DE2512587B2

DE2512587B2 - 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6' -N-alkylkanamycine A, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel

Info

Publication number: DE2512587B2
Application number: DE2512587A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-03-22
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1979-11-08
Also published as: FR2264556A1; DE2512587A1; GB1499041A; DE2512587C3; JPS5512039B2; FR2264556B1; JPS50140420A

Description

H₂NCH₂CH₂CHCOHn
C)H

L CH₁NHR

in der R Methyl oder Äthyl bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze. 2. Verfahren zur Herstellung der 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycine A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) nur die t -Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert,

B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem aktiven Ester der L^-Amino^-hydroxy-buttersäure, deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist, die von derjenigen verschieden ist, die an der 6'-Aminogruppe von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,

C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktes mit der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxybuttersäure aufweist, blockiert,

D) die ö'-Aminoschutzgruppe aus dem Acylierungsprodukt abspaltet,

E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert

F) die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem Alkylierungsprodukt abspaltet,

die jeweilige Verbindung gemäß Anspruch 1 aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch durch Säulenchromatographie isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

3. Pharmazeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der Verbindungen nach Anspruch 1 oder deren pharmakologisch verträgliche Salze in Kombination mit einem pharmakologisch verträglichen Träger enthalten.

Die Erfindung betrifft l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkyl-kanamycinc A und ihre pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalzc, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel.

Kanamycin A ist ein bekanntes Aminoglycosid-Anlibiotikum. In den letzten Jahren wurden jedoch einige gegen Kanamycin resistente Stämme gefunden und man ist seither bemüht, den Resistenzmechanismus bei diesen gegen Kanamycin resistenten Stämmen zu untersuchen.

Es wurde festgestellt, daß einige Stämme von gramnegativen Bakterien, die den R-Faktor tragen, der Familien Staphylococcus mirctis und l'seudomonas aeruginosa, die bei Patienten isoliert wurden, gegen Kanamycin resistent sind. Bei der genauen Untersuchung des Resistenzmechanismus wurde gefunden.

daß diese resistenten Stämme Phosphotransferasen, welche die 3'-Hydroxylgruppe von Kanamycin phosphorylieren können, eine Nucleotidyltransferase, welche die 2"-Hydroxylgruppe von Kanamycin nucleotidylieren kann, oder Acetyltransferasen, welche die 6'-Aminogruppen von Kanamycin acetylieren können, bilden, so daß diese Transferasen das Kanamycin inaktivieren. Daraufhin wurden die verschiedensten Kanamyeinderivate hergestellt und getestet, um die Beziehung zwischen ihren Strukturen und ihren antibakteriellen Wirksamkeiten zu untersuchen. Dabei ist es gelungen, neue Kanamycinderivatc zu finden, die eine verbesserte antibaktericlle Wirksamkeit (Aktivität) selbst gegenüber den verschiedenen Arten von gegen Kanamycin resistenten Stämmen aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycine A der allge-

meinen Formel

H, N,

l·- OH

0-^,'CH₂NHR

H₂NCH₂CH₂CHCOHn-V
OH

NH,

in der R Methyl oder Äthyl bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.

Beispiele für pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen der oben angegebenen Formel I sind das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Maleai, Fumarat, Succinat. Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat und Äthansulfonat.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-kanamycin A (nachiolgend abgekürzt mit »l-AHB-6'-MKM«) und l-N-(L-4-Anino-2-'ydroxybutyryl)-6'-N-äthylkanamycin A (nachfolgend abgekürzt mit »1-AHB-6'-EKM«) weisen die folgenden Eig nschaften auf:

Die Verbindung l-AHB-6'-MKM liegt in Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 169 bis 173⁰C zersetzt, [α]κ+78° (c=l, in Wasser). Sie entspricht der empirischen Formel C21H45N5OU, wie ihre Elementaranalyse gezeigt hat. Diese Verbindung ergibt bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Silicagel unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform/Methanol/28°/oigem wäßrigem Ammoniak/Wasser (I : 4 : 2 : I. bezogen auf das Volumen) als Entwicklungslösungsmittel bei Rf = 0,13 einen einzelnen Fleck, der positiv gegenüber der Ninhydrin-Reaktion ist.

Der Verbindung 1-AHB-6'-EKM liegt in Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 184 bis I88°C zersetzt, [λ] +80° (c=l, in Wasser). Sie entspricht der empirischen Formel C24H.17N5O1J, wie ihre Elementaranalyse zeigte. Diese Verbindung ergibt bei der TLC an Silicagel unter Verwendung der gleichen 2i Lösungsmittelmischung wie oben bei Rf = 0,20 einen einzelnen Fleck, der gegenüber der Ninhydrin-Reaktion positiv ist.

Die Strukturen dieser Verbindungen wurden durch NMR-Spektroskopie und durch Papierchromatogra-Id phie für die Produ'.üe bestätigt, die 40 Minuten lang bei 100⁰C einer Hydrolyse in 6 η HCI unterworfen wurden. Diese beiden Verbindungen sind beide wenig toxisch, ihr LDy,-Wert beträgt mehr als 200 mg/kg bei intravenöser Verabreichung an Mäusen. Die Verbindungen r, können bei niedrigen Konzentrationen das Wachstum von verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hemmen und sie können daher mit Erfolg zur Behandlung der durch diese Bakterien hervorgerufenen Infektionserkrankungen verwendet werden.

Es wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von l-AHB-6'-MKMund l-AHB-6'-EKM gegenüber verschiedenen Mikroorganismen nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung eines Agaric Nährmediums bei 37°C beslimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle

Untersuchte Mikroorganismen

Staphylococcus aurcus FDA209I'
Mycobaclcrium smegrmilis ATCC607
Iischerichia coli K-12
lischerichia coli K-12 R5
lisehcrichia coli K-12 MLI629
lischerichia coli K-12 ML1630
rischcrichia coli K-12 MLI410
lischerichia coli LA29O R55
lischerichia coli LA 290 R56
lischerichia coli LA290 R64

MIC Hg/ml)
Ι-Λ1ΙΙ1-ί.'-ΜΚΜ

l-AIIH-ft'-liKM

0,78	1,56
0.39	3,12
0,39	1.56
0,78	1,56
0,78	3.12
1,56	6,25
1.56	3,12
1,56	3,12
0,78	1.56
0.78	1,56

UniersuL'htc Mikroorganismen

Ι-ΛΙΙΗ-ft'-MKM

1-,UIIW-IiKM

Escherichia coli W677
Escherichia coli JR66/W677
KJebsiella pneumoniae PCI 602
RJebsiella pneumoniae 22-3038
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonas aeruginosa No. 12
PseudomGnas aeruginosa TI-13
Pseudomonas aeruginosa GN315
Pseudomonas aeruginosa 99

1,56	I
6,25	25
0,78	1
6,25	25
6,25	25
3,12	25
12,5	50
50	100
12.5	100

,56

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegenüber den 6'-N-Acetyltransferase bildenden Stämmen, wie z.B. Escherichia coli K-12 R5 und Pseudomonas aeruginosa GN315, aktiver (wirksamer) als die in der US-Patentschrift 37 81268 beschriebene verwandte Verbindung 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)kanamycin. Es wurde auch gefunden, daß diese Verbindungen durch eine durch Pseudomonas aeruginosa GN 315 gebildete 6'-N-Acetyltransferase im wesentlichen nicht acetyliert werden. Eine andere verwandte Verbindung, das in der britischen Patentschrift 13 84 221 beschriebene 6'-N-Methylkanamycin, ist nicht in der Lage, das Wachstum der gegen Kanamycin resistentcn Stämme, wie z.B. Escherichia coli K-12 ML 1629. K-12 ML 1630 und JR66/W677, Klebsieila pneumoniae 22-3038, Pseudomonas acmginosa Tl-13 und GN315. die 3'-Phosphotransferasen und 2"-Nucleotidyltransferasen bilden, zu hemmen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Behandlung von verschiedenen Infektionen, die du.ch Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hervorgerufen werden, oral oder parenteral, beispielsweise durch intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind höchst wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen, wenn sie parenteral verabreicht werden. Sie eignen sich auch für die Sterilisierung des Körperinnern (der Eingeweide) durch orale Verabreichung und für die chirurgische Sterilisation durch mechanische Reinigung.

Es wurde gefunden, daß sie bei subkutaner Verabreichung in einer Dosis von mehr als 2 mg/kg gegenüber bei Mäusen durch Styphylococcus aureus Smith und Klebsiella pneumoniae S-1802 künstlich hervorgerufenen Infektionen wirksam sind.

Für die parenterale Verabreichung können sie in üblichen Dosierungsformen, beispielsweise in Form sterilisierter wäßriger Lösungen und physiologischer Kochsalzlösungen, verwendet werden. Bei der parenteralen Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 200 bis 2000mg, die in 2 bis 4 Teildosen pro Tag verabreicht werden kann.

Für die orale Verabreichung können sie in konventionellen, bekannten Dosierungsformen verwendet werden, beisiielswcisc in Form von Pulvern. Kapseln.

Tabletten, Suppositorien und Sirupen. Bei der oralen Verabreichung an Menschen liegt die 'ägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 500 bis 2500 mg.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der oben angegebenen Formel I können nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) nur die 6'-Aminogruppc mit einer Aminoschutzgruppe blockiert.

B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem aktiven Ester der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure. deren Aminogruppc mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist. die von derjenigen verschieden ist. die an der 6'-Aminogruppe von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,

C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktes mit der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxy-buttcrsäure aufweist, blockiert.

D) die 6'-Aminoschutzgruppc aus dem Acylierungsprodukt abspaltet.

E) die freie o'-Aminogruppc des dabei erhaltenen Produktes alkylieri.

F) die restlichen Aminogruppen am dem Alkylierungsprodukt abspaltet.

die jeweilige Verbindung der oben angegebenen Formel I aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch durch Säulenchromalographie isoliert und gegebenenfalls in ein Säurcadditionssalz überführt.

Geeignete Beispiele für Aminoschutzgruppen. ihre Einführung und Entfernung sind in dem Artikel von Y. WoIi.lan »The Chemistry of Amino Group«. Seiten 669 bis 700 in der Interscicncc Publishers, 1908. und von Y. W. Barton »Protective Group in Organic Chemistry«. Seiten 43 bis 94. Plenum Press. 1973, beschrieben.

Bei uer praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nur die ö'-Aminogruppe des Kanamycins, die unter den vier vc:handenen Aminogruppen die reaktionsfähigste ist, mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert und das auf diese Weise gebildete blockierte Derivat wird dann mit einem Derivat der L-4-Amino-2-hydroxy-buticrsäure mit geschützter Aminogruppc oder einem funktionellen Äquivalent davon acyliert unter Bildung des gewünschten 1-N-monoacyliertcn Derivats und der beiden mono· atvlicrten Derivate als Nebenprodukt. Ohne diese drei

monoacyliertcn Derivate (F'ositionsisomere) voneinander zu trennen, werden die restlichen freien Aminogruppen jedes dieser Derivate mit üblichen, bekannten Aminoschutzgruppen blockiert, die jedoch von der zum Blockieren der 6'-Aminogruppe verwendeten verschieden sind. Anschließend wird nur die b'-Aminoschutzgruppe selektiv aus den Derivaten entfernt, danach wird alkyliert unter Bildung des b'-NAlkylierungsproduktes. aus dem die restlichen Aminoschutzgruppen dann entfernt werden. Aus der Reaktionsmischung. welche die so gebildeten l'ositionsisomcrcn enthält, können die erfindungsgemäßen l-N-(l.-4-Ami-INI-2-hydroxy-buKr\l)-6'-N-alkylkanamvcine A bequem isoliert werden, beispielsweise inner Anwendung eines chromatographisehen Verfahrens, wie es nachfolgend niiher beschrieben wird.

liei den oben in Verbindung mit dem erfindiirigsgi_'i(i<n.R'ir VL^-IIiIIi(LTi L'i v^ ä ίι π ten A ininoschut/gt'uppcn kann es sich um solche handeln, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Peptidcn verwendet werden, und sie können auf übliche Weise eingeführt werden, obgleich es bevorzugt ist. solche '\niinoschutzgruppen zu verwenden, die mit einer guten Reaktionsausbeute gegebenenfalls leicht entfernt werden können.

Beispiele für Aminoschutzgruppen die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind eine Λ Ik vlo\ ν carbon ν !gruppe, wie Äthoxycarbonvl. tcrt.-Butoxycarbonv I Lind tert.-Aniyloxycarbonyl: eine Cycloalkyloxycarbonylgruppc. w ie Cyclopentyloxycarbon ν I und Cv clohcx ν low carbonyl; und eine Aralkvloxvcarbonylgruppe. wie Benzyloxyearbonyl und p-Nitrobenzvloxyearbonvl. /ur Herstellung von blockierten Derivaten in form einer Schiffschen Base kann eine divalentc Aminoschiiiz.gruppe. z. B. Salicylidengruppe. verwendet werden. Vorzugsweise werden 2 oder mehr verschiedene Aminoschutzgruppen verwendet, die selektiv und unabhängig voneinander im Verlaufe von verschiedenen Reaktionen entlernt worden können.

In bezug auf die Schutzgruppe die zum Blockieren der 6-Aminogruppc von Kanamycin verwendet wird, ist es höchst zweckmäßig, eine tert.-Butoxycarbonvlgruppe zu verwenden, die vorzugsweise gegenüber der b'-Aminogruppe reaktiv ist und gegebenenfalls leicht entfernt werden kann. Wenn die 6-Aminogruppe beispielsweise mit der tert.-Butoxycarbonvlgruppe blockiert werden sol!, wird das Kanamycin in einer Mischung aus Pvridin. Wasser und Triäthylamin gelöst, dann werden 1 bis 3 Mol tert.-Butoxvcarbonvlazid unter Rühren zugetropft. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Rückstand wird durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines üblichen Kationenaustauscherharzes gereinigt, wobei man das e'-N-tert.-Butoxycarbonylkanarnycin in einer guten Ausbeute erhält, wenn das nicht-umgese'zte Kanamycin für die erneute Verwendung zurückgewonnen werden kann.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zum Acylieren der 1-Aminogruppe des Kanamycins verwendete L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder ein funktioneües Derivat davon zweckmäßig in einer solchen form vorliegen, daß die 4-Aminogruppe des Acylierungsmittels mit einer geeigneten Schutzgruppe blockiert ist. bei der es sich um irgendeine der oben erwähnten Aminoschutzgruppen > handeln kann. Wenn die Hydroxyaminosäure mit b'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin umgesetzt werden soll, wird die Aminoschutzgruppe der Hydroxyaminosäurc vorzugsweise mit einer Schutzgruppe, beispielsweise einer Benzyloxycarbonylgruppe, blockiert, die bei der Entfernung der b'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Butoxycarbonylkanamycin nicht freigesetzt , wird. Die Acylierung der I-Aminogruppe von Kanamycin mit dem L-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Rest kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie es üblicherweise bei der Synthese von Amiden angewendet wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der zuerst das b'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin hergestellt wird, kann das Acylierungsmittel vorzugsweise in einer solchen Form verwendet werden, die mit der I -Aminogrtippe des b'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamy· . ein mit hoher Selektivität reagiert, z. B. in Form eines aktiven f-stcrs der l.-4-Amino-2-hvdi()xybuttersäure. Der aktive Ester kann nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Umsetzung der Ι.-4-Amino-hydroxybuttersäure. in welcher die Aminogruppc mit einer Benzyloxycarbonylgruppe blockiert worden ist. mit N-Ilydroxysuccirimid in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Dimethylformamid. Aceton oder Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines Dehvdratisierungsmitlels. wie Dicvclohcxylcarbodiimid. 0.5 bis 3 Moi des so hergestellten aktiven Esters können mit b-N-tcrt.-Butoxycarbonylkanamycin in einen, wäßrigen organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyäthan. umgesetzt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Acylierungsprodukt besteht überwiegend aus der gewünschten 1-N-acylierien Verbindung und zu einem geringeren Anteil aus den 3-N-acylierten und 3 '-N-acyliertcn Verbindungen als Nebenprodukt. Diese Verbindungen brauchen für die Verwendung in der ■ nachfolgenden Stufe nicht voneinander getrennt zu werden, in der alle in dem Acylierungsprodukt vorhandenen restlichen freien Aminogruppen mit geeigneten Aminoschutzgruppen. die bei der Entfernung der b'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe nicht freigesetzt werden, und vorzugsweise mit den gleichen Aminoschutzgruppen. wie sie zum Blockieren der L-4-Amino-2-hvdioxybuttersäurc verwendet worden sind. z. B. der Benzyloxycarbonylgruppe. blockiert werden. Die Blokkierung der Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden und im allgemeinen wird sie durch Umsetzung mit Benzyloxycarbonyichlorid unter basischen Bedingungen in Wasser oder in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel durchgeführt.

Das auf diese Weise erhaltene Benzyloxycarbonylierungsprodukt kann mit einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure. Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure behandelt werden, um nur die ö'-N-tert-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt selektiv zu entfernen. Das dabei erhaltene Produkt, in dem die 6'-Aminogruppe nicht mehr blockiert ist, wird einer b'-Alky!ierung unterworfen, wobei das gewünschte aminoblockierte Derivat erhalten wird. Die Alkylierung kann auf irgendeine bekannte, übliche Art und Weise durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise durchgeführt durch Umsetzung der 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen wie die Alkylgruppe, die eingeführt werden soll. d. h. mit Formaldehyd oder Acetaldehyd, um die Aminogruppe in die Form der Schiffschen Base umzuwandeln, woran sich die normale katalytische Reduktion oder die Reduktion mit Natriumborhydrid anschließt, um sie in die 6'-N-Alkyiaminogruppe zu Oberführen.

Die Aminoschutzgruppen in dem die I-N-Acyl-6'-N-alkylgruppe aufweisenden Produkt, welches das letzte Zwischenprodukt in dem erfindungsgemäßen Verfahren darstellt, können auf übliche Weise daraus entfernt werden. Wenn beispielsweise die Aminoschutzgruppe eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, kann sie nach e^:..-;m üblichen Verfahren, beispielsweise durch katiilytische Reduktion oder durch Behandlung mit Bromwasserstoff/Essigsäure, leicht entfernt werden. Bei cin^r bevorzugten Ausführungsform c'is crfindungsgcmäßen Verfahrens, bei der die 6'-Aminogriippe mit einem Aklehyd umgesetzt wird unter Bildung einer SchiffsL'hi.'ii Hase, die dann reduziert wird, um die Alkylierung (unter Bildung einer entsprechenden Alkslaminogruppe) wie oben erwähnt zu bewirken, kann diese Reduktion auf katiilytische Weise unter Verwendung von Pd-C oder Pl-C durchgeführt werden.

und die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe erzielt werden kann.

Das nach der Entfernung der restliehen Aminoschutzgruppen erhaltene Reaktionsprodukt besteht iuis der erfindungsgemäßen 6'-N-Alkyl-1 -N-acyl-Verbindung und ihren Positionsisomeren einschließlich der 3-N-Acyl- und 3"-N-Acyl-Verbindungen. Die erfindungsgemäßc Verbindung kann aus dem die Isomeren enthaltenden Reaktionsprodukt durch Säulenchromatographie, beispielsweise unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauschharzes. isoliert werden. Das F.jat aus der chromatographischen Säule mit wäßrigem Ammoniak wird in Fraktionen mit jeweils einem geringen Voluem gesammelt und jede der Fraktionen wird auf ihre antibakterielle Aktivität hin untersucht. Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus den vereinigten Fraktionen gewonnen werden, die gegenüber einem resistenten Stamm eine höhere antibakterielle Aktivität (Wirksamkeit) aufweisen als üblich.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von l-N-(L-4-Aniino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methylkanamycin A

(a) b'-N-tert.-Butoxycarbonyl-kanamycin A

20 g (41.3 mMol) Kanamycin A wurden in 1600 ml einer Mischung aus Pyridin. Wasser und Triäthylamin (Volumenverhältnis 10:10:1) gelöst, der Lösung wurden dann 5.9 g (41.3 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Feststoff wurde in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung wurde durch eine mit einem Kationenaustauscherharz gefüllte 1000-ml-Säule geleitet, das im wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Mischpolymerisat bestand, um die Butoxycarbonylierungsprodukte an dem Harz zu adsorbieren. Die Säule wurde dann mit 5000 ml Wasser und 5000 ml 0,05 η wäßrigem Ammoniak gewaschen, dann mit 3000 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die gegenüber der Ninhydrinreaktion und der Rydon-Smith-Reaktion positiven Fraktionen des Eluats und diejenigen Fraktionen, die bei einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese einen einzelnen Fleck ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 10,9 g e'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin in Form eines weißen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 202 bis 203"C in einer Ausbeute von 45,3% erhielt. Durch weiteres Eluieren mit 0,3 η wäßrigem Ammoniak erhielt man 7,3 g nicht-umgesetztes Kanamycin A (Rückgewinnung 36,6%).

(b) 3-N, 3"-N-Di-Benzyloxycarbonyl-

l-N-(L-4-benzyloxycarbonylamido-

2hydroxybutyryl)kanamycin A

1,754 g (3 mMol) ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanatnycin A wurden in einer Mischung aus 12,5 ml Wasser und 12.5 ml Dimcthoxyiithan gelöst, dann wurde eine Lösung von 1,1 56 g (i,i mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der I.^-Benzyloxycarbonylamido^-hydroxybuttersäure in 25 ml Dimethoxyäthan zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene

in einer Mischung aus 12.5 ml Wasser und 12,5 rnl

J" Aceton gelöst, dazu wurde 1 g (11.9 mMol) Natriumbicarbonat zugegeben. Die Mischung wurde unter Eiskühlung gerührt, während 1,68 g (9.9 mMol) Benzvloxycarbonylchlorid zugetropft wurden. Danach wurde die Mischung I Stunde lang unter Hiskühlung und weitere

.'■. 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen unter Bildung von 3.0 g des Benzyloxycarbonylierungsproduktes in Form eines weißen Pulvers. Dieses Produkt wurde in 75 ml 90%iger

in Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen, um die tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt zu entfernen. Die Lösung wurde dann eingeengt, dann wurden 50 ml Diäthyläther zugegeben, um die Ausfällung

r. zu bewirken. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Diäthyläther gewaschen, Ausbeute 2,87 g. in Form eines weißen Pulvers.

(c) l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)·
6'-N-methylkanamycin A

575 mg der in Stufe (b) hergestellten Verbindung wurden in 8 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden I ml einer 1 η wäßrigen Natriumhydroxidlösung und 0.25 ml einer 37%igen wäßrigen Formaldehydlösung

i> zugegeben. 10 Minuten später wurden 222g Natriumborhydrid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zur Trockne eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 7 ml Wasser zugegeben, und der dabei erhaltene weiße Nie-

iii derschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 675 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Letzteres wurde in einer Mischung aus 5 ml Essigsäure, 4 ml Methanol und 1 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4,5 Stunden lang in Gegen-

ri wart eines aus 300 mg 5% Pd auf Kohle bestehenden Katalysators Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt und

W) zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 7 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,8 bis 9,0 eingestellt und dann durch eine Säule mit 30 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (in der Ammo-

to niumform) laufen gelassen. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser und 150 ml 0,3 η wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 150 ml 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 3-ml-Fraktionen gesammelt,

Il

und jede der Fraktionen wurde nach einem üblichen Plattenversuchsvcrfahrcn auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Bacillus subtilis PCI 219 und gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Excherichia coli IR66/W677 getestet. Die Fraktionen (39 ml), die eine höhere antibaKterielle Aktivität gegenüber diesen Stämmen aufwiesen, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 53mg l-N-(L-4-A mino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methy !kanamycin in Form eines weißen Pulvers erhielt. Zersct/ungspunkt 169 bis 173C, Ausbeute 15% (bezogen auf b'-N-tert,-IJ Litox year bony !kanamycin).

I! e i s ρ i e I 2

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-b'-N-äthylkanamycin A

1.13 g der in Heispiel I hergestellten Verbindung wurden in Ib ml Methanol gelöst, dann wurden 1.8 m! einer 2 η wäßrigen Acetaldchydlösung zugegeben. IO Minuten später wurden 444 mg Natriumborhydrid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt, danach wurden 25 ml Wasser zugegeben. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 804 mg eines weißen Pulvers erhielt. Das so erhaltene Pulver wurde in einer Mischung aus 6 ml Essigsäure. 4,8 ml Methanol und 1,2 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde 6,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 400 mg 5% Pd auf Kohle als Katalysator Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde dann abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden miteinander vereinig!, zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in 12 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf pH 9,2 eingestellt und durch eine Säule mit 80 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (Ammonium-Form) laufen gelassen. Das Harz in de: Säule wurde mit 435 ml Wasser und 384 ml 0,3 n wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 384 ml 0,5 η Vv ti iji'igCiVi /AmnlOniciK Ci'üCri. υϊΪΛ Lliiiut °*Vii~ijC iil 8-ml-Fraktionen gesammelt und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (c) getestet. Die aktiven Fraktionen (5b ml) wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei man 92mg l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-äthylkanamycin A in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 184 bis 188 C Ausbeute 13% (bezogen auf ö'-N-tcrt.-Butoxycarbony I kanamycin).

Claims

Patentansprüche:

1. I-N-(L-4-Amiiuv2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkiinamycine A, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

HO —

HO /Γ' ΗΟ-ί—K/