DE2509885A1

DE2509885A1 - 1-n-(alpha-hydroxy-beta-aminopropionyl)-xk-62-2, verfahren zu seiner herstellung und arzneipraeparate

Info

Publication number: DE2509885A1
Application number: DE19752509885
Authority: DE
Inventors: Yasuki Mori; Shinji Tomioka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1974-03-07
Filing date: 1975-03-06
Publication date: 1975-09-11
Also published as: AT340588B; GB1500218A; JPS50117748A; FR2263251B1; DE2509885B2; DK88475A; NO140428C; JPS573679B2; NO140428B; ZA751414B; ATA173875A; NL7502740A; FR2263251A1; PH13670A; NO750720L; CH613710A5; ES435375A1; CA1046057A; DE2509885C3; SE416208B

Description

" 1-N-(a-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneipräparate "

Priorität: 7. 3. 1974, Japan, Nr. 25 753/74

' Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Verbindung der Erfindung ist ein Derivat des Antibiotikums XK-62-2, das in der DT-OS 2 326 781 beschrieben ist. Die Verbindung der Erfindung kann in der D-, L- oder DL-Form vorliegen.

In der genannten DT-OS ist ausgeführt, daß sich das Antibiotikum XK-62-2 durch Züchtung von Aktinomyceten, wie Micromonospora sagaraiensis, Microinonospora ediinospora und MicrQmonospora purpurea nach der Züchtung von Actinomyceten üblichen Verfahren herstellen läßt. Insbesondere werden Stämme der vorgenannten Mikroorganismen, z.B. Micromonospora sagamiensis ATCC 21826, ATCC 21827, ATCC" 21803 und ATCC 21949 in ein flüssiges Nähr-

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medium inoculiert, das eine verwerfbare Kohlenstoffquelle, wie Zucker, Kohlenwasserstoffe, Alkohole oder organische Säuren, anorganische oder organische Stickstoffquellen sowie anorgani-

bei 25 bis 4D°C sehe. Salze und wachstumsfördernde Substanzen enthält, und / 2"bis 12 Tage gezüchtet, Ms sich in der Züchtungsflüssigkeit eine beachtliche antibakterielle Aktivität nachweisen läßt. Die Isolierung und Reinigung von XK-62-2 wird durch kombinierte Adsorptions- und Desorptionsschritte unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen und Aktivkohle sowie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Cellulose, Sephadex, Aluminiumoxid und Kieselgel durchgeführt. Auf diese Weise läßt sich XK-62-2 in Form eines Salzes oder der freien Base erhalten.

XK-62-2 ist ein weißes Pulver mit basischer Reaktion. Die Summenformel lautet CpqH^v^]N₁-Oy. Das Molekulargewicht beträgt 463. Die Verbindung löst sich gut in Wasser und Methanol, ist schwach löslich in Äthanol und Aceton und unlöslich in Chloroform, Benzol, Essigsäureäthylester und η-Hexan. Es weist folgende Strukturformel auf:
6¹I NHCIU

NH

2 2

(II)

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Erf indungsgemäß lassen sich das neue Derivat von XK-62-2 oder dessen Salze durch Einführung einer a-Hydroxy-ß-aiainopropionylgruppe in die am 1-Kohlenstoffatom von XK-62-2 gebundene Aminogruppe herstellen,

Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird XK-62-2 der Formel II mit einem zur Einführung einer a-Hydroxyß-substituierten-aminopropionylgruppe geeigneten Acylierungsmittel acyliert. Hierauf wird von dem erhaltenen Zwischenprodukt die Schutzgruppe in an sich bekannter Weise abgespalten. Gegebenenfalls kann das erhaltene 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 nach üblichen Verfahren zu entsprechenden Salzen umgesetzt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, nach der man die Verbindung der Erfindung in erhöhten Ausbeuten erhält, werden die an der 2^f- und/oder 6'-Stellung von XK-62-2 befindlichen Aminogruppen vor der Acylierungsreaktion zur Einführung einer a-Hydroxy-ß-substituierten-aminopropionylgruppe mit einem geeigneten Schutzgruppenreagens umgesetzt.

Das erfindungsgemäße Derivat von XK-62-2 wirkt stark antibakteriell gegen eine Reihe von gram-positiven und gram-negativen Bakterien. Insbesondere weist es eine starke antibakterielle Aktivität gegen Bakterien auf, die gegenüber bekannten Aminoglykosid-Antibiotika, einschließlich XK-62-2, resistent sind.

Demzufolge eignet sich das Antibiotikum der Erfindung zur Reini-

_Lgung und Desinfektion von Laboratoriurasglasgeräten und chirur- _i

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gischen Instrumenten. Außerdem kann es in medizinischen Seifen zur Reinigung und Desinfektion von Krankenhausräumen, einschließlich Küchen und Vorratsräumen, verwendet werden. Außerdem eignet sich das Antibiotikum der Erfindung zur Behandlung von verschiedenen Infektionen, z.B. des Harn- oder Atmungstrakts, die durch entzündungserregende Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Proteus, hervorgerufen werden.

Im folgenden wird die Erfindung näher erläutert.

I· Acylierung von XK-62-2

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird XK-62-2 in Form der freien Base mit einem Acylierungsmittel umgesetzt, das heißt 'mit einer Verbindung, die zur Einführung einer cc-Hydroxy-ßsubstituierten-aminopropionylgruppe geeignet ist, wobei mindestens ein Wasserstoffatom der ß-Aminogruppe durch eine Schutzggruppe substituiert ist. Die Umsetzung wird in einem Lösungsmittel durchgeführt. Man erhält ein Zwischenprodukt, bei dem eines der Wasserstoffatome der in der 1-Stellung von XK-62-2 befindlichen Aminogruppe durch die Acylgruppe ersetzt ist.

Als Acylierungsmittel können a-Hydroxy-ß-substituierte-aminopropionsäure und deren Derivate verwendet werden,, soweit sie acylierend wirken. Das Acylierungsmittel kann in D-, L·- oder DL*Form vorliegen.

Die Umsetzung' wird' je nach dem Acylierungsmittel in einem oder mehreren Lösungsmitteln der Gruppe Tetrahydrofuran, Dimethyl-

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formamid, Dimethylacetamid, niedere Alkohole, Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther, Pyridin und Wasser durchgeführt. Gegebenenfalls wird ein dehydratisierend und/oder kondensierend wirkendes Mittel, wie Dicyclohexylcarbodiimid, zugesetzt. Die Reaktionstemperatur beträgt -50 bis 50°C, vorzugsweise -20 bis 20⁰C,

Im allgemeinen werden 0,4 bis 2,5 Mol, vorzugsweise 0,7 bis 1,5 Mol Acylierungsmittel pro 1 Mol XK-62-2 verwendet. Bei Einsatz von größeren Mengen an Acylierungsmittel, beispielsweise 5 Mol, oder bei höheren Reaktionstemperaturen, beispielsweise 100⁰C, läuft die Reaktion ebenfalls ab. Jedoch ist in diesen Fällen die selektive Einführung der Acylgruppe in die gewünschte Stellung stark vermindert bzw. das Acylierungsmittel zersetzt sich. Infolgedessen wird das Zwischenprodukt nur in verminderter Ausbeute erhalten.

Als Schutzgruppe am Acylierungsmittel können alle leicht entfernbaren Schutzgruppen verwendet werden, die üblicherweise zur Peptidsynthese eingesetzt werden. Derartige Schutzgruppen und die entsprechenden Reagentien, die zur Einführung dieser Schutzgruppen geeignet sind, wurden von M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., V.St.A. (1966), S. 21 bis 41 und A. Kapoor, Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd. 59 (1970), S. 1 bis 27, beschrieben. Beispiele für bevorzugte Schutzgruppen und die entsprechenden Reagentien sind in Tabelle I aufgeführt.

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Tabelle I

S chutzgruppe Schutzgruppenreagens.

¹VoV-CH₂-O-C-

-¹^T O/-c^-o-c-o-N

Il -CH₂-O-C-X

CH, 0 I ^J Il H₃C-C-O-C-CH, O

H-.C-C-O-C-N-, CH,

0 Il CH₃-O-C-CH₃-O-C-X

Il

C₂H₅-O-C-

Ii C₂H-O-C-X

Il

R₃-CH₂-C-

Ii R. — CH«-*C—X

O ti R,—CH--C-OH

NO.

C₂H₅-O-C-N^TO 0

TWWTfTlTWl

In Tabelle I haben PL, und R₂ gleiche oder verschiedene. Bedeutung und sind Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatome, Hydroxyl- oder Nitrogruppen oder Alkyl- oder Alkoxyreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. fU bedeutet ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und X ein Chlor-, Brom- oder Jodatom.

Als Beispiele für Derivate von a-Hydroxy-ß-substituierter Aminopropionsäure, die acylierend wirken und als Acylierungsmittel verwendet werden können, sind. Säurehalogenide,' Säureazide, gemischte Säureanhydride und reaktive Ester zu nennen. Diese Derivate werden im allgemeinen zur Synthese von Peptiden verwendet. Spezielle Beispiele wurden von M. Bodanszky et al., Synthesis, (1972), S. 453, und M. Bodanszky et al, Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., V.St.A., (1966) S. 75 bis 135,angegeben.

Bevorzugte Derivate sind solche, bei denen die Hydroxylgruppe der Carboxylgruppe der a-Hydroxy-ß-substituierten-aminopropionsäure durch eine der folgenden Gruppen ersetzt ist.

- O-N

-O I

"? I ~^C1' "^Br' ~ ^J> "^N3 ^{oder R}4^0C00~

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Dabei bedeutet R^ einen Alkylrest mit 1 bis·7 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe» Besonders bevorzugt sind Derivate, bei denen die Hydroxylgruppe durch

O ·

—O—N
O

ersetzt ist.

Unter den vorgeschlagenen Acylierungsmitteln wird der N-Hydroxysuccinimidester von a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure der Formel

o . oh o:' η ι H

besonders bevorzugt.

Dieses Acylierungsmittel wird durch Umsetzung von a-Hydroxy-ßcarbobenzoxyaminopropionsäure mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines dehydratisieren und kondensierend wirkenden Mittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, hergestellt. Das auf diese Weise hergestellte Acylierungsmittel kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden und anschließend mit XK-62-2 umgesetzt werden, oder ohne vorherige Isolierung direkt mit XK-62-2 zur Reaktion gebracht werden.

Es können auch Derivate von a-Hydroxy-ß-substituierter-aminopropionsäure verwendet werden, bei denen die Hydroxylfunktion der Carboxylgruppe durch andere, hier nicht ausdrücklich beschriebene Gruppen ersetzt ist. Diese Derivate können auf üb- ,

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liehe Weise hergestellt werden.

Das durch die vorbeschriebene Umsetzung erhaltene Zwischenprodukt kann nach Isolierung aus dem Reaktionsgemisch und Reinigung als Ausgangsmaterial für die nachfolgende Umsetzung verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch nach beendeter Umsetzung das Reaktionsgemisch direkt als Ausgangsmaterial ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die.letztgenannte Ausführungsform ist besonders vorteilhaft-, da dadurch das Verfahren vereinfacht und die Ausbeute vergrößert wird.

Gegebenenfalls kann das Zwischenprodukt nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden, beispielsweise säulenchromatographisch unter Verwendung von Adsorptionsmitteln, wie Ionenaustauscherharzen, Kieselgel, Aluminiumoxid oder Cellulose oder dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Kieselgel, Aluminiumoxid oder Cellulose.

II. Abspaltung der Schutzgruppe

Die an der Aminogruppe des gemäß Stufe I hergestellten Zwischenprodukts vorhandene Schutzgruppe wird anschließend abgespalten, wodurch man 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 erhält.

Die Abspaltung der Schutzgruppe kann nach üblichen Verfahren vorgenommen werden. Beispielsweise wird die Phthaloylgruppe als Schutzgruppe mit Hydrazin abgespalten. Die Carbomethoxy- oder Carboäthoxygruppe wird mit Bariumhydroxid abgespalten. Die tert.-Butoxycarbonylgruppe wird mit Ameisensäure oder Trifluor-

l_ essigsäure, die Tritylgruppe mit Essigsäure oder Trifluoressig-_I

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säure, die o-Nitrophenylsulfinylgruppe mit Essigsäure oder Salz säure und die Chloracetylgruppe mit 3-Nitropyridin-2-thion abgespalten; vgl. K. Undheim et al., Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, Teil I, S. 829 (1973).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schutzgruppe des Zwischenprodukts eine Benzyloxycarbonylgruppe. Die Abspaltung dieser Schutzgruppe wird durch Hydrierung in Gegenwart von Palladium^ Platin, Rhodium, oder Raney-Nickel, vorzugsweise Palladium-auf-Aktivkohle, in Wasser, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, einem niederen Alkohol, Dioxan, Ithylenglykoldimethyläther und/oder Pyridin vorzugsweise in einem Gemisch aus Wasser und Methanol (1 : 1) in Gegenwart einer geringen Menge Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder Jodwasserstoff säure, vorzugsweise Essigsäure, bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck durchgeführt.

Das auf diese Weise hergestellte 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 wird in an sich bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, wie Ionenaustauscherharzen, Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose oder Sephadex, oder durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, Aluminiumoxid oder Cellulose.

Gegebenenfalls kann 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 in an sirh bekannter Weise

/En Salze mit Säuren, das heißt ein-, zwei-, drei-, vier- oder

überführt werden
fünfbasige Salze/. Dazu wird ein Mol der Verbindung der Erfindung

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-11 - ■ ^π

mit 1 bis 5 Mol einer Säure, insbesondere einer nicht-toxischen pharmakologisch verträglichen Säure, umgesetzt. Dazu können anorganische Säuren, wie Salzsäure.., Bromwasserstoff säure, Jodwasserstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Kohlensäure, oder organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Mandelsäure, Weinsäure oder Ascorbinsäure, verwendet werden.

Man erhält die Verbindung der Erfindung in erhöhter Ausbeute, wenn man nach folgender bevorzugter Ausführungsform bestimmte Aminogruppen von XK-62-2 blockiert.

Wie bereits erwähnt, wird die. Verbindung der Erfindung hergestellt, indem man in die in der 1-Stellung von XK-62-2 befindliche Aminogruppe, die a-Hydroxy-ß-aminopropionylgruppe einführt. Es wurde festgestellt, daß unter den Aminogruppen von XK-62-2 die in der 2-Stellung stehende reaktiver als die in der 1-Stellung stehende ist. Demgemäß wird die in der 2-Stellung befindliche Aminogruppe vor der Acylierungsreaktion zur Einführung der a-Hydroxy-ß-aminopropionylgruppe mit einer Schutzgruppe versehen. Ferner wurde festgestellt, daß die Aminogruppe in der 3-Stellung weniger reaktiv als die Aminogruppe in

-- deren

der 1-Stellung ist und daß / Reaktivität noch abnimmt, wenn . das Wasserstoffatom der in der 6'-Stellung befindlichen Aminogruppe durch eine Schutzgruppe ersetzt wird. Schließlich wurde festgestellt,daß die in der 3"-Stellung stehende Aminogruppe weniger reaktiv als die Aminogruppe in der 1-Stellung ist. Demgemäß werden vorzugsweise vor der Acylierungsreaktion die

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Aminogruppen in der 2ΐ- und 6'-Stellung mit Schutzgruppen versehen.

Wird in der Praxis versucht, die Aminogruppe in der 2'-Stellung zu schützen, so erhält man ein Gemisch aus Verbindungen, die entweder in der 2'- oder 6'-Stellung oder in beiden Stellungen eine Aminoschutzgruppe tragen.

A. Schutz der Aminogruppen in der 2'- und/oder 6'-Stellung XK-62-2 wird mit einem Aminoschutzgruppenreagens in einem geeigneten Lösungsmittel zu mindestens einer der folgenden Verbindungen umgesetzt:

Verbindung, bei der das an das Stickstoffatom der Methylaminogruppe gebundene Wasserstoffatom in der 6'-Stellung von XK-62-2 ersetzt ist (Zwischenprodukt II-A); eine Verbindung, bei der mindestens eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe in der 2'-Stellung von XK-62-2 ersetzt ist (Zwischenprodukt II-B); und eine Verbindung, bei der das an das Stickstoffatom der ,_; Methylaminogruppe gebundene Wasserstoffatom in der 6'-Stellung und mindestens eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe in der 2'-Stellung ersetzt ist (Zwischenprodukt H-C). Im allgemeinen werden diese Zwischenprodukte als Gemisch erhalten.

Die Umsetzung von XK-62-2 mit dem Aminoschutzgruppenreagens wird unter üblichen Bedingungen, z.B. unter den vorbeschriebenen Bedingungen, durchgeführt. Im allgemeinen werden 0,5 bis 4,5 Mol des Schutzgruppenreagens pro 1 Mol XK-62-2 eingesetzt. Die Reaktion wird bei Temperaturen von -50 bis 50⁰C durchgeführt. _|

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Γ "I

In diesem Fall ist es nicht wünschenswert, eine größere Menge an Schutzgruppenreagens zu verwenden, oder die Umsetzung bei erhöhten Temperaturen durchzuführen, da dabei die Schutzgruppe auch in die Aminogruppe in der 1-Stellung eingeführt wurde. Um den ausschließlichen selektiven Schutz der Aminogruppen in der 2'- und/oder 6'-Stellung zu erreichen, werden vorzugsweise 0,7 Ms 2,6 Mol Schutzgruppenreagens pro 1 Mol XK-.62-2 verwendet, wobei die Reaktionstemperatur bei -20 bis 20°C liegt.

Als Lösungsmittel werden dabei Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, niedere Alkohole, Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther, Pyridin oder Wasser oder Gemische derselben verwendet.

Allgemein ausgedrückt, können als Aminoschutzgruppenreagentien die in der Peptidsynthese verwendeten Verbindungen eingesetzt werden, mit denen sich leicht entfernbare Schutzgruppen einführen lassen. Bevorzugte Schutzgruppenreagentien sind in vorstehender Tabelle I angegeben.

Die Zwischenprodukte H-A, H-B und H-C können ohne weitere Isolierung und Reinigung direkt eingesetzt werden. Gegebenenfalls können diese Zwischenprodukte jedoch auch nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden.

B. Acylierung der in 1-Stellung stehenden Aminogruppe Mindestens eines der gemäß Stufe A. erhaltenen Zwischenprodukte H-A, H-B und H-C wird mit .einem Acylierungsmittel umgesetzt, das heißt mit oc-Hydroxy-ß-substituierter-aminopropionsäure · _j

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oder einem Derivat davon, das zur Acylierung geeignet ist. Die Umsetzung wird in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Man erhält mindestens eines der folgenden Zwischenprodukte: Zwischenprodukt HA, bei dem ein Wasserstoffatom der in 1-Stellung stehenden Aminogruppe des Zwischenprodukts HA durch eine α-Hydroxy-ß-substituierte—aminoprppionylgruppe ersetzt ist, ein Zwischenprodukt IHB, bei dem ein Wasserstoff atom der in 1-Stellung stehenden Aminogruppe des Zwischenprodukts HB durch eine a-Hydroxy-ß-substituierte-aminopropionylgruppe ersetzt ist und ein Zwischenprodukt HIC, bei dem ein Wasserstoffatom der in 1-Stellung stehenden Aminogruppe des Zwischenprodukts HC durch eine a-Hydroxy-ß-substituierte-amiriopropionylgruppe ersetzt ist.

Diese Acylierung sowie die Isolierung der Zwischenprodukte IHA, IHB und IHC kann auf die gleiche l/eise durchgeführt werden, wie es oben bei der Acylierungsstufe I für XK-62-2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß pro 1 Mol der Verbindung HA, HB und HC 0,5 bis 1,5 Mol , vorzugsweise 0,7 bis 1,2 MoI_-,

des Acylierungsmittels verwendet werden. Bei einer größeren Menge Acylierungsmittel, beispielsweise 3 Mol, oder bei Durchführung der Reaktion bei höheren Temperaturen läuft die Reaktion zwar ab, aber die Selektivität, mit der eine a-Hydroxy-ßsubstituierte-aminopropionylgruppe in die entsprechende Stellung eingeführt wird, nimmt ab, oder das Acylierungsmittel wird zersetzt. Infolgedessen nimmt die Ausbeute an den Zwischenprodukten IHA, HIB und IHC ab.

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C. Abspaltung; der Schutzpruppen

Die Abspaltung der Schutzgruppen von den auf diese Weise hergestellten Verbindungen IIIA, IHB und IHG, die zur Bildung von 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 führt, wird auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Ferner wird auch die Umwandlung der dabei erhaltenen Verbindungen in die entsprechenden Salze nach üblichen Verfahren durchgeführt.

Die durch Abspaltung der Schutzgruppen von den Zwischenverbindungen erhaltenen Produkte weisen in Bezug auf NMR-Spektrum, IR-Spektruia, Schmelzpunkt., spezifische Drehung, Elementarana- . lysis αϊ*! Mindesthemmkonzentration (MIC) gegenüber verschiedenen Bakterien die gleichen Eigenschaften auf. Auf Grund dieser Daten, werden die Produkte als i-N-(ct-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 identifiziert.

1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 ist ein wertvolles

Antibiotikum mit hoher antibakterieller Aktivität, insbesondere gegenüber Stämmen von Escherichia coli, die einen R-Faktor aufweisen, und die gegenüber bekannten Aminoglykosid-Antibiotika resistent sind.

In Tabelle II ist das antibakterielle Spektrum von Kanamycin A, Gentamycin C^_&, XK-62-2 sowie der D-, L- und DL-Formen von 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien angegeben. Die Mindesthemmkonzentration wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode bei einem pH-Wert von 8,0 bestimmt. Aus Tabelle II ist er-

L J

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• - 16 -

sichtlich, daß die Verbindung der Erfindung eine starke antibakterielle Aktivität insbesondere gegenüber Escherichia coli KY 8327 und 8348 besitzt.

5 0.983770967

Tabelle II
Mindesthemmkonzentration (MIC), y/ml

- 17 -

1-N-(ct-Hydroxy-3-aminopropionyl)-XK-62-2

Mikroorganismus

Kanamycin A	Gentamicin C,	XK-62-2	D-F orm	L-Form	DL- Form	ro
5₇2	0.13	. 0_; 52	2,08	.1^04	1,04	CD ■CO
0_;021	0,004	.0,008	0_f004	0,004	0.065 .	OO
0,021	0_;004	0_;004	0,004	0_?004	0,008	OO cn
0,16	0,033	0_r033.	0,033	0_r033	0,033,
• .0,16	0,033"	0,033	0,008 ·	0_?008	0_;016" .
0,08	0,016	• 0,008	0_;004 '	0,004	0.004
0.042 t	0_;016	.0,004	0_;004	0,004	0_r033
0^16 .	0,033	0_f016	0_;004	• 0.004	0_r003
l_;04	2,08	1,04 t	0_;004	V 0_;004	0,004

0,041	1,04	^Jl,04	0_;004 ·	0_?004	0,004

'£seudomonas aeruginosa BMH 1

Staphylococcus aureus ATCC 6538P

Bacillus subtilis . · No. 10707

Proteus vulgaris

ATCC 6897

Shigella sonnei

ATCC 9290

Salmonella typhosa

ATCC 9992

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Escherichia coli ATCC~2"6

Escherichia coli KY 8327

Escherichia coli ^: KY~83T8

,_ · 250988b _π

¹ ' - 18 -

Escherichia coli KY 8327 und KY 8348 bilden· intracellulär
Gentamycin-Adenyltransferase bzw. Gentarnycin-Acetyltransferase Type I. E. coli 8327 inaktiviert Kanamycine und Gentamycine
durch Adenylierung, während E. coli KY 8348 durch Acetylierung ' desaktiviert.

In Tabelle III ist das antibakterielle Spektrum der Verbindung der Erfindung (D-, L- und DL-Form),von Kanamycin A, Gentamycin C-Komplex (C₁, C_1& und C^) und XK-62-2 angegeben. Die Mindestheminkonzentration wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode bei
einem pH-Wert von 7,2 bestimmt.

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Tabelle III

Mindesthemmkonzentration, y/ml

Mikroorganismus

Kanamycin A

Gentam.ycin C-

Komplex (C₁, C_la.und C₂) XK-62-2

1-N-(a-Hyäroxy-ß-amihopropionyl)-XK-62-2

D-Form L- Form DL-Forxn

■ Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus aureus Smith subtilis ATCC 6633

Sarcina lutea ATCC 9341
Escherichia coli T-2
Escherichia coli T-5

Escherichia coli KY 8327¹

Escherichia coli KY 8321² Escherichia coli KY 8348³ Escherichia coli KY 8349⁴ Pseudomonas aeruginosa BMH 1 Pseudomonas aeruginosa KY 8510* Pseudomonas aeruginosa KY 8511

0_;2 0,2 0,2 6,25 Ij56 1_?56 50 100

°?⁷⁸

>100

12.5 100 100

<O₇O5 <0_;05

0_; 0,4 12,5 6_;25 3,12

3 j 50 <0_;05 <0,05 0,4 0,4

0,4

12,5 3,12

12,5 0,4 0,78 1,56

0.05

0_;05

0.2

0,2

1,56

3_T12

3,12·

0.05

0_f05

0,2 0,4 0,2

0,2 1,56 3,12 ' 3_T12

0,1 0_?05 0,1 0,4

0_;2

1.56

3,12 g

Tabelle III - Fortsetzung

CO CD -4

Pseudomonas aeruginosa KY'8512'

'•Pseudomonas aeruginosa KY 8516

Providencia sp.

Klebsiella pneumoniae No. 8045 Proteus mirabilis 1287 Proteus vulgaris 6897 Proteus rettgeri KY 4288 Proteus morganii.'.KY 4298

12,5

>100

>100 0.4 6,25 3,12 0_;78 1,56

50

0,78.	1,56	0_;78	. 0,78
0	6,25	6_;25	12,5
0,1 .	0,2	P,2 .	0_;2
0_;78	3,12	3,12	3,12
0,78	0_;78	1,56	3,12
0,4	-	■ -	0.78

1) Bildet Gentamycin-Adenyltransferase

2) Bildet Gentamycin-Adenyltransferase und Neomycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ II

3) Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ I

4) Bildet Neomycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ I

5) Bildet Kanamycin-Acetyltransferase

6) Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ I und Neomycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ I

7) Bildet Neomycin-Kanamycin-Phosphotransferase Typ I und Typ II und Streptomycin-Phosphotransferase ,

8) Bildet vermutlich Kanamycin-Acetyltransferase ₍

9) Bildet Gentamycin-Acetyltransferase Typ II

Die Enzyme werden intracellulär gebildet. Mittels dieser Enzyme inaktivieren die Bakterien die Antibiotika.

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß die Verbindung der Erfindung eine starke antibakterielle Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterien aufweist, die gegenüber Gentamycin-Antibiotika und XK-62-2 resistent sind, die Gentamycin-Adenyltransferase und/oder Gentamycin-Acetyltransferase Typ I und Typ II intracellulär bilden und hierdurch Gentamycin-Antibiotika und die Verbindung XK-62-2 -inaktivieren.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Es wird die DL-Form des Acylierungsmittels verwendet.

Beispiel 1

6^t-N-Carbobenzoxy-XK-62-2, 2^t-N-Carbobenzoxy~XK-62-2 und 2'-N,6 ^f-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2

4,00 g (8,65 ml'lol) der Verbindung XK-62-2 v/erden in 92 ml eines Gemisches gleicher Volumenteile Dimethylformamid und Wasser gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 3 Stunden bei 0 bis 5°C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 3,23 g (12,9 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 70 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über«. Nacht bei 0 bis 5°C stehengelassen. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches" aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis 4:1:1 als Laufmittel und unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel wird "die Gegenwart

l_ von nicht umgesetztem XK-62-2 neben 6^l-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 _j

5 0 9837/0967

(R_f-¥ert 0,71), 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 (R_f-Wert 0,62) und 2^f-N,6^t-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2 (R_f-¥ert 0,88), festgestellt.

Beispiel 2 2' -N, 6'-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Gemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit 70 ml Wasser und 50 ml Essigsäureäthylester versetzt. Das erhaltene Gemisch wird gründlich gerührt. Sodann wird das Gemisch stehengelassen, bis sich die·Wasser- und die Essigsäureäthylesterphase voneinander trennen. Die wäßrige Phase wird zweimal mit je 30 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterphase und die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Man erhält 2,24 g 2'-N, 6'-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2 als hellgelben, amorphen Feststoff (35,1 % d. Th.). Das so erhaltene Produkt wird direkt als Ausgangsmaterial für die nachfolgende Umsetzung verwendet. Jedoch kann das Produkt durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 4:1:1 weiter gereinigt werden. Das gereinigte Produkt weist folgende Eigenschaften auf:
F. 93 bis 95°C

6^O (c=0,12, Methanol)
IR-Absorptionsspektrum (KBr): 3800 bis 3000, 2950, 1700, 1540, 1456, 1403, 1310, 1250, 1160, 1050, 1010, 960, 738, 700, 605 cm"¹ (Fig. 4).

L _J

509837/0967

NMR-Spektrum (in Methanol -d^) δ (in ppm gegen TMS): 1,13 (3H, Singulett), 2,62 (3H, Singulett), 3,01 (3H, Singulett), 5,30 - 4,90 (6H, breit, Singulett), 7,43 (5H, Singulett), 7,47" (5H, Singulett) (Fig. 1).

	58	C	7	H	N
ber.:	58	,10	7	,29	9,46
gef.:	,02	,51	9,70

Beispiel3 6'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2

Die nach der Extraktion mit Essigsäureäthylester gemäß Beispiel 2 erhaltene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck auf ?iii Volumen von etwa 15 ml eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird auf eine mit 200 ml Ionenaustauscherharz Amberlite CG-50 (Ammoniumform) (Firma Röhm und Haas)beschickte Säule vom Durchmesser 2,5 cm gegeben. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird mit 0,1 η wäßriges Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird in Portionen von jeweils 10 ml abgenommen. Mit den Fraktionen Nr. 48 bis 65 wird 6·-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 eluiert. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 1,23 g eines farblosen, amorphen Feststoffs, (23,1 % d. Th.) Dieses Produkt kann direkt als Ausgangsmaterial für die anschließende Umsetzung verwendet werden. Jedoch kann dieses Produkt gemäß dem vorbeschriebenen Verfahren mit Ionenaustauscherharz weiter gereinigt werden.- Das gereinigte Produkt weist folgende Eigenschaften auf: F. 108 bis 110⁰C.

5.09837/0 96 7

^Γ - 24 -

/^/_D ⁸=+127,8° (c=0,094; Methanol).

IR-Spektrum (KBr ) 3700-3000, 2930, 1690,1630, 1596, 1480,

1452, 1402, 1250, 1143, IO96, IO5O, 1020, 83Ο, 768, 750, 697, 595, 550 cm"¹ (Fig. 5).

NMR-Spektrum (in Methanol -d^) δ (in ppm gegen TMS): 1,16 (3H,

Singulett), 2,61 (3H, Singulett), 3,01 (3H, Singulett), 5,30 -

4,90 (4H, Multiplett), 7,47 (5H, Singulett) (Fig. 2).

^C28^H47^N5°9'^H2^0: CH N

ber.: 54,77 7,84 11,13

gef.: 54,91 7,93 10,90.

Beisp-iel4 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2

Anschließend an die Slution von 6♦-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 gemäß Beispiel 3 wird mit den Fraktionen Nr. 78 bis 97 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 eluiert. Die Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 1,43 g 2^!-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 als farblosen, amorphen Feststoff (26,7 % d. Th.). Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann direkt als Ausgangsmaterial für die weitere Umsetzung verwendet werden. Jedoch kann das Produkt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz weiter gereinigt werden. Das gereinigte Produkt weist folgende Eigenschaften auf.
F. 107. bis 110⁰C.

^80° (c=0,10, Wasser)
IR-Spektrum (KBr): 3700 -3100, 2930, 1702, 1530, 1451, 1310, 1255, 1141, 1053, 1021, 960, 735, 697, 604 cm"¹ (Fig. 6).

L -J

509837/0967 .

Γ" ■ . ' -25-

NMR-Spektrum (in Methanol -d₄) δ (in ppm gegen TMS): 1,13 (3H, Singulett), 2,42 (3H, Singulett), 2,60 (3H_f Singulett), 5,13 (4H, breit, Singulett), 7,43 (5H, Singulett) (Fig. 3). C₂₈H₄₇N₅O₉.2H₂O: CH N

ber.: 53,08 8,06 11,06 gef.: 53,31 8,16 10,93.

Beispiel -5

N-Hydroxysuccinimidester von q-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure

1,0 g (4,2 mMol) a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure (beschrieben in The Carbohydrate Research, Bd. 28 (1973), S. 263 bis 280) und 0,48 g (4,2 mMol) N-Hydroxysuccinimid werden in 35 ml Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit 0,86 g (4,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, wobei die Temperatur bei 0 bis 5°C gehalten wird. Anschließend wird das Gemisch über Nacht bei derselben Temperatur stehengelassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das erhaltene Filtrat wird zur Entfernung des Essigsäureäthylesters unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 1,30 g N-Hydroxysuccinimidester von a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure .als farbloses, durchsichtiges Öl ^ (92,0 % d. Th.). Dieses Produkt kann direkt für die weitere Umsetzung verwendet werden, jedoch läßt sich das Produkt durch Säulenchromatographie und andere bekannte Verfahren »reiter reinigen. Das gereinigte Produkt zeigt folgende Eigenschaften: IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm) 3700-3100, 2950, 1816, 1780, 1700, 1520, 1320, 1170, 1070, 992, 830-500 cm"¹.'

509837/0967

NMR-Spektrum (in Deut er ο chloroform) δ (in ppm gegen ITiS): 2,77 (4H, Singulett), 3,67 (2H, Multiplett), 4,64.(1H, Kultiplett), 5,11 (2H, Singulett), 5,82 (1H, Triplett, J=3,0 Hz), 7,33
(5H, Singulett).

^C15^Hi6^N2°7ⁱ C H N

ber.: 53,57 4,76 .8,33

gef.: 53,42 4,65 8,39.

Beispiel 6

1 -N- (g-Kydroxy-ß-carbobenzoxyaminopro-pionvl)-2' -N, 6' -N-di carbobenzoxy-XK-62-2

740 mg (1,0 mMol) 2^!-N, 6^!-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2 werden in 20 ml eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Wasser und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei -5 bis O⁰C unter
Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 403 mg (1,2 mMol)
N-Hydroxysuccinimidester von cc-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure in 15 ml Dimethylformamid versetzt. Innerhalb
1 Stunde ist die Zugabe beendet. Anschließend wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel unter den Bedingungen gemäß Beispiel 1
wird die Anwesenheit einer geringen Menge von Nebenprodukten und nicht-umgesetztem 2^f-N,6'-N-Dicarbobenzoxy-XK-62-2 neben -. 1-N-(α-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionyl)-2'-N,6'-N-dicarbobenzoxy-XK-62-2 (R_f-¥ert 0,95) festgestellt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird ohne weitere Reinigung zur weiteren Umsetzung verwendet. Gegebenenfalls

5.09837/0967

kann dieses Produkt gemäß Beispiel 1 durch Säulenchromatographie an Kieselgel weiter gereinigt werden.

Beispiel 7 1 -K-. (g-Hvdroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionvl) -2 * -N-carbobenz-

oxy-XK-62-2

633 mg (1,0 mMol) 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 werden in 20 ml eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Dimethylformamid und Wasser gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 1 Stunde bei -5 bis O⁰C tropfenweise mit einer Lösung von 403 mg (1,2 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure in 15 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch Dünnschichtchronatographie an Kieselgel unter den Bedingungen gemäß Beispiel 1 läßt sich die Anwesenheit einer geringen Menge an Nebenprodukten und nicht umgesetztem 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 neben 1-N-(a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionyl)-2¹-N-carbobenzoxy-XK-62-2 (R_f-Wert 0,83) feststellen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung direkt zur weiteren Umsetzung verwendet. Gegebenenfalls kann das Produkt gemäß Beispiel 1 durch Säulenchromatographie an Kieselgel weiter gereinigt werden.

Beispiel 8

1-N-"(a-Hvdroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionyl)-6¹-N-carbobenz-OXV-XK-62-2 -

615 mg (1,0 mMol) 6^f-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 werden in 20 ml , eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Dimethylformamid

509837/0967

^Γ - 28 - ^Π

und Wasser gelöst. Die Lösung wird innerhalb 1 Stunde bei -5 bis O⁰C unter Rühren mit einer Lösung von 403 mg (1,2 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsäure in 15 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel gemäß Beispiel 1 läßt sich die Anwesenheit einer geringen Menge von Nebenprodukten und nicht umgesetztem 6'-N-Carbobenzoxy-XK-62-2 neben 1-N-(oc-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionyl)-6'-N-carbobenzoxy-XK~62-2 (Rp-Wert 0,87) feststellen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht gelblichen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung direkt zur weiteren Umsetzung verwendet. .Gegebenenfalls kann das Produkt gemäß Beispiel 3 durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz gereinigt werden.

Beispiel 9

1 -N- («-Hvdroxy-ß-amino-pro-pionyl) -XK-62-2

Der in Beispiel 6 erhaltene Rückstand, der 1-N-(a-Hydroxy-ßcarbobenzoxyaminopropionyl)-2'-N,6·-N-dicarbobenzoxy-XK-62-2 als Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird sodann in Gegenwart von 120 mg 5prozentigem Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator bei Raumtem-

• ρeratür und Atmosphärendruck 6 Stunden hydriert. Durch Dünn-Schichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1:1 und Nin-

. hydrin als Anfärbemittel läßt sich 1-N-(«-Hydroxy-ß-amino~ _t

509837/0967

Γ Π

propionyl)-XK-62-2 (R^-Wert 0,42) als Hauptbestandteil neben seinen Stellungsisomeren und einer geringen Menge von XK-62-2 (auf Grund von in Beispiel 6 nicht umgesetztem 2'-N,6'-Dicarbobehzoxy-XK-62-2) feststellen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft« Anschließend wird der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 70 ml Ionenaustauscherharz Amberlite CG-50 (Ammoniumform) beschickte Säule vom Durchmesser 1,5 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird eine 0,-2 η wäßrige Ammoniaklösung über die Säule gegeben, v/o durch 5S mg XK-62-2 erhalten v/erden. Die EIution wird sodann mit 0,4 η wäßriger Ammoniaklösung durchgeführt, wobei die Bestandteile düilnschichtchromatographisch untersucht werden. Die Fraktionen, die 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 (R^-Wert 0,42) als einzigen Bestandteil enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 371 mg eines farblosen amorphen Feststoffs (58,1 % d. Th.) bezogen auf 2'-N,6'-N-Dicarbobenzoxy-XK-52-2.

Das Produkt zeigt folgende Eigenschaften: F, 149 bis 152⁰C (Zersetzung bei 16O°C) /Ö/q⁸=+91,5° (o=0,106j Wasser)

IR-Spektrum (KBr): 3800-3000, 2930, 1650, 1570, 1480, 1385 1330, 1110, 1052, 1020, 813 cm"¹ (Fig. 7).

5H₂Os	45	G	7	H	13	N
ber. t	45	,07	7	,98	13	,14
gef .s	,21.	,7ί	,32.

V ft A β"* *"i ^ f Λ Λ Λ d

oü3o37/096?

Beispiel 10 ----1-N-(g-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2

Der in Beispiel 7 erhaltene Rückstand, der 1-N-(ct-Hydroxy-ßcarbobenzoxyaminopropionyl)-2^! -N-carbobenzoxy-XK-62-2 als
Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird in Gegenwart von 110 mg 5prozentigem " Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator bei Raumtemperatur und Atmosphärendurck 6 Stunden hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch gemäß Beispiel 9 aufgearbeitet. Man erhält 397 mg 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 (62,1 % d. Th.) bezogen auf 2'-N-Carbobenzoxy-XK-62~2.

Beispiel 1-1

1 -N- (g-Hvdroxv"ß-aminopropi_ionyl_lrXK-62-2_i

Der in Beispiel 8. erhaltene Rückstand, der 1-N-(ct-Hydroxy-ßcarbobenzoxyaminopropionyl)-6^?-N-carbobenzoxy-XK-62-2 als
Hauptbestandteil enthält, wird in 20 ml wäßrigem 20prozentigem Methanol gelöst. Die Lösung -wird mit 1,0 ml Essigsäure versetzt. Das erhaltene Gemisch wird in Gegenwart von 110 mg
5prozentigem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator bei Raumtemperatur und ÄtmoSphärendruck 6 Stunden hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch gemäß Beispiel 9 aufgearbeitet. Man erhält 243 mg 1-N-(a-HydrGxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 (38,1 % d.Th.) bezogen auf 6«-N-Carbobenzoxy-XK-62-2.

Beispiel ■ 12 ^? i^T-(g-Hydrü-cy-ß-aminopropionvl)-XK-62-2-monosulfat -4 g (10 ffiMol') 1 -N- (a-Hydroxy-ß-aminopropionyl) -XK-62-2

50^837/098?

werden in 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Kühlung
mit einer Lösung von 0,98 g (10 mMol) Schwefelsäure in 5₅O ml Wasser versetzt. Nach 30 Minuten wird die Lösung tropfenweise mit kaltem Äthanol versetzt, bis die Fällung vollständig ist. Der weiße Niederschlag wird abfiltriert. Man erhält 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl) -XK-62-*2-monosulf at.

Beispiel 13

-] -H- ((x-Hvdroxv-ß-carbobenzoxyarninopropionyl) -XK-62-2
2,79 g (6,0 mMol) XK-62-2 werden in 50 ml eines Gemisches aus. gleichen Volumenteilen Wasser tmd Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei -5 bis 0⁰C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 2,82 g (8,4 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von

in 20 ml Dimethylformamid

a-Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionsaure/versetzt. Die Zugabe ist innerhalb 1 Stunde beendet. Sodann wird das Gemisch
über Nacht zur Umsetzung gebracht. Durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus
Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 4 ι 1 : 1 und unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel werden T-H-(a~Hydroxy-ßcarbobenzoxyaminopropionyl)-XK-62-2 (R^-Wert 0,63), Nebenprodukte und nicht umgesetztes XK-62-2 festgestellt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zu einem leicht
gelblichen Rückstand eingedampft, der 1-N-(a~Hydroxy-ß-carbobenzoxyaminopropionyl)-XK-62-2 enthält. Dieser Rückstand wird ohne weitere Reinigung zur· weiteren Umsetzung verwendet.

"98 37/096

Beispiel 14

1-N-(κ-Hydroxv-ß-aminopropionyl)"XK-62-2

Der in Beispiel 13 erhaltene Rückstand wird in 40 ml eines Gemisches aus gleichen Volumteilen Wasser und Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 0,6 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird in Gegenwart von 250 mg 5prozentigem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 6 Stunden hydriert. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Isopropanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Chloroform im Volumenverhältnis von 2:1:1 lassen sich 1-N-(a~Hydroxy-ß--aminopropionyl)-XK-62-2, dessen Stellungsisomere und eine geringe Menge an XK-62-2 nachweisen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 15 ml Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 150 ml Ionenaustauscherharz Amberlite CG 50 (Ammoniumform) beschickte Säule vom Durchmesser 2,5 cm aufgesetzt. Die" .Säule wird mit 200 ml Wasser-gewaschen. Anschließend wird eine 0,2 η wäßrige Ammoniaklösung über die Säule gegeben. Dabei werden 116 mg XK-62-2 erhalten. Sodann wird die Elution unter Verwendung einer 0,4 η wäßrigen Ammoniaklösung durchgeführt,-wobei die Bestandteile dünnschichtchromatographisch nachgewiesen werden. Die 1-N-(a-Hydroxy-ß-aminopropionyl)-XK-62-2 (R^-Wert 0,42) als einzigen Bestandteil enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 586 mg eines farblosen, amorphen Feststoffs (15,3 % d. Th.). ■ ' ·

_J 509837/0 9 67

Das Produkt zeigt folgende Eigenschaften:

F. 149 bis 152⁰C (Zersetzung bei 16O⁰C).

/o/Jj⁸ =+91,5° (c=0,106; Wasser).

IR-Spektrum (KBr): 3800-3000, 2930, 1650, 1570, 1480, 1385,

1330, 1110, 1052, 1020, 813 cm"¹.

C„H,_rN_r0_o. H₀CO^-I₁SH₀O: CHN

C.J H-O D y C- j ' C-

ber.: 45,07 7,98 13,14 gef.: 45,31 7,54 13,13.

Beispiel 15

1-N-(q-Hydroxy-ß-aminoOroOionyl)-XK-62-2

926 mg (2,0 mMol)XK-62-2 werden in 100 ml eines Gemisches aus gleichen Volumenteilen Wasser und Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 15 Minuten bei 20 bis 25°C unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 1,18 g (5,4 mMol) N-Äthoxycarbonylphthalirnid in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur Umset- ' zung gebracht. Das Reaktionsgemisch enthält 2'-N-Phthaloyl-XK-62-2 als Hauptbestandteil und wird ohne weitere Isolierung und Reinigung zur v/eiteren Umsetzung-verwendet.

Das Reaktionsgemisch wird innerhalb von 15 Minuten bei 20 bis 25°C tropfenweise mit einer Lösung von 1,05 g (3,2 mMol) -N-Hydroxysuocinimidester von a-Hydroxy-ß-N-phthaloylpropion-

iri IO ml Dimethylformamid

säure/versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch über Nacht zur umsetzung gebracht, Dss erhaltene Reaktionsgemisch enthält 2' - H- Piitlial oy 1-1 - H- (a -hydroxy- β - N-phthal oylpr opi onyl) ZK-62-2 als Hauptbestandteil.

L -J

5-0 9337/09S¹?

r -

Dieses Reaktionsgemisch wird sodann innerhalb von 30 Minuten bei 10 bis 15 C tropfenweise mit einer Lösung von 12,9 g wäßrigem 80prozentigem Hydrazin in 70 ml Methanol· versetzt. Nach beendeter Zugabe bringt man das Gemisch über Nacht zur Umsetzung, wobei die· Phthaloylgruppe abgespalten wird. Das Reaktionsgemisch v/ird sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst. Durch Säu lenchromatographie unter Verwendung von Amberlite CG-50 (Ammoniumform) unter den in Beispiel 14 angegebenen Bedingungen erhält man 685,5 mg-des gewünschten 1-N-(a-Hydroxy-ß-amino propionyl)-XK-62-2 (53,7 % A. Th.).

Claims

Patentansprüche

1.. Verbindung der Formel 6'i NHCH-,

NH.

O Oi!

Il I

NH-C-CHCH₂NH₂

HO

(D

und deren Salze mit Säuren.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß-man 1 Mol der Verbindung der Formel II 6¹

NHCH

0SS37/0967

mit 0,4 Ms 2,5 Mol eines zur Einführung einer a-Hydroxy-ßsubstituierten-aminopropionylgruppe geeigneten Aeylierungsmittels, bei dem die ß-Aminogruppe durch eine Schutzgruppe der

Formel

CH., O I³H

H-C-C-O-C-³ I

CH₃-O-C-

C₂H₅-O-C-

oder

geschützt ist, v/orin R^ und R₂ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Hydroxyl- oder Nitrogruppe oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und IU ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, in einem Lösungsmittel bei Temperaturen von -50 bis 50⁰C in der 1-Stellung acyliert und anschließend die Schutzgruppe entfernt.

509837/0967

-. 37 -

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel eine a-Hydroxy-ß-substituierte Aminopropionsaure oder ein zur Acylierung geeignetes, entsprechendes Derivat verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel die Verbindung der Formel

O OH O. Il I Ii CH₂-O-C-NH-CH₂-CH-C-O-N

verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ac3^rlierung bei -20 bis 20⁰C durchführt und pro Mol der Verbindung der Formel II 0,7 bis 1,5 Mol Acylierungsmittel verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzgruppe die Benzyloxycarbonylgruppe verwendet und diese durch Hydrierung abspaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzgruppe die Phthaloylgruppe verwendet und diese durch Behandlung mit Hydrazin abspaltet.

L A

10.9 837/091?

■ ■ _ "5Q _

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dafi man als Lösungsmittel Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, niedere Alkohole, Dioxan, Äthylenglykoldiinethyläther, Pyridin, Wasser oder Gemische dieser Lösungsmittel verwendet.

9. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 Mol.der Verbindung der allgemeinen Formel II

(H)

mit 0,5 bis 4,5 Mol eines Aminoschutzgruppenreagens der Formel

fi -ι η, / η ο. β Ί

il CH-O-C-O-N

CH, 0

ι ³ Il

H-.C-C-0-C-N 3 ι

CH₃

Il
CH₃-O-C-X

C₂H₅-O-C-X

oder

Ii

R₃-CH₂-C-X O

II"

R-CH₂-C-OH

Il

C₂H₅-O-C-N:

worin R^ und Fu gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Hydroxyl- oder Nitrogruppe oder einen Alkyl- odsr Alkoxyrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, R, ein Wasserstoff-5 Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom,oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und

bedeuten, . .

X ein Chlor-, Brom- oder Jodatöm/bei -50 bis 50 C in einem Lösungsmittel zu einem Gemisch aus Zwischenprodukten umsetzt, wobei mindestens eine der in der 2'-Stellung und 6'-Stellung des Ausgangsproduktes stehenden Aminogruppen durch eine Schutzgruppe geschützt ist, sodann 1 Mol des erhaltenen Zwischenprodukts mit 0,5 bis 1,5 Mol eines zur Einführung einer ct-Hydroxyß-substituierten-aminopropionylgruppen geeigneten Acylierungsmittels, bei dem die ß-Aminogruppe durch eine Schutzgruppe der Formeln

F° 9837/0967

II

CH₂-O-C-

Il

. CH₃-O-C-

Il C

-C-

- 40 -

CH, 0

Il

H^C-C-O-C-3 ι CH,

Il

C₂H₅-O-C-

oder

geschützt ist, worin R. und R₂ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Hydroxyl- oder Nitrogruppe oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und R-* ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor- , Brom- oder Jodatorn oder einen Alkylrest mit 1 Ms 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, in einem Lösungsmittel bei Temperaturen von -50 bis 50⁰C in der 1-Stellung acyliert und anschließend die Schutzgruppe entfernt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel eine a-Hydroxy-ß-substituie-rte-ajninopropionsäure oder ein entsprechendes ₉ zur Acylierung geeignetes Derivat verwendet.

5Ö9837/0967

^Γ ■ - 41 -

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsraittel die Verbindung der Formel

O OH O.

Ii ι ti

CH₂-O-C-NH-CK₂-CH-C-O-N

verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzgruppe die Benzyloxycarbonylgruppe verwendet und diese durch Hydrierung abspaltet.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzgruppe, die Phthaloylgruppe verwendet und diese durch Behandlung mit Hydrazin abspaltet.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für die Einführung der Amino schutzgruppe Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, niedere Alkohole, Dioxan, A'thylenglykoldimethyläther, Pyridin, Wasser oder Gemische dieser Lösungsmittel verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für die Acylierungsstufe Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dimethylacetamid ₃ niedere Alkohole/. Dioxan, Äthylenglykoldimethyläther, Pyridin oder Wasser verwendet.

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16. Arzneipräparate, bestehend aus der Verbindung nach Anspruch 1 oder deren Salzen und üblichen Trägerstoffen und/ oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

17. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 als Desinfektionsmittel .

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