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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminocyclitol-Antibiotika, u. zw. von Verbindungen der Formel
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worin
R l'R 3 und R, jeweils Wasserstoff bedeuten oder einer der Reste
R1,R3 und R, eine #-Amino-α-hydroxy-niedrigalkanoylgruppe der Formel
H2NCH2 (CH2)nCHOHCO- darstellt, worin n den Wert Null oder 1 hat und die andern der Reste
R1,R3 und R, Wasserstoff sind ; R. und R 5 jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und
R6 und R, jeweils Wasserstoff oder Methyl bedeuten, oder eines Säureadditionssalzes derselben.
Verbindungen der Formel (I), worin R1,R3 und RB Wasserstoff darstellen, werden nach dem in der US-PS Nr. 3, 669, 838 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren umfasst die Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlehydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein zugefügtes Aminocyclitolderivat der Formel
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worin
R1, R2, R3 und Rs die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und worin
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R und R zusätzlich eine einfache, je zwei Aminostickstoffatome miteinander verbindende
Bindung darstellen können, in Gegenwart eines geeigneten Mutanten-Mikroorganismus, wobei dieser Mutanten-Mikroorganismus zur Synthese dieses Aminocyclitols selbst nicht befähigt ist, jedoch befähigt ist, dieses Aminocyclitol in die Verbindung der Formel (I) einzubauen,
speziell eine Mutante von Micromonospora purpu- rea mit der Bezeichnung Micromonospora purpurea ATCC 31119, enthält und Isolieren des Produktes aus dem Kulturmedium. Die Verbindungen der Formel (I), worin sowohl Rl als auch R Wasserstoff bedeuten, werden gebildet, wenn das Aminocyclitol der Formel (II), worin Rl und Ru eine Einfachbindung darstellen, verwendet wird. Gemäss dem in der vorstehenden US-PS beschriebenen Verfahren ist die Natur der Mutante derart, dass sie nicht befähigt ist zur Synthese der Aminocyclitol-Untereinheit aus einem Nährmedium, um hiedurch das Antibiotikum zu bilden, jedoch befähigt ist, die letztere in ein Antibiotikum einzubauen, wenn zu dem Nährmedium das Aminocyclitol zugefügt wird.
Es wurde nun gefunden, dass eine weitere Mutante von M. purpurea ATCC 31119, nämlich M. purpurea ATCC 31164, gleichfalls dazu befähigt ist, zur Herstellung von Antibiotika der Formel (I) ein Aminocyclitol einzubauen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Aminocyclitol der Formeln
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wobei in jedem Fall
R'2 und R'5 jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und RJ in Formel (IIa) Amino oder Hydroxy und in Formel (IIb) Hydroxy oder Ben- zylidenamino darstellt, in Gegenwart von Micromonospora purpurea ATCC 31164 enthält, wobei eine Verbindung der Formel (I), worin R R, und R, jeweils Wasserstoff bedeuten und R ;, Rs, Re und R, die angegebenen Bedeutungen besitzen, gebildet wird, und dass man gewünschtenfalls zur Bildung einer Verbindung, worin einer der Reste RRg und R, eine #-Amino-α
-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe bedeutet, die erhaltene Verbindung der Formel (I) mit einem N-Hydroxy-succinimidester der Formel
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worin n 0 oder 1 ist, umsetzt und die Benzyloxycarbonylgruppe in der erhaltenen Verbindung durch Hydrogenolyse mit Wasserstoff über einem Katalysator abspaltet und gewünschtenfalls eine erhaltene freie Base in ein Säureadditionssalz derselben überführt.
Die Verbindungen der Formel (I), worin einer der Reste R ;, R g und R, eineM-Aminoct-hydro- xy-niedrig-alkanoylgruppe darstellt, werden nach dem in der US-PS Nr. 3, 780, 018 beschriebenen Verfahren hergestellt.
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Dabei erhält man eine Mischung der drei möglichen isomeren Monoamide, worin eines der R,-, R.,-oder R,-Aminwasserstoffatorne durch die u- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxy-niedrig- -alkanoylgruppe ersetzt ist. Ist eine individuelle Charakterisierung und Untersuchung dieser Produkte erwünscht, so müssen sie selbstverständlich voneinander getrennt werden. Die Acylierungsreaktion wird durch Umsetzung molaräquivalenter Mengen der Verbindung der Formel (I) und des N-Hydroxysuccinimidesters vorzugsweise bei einer Temperatur von-10 bis zirka 10 C und in einer
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B.durchgeführt.
Die Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe wird über einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator in einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Äthanol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol-dimethyläther, Propylenglykol-dimethyläther u. dgl. durchgeführt.
Die Verbindungen der Formel (I) sind neu unter der Bedingung, dass, wenn R2 Wasserstoff bedeutet, R 5 keine Hydroxygruppe in cis-Stellung zu den Aminogruppen in der l-und 3-Stellung darstellt.
Die N-Hydroxysuccinimidester der Formel (IV) sind eine allgemein bekannte Verbindungsklasse.
Die Verbindungen der Formel (I) wurden in einem antibakteriellen Standard-Reihenverdünnungstest untersucht, und es wurde gefunden, dass sie eine antibakterielle Aktivität, insbesondere gegenüber Gentamicin resistenten Organismen besitzen. Die Verbindungen sind somit als antibakterielle Wirkstoffe verwendbar.
Die Verbindungen der Formel (I) sind insbesondere für die orale, topische oder parenterale Verabreichung bestimmt und können zu ihrer Verwendung mit einem pharmazeutischen Träger durch Suspension entweder in Form ihrer freien Basen oder als pharmazeutisch annehmbare, nichttoxische Säureadditionssalze in einem inerten Träger, wie Polyäthylenglykol, oder durch Tablettieren oder Einkapselung für die orale Verabreichung entweder allein oder mit geeigneten Adjuvantien hergestellt werden oder sie können alternativ mit herkömmlichen Cremes oder Gallerten bzw. Gelees für die topische Verabreichung formuliert werden.
Die molekularen Strukturen der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen wurden ermittelt unter Zugrundelegung eines Studiums ihrer chromatographischen Eigenschaften, bestimmt durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Analyse, ihrer Kernresonanz (NMR)-und Massenspektren, durch Abbau zu bekannten Verbindungen und durch die Übereinstimmung zwischen berechneten und gefundenen Werten für die Elementaranalyse der einzelnen Elemente.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindungen und die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.
Mutationsverfahren.
Bei den folgenden Verfahren wurden verschiedene Medien, die wie folgt zusammengesetzt waren, verwendet.
Medium 1 : N-Z-Amin
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Glucose 10 Lösliche Stärke 20 Hefeextrakt 5 N-Z-Amin Typ A (Difco) 5 CaCOs l Agar 15
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Medium 2 : Keimbildungsmedium (in destilliertem Wasser)
Rindfleischextrakt 0, 3%
Trypton 0, 5 %
Dextrose 0, 1 %
Lösliche Stärke 2,4%
Hefeextrakt 0,5% CaCOa 0,4%
Medium 3 : Sojabohnen-Glucose g/l
Sojabohnenmehl 30
Dextrose (Cerelose) 40 CaCOa 1
Medium 4 : TGE g/l Trypticase-glucose-Extrakt 5,0
Trypticase-pepton 3,0
Glucose 1,0
Agar 15, 0
Medium 5 :
Produktionsmedium
Rindfleischextrakt 0, 3%
Hefeextrakt 0, 5%
Sojabohnenmehl 0,5%
Maltose 0, 1 %
Stärke 2,4%
Casaminosäure 0, 1 % CaCOa 0, 4% Cocu 2 . 6 H, 0 1 mg/l
Medium 6 : Streptomycin-Versuchsagar g/l
Rindfleischextrakt 1, 5
Hefeextrakt 3,0
Pepton 6, 0
Agar 15, 0
Der Organismus Micromonospora purpurea wurde von dem United States Department of Agriculture unter der Bezeichnung NRRL 2953 erhalten und auf N-Z-Amin-Schrägen (Medium 1) belassen.
Es wurden Eintauchfermentationenin Flaschen, die das Keimbildungsmedium 2 enthielten, während 4 Tagen bei 370C auf einem Rotationsschüttler durchgeführt. Aus den Erträgen dieser ersten Stufe wurde ein 10% iger Impfstoff in das Keimbildungsmedium (Medium 2) übergeführt und die Fermentation wurde wie vorstehend 7 Tage bei 28 C fortgesetzt.
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Um die Befähigung des Organismus zur Biosynthese von Gentamicin in Abwesenheit von zugefügtem Deoxystreptamin zu ermitteln, wurde eine dritte Fermentationsstufe unter Verwendung eines 5%igen Impfstoffes in einem 10 1-Fermentationsgefäss in einem Sojabohnenglucose-Medium (3) bei 280C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdr/min und Zufuhr von 2 l/min an gefilterter Luft durchgeführt. Nach 6 Tagen wurde der Gefässinhalt mit 6N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2, 0 angesäuert, filtriert und ein Anteil von 500 ml wurde mit Ammoniumhydroxyd neutralisiert und durch ein IRC-50 Ionenaustauscherharz (Na +-Form) geleitet. Die Säule wurde dann mit Wasser' gespült und mit 2N Schwefelsäure eluiert.
Nach dem in der US-PS Nr. 3, 091, 572 beschriebenen Verfahren wurde eine 300 mg-Probe an rohem Gentamicin isoliert, das sich als biologisch aktiv erwies und drei Komponenten entsprechend Gentamicin Cl'C2 und cula auf Grund der dünnschichtchromatographischen Untersuchung enthielt.
Um den Organismus zu mutieren, wurden Kulturbrühen in Medium 2 (37 C während 3 Tagen) kultiviert und die erhaltenen Zellen durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und erneut in gepuffertem Salz suspendiert. Diese Suspension wurde mit dem Mutanten bildenden Mittel (mutagenic agent) N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Proben der Mutanten bildenden Kultur wurden in Medium 4 bei 37 C plattenförmig aufgebracht, bis Kolonien sichtbar wurden (gewöhnlich zirka 1 Woche). Die Kolonien wurden in doppelte Platten (Medium 4) aufgeteilt, wobei man auf einen Satz derselben eine Sporensuspension von B. subtilis aufbrachte.
Nach Inkubation bei 37 C während 18 bis 20 h wurden die "Bruchstücke", die keine Zone der Inhibition auf der B. subtilisPlatte zeigten, von der Stammplatte (kein B. subtilis) zu Medium 1-Schrägen übergeführt und inkubiert, bis volles Wachstum ersichtlich war.
Diese potentiell nichtproduktiven Mutanten wurden dann mit Deoxystreptamin in einem Versuch zur Stimulierung der antibiotischen Biosynthese wie folgt geprüft. Stammkulturen der potentiellen Mutanten wurden als Strichkultur in Form von Banden auf die Oberfläche der Medium 4-Platten aufgebracht und bei 37 C inkubiert, bis das Wachstum sichtbar wurde (zirka 3 bis 4 Tage). Es wurden dann Filterpapierscheiben in eine Lösung von Deoxystreptamin (500 pg/ml) eingetaucht und auf eine Strichkultur aufgebracht. Nach Inkubation während 24 h wurde die Oberfläche der Platte mit B. subtilis unter Verwendung der Oberschichtungstechnik (overlay technique) geimpft, und die Inkubation wurde weitere 18 bis 20 h fortgesetzt.
Isolationen, die die Inhibierung um die Scheibe herum zeigten, wurden als Deoxystreptamin-Mutanten bezeichnet. Eine derartige Mutante, die als Mutante VIB gekennzeichnet und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 als Micromonospora purpurea ATCC 31119 hinterlegt wurde, wurde für die Bildung von Antibiotika des Gentamicin-Typs wie nachfolgend beschrieben verwendet.
Der letztgenannte Organismus seinerseits, der dem gleichen Mutationsverfahren wie vorstehend beschrieben unterworfen worden war, und Proben der Mutanten bildenden Kultur wurden in das Medium 4 bei 37 C plattenförmig aufgebracht, bis Kolonien sichtbar wurden (gewöhnlich zirka 1 Woche). Es wurden Kolonien in doppelte Platten, die Streptomycin-Versuchsagar (Medium 6) enthielten, aufgeteilt.
Ein Satz diente als Stammplatte für die spätere Gewinnung, während der zweite Satz 25 pg/ml
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gen, die die grössten Zonen zeigten, wurden von der Stammplatte auf N-Z-Amin-Schrägen (Medium 1) übergeführt und 1 Woche bei 370C inkubiert.
Diejenigen Mutanten, die niedrige Gehalte an Steptaminsulfat einbauten, wurden dann mit Streptamin und Scyllo-inosose bei einer Konzentration von 500 pg/ml als Base klassiert. Stammkulturen wurden in Flaschen, die Medium 2 sowie die vorstehenden Zwischenstufen enthielten, übergeführt und bei 37 OC auf einem Rotationsschüttler 7 Tage inkubiert. Die Flaschen wurden-periodisch hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität nach der Versuchsmethode der Scheibendiffusion unter Verwendung von B. subtilis als Testorganismus untersucht. Die Isolate, die Inhibitionszonen um die Scheibe herum aufwiesen, wurden als Streptamin- oder Scyllo- inosose-Mutanten bezeichnet.
Eine derartige Mutante, als Mutante VIB-3P bezeichnet und bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20851 als Micromonospora purpurea ATCC 31164 hinterlegt, wurde für die Bildung der Aminocyclitol-Antibiotika vom Typ des Streptamin, Deoxystreptamin
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und Dideoxystreptamin wie nachstehend beschrieben verwendet.
Biosynthese mit M. purpurea ATCC 31164.
Beispiel 1 :
Der Mutantenorganismus wurde auf N-Z-Amin-Agar-Schrägen (Medium 1) belassen, von denen Übertragungen in Flaschen, die 500 ml Keimbildungsmedium 2 enthielten, vorgenommen wurden.
Die Flaschen wurden bei 28 C 4 Tage auf einem Rotationsschüttler (2 s-Takt) bei 225 Umdr/min inkubiert.
Man überführte einen 10% igen (Vol./Vol.) Impfstoff von der Keimbildungsstufe aseptisch in
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Die Fermentationen wurden durch Zugabe von ION Schwefelsäure bis auf ein PH von 2,0 und Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe zur Entfernung von Mycelien beendet. Die filtrierte Brühe wurde auf PH 7, 0 eingestellt, und es wurden 1, 56 g Oxalsäure je Gramm Calciumcarbonat, das in dem Medium vorlag, zur Entfernung des Calciums zugegeben. Dieses liess man über Nacht stehen und die geklärte Brühe wurde dekantiert und über Bio-Rex 70 (schwaches Kationenaustau- scher)-Harz in der Natrium + -Form unter Verwendung von zirka 14 g Harz je Liter Brühe geleitet.
Die Säule wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2N Schwefelsäure eluiert. Sämtliche Fraktionen, die eine antibiotische Aktivität zeigten, wurden vereinigt, neutralisiert und unter Vakuum unterhalb 50 C bis zu dem Punkt konzentriert, an dem die Salzkristallisation sichtbar wurde (zirka 1/3 des Volumens). Das PH wurde dann auf 10, 5 eingestellt, und es wurden vier Volumina Aceton zur Ausfällung anorganischer Bestandteile, die dann durch Filtration entfernt wurden, zugegeben. Das Filtrat wurde mit 6N Schwefelsäure auf ein PH von 5, 0 eingestellt und unter Vakuum auf annähernd 1/20 des ursprünglichen Volumens konzentriert und abgekühlt.
Man sammelte durch Filtration eine weisse kristalline Fraktion, die über 3000C schmolz- und die sich auf Grund ihrer dünnschichtchromatographischen Eigenschaften und ihres Infrarotspektrums als identisch mit Streptaminsulfat erwies. Aus zwei 10 1-Fermentationen, die wie vorstehend durchgeführt wurden, wurden insgesamt 0, 7 g Streptaminsulfat erhalten, und aus zwei 80 1-Fermentationen wurden bei dieser Stufe insgesamt 21 g Streptaminsulfat gewonnen.
Das Filtrat wurde weiter konzentriert, und es wurden 10 Volumina Methanol hinzugegeben, wobei der erste rohe antibiotische Feststoff erhalten wurde. Aus zwei 10 1-Fermentationen wurden 7 g und aus zwei 80 1-Fermentationen 24 g erhalten.
Zur Identifizierung der antibiotischen Komponenten während der Reinigungsverfahren wurden Werte für die chromatographische Mobilität, die bei der Papierchromatographie und bei der Dünnschichtchromatographie erhalten wurden, für die Gentamicine Cl'C2 und cula und für jede der entsprechenden Aminocyclitol-Analogen, die wie vorstehend hergestellt wurden, bestimmt, wobei
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Die verwendeten chromatographischen Systeme waren die folgenden :
System 1 Whatman No. 1 Papier, das mit O, 95M Sulfat-Bisulfat gesättigt war und in abstei- gender Weise in 80%igem wässerigem Äthanol + 1, 5% NaCl und anschliessend bio- autographisch unter Verwendung von B. subtilis als Testorganismus entwickelt wurde ;
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System 2 Siliciumdioxydgel F 254 Platte (Hersteller EM Reagents, vertrieben von E. Merck,
Darmstadt, B. R. D.), die in. einer niedrigen Phase von Chloroform (l) : Metha- nol (l) : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (1) entwickelt wurde. Die Kom- ponenten wurden mit einem Ninhydrin-Spray unter Erhitzen lokalisiert.
Die C. M. -Werte des überwiegenden Anteils der antibiotischen Komponenten der Erfindung sind im Vergleich zu einem Vergleichs-Gentamicinkomplex sämtlich in bezug auf Gentamicin C. in Tabelle I angegeben, in der unter den mit Komponente 1, Komponente 2 bzw. Komponente 3 bezeichneten Verbindungen die folgenden Verbindungen zu verstehen sind :
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(1-6)-0- [2-amino-6-methylamino-O-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ss-L-arabinopyranosyl-(1#6)-O-[2, 6-diamino-2, 3, 4, 6-tetra- deoxy-α-D-erythro-glucopyranosyl-(1#4)]-D-streptamin.
Tabelle I
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<tb>
<tb> C. <SEP> M. <SEP> System <SEP> 1 <SEP> C. <SEP> M. <SEP> System <SEP> 2
<tb> Gentamicin <SEP> C <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gentamicin <SEP> C2 <SEP> 0, <SEP> 89 <SEP> 0, <SEP> 83 <SEP>
<tb> Gentamicin <SEP> C <SEP> 1a <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 67 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1 <SEP> (bedeutender) <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 2 <SEP> (weniger <SEP> bedeutend) <SEP> 0, <SEP> 76 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 3 <SEP> (weniger <SEP> bedeutend) <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP>
<tb>
Aus 10 1-Fermentationsgefässen wurden 7 g roher Feststoff, der eine antibakterielle Aktivität zeigte, in 200 ml Methanol und 10 ml konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd suspendiert, und die Mischung wurde 30 min gerührt und filtriert.
Dieser Vorgang wurde weitere zwei Male wiederholt und die Filtrate wurden vereinigt und unter Vakuum unter Erzielung eines blassgelben Öls mit einem Gewicht von 0, 9 g konzentriert. Die"erschöpften Salze" ("spent salts") waren im wesentlichen frei von antibiotischer Aktivität.
Die ölige Base wurde mit 4 g Siliciumdioxydgel (Davison Grad 923, Korngrösse 0, 147 bis 0, 044 mm) gemischt und auf eine Siliciumdioxydsäule von 1, 8 x 28 cm gegeben. Die Säule wurde als Aufschlämmung unter Verwendung einer niedrigeren Phase von Isopropylalkohol (1) : Chloroform (2) : 17% iges wässeriges Ammoniumhydroxyd (1) hergestellt. Die Säule wurde mit diesem Lösungsmittel entwickelt und es wurden 50 ml-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen 8 und 9 enthielten eine einzige ninhydrinpositive Komponente, die 20 mg in Form eines blassgelben Öls beim Entfernen des Lösungsmittels ergab. Das Massenspektrum dieses Materials, das als Komponente 1 bezeichnet wurde, zeigte ein Molekülion und bedeutendere Fragmente mit jeweils 16 Masseneinheiten (d. h. ein Sauerstoffatom), die grösser waren als diejenigen von Gentamicin C.. erhaltenen, wie aus dem folgenden hervorgeht : Bezugs-Gentamicin Cl : M+ 477,420, 360,350, 347,322, 319,304.
Komponente 1 : M+493, 436,376, 366, 363. 338,335, 320.
Dieses Material wurde in sein Sulfatsalz durch Auflösen in Äthanol und Zugabe von wenigen Tropfen Äthanol enthaltender Schwefelsäure übergeführt. Der erhaltene weisse Feststoff wurde ge-
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-L-arabinopyranosyl- (1-zeigte, bestimmt wurde.
Die Fraktionen 15 bis 26 ergaben eine dritte polarere Komponente, die eine antibiotische Aktivität zeigte. Das Massenspektrum dieser Komponente zeigte charakteristische Zucker-Maxima, die Gentamicin C bei 129 (Purpurosamin) und 160 (Garosamin) entsprachen, und wurde
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(1) 6)-0- [2, 6-diamino-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-Alternativ wurde die neue Komponente 1 wie folgt isoliert :
Man löste 0, 9 g einer Mischung roher antibiotischer Base, die wie vorstehend erhalten wurde, in 7 ml Wasser und stellte das PH mit IN Schwefelsäure auf 4, 5 ein. Man leitete das Lösungsmittel über ein starkes Anionenaustauscherharz (IRA 401 ; Hersteller Mallinckroft Chemical Works, St.
Jones., Missouri, U. S. A.) in der OH- -Form (Masse des Bettes : 0, 7 x 10 cm). Die Säule wurde mit Wasser eluiert und das Eluat im Vakuum bei 350C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mit 50 ml der niedrigeren Phase eines Lösungsmittels aus 17% wässerigem Ammoniumhydroxyd : Isopropanol : Chloroform (l : l : 2) behandelt. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und unter Vakuum unter Hinterlassen eines öligen Rückstandes mit einem Gewicht von 140 mg konzentriert.
Das Massenspektrum dieses Materials entspricht demjenigen der vorstehenden Fraktionen Bund 9, d. h. M+ 493. 436,376, 366, 363, 338, 335,320.
Das Kernresonanzspektrum für die Komponente 1 stimmte ebenfalls mit der vorgeschlagenen
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ein und ist in Tabelle II angegeben.
Tabelle II
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<tb>
<tb> Integration <SEP> Zuordnung
<tb> 5, <SEP> 87, <SEP> 5,60 <SEP> 2 <SEP> isomere <SEP> OCHO-Gruppen
<tb> 5,22 <SEP> 12 <SEP> austauschbares <SEP> H
<tb> 3, <SEP> 09, <SEP> 3, <SEP> 15 <SEP> MCH, <SEP> x <SEP> 2
<tb> 2, <SEP> 9-4, <SEP> 8 <SEP> 13-CHO <SEP> x <SEP> 6, <SEP> -CHN <SEP> x <SEP> 5, <SEP> -CH <SEP> O
<tb> 1, <SEP> 9-2, <SEP> 6 <SEP> 4-CH, <SEP> CH,- <SEP>
<tb> 1, <SEP> 72 <SEP> 6 <SEP> CH, <SEP> C-, <SEP> CH, <SEP> CH-
<tb>
Alternativ löst man 4 g einer Probe an rohem antibiotischem Salz in 50 ml Wasser und leitet es über ein Anionenaustauscherharz (Harzbett 1 x 27 cm). Das Antibiotikum wurde mit Wasser eluiert und sämtliche Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft.
Man führte ein weiteres Entsalzen des Rückstandes durch Extraktion mit methanolischem Natriumhydroxyd durch.
Die freigesetzte Base wurde mit 7 g Silioiumdioxydgel gemischt und auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxydgel gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (3 : 4 : 2) entwickelt, und es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die ersten Fraktionen ergaben die neue weniger palare Komponente l, die jedoch mit verschiedenen weniger polaren Verunreinigungen, wie es aus der Dünnachicht-Chromatographie hervorging, vermischt waren.
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Diese Fraktionen wurden vereint und das Konzentrat auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxydgel wie vorstehend gegeben. Diese Säule wurde mit Chloroform : Methanol : konz. (28%)-Ammonium- hydroxyd (5 : 3 : 1) entwickelt, und es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 6 bis 12 enthielten die gewünschte Komponente, die frei war von offensichtlichen Verunreinigungen. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das erhaltene Öl in das Sulfatsalz in äthanolischer Schwefelsäure wie vorstehend beschrieben unter Erzielung von 0, 124 g an Komponente 1 in Form des di-Base. Heptasulfat. Decahydrat mit einem Fp. von > 3000C wie vorstehend beschrieben übergeführt.
Indem man ein geeignetes Aminocyclitol mit der Mutante Micromonospora purpurea ATCC 31164 in dem Keimbildungsmedium 2 kultivierte und die Produkte wie vorstehend im Beispiel 1 beschrieben isolierte, wurden die folgenden Verbindungen der Formel (I) in analoger Weise hergestellt :
Beispiel 2 :
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auf Gentamicin Cul : System 1 = 0, 59, System 2 = 0, 63).
Beispiel 3 :
Es wurde analog zu der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0, 10 g/l 2-Deoxystreptamin in einer 10 1-Fermentation in dem Produktionsmedium 5 in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31164 verwendet wurden. Die Isolierung des Produktes wie vorstehend beschrieben ergab 0, 51 g eines rohen Materials, das bei der Chromatographie auf Siliciumdioxydgel als überwiegende Komponente ein Material ergab, das sich auf Grund der Identität der chromatographischen Mobilitäten als identisch mit Gentamicin C. erwies, nämlich 0-3-Dioxy-4-C-methyl-3- (me-
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Beispiel 4 :
Es wurde analog der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0, 10 g/l 2, 5-Dideoxystreptamin in zwei 80 1-Fermentationen und sechs 10 1-Fermentationen in dem Produktionsmedium 5, in dem das Sojabohnenmehl durch 0, 5% Trypton und die Stärke durch 2% Cerelose ersetzt worden waren, in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31164 verwendet wurden.
Die Isolierung des Produktes wie vorstehend beschrieben ergab zwei Rückstände von 0, 68 und 0, 13 g, die vereinigt wurden und auf Siliciumdioxydgel-Platten chromatographiert wurden, wobei drei Banden erhalten wurden, deren Massenspektren das Vorliegen der folgenden Verbindungen ergab :
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: 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3- (methylamino)-6-L-arabinopyranosyl-d-amin ; und Komponente C la : 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3- (methylamino)-6-L-arabinopyranosyl-d----6)- - 0- [2, 6-diamino-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-d- 4)]-D-2, 5-dideoxystreptamin.
Die Massenspektren der drei vorstehend angegebenen Komponenten Cil c 2 und cula zeigten die folgenden Massen-Peaks :
Komponente Cul : M 461,404, 344, 334, 331,306, 303, 288, 160 und 157.
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: MC2 bzw. C la.
Beispiel 5 :
Es wurde analog der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0,50 g/l 2-Amino-1,3,4,5,6-cyclohexanpentol (1,3,5-cis) in drei 10 1-Fermentationen in dem Produktionsmedium 5 gemeinsam mit 0, 1% zugefügtem Phyton in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31164
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verwendet wurden. Die Isolierung des Produktes wie vorstehend beschrieben ergab 214 mg an Material, das sich auf Grund seiner chromatographischen Mobilität und auf Grund seines Massenspektrums als identisch mit der in Beispiel 1 beschriebenen "Komponente 1" erwies, nämlich 0-3-Deoxy-
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die folgenden Peaks :
M+ 493,457, 436,383, 376,366, 363, 346, 344, 338, 335, 321, 318,261, 160 und 157.
Synthese von Amino-hydroxy-niedrig-alkanoyl-Derivaten.
Beispiel 6 :
Man kühlte in einem Eisbad eine Lösung von 270 mg (0,54 Mol) des im Beispiel 1 beschrie-
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in 5 ml 50%igem wässerigem Tetrahydrofuran auf 5 C und behandelte mit 208 mg (0,59 Mol) N-Hydroxysuccinimidester des S- (-)-Y- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybuttersäure (US-PS Nr. 3, 780, 018) und rührte die Mischung 20 h bei 5 C. Die Mischung wurde dann im Vakuum auf 10 ml konzentriert. Man fügte 25 ml n-Butanol und 10 ml Wasser hinzu und trennte die Schichten.
Die wässerige Schicht wurde wieder mit 10 ml n-Butanol gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden eingedampft, wobei ein Rückstand von 513 mg eines rohen Produktes, das zur Seite gestellt wurde, hinterblieb.
Die wässerige Schicht wurde zur Trockne eingedampft, wobei 304 mg eines Rückstandes erhalten wurden, der in 25 ml 50%igem wässerigem Tetrahydrofuran gelöst und mit weiteren 208 mg N- - Hydroxysuccinimidester der S- (-)-f- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-ct-hydroxybuttersäure wie vorstehend behandelt wurde. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung ergab weitere 435 mg Rohprodukt, das mit den zuvor erhaltenen 513 mg vereinigt wurde und auf sieben 40 x 20 cm Siliciumdioxydgelplatten mit einer Dicke von 1 mm chromatographiert wurde. Das System wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (3 : 1 : 1) (niedrigere Phase) entwikkelt.
Es waren 7 Durchgänge in diesem Lösungsmittelsystem erforderlich und es wurden nach dem Eluieren der Produktband, die im Ultravioletten sichtbar war, 229, 5 mg einer rohen Mischung der drei monoacylierten Produkte erhalten.
Die Mischung der acylierten Produkte wurde auf drei 40 x 20 cm Siliciumdioxydgelplatten mit einer Dicke von 1 mm aufgebracht und die Platten wurden 5mal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrigere Phase), zweimal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (3 : 1 : 1) (niedrigere Phase) und 9mal mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrigere Phase) entwickelt.
Es wurden 3 individuelle Banden erhalten, die unter Ultraviolettbestrahlung sichtbar waren und getrennt, herausgeschnitten und aus dem Siliciumdioxydgel mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (1 : 1 : 1) (niedrigere Phase) eluiert wurden, wobei 3 Komponenten erhalten wurden :
A) 90, 9 mg ;
B) 59, 1 mg und
C) 48, 5 mg, die die S- (-)-y- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-ct-hydroxybuttersäureamidderivate in den 2'-, l-bzw.
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Die Rf-Werte für die Komponenten A, B und C waren nach dem 5maligen Entwickeln auf Siliciumdioxydgel mit einem Sytem, bestehend aus Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrige Phase) die folgenden :
A 0, 48
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6256, 1 mg Komponente B (1-Amid), gelöst in 25 ml 50% igem wässerigem Äthanol, und 20 mg 10% iges Palladium auf Aktivkohle wurden in einem Parr-Schüttler bei 3, 87 at (55 psi) während 5 1/2 h-geschüttelt, wonach der Katalysator durch Filtration durch eine Filterhilfe entfernt wurde. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab 34, 3 mg eines weissen glasartigen Rückstandes, der in 2, 5 ml Wasser gelöst und mit 11, 4 mg Schwefelsäure in 0, 1 ml Wasser behandelt wurde.
Die Zugabe von 10 ml Äthanol führte zur Ausfällung von 32 mg 1-[S-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuty-
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] -0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino- ss -L-arabinopyranosyl- (1-- 6) -0-[ 2-amino-6-methylamino-Analyse : C35H50O10N6 . 5H2SO4 ber. : C 27, 67 H 5, 57 N 7, 75 gef. : C 27, 50 H 5, 58 N 7, 42.
Die Komponenten A und C wurden in analoger Weise behandelt. A ergab 27 mg 2'- [S- (-)- - γ-Amino-α-hydroxy-butyryl]-O-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ss-L-arabinopyranosyl-(1#6)-O- - [ 2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl- (l- 4)]-D-strept- amin in Form des Bis-Base. Tetrasulfat. Heptahydrats, Fp. 237 bis 2410C (Zersetzung), Dünnschicht-
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; Rf = 0, 33 [Siliciumdioxydgel,Analyse : (C25H30N5O10)2 . 4H2SO4 . 7 H20 ber. : C 35, 16 H 7, 20 N 9, 84 geL : C 35, 38 H 7, 08 N 9, 49.
Die Komponente C ergab 26 mg 3- [S- (-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-O-3-deoxy-4-C-methyl-3-
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methylamino-ss-L-arabinopyranosyl- -f 6)-0- [2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-ber. : C 34, 64 H 6, 74 N 9, 67 gef. : C 34, 35 H 6, 38 N 8, 60.
Antibakterielle Testergebnisse.
Das im Beispiel 1 beschriebene und als Komponente 1 bezeichnete 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-me- thylamino-ss-L-arabinopyranosyl- (1#6)-O-{2-amino-6-methylamino-6-c-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy- - α-D-erythro- @lucopyranosyl-(1#4)]-D-streptamin wurde im Vergleich mit Gentamicin gegenüber einer Anzahl v@n Mikroorganismen gemäss dem folgenden Verfahren untersucht.
Man @@ Stammlösungen einer jeden Verbindung, die 200 pg/ml Base enthielt, in destilliertem Wasser heu, wobei man sterilisierte Filter verwendete. Die Kulturen des Testorganismus liess man 24 h bei 3'oC in 10 ml Rohren von Tryptosephosphat oder einer Mueller-Hinton-Brühe wachsen. Jede Kultur wurde mit der Brühe auf eine optische Dichte von 0, 1 auf einem Spectronic-20-Gerät (zirka 10"Zellen/ml) eingestellt. Die eingestellten Kulturen wurden 1 : 500 in der Brühe für die Verwendung als Impfstoff (endgültige Zellen-Konzentration zirka 2 # 16@ Zellen/ml) verdünnt. Die Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Aktivität in oiner einreihigen Rohrchen-" Verdiinnungsmethode untersucht.
Es wurden zweifache Stammreihenverdunnungen in Brühe aus den
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des Mittels, die kein Wachstum zeigt) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben. Die Verbindungen wurden bei einer inhibierenden Konzentration von mehr als 100 pg/ml als inaktiv angesehen.
Tabelle III *
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> min. <SEP> inhibierende <SEP> Konzentration
<tb> (pg/ml)
<tb> Komponente <SEP> 1 <SEP> Gentamicin
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 195 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Vogel <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> W677/HJR66 <SEP> 50-inaktiv
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> JR <SEP> 35 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> JR <SEP> 76.
<SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 100 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> JR89 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> K12 <SEP> ML <SEP> 1629 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> A-20960 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 25
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 39645 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> A-20636 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 50
<tb> Proteus <SEP> mirabilis <SEP> MGH-1 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Providencia <SEP> 164 <SEP> 100 <SEP> inaktiv
<tb> Providencia <SEP> stuartii <SEP> A-20894 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> MGH-2 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> A-20717 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 12,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> A-20741 <SEP> inaktiv <SEP> inaktiv
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> A-20897 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> inaktiv
<tb>
* Kultivierung in Tryptosephosphat-Brühe Die gleiche im Beispiel 1 beschriebene Komponente 1 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-
EMI12.3
ss-L-arabinopyranosyl- (l-- cula) und Gentamicin C. untersucht und die 1-, 3-und 21- [S- (-)-y-Amino-a-hydroxy-butyryll-amide der Komponente 1, beschrieben im Beispiel 6, und als Komponente 1 (1-HABA), Komponente 2 (3-HABA) bzw.
Komponente 1 (2'-HABA) bezeichnet, wurden im Vergleich mit den entsprechenden
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die Testorganismen 1, 2,3, 4,5 und 6 die Organismen B. subtilis ATCC 6633, S. aureus Smith, E. coli JR 76. 2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 bzw. PS. aeruginosa A-20897 darstellen.
Tabelle IV *
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<tb>
<tb> Testorganismus
<tb> Verbindung <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP>
<tb> Gentamicin
<tb> C1,C2,C1a <SEP> 0,024 <SEP> 0,39 <SEP> 50 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> > 100
<tb> GentamicinCC1 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 50 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 25 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 25
<tb> C1 <SEP> (1-HABA) <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (1-HABA) <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> C1 <SEP> (3-HABA) <SEP> 3,
<SEP> 13 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (3-HABA) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> C. <SEP> (2'-HABA) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (2'-HABA) <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb>
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