DE2458920A1

DE2458920A1 - Verfahren zur herstellung von 1-n- eckige klammer auf l-(-)-alpha-hydroxy- gamma-aminobutyryl eckige klammer zu- xk-62-2

Info

Publication number: DE2458920A1
Application number: DE19742458920
Authority: DE
Inventors: Isao Matsubara; Yasuki Mori; Takashi Nara; Kunikatsu Shirahata; Shinji Tomioka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-12-12
Filing date: 1974-12-12
Publication date: 1975-06-26
Also published as: ZA747908B; IN141069B; FR2254566A1; AU7636174A; SE417826B; GB1470330A; NL7416210A; AT337360B; JPS5088051A; ES432863A1; NO744448L; JPS5635194B2; DK644274A; PH14352A; NO139563C; CA1030531A; SE7415610L; NO139563B; FR2254566B1; ATA991974A

Description

" Verfahren zur Herstellung von 1-N-/L-( — )-oc-Hydroxy-y~amino« butyryl7-XK-62-2 "

PirLorität: 12. Dezember .1973, Japan, Nr. 137 828/73

Die Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.

-verbindung Die verfahrensgemäß eingesetzte Gentamycin/tmd ein Verfahren zu ihrer Herstellung ist in der DT-OS 2 326 781 beschrieben. Die Verbindung wird'dort als Antibiotikum XK-62-2 bezeichnet.'

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann XK-62-2 der Formel

das Antibiotikum

509826/0979

NHCH

NH

2 2

5"'

entweder mit einem Acylierungsmittel der allgemeinen Formel

- CH₀ -O-C-O-N

- O - C - JU , CH„ -

PH O

I ³ Il C-O-C-N

CH₃ -

oder

0 - C - R₃ , C₂H₅

ff

- CH₂ - C - OH

,Λ

₃ ,

ft

- CH₂ - C - R₃

in der R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Hydroxyl- oder Nitrogruppe oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten, R„ ein Chlor-, Brom- oder Jodatom und Rl ein

L . 509826/0970 _J

Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom darstellt, oder mit einem Aminoschutzgruppenreagens der Formel

C - R₃ ,

-S-OH

'NO₂

oder

II

N-C-O-C₂II₅

in der R„ die vorstehende Bedeutung bat, oder einem funktionoll äquivalenten Derivat des Acylierungsmittels oder des Aminoschutz-

werden

gruppenreagens umgesetzt/i Es wird eine Verbindung der allgemeinen Formel III

NHCH

(III)

erhalten, in der Y₁ ein ¥asserstoffatom und Y_ die Gruppe

-CH- 0 - C

CH_ O ι J · η

, CH - C - O - C 3 ·

CH_

509826/0979

O
η

CH, - O - C - _#

oder

O η

- O - C - , R. - CH₀ - C -

bedeutet, in der R₁, R_? und R. die vorstehende Bedeutung haben,

gruppe darstellen·

und Y„ zusammen mit dem Stickstoffatom eine Phthalimido-

Die Verbindung der allgemeinen Formel III wird sodann mit einem funlctionellen Derivat einer Cx -Hydroxy- ri-aminobuttersäure der

allgemeinen Formel IV

OH 0

N-CH - CH - CH - C - Z

4L· £

in der Y« ein Wasserstoffatom und Y. die Gruppe

H ι 3

- CH - O - C - , CH - C -

R ^CH*

O O .

CH₃ - O - C - , C₂H₅ - O - C - , O

•ι

R^ - CH - C - oder (( ^)V-S-

Il

- C

(IV)

bedeutet, in der R₁, R_? und Ii. die vorstehende Bedeutung haben oder Y„ und Yl zusammen mit dem Stickstoffatom eine Phthalimidogi-uppe darstellen und Z eine Gruppe der Formel

509826/0979

-ο

-NO,

0,

I=N ,

oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder cine Hydroxylgruppe darstellt, oder mit einer funktionell äquivalenten Verbindung des Acylierungsmxttels in an sich bekannter Weise acyliert. Es wird eine Verbindung der allgemeinen Formel V

NHCH

NH

0 OH ti ι

NH-C-CH-CH₂-CH₂-N

(V)

CH₃ OH

•erhalten, in der Y₁, Y_, Y_ imd Y. die vorstehende Bedeutung haben. Hierauf werden die Schutzgruppen Y₁, Y₂, Y^ und Y. in an sich bekannter Weise abgespalten, und gegebenenfalls wird die erhaltene Verbindung der Formel I

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NHCH

O OH

Il I

NH-C-CH-CH-CH₂-NH₂

durch Umsetzen mit einer Säure in ein Salz überführt.

Figur 1 zeigt das IR-Absorptionsspektrum und Figur 2 zeigt das
NMR-Sp eic trum der Verbindung der Formel I.

Erfindungsgemäß wird die Verbindung der Formel I durch selektive Acylierung der freien Aminogruppe in der 1-Stellung der Verbindung XK-62-2 hergestellt. Zunächst wird die freie Aminogruppe in der 2'-Stellung, die von den drei freien Aminogruppen der Verbindung XK-62-2 die reaktionsfähigste ist, durch Einfügung
einer Schutzgruppe geschützt. Zu diesem Zweck wird die Verbindung XK-62-2 mit einem Acylierungsmittel der allgemeinen Formel

-CH-O-C-O-N

(I O

509826/0973

f^H3O ff " ■ ■ ' ί

CH-C-O-C-N₃ , CH₃-O-C-R₃ , C₂H₅-O-C-R₃ ,

CH₃

R₄-CH₂-O-R₃

oder R, -CH-C-OH

R,-CH -C-(

in der R und R„ die vorstehende Bedeutung haben, oder einem Aminoschutzgruppenreagens der Formel

S-OH C-R₃ , . KJl oder

<ö

in der R„ die vorstehende Bedeutung hat, oder einer dem Acylierungsmittel oder dem Aminoschutzgruppenreagens funktionell äquivalenten Verbindung acyliert. Es wird eine Verbindung der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel III erhalten, in der Y₁ und Y₂ die vorstehend angegebene Bedeutung haben. Der Schutz der Aminogruppe kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Zum selektiven Schutz der Aminogruppe in der 2'-Stellung werden vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Mol, insbesondere 0,7 bis 1,2 MoljSchutzgruppenreagens pro Mol der Verbindung XK-62-2 eingesetzt. Die Reaktionstemperätur liegt im allgemeinen im Bereich von -50 bis 50 C, vorzugsweise bei -20 bis 20 C. Die Reaktionszeit beträgt 15 Minuten bis 2k Stunden, vorzugsweise bis 15 Stunden» Bei Verwendung von größeren Mengen, beispiels- · weise 3 Mol Schutzgruppenreagens, oder bei der Durchführung

L -I

: 509826/0979

der Umsetzung bei erhöhten Temperaturen von beispielsweise 100 C ist die Selektivität der Einführung der Schutzgruppe stark vermindert. Infolgedessen nimmt der Anteil an der Verbindung der allgemeinen Formel III im Reaktionsgemisch ab.

Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel kommen beispielsweise Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, niedere Alkohole, Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther, Pyridin oder Wasser oder deren Gemische in Frage.

Die erhaltene Verbindting der allgemeinen Formel III wird sodann mit einem Acylierungsmittel der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel IV acyliert. Es wird eine Verbindung der allgemeinen Formel V erhalten. Die Verfahrensgemäß eingesetzten Acylierungsmittel sind Verbindungen, die sich vonOf -Hydroxy-y-aminobuttersäure ableiten. Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch andere Derivate der or-Hydroxy-jf-aminobuttersäure eingesetzt werden, die den vorgenannten Acylierungsmitteln funktionell äquivalent sind»

Acylierungsmethoden, bei denen solche Verbindungen eingesetzt werden, die den Acylierungsmitteln funktionell äquivalent sind,· sind von M. Bpdansky et al_o, Synthesis, S. 435 (1972), und von M. Bodansky et al., Peptide Synthesis, Seiten 75 bis 135 (1966) (John Wiley & Sons, Inc., V.St.A.), beschriebene Vorzugsweise wird als Acylierungsmittel eine Verbindung der Formel

509826/0979

Il

CH₂-O-C-NH-CH₂-CH

⁰ S

I₂-CH-C-O-Ni J

Oh »

verwendet. Die Acylierung wird in Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, einem niederen Alkohol, Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther, Pyridin oder Wasser oder deren Gemisch, vorzugsweise einem Gemisch von Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 2 : 1 bei Temperaturen von -50 bis 50 C, vorzugsweise -20 bis 20 C, während eines Zeitraumes von 15 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 5 bis 15 Stunden, durchgeführt. In diesem Fall werden vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Mol, insbesondere 0,7 bis 1,2 MoljAcylierungsmittel pro Mol der Verbindung der allgemeinen Formel III verwendet. Sodann werden die Schutzgruppen in. der entstandenen Verbindung der allgemeinen Formel V in an sich bekannter ¥eise abgespalten. Wenn die Schutzgruppen beispielsweise Phthaloylgruppen darstellen, wird die Abspaltung' mit Hydrazin erreicht. Bei Verwendung von Cax"bumethoxy— oder Carbäthoxygruppen wird die Abspaltung mit Bariumhydroxid erreicht. Wenn die Schutzgruppen tert.-Butoxycarbonylgruppen bedeuten, wird die Abspaltung durch Behandeln mit Ameisensäure oder Trifluoressigsäure bewirkt» Trityl-Schutzgruppen werden · durch Behandeln mit JSssigsäure oder Trifluoressigsäure abgespalten. o—Nitrophenylsulfenylgruppen werden durch Behandeln mit Essigsäure oder Salzsäure abgespalten. Chloracetyl-Schutzgruppen worden durch Behandeln mit 3-Nitropyridin-2-thion abgespalten; vgl ο Ko Undheim et al_o , Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, Teil I, S. 829 (1973).

L -I

. 50 9 826/09 79

Vorzugsweise bedeuten in der Verbindung der allgemeinen Formel V die Reste Y₁ und Y Wasserstoffatome und die Reste Y und Y. Benzyloxycarbonylgruppenο Die Abspaltung dieser Schutzgruppen wird durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie Palladium, Platin, Rhodium oder Raney-Nickel, vorzugsweise mit einem Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator, bewirkt. Die Hydrogenolyse wird in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, einem niederen Alkohol, Dioxan oder Äthylenglykoldimethyläther, vorzugsweise in einem Gemisch gleicher Volumenteile Wasser und Methanol, in Gegenwart einer geringen Menge Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder Jodwasserstoffsäure, vorzugsweise Essigsäure, bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck durchgeführt.

Zur Herstellung der Salze der Verbindung der Formel I können anorganische Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Kohlensäure, oder organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Citronensäure, Mandelsäure, Weinsäure oder Ascorbinsäure, verwendet werden. Die Herstellung der Salze erfolgt in an sich bekannter Weise.

Zur Acylierung imd zum Schutz der Aminogruppen können auch andere leicht abspaltbare Schutzgruppen verwendet werden, wie sie in der Peptid-Chemie üblich sind; vgl« M, Bodansky et al., Peptide Synthesis, Seiten 21 bis *! 1 (1966) (John Wiley & Sons, Inc., VeSt.A, )j und A. Kapoor, Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd. 59 (1970), Seiten 1 bis 27„

^L 509826/0979 "*

Γ "1

Die Verbindung der Formel I ist ein wertvolles Antibiotikum mit hoher antibalcterxeller Aktivität insbesondere gegenüber Stämmen von Escherichia coli, die einen R-Faktor haben und die gegenüber bekannten Aminoglykosid-Antibiotika resistent sind.

In Tabelle I ist das antibakterielle Spektrum von Kanamycin A, Gentamycin C₁ , der Verbindung XK-62-2 und der Verbindung der Formel I gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien' angegeben. Die Mindestlxemmkonzentration -wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode bei einem pH-Wert von 8,0 bestimmt» Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Verbindung der . Formel I eine starke antibakterielle Aktivität insbesondere gegenüber Escherichia coli KY 8327 und 83*4-8 besitzt.

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Tabelle I

CD CO I¹O CO \ O CD *-4 «D

Mikroorgani smus

Pseudomonas aeruginosa BMH

Staphylococcus aureus ATCC 6538P

Bacillus subtilis

Nr. 10707

Proteus vulgaris

ATCC 6897

Shigella sonnei

ATCC 929Ο

Salmonella typhosa

ATCC 9992

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Escherichia coli

ATCC

Escherichia coli

KY 8327

Escherichia coli

KY 8348

Mindesthemmkonzentration, Y- /ml

Kanamycin A Gentamycin C₁ XK-62-2 Verbindung der Formel I

I et

0,13

0,004

0,16	0,033
0,16	0,033
0,081	0,016
0,042	0,016
0,16	0,034
1,04	2,08
0,041	1,04

0,52

0,008

0,044

0,033

0,008

0,004

0,016

1,04

2,08

0,016

0,004

0,065

ο,	033	245
?»	008	GO
ο,	008	CO ro
ο,	004	Q
ο,	016

ο,	004

Escherichia coli KY 8327 und KY 83^8 bilden intracellulär Gentamycin-adenyltransferase bzw. Gentamycinracetyltransferase Typ I. E, coli KY 8327 desaktiviert Kanamycin und die Gentainycine durch Adenylierung, während E, coli KY 83^8 die Gentamycine durch Acetylierung desaktiviert.

In Tabelle II ist das antibakterielle Spektrum der Verbindung der Formel I, von Kanamycin A, dem Gentamycin-Komplex (C₁, C₁ und C_?) und der Verbindung XK-62-2 angegeben. Die Mindesthemmkonzentration wurde nach der Agar-pVerdünnungsmethode bei einem pH-Wert von 7»2 bestimmt.

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Tabelle II

Mikroorgani smus Mindesthemmkonzentration, γ /ml

Kanamycin A

Gentamycin-Komplex

XK-62-2	Verbindung der Formel I, L-Form
0,1	0,1
<0,05	0,1
<0,05	0,1
0,4	0,4
0,4	0,4
0,4	. 0,4 V
12,5	0,2
3,12	0,2
12,5	0,1
0,4	0,2
0,78 1,56 100	1,56 3 12 ° Jt ¹^ j>»* cn 3,12(DO co ro CD

CD CD CD NJ CT)

O CO •*4 CO

Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus aureus Smith Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina Iutea ATCC 9341 Escherichia coli T-2 Escherichia coli T-5 Escherichia coli KY 8327 ¹' Escherichia coli KY 8321 ²' Escherichia coli KY 8348 ³' Escherichia coli KY 8349 ' Pseudomonas aeruginosa BmH Nr·

Pseudomonas aeruginosa KY 8510' Pseudomonas aeruginosa KY 8511

0,2 0,2 0,2 6,25 1,56 1,56 50 100

0,78 >100

12,5 100 100

^0,05

<0,05 0,2 0,4 0,4 12,5 6,25 3,12 0,2 0,4

3,12 50

Kikrοorganismus

Mindestheimnkonzentration, y-/ml

Kanamycin A	Gentamycin-Komplex	ΧΚ-62-2	Verbindung der Formel I, L-Form
12,5	0,4	0,78	0,78
>100	3,12	. 3,12	3,12
>1Ό0	50	100	12,5
.0,4	0,2	0,1.	0,2
6,25	1,56	0,78	3,12
3,12	0,78	0,78	3,12
0,78	0,78	0,4	0,78 ^
1,56	0,78	0,4	0,78

7) Pseudomonas aeruginosa KY 8512 '

8)

Pseudoir.onas aeruginosa KY 8516 '

Pseudomonas providencia sp_oi64 '

Klebsiella pneumonias WC. 8045 cn
O Protcus mirabilis 1287

⁰⁰ Proteus vulgaris 6897

rO ————— ——-**—-——

5 Proteus rettgeri KY 4288

⁰⁰ Proteus morganii KY 4298

¹⁰ Anmerkungen:

1) bildet Gentamycin-adenyltransferase

2) bildet Gentamycin-adenyltransferase und Neomycin-Kanamycin-phosphotransferase Typ II

3) bildet Gentamycin-acetyltransferase Typ I '

4) bildet Neomycin-Kanamycin-phosphotransferase Typ I

5) bildet Kanamycin-acetyltransferase

6) bildet Gentamycin-acetyltransf erase Typ I und Neomycin-Kanamycin-ph.osph.otransf erase Typ I

ro cn CO

7) bildet Neomycin-Kanamycin-phosphotransferase Typ I und Typ II und Streptomycin-phosphotransferaseoo

•8) bildet vermutlich Kanamycin-acetyltransferase 9) bildet Gentamycin-acetyltransferase Typ II

Die
/fenzyme werden intracellulär gebildet und mittels der Enzyme des-

aktivieren die Bakterien die Antibiotika.

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die Verbindung der Formel eine starke antibakterielle Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterien aufweist, die gegenüber Gentamycin-Antibiotika und der Verbindung XK-62-2, resistent sind, die Gentamycin-adenyltransferase und/oder Gentamycin-acetyltraiisferase Typ I und Typ II intracellulär bilden und hierdurch Gentamycin-Antibiotiund die Verbindung XK-62-2 desaktivieren.

Verschiedene Untersuchungen bei Infektionen durch Stämme der vorgenannten resistenten Bakterien haben ergeben, daß die Verbindung der Formel I in vivo die «-Hydroxy-gf'-aminobutyryl gruppe beibehält und eine wesentlich höhere antibakterielle Wirkung zeigt, als die Gentamycin-Antibiotika und die Verbindung XK-62-2«

Die Verbindung der Formel I eignet sich daher zur Bekämpfung bakterieller Infektionen, die von den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien hervorgerufen werden, einschließlich solcher Bakterien, die gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika resistent sind₀ Beispielsweise kann die Verbindung der Formel I zur Behandlung von Infektionen der Harnwege und der Atmungsorgane verwendet werden, die durch Staphylococcus aureus, Eschcrichia coil, Pseudomonas aeruginosa und Stämme der· Gattung Proteus verursacht werden,,

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Die akute Toxizität (LD ) der Verbindung der Formel I bei Mäusen beträgt bei intravenöser Verabfolgung 250 mg/kg, während die LDe₀ für die Verbindung XK-62-2 und den Gentamycin-Komplex 93 mg/kg bzw. 72 mg/kg beträgt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung,

Beispiel 1 Herstellung von 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 (Verbindung A)

2,778 g (6,0 niMol) der Verbindung XK-62-2 werden in 30 ml eines Gemisches gleicher Volumenteile Dimethylformamid und Wasser gelöst. Die Lösung wird innerhalb 2 Stunden bei -10 bis -5 C tropfenweise mit einer Lösung von 2,56 g (1,03 mMol) N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in 25 ml Dimethylformamid unter Rühren versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch 15 bis 18 Stunden bei.der gleichen Temperatur stehengelassen. Durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit einem Gemisch von Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1:1 und unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel wird die Gegenwart von nicht-umgesetztem XK-62-2 neben dem Hauptprodukt der Verbindung A (l? „-»Wert 0,86) festgestellt. Das Reaktionsgemische wird mit 30 ml Wasser verdünnt und auf eine mit 150 ml des ' Ionenaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüll- ■ te Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gegeben,, Die Säule •wird mit 200 ml Wasser und sodann mit 300 ml 0,05 η wäßriger Ammoniaklösung, 300 ml 0,10 η wäßriger Ammoniaklösung und

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schließlich mit 0,15 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Fraktionen mit der Verbindung A als einziger Komponente werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Ausbeute 1,82 g (47,2 °/o d. Th.) der Verbindung A als farbloser, amorpher Feststoff. Die Verbindung kann, unmittelbar in die nächste Stufe eingesetzt werden. Die Verbindung kann auch durch Säulenchromatographie an dem vorgenannten Ionenaustauscher weiter gereinigt werden, F. 107 bis 110 C. fyJJ* = +87,7 (c = 0,10, Wasser).

IR-Absorptionsspektrum (KBr-Preßling): 3700-3100, 2930, 1702, 1530, 1451, 1310, 1255, 1141, 1053, 10.21, 96Ό, 735, 697, 6o4 cm"¹

NMR

!-Spektrum (in Methanol-d^) £ (in ppm aus TMS): 1,13 (3H, Singulett), 2,42 (3H₁ Singulett), 2,60 (3H, Singulett), 2,88 (211, Singulett), 5,33 bis 4,90 (Multiplett überlappend das Signal von OH), 7,43 (5H, Singulett).

^C28^H47^N5°9 ·

	C	08	H	06	N	06
ber. j	53,	19	8,	91	11,	02
gef. :	53,	7,	10,

Beispiel 2

Herstellung von 1-N-/L-(-)-iX'-IIydroxy-₍|^/li-carbobcnzoxy-aminobutyryl7-2'-N-carbobenzoxy-XK-62-2 (Verbindung B)

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643 mg (1,Ο mMol) 2* ~N-Carbobeiizoxy-XK-62-2-dihydrat werden in 20 ml eines Gemisches gleicher Volumenteile Tetrahydrofuran und Wasser gelöst. Die Lösung wird bei 0 bis -5 C mit einer Lösung von 385 mg (1,1 mMol) L-(-)-ßf-Hydroxy-!f-carbobenzoxyaminobuttersäure-N-hydroxysuccinimidester in 10 ml Tetrahydrofuran tropfenweise und unter Rühren versetzt. Die Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters ist in Journal of Antibiotics, Bd. 25 (1972), Seiten- 695 bis 708, die Herstellung der L-(-)-iX-Hydroxy-^*-aminobuttersäure in Tetrahedron Letters, 1971» Seiten 2625 bis 2628 beschrieben» Die Zugabe ist innerhalb 1 Stunde beendet. Sodann wird das Gemisch 15 bis 18 Stunden stehengelassen» Die Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter den Bedingungen des Beispiels 1 zeigt die Gegenwart einer geringen Menge von Nebenprodukten und nicht-umgesetzter Verbindung A neben dem Hauptprodukt B (R_f-¥ert 0,91) an. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden 1,05 g eines gelblich gefärbten Rückstands erhalten. Dieser Rückstand enthält N-Hydroxy-' succinimid sowie L- (-·)-(X-Hydroxy-^-carbobenzoxyaminobuttersäure sowie die vorgenannten Komponenten. Der Rückstand kann jedoch ohne weitere Reinigung in die nächste Reaktion eingesetzt werden. Gegebenenfalls kann die Verbindung B durch Chromatographie an einem Ionenaustauscher gemäß Beispiel 1 isoliert und gereinigt werden.

Beispiel 3

Herstellung von 1 -N~/L-(-)-Cv~IIydroxy-r-aminobutyryl7-XK-62-2 (Vorbindung der Formel i)

L j

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Das in Beispiel 2 erhaltene Rohprodukt, das die Verbindung B als Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml 20prozentigem wäßrigem Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 2 ml Essigsäure versetzt und in Gegenwart von 150 mg 5p*Ozentigem Palladiumauf-Kohlenstoff-Katalysator bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 6 Stunden hydriert. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wird die Gegenwart der Verbindung der Formel I (R„-Wert Ο,4θ) als Hauptbestandteil, eine geringe Menge der Verbindung XK-62-2 und einer Stellungsisomerenverbindung der Formel I nachgewiesen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung auf eine mit 80 ml des Ionenaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm gegeben. Die Säule wird mit 150 nil Wasser ausgewaschen und sodann mit 0,2 η wäßriger Ammoniaklösung eluierto Das Eluat wird eingedampft. Es werden 63 mg der Vei"bindung XK-62-2 erhalten. Sodann wird mit 0,4 11 wäßriger Ammoniaklösung eluiert_e Das Eluat wird dünnschichtclrromatographisch analysierte Das Eluat mit der Verbindung der Formel I als einziger Komponente wird in Fraktionen entnommen und unter vermindertem Druck eingedampfte Ausbeute 459 mg (64 ⁰Jo d. Th. ) der Verbindung der Formel I als farbloser, amorpher Feststoff^ F. 120 bis 124°C. jpU^ = +99,0° (c = 0,10, Wasser) _o

IR-Absorptionsspoktrum (KBr-Preßling) : 3700-3100, 2^cjh0_t 164O, 1565, 1480, 1385, 1340, 1282, 1111, 1054, 1022, 973, 8I6, 7ΟΟ-6ΟΟ cm"¹ (Fig. 1)o

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NMR-Spektrum-(in Deuteriumoxid) δ (in ppm aus DSS):

1,20 (3H, Singulett), 2,36 (3H, Singulett), 2,52 (3H, Singu-

lett) 5,14 (1H, Dublett, J=4,0 Hz), 5,22 (IH, Düblett, J = 4,0 Hz) (Fig.2).

C H-N C₂₄H₄₈N₆O₉.1 /2.H₂CO₃; ber. : 49, 39 8,29 14,11

gef.: 48,96 8,37 13,96.

Beispiel 4

Herstellung von 1-N-/L-(-)-a-Hydroxy-y-aminobutyryl7-XK-62-2 (Verbindung der Formel I)

113 mg (0,97 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 242 mg (0,97 mMol) L-(-)-a-Hydroxy-y-phthalimidobuttersäure (vgl. The Journal of Antibiotics, Bd. XXV (1972), Seiten 741 bis 742) werden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die- Lösung wird unter Eiskühlung und Rühren mit 200 mg (0,97 -mMol) Dicyclohexylcarbodiirnid versetzt. Nach 1stündiger Umsetzung wird der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat zu einer Lösung von 482 mg (0,75 mMol) 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2-dihydrat in 10 ml 50prozentigem \v^räßrigem Tetrahydrofuran gegeben. Die. Zugabe erfolgt innerhalb 50 Minuten. Das Gemisch wird 15 bis 18 Stunden stehengelassen, sodann unter vermindertem Druck . konzentriert und der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Der Rückstand wird in 10"ml 50prozentigem wäßri-. gern Äthanol gelöst, das 10 % Hydrazin enthält. Die Lösung wird 3 Stunden auf 60⁰C erwärmt, um die'Phthaloylgruppe abzuspalten. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird sodann mit 5 ml

Esnigsüure, 10 ml Äthanol und 200 mg 5prozentigem Palladium- J · 509826/0979

auf-Kohlenstoff-Katalysator versetzt und bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck hydriert, um die Carbobenzoxygruppe abzuspalten. Hierauf wird der Katalysator abfiltriert und das FiI-tfat gemäß Beispiel 3 aufgearbeitet und an einer mit 200 ml des Ionenaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllten Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm chromatographiert. Das Eluat wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel untersucht. Die eluierten Fraktionen, die die Verbindung der Formel I als einzige Komponente enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck' zur Trockene eingedampft. Ausbeute 226 mg (42,1 % d. Th.) der Verbindung der Formel I als farbloses Produkt.

Beispiel 5

Herstellung von 1-N-JlL-(-)-a-Hydroxy-y-aminobutyryl/-XK-62-2 (Verbindung der Formel I)

2,778 g (6,0 mMcl) der Verbindung XK-62-2 werden in j5C ml eines. Gemisches von Vasser, Pyridin und Triethylamin (10 : 10 : 1) gelöst. Das Gemisch wird bei einer Temperatur von -10 bis -5⁰C innerhalb 2 Stunden tropfenweise mit einer Lösung von 1,04 g (7,2 mMol) tert.-Butyloxycarbonylazid in 10 ml 50prozentigem wäßrigem Pyridin unter Rühren versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch 15 bis 18 Stunden bei der gleichen Temperatur stehengelassen. Hierauf' wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird ein gelblicher Rückstand erhalten, der als Hauptbestandteil 2'-N-tert.-Butyloxycarbonyl-XK-62-2 enthält. Der Rückstand wird in 30 ml 50prozentigern wäßrigem Dimethylformamid gelör/t.

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^Γ - 23 -

Die Lösung wird innerhalb 1 Stunde bei einer Temperatur von -10 bis -5⁰C tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 2,52 g (7,2 mMol) L-(-)-a-Hydroxy-y-carbobenzoxyaminobuttersäure-N-hydroxysuccinimidester versetzt.und danach 15 bis 18 Stunden stehengelassen. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter,den Bedingungen, gemäß Beispiel 1 wird in Gegenwart von 1-N-/L-(-)-a-Hydroxy-y-carbobenzoxyaminobutyryl/-2'-N-tert.-butyloxycarbonyl-XK-62-2 als Hauptbestandteil und eine geringe Menge der Stellungsisomerenverbindung und nicht umgesetztem XK-62-2 nachgewiesen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rück- ■ stand wird in einem Geraisch von 5 ml Trifluoressigsäure und 7 ml Methanol gelöst. Die Losung wird sodann in Gegenwart von 160 mg 5proζentigem Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator · 3 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck hydriert, um die tert,-Butyloxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppe abzuspalten. Durch'Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wird die Gegenwart der Verbindung der Formel I als Hauptbestandteil, eine geringe Menge:der Stellungsisomerenverbindung und von nicht umgesetztem λΚ-62-2 'nachgewiesen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst und die Lösung gemäß Beispiel 3 behandelt, das heißt, auf eine mit 150 ml des Ionenaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gegeben. Das Eluat v:ird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 untersucht. Diejenigen Fraktionen des Eluats, die die Verbindung dor Formel I als einci- _j

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ge Komponente enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Ausbeute 1,95 g (45,3 % d. Th.) farblose Verbindung. Die Verbindung ist in jeder Hinsicht identisch mit der in Beispiel 3 erhaltenen Verbindung .

Beispiel 6 Herstellung des Monosulfats der Verbindung der Formel I

7,06 g (10 mMol) der Verbindung der Formel I werden in 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 0,9Sg (10 mMol) Schwefelsäure in 5,0 ml Wasser unter Kühlung versetzt. Nach 30 Minuten wird die Lösung mit eiskaltem Äthanol versetzt, bis keine Fällung mehr erfolgt. Die weiße Fällung wird abfiltriert. Es wird das Monqsulfat der Verbindung der Formel I erhalten.

^L 50 98 2 67 09 79

Claims

- 25 Pat enta.ns-p.ruch

Verfahren zur Herstellung von 1-N-/L-(-)-a-Hydroxy-y-aminot>utyryl/-XK-62-2 der Formel

NHCH-

. CH₃ OH

dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung XK-62-2 der Formel

NHCH

KO

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••26-

mit einem Acylierungsmittel oder einem Aminoschutzgruppen-■ reagens in an sich bekannter Weise umsetzt, hierdurch eine abspaltbare Schutzgruppe an die Aminogruppe in der 2'-Stellung einführt, und sodann die Aminogruppe in der 1-Stellung mit einem funktionellen Derivat einer a-Hydroxy-y-aminobuttersäure der allgemeinen Formel IV

OH O

N-CH₂- CH₂ -CH-C¹ -Z

in der Y-, ein Wasserstoff atom und Y^ die Gruppe

p CH₃ O O

-CH₂-O-C- , CH₃-C -O-C- , CH₃-O-C-

(IV)

C₂H₅-O-C-

CH₃

I?

. ,' R4-CH₂-C- oder

bedeutet, in der R^ und R« gleich oder verschieden sind und ein -.Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Hydroxyl- oder Nitrogruppe oder ein^Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellten und H< ein Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom bedeutet und Z eine Gruppe der Formel

Il

-0-N

-O-

-Ο

-0

ι- KO.

oder

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oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt, acyliert und hierauf die Schutzgruppen in an sich "bekannter Yeise abspaltet.

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