DE2820637A1

DE2820637A1 - Fortimicin-derivate und ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung bei der bekaempfung bakterieller infektionen

Info

Publication number: DE2820637A1
Application number: DE19782820637
Authority: DE
Inventors: Kenichi Mochida; Yasuki Mori
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1977-05-11
Filing date: 1978-05-11
Publication date: 1978-11-16
Also published as: GB1594786A; AU3598578A; AR223645A1; PH15074A; US4169942A; FR2390452B1; CA1088080A; AU516948B2; FR2390452A1; JPS53141244A; BE866933A; GR64530B

Description

u.Z.: M Case: 210 KYOWA ΗΑ.ΚΚ0 KOGYO CO., LTD.

Tokyo, Japan

"Fortimicin-Derivate und ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen" 15

Die Erfindung betrifft Fortimicin-Derivate der allgemeinen Formel I

'CH₂	NHCH	- O -	NH₂	HO	/	-OCH₃
	>-			v
	\ NH₂	N-y CH.

tf- r> ο Cs 3^ nm

(D

in der Y ein Wasserstoffatom oder eine -COCH₂NH₂-GrUPpe bedeutet. Wenn Y ein Wasserstoffatom bedeutet, handelt es sich um 6'-N-Methylfortimicin KE, und wenn Y die -COCH₂HH₂-Gruppe bedeutet, handelt es sich um 6'-lf-Methylfortimicin D.

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γ -\

Fortimicin KE und Fortimicin D sind bekannte Pseudodisaccharid-Antibiotika mit einem 1,4-Diaminocyclitrest. Diese Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den JA-OSen 128 837/76 und 2338/77 und in der DE-OS 27 48 53Ο beschrieben. Diese bekannten Verbindungen weisen zwar eine antibakterielle Aktivität auf, jedoch besteht ein Bedürfnis nach stärker wirkenden Verbindungen.

Es wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass das durch Methylierung der Aminogruppe in der 6'-Stellung von Fortimicin D erhaltene 6'-N-Methylfortimicin D eine stärkere antibakterielle Aktivität als die Ausgangsverbindung aufweist.

Erfindungsgemäss lassen sich 6'-N-Methylfortimicin KE und 6'-N-Methylfortimicin D synthetisch nach folgendem Reaktionsschema herstellen.

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MW nw CK₀NHCOR

2 ^v

Ov / \ Stufe

0 \ /—OCH-

HO NH

CH

NH₂ OH

\—/ Stufe -/V-OCH₃

HO ^H CH-3

Fortimicin KE 10 (II)

(III)

CH

CH₂NKCH₃

OK

NH, HO

Stufe 3 / °x

OCH-ς ;

I¹

NH OH

Stufe 4-OCH *

NH I

CH

HO NH CH.

6'-N- ifethylfortimicin KE (I-B) (IV)

^f*3

(V) 6'-N-flethylfortiinicxn D (I-A)

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In diesem Schema bedeutet E einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder einen Aralkylrest mit 7 oder 8 Kohlenstoffatomen und R* und R¹ eine Amino schutz gruppe, wie

-CH₂OCO-

oder

CH -Q-OCO-.
3

! I

6'-N-Methylfortimicin D weist ein breites antibakterielles VirkungsSpektrum auf und eignet sich daher u.a. zur Reinigung und Sterilisation von Glasgeräten im Laboratorium und von chirurgischen Instrumenten. Es kann auch zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschflüssigkeiten für sanitäre Zwecke verwendet werden. 6'-N-Methylfortimicin KE ist ein wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung von 6'-N-Methylfortimicin D.

Die Erfindung betrifft auch die Salze der genannten Verbindungen, insbesondere die pharmakologisch verträglichen, nicht-toxischen Salze mit Säuren von 6'-N-Methylf ortimicin D. Die Salze leiten sich beispielsweise von Mineralsäuren ab. Beispiele dafür sind Hydrochloride, Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Sulfamate und Phosphate. Die Salze können sich auch von organischen Säuren ableiten. Beispiele dafür

sind die Maleate, Acetate, Citrate, Oxalate, Succinate, Benzoate, Tartrate, Fumarate, Malate, Mandelate und Ascorbate.

Nachstehend sind physikalische, chemische und biologische Daten von 6'-N-Methylfortimicin D zusammengestellt.

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γ -ι

(1) Es handelt sich um ein weisses Pulver.

(2) Der R^-Wert bei der Dünnschichtcliromatographie unter Verwendung der unteren Phase eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (1:1:1 Volumteile) als Laufmittel beträgt 0,47.

(3) NMR-Spektrum (Protonen)6 (ppm):

a. freie Base (in DpO)

2,31 (3H, s), 3,02 (3H, s), 3,«) (3H, s), 3,^7 (2H, s), 4,75 (1H, d).

b. Hydrochlorid (es wird eine Probe verwendet, in der die freie Base mit DCl bis zum pD-Wert versetzt ist).

2,77 (3H, s) 3,12 (3H, s), 3,47 (3H, s), 4,06 (2H, s), 5,32 (1H, d).

(4) Massenspektrum (m/e):

405 (M⁺), 387, 356, 292, 274, 264, 246, 207, 143-20

(5) Ϊ. (freie Base) 88 bis 91⁰C

(6) Spezifische Drehung (Sulfat) Ζ~^α_7ΐΡ = +82.0° (c = 0,2; H₂O).

(7) CMR-Spektrum (Dioxan als interner Standard): vgl. Fig. 1 und 2.

(8) Elementaranalyse C,, ,-,H, ^NcOg

(9) Antibakterielle Aktivität (minimale Hemmkonzentration, MHK, lig/ml), bestimmt unter Verwendung eines Mediums vom pH-Wert 7,2 gemäss dem japanischen Standardverfahren zur Messung der antibiotischen Aktivität von Arzneistoffen: Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammen gestellt.

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	8	H	C	N
gef.:	8	,79	49,00	16,63
ber.:	,75	^9,26	16,89

Tabelle I

Microorganisms Staphylococcus aureus 209-P

" Smith(A)

"

Escherichia coli NIHJC-2

KY-8371 3100

Klebsiella pneumoniae KY 4274 Proteus vulgaris JJ

Salmonella enteritidis G-14

Shigella sonnei ATCC 9290 Pseudomonas aeruginosa BMH#1 Escherichia coli 76-2 *1

57R *1 KY 8321 *2 ■ Z-343 *3 » KY 8349 *4 Providencia sp. 164 *5 Serratia marcescens 1065 *3

6 · -N-Methyl-IOrtimicin fortimicin D D

Klebsiella pneumoniae 3020 Y-60

*1 *2

bildet 2"-Adenylyltransferase bildet 2"-Adenylyltransferase und 6'-Acetyltransferase bildet 6'-Acetyltransferase bildet 3'-Phosphotransferase bildet 2'-Acetyltransferase

Kanamycin

1,56	1,56	0,4
1₇56	3,12	0,4
3,12	6,25	0,78
6,25	6,25	1,56
25	3,12	3,12
6,25	6,25	3,12
3,12	3,12	>100
25	6,25	1,56
25	12,5	3,12
12,5	6,25	3,12
25	12,5	25
6,25	6,25	>100
6,25	6,25	>100
12,5	12,5	>100
6,25	3,12	12,5
3,12	3,12	>100
100	25	>100
12,5	6,25	100
*1 25	25	>100

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^Γ - 10 -

Nachstehend sind die physikalischen Eigenschaften von 6'-lT-Methylfortimicin KE zusammengestellt.

(1) Es handelt sich um ein weisses Pulver. 5

(2) Der R~-Wert "bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung der unteren Phase eines Gemisches aus Chloro form, Methanol und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (1:1:1 Volumteile) als Laufmittel beträgt

10 0,72.

(3) NMR-Spektrum (in D₃O) <$ (ppm):

2,38 (3H, s) 2,68 (3H, s), 3,^7 (3H, s), 5,02 (1H, d)

15 (4) Massenspektrum (m/e):

343 (M⁺), 331, 299, 258, 235, 217, 207, 189, 14-3, , 100, 86.

(5) F. 86 bis 90°C. 20

aranal	yse C₁₅H₅₂	VyCO₂	14	Ii
	H	C	14
gef.:	8,52	48,85		,28
ber.:	8,22	48,97

Das im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsprodukt verwendete Fortimicin KE erhält man durch Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies Micromonospora olivoasterospora, beispielsweise Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FEEM-P 1560, ATCC 21819). Die mikrobiologischen Eigenschaften von entsprechenden Stämmen sind in der US-PS 3 931 400, entsprechend der DE-OS 24 18 349 beschrieben. Wie vorstehend erwähnt, ist Fortimicin KE und ein Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobxologxschem Wege in der DE-OS 27 48 530 beschrieben. Dabei wird Fortimicin KE auf

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Γ Π

die nachstellend angegebene Weise aus einer nach Züchtung eines entsprechenden Stammes erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnen.

Das Filtrat der Kulturflüssigkeit wird auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und über eine mit einem Kationenaustauscherharz, wie Amberlite IRC-50, Ammoniumform, gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird mit 0,5 υ wässriger Ammoniaklösung eluiert. Die eluierten, biologisch aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft und unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes, beispielweise Dowex 1x2, OH-Porm, chromate graphiert. Die eluierten, aktiven !Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Fortimicin-Komplex in Form eines rohen Pulvers, der !Fortimicin A, !Fortimicin B, !Fortimicin C, Fortimicin D und Fortimicin KE enthält. Das rohe Pulver wird in Wasser gelöst und mit 2 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,0 eingestellt. Die Lösung wird sodann über eine mit Aktivkohle gepackte Säule gegeben, um die aktiven Bestandteile daran zu adsorbieren. Verunreinigungen, die an der Aktivkohle nicht adsorbiert werden, werden durch Waschen mit Wasser eluiert. Anschliessend wird 0,2 η Schwefelsäure über die Säule gegeben, um die aktiven Bestandteile zu eluieren.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Neutralisation über ein Anionenaustauscherharz, wie Dowex 44-, OH-Form, gegeben. Das ELuat wird gefriergetrocknet. Man erhält ein Gemisch sämtlicher Bestandteile des Fortimicin-

Komplex in Form der freien Basen.
30

Dieses gefriergetrocknete Pulver wird in Wasser gelöst und mit 2 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 7,5 eingestellt. Die Lösung wird sodann über eine mit einem Kationenaustauscherharz, wie Amberlite CG-50 Typ I, Ammoniumform, gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit

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Wasser, wird 0,2 η wässrige Ammoniaklösung über die Säule gegeben. Zunächst werden einige untergeordnete Bestandteile eluiert. Anschliessend wird ein Gemisch aus Fortimicin B und Fortimicin KE als eine grosse aktive Fraktion eluiert. Hierauf werden nach Elution von mehreren untergeordneten Bestandteilen Fortimicin D und Fortimicin A eluiert. Die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an Fortimicin ElE und Fortimicin B werden zur Trockne eingedampft. Man erhält ein Pulver, das aus den freien Basen, dieser Verbindungen besteht. Dieses Pulver wird der Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Isopropanol, Chloroform und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (4:2:1 Volumteile) als Laufmittel unterworfen. Das Pulver wird im Lösungsmittel suspendiert und auf die Säule aufgesetzt. Die Jüution wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Stunde durchgeführt. Zunächst wird Fortimicin B und anschliessend Fortimicin KE eluiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an Fortimicin KE werden vereinigt und

unter vermindertem Druck eingedampft. Der Ruckstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst und sodann gefriergetrocknet. Man erhält Fortimicin KE in Form der freien Base.

Die nachstehend erläuterten Stufen 1 bis 5 werden zur erfindungsgemässen chemischen Modifikation angewendet.

Stufe 1

3Q Fortimicin KE wird mit einem Acylierungsmittel vom Urethantyp der allgemeinen Formel ROCOX, in der R einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder einen Aralkylrest mit 7 oder 8 Kohlenstoffatomen und X Cl, Br, J, ET-,,

35 Ι

^⁰ /\, oder

-O-N

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bedeutet, in einem Lösungsmittel umgesetzt, wodurch man eine Verbindung der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel III erhält, in der ein Wasserstoffatom in der Aminogruppe, die an das Kohlenstoffatom in der 6'-Stellung von Fortimicin KE gebunden ist, durch eine ROCO-Gruppe, in der R die vorgenannte Bedeutung hat, ersetzt ist.

Als Acylierungsmittel vom Urethantyp können Verbindungen der folgenden Strukturformeln verwendet werden:

Π Γ

CH₀OC-O-N

/ \-CH₂OC-Cl

CH. O I Il	I CHo-C I	0 I)
I Il -C-OC-N₃,	I CH	Il -OC
CH₃

Das Acylierungsmittel vom Urethantyp wird vorzugsweise in einer Menge von 1,0 bis 1,2 Mol pro 1 Mol Fortimicin KE eingesetzt. Die letztgenannte Verbindung wird vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 250 millimolar verwendet.

Beispiele für Lösungsmittel, in denen diese Reaktion durchgeführt werden kann, sind Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methanol, Ethanol, Wasser und Gemische dieser Lösungsmittel.

Die Reaktion wird bei Temperaturen von 0 bis 60⁰G, vorzugsweise bei O⁰C bis Raumtemperatur, im allgemeinen 1 bis

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^Γ - 14 -

Stunden durchgeführt.

Die auf die vorstehende Weise erhaltene Verbindung der allgemeinen !Formel III wird auf folgende Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Zunächst wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Sodann wird der Rückstand mit Wasser versetzt (mit der 1- "bis 10-fachen Gewichtsmenge des Rückstands), um den wasserlöslichen Anteil zu extrahieren. Der Extrakt wird mit Alkalien oder einer Säure auf den pH-Wert 5 bis 6 eingestellt und über eine mit einem schwach sauren Kationenaustauscher,· wie Amberlite CG-50, gepackte Säule gegeben. Nach Waschen mit Wasser wird mit 0,01-1 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung der allgemeinen Formel III werden vereinigt. Das wässrige Ammoniak wird sodann abdestilliert. Man erhält die gewünschte Verbindung in Form eines weissen Pulvers. Diese Verbindung kann auch nach anderen üblichen Verfahren, beispielsweise durch Säulenchromatographie an Kieselgel,isoliert und gereinigt werden. In den vorstehenden Stufen wird die Anwesenheit der Verbindung der allgemeinen Formel III durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und 14-prozentiger wässriger Ammoniaklösung (2:1 : 1 Volumteile) als Laufmittel festgestellt.

Stufe 2

Die in Stufe 1 erhaltene Verbindung wird in einem nicht-

wässrigen Lösungsmittel in Gegenwart eines Reduktionsmittels reduziert, wodurch die ROCO-Gruppe in eine Methylgruppe umgewandelt wird. Diese Reduktion wird bei Temperaturen von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur des Lösungsmittels durchgeführt. Man erhält 6'-N-Methylfortimicin KE der Formel I-B.

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-¹5- 282Ü637

Bei dieser Umsetzung wird als Lösungsmittel Tetrahydrofuran, Dioxan, Diethylether oder ein Gemisch dieser Lösungsmittel verwendet. Als Reduktionsmittel eignen sich beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid und Diboran. Das Reduktionsmittel wird in Mengen von 10 bis 100 Mol pro 1 Mol der Verbindung der allgemeinen Formel III verwendet. Die Verbindung der allgemeinen Formel III wird vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 100 millimolar eingesetzt. Im allgemeinen beträgt die Reaktionszeit 3 bis 18 Stunden.

Das im Reaktionsgemisch gebildete 6'-N-Methylfortimicin KE kann auf folgende Weise isoliert werden. Das im Reaktionsgemisch verbliebene, überschüssige Reduktionsmittel wird durch Zusatz von Essigsäureethylester oder Wasser in einer Menge, die dem 10-fachen Gewicht des Reduktionsmittels entspricht, zersetzt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wird mit einer Säure auf den pH-Wert 5 bis 6 und mit der 10-fachen Volumenmenge Wasser, bezogen auf den Rückstand, versetzt, um einen wasserlöslichen Anteil zu extrahieren. Der Extrakt wird über eine mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, wie Amberlite CG-50, gepackte Säule gegeben. Es wird sodann entweder direkt der Extrakt oder ein Piltrat, das nach Einstellen des pH-Wertes auf 5 bis 6 und Entfernen des erhaltenen Niederschlags durch Filtration erhalten worden ist, verwendet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird mit 0,1 bis 1 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Fraktionen mit einem Gehalt an 6'-N-Methylfortimicin KE werden vereinigt. Das wässrige Ammoniak wird unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 6' -N-Methylf ortimicin KE in Form eines weissen Pulvers. Die Anwesenheit von 6!-N-Methylfortimicin KE wird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter

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wässriger Ammoniaklösung (1:1:1 Volumteile) festgestellt.

Stufe 3

6' -N-Methylfortimicin KE wird mit einem Aminoschutzgruppenreagens in einem Lösungsmittel umgesetzt. Man erhält eine Verbindung der allgemeinen Formel IV, in der die Aminogruppen in den Stellungen 1, 2' und 6¹ mit einer Aminoschutzgruppe, wie

^Oder

N=/

CH₂OCO

CH₃-C-OCO,

geschützt sind.

Als Aminoschutzgruppen eignen sich solche Schutzgruppen, die üblicherweise bei der Synthese von Peptiden verwendet werden. Bevorzugt sind Aminoschutzgruppen, zu deren Beseitigung keine alkalische Behandlung erforderlich ist, da die Verbindung der allgemeinen Formel V unter alkalischen Bedingungen nicht stabil ist. Als Aminoschutzgruppenreagentien, die der vorgenannten Bedingung genügen, können folgende Verbindungen verwendet werden:

O ι

-CH₂OC

-O-N

l/ y-CH₂OC-Cl

CHo O

I ³ 1

j-C-O-C-

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Das Aminoschutzgruppenreagens wird vorzugsweise in einer Menge von 3 bis 4- Mol pro 1 Mol 6'-lT-Methylfortimicin KE verwendet. 6·-N-Methylfortimicin KE wird im Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 1 bis 250 millimolar eingesetzt.

Als Lösungsmittel für diese Umsetzung eignen sich beispielsweise Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxari, Methanol, Ethanol, Aceton, Wasser oder Gemische dieser Lösungsmittel. Die Umsetzung wird 2 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 0 bis 60⁰C durchgeführt.

Die auf diese Weise synthetisierte Verbindung der allgemeinen Formel IV wird in der nachfolgenden Stufe entweder direkt in Form des Reaktionsgemisches oder nach vorheriger Isolierung eingesetzt.

Die Isolierung dieser Verbindung aus dem Reaktionsgemisch kann auf folgende Weise durchgeführt werden. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Der erhaltene Rückstand wird mit 10 bis 100 Volumteilen eines organischen Lösungsmittels, wie Essigsäureethylester oder Chloroform, versetzt, um extrahierbare Substanzen zu extrahieren. Der Extrakt wird der Säulenchromatographie,

beispielsweise an Kieselgel, wie Kieselgel 60 (E. Merck & Co.), unterworfen. Die Elution wird dabei mit einem Lösungsmittelgemisch, wie Chloroform und Methanol (99 : bis 90 : 10 Volumteile) oder Essigsäureethylester und

Ethanol (99 : 1 bis 90 : 10 Volumteile), durchgeführt. 30

Die Fraktionen mit einem Gehalt an der gewünschten Verbindung werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Man erhält ein weisses Pulver. Die Anwesenheit der gewünschten Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol (9 : 1 Volumteile) als Laufmittel festgestellt.

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Stufe 4-

Die Verbindung der allgemeinen Formel V erhält man durch. Kondensation der Verbindung der allgemeinen Formel IV mit einem N-geschützten Glycin der allgemeinen Formel

R¹MCH₂CO₂H
in einem entsprechenden Lösungsmittel.

Als N-Schutzgruppe (E¹) des Η-geschützten Glycins können üblicherweise in der Peptidsynthese verwendete Gruppen eingesetzt werden, vorzugsweise die Schutzgruppen E^. In entsprechender Weise können auch in der Peptidsynthese

übliche Kondensationsverfahren angewendet werden. Vorzugs-15

weise bedient man sich eines Aktivesterverfahrens unter

Verwendung eines N-geschützten Glycins als aktivem Ester. Als aktive Ester von N-geschütztem Glycin können Ester mit folgenden Alkoholen verwendet werden: O

H-O-N

EO-ff V-NO,

O
Bevorzugt sind Ester mit ι

HO- _

oder

HO-

Die Verbindung der allgemeinen Formel IV liegt im Eeaktions gemisch in Konzentrationen von 10 bis 1OO millimolar vor. Die Menge der aktivierten, an der Carboxylgruppe substituierten Derivate des N-geschützten Glycins ist vorzugsweise äquimolar der Menge der Verbindung der allgemeinen Formel IV oder liegt darüber. Beispielsweise wird ein aktiver Ester in Mengen von 1 bis 3 Mol pro 1 Mol der Verbindung der allgemeinen Formel IV verwendet.

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Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid oder Gemische davon.

Die Umsetzung wird bei Temperaturen von -1O°C bis Raumtemperatur 15 bis 20 Stunden durchgeführt, wobei sich die Verbindung der allgemeinen Formel V im Reaktionsgemisch bildet. Diese im Reaktionsgemisch vorliegende Verbindung wird im allgemeinen direkt ohne vorherige Isolierung in der nächsten Stufe eingesetzt. Gegebenenfalls kann die Verbindung aber auch säulenchromatographisch auf die gleiche Weise wie in Stufe 3 isoliert werden. Die Anwesenheit dieser Verbindung wird dünnschichtchromatographisch unter Verwendung eines entsprechenden Lösungsmittelgemisches festgestellt.

Stufe 5

6'-N-Methylfortimicin D wird erhalten, indem man in an sich bekannter Weise von der Verbindung der allgemeinen Formel V die Amino schutz gruppe η R_x. und R' entfernt. Beispielsweise können Benzyloxycarbonylgruppen durch katalytische Hydrierung entfernt werden, wobei die Verbindung in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Tetrahydrofuran, Methanol, Dimethylformamid, Dioxan oder einem Gemisch davon, vorzugsweise in einem Gemisch aus Methanol und Wasser ( 99 : 1 bis 90 : 10 Volumteile) in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie Palladium-auf-Kohlenstoff, Platin oder Rhodium, und einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure oder Schwefelsäure, bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck mit Wasserstoff in Kontakt gebracht wird. Der Metallkatalysator wird im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 10 Gewichtsprozent der Verbindung der allgemeinen Formel V verwendet.

L - J

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Γ

Die Verbindung der allgemeinen Formel V wird in einer Konzentration von 10 bis 100 millimolar eingesetzt. Die Entfernung der Amino schutz gruppen ist nach. 2 bis 18

Stunden beendet.
5

6' -N-Methylfortimicin D wird aus dem Reaktionsgemisch als ein Salz mit einer Säure isoliert, indem man den Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eindampft.

Zur Reinigung wird dieses Salz in Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, wie Amberlite CG-50, Ammoniumform, gepackte Säule aufgesetzt, wobei die gewünschte Verbindung adsorbiert wird. Nach dem Vaschen der Säule mit dem 5- bis 10-fachen ihres Volumens mit Wasser wird mit 0,1 bis 1 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Die Fraktionen mit biologischer Aktivität werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Man erhält die gewünschte Verbindung in Form eines weissen

Pulvers.
20

Die Anwesenheit der gewünschten Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (1:1:1 Volumteile) als Laufmittel festgestellt.

Das erfindungsgemässe 6' -N-Methylfortimicin D wird entweder als freie Base oder als pharmakologisch verträgliches Salz mit einer Säure eingesetzt. Beispiele für pharmakologisch verträgliche Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Amidosulfonsäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Citronensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure und Ascorbinsäure. Die Umwandlung der Base in ein Salz mit einer Säure wird nach

L J

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Γ

üblichen Verfahren durchgeführt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli Herstellung von e'-U-Benzyloxycarbonylfortimicin KE (Stufe 1)

120 mg Fortimicin EE werden in 12 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit 89,4- g N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wird mit 10 ml Wasser und 10 ml Essigsäureethylester versetzt. Das Gemisch wird heftig gerührt. Die wässrige Phase wird abgetrennt, mit 1 η Salzsäure auf den pH-Wert 6 eingestellt und über eine mit 25 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50, Ammoniumform) gepackte Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm gegeben, um die gewünschte Verbindung daran zu adsorbieren. Nach Waschen mit 100 ml Wasser wird mit 0,05 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 5 ml abgenommen. Die Fraktionen Nr. 33 bis 40 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 87 mg weisses Pulver. Bei diesem Pulver handelt es sich um ö'-N-Benzyloxycarbonylfortimicin KE mit folgenden Eigenschaften. Die Ausbeute beträgt 47,6 Prozent d.Th.

(1) Der R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung der unteren Phase eines

Losungsmittelgemisch.es aus Chloroform, Methanol und 30

14prozentiger wässriger Ammoniaklösung (2:1:1 Volumteile) beträgt 0,64.

(2) NMR-Spektrum (Methanol-D^) (5(ppm):

2,39 (3H, s), 3,47 (3H, s), 4,97 (1H, d), 5,07 (2H, s), 7,34 (5H, s).

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(3) Massenspektrum (m/e):

468 (M⁺), 451, 391, 305, 281, 279, 263, 235, 207, 108, 91.

(4) I. 75,5 Ms 78°C.
5

Beispiel 2
Herstellung von 6'-N-Methylfortimicin KE (Stufe 2)

500 mg 6 '-N-Benzyloxycarbonylf ortimicin KE werden in 30 ml Tetrahydrofuran, das vorher über Lithiumaluminiumhydrid getrocknet worden ist, gelöst. Anschliessend wird die Lösung mit 100 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Das Gemisch wird 18 Stunden unter Eückfluss erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und in 200 ml Eiswasser

■J5 (0 bis 5°C) gegossen, um nicht umgesetztes Lithiumaluminium hydrid zu zersetzen. Sodann wird das Gemisch unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingeengt und mit 1 η Salzsäure auf den pH-Wert 6 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird über eine mit 50 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50, Ammoniumform) gepackte Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm gegeben. Nach Waschen mit 200 ml Wasser wird mit 0,2 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 10 ml abgenommen. Die Fraktionen Nr.

28 bis 38 werden vereinigt. Das wässrige Ammoniak wird unter vermindertem Druck abgedampft. Man erhält 210 mg weisses Pulver. Bei diesem Pulver handelt es sich um 6'-N-Methylfortimicin mit den nachstehend angegebenen Eigenschaften. Die Ausbeute beträgt 56,5 Prozent d. Th.

(1) Bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (1:1:1 Volumteile) beträgt der R.-Wert 0,72.

*

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Γ

(2) NMR-Spektrum (in D₂O) 6(ppm):

2,38 (3H, s), 2,68 (3H, s), 3,4-7 (3H, s), 5,02 (1H, d).

(3) Massenspektrum (m/e):

348 (M⁺), 331, 299, 258, 235, 217, 207, 189, 14-3, 114·, 100, 86.

(4) J?. 86 bis 90⁰C

(5) Elementaranalyse C,.,-H^oELO₁-.COo
10

H CN

gef.: 8,52 48,85 14,49

ber.: 8,22 48,97 14,28

Beispiel 3

Herstellung von 1,2', 6' -N-Tribenzyloxycarbonyl-6' -N-methylfortimicin KE (Stufe 3)

220 mg 6 · -N-Methylfortimicin KE werden in 15 ml Methanol gelöst. Anschliessend wird das Gemisch unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 520 mg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 10 ml Methanol versetzt. Das Gemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung des Methanols destilliert. Der Rückstand wird mit 50 ml Essigsäureethylester versetzt. Das Gemisch wird mit 50 ml Wasser gewaschen.

Die erhaltene Essigsäureethylesterphase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert. Man erhält die gewünschte Verbindung in Form eines rohen Pulvers. Dieses rohe Pulver wird zur weiteren Reinigung in 2 ml Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird über eine mit 20 g Kieselgel (Kieselgel 60, E. Merck & Co.) gepackte Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm gegeben. Die Elution wird

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mit einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Chloroform (1 : 4-9 Volumteile) durchgeführt. Das ELuat wird in Fraktionen von 10 ml abgenommen. Die Fraktionen Nr. 20 bis 52 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 34-0 mg weisses Pulver. Bei diesem Pulver handelt es sich um 1,2' ,e'-N-Tribenzyloxycarbonyl-e'-IT-methylfortimicin KE mit den nachstehend angegebenen Eigenschaften. Die Ausbeute beträgt 71*7 Prozent d. Th.

(1) Der R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol (9 : 1 Volumteile) als Laufmittel beträgt 0,60.

(2) NMR-Spektrum (Methanol-D^) 6 (ppm):

2,35 (3H, s), 2,87 (3H, s), 3,46 (3H, s), 5,08 (6H, s), 7,32 (15H, s).

(3) F. 74 bis 76°C.

Beispiel 4

Herstellung von 6'-N-Methyl-N-tetrabenzyloxycarbonylfortimicin D (Stufe 4)

134 mg N-Benzyloxycarbonylglycin und 86 mg 1-Hydroxybenztriazol werden in 16 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird mit 14-3 mg NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.

Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlen auf 0 bis 5°C gerührt und dann mit 400 mg 1,2' ,ö'-lT-Tribenzyloxycarbonyl-6 '-IT-methylf ortimicin KE versetzt. Sodann wird das Gemisch 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abfiltrieren der ausgefallenen Verunreinigungen wird das Piltrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält ein blassgelbes Pulver. Zur weiteren Reinigung wird dieses Pulver in 2 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird über eine mit 20 g Kieselgel (Kieselgel 60, E. Merck & Co.) gepackte Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm gegeben. Die Elution wird mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform

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und Methanol (1 : 99 Volumteile) durchgeführt. Das KLuat wird in Fraktionen von 10 ml abgenommen. Die Fraktionen Nr. 20 bis 31 werden vereinigt. Nach dem Abdestillier en des Lösungsmittels erhält man 310 mg (61,8 Prozent d. Th.) 6'-N-Methyl-N-tetrabenzyloxycarbonylf ortimicin D in Form eines weissen Pulvers mit den nachstehend angegebenen Eigenschaften.

(1) Der B.£-wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol (19 : 1 Volumteile) beträgt 0,40.

(2) F. 81,5 bis 84-⁰C.

Beispiel "5

Herstellung von 6' -N-Methylfortimicin D (Stufe 5)

310 mg 6' -N-Methyl-N-tetrabenzyloxycarbonylf ortimicin D, das gemäss Beispiel 4 erhalten worden ist, werden in 20 ml einer 0,2 η Lösung von HCl in Methanol gelöst und mit etwa 40 mg lOprozentiger Palladium-auf-Aktivkohle versetzt. Das Gemisch wird bei Umgebungstemperatur unter Atmosphärendruck 3 Stunden hydriert. Nach dem Entfernen des Katalysators und Abdestillieren des Lösungsmittels wird der erhaltene Bückstand in 5 ml Wasser aufgenommen. Die Lösung wird sodann über eine mit 10 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50, Ammoniumform) gepackte Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm gegeben. Nach Waschen mit 20 ml Wasser wird mit 0,3 η wässriger Ammoniaklösung eluiert. Das ELuat wird in Fraktionen von 5 ml abgenommen. Die Fraktionen Nr. 13 bis 18 werden vereinigt.

Nach dem Abdestillieren des wässrigen Ammoniaks erhält man 120 mg (89,9 Prozent d. Th.) gereinigtes 6'-N-Methylfortimicin D in Form der freien Base.

100 mg der freien Base von 6 · -N-Methylfortimicin D werden in 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Schwefelsäure

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auf den pH-Wert 3 eingestellt. Sodann wird die Lösung tropfenweise zu 20 ml Ethanol gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert. Man erhält I30 mg Sulfat von 6 · -N-Methylfortimicin D mit den nachstehend angegebenen Eigenschaften.

(1) Der Ε--Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (1 : 1 : 1

) Volumteile als Laufmittel beträgt 0,47·

(2) KMR-Spektrum (Protonen)6 (ppm):

a. freie Base (in DpO)

2,31 (3H, s), 3,02 (3H, s), 3,40 (3H, s), 3,47 (3H, s), 4,75 (1H, d).

b. Hydrochlorid (es wird eine Probe verwendet, in der die freie Base mit DCl bis zum pD-Wert 1 versetzt ist). 2,77 (3H₁ s), 3,12 (3H, s), 3,47 (3H, s), 4,06 (2H, s), 5,32 (1H, d).

(3) Massenspektrum (m/e):

405 (M⁺), 387, 356, 292, 274, 264, 246, 207, 143-

(4) Spezifische Drehung (Sulfat)

22

r*Jj> = + ⁸²>°° Cc = 0·,2; H₂O). 25

(5) P. (freie Base) 88 bis 91⁰C

(6) Das CMR-Spektrum ist in den Fig. 1 und 2 abgebildet. Pig. 1 zeigt das Spektrum der freien Base und Fig. des Hydrochloride (Probe, bei der die freie Base bis zum pD-Wert 1 mit DCl versetzt ist).

(7) Elementaranalyse Ο^Έ^^Ο^,

	H	C	16	N
gef.:	8,79	49,00	16	,62
ber.:	8,75	49,26	,89

J 809846/0977

Le

r s e 11 e

Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCHNEF? · HEUNEMANN

PATENTANWÄLTE

SI E BE RTSTRASS E A · SOOO MÖNCHEN 86 ■ PHONE: (Ο89) 474Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 45 3 VOPAT D

u.Z.: M 713 11. Mai 1978

Case: 210 - 4-

KIOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan

"Fortimicin-Derivate und ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen"

Priorität: 11. Mai 1977, Japan, Nr. 53 879/77

20

Patentansprüche

^"M Fortimicin-Derivate der allgemeinen Formel I

CH₂NHCH₃ NH₂ p_H

30

2 HO N-Y

(D

35

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Γ

in der Y ein Wasserstoff atom oder eine -COCI^NHp-Gruppe bedeutet, und ihre Salze mit Säuren.
2. 6'-lT-Methyiformicin KE und seine Salze mit Säuren. 5
3. 6'-N-Methylfortimicin D und seine Salze mit Säuren.
4-, Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Fortimicin KE mit einem Acylierungsmittel der allgemeinen Formel EOCOX, in der R einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder einen Aralkylrest mit 7 oder 8 Kohlenstoffatomen und X Cl, Br, J, N₅.,

oder 20

bedeutet, in einem Lösungsmittel umsetzt, bis ein Wasser-25 stoffatom in der Aminogruppe, die an das Kohlenstoffatom

in der 6'-Stellung gebunden ist, durch die Gruppe ROCO, in der R die vorstehende Bedeutung hat, ersetzt ist, wodie erhaltene Verbindung in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel in Gegenwart eines Reduktionsmittels bei 30

Temperaturen von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur des Lösungsmittels reduziert, bis die ROCO-Gruppe in eine Methylgruppe umgewandelt ist, wodurch man 6'-N-Methylfortimicin KE erhält,

gegebenenfalls das 6'-M-Methylfortimicin KE in einem 35 Lösungsmittel mit einem Aminoschutzgruppenreagens umsetzt, bis die Aminogruppen in den Stellungen 1, 2 und

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γ ~ι

6¹ mit einer Aminoschutzgruppe versehen sind, die erhaltene Verbindung mit geschützten Aminogruppen mit einem N-geschützten Glycin in einem Lösungsmittel kondensiert, bis das N-geschützte Glycin in die ungeschützte Aminogruppe eingeführt ist und die Aminoschutzgruppen unter Bildung von 6'-N-Methyl fortimicin D entfernt und diese Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gegebenenfalls die erhaltenen Verbindungen mit einer Säure in ein Salz !Überführt.
5. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass man 6'-N-Methylf ortimicin KE aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
6. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

L· . _J

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