DE2509885C3

DE2509885C3 - 1 -N-(2-Hydroxy-3-amim>propionyl)-XK-62-2, dessen Salze und seine Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen

Info

Publication number: DE2509885C3
Application number: DE2509885A
Authority: DE
Inventors: Yasuki Kawasaki Kanagawa Mori; Shinji Machida Tokio Tomioka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1974-03-07
Filing date: 1975-03-06
Publication date: 1978-08-17
Also published as: SE416208B; DE2509885A1; ATA173875A; NO140428C; JPS573679B2; ES435375A1; NO140428B; NL7502740A; AT340588B; CH613710A5; JPS50117748A; PH13670A; NO750720L; DE2509885B2; GB1500218A; DK88475A; ZA751414B; FR2263251B1; FR2263251A1; CA1046057A

Description

und seine Salze mit Säuren.

2. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 oder ihrer Salze bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Verbindung der Erfindung ist ein Derivat des Antibiotikums XK-62-2, das in der DT-PS 23 26 781 beschrieben ist. Die Verbindung der Erfindung kann in der D-, L- oder DL-Form vorliegen.

In der genannten DT-PS ist ausgeführt, daß sich da:. Antibiotikum XK-62-2 durch Züchtung von Actinomyceten, wie Micromonospora sagamiensis, Micromonospora echinospora und Micromonospora purpurea, nach üblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten herstellen läßt. Insbesondere werden Stämme der vorgenannten Mikroorganismen, z. B. Micromonospora sagamiensis ATCC 21826, ATCC 21827, ATCC 21803 und ATCC 21949, in ein wäßriges Nährmedium überimpft, das verwertbare Kohlenstoffquellcn, wie Zucker, Kohlenwasserstoffe, Alkohole oder organische Säuren, anorganische oder organische Stickstoffqucllen sowie anorganische Salze und wachstumsförderndc Substanzen enthält, und bei 25 bis 40°C 2 bis 12 Tage gezüchtet. Die Isolierung und Reinigung von XK-62-2 wird durch kombinierte Adsorptions- und Desorptionsschritte unter Verwendung von lonenaiustauscherharzcn und Aktivkohle sowie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Cellulose, vernetzten! Dextran, Aluminiumoxid oder Kieselgel durchgeführt. Auf diese Weise läßt sich XK-62-2 in Form eines Salze; oder der freien Base erhalten.

XK-62-2 ist ein weißes Pulver mit basischer Reaktion. Die .Summenformel lautet C>i,l l4iN-,O>. Das Molekulargewicht beträgt 463. Die Verbindung löst sich gut in Wasser und Methanol, ist schwach löslich in Äthanol und Aceton und unlöslich in Chloroform, Benzol, •Mi Essigsäureäthylester und η-Hexan. Es weist folgende Strukturformel auf:

o—i

HO

NH

NH,

HO

L CH, OH

CH,

Die Verbindung der Erfindung kann nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.

Die Aminogruppen der !-Stellung von XK-62-2 wird mit 2-Hydroxy-3-aminopropionsäure acyliert. Es wurde festgestellt, daß unter den Aminogruppen von XK-62-2 die in der 2'- und 6'-Ste|lung stehenden reaktiver als die in der 1-Stellung stehenden sind, Deshalb werden vorzugsweise die in der 2'- und 6'-Stellung befindlichen Aminogruppen vor der Acylierung durch eine Schutzgruppe blockiert. Ferner wurde festgestellt, daß die Aminogruppe in der 3-Stel!ung weniger reaktiv als die Aminogruppe in der !-Stellung ist und daß deren Reaktivität nocn abnimmt, wenn das Wasserstoffatom der in der 6'-Stellung befindlichen Aminogruppe durch eine Schutzgruppe ersetzt worden ist. Schließlich wurde festgestellt, daß die in der 3"-Stellung stehende Aminogruppe weniger reaktiv als die Aminogruppe in der !-Stellungist.

A. Schutz der Aminogruppen in der T- und/oder
6'-StelIung

XK-62-2 wird mit einem Aminoschutzgruppenreagens in einem Lösungsmittel zu mindestens einer der folgenden Verbindungen umgesetzt:

Verbindung, bei der das an das Stickstoffatom der Methylaminogruppe gebundene Wasserstoffatoin in der b'-Stellung von XK-62-2 ersetzt ist (Zwischenprodukt H-A); eine Verbindung, bei der mindestens eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe in der 2'-Stellung von XK-62-2 ersetzt ist (Zwischenprodukt H-B); und eine Verbindung, bei der das an das Stickstoffatom der Methylaminogruppe gebundene Wasserstoffatom in der 6'-Stellung und mindestens eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe in der 2'-Stellung ersetzt ist (Zwischenprodukt M-C). Im allgemeinen werden diese Zwischenprodukte als Gemisch erhallen.

Die Umsetzung von XK-62-2 mit dem Aminoschutzgruppenreagens wird unter üblichen Bedingungen

durchgeführt. Es werden 0,5 bis 4,5 Mol des Schutzgruppenreagens pro 1 Mol XK-62-2 eingesetzt. Die Reaktion wird bei Temperaturen von -50 bis 50C durchgeführt. Es ist nicht zweckmüßig, eine größere Menge an Schulzgruppenreagens zu verwenden oder die Umsetzung bei erhöhten Temperaturen durchzuführen, da dabei die Schutzgruppe auch in die Aminogruppe in der !-Stellung eingeführt wird. Um den ausschließlichen selektiven Schutz der Aminogruppen in der T- und/oder 6'-Stellung zu erreichen, werden vorzugsweise 0.7 bis 2,6 Mol Schutzgruppenreagens pro 1 Mol XK-62-2 verwendet, wobei die Reaktionstemperatur bei -20 bis 20° C liegt.

Als Lösungsmittel werden dabei Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, niedere Alkohole, Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther. Pyridin oder Wasser oder deren Gemische verwendet.

Als Aminoschutzgruppe können an sich alle leicht entfernbaren Schutzgruppen verwendet werden, die 2D üblicherweise zur Peptidsynthese eingesetzt werden. Derartige JJchutzgruppen und die entsprechenden Reagenzien, die zur Einführung dieser Schutzgruppen geeignet sind, wurden von M. Bodanszxyu. Mitarb., Reptide Synthesis, 1966. John Wiley & Sons, New York. S. 21 bis41 und A. K a poo r. Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd 59 (1970), S. 1 bis 27. beschrieben.

Die Zwischenprodukte H-A. Il-B und H-C können ohne weitere isolierung und Reinigung direkt zur Acylierung eingesetzt werden. Gegebenenfalls können diese Zwischenprodukte jedoch auch nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden.

Zur Acyferung werden pro 1 Mol der Verbindung H-A, H-B und H-C 0,5 bis 1,5 Mol. vorzugsweise 0,7 bis 1,2 Mol, des Acylierungsmittels verwendet.

Besonders, bevorzugt ist der 2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyamiri'D-propionsaure-N-hydroxysuccinimidester der Formel

OH O

CH₂-O-C-NH-CH₂-CH-C-O-N

Dieses Acylierungsmittel wird durch Umsetzung von 2- Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionsäure mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart einer dehydratisierend und kondensierend wirkenden Verbindung, wie Dicyclohexylcarbodiimid, hergestellt.

Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach üblichen Verfahren vorgenommen werden.

Vorzugsweise wird mit der Benzyloxycarbonyl-Schulzgruppe gearbeitet. Die Abspaltung dieser Schutzgruppe wird durch Hydrierung vorzugsweise in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle vorzugsweise in einem Gemisch aus Wasser und Methanol (1 : I) in Gegenwart einer geringen Menge einer Säure, vorzugsweise Essigsäure, bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck durchgeführt.

Das auf diese Weise hergestellte I-N(2-Hydro\y-j- iimiiuipropionyl)-XK-62-2 der Formel I wird in un sieh bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Säiilenchromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittel, wie lonenaustiiiischerhar/.en. Kieselgel. Aluminiumoxid. Cellulose oder vemctztcm Dextran, oder durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, Aluminiumoxid oder Cellulose.

Gegebenenfalls kann l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2 in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von einer, zwei, drei, vier oder fünf Aminogruppen mit Säuren in Salze überführt werden.

Dazu wird ein Mol der Verbindung der Erfindung mit ! bis 5 Mol einer Säure umgesetzt. Beispiele für die zur Salzbildung verwendbaren Säuren sind anorganische Säuren, wie Salzsäure, Eromwasserstoffsäure. Jodwasserstc isäure. Schwefelsäure. Phosphorsäure und Kohlensäure, und organische Säuren, wie Essigsäure. Fumarsäure, Apfelsäure, Citronensäure. Mandelsäure. Weinsäure und Ascorbinsäure.

Die durch Abspaltung der Schutzgruppen aus den Zwischenprodukten III A, III B und HIC erhaltenen Produkte weisen in bezug auf NMR-Spckirum. IR-Spektrum. .Schmelzpunkt, spezifische Drehung. FJementaranalyse und Mindcsthenimkon/enlratior (MIIK) gegenüber verschiedenen Bakterien die gleichen Eigenschaften auf. Aufgrund dieser Daten werden die Produkte als I -N-(?-Hydro\y-3-aminopropionyl)-XK-62-2 bezeichnet.

I -N-(2-Hydroxy-3-aniinopriipionyl)-XK-62-2 ist ein

Antibiotikum nut hoher anlibakierieller Aktivität. insbesondere gegenüber Stämmen von Fscherichia eoli. die einen R-Faklor aufweisen, und die gegenüber bekannten Aminoglvkosid-Antibiolika resistent sind.

In Tabelle I ist das antibakteriell Spektrum von Kanamycin A. Gcntamyein Ci.,, XK-62-2 sowie der D-. I.- und Dl.-formen von I -N-(2-Myclroxy-i -aminopropionyl)-XK-b2-2 gegenüber verschiedenen grampositivcn und granincgaüvcn Bakterien angegeben. Die Minilestheinnikon/enli'iilion wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode bei einem pH-Wert von 8.0 be stimmt. Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Verbindung der Erfindung eine starke antihaktcricllc Aktivität insbesondere gegenüber Escherichia eoli KY 8327 und 834K besitzt.

Tabelle I
Teslkeim

Mindesthemmkon zentral ion. y/m\

Kanamycin Λ (icnlamycin XK-h2-2 Ct.,

Pseudomonas aeruginosa 5,2 0,13

BMH I

Staphylococcus aureus 0,021 0,004

ATCC 6538 P

Bacillus subtilis 0,021 0,004

Nr. 10707

Proteus vulgaris 0,16 0,033

ATCC 6897

Shigella sonnei 0,16 0,033

ATCC 9290

Salmonella typhosa 0,08 0,016

ATCC 9992

Klebsiella pneumoniae 0,042 0,016

ATCC 10031

Escherichia eoli 0,16 0.033

ATCC 26

Escherichia eoli 1.04 2.08

KY 8327

Escherichia eoli 0.041 1,04

KY 8348

0,52

0,008

0,004

0,033

0.033

0.008

0,004

0.016

1.04

1.04 l-N-(2-Hydnixy-3-aminopropicinyl)-XK-h2-2 D-Fnrm L-I'orm I)I.-Form

2.08

0.004

0,004

0,033

0.008

0.004

0,004

0.004

0,004

1.04	1,04
0.004	0,065
0.004	0,008
0,033	0,033
0,008	0,016
0.004	0,004
0,004	0,033
0.004	0,008
0.004	0,004
0.004	0.004

F.schcrichia eoli KY 8327 und KY 8348 bilden intracellulär Gcntaniycin-Adenyltransferase bzw. Gentamycin-AcetyltransfcraseType I. E. eoli 8327 inaktiviert Kanamycine und Gentamycine durch Adenylierung. während F.. coli KY 8348 durch Acetylierung desaktivicrt.

In Tabelle Il ist das antibakteriell Spektrum der Verbindung der Erfindung (D-. L- und DL-Form), von Kanamycin A. Gentamycin C-Komplex (Ci. Ci., und C_:) und XK-62-2 angegeben. Die Mindesthemmkonz.entration wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode bei einem pH-Wert von 7.2 bestimmt.

Tabelle II

restkeim	Mindesthemmkonzentration	A Gentamycin C-Komplex (C₁, C]_a und C₂)	, y/ml
	Kanamycin	<0,05	XK-62-2
Staphylococcus aureus 209 P	0,2	<0,05	0,1
Staphylococcus aureus Smith	0,2	<0,05	< 0,05
Bacillus subtilis ATCC 6633	0,2	< 0,05

l-N-i2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

D-Form

L-Form

DL-Form

0,05

0,1

0,05

0,1

lorlsct/υημ Testkeim

Mindesthemmkon/entration. )7nil

Kanamycin Λ (ienlamycin XK-d2■).
C-Komplcx

(C" |. ( i_. und

Sarcina lutea ATCC 9341	6,25
F.schcrichia coli T-2	1.56
Hscherichia coli T-5	1.56
Escherichia coli KY 8327¹)	50
Escherichia coli KY8321²)	100
Escherichia coli KY 8348³)	0,78
Escherichia coli KY 8349")	> 100
Pseudomonas aeruginosa BMH 1	12,5
Pseudomonas aeruginosa K .851O⁵)	100
Pseudomonas aeruginosa KY 8511^A)	100
Pseudomonas aeruginosa KY 8512⁷)	12.5
Pseudomonas aeruginosa KY 8516")	> 100
Providencia sp. 164")	> 100
Klebsiella pneumoniae Nr. 8045	0,4
Proteus mirabilis 1287	6,25
Proteus vulgaris 6897	3,12
Proteus rettgeri KY 4288	0,78
Proteus morgana KY 4298	1,56

l-N-(2-llydr()ny-3-amin()propionyD-XK-ii2-2

<Ί) D-l-orm I.-Porm OL-I-orm

0.2 0,4 - - 0,4

0.4 0,4 0,2 - 0,4

0,4 0,4 - - 0,4

12.5 12,5 0,2 0,2 0,4

6.25 3,12 0,2 0,4 0,2

3,12 12,5 0,2 0,2 0,2

0.2 0,4 0,2 0,2 0,2

0,4 0,78 1,56 1,56 1,56

3,12 1,56 3,12 3,12 3,12

50 100 3.12 3,12 3,12

0,4 0,78 1.56 0,78 0,78

3,12 3,12 - - 3,12

50 100 6,25 6,25 12,5

0,2 0.1 0,2 0,2 0.2

1,56 0,78 3,12 3,12 3,12

0,78 0,78 0,78 1,56 3,12

0,78 0,4 - - 0,78

') Bildet Gentamycin-Adenyltransferase

²) Bildet Gentamycin-Adenyltransferase und Neomycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ Π

^ Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ I

ι Bildet Neomycin-Kanamyctn-Phosphotransferase Typ I

ι Bildet Kanamycin-Acetyltransferase

I Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ I und Neotnycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ I

) Bildet Neomycin-Kanamycin-Phosphotiansferase Typ I und Typ Π und Streptomyctn-Phospnotransferase ⁸) Bildet vermutlich Kanamycin-Acetyltransferase * Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ Π

Die Enzyme werden intracellulär gebildet. Mittels 65 Erfindung eine starke antibakterielle Wirkung gegendieser Enzyme inaktivieren die Bakterien die Antibscti- über verschiedenen Problemkeimen aufweist die ka. gegenüber Gentamyrin-Antibiotika und XK-62-2 resi-

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die Verbindung der stent sind, die Gentamycin-Adenyltransferase und/oder

Gcntamycin-Acetyltransferasc Typ I und Typ Il ininiccllulär bilden und hierdurch Gentamicin Antibiotika und die Verbindung XK-62-2 inaktivieren.

Die Heispiele erläutern die Erfindung. I is wird die Dl.-Form des Aeylierungsmittels verwendet.

Beispiel I

2-Hydroxy- carbobenzyloxyiiminopropionsäurc-N-hydroxysuccinimidestcr

1.0 g (4.2 inMol) 2-Hydroxy■3-carbobcnzyloxyaminopropionsäure (beschrieben in The Carbohydrate Rc search, Bd. 28 [1973], S. 26J bis 280) und 0.48 g (4,2 mMol) N-Hydroxysuccinimid werden in 35 ml Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit 0,86 g (4.2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, wobei die Temperatur bei 0 bis 5°C gehalten wird. Anschließend wird das Gemisch über Nacht bei derselben Tc^mpc^ra^tllr stehengelassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das erhaltene Filtrat wird zur Entfernung des Essigsäureäthylesters unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 1,30 g (92,0% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses, durchsichtiges öl. Dieses Produkt kann direkt für die weitere Umsetzung verwendet werden, jedoch läßt sich das Produkt durch Säulenchromatographie weiter reinigen. Das gereinigte Produkt zeigt folgende Eigenschaften:

IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm) 3700-3100. 2950, 1816. 1780, 1700, 1520. 1320, 1170. 1070, 992. 830-500Cm'.

NMR-Spektrum (in Deu'erochloroform) Λ (in ppm gegen TMS): 2,77 (4 H, Singulett). 3,67 (2 H, Multiplen), 4.64 (I H. Multiple»), 5,11 (2 H, Singulett), 5,82 (I H. Triplett.) = 3,0 Hz), 7.33 (5 H, Singulett).

C₁₅H₁₆N₂O₇:

N (V.)

Ber.:
Gef.:

53,57
53,42

A.Ib
4,65

Beispiel 2

8,33 8,39

Beispiel 3 2'-N.6'M-Dicarbobcnzy!oxy XK 62 2

Das gernäß Beispiel 2 erhaltene Gemisch wird unier

■> vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit 70 ml Wasser und 50 ml Essigsäiircäthylester versct/t. Das erhaltene Gemisch wird gründlich gerührt. Sodann wird das Gemisch stehengelassen, bis sich die Wasser- und die Essigsäureäthylesicr-

I» phase voneinander trennen. Die wäßrige Phase wird zweimal mit je 30 ml Essigsäiireäthylestcr extrahiert. Die Essigsäureäthylesterphase und die Essigsäureäthylcs'ierexirakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene einge- > dampft. Man erhält 2.24 g (35.1 % d. Th.) der Titelverbm dung als hellgelben, amorphen Feststoff.

Das so erhaltene Produkt wird direkt als Ausgangsmatcrial für die nachfolgende Umsetzung verwendet. Jedoch kann das Produkt durch Säulenchromatographic

_'i> an Kicselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol. konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 4:1:1 weiter gereinigt werden. Das gereinigte Produkt weist folgende Eigenschaften auf:
F. 93 bis 95° C.

fit]? +81,6° (c = 0,12,Methanol). IR Absorptionsspektrum (KBr): 3800 bis 3000, 2950, 1700, l>40, 1456, 1403, 1310. 1250, 1160. 1050. 1010. 960. 738.700.605cm ' (Fig.4).

μι NMR-Spektrum (in Methanol -d.i) Λ (in ppm gegen TMS): 1.13 (3 H, Singulett), 2.62 (3 H. Singulett), 3.01 (3 II, Singulett), 530-4.90 (6 H. breit. Singulett), 7.43 (5 H.Singulett). 7.47 (5 H. Singulett)(F i g. 1).

r, C₃(Hs₅N₅O₁₂ ■ '/2 H₂O:

	Ber.:	C (·/.)	H (%)	N C/,)	I
	Gef.:	58,10	7,29	9,46	-N-Carbobenzyloxy-XK-62-2
		58,02	7,51	9,70
			Beispiel 4
45	6'

6'-N-Carbobenzyloxy-XK-62-2^'-N-Carbobenzyl oxy-XK-62-2 und 2'-N,6'-N-Dicarbobenzyloxy-XK-62-2

4,00 g (8,65 mMol) der Verbindung XK-62-2 werden in 92 mi eines Gemisches gleicher Volumenteile Dimethylformamid und Wasser gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 3 Stunden bei 0 bis 5° C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 323 g (123 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 70 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht bei 0 bis 5° C stehengelassen. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis 4:1:1 als Laufmittel und unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel wird die Gegenwart von nicht umgesetztem XK-62-2 neben 6'-N-Carbobenzyloxy-XK-62-2 (RrWert 0,71), T-N-Carbobenzyloxy-XK-62-2 (Rt-Wert 0*2) und 2^r-N,6'-N-Dicarbobenzyloxy-XK-62-2 (R,-Wert 0,88), festgestellt.

Die nach der Extraktion mit Essigsäureäthylester gemäß Beispiel 3 erhaltene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 15 ml eingeengt Das erhaltene Konzentrat wird auf eine mit 200 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform beschickte Säule vom Durchmesser 2J5 cm gegeben. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird mit 0,In-wäßriger Ammoniaklösung eluiert Das Eluat wird in Portionen von jeweils 10 ml abgenommen. Mit den Fraktionen Nr. 48 bis 65 wird 6'N-Carbobenzyloxy-XK-62-2 ehiierL Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 13 g (23,1% cLTh.) eines farblosen, amorphen Feststoffs. Dieses Produkt kann direkt als Ausgangsmaterial für die anschließende Umsetzung verwendet werden. Jedoch kann dieses Produkt gemäß dem vorbeschriebenen Verfahren mit dem Kationenharzaustauscher weiter gereinigt werden. Die gereinigte Titelverbindung weist folgende Eigenschaften auf:

F. 108 bis IiO⁰C

[«]? +1273° (c=0,094; Methanol).

Il

ir.-.Sp,;ktrum <K»r) 570O-3000, 29J0. 1690. IbJO. 1596, 1480. !452. !-t()2. !25O. 1 143. 1096, 1(150, 1020. 8J0. 768. 750.697. 595. 550 cm ' (F i g. 5).

NMR-Spe'-.trum (in Methanol —dj) Λ (in ppm gegen TMS): I.Ib (JH. Singulett). 2.61 (3 H. Singulett), 3,01 (5 H, Singulett). 5.30-4.90 (4 H. Multiplen). 7.47 (5 H. Singulett)(F i g. 2\

	C ι' )	H (%)	N (%)
Her.:	54.77	7.84	11,13
Ci e Γ.:	54." 1	7.93	10.90
		Beispiel 5
	2'	-N-Cirbobenzylow-XK-	62-2

Anschließen"! jn die Klution von 6' N-C arboben/\ I-oxy-XK-62-2 "imäß Beispiel 4 wird mit den Fraktionen Nr. 78 bis 97 2' N-C arbobenzyloxy XK 62-2 eluiert. Die l'raktionen «erden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhiilt 1.43g (26,7% d. Th.) 2'-N-Carbobcn/vK>xy-XK-62-2 als farblosen, amorphen Feststoff. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann direkt als Ausgangsmaterial für die weitere Umsetzung verwendet werden. |edoch kann das Produkt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 durch Behandlung mit dem Kationenhjivaustauschcr weiter gereinigt werden. Die gereinigte litelverbmdiing weist folgende Eigenschaften auf:

F. 107 bis 110 C.

[x\ + 87.80" (c = 0.10. Wasser).

IR Spektrum (KBr): 3700-3100. 2930. 1702. 1530. 1451.1310.1255.1141.1053. 1021.960. 735.697.604 cm '

NMR-Spektrum (in Methanol —d₄) Λ (in ppm gegen TMS) 1,13 (3 H. Singulett), 2,42 (3 H. Singulett). 2.60 (3 H. Singulett). 5.13 (4 H, breit, Singulett). 7.43 (5 H. Singulett)(F i g. 3).

C^aliirN.O- · 2 rijO:

Ber.:
Gef:

53.08
53.31

8.06
8,16

Beispiel 6

11,06 10,93

1-N-(2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyacninopropionyl)-2'-N,6'-N-dkarbobenzyloxy-XK-62-2

740 mg (1,OmMoI) 2'-N,6'-N-Dicarbobenzyloxy-XK-62-2 werden in 20 mi eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Wasser und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei -5 bis 0°C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 403 mg (1,2 mMol) 2-Hydroxy-3k3irbobenzyloxyarninopropionsäure-N-hydroxysucdninridester in 15 ml Dimethylformamid versetzt Innerhalb 1 Stunde ist die Zugabe beendet. Anschließend wird das Gemisch Ober Nacht zur Umsetzung gebracht- Durch Dünnschichtchromatographie an Kteselgel unter den Bedingungen gemäß BeisDtel 2 wird die Anwesenheit einer geringen Menge von Nebenprodukten und nicht umgesetztem 2'-N.6'-N-Dicarbobenzyloxy-XK-62-2 neben l-N-(2-Hydroxy-3-carbobenzylo)iyaminopropionyl)-2'-N,6'-N-dicarbobenzyloxy-XK-62! 2 (R,-Wert 0.95) festgestellt. Das RrMk-"i tionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird ohne weitere Reinigung zur weiteren Umsetzung verwendet. Gegebenenfalls kann dieses Produkt gcmiiiß Beispiel 2 durch Säulenchromatogrdi" phie an Kieselgel weiter gereinigt werden.

B e i s ρ i e ! 7

I N (2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionyI)-2'N-carbobenzyloxy-XK-62-2

6}3ing (1.0 mMol) 2'-N-Carhobcn/yloxy-XK-62-2 werden in 20 ml eines Gemisches aus gleichen Volumteilen Dimethylformamid und Wasser gelöst. Dit l.risiing wird innerhalb von 1 Stunde bei —5 bis OC

ί tropfenweise mit einer Lösung von 403 mg (1.2 mMol) 1 iUdroxy-J-earbobenzyioxyaminopropioiisäurc N-iiydroxysucciniinidester in 15 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch Dünnschicht-

: Chromatographie an Kieselgel unter den Bedingungen gemäß Beispiel 2 läßt sich die Anwesenheit einer geringen Menge an Nebenprodukten und nicht umgesetztem 2'-N-Carbobenzylo\y-XK-62-2 neben l-N-(2-rlydroxy-3-carbobenzylo\yaminopropionyl)-2'-

iii N-carbobenz>'loxy-XK-62-2 (R -Wert 0.83) feststellen. Das Rcakiionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem lcic'ht gelblichen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung direkt zur wetteren Umsetzung verwendet. Gegebenenfalls kann

• ■. das Produkt gemäß Beispiel 2 durch Saulenchromatographie an Kieselgel weiter gereinigt «.erden

Beispiel H

l-N-(2-l lydroxy-3-earbobenzyli.>x>.imin.»propion\l)-""' 6'-N-carbobenzvlcixy XK-b2 2

615 mg (1.0 mMol) 6'-N-Carboben/>lo\\-Xk-b2-2 werden in 20 ml eines Gemisches aus gleichen Volürncnlciicn Dimetivliormsrp.id und Wasser gelöst

j". Die Lösung wird innerhalb 1 Stunde bei -5 b> OT unter Rühren mit einer Lösung von 403 mg (1.2 mMol) 2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionsäure-N-h>droxysuccinimidester in 15 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über

■ι. Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch Dünnschicht Chromatographie an Kieselgel gemäß Beispie! 2 Iäl3t sich die Anwesenheit einer geringen Menge von Nebenprodukten und nicht umgesetztem 6-NCarbobenzyloxy-XK-62-2 neben i -N-(2-H)dro\y-3-carboben-

5.5 zyloxyaminopropionyl)-6'-N-carbobenzyloxy-XK-62-2 (Rf-Wert 0,87) feststellen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung direkt zur weiteren Umsetzung

te verwendet Gegebenenfalls kann das Produkt gemäß Beispiel 4 durch Behandlung mit dem Kationenharzaustauscher gereinigt werden.

Beispiel 9 ^h5 1 -N-{2-Hydroxy-3-aminopropiony!)-XK-62-2

Der in Beispiel 6 erhaltene Rückstand der 1 -N-{2-Hydroxy-3-carfaobenzyloxyaminopropionyl)-2'-N,6'-N-di-

carbobenzyloxy-XK-62-2 als Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst Die Lösung wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird sodann in Gegenwart von 120 mg 5prozentigem Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 6 Stunden hydriert Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1:1 und Ninhydrin als Anfärbemittel läßt sich l-N-(a-Hydroxy-/?-aminopropionyl)-XK-62-2 (Rf-Wert 0,42) als Hauptbestandteil neben seinen Stellungsisomeren und einer geringen Menge von XK.-62-2 (aufgrund von in Beispiel 6 nicht umgesetztem 2'-N,6'-Dicarbobenzyloxy-XK-62-2) feststellen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter venr.indertem Druck eingedampft Anschließend wird der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst Die Lösung wird auf eine mit 70 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform beschickte Säule vom Durchmesser 1.5 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird eineO,2-n wäßrige Ammoniaklösung über die Säule gegeben, wodurch 58 mg XK-62-2 erhalten werden. Die Elution wird sodann mit 0,4-n wäßriger Ammoniaklösung durchgeführt wobei die Bestandteile dünnschichtchromatographisch untersucht werden. Die Fraktionen, die 1-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2 (Rf-Wert 0,42) als einzigen Bestandteil enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Man erhält 371 mg (58,1 % d. Th.) eines farblosen, amorphen Feststoffs.

Die Titelverbindung zeigt folgende Eigenschaften: F. 149 bis 152° C (Zersetzung bei 160⁰C).

[«]!,* + 915° (c=0.106; Wasser).

IR-Spektrum (KBr): 3800-3000. 2930, 1650. 1570. 1480.1385.1330.1110.1052.1020.813 cm-' (F i g. 7).

C₂₃H^N₆O, H₂COi ■ 13 H₂O:

	C(%)	HTO	10	NW
Ben:	45,07	7,98	13,14
Gef.:	45,21	7,71	13,32
		Beispiel

l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

Der in Beispiel 7 erhaltene Rückstand, der l-N-(2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionyl)-2'-N-carbobenzyloxy-XK-62-2 als Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst Die Lösung wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt Das Gemisch wird in Gegenwart von 110 mg 5prozentigem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 6 Stunden hydriert Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch gemäß Beispiel 9 aufgearbeitet Man erhält 397mg (62,1% d.Th.) der Tuelverbindung.

Beispiel 11 l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

Der in Beispiel 8 erhaltene Rückstand, der IN (2 Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionyl)-6'-N-carbo-

henzyloxy-XK-62-2 als Hauptbestandteil enthält wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst Die Lösung wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt Das erhaltene Gemisch wird in Gegenwart von 110 mg 5prozentigem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator bei Raumtemperatur und Almosphärendruck 6 Stunden hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch gemäß Beispiel 9 aufgearbeitet. Man erhält 243 mg (38.1 % d. Th.) der Titelverbindung.

Beispiel 12

1 -N-(2-Hydroxy-3-am!nopropionyl)-XK-62-2 - £5 H₃SO₄

H₂O

639 g (10 mMol) l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyI)-XK-62-2 werden in 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Kühlung mit einer Lösung von 2,45 g (25 mMol) Schwefelsäure in 5.0 ml Wasser versetzt Nach 30 Minuten wird die Lösung tropfenweise mit kaltem Äthanol versetzt bis keine weitere Fällung mehr erfolgt. Der weiße Niederschlag wird abfiltrien. Es wird die Titelverbindung mit folgenden Eigenschaften erhalten.

F. 240° C(Zers.).

[«]? +97,8"(C= 1,03; Wasser).

Beispiel 13

1 -N-(2-Hydroxy-3-carbobenzoxyamino propionyl)-XK-62-2

2.79 g (6.OmMoI) XK-62-2 werden in 50 ml eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Wasser und Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird bei - 5 bis 0⁰C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von

2,82 g (8.4 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von 2-Hydroxy-3-carbobenzyloxyaminopropionsäure in 20 ml Dimethylformamid versetzt Die Zugabe ist innerhalb 1 Stunde beendet Sodann wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht Durch Dünnschichtchromato graphic an Kieselgel unter Verwendung eines Gemi sches aus lsopropanol. konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 4:1:1 und unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel werden 1-N-(2-Hydroxy-3-carboben zyloxyaminopropionyl)-XK-62-2 (R₍-Wert 0,63), Neben produkte und nicht umgesetztes XK-62-2 festgestellt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft, der l-N-(2-Hydroxy-3-carbobenzykixyaininopropionyl)-

XK-62-2 enthält Dieser Rückstand wird ohne weitere Reinigung zur weiteren Umsetzung verwendet

Beispiel 14 l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

Der in Beispiel 13 erhaltene Rückstand wird in 40 m eines Gemisches aus gleichen Volumteilen Wasser line Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 0.6 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird in Gegenwart von 250 mg 5prozentigem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysatoi bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 6 Stunder

hydriert. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Iscipropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 2:1:1 lassen sich l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK.-62-2, dessen Stellungsisomere und eine geringe Menge an XK-62-2 nachweisen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 15 ml Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 150 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes in der Ammoniumform beschickte Säule vom Durchmesser 2,5 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird eine 0,2-n wäßrige Ammoniaklösung auf die Säule gegeben. Dabei werden 116 mg XK-62-2 erhalten. Sodann wird die Elution unter Verwendung einer 0,4-n wäßrigen Ammoniaklösung durchgeführt, wobei die Bestandteile dünnschichtchromatographisch nachgewiesen werden. Die l-N-{2.Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2 (Rr-Wert 0,42) als einzigen Bestandteil enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 586 mg eines farblosen, amorphen Feststoffs (i53% d. Th.).

Das Produkt zeigt folgende Eigenschaften:

F. 149 bis 152° C (Zersetzung bei 160⁰Q.

[«]? = + 91.5°C(c=0,106; Wasser).

IR-Spektrum (KBr): 3800-3000, 2930. 1650. 1570. 1480,1385,1330, 1110,1052,1020,813cm '.

C₂IU_4nN_nO, - H₂CO₃ - 1,5 H₂O:

Ber.: 45,07
GeC: 45,31

7,98
7,54

13,14
13,13

Beispiel 15

l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

926 mg (2,0 mMol) XK-62-2 werden in lOOrnl eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Wasser und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 15 Minuten bei 20 bis 25°C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 1,18 g (5,4 mMol) N-Äthoxycarbonylphthalimid in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gelbracht. Das Reaktionsgemisch enthält 2'-N-Phthaloyl-XK-62-2 als Hauptbestandteil und wird ohne weitere Isolierung und Reinigung zur weiteren Umsetzung verwendet.

Das Reaktionsgemisch wird innerhalb von 15 Minuten bei 20 bis 25°C tropfenweise mit einer Lösung von 1,05 g (3,2 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von 2-Hydroxy-3-N-phthaloylpropionsäure in 10n;< Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht. Das erhaltene Reaktionsgemisch enthält 2'-N-Phthaloyl-1-N-(2-hydroxy-3-N-phthaioyipropionyi)-XK-62-2 als Hauptbestandteil.

Dieses Reaktionsgemisch wird sodann innerhalb von 30 Minuten bei 10 bis 15°C tropfenweise mit einer Lösung von 12,9 g wäßrigem 80prozcntigem Hydrazin in 70 ml Methanol versetzt. Nach beendeter Zugabe bringt man das Gemisch über Nacht zur Umsetzung, wobei die Phlhaloylgruppe abgespalten wird. Das

jo Reaktionsgemisch wird sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst. Durch Säulcnchroniatographic unter Verwendung eines schwach sauren Kalionenaustauscherharzes etin der Ammoniumform unter den in Beispiel 14 angegebenen Bedingungen erhält man 685,5 mg (53.7% d.Th.) 1-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2.

Hierzu 4 Blatt 2'ciclinungcn

Claims

Patentansprüche: I. l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2 der Formel O OH

ι H ι

^l!—NH- C-CHCH₂NH,

HO