DE2248793C3

DE2248793C3 - Verfahren zur Herstellung von Macrolid-Antibiotika

Info

Publication number: DE2248793C3
Application number: DE19722248793
Authority: DE
Inventors: Tamotsu Tokio Furumai; Tadashi Kasugabe Setoguchi; Makoto Urawa Saitama Suzuki; Katuo Omiya Takeda
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1972-10-05
Filing date: 1972-10-05
Publication date: 1975-07-31
Also published as: DE2248793A1; DE2248793B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika, die als DOA-, DOP-, EOA- und EOP-Verbindungen bezeichnet werden.

Es ist bekannt, daß ein Macrolid-Antibiotikum, das als YL 604 bezeichnet wird, beim Züchten von Streptomyces platensis var. sp. NRRL 3761 in einem üblichen Nährmedium erzeugt wird (vgl. japanische Patentschrift 28 836/1971). Dieses Macrolid-Antibiotikum besteht aus wenigstens zwei Gruppen von •ntibiotischen Substanzen, von denen b"ie eine als YL 704 A und die andere als YL 704 B bezeichnet wird. Jede dieser Gruppen ist in zwei Komponenten

CH,CHO

in der R die Acetyl- oder Propionylgruppe und X die — CH — CH-Gruppe oder die

-CH CH-Gruppe

bedeutet, ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces platensis sp. NRRL 3761 bei einem etwa neu

aufteilbar, und zwar die erstere in YL 704A₁ und YL 704A₂ und die zweite in YL 704B₁ und YL704B₂. Jede dieser vier Komponenten des Macrolid-Antibiotikums YL 704 stellt ein 16gliedriges Lacton dar, das mit Mycarosylmycaminose und mit einer O-Isovaleryl- oder -propionyl-Gruppe in der 4-SteIlung des Mycaroseanteils verknüpft ist.

Es wurde ein Verfahren gefunden, nachdem es möglich ist, ebenfalls unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Stamm Streptomyces platensis andersartige Macrolid-Antibiotika herzustellen. Das erfindurigsgemäße Verfahren zur Herstellung von Macrolid-Antibiotika der allgemeinen Formel

OH

tralen pH-Wert in Gegenwart von 0,005 bis 0,40% (Gewicht/Volumen) metallischen Zinks, Zinksulfats oder Zinkchlorids bei einer Temperatur von 25 bis 35 C unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Nährmedium züchtet und anschließend die gebildeten Antibiotika nach üblichen Methoden aus der Fermentationsbrühe abtrennt.
Es war nicht öhre weiteres voraussehbar, daß

each dem crfindungsgemäßen ^verfahren andere Macrolid-Antibiotika erhalten werden wurden als η ich 4eoi bekannten Verfahren.

Man erhält dabei vier Macrolid-Antibiotika, die fcier wie folgt bezeichnet werden: '

DOA-Verbindung:
R = Acetyl, X = - CH -~- CH -

DOP-Verbindung:

R = Propionyl, X = — CH =CH -

EOA-Verbindung: / \
R = Acetyl, X = CH CH

EOP-Verbindung: / \

R = Propionyl, X = — CH —- CH

'5

Die morphologischen Eigenschaften sowie die Züchtungscharakteristika des Mikroorganismus Strepto- _M myccs platcnsis var. sp. NRRL 3761. der bei der Agricultural Research Service Culture Collection of United States Department of Agriculture. Peoria. Illinois, USA. hinterlegt ist. sind in der japanischen Patentschrift 28 836 1971 beschrieben.

Die durchzurührende Fermentation kann als Schüttelfermentation oder als Submersfermentation unter aeroben Bedingungen durchgefiihrt werden. Man kann die üblichen Nährmittel, wie sie zum Züchten von Schimmelpilzen eingesetzt werden, zur Durchführung der Fermentation verwenden. Beispielsweise eignen sich Stärke. Glukose, Glyzerin sowie Dextrin als Kohlenstoffquelle. Beispiele für geeignete Stickstoffliefernde Materialien sind Fleischextrakt, Pepton. Hefeextrakt. Sojabohnenmehl sowie Baumwollsamenmehl. Natriumchlorid, Calciumcarbonat od. dgl. eignen sich als anorganische Elemente. Die Menge des zu verwendenden metallischen Zinks oder von Zinksulfat oder Zinkchlorid, die dem Medium zugesetzt wird, beträgt 0,005 bis 0,40% (Gewicht Volumen), insbesondere 0.01 bis 0,25% (Gewicht Volumen). Zur Durchführung einer Submersfermentation kann ein Antischüumungsmittel. wie z. B. ein Silikonöl, ein pflanzliches Ol oder ein grenzflächenaktives Mittel dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Die Fermentation wird bei etwa neutralem pH-Wert sowie bei 25 bis 35 C, insbesondere bei ungefähr 27 C. durchgefiihrt. Die Menge der sich in dem Fermentationsmedium anreichernden Macrolid-Antibiotika IaBt sich ohne weiteres während der Fermentation. beispielsweise dadurch ermitteln, daß man eine kleine Menge der Fermentationsbrühe nitriert, dann das Filtrat auf einen pH-Wert von 8,0 einstellt, hierauf das Filtrat mit Äthylacetat extrahiert und den Äthylacetatextrakt zur Trockne eindampft. Dann wird der erhaltene Rückstand auf einer dünnen Schicht aus Aluminiumoxid entwickelt, wobei eine äquivalente Mischung aus Benzol und Aceton als Lösungsmittel verwendet wird. Die Konzentration der vorhandenen Macrolid-Antibiotika wird aus dem reflektierenden UV-Absorptionsspektrum (Wellenlänge 232 πΐμ, 280 ηΐμ) der Flecken abgeschätzt, die auf dem Dünnschiehtchromatogramm festgestellt werden. Die maximale Ausbeute an den betreffenden Macrolid-Antibiotika wird nach 34- bis 80stündiger Fermentation erzielt.

Die Macrolid-Antibiotika werden hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Fermentationsbrühe angereichert. Nach dem Wachsen der Mikroorganismen werden Myzel sowie andere feste Komponenten aus der Fermentationsbrühe durch Filtration und oder durch Zentrifugieren, falls erforderlich, entfernt, wobei Diatomecnerde als Filterhilfsmittel eingesetzt wird. Die Abtrennung der Macrolid-Antibiotika erfolgt nach üblichen Methoden. Beispielsweise wird das Filtrat oder die überstehende Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 oder darüber gebracht, worauf eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform oder Methylendichlorid, oder mit einem Fettsäureester, wie Methylacetat, Äthylacetat oder Butylacetat, oder mit einem Keton, wie Aceton oder Methylisobutylketon, oder mit einem Alkanol, wie Butanol oder Amylalkohol, durchgeführt wird. Der Extrakt wird hierauf erneut mit angesäuertem Wasser (pH 5,5) extrahiert und die wäßrige Lösung nach Einstellung auf einen pH-Wert von 8,0 nochmals mit dem gleichen organischen Lösungsmiltel. wie es vorher angewandt worden ist, extrahiert Durch Eindampfen des Extraktes werden die betreflcnden Macrolid-Antibiotika in Form eines rohen 1'ulvciS mit schwach basischer Natur erhalten. Die Verfahrensprodukte können auch in der Weise abgetrennt werden, daß das 1 iltrat oder die überstehende Lösung der Fermentationsbrühc mit einem Adsorptionsmittel, beispielsweise mit Aktivkohle. Bentonit. Aluminiumoxid oder Kieselgel in Kontakt gebracht wird, worauf das Adsorptionsmittel mit wäßrigem angesäuertem Methanol oder Aceton extrahiert und dann der Extrakt zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft wird.

Die Reinigung der erhaltenen rohen Macrolid-Antibiotika oder deren Trennung in die betreffenden Komponenten lassen sich ir'ttels einer Säulenchromaiographie oder einer Gegenstromverteilung durchführen. Zur Durchführung der Säulenchromatographie wird ein Adsorptionsmittel, beispielsweise Kieselgel. Aluminiumoxid. Kieselsäure oder Aluminiumsilikat verwendet. Halogenicrtc Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Chloroform, oder Fettsäureester, beispielsweise Methylacetat oder Äthylacetat, oder Ketone, beispielsweise Aceton oder Methylethylketon, oder Alkanole, beispielsweise Methanol oder Äthanol, oder eine Mischung aus diesen Lösungsmitteln oder eine Mischung aus einem dieser Lösungsmittel mit einem nicht polaren Lösungsmittel, beispielsweise Benzol, eignen sich als Lösungsmittel für die chromatographische Entwicklung. Wird die Gegenstromverteilungsmethode angewendet, dann ist es zweckmäßig, zwei nicht mischbare Lösungsmittel zu verwenden, beispielsweise ein organisches Lösungsmittel wie Benzol oder Äthylacetat sowie eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von 6,0.

Die erfindungsgemäß hergestellten Macrolid-Antibiotika zeigen eine stark inhibierende Wirkung auf das Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen, insbesondere auf das Wachstum von grampositiven Bakterien. Darüber hinaus können sie als Zwischenprodukte zur Synthetisierung von anderen Macrolid-Antibiotika verwendet werden, von denen einige dafür bekannt sind, daß sie wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen. Weiterhin können einige der hergestellten Verbindungen auch als Vorläufer zur fermentativen Herstellung von Macrolid-Antibiotika eingesetzt werden.

Es wurde die ln-vitro-Aktivität der obengennten

und im Beispiel hergestellten vier Macrolid-Antibiotika, nämlich von der DOA-, DOP-, EOA- und EOP-Verbindung, nach der Agarverdünnungsmethode ermittelt.

Die minimale inhibierende Konzentration der Testverbindungen wurde durch eine Reihenuntersuchung »ach der zweifachen Agarverdünnungsmethode geprüft, wobei Herzinfusionsagar als Züchtungsmedium verwendet wurde. Die Testmikroorganismen wurden vorher 18 bis 24 Stunden lang auf der Trypticase-

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

IO

sojabrühe gezüchtet, und ein Löffel voll einer Zellsuspension, die etwa 10⁷ lebensfähige Zellen pro Millimeter an Testmikroorganismen enthielt, wurde auf jede Prüfplatte aufgestrichen. Die Platten wurden bei 37° C inkubiert und das Wachstum des Mikroorganismus auf der Platte routinemäßig 48 Stunden später untersucht Die minimale inhibierende Konzentration der Testverbindungen wurde je nach der Verhinderung des sichtbaren Wachstums der Testmikroorganismen eingestuft.

Organismen

Staphylococcus aureus FDA 209 P
Staphylococcus aureus Terashima .

Staphylococcus aureus Smith

Staphylococcus epidermidis 10131

Streptococcus faecalis

Bacillus subtilis PCI 219

Escherichia coli NIHJ

Klebsiella pneumoniae

Pseudononas aeruginosa A₃

Proteus vulgaris

	Minimale inhibierende	Konzentration (meg	ml)	EOP-Vcrb
DOA-Verb.		EOA-Verb.		1.56
1.56		3,13		3.13
0,78		3,13		6,25
3,13		6,25		3.13
3,13		6,25		2S
25		12.5		3.13
3,13		3,13		> !(KM)
>100		>100		K)O
50		50		>1(M)
> 100		>100		HX)
100		100
DOP-Verb
3,13
1,56
6,25
6,25
12,5
3.13
>100
100
>100
100

Aus den erhaltenen Werten ist ersichtlich, daß die geprüften Macrolid-Antibiotika stark inhibierende Wirkungen auf das Wachstum von Mikroorganismen, insbesondere auf das Wachstum von grampositiven Bakterien, besitzen. Sie eignen sich damit als Desinfektionsmittel oder Chemotherapeutika.

In ihrer Eigenschaft als Zwischenprodukt für die Herstellung von wertvollen anderen Macrolid-Antibiotika kann beispielsweise aus der E OA-Verbindung das bekannte CarbomycinA (vgl. USA.-Patentschriften 2 771 392 und 2960438) und aus der DOA-Verbindung das bekannte Carbomycin B hergestellt werden.

Beispiel

151 eines wäßrigen Nährmediums, das 1,5% (Gewicht Volumen) Stärke, 1,0%(Gewicht Volumen)Glukose, 0,8% (Gewicht/Volumen) Sojabolinenmehl.0,1% (Gewicht/Volumen) Glutenbeschickung, 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid, 0,2% (Gewicht/Volumen) Calciumcarbonat, 0,05% (Gewicht/Volumen) sekundäres Kaliumphosphat sowie 0,06% (Gewicht/ Volumen) Zinksulfat-7-hydrat enthält, werden in ein 30-1-Fermentationsgefäß gegeben. Das Medium wird mittels Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und bei einer Temperatur von 120⁰C im Verlaufe von 20 Minuten in einem Autoklav sterilisiert. Ferner wird eine Impfkultur in der Weise hergestellt, daß man Streptomyces platensis var. sp. NRRL 3761 48 Stunden lang in einem Nährmedium züchtet, das die vorstehend geschilderte Zusammensetzung aufweist, mit der Ausnahme, daß kein Zinksulfat-7-hydrat enthalten ist. Dann werden 150 ml dieser Impfkultur aseptisch auf das oben angeführte Medium aufgeimpft, und hierauf wird das Medium bei 27" C unter Belüften und Rühren gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums steigt allmählich an und erreicht nach ungefähr 120stündiger Züchtung den Wert von 7,6. Nach 24- bis 48stündiger Züchtung reichern sich die Macrolid-Antibiotika der oben angegebenen allgemeinen Formel an, und nach ungefähr 72 Stunden wird die maximale Ausbeute erhalten.

1001 der auf diese Weise erhaltenen Fermentationsbrühe werden dann mit Hilfe von 2% (Gewicht Volumen) Diatomeenerde filtriert. Dabei erhält man 981 Filtrat. Das Filtrat wird mittels wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, dann wird das Filtrat zweimal mit 301 Äthylacetat extrahiert, der Extrakt unter vermindertem Druck auf 51

konzentriert, das Konzentrat mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und zweimal mit 2,01 mit mittels Salzsäure auf pH 5,0 angesäuertem Wasser extrahiert. Der saure Extrakt wird mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und die wäßrige Lösung erneut zweimal mit 21 Benzol extrahiert. Der Benzolextrakt wird dann unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert, und dem konzentrierten Extrakt werden 100 ml η-Hexan zugesetzt. Die dabei erhaltenen Niederschlüge werden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,0 g eines weißen Pulvers, das die Macrolid-Antibiotika der oben angegebenen allgemeinen Formel enthält.

Die Abtrennung der vier Macrolid-Antibiotika,

S5 nämlich der DOA-, DOP-, EOA- und der EOP-Verbindung wird wie folgt durchgeführt:

2,0 g des oben erhaltenen weißen Pulvers werden eineir Säulenchromatographie unterworfen. Hierzu verwendet man eine Säule, die aus einem Rohr mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Höhe von 40 cm besteht. Die Substanz wird in Benzol gelöst, das 30% Aceton enthält, und auf die Säule aufgegeben, die 100 g Silica-Gel (Merck & Co., Handelsname Silica Gel H) enthält. Die Antibiotika werden so auf der Säule zurückgehalten. Die Säule wird dann nacheinander mit jeweils 600 ml Benzol entwickelt, das 30, 40, 50, 60 bzw. 70% Aceton enthält. Jeweils 20 mil des Eluates werden automatisch durch Frak-

tionsschneider gesammelt. Somit sind die Fraktionen Nr. 1 bis 30 mit Benzol-30% Aceton, die Fraktionen Nr. 31 bis 60 mit Benzol-40% Aceton, die Fraktionen Nr. 61 bis 90 mit Benzol-50% Aceton und die Fraktionen Nr. 91 bis 120 Benzol-60% Aceton und Nr. 121 bis 150 Benzol-70% Aceton eluiert. Bei dieser Arbeitsweise wird die DOP-Verbindung hauptsächlich in die Fraktionen Nr. 30 bis 45, die D OA-Verbindung hauptsächlich in die Fraktionen Nr. 45 bis 60, die EOP-Verbindung hauptsächlich in die Fraktionen Nr. 60 bis 67 und die EOA-Verbindung hauptsächlich in die Fraktionen Nr. 66 bis 75 eluiert. Die Eluate der Fraktionen Nr. 35 bis 42 werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird abgedampft. Dabei erhält man 160 rag der DOP-Verbindung in Form eines Pulvers.

Aus dem Eluat der Fraktionen 50 bis 56 werden 80 mg der DOA-Verbindung, aus den Fraktionen 63 bis 65 werden 20 mg der EOP-Verbindung und aus den Fraktionen 68 bis 70 werden 10 mg der EOA-Verbindung erhalten.

Durch Umkristallisieren der DOP-Verbindung aus einem Gemisch von 2 ml Benzol und 4 ml n-Hexan bzw. der DOA-Verbindung aus einem Gemisch von 1 ml Benzol und 2 ml η-Hexan erhält man ein weißes Pulver. Durch Umkristallisieren der EOP-Verbindung bzw. der EOA-Verbindung aus einem Gemisch von 0,2 ml Hexan und 0,8 ml η-Hexan bzw. einem Gemisch von 0,1 ml Benzol und 0,5 ml η-Hexan erhält man diese Verbindungen in Form eines weißen Pulvere. y>

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind folgende:

Schmelzpunkt D OA-Verbindung 83 bis 86⁰C DOP-Verbindung 92 bis 94°C EOA-Verbindung 133 bis 136° C EOP-Verbindung 135 bis 138°C Gewichtsanalyse in % für DOA-Verbindungen

C₁₇H₅₉NO

14·

Berechnet gefunden . MG

C 59,9Z H 7,96. N 1,89: C 59,80, H 7.79. N 1,93; 741.

45

DOP-Verbindung C₃₈H₆₁NO₁₄:

Berechnet ... C 60,40, H 8,08. N 1,85; gefunden .... C 60,63, H 8,06. N 1,93; MG 755.

EOA-Verbindung C₃₇H₅₉NO₁₅:

Berechnet ... C 58,63, H 7,79, N 1,85; gefunden .... C 583, H 7,81, N 1.78; MG 757.

EOP-Verbindung C₃₈H₆₁NO₁₅:

Berechnet ... C 59,14, H 7,91, N 1,82; gefunden ... C 59,21, H 7,97, N 1,79; MG 771.

Infrarotebsorptionsspektrum i.w cm "' j DOA-Verbindung:

3455. 292a 2720. 1734, 167Z 1626, 1595, 1450, 1730. 129a 1217. 1154, IUZ 1072. 1043, 1008, 990, 895.

DOP-Verbindung:

3440, 2810, 2720, 1728, 1670, 1626, 1595, 1450, 1380, 1287, 1235, 1154, 1113, 1073, 1043, 1007, 990, 895.

EOA-Verbindung:

3460, 2910, 2720, 1730, 1684, 1620, 1447, 1370, 1287, 1218, 1152, 1114, 1070, 1040, 1007, 900.

EOP-Verbindung:

3460, 2920, 2720, 1730, 1690, 1620, 1450, 1383, 1287, 1226, 1155, 1118, 1074, 1043, 1008, 900.

UV-Absorptionsspektrum DOA-Verbindumg: Äm°^h 281,5 rn^Oogf = 4,18).

DOP-Verbindumg: EO A-Verbindung

λ *'„<?" 241n^(log_r = 4,07). EOP-Verbindung:

λ£Ε^η 238m_ti(logf = 4,02).

Löslichkeit

Die DOA-, DOP-, EOA- und EOP-Verbindungen sind in Methanol, Äthanol, Butanol, Methylacetat, Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Aceton, Äthyläther und Benzol löslich, in Wasser wenig löslich und nicht löslich in Cyclohexan, η-Hexan und Petroläther.

Farbreaktion

Die DOA-, DOP-, EOA- und EOP-Verbindungen ergeben gegenüber Ninhydrin sowie Eisen(III)-chlorid eine negative Reaktion. Sie werden durch eine Bromoder Kaliumpermanganatlösung entfärbt. Sie schlagen nach Rötlichviolett mit konzentrierter Schwefelsäure sowie nach einer Weinsteinfarbung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure um.

Rf-Werte auf einem Dünnschichtchromatogramm

Die DOA-, DOP-, EOA- und EOP-Verbindungen werden auf einer dünnen Schicht aus Aluminiumoxid, wobei als Lösungsmittel Benzol/Aceton (1:1] verwendet wird, oder auf eiser dünnen Schicht aus Kieseigel, wobei als Lösungsmittel Äthylacetat/Methanol (19:1) eingesetzt wird, Chromatographien.

Die erhaltenen Rf-Werte sind folgende:

Sabstanz

te DOA-Verbindung DOP-Verbindung EOA-Verbindung EOP-Verbindung

Dünne Schicht Aluminiumoxid Kjesdgd

0.47 0.64 0.35 0,38

056 0,60 0,48 051

509631/200

ι.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von Macrolid-Antibiotika der allgemeinen Formel

CH₃ CH₂CHO

CH₃

HO N-CH₃ HO

in der R die Acetyl- oder Propionyjgruppe und X die —CH=CH-Gruppe oder die

/ \
-CH CH-Gruppe

bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces platensis sp. NRRL 3761 bei einem etwa neutralen pH-Wert in Gegenwart von 0,005 bis 0,40% (Gewicht/Volumen) metallischen Zinks, Zinksulfats oder Zinkchlorids bei einer Temperatur von 25 bis 35" C unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Nährmedium züchtet und anschließend die gebildeten Antibiotika nach üblichen Methoden aus der Fermentationsbrühe abtrennt.