DE2512587C3 - 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6' -N-alkylkanamycine A, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel - Google Patents
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Description
OH
ί- OH
CH.NHR
in der R Methyl oder Äthyl bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryI)-6'-N-alkylkanamycine
A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jo
jeweils in an sich bekannter Weise
A) nur die 6'-Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe
blockiert,
B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem ^
aktiven Ester der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure. deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe
blockiert ist, die von derjenigen verschieden ist, die an der 6'-Aminogruppe
von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,
C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktcs
mit der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxybuttersäure
aufweist, blockiert,
D) die ö'-Aminoschutzgruppe aus dem Acylierungsprodukt
abspaltet,
E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert
F) die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem Alkylierungsprodukt abspaltet,
die jeweilige Verbindung gemäß Anspruch 1 aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch durch Säulenchromatographie
isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.
3. Pharmazeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der Verbindungen nach
Anspruch I oder deren pharmakologisch verträgliche Salze in Kombination mit einem pharmakologisch
verträglichen Träger enthalten.
Die Erfindung betrifft l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkyl-kanamycine
A und ihre pharmakologisch verträglichen Säurcadditionssalze, ein Verfahren
zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen ^ enthaltende pharmazeutische Mittel.
Kanamycin A ist ein bekanntes Aminoglycosid-Antibiotikum.
In den letzten Jahren wurden jedoch einige gegen Kanamycin resistcnte Stämme gefunden und man
ist seither bemüht, den Resistenzmechanismus bei ,,„
diesen gegen Kanamycin resistenten Stämmen zu untersuchen.
Es wurde festgestellt, daß einige Stämme von gramnegativen Bakterien, die den R-Faktor tragen, der
Familien Staphylococcus aurcus und Psciiclomomis h^
aeruginosa, die bei Patienten isoliert wurden, gegen Kanamycin resistent sind. Bei der genauen Untersuchung
des Resistenzmechanismus wurde gefunden, daß diese resislenten Stämme Phosphotransferasen,
welche die 3'-Hydroxylgruppc von Kanamycin phosphorylieren können, eine Nucleotidyltransfcrase, welche
die 2"Hydroxylgruppe von Kanamycin nucleotidylieren kann, oder Acetyltransferascn, welche die
6'-Aminogruppen von Kanamycin acetylicren können, bilden, so daß diese Transferasen das Kanamycin inaktivieren.
Daraufhin wurden die verschiedensten Kanamycinderivatc hergestellt und getestet, um die Beziehung
zwischen ihren Strukturen und ihren antibakteriellen Wirksamkeiten zu untersuchen. Dabei ist es
gelungen, neue Kanamycinderivate zu finden, die eine verbesserte antibakterielle Wirksamkeit (Aktivität)
selbst gegenüber den verschiedenen Arten von gegen Kanamycin resistenten Stämmen aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycinc
A der allge-
meinen Formel
HO
f— OH
CH1NHR
H2NCH2Ch2CHCOHN-L
OH
NH,
in der R Methyl oder Äthy! bedeutet, und deren pharmakologisch
verträgliche Säureadditionssalze.
Beispiele für pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze
der erfindungsgemäßen Verbindungen der oben angegebenen Formel I sind das Hydrochlorid,
Sulfat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat,
Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat und Äthansulfonat.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybulyryl)-6'-N-mcthyl-kanamycin
A (nachfolgend abgekürzt mit »l-AHB-6'-MKM«)
und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxvbutyryl)-6'-N-äthylkanamycin A (nachfolgend abgeküizt mit»I-AHB-6'-EKM«)
weisen die folgenden Eigenschaften auf:
Die Verbindung l-AHB-6'-MKM liegt i.i Form eines
weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 169 bis 173°C zersetzt, [«];,+78° (c=l, in Wasser). Sie entspricht
der empirischen Formel C^H^NiOu, wie ihre
Elementaranalyse gezeigt hat. Diese Verbindung ergibt bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) auf
Silicagel unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform/Methanol/28%igcm
wäßrigem Ammoniak/Wasser (1 :4 :2 : I, bezogen auf das Volumen) als Entwicklungslösungsmitlcl
bei Rf = 0.13 einen einzelnen Fleck, der positiv gegenüber der Ninhydrin-Rcaklion ist.
Der Verbindung 1-AHB-6'-EKM liegt in Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 184 bis
!880C zersetzt, [»] +80° (c=!, in Wasser). Sie entspricht
der empirischen Formel C24H47N5Ou, wie ihre
Elementaranalyse zeigte. Diese Verbindung ergibt bei der TLC an Silicagel unter Verwendung der gleichen
Lösungsmittelmischung wie oben bei Rf=0,20 einen einzelnen Fleck, der gegenüber der Ninhydrin-Reaktion
positiv ist.
Die Strukturen dieser Verbindungen wurden durch NMR-Spektroskopie und durch Papierchromatogra-
jo phie für die Produkte bestätigt, die 40 Minuten lang bei
1000C einer Hydrolyse in 6 η HCI unterworfen wurden.
Diese beiden Verbindungen sind beide wenig toxisch, ihr LDw-Wert beträgt mehr als 200 mg/kg bei intravenöser
Verabreichung an Mäusen. Die Verbindungen
Ii können bei niedrigen Konzentrationen das Wachstum
' von verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten
Stämme hemmen und sie können daher mit Erfolg zur Behandlung der durch diese Bakterkii hervorgerufenen
Infektionserkrankungen verwendet werden.
Es wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von 1-AHB-6-MKMund l-AHB-6'-EKM gegenüber
verschiedenen Mikroorganismen nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung eines Agar-
4·ϊ Nährmediums bei 37°C bestimmt. Die dabei erhaltenen
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Untersuchte Mikroorganismen | MIC (wg/ml) | I-All U-O-IiKM |
l-/\IIH-6'-MKM | 1.56 | |
Staphylococcus auicus !'ΌΛ209Ρ | 0,78 | 3.12 |
Vlycobiietcrium smcgmatis ATCC6O7 | 0,39 | 1.56 |
l'schcrichiii coli K-12 | 0,39 | 1.56 |
[•schcrichiii coli K=I 2 R5 | 0,78 | 3,12 |
[•schcrichiii coli K-12 MLI629 | 0,78 | 6.25 |
!•schcrichiii coli K-12 MLI630 | 1,56 | 3.12 |
!•schcrichiii coli K-12 MLI4I0 | 1,56 | 3.12 |
[•schcrichiii coli LA29O R55 | 1,56 | 1,56 |
l-schcrichiii coli LA 290 R56 | 0,78 | 1.56 |
!•schcrichiii coli LA29O R64 | 0.78 | |
Fortsetzung
Untersuchte Mikroorganismen
MiC (,-ig/ml) | I-AIIB-6'EKM |
l-AIIB-6'-MKM | 1,56 |
1,56 | 25 |
6,25 | 1,56 |
0,78 | 25 |
6,25 | 25 |
6,25 | 25 |
3,12 | 50 |
12,5 | 100 |
50 | 100 |
12,5 | |
Escherichia coü W677
Escherichia coli JR66/W677
Klebsieila pneumoniae PCI 602
Klebsielia pneumoniae 22-3038
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonns aeruginosa No. 12
Pseudomonas aeruginosa TI-13
Ps:eudomonas aeruginosa GN315
Pseudomonas aeruginosa 99
Escherichia coli JR66/W677
Klebsieila pneumoniae PCI 602
Klebsielia pneumoniae 22-3038
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonns aeruginosa No. 12
Pseudomonas aeruginosa TI-13
Ps:eudomonas aeruginosa GN315
Pseudomonas aeruginosa 99
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegenüber den ö'-N-Acetyltransferase bildenden Stämmen,
wie z.B. Escherichia coli K-12 R5 und Pseudomonas aeruginosa GN315, aktiver (wirksamer) als die in der
US-Patentschrift 37 81268 beschriebene verwandte Verbindung 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryI)kanamycin.
Es wurde auch gefunden, daß diese Verbindungen durch eine durch Pseudomonas aeruginosa
GN 315 gebildete ö'-N-Acetyltransferase im wesentlichen
nicht acetyliert werden. Eine andere verwandte Verbindung, das in der britischen Patentschrift 13 84 221
beschriebene ö'-N-Methylkanamycin, ist nicht in der Lage, das Wachstum der gegen Kanamycin resistenten
Stämme, wie z.B. Escherichia coli K-12 ML 1629, K-12 ML 1630 und JR66/W677, Klebsielia pneumoniae
22-3038, Pseudomonas aeruginosa TI-13 und GN315,
die 3'-Phosphotransferasen und 2"-NucleotidyItransferasen bilden, zu hemmen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Behandlung von verschiedenen Infektionen, die durch
Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hervorgerufen werden, oral oder
parenteral, beispielsweise durch intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht
werden.
Die eiiindungsgemäßen Verbindungen sind höchst
wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen, wenn sie
parenteral verabreicht werden. Sie eignen sich auch für die Sterilisierung des ivörperinnern (der Eingeweide)
durch orale Verabreichung und für die chirurgische Sterilisation durch mechanische Reinigung.
Es wurde gefunden, daß sie bei subkutaner Verabreichung in eimer Dosis von mehr als 2 mg/kg gegenüber
bei Mäusen durch Styphylococcus aureus Smith und Klebsielia pneumoniae S-1802 künstlich hervorgerufenen
Infektionen wirksam sind.
Für die parenteral Verabreichung können sie in üblichen Dosierungsformen, beispielsweise in Form
sterilisierter wäßriger Lösungen und physiologischer Kochsalzlösungen, verwendet werden. Bei der parenteralen
Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 200 bis
2000 mg, die in 2 bis 4 Teildosen pro Tag verabreicht werden kann.
Für die orale Verabreichung können sie in konventionellen, bekannten Dosierungsformen verwendet
werden, beispielsweise in Form von Pulvern, Kapseln,
Tabletten, Suppositorien und Sirupen Bei der oralen
Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 500 bis 2500 mg.
Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der oben angegebenen Formel I können nach einem einen
weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise
A) nur die 6'-Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert,
B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem aktiven Elster der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure,
deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist, die von derjenigen verschieden
ist die an der 6'-Aminogruppe von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,
C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktes
mil der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxy-buttersäure
aufweist, blockiert,
O) die ö'-Aminoschutzgruppe aus dem Acylierungs-
produkt abspaltet
E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert
E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert
F) die restlichen Aminogruppen aus dem Alkylierungsprodukt
abspaltet
die jeweilige Verbindung der oben angegebenen Formel I aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch
durch Säulenchromatographie isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.
Geeignete Beispiele für Aminoschutzgruppen, ihre Einführung und Entfernung sind in dem Artikel von
Y. Wolman »The Chemistry of Amino Group«, Seiten 669 bis 700 in der Interscience Publishers, 1968, und von
Y. W. Barton »Protective Group in Organic Chemistry^, Seiten 43 bis 9i, Plenum Press, 1973, beschrieben.
Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfah.ens wird nur die 6'-Aminogruppe des
bo Kanamycins, die unter den vier vorhandenen Aminogruppen
die reaktionsfähigste ist, mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert und das a if diese Weise
gebildete blockierte Derivat wird dann mit einem Derivat der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure mit geschützter
Aminofc'rjppe oder einem funktionellen
Äquivalent davon acyliert unter Bildung des gewünschten 1-N-monoacylierten Derivats und der beiden monoacylierten
Derivate als Nebenprodukt. Ohne diese drei
monoacylierten Derivate (Positionsisomere) voneinander zu trennen, werden die restlichen freien Aminogruppen
jedes dieser Derivate mit üblichen, bekannten Aminoschutzgruppen blockiert, die jedoch von der zum
Blockieren der ö'-Aminogruppe verwendeten verschieden
sind. Anschließend wird nur die 6'-Aminoschutzgruppe selektiv aus den Derivaten entfernt,
danach wird alkyliert unter Bildung des 6'-N-Alkylierungsproduktes,
aus dem die restlichen Aminoschutzgruppen dann entfernt werden. Aus der Reaktionsmischung, welche die so gebildeten Positionsisomeren
enthält, können die erfindungsgemäßen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxy-butyryl)-6'-N-alkylkanamycine
A bequem isoliert werden, beispielsweise unter Anwendung eines chromatographischen Verfahrens, wie es nachfolgend
näher beschrieben wird.
Bei den oben in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erwähnten AminoschutzgruDpen
kann es sich um solche handeln, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Peptidcn verwendet werden, und
sie können auf übliche Weise eingeführt werden, obgleich es bevorzugt ist, solche Aminoschutzgruppen
zu verwenden, die mit einer guten Reaktionsausbeute gegebenenfalls leicht entfernt werden können.
Beispiele für Aminoschutzgruppen die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können,
sind eine Alkyloxycarbonylgruppe, wie Äthoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl; eine
Cycloalkyloxycarbonylgruppe. wie Cyclopentyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und eine Aralkyloxycarbonylgruppe,
wie Benzyloxycarbonyl und p-Nitrobenzyloxycarbonyl. Zur Herstellung von blockierten
Derivaten in Form einer Schiffschen Base kann eine divalente Aminoschutzgruppe, z. B. Salicylidengruppe,
verwendet werden. Vorzugsweise werden 2 oder mehr verschiedene Aminoschutzgruppen verwendet, die
selektiv und unabhängig voneinander im Verlaufe von verschiedenen Reaktionen entfernt werden können.
In bezug auf die Schutzgruppe die zum Blockieren der
6'-Aminogruppe von Kanamycin verwendet wird, ist es höchst zweckmäßig, eine tert.-Butoxycarbonylgruppe
nogruppe reaktiv ist und gegebenenfalls leicht entfernt werden kann. Wenn die 6'-Aminogruppe beispielsweise
mit der tert.-Butoxycarbonylgruppe blockiert werden soll, wird das Kanamycin in einer Mischung aus Pyridin,
Wasser und Triäthylamin gelöst, dann werden 1 bis 3 Mol tert.-Butoxycarbonylazid unter Rühren zugetropft.
Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann unter vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Rückstand wird durch Säulenchromatographie unter
Verwendung eines üblichen Kationenaustauscherharzes gereinigt, wobei man das ö'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin
in einer guten Ausbeute erhält, wenn das nicht-umgesetzte Kanamycin für die erneute Verwendung
zurückgewonnen werden kann.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zum Acylieren der l-Aminogruppe des
Kanamycins verwendete L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure
oder ein funktionelles Derivat davon zweckmäßig in einer solchen Form vorliegen, daß die
4-Aminogruppe des Acylierungsmittels mit einer geeigneten Schutzgruppe blockiert ist, bei der es sich um
irgendeine der oben erwähnten Aminoschutzgruppen handeln kann. Wenn die Hydroxyaminosäure mit
o'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin umgesetzt werden
soll, wird die Aminoschutzgruppe der Hydroxyaminosäure vorzugsweise mit einer Schutzgruppe, beispielsweise
einer Benzyloxycarbonylgruppe, blockiert, die bei der Entfernung der o'-N-tert-Butoxycarbonylgruppe
aus dem Butoxycarbonylkanamycin nicht freigesetzt wird. Die Acylierung der I-Aminogruppe von Kanamycin
mit dem L-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Rest kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt
werden, wie es üblicherweise bei der Synthese von Amiden angewendet wird. Bei einer bevorzugten Aus-
H) führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei
der zuerst das 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin hergestellt wird, kann das Acylierungsmittel vorzugsweise
in einer solchen Form verwendet werden, die mit der l-Aminogruppe des ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamy-
i) ein mit hoher Selektivität reagiert, z.B. in Form eines
aktiven Esters der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure. Der aktive Ester kann nach irgendeinem bekannten
Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Umsetzung der L-4-Amino-hydroxybuttersäure, in
welcher die Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe blockiert worden ist, mit N-Hydroxysuccinimid
in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran, in Gegenwart
eines Dehydratisierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbo-
j) diimid. 0,5 bis 3 Mol des so hergestellten aktiven Esters
können mit ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyäthan,
umgesetzt werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
in erhaltene Acylierungsprodukt besteht überwiegend aus
der gewünschten l-N-acylierten Verbindung und zu
einem geringeren Anteil aus den 3-N-acylierten und 3"-N-acylierten Verbindungen als Nebenprodukt. Diese
Verbindungen brauchen für die Verwendung in der
r. nachfolgenden Stufe nicht voneinander getrennt zu
werden, in der alle in dem Acylierungsprodukt vorhandenen restlichen freien Aminogruppen mit geeigneten
Aminoschutzgruppen, die bei der Entfernung der 6'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe nicht freigesetzt wer-
iii den, und vorzugsweise mit den gleichen Aminoschutzgruppen,
wie sie zum Blockieren der L-4-Amino-2-iiyui uxyuuiici säui c vciwciiuci wutucii siiiu, /.. u. uci
Benzyloxycarbonylgruppe, blockiert werden. Die Blokkierung der Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbo-
>> nylgruppe kann nach irgendeinem bekannten Verfahren
durchgeführt werden und im allgemeinen wird sie durch Umsetzung mit Benzyloxycarbonylchlorid unter basischen
Bedingungen in Wasser oder in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel durchgeführt
in Das auf diese Weise erhaltene Benzyloxycarbonylierungsprodukt
kann mit einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure, Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure
behandelt werden, am nur die 6'-N-tert-ButoxycarbonyIgruppe aus dem Produkt
")) selektiv zu entfernen. Das dabei erhaltene Produkt, in
dem die 6'-Aminogruppe nicht mehr blockiert ist, wird
einer 6'-Alkylierung unterworfen, wobei das gewünschte aminoblockierte Derivat erhalten wird. Die
Alkylierung kann auf irgendeine bekannte, übliche Art
wi und Weise durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise
durchgeführt durch Umsetzung der 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen
wie die Alkylgruppe, die eingeführt werden soll, d. h. mit Formaldehyd oder Acetaldehyd, um die
"i Aminogruppe in die Form der Schiffschen Base umzuwandeln,
woran sich die normale katalytische Reduktion oder die Reduktion mit Natriumborhydrid anschließt
um sie in die 6'-N-Alkylaminogruppe zu überführen.
Die Aminoschutzgruppen in dem die 1-N-Acyl-6'-N-alkylgruppe
aufweisenden Produkt, welches das letzte Zwischenprodukt in dem erfindungsgemäßen
Verfahren darstellt, können auf übliche Weise daraus entfernt werden. Wenn beispielsweise die Aminoschutzgruppe
eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, kann sie nach einem üblichen Verfahren, beispielsweise durch
katal/t.sche Reduktion oder durch Behandlung mit
Bromwasserstoff/Essigsäure, leicht entfernt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens, bei der die 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd umgesetzt wird unier Bildung einer
Schiffschen Base, die dann reduziert wird, um die Alkylierung (unier Bildung einer entsprechenden Alkylaminogruppe)
wie oben erwähnt zu bewirken, kann diese Reduktion auf katalytische Weise unter Verwendung
von Pd-C oder Pt-C durchgeführt werden, wodurch gleichzeitig die Einführung der Alkylgruppe
und die Entfernung der Benzyioxycarbonyigruppe erzielt werden kann.
Das nach der Entfernung der restlichen Aminoschutzgruppen erhaltene Reaktionsprodukt besteht aus der
erfindungsgemäßen 6'-N-Alkyl-I -N-acyl-Verbindung
und ihren Positionsisomeren einschließlich der 3-N-Acyl- und 3'-N-Acyl-Verbindungen. Die erfindungsgemäße
Verbindung kann aus dem die Isomeren enthaltenden Reaktionsprodukt durch Säulenchromatographie,
beispielsweise unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauschharzes, isoliert werden. Das
Eluat aus der chromatographischen Säule mit wäßrigem Amr.njniak wird in Fraktionen mit jeweils einem
geringen Voluem gesammelt und jede der Fraktionen wird auf ihre antibakterielle Aktivität hin untersucht.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus den vereinigten Fraktionen gewonnen werden, die gegenüber
einem resistenten Stamm eine höhere antibakterielle Aktivität (Wirksamkeit) aufweisen als üblich.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
I I .-Il
6'-N-methylkanamycin A
(a) ö'-N-tert.-Butoxycarbonyl-kanamycin A
(a) ö'-N-tert.-Butoxycarbonyl-kanamycin A
20 g (41,3 mMol) Kanamycin A wurden in 1600 ml einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Triethylamin
(Volumenverhältnis 10:10:1) gelöst, der Lösung wurden
dann 5,9 g (41,3 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 20 Stunden
lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei
erhaltene Feststoff wurde in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung wurde durch eine mit einem Kationenaustauscherharz
gefüllte 1000-ml-Säule geleitet, das im
wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Mischpolymerisat
bestand, um die Butoxycarbonylierungsprodukte an dem Harz zu adsorbieren. Die Säule
wurde dann mit 5000 ml Wasser und 5000 ml 0,05 η
wäßrigem Ammoniak gewaschen, dann mit 3000 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die gegenüber der
Ninhydrinreaktion und der Rydon-Smith-Reaktion positiven
Fraktionen des Eluats und diejenigen Fraktionen, die bei einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese
einen einzelnen Reck ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man
103 g 6'-N-tert--Butoxycarbonylkanamycin in Form eines weißen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von
202 bis 203°C in einer Ausbeute von 45,3% erhielt. Durch weiteres Eluieren mit 0,3 η wäßrigem Ammoniak
erhielt man 7,3 g nicht-umgesetztes Kanamycin A (Rückgewinnung 36,6%).
(b) 3-N, 3"-N-Di-Benzyloxycarbonyl-
l-N-(L-4-benzyloxycarbonylamido-
2-hydroxybutyryl)kanamycin A
1,754 g (3 mMol) ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin
A wurden in einer Mischung aus 12,5 ml Wasser und 12,5 ml Dimethoxyäthan gelöst, dann wurde eine
Lösung von 1,156 g (3,3 mMol) des N-HydOxysuccinimidesters
der L-4-Benzyloxycarbonylamido-2-hydroxybtittersätire
in 25 ml Dimethoxyäthan zugegeben.
ι". Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene
Kondensationsprodukt wurde ohne weitere Reinigung in einer Mischung aus i 2,5 mi Wasser und i 2,5 mi
Aceton gelöst, dazu wurde 1 g (11,9 mMol) Natriumbicarbonat
zugegeben. Die Mischung wurde unter Eiskühlung gerührt, während 1,68 g (9,9 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid
zugetropft wurden. Danach wurde die Mischung I Stunde lang unter Eiskühlurig und weitere
r, 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der dabei
erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen unter Bildung von 3,0 g des
Benzyloxycarbonylierungsproduktes in Form eines weißen Pulvers. Dieses Produkt wurde in 75 ml 90%iger
üi Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wurde I Stunde
lang bei Raumtemperatur stehengelassen, um die tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt zu entfernen.
Die Lösung wurde dann eingeengt, dann wurden 50 ml Diäthyläther zugegeben, um die Ausfällung
ι, zu bewirken. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Diäthyläther gewaschen, Ausbeute 2,87 g, in Form
eines weißen Pulvers.
(c) l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-(||
6'-N-methylkanamycin A
575 mg der in Stufe (b) hergestellten Verbindung
1 ml einer 1 η wäßrigen Natriumhydroxidlösung und
0,25 ml einer 37%igen wäßrigen Formaldehydlösung
ι. zugegeben. 10 Minuten später wurden 222g Natriumborhydrid
zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann
zur Trockne eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 7 ml Wasser zugegeben, und der dabei erhaltene weiße Nie-
•ι derschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen,
wobei 675 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Letzteres wurde in einer Mischung aus 5 ml Essigsäure,
4 m! Methanol und 1 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4,5 Stunden lang in Gegen-
v. wart eines aus 300 mg 5% Pd auf Kohle bestehenden Katalysators Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische
Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und
das Waschwasser wurden miteinander vereinigt und
ι" zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand
wurde in 7 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,8 bis 9,0 eingestellt
und dann durch eine Säule mit 30 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (in der Ammo-
■>> niumform) laufen gelassen. Die Säule wurde mit 200 ml
Wasser und 150 ml OJn wäßrigem Ammoniak gewaschen
und dann mit 150 ml 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 3-ml-Fraktionen gesammelt.
Il
und jede der Fraktionen wurde nach einem üblichen Plattenversuchsverfahren auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten
Stamm Bacillus subtilis PCI 219 und gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Excherichia coli
JR66/W677 getestet. Die Fraktionen (39 ml), die eine höhere antibakterielle Aktivität gegenüber diesen
Stämmen aufwiesen, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 53 mg l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methylkanamycin in
Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 169 bis 173° C, Ausbeute 15% (bezogen auf 6'-N-tert.-Bu
toxycarbony !kanamycin).
l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N äthylkanamycin A
I1Ug aer in Beispiel ι nergesienien veromuung
wurden in 16 ml Methanol gelöst, dann wurden 1,8 ml einer 2 η wäßrigen Acetaldehydlösung zugegeben.
IO Minuten später wurden 444 mg Natriumborhydrid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei
Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt, danach wurden
25 ml Wasser zugegeben. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde «!-«filtriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 804 mg eines weißen Pulvers erhielt.
Das so erhaltene Pulver wurde in einer Mischung aus 6 ml Essigsäure, 4,8 ml Methanol und 1,2 ml Wasser ge löst. In die Lösung wurde 6,5 Stunden lang bei Raum
temperatur in Gegenwart von 400 mg 5% Pd auf Kohle als Katalysator Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde
dann abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat
ίο und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt,
zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in 12 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit wäßrigem
Ammoniak auf pH 9,2 eingestellt und durch eine Säule mit 80 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers
r> (Ammonium-Form) laufen gelassen. Das Harz in der
Säule wurde mit 435 ml Wasser und 384 ml 0,3 η wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 384 ml 03 ti
wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 8-ml-Fraktionen gesammelt und auf die gleiche Weise
-'<> wie in Beispiel I (c) getestet. Die aktiven Fraktionen
(56 ml) wurden miteinander vereinigt und /ur Trockne eingedampft, wobei man 92mg l-N(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-äthylkanamycin
A in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 184 bis
2S I88°C, Ausbeute 13% (bezogen auf 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin).
Claims (1)
1. l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-aIkyIkanamycine A, gekennzeichnet durch die allgemeine
Formel
HO
H,N
HiNCH1CH1CHCOHN
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---|---|---|---|
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