DE2014277C3

DE2014277C3 - Verfahren zur Herstellung von Acylderivaten des Antibiotikums T-2636 C

Info

Publication number: DE2014277C3
Application number: DE2014277A
Authority: DE
Inventors: Takeshi Fugono; Eiji Higashide; Komei Osaka Mizuno; Takashi Suzuki; Hiroichi Yamamoto
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-03-31
Filing date: 1970-03-25
Publication date: 1974-10-03
Also published as: DK124197B; CA928653A; GB1310712A; DE2014277A1; SE368705B; NO127918B; FR2034596A1; FR2034596B1; NL7004290A; DE2014277B2; CH533617A; US3676300A

Description

Antibiotikum T-2636C (nachstehend häufig kur als »C« bezeichnet) ist eine farblose, kristalline, fet) lösliche Substanz, die gegen grampositive Bakterie wirksam ist und zwei Hydroxylgruppen in den Stei Jungen 8 und 14 enthält, wie die folgende Formt zeigt:

(I)

'^NHCOCOCH₃

CH,

H₃C

worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum T-2636 C der allgemeinen Formel

NHCOCOCH₃

H,C

HO

NHCOCOCH₃

CH₃

mit Estern organischer Säuren, die einen Acylrcst der Formel R.CO— enthalten, in der R die obengenannte Bedeutung hat, in Gegenwart einer gegebenenfalls gereinigten Kultur der Mikroorganismen Streptomyces rochei var. vclubilis (IFO 12 507), Streptomyces tolypophorus (IFO 12 554), Streptomyces hygroscopicus (IFO 12 703), Aspergillus sojae (IFO 4200) und Trametes; sanguinea (IFO 7045) bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und pH-Werten von 4 bis 9 umsetzt.

In dem Bemühen, neue wertvolle Derivate von C nach einem technisch durchführbaren Verfahren her zustellen, wurde gefunden:

1. C kann in Gegenwart einer Kultur gewissei Mikroorganismen oder eines verarbeiteten Be Standteils der Kultur acyliert werden.

2. Die Acylierung findet spezifisch in der 14-Stellunj; statt, so daß die Ausbeute der Reaktion sehr hoch

3. Das gebildete T-2636 C-14-Monoacylderivat kann durch Chromatographie oder nach anderen üblichen Verfahren in gewünschter Reinheit isolierl

werden.

Der Erfindung liegen diese Feststellungen zugrunde. Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von 14-Monoacylderivaten des Antibiolikums T-2636C der allgemeinen Formel I, worin R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, das dadurch gekennzeichnet i?:, daß man das Antibiotikum T-2636C der allgemeinen Formel

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55

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch wertvollen Äcyldetivaten von Antibiotikum T-2636 C.

Es ist bekannt, daß ein neues, als »Antibiotikum T-2636 C« bezeichnetes Antibiotikum in einer Kulturbrühe eines neuen Stammes der Gatturig Streptomyces, nämlich Streptomyces rochei var. volubilis

i^NHCOCOCH,

CH₃
H₃C O

mit Estern organischer Säuren, die einen Acvlrest der

Formel R.CO — enthalten, in der R die obengenannte Bedeutung bat, in Gegenwart einer gegebenenfalls gereinigten Kultur der Mikroorganismen Streptomyces röchet var. volubilis (IFO 12 507), Streptomyces tolypophorus (IFO 12 554), Streptomyces hygroscopicus (IFO 12 703), Aspergillus sojae (IFO 4200) und Trametes sanguinea (IFO 7045) bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und pH-Werten von 4 bis 9 umsetzt. Die IFO-Nummern in Klammern sind die Hinterlegungsnummera beim Institute for Fermentation, Osaka. Von diesen Stämmen ist Streptomyces rochei var. volubilis am vorteilhaftesten für die gemäß der Erfindung zu lösende Aufgabe, da der Stamm selbst eine große Menge C anreichert und es somit ermöglicht, das gewünschte C-14-Monoacylderivat lediglich durch Behandlung der Kultur mit einem geeigneten Ester einer organischen Säure zu erhalten.

Als Ester von organischen Sauren eignen sich beispielsweise die Ester von Fettsäuren, die gegebenenfalls relativ niedere Substituenten enthalten. 7. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure usw.. mit niederen Alkoholen wie Methanol, Äthanol. Propanol, Äthylenglykol und Glycerin. Insbesondere sind Methylformiat, Äthylacetat. Äthvlpropionat. Monoacetin und Triacetin zu erwähnen. In jedem Fall wird das dem verwendeten Ester der organischen Saure entsprechende C-14-Monoacylderivat erhalten.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird eine Kultur der vorstehend genannten Mikroorganismen oder ein verarbeiteter Bestarid'eil dieser Kultur verwendet. Der hier gebrauchte Ausdruck »verarbeiteter Bestandteil« bezeichnet jede Fraktion, die in höherem Maße als die Kultur selbst die Fähigkeit hat. C in der I4-Stellung zu acylieren, und die durch Reinigung der Kultur beispielsweise durch Lösungsmittelextraktion oder mit Hilfe eines Adsorptionsmittels oder eines lonenauslauscherharzes erhalten werden kann.

Als verarbeitete Bestandteile kommen beispielsweise die rohen Enzyme, die aus der Kultur von Streptomyces rochei var. volubilis. Streptomyces to}ypophorus, Streptomyces hygroscopicus erhalten werden, das aus einer Kultur von Aspergillus sojae erhaltene rohe Esterasesystem (Journal of Fermentation Technology, Vol. 40. P 610. 1962) und das aus einer Kultur von Trametes sanguinea erhaltene rohe Cellulasesystem (japanische Patentveröffenllichung 217 45/66) in Frage. Die jeweiligen rohen Enzyme werden in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften für verschiedene Zwecke verwendet. Neu ist die Feststellung, daß diese Systeme für die Zwecke der Erfindung geeignet sind.

Mit steigender Menge des Esters und mit langer werdender Reaktionszeit steigt der Umsatz zum gewünschten Produkt. Die Reaktionszeit variiert mit den Reaktionsbedingungen. Im allgemeinen sind mehr als 30 Minuten für die Reaktion erforderlich. Bei Verwendung eines Esters einer organischen Säure, der mit Wasser nicht mischbar ist, ist es zweckmäßig, das Reaktionssystem zu rühren, bis sich eine Emulsion gebildet hat. Die Reaktionstemperatur und der pH-Wert sind bei verschiedenen Arten von Kulturen oder Enzymen verschieden.

Als Lösungsmittel Tür die Extraktion des gebildeten C-14-MonoacyIderivats wird der in der Kulturbrühe verbliebene Ester der organischen Säure sowie ein zusätzlich zu diesem Ester zugegebenes organisches Lösungsmittel, z. B. Methylisobutylketon, Benzol und Chloroform, verwendet. Die Lösungsmittelphase wird mit einer wäßrigen Lösung eines schwach alkalischen Salzes wie Natriumhydrogencarbonat und dann mit Wasser gewaschen, worauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt wird. Das erhaltene Konzentrat enthält ein C-14-Monoacylderivat und den nicht umgesetzten Teil von C. Zur Isolierung des gewünschten Produkts vom Konzentrat kann eine Cbromatograpbiesäule, die mit einem Adsorptionsmittel wie Kieselgel (für Chromatographie geeigneter Typ, Nr. 0,05 bis QX Merck) gefüllt ist, verwendet werden. Das Konzentrat wird zunächst mit einer geeigneten Menge eines Lösungsmittels von niedriger Polarität, z. B. Benzol oder Chloroform, verdünnt und Chromatographien. Das an der Säule adsorbierte Produkt wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. einem Gemisch von Benzol und Allylacetat, ehriert. Die Fraktion, die die gewünschte Verbindung enthält, wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Derivat scheidet sich ohne weitere Behandlung oder beim Stehenlassen des Konzentrats nach Zusatz einer geeigneten Menge beispielsweise von Äther oder Petroläther in Form von Kristallen ab.

Die verschiedenen C-14-Acylderivate haben die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

Physikalische und chemische Eigenschaften

a) C-14-Monoformiat

Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacctat-Diäthyläther, Schmelzpunkt 175 bis 177⁰C; [«]" = 276,0³C (C = 1.0 in Äthanol).

Elementaranalyse für C₂₆H₃₃N¹J₈:
Berechnet ... C 64,04, H 6,82. N 2,87%;
gefunden .... C 63.90, H 6.72. N 3,06%.

Ultra violett-Absorptionsspektrum:
/.,',,'.I;"227 (EU = 1010>.

b) C-14-Monoacetat (T-2636A)

Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacetat; Schmelzpunkt 200 bis 202⁰C; [«]? = -235°C(C = 1,0 in Äthanol).

Elementaranalyse für C₂₇H₃₅NO₈:

Berechnet ... C 64.67, H 6,99, N 2,79%;
gefunden .... C 64,59, H 7,05, N 2,99%.

c) C-14-Monopropionat

Farblose Plättchen nach Umkristallisation aus Äthylacetat-Diäthyläther; Schmelzpunkt 188 bis 199°C;[«]!? = 254,3°C(C = 1,0 in Chloroform).

Elementaranalyse Tür C₂₈H₃₇NO₈:
Berechnet ... C 65,23, H 7,23, N 2,72%;
gefunden .... C 65,17, H 7,24, N 2,94%.

Die C-14-Monoacylderivate haben eine geringere Toxizität und eine höhere Wirksamkeit als das" als Ausgangsprodukt verwendete Antibiotikum T-2636C,

wie beispielsweise die folgenden Versuchsergebnisse zeigen:

Verbindung

C-14-Monoforraiat ,.

C-14-Monoacetat

C-14-Monopropionat

Akute

Taxuitiii·)

(LD₅₀). mg \g

Körpergewicht

4100

5000— iOOOO

8000—10000

> 10000

Effektive

Dosis"!

lEDsa). me %$ Körpergewicht ■

50 40 32,5 38,5

*) Eine Emulsion der Testverbindung in 5%igem Gummiarabikum wurde Gruppen von 4 Wochen alten männlichen Mäusen (Stamm ICR-JCL/T) mtraperitoneal verabfolgt Nach 7 Tagen wurde die mittlere Letaldosis (LD₅₀) berechnet

**J 4 Wochen alte männliche Mäuse wurden mtraperitoneal mit Staphylococcus aureus 308A-I infiziert. Unmittelbar anschließend wurde ihnen eine Emulsion der Testverbindung in 0.2%iger Carboxymethylcellulose oral verabreicht, worauf die mittlere effektive Dosis ED₅₀ ermittelt wurde

Die Herstellung der Ausgangsverbindung C wird im folgenden Versuch beschrieben. Anschließend wird die Herstellung von C-14-MonoacyIderivaten iu Ausführungsbeispielen beschrieben. In diesen Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Versuch

1,5 Raumteile eines Mediums, das 1 '0 lösliche Stärke, 2% Maisquellwasser, 0,3% Pcpton und 1% gefälltes Calciumcarbonat enthält, wird in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 3 Raumteilen hat und 15 Minuten unter einem Druck von 1,5 kg/cm² sterilisiert wird. In den Fermenter wird eine Kultur von Streptomyces rochei var. volubilis T-2636 (IFO 12 507) aus Schrägagarkulttiren geimpft, worauf 42 Stunden bei 28 C bebrütet wird. Die Kulturbrühe wird in einen sterilisierten Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat und 100 Raumteile des Mediums der obengenannten Zusammensetzung enthält.

Die Kultivierung wird als Submerskultur bei einer Temperatur von 28"C und 50% Belüftung pro Minute pro Raumteil des Mediums unter Rühren mit 200 UpM durchgeführt. 60 Raumteile der erhaltenen Impfkultur werden in einen Hauptfermenter überführt. In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 6000 Raumteilen hat, we^rden 4000 Raumteile eines Mediums £2geben, das 3% Glycerin, 2% Maisquellwasser. 1% Baumwollsaattnehl, 0,2% Pepton und 0.5% Natriumchlorid enthält (pH 6.8). wprauf das Medium sterilisiert wird. In den Fermenter wird die obengenannte Impfkultur gegeben, worauf 44 Stunden bei 28° C und 50% Belüftung pro Minute pro Raumtcil des Mediums unter Rühren mit 150UpM bebrütet wird. Nach der Bebrütungszcit haben sich 200 ; ml C in der Kulturbrühe angereichert.

Beispiel 1 _fto

2000 Raumteile der beim vorstehend beschriebenen Versuch erhaltenen Kulturbrühe werden mit 60 Gcwichtsteilcn eines Filterhilfsmittels filtriert. Die Zellen werden anschließend mit 400 Raumteilen Wasser gewaschen. Das. Filtrat wird mit dem Waschwasser vereinigt, worauf 1000 Raumteile Älhylacetat zugesetzt werden. Das iJcmisch wird 30 Minuten gerührt und dann etwa 2 Stunden stehengelassen. Die organische Phase wird roit 200 Rauroteilen Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auT 20 Rauroteile eingeengt. Das Konzentrat wird zweimal mit je

5 Raumteilen einer 2%igen wäßrigen Natriurabicarbonatlösung und dann mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf eine weitere Einengung auf 2 Raumteile vorgenommen wird. Das Konzentrat wird mit

6 Rauroteilen Benzol verdünnt und an einer Säule, die 2 Gewicbtstetle Kieselgel enthält, das in Benzol suspendiert worden ist, adsorbiert. Dann wird ein Gemisch von Benzo! und Ätbylacetat (1:!) durch die Säule geleitet, wobei das C-14-Monoacetat zuerst aus der Säule austritt, worauf C erscheint Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei C-14-Monoacetat in Form von Stäbchen erhalten wird. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat werden 0,15 Gewichtsteile reine Kristalle erhalten.

Schmelzpunkt 20G bis 202° C; [«]? = -235 C (Γ = 1,0 in Äthanol).

Elementaranalyse (C₂₇H₃₅NO₈):

Berechnet ... C 64,67, H 6,99, N 2.79%;
gefunden .... C 64,59, H 7,05, N 2,99%.

Beispiel 2

Zu 3000 Raumteilen d"s im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Methylacetat gegeben. Das Gemisch wird 4 Stunden bebrütet. Es wird dann stehengelassen, worauf die wäßrige Phase mit 1000 Raumteilen Mcthylisobutylketon extrahiert wird. Die organischen Phasen werden vereinigt und zweimal mit je 400 Raumteilen einer 2%igen wäßrigen Natriumbicarbonatiösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.

Zu 5 Raumteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform gegeben. Das Gemisch wird mit 20 Gewichtsteilen Kieselgel auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Die effektive Fraktion wird eingeengt, wobei 0,05 Gewichtsteile C-14-Monoacetat erhalten werden.

Schmelzpunkt 201 bis 204° C.

Elemcntaranalyse (C₂7H,₅NO₈):

Berechnet ... C 64,67. H 6,99, N 2,79%;
gefunden .... C 63,95, H 6,76, N 3,00%.

Beispiel 3

Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Propylacctat zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bebrütet. Es wird dann stehengelassen, worauf die wäßr^:ge Phase mit 1000 Raumteilen Meihylisobutylketon extrahiert wird. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit 400 Raumteilen 2%igcr wäßriger Natriumbicarbonatiösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.

Zu 5 Rauinteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform gegeben, worauf das Gemisch mit 20 Gewichtstcilen Silicagel.auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wild. Die effektive Fraktion wird eingeengt, wobei 0,15 Gewichtsteile C-14-Monoacetat erhalten werden.

Schmelzpunkt 201 bis 204⁰C.

Elcmenlaranalysc (C₂₇H₁₅NO₈):

Berechnet ... C 64,67, H 6,99. N 2.79%;
gefunden .... C 63,98, H 6.70. N 3.02%.

Beispiel 4

Zu 3000 Raumteücn des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raiimteile Äthylformiat zugesetzt, worauf das Oemisch 4 Stunden bebrütet wird. Danach wird stehengelassen. Die wäßrigen Phasen werden dann mit 1000 Raumteilen Methylisobutylketon extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt. 2mal mit 400 Raumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen,und schließlich wird unter vermindertem Druck eingeengt.

Zu 5 Raumteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform zugegeben, worauf das Gemisch mit 20 Gewichtsteilen Silicagel auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt wird. Die Monoformiatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, worauf säulenförmige Kristalle von C-14-Monoformiat erhalten werden, die nach Umkristallisation aus Diäthyläther 0,23 Gewichtsteile reine Kristalle ergeben

Schmelzpunkt 175 bis 177"C; [«]? = -276,0" C (C = 1,0 in Äthanol).

Elemenlaranalyse (C₂₆H₃₃NO₈):
Berechnet ... C 64,04, H 6,82, N 2.87%;
gefunden .... C 63,90, H 6,72, N 3,06%. '

UV-Absorptionsspektrum:
/1,'.,',"'227IT^ (EJ* = 1010).

Beispiel 5

Zu 3000 Raumteilen des im oben beschriebenen Versuch erhaltenen Filtrats werden 600 Raumteile Äthylpropionat zugesetzt, worauf das Gemisch 4 Stunden bebrütet wird. Nach Stehenlassen wird die wäßrige Phase mit 1000 Raumteilen Methylisobutylketon extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit 400 Raumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf unter vermindertem Druck eingeengt wird.

Zu 5 Raumteilen des Konzentrats werden 20 Raumteile Chloroform zugesetzt, worauf die Mischung mit 20 Gewichtstetlen Silicagel auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wird. Die Monopropionatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei Säulen von C-14-Monopropionat erhalten werden. Nach Umkristallisation aus Diäthyläther beträgt die Ausbeute an reinen Kristallen 0,23 Gewichtsteile.

Schmelzpunkt 198 bis 199°C; [«]? = -254,3°C (C = 1,0 in Chloroform).

Elementaranalyse (C₂₈H₃₇NO₈):
Berechnet ... C 65,23, H 7,23, N 2,72%;
gefunden .... C 65,17, H 7,24, N 2,94%.

enthält. Die Bebrütung wird 42 Stunden bei 28 C vorgenommen. Die erhaltene Kulturbrühc wird zusammen mit 3% Filterhilfsmittel filtriert. Zu 1000 Raumtcilcn des Filtrats wird nach Entfernung von ToIypomycin (ein von St. tolypophorus gebildetes Antibiotikum) durch Extraktion eine Lösung von 2 Gewichlsteilen C in 10 Raumteilen Methanol und 100 Raumteilen Monoacetin zugesetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden der Reaktion bei 37°C überlassen.

Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Gemisch mit 500 Raumteilen Äthylacetat extrahiert und der Extrakt mit 200 Raumteilen Wasser gewaschen und auf 20 Raumteile eingeengt. Das Konzentrat wird 2mal mit 5 Raumteilen 2%iger wäßriger Natrium-

bicarbonatlösung und danach mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen und bis auf 5 Raumteile weiter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 15 Raumteilen Benzol verdünnt und an einer Säule adsorbiert, die mit 5 Gewichtstetlen von in Benzol suspendiertem Silicagel beschickt ist. Auf die Säule wird ein Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) gegeben, worauf das C-14-Monoacetat zuerst die Säule verläßt, gefolgt von nichtacyliertem Produkt. Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei Säulen von C-14-Monoacetat erhalten werden. Die Auf^-eutean reinen Kristallen beträgt nach Umkristallisation aus Äthylacetat 0,10 Gewichtsteile.
Schmelzpunkt 202 bis 204T.

Elementaranalyse (C₂₇H₃₅NO₈):

Berechnet ... C 64.67, H 6,99. N 2,79%;
gefunden .... C 64.68. H 6.97. N 2,89%.

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Beispiel 6

Streptomyces tolypophorus (IFO 12544) wird verwendet, um ein Medium (pH 7,0) zu impfen, das 2,0% Glucose, 3,0% lösliche Stärke, 1,0% Maisquellwasser, 1,0% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% gefälltes Calciumcarbonat

Beispiel 7

45 Raumteile des nach Beispiel 1 mit Äthylacetat extrahierten Filtrats der Kulturbrühe wird bei 40^rC unter vermindertem Druck auf 7,5 Teile eingeengt. Hierauf werden 45 Raumteile Äthanol bei 0 bis 5" C diesem Konzentrat zugesetzt, worauf 30 Minuten stehengelassen wird. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und gibt 1 Gewichtsteil rohes Enzym.

1 Gewichtsteil des rohen Enzyms wird in 1000 Raumteilen Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 M) gelöst. Die Lösung wird mit 2 Gewichtsteilen von C, gelöst in 1000 Raumteilen Äthylacetat, vereinigt, ui.d das Gemisch wird 3 Stunden bei 37° C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch getrennt Die organische Phase wird mit 200 Raumteilen Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf 20 Teile eingeengt. Das Konzentrat wird 2mal mit 5 Raumteilen 2%iger wäßriger Bicarbonatlösung und danach mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf weiter bis zu einer Menge von 5 Raumteilen eingeengt wird. Das erhaltene Konzentrat wird mit 15 Raumteilen Benzol verdünnt und auf einer Säule an 5 Gewichtsteilen Silicagel adsorbiert, das vorher in Benzol suspendiert worden war. Auf die Säule wird ein Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) aufgegeben und durchlaufen gelassen, wobei C-14-Monoacetat die Säule erst verläßt, gefolgt von C. Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei das C-14-Monoacetat in Form von Säulen erhalten wird. Die Umkristallisation aus Äthylacetat ergibt 1.8 Gewichtsteile reiner Kristalle.

Schmelzpunkt 200 bis 202⁰C.

Elementaranalyse (C₂₇H₁₅NO₈):

Berechnet ... C 64,67, H 6,99, N 2,79%:
gefunden .... C 64,63, H 7,01, N 2,9.V¹/,,.

Beispiel«

1000 Gewichtsteile Weizcnkleie werden mit 1000 Raumteilen Leitungswasser befeuchtet und bei 115 C 15 Minuten sterilisiert. Die sterilisierte Kleie wird mit Aspergillus sojae (IFO 4200) bebrütet und anschließend I Woche bei 28° C die Züchtung fortgesetzt. Die als Kultur verwendete Kleie wird mit 4000 Volumteilen destilliertem Wasser extrahiert und filtriert. 3000 Raumteile des Filtrats werden mit 7000 Raumteilen Aceton versetzt. Nach 2'4stündigem Stehen wird das ausgefallene Produkt durch Zentrifugieren gesammelt, wobei 10 Gewichtüteile rohe Esterase erhalten werden.

In 1000 Raumteilen Tris-Puffer (pH 7,0, 0,1 M) werden 10 Gewichtsteile des rohen Esterasepräparats gelöst. Zu dieser Lösung werden 2 Gewiclhtsteile von C in 10 Raumteilen Methanol und 130 Raumteile Monoacetin zugegeben. Das Gemisch wird bei 37" C für 3 Stunden reagieren gelassen, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird.

Der Extrakt wird mit 200 Raumteilen Wasser gewaschen und auf 20 Raumteile unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird 2mal mit 5 R lumteilen 2%iger Natriumbicarbonatlösung und danach mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf weiter bis auf 5 Raumteile eingeengt wird. Das Konzentrat wird mit 15 Raumteilen Benzol verdünnt und auf einer Säule an 5 Gewichtsteilen Silicagel. das in Benzol suspendiert worden war, adsorbiert. Dann wird ein Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) durch die Säule gegeben, wobei C-14-Monoacelat zuerst aus der Säule austritt, gefolgt von C. Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei säulenförmiges C-14-Monoacetat erhalten wird. Die Ausbeute an Umkristallisation aus Allylacetat beträgt 0,055 Gewichtsteile an reinen Kristailen.

Schmelzpunkt 201 bis 202 C.

Elementaranalyse (C₂₇H₁₅NO₈):

Berechnet ... C 64,67. H 6.99. N 2.79%:
gefunden .... C 64.69. H 6.98. N 3.03%.

Beispiel 9

Ein sterilisiertes wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 6.0.das 6% Saccharose, 3% Sojabohnenpreßkuchen. 3% Miiisquellwasser, 1% gemahlenen Holzzcllstoff (powdered pulp), 0,2% monobasisches Kaliumphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat (als Heptahydrat) enthält, wird mit Trametes sanguinea (IFO 7045) beimpft. Das Medium wird mit 160 Umclrehungen/Minute bei 100% Belüftung gerührt. Die Züchtungsdauer beträgt bei 28 C 138 Stunden. Nach Einstellung des pH-Werts auf 4,0 mit Schwefelsäure wird die Kulturbrühe filtriert. Dann werden 500 Gewichtsteile Ammoniumsulfat zu 1000 Raumteilen des Filtrats zugegeben, wobei ein Niederschlag entsteht. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, bei 35°C getrocknet und ergibt 10 Gewichtsteile rohes Cellulasepräparat.

In 1000 Raumteilen Tris-Puffer (pH 7,0.0,1 M) werden 10 Gewichtsteile der rohen Cellulase gelöst, worauf zu dieser Lösung 2 Gewichtsteile C in 10 Gewichtsteilen Methanol und 130 Raumteile Monoacetin zugesetzt werden. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 37°C reagieren gelassen, danach wird mit 500 Raumteilen Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit 200 Raumteilen Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf 20 Raumteile eingeengt. Das Konzentrat wird 2mal mit 5 Raumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und darauf mit 5 Raumteilen Wasser gewaschen, wonach weiter bis auf 5 Raumteile eingeengt wird. Das Konzentrat wird mit 15 Raumteilen Benzol verdünnt und auf einer Säule an 5 Gewichtsteilen Silicagel, das in Benzol suspendiert worden war, adsorbiert. Dann wird ein Gemisch aus Benzol/Äthylacetat (1:1) durch die Säule gegeben, wobei C-14-Monoacetat zuerst austritt, gefolgt von C. Die Monoacetatfraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei säulenförmiges C-14-Monoacetat erhalten wird. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat beträgt die Ausbeute an reinem Kristall 0,075 Gewichtsteile.

Schmelzpunkt 202 bis 204° C.

Elementaranalyse (C₂₇H₃₅NO₈):
Berechnet ... C 64.67, H 6,99. N 2,79%;

gefunden

C 64,59. H 7,03, N 3,00%.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von l4"Monoacylderivateu des Antibiotikums T-2636 C der allgeraelnen Formel

R-CO

gebildet wird und In guter Ausbeute aus der Kultui brühe isoliert werden kwro (s. belgisches Patei