperitoneal isologen Ratten in einer Mischung von 0,5 ml/Ratte injiziert. Dann wurde die gleiche Menge dieser Mischung alle 2 Wochen verabreicht bis das 30 Proteinharnstoffniveau 100 mg/Tag überstieg (diese Zeit betrug etwa 6 bis 8 Wochen).

Jede der zu prüfenden Verbindungen wurde intraperitoneal den unter einer heymannartigen Nephritis leidenden Ratten verabreicht (Körpergewicht 300 bis 350 g), und zwar 35 7 Tage lang lmal täglich, und die Mengen an Proteinharnstoff (mg/Tag) wurden in der vorher angegebenen Weise gemessen. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.

40 Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3 Proteinharnstoffniveau (mg/Tag)

geprüfte Verbindung

Tag

vor der

Verabreichung

1

4

7

14

21

Kontrolle

1

132

127

135

126

135

114

2

121

105

121

109

103

105

3

135

117

137

132

121

109

Durchschnitt

129

116

131

122

119

109

erfindungsgemäs-

1

117

89

42

27

3

8

se Verbindung

2

129

127

75

39

17

13

(3 mg/Körper)

3

123

119

58

18

9

7

Durchschnitt

123

112

58

28

3

9

Zwei bis drei Wochen nach Beginn der Versuchsserie hatte 65 dass die erfindungsgemässen Verbindungen heymannartige das Körpergewicht der Ratten auf 400 bis 500 g zugenom- Nephritis heilen können.

men, und es lagen normale Proteinharnstoffniveaus, die 5 bis Zur ausführlicheren Beschreibung der vorliegenden Er-15 mg/Tag betragen, vor. Aus der Tabelle 4 wird ersichtlich, findung wird die Herstellung der erfindungsgemässen Ver-

640 868

10

bindungen der Formel (I) und deren Salze in den folgenden Beispielen beschrieben und in den Referenzbeispielen wird die Herstellung von Nephritis-Behandlungsmitteln erläutert, welche die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel (I) und deren Salze als aktiven Bestandteil enthalten.

Beispiel 1

(a) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30 ml Methanol gelöst; nach Zugabe von 1,5 ml 15n Schwefelsäure wurde die Lösung 3,5 Stunden unter Rückfluss behandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete, der gesammelt und ausreichend mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde auf einer Kieselgelsäule adsorbiert und mit einem Gemisch aus Chloroform/Äthanol abwechselnd (20:1 V/V, 200 ml; 10:1 V/V, 150 ml; 5:1 V/V, 200 ml und 2:1 V/V, 200 ml) entwickelt, wobei man 71 mg 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyrano-syl)-sojasapogenoI B erhielt.

3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapoge-nol B (71 mg), das so erhalten worden war, wurde in 2 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 2 ml I n einer wässrigen NaOH-Lösung gegeben und anschliessend wurde 2 Stunden unter Rückfluss gekocht. Nach dem Vermischen des Reaktionsgemisches mit kaltem Wasser und der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 1 mit In wässriger HCl-Lösung wurde das Gemisch mit n-Butanol extrahiert. Die n-Buta-nolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Beim Umkristallisieren des Rückstandes aus einer Mischung von Chloroform/Aceton (1:1 V/V) erhielt man 50 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B. Schmelzpunkt: 231-232 °C (Zersetzung).

Elementaranalyse für C36H5809

Berechnet: C 68,11 H 9,21%

Gefunden: C 67,85 H 9,08%

Dünnschichtchromatografie über «Kieselgel F254» (Handelsname für ein Produkt der Merck Co.)

1. Chloroform-Methanol-Wasser (65:35:8 V/V/V) Rf =

0,38

2. Isopropanol-2 n wässrige Ammoniaklösung (100:15 V/

V) Rf = 0,21

Löslichkeit: Sehr löslich in Methanol, Äthanol, n-Propa-nol, n-Butanol, wässriger Alkalilösung, Pyridin, Dimethyl-sulfoxid und Dimethylformamid; löslich in Aceton, Äthyl-acetat und Methyläthylketon und schwach löslich in Benzol, Chloroform, Diäthyläther, n-Hexan und Petroläther.

(b) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30 ml in mit HCl gesättigtem Äthanol gelöst und die Lösung wurde 3 Stunden rückflussbehandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete, der gesammelt und mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde dann über einer Kieselgelsäule chromato-grafisch gereinigt (Eluiermittel: Chloroform/Äthanol 20:1 V/V, 200 ml; 10:1 V/V, 150 ml; 5:1 V/V, 200 ml und 2:1 V/ V, 200 ml), wobei 75 mg 3-0-(6-0-Äthyl-ß-D-glucuronpyra-nosyl)-sojasapogenol B erhalten wurden.

Die so erhaltene Verbindung wurde mit 2 ml Äthanol und 2 ml einer In wässrigen KOH-Lösung vermischt, und die Mischung wurde 2 Stunden unter Rückfluss gehalten.

Das Reaktionsgemisch wurde mit kaltem Wasser vermischt und der pH-Wert wurde auf etwa 1 mit einer In wässrigen HCl-Lösung eingestellt und anschliessend wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus einer Mischung von Chloroform und Aceton (1:1 V/V) umkristallisiert, wobei man 45 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenoI B erhielt.

Schmelzpunkt: 231 bis 232 °C (Zersetzung).

Beispiel 2

Sojasaponin B (1 g) wurde in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 5 ml einer 15n wässrigen Schwefelsäurelösung vermischt und anschliessend 2,5 Stun-s den unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule absorbiert und mit einer Mischung aus Chloroform/Äthanol (20:1,10:1 io und 2:1 V/V) entwickelt, wobei man 350 mg 3-0-(ß-D-Glu-curonpyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.

Schmelzpunkt: 231 bis 232 :C (Zersetzung).

Beispiel 3

15 In einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums der nachfolgenden Zusammensetzung gegeben und Stachybotrys sp. T-791 wurde bei 25 °C und einem pH von 5,5 4 Tage lang unter Schütteln kultiviert.

Glyzerin 0,5%

20 Stärke 1,0%

Saccharose 0,2%

Sojabohnenpulver 0,5%

Pepton 0,1%

Malzextrakt 0,2%

25 MgS04 0,3%

HCl 0,05%

In einem 30-Liter-Glasfermentator wurden 201 eines Kulturmediums der obigen Zusammensetzung vorgelegt und ein Kolben der entstandenen Keimkultur wurde in dem Kul-30 turmedium 5 Tage bei 28 °C unter Rühren mit 300 Upm und einem Belüftungsgrad von 11 pro Liter Kulturmedium pro Minute kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit 8000 Upm zentrifugiert, wobei man die Mikrobenzellen entfernte und der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit-35 tels konzentrierter Salzsäure auf etwa 1 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wurde auf der Zentrifuge gesammelt und mit Methanol extrahiert. Die Methanolfraktion wurde auf einer Säule mit Aktivkohle (500 ml) absorbiert, nachdem sie unter vermindertem Druck konzentriert worden war. Die 40 Säule wurde mit einer wässrigen 30%igen Acetonlösung eluiert und dann mit einer wässrigen 50%igen Lösung. Die Fraktion aus der wässrigen 50%igen Acetonlösung wurde gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule 45 aufgenommen und entwickelt, unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform und Aceton (2:1 bzw. 1:1 V/V) als Eluiermittel. Ausserdem wurde eine Fraktion, enthaltend 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B [entsprechend der Fraktion mit dem Rf-Wert von 0,38, die erhalten wurde, so indem «Kieselgel F254» (Handelsname der Merck Co.) unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform-Methanol-Wasser (65:35:8 V/V/V) als Entwicklerlösung erhalten worden war] als Entwickler gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Das Konzentrat wurde ss wiederum auf einer Kieselgelsäule adsorbiert und mit einer Mischung aus Chloroform-Aceton abwechselnd (2:1 und 1:1 V/V) entwickelt, und die Fraktion, die der vorher erwähnten entsprach, wurde gesammelt und anschliessend zur Trockene konzentriert. Beim Umkristallisieren des Rück-6o standes aus einer Mischung aus Chloroform-Aceton (1:1V/ V) wurden 36 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapoge-nol B erhalten.

Schmelzpunkt 231 bis 232 ZC (Zersetzung).

65 Referenzbeispiel 1

Natriumsalz der erfindungsgemässen Verbindung 500 mg

Glucose 250 mg

11

640 868

Destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen zum Injizieren von 5 ml

Das Natriumsalz und die Glucose wurden in destilliertem Wasser für Injektionszwecke gelöst und die Lösung wurde in eine 5 ml Ampulle gegeben. Die Luft wurde durch Stickstoff verdrängt und die Ampulle 15 Minuten zur Sterilisierung der Lösung auf 121 °C erhitzt. Man erhielt eine injizierbare Zubereitung.

Referenzbeispiel 2 Erfmdungsgemässe Verbindung 500 mg halbsynthetische Glycerid- bis zu einer Gesamtmenge base von 2000 mg

Die erfmdungsgemässe Verbindung wurde zu der halbsynthetischen Glyceridbase gegeben und das Ganze wurde bei 50 °C vermischt und suspendiert. Die Mischung wurde in eine Form gegeben und ohne Hilfe abkühlen gelassen. Das Produkt wurde aus der Form entnommen, wobei man ein Suppositorium erhielt.

Referenzbeispiel 3 Erfmdungsgemässe Verbindung 150 g

Avicel (Handelsname für ein Produkt der Asahi Kasei Kabushiki Kaisha) 40 g

Maisstärke 30 g

Magnesiumstearat 2 g 5 TC-5 (Handelsname für Hydroxy-

propylmethylzellulose) 10 g

Polyäthylenglykol 3 g

Castoröl 40 g

Methanol 40 g io Die erfmdungsgemässe Verbindung B, Avicel, Maisstärke und Magnesiumstearat wurden vermischt und zerkleinert und dann in einer üblichen Tablettiervorrichtung (10 mm Radius) für eine Zuckerbeschichtung tablettiert. Die erhaltenen Tabletten wurden mit einem überzugsbildenden Mittel 15 aus TC-5, Polyäthylenglykol 6000, Castoröl und Methanol unter Ausbildung von überzogenen Tabletten beschichtet.

Die Erfindung wurde ausführlich und hinsichtlich besonderer Ausführungsformen beschrieben, aber es ist für den Fachmann ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen und Mo-20 difikationen möglich sind, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

s

1 Blatt Zeichnungen

Claims

640 868

2

PATENTANSPRÜCHE 1. 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B der Formel (I)

-—OH

COOH

0

•OH io

COOR

/C

0

15

ISlI/I

N

— 0^

CH20H

(III)

HO

OH

rCH2OH

(I)

und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I)

in der R eine Niedrigalkylgruppe bedeutet.

20 5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse bei Raumtemperatur bis 150 °C

25 durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse bei 50 bis 110 °C durchgeführt wird.
8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

30 man Sojasaponin B in Wasser oder in einem wässrigen Lösungsmittel in Gegenwart eines Halogenwasserstoffs, einer starken anorganischen Säure oder einer starken organischen Säure teilhydrolysiert und aus dem Teilhydrolysat eine Verbindung der Formel (I) gewinnt.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilhydrolyse bei Raumtemperatur bis 150 °C durchgeführt wird.
10. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilhydrolyse bei 50 bis 110 °C durchgeführt wird.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung mit antikomplementärer Aktivität bei Lebewesen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines Sojasapogenolderivates der Formel (I)

50

dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus Stachybotrys sp. T-791 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, anorganische Salze und Spurenmineralien enthält, bei einem pH von 3,5 bis 11,5 bei einer Temperatur von 15 bis 38 °C kultiviert und das erhaltene Produkt der Formel (I) aus der Kulturbrühe gewinnt.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Produkt in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen 3-0-(6-0-Alkyl-ß-D-gIucuronpyranosyl)-sojasa-pogenol B der Formel (III) hydrolysiert,

60

COOH }—0

n I

•OH
CH.OH &

(I>

011

65

oder ein annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
12. Zusammensetzung gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des Sojasaponinderivates oder des pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon 1 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, beträgt.