DE2543535C3

DE2543535C3 - 1 -N-(a-Hydroxy-co-aminoalkanoyl) -6'-N-methyl-3',4'-didesoxy-kanamycine B, deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze, Verfahren zur Herstellung derselben und Arzneimittel

Info

Publication number: DE2543535C3
Application number: DE2543535A
Authority: DE
Inventors: Shinji Yokokama Kanagawa Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa; Sumio Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-10-08
Filing date: 1975-09-30
Publication date: 1978-06-01
Also published as: NL7511662A; CH615685A5; CA1050537A; HU173702B; YU253075A; GB1475481A; AU8518975A; BE834236A; NL181503B; FR2287233A1; SE7511229L; YU39659B; LU73533A1; ZA756291B; JPS5653558B2; DE2543535B2; IE42354L; NL181503C; DE2543535A1; IE42354B1

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen antibakterielle Wirksamkeit auf gegenüber verschiedenen gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich der resistenten Stämme dieser Bakterien.

Die Kanamycine A und B sind bekannte Aminoglykosid-Antibiotika, die als chemotherapeutische Mittel weite Verbreitung gefunden haben. In den letzten Jahren sind jedoch viele kanamycin-resistente Stämme von Bakterien aufgetreten. So hat sich beispielsweise gezeigt, daß einige, den R-Faktor tragende Stämme der gramnegativen Bakterien Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, die aus Patienten isoliert worden sind, gegenüber der bakteriellen Wirkung des Kanamycins restitent sind. Der Mechanismus der Resistenz dieser kanamycinresistenten Bakterien gegenüber bekannten Aminoglykosid-Antibiotika ist von H. U m e ζ a w a et al. (»Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry«, Bd. 30, Seiten 183-225, 1974, Academic Press) untersucht worden. Dabei konnte festgestellt werden, daß einige kanamycon-resistente Bakterien Enzyme produzieren, die die Fähigkeit besitzen, die 3'-Hydroxylgruppe der Kanamycine zu phosphorylieren und die Kanamycine mit Hilfe didser 3'-Phosphotransferasen zu inaktivieren; andere kanamycin-resistente Bakterien erzeugen ein Enzym, welches die Eigenschaft besitzt, die 2"-Hydroxylgruppe der Kanamycine zu nucleotidylieren und über die 2"-Nucleotidyltransferase die Kanamycine zu inaktivieren;

(.<, wieder andere kanamycin-resistente Bakterien erzeugen Enzyme, die die Fähigkeit besitzen, die 6'-Aminogruppe der Kanamycine zu acetylieren und die Kanamycine mittels der 6'-Acetyltransferasen zu

inaktivieren. Auf diese Weise konnte der Zusammenhang zwischen der Molekularstruktur der Aminoglykosid-Antibiotika und ihrer antibakteriellen Wirkung wie auch der biochemische Mechanismus der Resistenz der kanamycin-resitenten Bakterien gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika aufgeklärt werden.

Es sind bereits mehrere halbsynthetische Derivate des Kanamycins, die auch gegenüber kanamycin-resistenten Bakterien eine Wirkung aufweisen, aus den Stammkanamycinen synthetisiert worden. Dabei handelt es sich ι ο beispielsweise um folgende:

3',4'-Didesoxykanamycin B(US-PS 37 53 973);
6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycinB

(GB-PS 13 84 221);

1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A ^lri und

-kanamycin B(US-PS 37 81 268),
l-N-(ii-Hydroxy-ß)-amino-alkanoyl)-3',4'-didesoxykanamycin B (DT-OS 23 50 169.

Diese halbsynthetischen Kanamycinderivate sind gegenüber einigen kanamycin-resistenten Bakterien wirksam.

Gemäß der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe sollten neue und wertvolle Derivate des 3\4'-Didesoxykanamycin B hergestellt werden, die nicht nur gegen gramnegative und grampositive Bakterien, die auf Kanamycine ansprechen, sondern auch gegen kanamycyn-resistente Bakterien wirksam sind. Erfindungsgemäß konnte festgestellt werden, daß durch selektive Acylierung der 1-Aminogruppe von 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B mit einer der den in Anspruch 1 unter a) bis d) angegebenen Acylresten zugrundeliegenden «-Hydroxy-to-aminocarbonsäure neue und wertvolle Derivate des Kanamycins is B hergestellt werden können, die ein breiies antibakterielles Wirkungsspektrum gegen gramnegative und grampositive Bakterien, die auf Kanamycine ansprechen, wie auch gegen kanamycin-resistente Bakterien aufweisen.

Die erfindungsgemäßen neuen Derivate des Kanamycins B sind auch gegen die kanamycin-resistenten Bakterien, die die eingangs erwähnten inaktivierend wirkenden Enzyme produzieren, wirksam. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Derivate de:s Kanamycins B aus 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B ist in einfacher Weise durchführbar und liefert das gewünschte Produkt in guter Ausbeute.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nachfolgend aufgeführt:

(a) 1 -N^DL^-Hydroxy-S-aminopropionylJ-e'-N-me-

thyl-3',4'-didesoxy-kanamycin B,

(b) 1 -N-(L-2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-6'-N-

methyl-3',4'-didesoxy-kanamycin B,

(c) l-N-(L-2-Hydroxy-4-aminobutyryl)-6'-N-methyl- ss

3',4'-didesoxykanamycin B,

(d) 1 -N-(L-2-Hydroxy-5-aminovaleroyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxykanamycin B.

Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Säureanlagerungsalze der vorstehenden Verbindungen sind die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Carbonate, Acetate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Methansulfonate, Äthansulfonate, Ascorbate, wobei es sich um die Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentasalze handeln kann, die durch Umsetzung von 1 Mol der neuen Verbindung mit 1 —5 Mol einer entsprechenden Säure gebildet werden.

Die physikalisch-chemischen Kennzahlen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle 2 zusammengestellt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Anspruch 1 zeichnen sich dadurch aus, daß sie in keiner Weise für die enzymatischsn Inaktivierungsreaktionen durch die eingangs erwähnten verschiedenen Enzyme, die die Stammkanamycine A und Kanamycin B inaktivieren, anfällig sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden weder durch 6'-Acetyltransferasen inaktiviert, weil die 6'-Aminogruppe in den erfindungsgemäßen neuen Derivaten methyliert ist, noch durch 2"-Nucleotidyltransferase noch durch 3'-Phosphotransferase inaktiviert, weil die 1-Aminogruppe der erfindungsgemäßen Derivate durch die «Hydroxy-w-amino-acylgruppe acyliert ist, noch unterliegen sie eine: Inaktivierung durch irgendeine andere Art von 3'-Phosphotransferase, weil die 3'- und 4'-HydroxyIgruppen, die ursprünglich in der Stammverbindung Kanamycin B vorhanden sind, in den erfindungsgemäßen Derivaten nicht vorliegen. Die erfindungsgemäßen Derivate sind den bisher bekannten Derivaten infolgedessen weit überlegen, da sie eine starke antibakterielle Wirkung nicht nur gegenüber den verschiedenen Arten von gramnegativen und grampositiven Bakterien, die für Kanamycin empfindlich sind, sondern auch gegenüber den kanamycin-resistenten Stämmen dieser Bakterien, insbesondere gegen die kanamycin-resistenten Stämme Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa aufweisen.

Die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) der Verbindungen la, Ib, Ic und Id gegen verschiedene Organismen wurde nach der seriellen Verdünnungsmethode unter Verwendung von Nähragar als Medium bei 37⁰C bestimmt, wobei die Beurteilung nach achtzehnstündiger Bebrütung erfolgte. Zum Vergleich wurden auch die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A (abgekürzt AHB-KMA) und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyry!)-kanamycin B (abgekürzt AHB-KMB) in derselben Weise bestimmt; diese letztgenannten Verbindungen sind aus der US-PS 37 81 268 bekannt.

Die antibakteriellen Wirkungsspektren der genannten Verbindungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle

Test-Organismen

Staphylococcus aurcus Smith
Staphylococcus aureus 1-'I)A 2091'
Staphylococcus aureus I crajima

Mindesthemmkonzentrationen von (mcg/ml)

Li lh lc Id

AIIU-KMA AHB-KMB

<0,20	<0,20	<(),20	<(),20	<(),20	<0,20
0,7K	< 0,2(1	0,78	0,39	0,39	0,78
<0.20	<().2O	<0.20	<0.20	<0.20	0.20

Tcst-Orgunismen

Mindeslhemmkon/enlra'ioncn ion (πκμ/ηιΐι
Iu lh Il !,j

AHIi-KM ·\ MIH-K MIi

Sarcina lutea F¹Cl KXJl
Bacillus anthracis
Bacillui subtilis PCI 214
Bacillus subtilis NRRL B-558
Bacillus cereus ATCC 10702
Coryncbactetium bovis 1810
Mycobactcrium smegmatis ATCC 607 Shigclla dysenteriac JS 11910
Shigella flexneri 4b JS 11811
Shigclla sonnei JS 11746
Salmonella typhosa T-63
Salmonella enteritidis 1891
Proteus vulgaris OX 19
Klebsiella pneumoniae PCI 602
Klcbsiclla pnei.noniae 22 #3038 Hscherichia coli NIHJ
Hscherichia coli K-12
lischerichia coli K-12 R5
Hscherichia coli K-12 ML 1629
Hscherichia coli K-I? ML 1630
Escherichia coli K-12 ML 1410
Escherichia coli K-12 ML 1410 R81 Escherichia coli LA 290 R55
Escherichia coli LA 290 R56
lischerichia coli LA 290 R64
Hscherichia coli W677
Escherichia coli JR66/W677
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonas aeruginosa No. 12
Pseudomonas aeruginosa TI-13
Pseudomonas aeruginosa GN315 Pseudomonas aeruginosa 99

6,25	3.13	3.13	12.5	3.13	3.13
<0,20	< (),2i ι	«Ό.20	< 0.20	"0.20	••"(.1.20
< 0.20	<(l,20	<().2()	<0.20	^ 0.20	''i 1.20
<0,20	-Ό.20	< 0.2(1	<(i.20	-"0.20	^ 0.20
3.13	1,56	3.13	1.56	0.7S	1.56
3,13	0.78	3.13	6.25	0.78	D.39
0,39	0.3·:	0.2(1	(!.78	•''(1.20	0.78
6.25	3,13	3.i3	3.13	-i. 1 .·>	3.13
3,13	1.56	3.13	3.13	3.13	3.13
3,13	3.13	6.25	3.13	1.56	1.56
1,56	0.39	3.13	0.78	0.39	0.39
3,13	(1.78	1.56	0.78	(1.78	3.i3
1,56	(1.78	1.56	0.78	0.78	1.56
1,56	0,78	0.78	0.78	0.39	0.39
3,13	1,56	3.13	3.13	1.56	6.25
1,56	1,56	1.56	I)."S	0.⁷8	Ί.78
1,56	,1.78	0.78	0.78	(1.78	0.78
3,13	1.56	1.56	1.56	0,39	0.78
1.5b	1.56	1.56	0.78	0.78	! .56
3.13	1,56	0.7X	1.56	0.78	1.56
3,13	1,56	1.56	1.56	0.78	3.13
3,13	1,56	1.56	1,56	1,56	1.56
3,13	1.56	0.78	0.78	0.78	1.56
0,78	0,78	0.78	0.39	0.34	0.39
0,78	0,39	0,78	0.39	0.39	0.39
1,56	0,78	0,78	0.78	<0.20	0.39
3,13	1,56	3.13	1,56	1,56	3,13
3,13	3.13	3,13	3.13	3.13	6.25
6,25	25	3,13	25	3.13	6.25
12,5	6,25	6,25	6,25	3.13	6.25
12,5	25	6.25	12,5	100	50
25	25	25	25	6.25	25

Die Verbindungen gemäß Anspruch 1 besitzen für Tiere und Menschen nur eine geringe Toxizität, denn ihr LDso-Wert beträgt bei intravenöser Injektion bei Mäusen mehr als 100 mg/kg. Wegen ihrer bereits mehrfach erwähnten starken antibakteriellen Wirkung sowohl gegen gramnegative als auch gegen grampositive Bakterien, die gegenüber Kanamyrinen ansprechen, als auch gegenüber kanamyein-resistenten Stämmen, sind die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen in hervorragender Weise zur therapeutischen Behandlung von durch solche gramnegativen und grampositiven Bakterien hervorgerufenen Infektionen geeignet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden, wobei alle beliebigen bekannten pharmazeutischen Verabreichungsformen verwendet werden können. Für die orale Verabreichung der Verbindungen eignen sich beispielsweise Pulver, Kapseln, Tabletten, Sirupe. Eine ausreichende Dosis zur wirksamen Behandlung bakterieller Infektionen liegt beispielsweise bei 0,25—2 g pro Person und Tag, wenn die Verabreichung oral erfolgt. Vorzugsweise erfolgt die orale Verabreichung in drei oder vier gleichen Teilmengen pro Tag. Die (.rfindungsgemäßen Verbindungen können auch durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden, und zwar in einer Dosis von 50—500 mg pro Person, die in zwei bis vier Einzeldosen pro Tag aufgeteilt wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Salben für die äußere Anwendung eingearbeitet werden, die dann die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 0,5 — 5 Gewichtsprozent in einer bekannten Salbengrundlage, wie Polyäthylenglykol. enthalten.
Die erfindungsgemaßen Verbindungen werden aus

6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B

(H₂OI!

HO V (I

H-N ·,

OH /\
°H,N

ILN- 7

'■: O

V NH,

/ CM₂NIIC H,

hergestellt, indem die 6'-Melhylaminogruppe und gegebenenfalls die 2'-Aminogruppe durch eine Schutzgruppe blockiert werden, während die anderen Aminogruppen unverändert bleiben. Die Herstellung eines solchen Derivates aus der genannten Ausgangsverbindung ist einfach, weil die o'^Yicthylamiriogruppe und die 2'-Aminogruppe die reaktivsten unter den Aminogruppen der Ausgangsverbindung sind und infolgedessen vorzugsweise blockiert werden, während die anderen Aminogruppen unblockiert bleiben. Da die Reaktivität der 2'-Aminogruppe etwas geringer ist als die der β'-Methylaminogruppe, aber höher ist als die der 1-, 3- und 3"-Aminogruppen, wird die 2'-Aminogruppe gegebenenfalls auch blockiert.

Bevorzugt wird als Aminoschutzgruppe die t-Butoxycarbonylgruppe, weil diese die Fähigkeit besitzt, in erster Linie mit der 6'-Methylaminogruppe und nur in geringem Maße mit der 2'-Aminogruppe von 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B zu reagieren und sich außerdem leicht aus dem Acrylierungsprodukt abspalten läßt.

Das 2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxykanamycin B, welches vorzugsweise als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren benutzt wird, läßt sich beispielsweise in hoher Ausbeute herstellen, wenn man 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B in Lösung in einem Gemisch aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin mit der zwei- bis dreifachen Molmenge t-Butoxycarbonylazid tropfenweise unter Rühren versetzt, die die entstandene Mischung bei Umgebungstemperatur über Nacht rührt, das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne einengt und den verbleibenden festen Rückstand durch Säulenchromatographie reinigt; andererseits ist es auch möglich, 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B in Form einer wäßrigen Lösung mit der zwei- bis dreifachen Molmenge t-Butyl-S-(4,6-dimethyl-pyrimid-2-yl)-thiocarbonat unter Rühren zu versetzen, das Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur fortzusetzen, das Reaktionsgemisch dann im Vakuum zur Trockne einzuengen und den verbleibenden festen Rückstand wiederum durch Säulenchromatographie zu reinigen. Die Reinigung des festen Rückstandes durch Säulenchromatographie kann unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes durchgeführt werden; beispielsweise eignet sich zu diesem Zweck ein Copolymer der Methacrylsäure mit DivinylbenzoL Der gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnene fest Rückstand besteht aus dem gewünschten 2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-6'-N-methyl-3',4'-Didesoxykanamycin und 6'-N-{t-Butoxycarbonyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxykanamycin B und kann direkt als Ausgangsmaterial für die Acylierung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Zwecks Einführung des «-Hydroxy-w-aminoalkanoyl-restes wird das genannte 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin-B-Derivat mit der jeweiligen «-Hydroxy-ω-aminocarbonsäure in der für die Herstellung von Amiden üblichen Weise umgesetzt, z. B. in Lösung in wäßrigem Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran unter Eiskühlung und in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid. is Die jeweilige «-Hydroxy-tj-aminocarbonsäure wird vorzugsweise zunächst mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zu einem aktiven Ester der allgemeinen Formel

O

[ "Ν —Ο
\ C-CH-(C

(CH₂ )„■-NH--Boc

O OH

umgesetzt, der dann seinerseits mit dem in Anspruch 2

,o genannten Kanamycin-B-Derivat zur N-Acylierung der letztgenannten umgesetzt wird. Vorzugsweise setzt man mit der 0,5- bis 3fachen Molmenge, noch besser mit der 0,5- bis l,5fachen Molmenge des vorstehenden aktiven Esters um, und zwar in einem Reaktionsmedium.

3s welches aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyäthan, besteht.

In der Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet sich ein Gemisch von N-acylierten Derivaten; dieses Gemisch besteht im allgemeinen aus dem erwünschten 1-N-mono-acylierten Derivat sowie den übrigen unerwünschten mono-N-acylierten Derivaten und den unerwünschten poly-N-acylierten Derivaten. Dieses Gemisch der N-acylierten Derivate kann dann direkt zwecks Abspaltung der tert.-Butoxycarbo-

₄s nyl-Aminoschutzgruppen umgesetzt werden, indem man das Gemisch der N-acylierten Derivate einer milden Hydroiyse mit einer Säure wie wäßriger Trifluoressigsäure. wäßriger Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure unterwirft.

so Nach der Entfernung der Aminoschutzgruppen liegt ein Gemisch verschieden N-acylierter Produkte vor, die sich vom 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B ableiten, zu denen das gewünschte Endprodukt, 1-Ν-(λ-Hydroxy-a)-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxy kanamycin B, dessen Stellungsisomere und dessen poly-N-acylierte Derivate sowie nicht umgesetztes 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B gehören. Die Isolierung des gewünschten Endproduktes gemäß Anspruch 1 kann am wirksamsten erreicht werden,

ho indem man das Gemisch der Säulenchromatographie unterwirft, wobei man mit Silikagel oder einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, einem carboxymethylierten vernetzten Dextran oder CM-Cellulose arbeitet Das bei der Chromatographie anfallende Eluat wird in

(S₅ Fraktionen aufgefangen, deren antibakterielle Wirkung unter Verwendung sensitiver und resistenter Bakterien als Testmikroorganismen bestimmt wird. Durch diese Bestimmung kann die antibakterielle Wirkung jeder

Fraktion festgestellt werden, so daß es leicht ist. die aktiven Fraktionen herauszufinden, die die gewünschte Verbindung gemäß Anspruch 1 enthalten. Ein Teil dieser aktiven Fraktionen wurde angenommen und der Dünnschichtchromatographie an Siiikagel unterworfen, wobei man ein Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17%igcm wäßrigem Ammoniak benutzte. Auf diese Weise ist es möglich, die Fraktionen herauszufinden, die bei einem typischen Rf-Wert einen Einzelfleck ergeben, der dem gewünschten l-N-(«-Hydroxy-ü)-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxykanamycin B la, Ib, lc oder ld entspricht.

Diese Fraktionen können vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

l-N-(L-2-Hydroxy-4-aminobutyryl)-MDDKB^#
(Verbindung Ic)

(a) Zu einer Lösung von 930 mg (2mMol) MDDKB* in 5 ml Wasser wurde eine Lösung von 960 mg (4mMol) tert.-Butyl-S-(4,6-dimethylpyrimid-2-yl)-thiocarbonat in 5 ml Dioxan gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man einen festen Rückstand erhielt. Dieser feste Rückstand wurde in 40 ml Wasser aufgenommen, aus der Lösung wurde das unlösliche Material abfiltriert. Das Filtrat wurde über eine Kolonne (20 χ 290 mm) geleitet, die mit einer 100 ml entsprechenden Menge eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes gefüllt war, um die Adsorption der t-Butoxycarbonylierungsprodukte an das Harz zu bewirken; das Kationenaustauscherharz lag in der Ammonium-Form vor. Die Harzkolonne wurde mit Wasser (500 ml) gewaschen und mit 0,1-n wäßrigem Ammoniak eiuiert Die Fraktionen des Eiuates, die sich bei der Ninhydrin- und der Rydon-Smith-Reaktion positiv verhielten und auch einen Hauptfleck bei Rf 0,60 bei der Dünnschichtchromatographie an Siiikagel unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform-17°/oiges Ammoniak (4:5:2:3 Volumenverhältnis) als Entwicklungs-Lösungsmittelgemisch ergaben, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt so 538 mg eines farblosen Pulvers, welches hauptsächlich aus 2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-MDDKB* (A), bestand. Ausbeute: 41 °/o.

(b) Dieses farblose Pulver (100 mg), welches hauptsächlich aus der vorstehend genannten Verbindung (A) bestand (0,15 mMol), wurde in einem Gemisch aus 1 ml Wasser und 1 ml Dimethoxyäthan gelöst Die so entstandene Lösung wurde zu einer Lösung von 54 mg (0,17 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der L-4-(N-t-Butoxycarbonylamino)-2-hydroxybuttersäure in 2 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 22 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Man erhielt auf diese Weise einen festen Rückstand, der aus einem Gemisch der N-acylierten Derivate des N-geschützten MDDKB* bestand.

'MDDKB = 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycinB

(c) Der feste Rückstand wurde in 2,4 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure gelöst. Man ließ die Lösung I Stunde bei Umgebungstemperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde in 4 ml Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wäßrigem Ammoniak aul einen pH-Wert von 8 eingestellt und dann durch ein« Kolonne (8 χ 400 mm) geleitet, die mit einer 20 m entsprechenden Menge eines schwach sauren Kationen austauschendes (in der Ammonium-Form) gefüll war, um die Adsorption der gemischten N-acylierter MDDKB'-Produkte an dem Harz zu erreichen. Die Harzkolonne wurde nacheinander mit 100 ml Wasser 100 ml 0,3-n wäßrigem Ammoniak und 0,5-n wäßrigerr Ammoniak gewaschen und dann mit 0,75-n wäörigerr Ammoniak eiuiert. Das Eluat wurde in 2-ml-Fraktioner aufgefangen, und jede Fraktion wurde mit Hilfe dei üblichen Plattenmethode auf ihre antibakterielle Wir kung gegenüber dem kanamycin-empfindlichen Stamrr Bacillus subtilis PCI 219 und dem kanamycin-resistenter Stamm Escherichia coli JR66/W677 geprüft. Dit Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Wirkung gegenüber beiden genannten Stämmen zeigten, wurder vereinigt (auf ein Volumen von 26 ml) und dann zui Trockne eingeengt. Man erhielt so 39 mg eine; farblosen Pulvers, welches im wesentlichen aus dei gewünschten Verbindung Ic bestand. Zur weiterer Reinigung wurde das farblose Pulver in 0,5 ml eine; Gemisches auf Methanol, Chloroform und 17%igerr wäßrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 4 :1 :2) ge löst, und die entstandene Lösung wurde der Säulenchro matographie über 3 g Siiikagel unterworfen, wöbe wiederum ein Gemisch aus Methanol, Chloroform um I7^o/oigem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältni: 4:1:2) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Da: Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgefangen; es zeigt« sich, daß die Fraktionen Nr. 46—78 ausschließlicl l-N-(L-2-Hydroxy-4-aminobutyryl)-MDDKB* enthiel ten, welches bei der Dünnschichtchromatographie ar Siiikagel unter Verwendung von Butanol, Äthanol Chloroform und 28%igem wäßrigen Ammoniak (VoIu menverhältnis 4:5:2:8) als Eluierungsmittel einei Einzelfleck bei Rf 0,38 ergab. Die genannten Fraktionei wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wodurcl man 15 mg der vorstehend genannten Verbindung 1 c al reines Produkt in Form eines farblosen Pulvers erhieli Zersetzungspunkt: 158- 161°C

Beispiel 2

1-N-(DL-2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-MDDKB* (Verbindung la)

(a) Das farblose Pulver (403 mg), welches hauptsäch lieh aus 2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-MpDKB^l (0,6 mMol) bestand und welches gemäß Beispiel 1 (a erhalten worden war, wurde in einem Gemisch aus 4 m Wasser und 4 ml Dimethoxyäthan gelöst Die gewönne ne Lösung wurde mit einer Lösung von 221 mj (0,66 mMol) des N-Hydroxysuccinimidester von DL-2

Hydroxy-3-(N-t-Butoxycarbonyl-amino-propionsäure

in 8 ml Dimethoxyäthan vermischt Die Mischung wurdi 23,5 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt Da nach wurde das Reaktionsgemisch unter verminderten Druck zur Trockne eingeengt, wodurch man einei

festen Rückstand erhielt, der hauptsächlich aus den gemischten N-acrylierten Derivaten des 2'-N,6'-N-Dt-(tbutoxycarbonyl)-MDDKB* bestand.

(b) Dieses feste, als Rückstand gewonnene Produkt wurde in 7,5 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure ^s gelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur abgestellt, damit die Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppe eintreten konnte. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde u> in 16 ml Wasser gelöst. Die so gewonnene wäßrige Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf pH 8 eingestellt und dann über eine Kolonne (10 χ 560 mm) geleitet, die in einer 43 ml entsprechenden Menge mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz (ip. der Ammonium-Form) gefüllt war, um die Adsorption der gemischten N-acylierten Produkte zu erreichen. Die Harzkolonne wurde zunächst mit 200 ml Wasser und dann mit 400 ml 0,3-n wäßrigem Ammoniak gewaschen und anschließend 0,5-n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 4-ml-Fraktionen aufgefangen, und jede einzelne Fraktion wurde nach der üblichen Plattenmethode auf ihre antibakterielle Wirkung gegenüber Bacillus subtilis PCI 219 und Escherichia coli Jr66/W677 getestet. Die Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Wirkung gegenüber beiden Stämmen ze^;gten, wurden vereinigt (auf ein Volumen von 100 ml) und dann zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 135 mg eines farblosen Pulvers, welches hauptsächlich aus der gewünschten Verbindung la bestand. Zur weiteren Reinigung wurde dieses farblose Pulver in 2,6 ml eines Gemisches aus Methanol, Chloroform und 17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:1 :2) gelöst, und die entstandene Lösung wurde der Säulenchromatographie an Silikagel (8 g) unterworfen, wobei ein Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:1 :2) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 2-ml-Fraktionen aufgefangen, wobei sich zeigte, daß die Fraktionen Nr. 20—27 allein das gewünschte Produkt enthielten, welches bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 28%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 4:5:2:8) als Eluierungsmittel einen Einzelfleck bei 0,51 ergab. Diese Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt; man erhielt so 38 mg der Verbindung la als reines Produkt in Form eines farblosen Pulvers. Zersetzungspunkt: 165-169° C.

Beispiel 3

l-N-(L-2-Hydroxy-3-aminopropionyl)-MDDKB*
(Verbindung Ib)

55

(a) t-Butoxycarbonylazid (465 mg; 3,2 mMol) wurde zu einer Lösung von 500 mg (1,1 mMol) MDDKB* in einem Gemisch aus 21 ml Pyridin, 21 ml Triethylamin und 12,6 ml Wasser gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Man erhielt auf diese Weise 727 mg eines farblosen Pulvers, welches haupt-

•MDDKB - 6'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B

sächlich aus einem Gemisch von 2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-MDDKB" (B) und 6'-N-t-Butoxycarbonyl-MDDKB* (C) bestand.

(b) Das in der vorstehend beschriebenen Weise gewonnene farblose Pulver (510 mg) wurde ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde eine Lösung von 254 mg (0,84 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der L-2-Hydroxy-3-(N-tbutoxycarbonylamino)-propionsäure in 10 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 19 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktionsgemiscli wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, so daß man 794 mg eines festen Rückstandes erhielt, der aus einer Mischung der N-acylierten Derivate der vorstehend genannten Verbindungen (B) und (C) bestand.

(c) Der feste Rückstand wurde mit wäßriger 90%iger Trifluoressigsäure behandelt, um die t-Butoxycarbonylgruppe zu entfernen. Danach wurde zur Isolierung eine Säulenchromatographie mit einem schwach sauren Kationenaustausiher und anschließend zur Reinigung eine Säulenchromatographie an Silikagel in der in Beispiel 1 (b) beschriebenen Weise durchgeführt. Die reine Verbindung Ib wurde in Form eines farblosen Pulvers gewonnen; Ausbeute: 34 mg; Zersetzungspunkt: 162 bis 166⁰C.

Beispiel 4

l-N-(L-2-Hydroxy-5-aminovaleroyl)-MDDKB*
(Verbindung Id)

(a) Das farblose Pulver (510 mg), welches hauptsächlich aus einem Gemisch der Verbindungen (B) und (C), die gemäß Beispiel 3 (a) erhalten worden war, bestand, wurde ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde eine Lösung von 278 mg (0,84 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von

L-5-(N-t-Butoxycarbonylamino)-2-hydroxy-valeriansäure in 10 ml Dimethoxyäthan gegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, so daß man 834 mg eines festen Rückstandes erhielt, der aus den gemischten N-acrylierten Derivaten der vorstehend genannten Verbindungen (B) und (C) bestand.

(b) Das so gewonnene feste Produkt wurde in 8 ml wäßriger 90%iger Trifluoressigsäure gelöst; die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 1 Stunde abgestellt. Das Reaktionsgemisch wurde danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde in 60 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wäßrige Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wäßrigen Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,4 eingestellt und dann an einer Kolonne (10 χ 560 mm), welche eine 40 ml entsprechende Menge eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes (in der Ammonium-Form) enthielt, adsorbiert Anschließend wurde die Kolonne nacheinander mit 200 ml Wasser, 250 ml 0,3-n wäßrigem Ammoniak und 240 ml 0,5-n wäßrigem Ammoniak gewaschen und anschließend mit 0,75-n wäßrigem Ammoniak eluiert Das Eluat wurde in 4-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen, die

eine hohe antibakterielle Wirkung gegen Bacillus subtilis PCI 219 und Escherichia coli |R66/Wb77 aufwiesen, wurden bestimmt, vereinigt (auf ein Volumen von 60 ml), zur Trockne eingeengt und dann über eine

Silikagelkolonne in der in Beispiel 1 (c) beschriebenen Weise chromatographiert. Man erhielt auf diese Weise reine Verbindung Id in Form eines farblosen Pulvers Ausbeute:29 mg. Zersetzungspunkt: 152-155⁰C.

Tabelle 2

Werte von η und Konfiguration der —C - CH — (CH,),, NH₂-Gruppe

	Rpicnipl	c %	j j O OH	7	l/L	3	2/L	1	.VL	4
		H %	Verbindung		(lh)		(Ic)		lld)
		N %	1/DL		farbloses		farbloses		farbloses
			(la)	kristallines	kristallines	kristallines
Aussehen			farbloses	Pulver	Pulver	Pulver
			kristallines	162-166	158-161	152-155
			Pulver	+ 80° (c 1,02)	+ 71°(_C 0,8)	■+ 79° (c 0.71)
Zersetzungstemperatur,			165-169	C₂₂H₄₄N₁₁O₁₁,	C₂UI₄₁₁N₁₁O_n,	C₂₄H,sN..O,,
(α)^!ό in H₂O			+ 96°(c 1,175)	Ber. Gel'.	B er. Gel.	Her Gel.
Bruttoformel			C₂₂H₄₄N₁₁O,,,	47.81 47,94	48,75 48.22	49.64 4^.11
			B e ι. Ge f.	8.03 8.54	8,18 8.14	8.33 8.37
			47,81 48,34	15,21 15,68	14,83 14.49	14.47 14.13
	8,03 8,07	0,51	0.38 .	0.34
	15,21 14.87	positiv	positiv	positiv
Rf-Wert^a)	0,51	1640	1650	1650
Ninhydrin-Reaktion	positiv	1570	1570	1570
IR(cm"')Amid-l	1640	1.6-2.7(611;	1,6-2.7(8H)	1.7-2.6IiOIh
Amid-II	1570	3.13(S)	3.15(S)	3.!3(S)
NMR (ppm) C-CH₂-C	1,7-2,7(6H)	5.5O(d)	5.53 id ι	5.501 dl
N-CH,	3,18(s)	5.67 (d)	5.65 (dl	5.6(1 id)
Γ-H	5,55 (d)
Γ-H	5,66(d)

^a) Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel.

Laufmittel: n-Butanol/Äthanol/thloroform/28%iges wässriges NH-, 4:5:2:8 (Voi.i.

Claims

Patentansprüche:
1. l-N-lx-Hydroxy-iM-aminoalkar.oyU-o'-N-methyl-i^'-didesoxykanamycine B der allgemeinen Formel

in der der Rest

CH,OH HjN--^'-^ 4' ii,nV—V\ «°\ 4
()H\ ,^V"^
° HN V"⁷ , "NH₂ ^CH₂NHCH₃
U I
CO
j I
CHOH
I (CH₁),, NH₂ -C-CH-(CH₁I_n-NH,
Il I O OH

folgende Bedeutungen hat:

a) DL^-Hydroxy-S-aminopropionyl-,

b) L^-Hydroxy-S-aminopropionyl-,

c) L-2-Hydroxy-4-aminobutyryl-,

d) L^-Hydroxy-S-aminovaleroyl-,

sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man selektiv die 1-Aminogruppe von

2'-N,6'-N-Di-(t-butoxycarbonyl)-6'-N-irethyl- -)"

3\4'-didesoxykanamycin B
und/oder

6'-N-(t-Butoxycarbonyl)-6'-N-methyl-3',4'-didesoxykanamycin B

mit dem N-Hydroxysuccinimidesterder

2-Hydroxy-3-(N-t-Butoxycarbonylamino)

DL-propionsäure,
2-Hydroxy-3-(N-t-Butoxycarbonylamino)-

L-propionsäure,
L-2-Hydroxy-4-(N-t-Butoxycarbonylamino)-

buttersäure oder
L-2-Hydroxy-5-(N-t-Butoxycarbonylamino)

valeriansäure

umsetzt, aus dem 1-N-acylierten Derivat die Aminoschutzgruppe in an sich bekannter Weise abspaltet und die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls in ihre pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze überführt.
3. Arzneimittel, enthaltend eine der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff.