DE3112124A1 - Neue derivate der istamycin a und b und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents

Description

Neue Derivate der Istamycin A und B und Verfahren zur Herstellung derselben

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf neue Derivate der Istamycine A und B, insbesondere auf Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B sowie die Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen. Die genannten Verbindungen sind brauchbare halbsynthetische Aminoglycosid-Antibiotika. Die Erfindung bezieht sich auch auf das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Bei den Untersuchungen zur Verbesserung der Antibiotika Istamycin A und Istamycin B, die von den Erfindern durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus, Streptomyces tenjimariensis FERM P-4932 (ATCC 31603)(Japan. Patent-KOKAI 145697/80, "Journal of Antibiotics" 32., 964-966 (September 1979); GB-patentanmeldung GB 2048855A₅ offengelegt

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Eingesandte Modelle weiden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mundliche Abreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Betätigung. — Die in Re^injng gestellten Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

] 17. Dezember 1980) gewonnen worden sind, konnte festgestellt werden, daß Formimidoylfortimicin A (Substanz SF-2052 "Journal of Antibiotics", _32, 1354-1356 (1979)) eine stärkere antibakterielle Wirkung hat als Fortimicin A. Daraufhin wurde versucht, diese Erkenntnisse auch auf die Istamycine zu übertragen. D.h., es wurde versucht, die Aminogruppe in dem Glycinteil der Istamycine A und B in eine Amidingruppe umzuwandeln. Bei den erfolgreichen Versuchen ist es gelungen, neue Verbindungen, nämlich Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B herzustellen, deren antibakterielle Wirkung stärker ist als die von Fortimicin A und der der Ista-^: mycine A und B entspricht, jedoch bei einer geringeren Toxicität als sie die Istamycine A und B aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind in erster Linie die neuen Verbindungen Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B der Formel I, die in den Ansprüchen 1 bis 3 gekennzeichnet und beansprucht sind.

Die physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften der Formimidoylistamycine A und B sind in den folgenden Tabellen I und II zusammengestellt.

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Tabelle I Physikalisch-chemische Eigenschaften

	Formimidoyl- istamycin A •disulfat •trihydrat	Formimidoyl- istamycin B •disulfat •dihydrat
Aussehen	farbloses Pulver	farbloses Pulver
Zersetzungspunkt	202 - 208°C	202 - 210°C
Spezifische Drehung	[a]27 + 82° (c 1, H2O)	Ca]^3 + ^7° (c 1, H2O)
Gewichtsanalyse (%)
C	32,34 (32;42)*	33;67 (33;33)**
H	6,52 ( 6,95)*	S;sH ( 6^,84)**
N	Ilj82 (12j60)*	12f35 (12,96)**
S	9;69 ( 9,62)*	9,02 ( 9^,87)**
Cellulosedünnschicht- chromatographie
Rf***	0,39 (Einzel- ' fleck)	0,42 (Einzel fleck)

* Berechnete Werte für ** Berechnete Vierte für

^Cl8^H36^N6V^2H2^SV^3H2° ^C18^H36^N6^O5'^2H2^SO4'^2H2^O

*** Lösungsmittelsystem: Propanol-Pyridin-Essigsäure-

T'Jasser
(Volumenverhältnis 15:10:3:12

^arbreagenz:

Ninhydrin

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NAOHQEREIOHTI

•j Tabelle II Biologische Eigenschaften (antibakterielle

Wirkungsspektren

. Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) ***

Test-Mikroorganismen

Staphylococcus aureus PDA 209P ¹¹ " Smith ¹¹ " ApOl

Staphylococcus epidermidis Micrococcus flavus FDA 16 Sarcina lutea PCI 1001 Bacillus anthracis Bacillus subtilis P.CI 219

" " NRRL B-558 Bacillus cereus ATCC 10702 Corynebäcterium bovis 1810

Mycobacterium smegmatis ATCC Escherichia coli NIHJ ¹¹ " K-12 ¹¹ " K-12 R5 ¹¹ " K-12 R388 ¹¹ " K-12 J5R11-2 " " K-12 ML1629 ¹¹ " K-12 MLI63O ¹¹ " K-12 ML1410 " " K-12 ML1410 R8I " " K-12 LA290 R55 Formimidoyl- Formimidoylistamycin A* istamycin B**

1,56
< 0,20
1,56
1,56
0,39
0_;39
0,39
0,20

0,39
3,13
1,56
0,78
3,13
3,13
6,25
1,56
3,13
6,25
6,25
6,25
3,13
6,25

0,39

< 0,20 0,78 0,78 0,39 0,39

< 0,20

< 0,20

< 0,20 1,56 1,56 0,39 3,13 1,56 3,13 1,56 1,56 1,56 1,56 1,56 1,56 1,56

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Escherlchia coil K-12 LA290 R56 ¹¹ " K-12 LA290 R64 " " W677 " " JR66/W677 ¹¹ " K-12 C600 R135 ¹¹ " JR225

Klebslella pneumonlae PCI602 ¹¹ " 22#3038

Shigella dysenteriae JS11910 Shigella flexneri 4B JS11811 Shigella sonnei JS11756 Salmonella typhi T-63 Salmonella enteritidis I891 Proteus vulgaris 0X19

Proteus rettgeri GN311 ¹¹ « GN466

Serratia marcescens

Serratia sp. SOU Serratia sp..

Providencia sp. Pvl6 Providencia sp. 2991 Pseudomonas aeruginosa A3

¹¹ " No.

11 it _H9

" . " HIl

11 ti TI-I3

3,13	1	,56
3,13	1	,56
3,13	1	,56
6,25	1	,56
100	50
3,13	1	,56
3,13	1	,56
6,25	3	,13
12,5	3	>13
6,25	3	.13
12,5
1,56	0	,78
3,13	1	>56
1,56	0	,78
25	12	,5
6;25	6
12,5	6^	525
> 100	> 100
100	100
12,5	12	,5
12,5	6	,25
6,25	12,	,5
100	100
50	100
100	> 100
50	100

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I NACH<?e-!=?E:>OMTf	- 11 -	Il	99	-, ■*, Λ ··. »
	Pseudomonas aeruginosa GN31<i	Il	B-13	25
If	Il	21-75	> 100
Il	It	PSTl	> 100
Il	It	ROS 13V PU21	> 100
It	Il	K-Ps 102	> 100
Il	Pseudomonas maltophilia GNQ07	> 100
Il	50
> 100

50

> 100

> 100

> 100

> 100

> 100 PU21

" " K-Pr in? cn 2.QQ

100

In Form des Disulfat-Trihydrates.
** In Form des Disulfat-Dihydrates .

*** Bestimmt nach der Standard-Methode der seriellen Verdünnung an Nähragarplatten bei 17stündiger Bebrütung bei 37⁰C.

Die Formimidoylistamycine A und B zeichnen sich durch geringe Toxicität aus. Eine Bestimmung der akuten
Toxicität dieser Verbindungen und von Istamycin B
bei Mäusen, denen die Verbindungen intravenös verab-

reicht wurden, zeigte, daß bei einer Dosis von 300 mg/kg Formimidoylistamycin A-Disulfat-Trihydrat oder Formimidoylistamycin B-disulfat-dihydrat alle getesteten Mäuse überlebten, wogegen bei einer Dosis von nur 150 mg/kg Istamycin B alle Mäuse starben.

Die erfindungsgemäßen Formimidoylistamycine A und B
können in Form ihrer freien Basen als Hydrate oder
Carbonate gewonnen werden. Sie lassen sich, vorzugsweise im Hinblick auf ihre Stabilität, in pharma-

zeutische, nicht toxische Säureanlagerungssalze um-

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wandeln, indem man sie mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure in an sich bekannter Weise verbindet. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Säuren sind anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phsophorsäure und Salpetersäure sowie organische Säuren wie Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure und Methansulfonsäure.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der Formimidoylistamycine A und B der Formel I, welches im Anspruch 4 beansprucht und gekennzeichnet ist.

Die Verbindungen der Formel V, die für das erfindungsgemäße Verfahren al.s Ausgangsmaterial benutzt werden, entsprechen den 1,2',6'-tri-N-geschützten Derivaten der Istamycine A und B und können von den Istamycinen Aq bzw. B_Q (vergl. Japan. Patentanmeldung 117912/79; GB-Patentanmeldung GB 2048855A; U.S.-Patentanmeldung Ser. Nr. 141 492) der Formel II

OH

(H)

abgeleitet werden; in der Formel II bedeuten im Falle von Istamycin Aq X eine Aminogruppe und Y ein Wasser-

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- 13 -

stoffatom und im Falle von Istamycin B_Q X Wasserstoff und Y eine Aminogruppe. Die Verbindungen der Formel V werden hergestellt, indem man gleichzeitig die Amino- und Methylaminogruppen in der 1-, 2'- und 6'-Stellung von Istamycin A_Q oder B_Q mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert, wodurch man eine Verbindung der Formel III

X¹

(III)

erhält, in welcher bei der Istamycin Α-Reihe X¹ eine -NHR-Gruppe und Y¹ ein Wasserstoffatom darstellen und bei der Istamycin B-Reihe X¹ ein Wasserstoffatom und Y¹ eine -NHR-Gruppe bedeuten und R für eine einwertige Aminoschutzgruppe steht. Setzt man die Verbindung der Formel III mit einem N-geschützten Glycin, dessen Aminoschutzgruppe von den Aminoschutzgruppen in den 1-, V- und 6'-Stellungen verschieden ist, oder mit einem reaktiven Derivat dieses Glycins zur Acylierung der 4-Methylaminogruppe um, so erhält man eine Verbindung der Formel IV

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NACH-j

gREICHT*}

- 14 -

(IV);

NCH,

COCH₂N

in welcher X', Y¹ und R die bereits angegebene Bedeutung haben, A ein Wasserstoffatom ist und B eine einwertige Aminoschutzgruppe darstellt; A und B zusammen können auch eine zweiwertige Aminoschutzgruppe bilden. Anschließend wird die Schutzgruppe an der Aminogruppe im Glycinteil des Moleküls entfernt, wodurch man die Verbindung der Formel V erhält, die der Verbindung der Formel IV entspricht, wenn sowohl A als auch B Wasserstoffatome sind.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Herstellung der Ausgangsverbindung der Formel V angegeben.

Man geht zu diesem Zweck von Istamycih A_Q oder B_Q der Formel II aus. In der ersten Verfahrensstufe werden die 1- und 2'-Aminogruppen und die G'-Methylaminogruppe gleichzeitig durch eine einwertige Aminoschutzgruppe geschützt, ohne daß es dabei zu einer Blockierung der 4-Methylaminogruppe kommt. Als ein-

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wertige Aminoschutzgruppe sind für diesen Zweck beispielsweise folgende Gruppen geeignet: Eine Alkoxycarbonylgruppe, insbesondere eine solche mit 2 ■- 7 Kohlenstoffatomen, z.B. tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl; eine Cycloalkyloxycarbonylgruppe, insbesondere eine solche mit 4-7 Kohlenstoffatomen, z.B. Cyclohexyloxycarbonyl; eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie Benzyloxycarbonyl; eine Acylgruppe, insbesondere eine Alkarioylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, z.B. Trifluoracetyl und o-Nitrophenoxyacetyl. Die Einführung einer solchen Aminoschutzgruppe kann in der aus der Synthese von Peptiden bekannten Weise durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung eines Säurehalogenides, eines Sä'ureazides, eines aktiven Esters, eines Säureanhydrides usw.. Verwendet man ein solches, zur Einführung der Aminoschutzgruppe geeignetes Reagenz in einer Menge von 2,5 bis 3,5 Mol pro Mol Istamycin A_Q oder B_Q, so ist es möglich, 1,2', 6'-tri-N-geschütztes Istamycin Aq oder B_Q der Formel III herzustellen, und zwar infolge des Unterschiedes in der Reaktivität der entsprechenden Amino- und Methyl aminogruppen von Istamycin Aq oder B_Q. Andererseits kann das 1,2',6'-tri-N-geschützte Istamycin A_Q oder B_Q der Formel III in höherer Ausbeute gewonnen werden, indem man Istamycin Aq oder Bq mit einem Moläquivalent eines zweiwertigen Kations eines zweiwertigen übergangsmetalles wie Kupfer, Nickel, Kobalt oder Zink (II) umsetzt, so daß sich ein Metallkomplex bildet. Dieser Komplex wird dann mit 3-5 Mol eines zur Einführung von Aminogruppen geeigneten Reagenzes umgesetzt, worauf das .Metallkation aus dem Reaktionsprodukt entfernt w i rd.

Die anschließende Glycylierung (d.h. die Acylierung

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-■ V w

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mit Glycin) der 4-Methylaminogruppe des 1,2',6-tri-N-geschützten Istamycin A_n oder B_n der Formel III kann so durchgeführt werden, daß man die Verbindung mit Glycin oder einem reaktiven Derivat von Glycin umsetzt. Die Umsetzung erfolgt dabei mit Hilfe eines der üblichen, aus den Peptid-Synthesen bekannten N-Acylierungsverfahren wie dem Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren, dem Verfahren mit gemischten Säureanhydriden, dem Azid-Verfahren, dem Verfahren mit aktiven Estern usw.. In dem benutzten Glycin soll die Aminogruppe vorzugsweise geschützt sein; die für diesen Zweck benutzte Aminoschutzgruppe muß eine andere sein als die die zum Blockieren der 1- und 2"-Aminogruppen und der 6'-Methylaminogruppe im Istamycin A_n oder B_n verwendet worden sind, sie muß außerdem leicht entfernbar sein. Die Schutzgruppe für die Aminogruppe in dem Glycin kann folglich aus den vorstehend aufgezählten Aminoschutzgruppen ausgewählt werden; es ist aber auch möglich zweiwertige Aminoschutzgruppen vom Typ der Schiff'schen Basen zu wählen. Die Acylierung mit dem Glycin wird vorzugsweise nach dem Verfahren über einen aktiven Ester in einem organischen Lösungsmittel wie Dioxan unter Erwärmen auf eine Temperatur von 40 bis 6O⁰C durchgeführt; dabei gewinnt man die Verbindung der Formel IV. In einem bevorzugten Beispiel wird 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A_n an einer 4-Methylaminogruppe mit dem N-Hydroxysuccinimidester von N-tert.-Butoxycarbonylglycin acyliert, wobei ein N-geschütztes Zwischenprodukt der Formel IV erhalten wird, in welcher R eine Benzyloxycarbonylgruppe, A Wasserstoff und B eine tert.-Butoxycarbonylgruppe bedeuten. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird 1,2'-6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin

B_n an der Methylaminogruppe mit dem N-Hydroxysuccinimid-35

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ester von N-Benzyloxycarbonylglycin acyliert, wobei man ein N-geschütztes Zwischenprodukt der Formel IV gewinnt, in welchem R eine tert.-Butoxycarbonylgruppe, A Wasserstoff und B eine Benzyloxycarbonylgruppe darstellen.

Die nächste Verfahrensstufe dient der selektiven Entfernung der Aminogruppe aus dem Glycinteil der an der Amino- und Methylaminogruppe geschützten Ver-

]q bindung der Formel IV, wodurch man die gewünschte Ausgangsverbindung der Formel V erhält, welche einem 1,2'6'-tri-N-geschützten Istamycin A oder B entspricht. Die Entfernung der Schutzgruppe an.!der Aminogruppe im Glycinteil der Verbindung der Formel IV kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Hydrierung in Gegenwart von Palladium, Plantinoxid usw. als Katalysator, wenn es sich um die Entfernung einer Aralkyloxycarbonylgruppe handelt, oder durch Hydrolyse in einer wässrigen Lösung von Trifluoressigsäure, Essigsäure usw. oder in verdünnter wässriger Salzsäure, wenn es sich um die Entfernung der anderen Aminoschutzgruppen handelt.

Typische Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrehs werden im folgenden erläutert. In der ersten Stufe dieses Verfahrens wird die Verbindung der Formel V mit einem Iminoäther umgesetzt, um die Aminogruppe in dem GTycinteil des 1,2',6'-tri-N-geschützten Istamycin A oder B in eine Amidingruppe umzuwandeln. Der benutzte Iminoäther kann der allgemeinen Formel

R¹OCH=NH

entsprechen, in welcher R¹ eine niedere Alkylgruppe oder eine Aralkylgruppe wie Benzyl darstellt; man

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kann auch ein Säureanlagerungssalz, beispielsweise das Hydrochlorid oder das Sulfat des Iminoäthers verwenden. Ein Iminoäther-Hydrochlorid wie Äthylformimidat-Hydrochlorid oder Benzylformimidat-Hydrochlorid hat sich als besonders günstig erwiesen. Die Umsetzung kann in einem organischen Lösungsmittel wie Dioxan oder Methanol oder in einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur unter 3O⁰C in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die entstandene Verbindung der Formel VI, das 1,2',6'-tri-N-geschützte Formimidoylistamycin A oder B oder gegebenenfalls das Säureanlagerungssalζ dieser Verbindung kann durch Säulenchromatographie an Silikagel u.a. gereinigt werden. In der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die verbliebenen Aminoschutzgruppen aus der Verbindung der Formel VI ebenfalls in an sich bekannter Weise entfernt, so daß man schließlich das gewünschte Formimidoyl istamycin A oder B der Formel I in Form eines Säureanlagerungssalzes erhält.

Durch Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Verfahren zur Herstellung der Ausgangsverbindung der Formel V ergibt sich so ein Verfahren zur Herstellung von Formimidoylistamycin A oder B aus Istamycin A_Q oder B_Q, welches per Saldo in der Acylierung der 4-Methylaminogruppe von Istamycin A_Q oder B₀ mit Formimidoylglycin besteht. Das Gesamtverfahren besteht folglich aus den Stufen zum Schutz der 1- und 2'-Aminogruppen und der 6'-Methylaminogruppe von Istamycin A_Q oder B_Q mit einer geeigneten Schutzgruppe, Einführung einer Glycylgruppe an der 4-Methylaminogruppe des 1,2'-6'-tri-N-geschützten Istamycin A_Q oder B_Q, Umwandlung der Glycylgruppe in eine Formimidoglycylgruppe und der schließlichen Entfernung aller Amino- und Methylaminoschutzgruppen

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] aus der gewonnenen Verbindung.

Die Formimidoylistamycine A und B gemäß vorliegender Erfindung zeichnen sich durch hohe antibakterielle Wirkung bei geringer Toxicität für Tiere aus. Die Verbindungen sind infolgedessen in entsprechender Weise wie die bekannten Antibiotika als antibakterielle Mittel verwendbar. Sie können in an sich bekannter Weise in übliche pharmazeutische Verabreichungsformen gejQ bracht und in diesen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft infolgedessen die im Anspruch 5 beanspruchte und gekennzeichnete pharmazeutische Zubereitung.

Die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen eignen sich zur Bekämpfung und Unterdrückung des Bakterienwachstums bei Tieren. Die tatsächlich im Einzelfall zu verabreichenden effektiven Mengen an Formimidoylistamycin A oder B hängen dabei selbstverständlich von der Art der Zubereitung sowie von der Art der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand des Tieres ab. Viele Faktoren sind dabei zu berücksichtigen, so beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Ausmaß der Ausscheidung, Medikamentenkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit des Patienten. Anhand dieser Faktoren kann der Fachmann leicht die optimale Dosis feststellen. Ganz allgemein kann gesagt werden, daß bei einer intramuskulären Injektion die Dosierung von Formimidoylistamycin A oder B bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei 50 bis 500 mg pro Person zwei- bis viermal pro Tag liegen kann.

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•j Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und betreffen die Verfahrensstufen bei Verwendung von Istamycin A_Q oder B₀ als Ausgangsma terial.

Beispiel 1 Herstellung von Formimidoylistamycin A

(1) 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A-

_in (Formel III; R = Benzyloxycarbonyl, X¹ = NHR,

Y¹ = Wasserstoff.

Zu einer Lösung von Istamycin A_Q (1,0 g; 3,0 mMol) in 40 ml Methanol wurden 0,72 ml Triäthylamin gegeben.

■J5 Anschließend wurde die Lösung mit N-Benzyloxycarbonylsuccinimid (2,1 g; 8,1 mMol) in Methanol (12 ml) unter Rühren versetzt. Die entstandene Mischung wurde weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt und der Rück- stand wurde in 60 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wurde mit 60 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Chloroformschicht zur Trockne eingeengt, wobei man 2,17 g eines pulverförmigen Rohproduktes erhielt. Dieses Pulver wurde in 3 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde über eine

Kolonne geleitet, die 55 g Silikagel, CC-7®, enthielt. Die Kolonne wurde mit 560 ml einer Mischung aus Dichlormethan und Äthanol (Volumenverhältnis 150 : 1) gewaschen und anschließend mit demselben Lösungsmittelgemisch (Volumenverhältnis jedoch 20 : 1) eluiert. Man erhielt auf diese Weise 931 mg der Ti te!verbindung in Form eines Pulvers. Ausbeute 42%.

(2) 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-2"-N-tert.-butoxycarbonylistamycin A (Formel IV; R = Benzyloxycarbonyl, A = Wasserstoff, B = tert.-butoxycarbonyl, X¹ = -NHR, Y¹ = Wasserstoff

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] 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A_Q (931 mg; 1,27 mMol), welches gemäß Verfahrensstufe (1) erhalten worden ist, wurde in 30 ml Dioxan gelöst. Zu der Lösung wurden Triäthylamin (0,42 ml) und N-Hydroxysuccinimidester von N-tert.-Butoxycarbonylglycin (830 mg; 3,0 mMol) in Dioxan (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde 4,5 Stunden bei 6O⁰C gerührt. Danach wurde die Reaktionslösung zur Trockne eingeengt, wobei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhiel:t. Dieses Pulver wurde in 5 ml Dich! ormethan gelöst. Die Lösung wurde über eine Kollonne mit 150 g Silikagel, CC-7 ®, geleitet.Zum Eluieren der Kolonne wurde eine Mischung aus Dichlormethan und Äthanol (Volumenverhältnis 200 : 1) verwendet. Das erhaltene pulverförmige Rohprodukt wurde in 5 ml Methanol gelöst und.die Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, welche einer einem Volumen vom 100 ml entsprechende Menge Sephadex LH-20 ® enthielt. Die Kolonne wurde mit Methanol eluiert, wobei man die Titelverbindung als reines pulverförmiges Produkt in einer Menge von 438 ml erhielt. Ausbeute 39%.

(3) Formimidoylistamycin A (Formel I; X = Amino, Y = Wasserstoff)

Das gemäß Stufe (2) erhaltene 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl -2"-N-tert.-butoxycarbonylistamycin A (388 mg; 0,44 mMol) wurde in 90%iger wässriger Trifluoressigsäurelösung (5 ml) gelöst. Man ließ die Lösung 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen und engte sie dann zur Trockne ein. Der Rückstand wurde mit Sthyläther (20 ml) gewaschen. Man erhielt auf diese Weise 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A-Tri-fluoracetat (375 mg). Das Trif1uoracetat wurde in einer

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] Mischung aus 60 ml Methanol und 8 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde tropfenweise mit einer Lösung von Benzylformimidat-Hydrochlorid (624 mg; 2,5 mMol) in 10 ml Methanol versetzt, und zwar unter Eiskühlung c im Verlauf von 15 Minuten, wobei der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,5 η wässriger Kaliumhydroxidlösung bei 8,5 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde unter Eiskühlung gerührt, damit die Einführung der Formimidoylgruppe -CH=NH, vervollständig werden konnte. Danach wurde durch Zugabe von 1 η Salzsäure der pH-Wert auf 3,7 eingestellt und die Mischung zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in 100 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (zweimal je 30 ml) gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und zur Trockne eingeengt, so daß man ein pulverförmiges Rohprodukt (411 mg) erhielt. Dieses Pulver wurde in 3 ml einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 20 : 1) gelöst. Die Lösung wurde chromatographisch gereinigt, indem man sie über eine Kolonne mit 20 g Silikagel, CC-7®, leitete und die Kolonne anschließend mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 20 : 1) eluierte. Auf diese Weise erhielt man 1,2'6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-2"-N-formimidoylistamycin A-Hydrochlorid (193 mg) als Pulver. Ausbeute 54%.

Das so gewonnene Pulver (193 mg; 0,24 mMol) wurde in 12 ml einer Mischung aus Methanol, Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 2:1:1) gelöst. Die Lösung wurde über 5%igem Palladium-auf-Kohle (100 mg) als Katalysator im Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur im Verlauf von 4 Stunden hydriert, um die verbliebenen Aminoschutzgruppen zu entfernen.

Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde die Reaktions-

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lösung zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 12 ml entsprechende Menge eines stark basischen Anionenaustauscherkatalysators, Amberlite IRA 400® (SO,-Form), enthielt. Zu eluieren der Kolonne wurde Wasser verwendet. Das Eluat wurde zur Trockne eingeengt und lieferte so die Titelverbindung in Form des Disulfat-Trihydrates als Pulver.(134 mg). Ausbeute 82%. 10

Beispiel 2 Herstellung von Formimidoylistamycin B

(1) 1,2',6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin Bq (Formel III; R = tert.-Butoxycarbonyl, X' = Wasserstoff, Y'' = NHR)

Zu einer Lösung von Istamycin B_Q (500 mg; 1,5 mMol) in 20 ml Methanol wurde Zinkacetat (500 mg; 2,3 mMol) gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Mischung mit 2-(tert.-Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylacetoni tri1 (17,1 g; 6,9 mMol; z.B. BOC-ON ^R versetzt.und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt. Daß auf diese Weise erhaltene Pulver wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt (SiI ikagel: 100 g Wako gel 0-200^; Eluierungsmittel: Chloroform-Methanol im Volumenver-

hältnis 10 : 1). Man erhielt auf diese Weise die Titelverbindung als pulverförmiges Produkt in einer Menge von412 mg. Ausbeute 44%. Zersetzungspunkt 71 bis 74⁰C; IcA-Ip²+ 50° (c 1,0; Methanol) R_f 0,28 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel (Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 4 : 1).

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(2) 2"-N-Benzyloxycarbonyl-l,2',6'-tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin B (Forme! IV; R = tert.-Butoxycarbonyl, A = Wasserstoff, B = Benzyloxycarbonyl, X¹ = Wasserstoff, Y' = -NHR)

Das in Stufe (1) gewonnene 1,2',6'-Tri-N-tert.-butoxy- carbonylistamycin B_Q (200 mg; 0,32 mMol) wurde in 6 ml Dioxan gelöst. Die Lösung wurde mit 0,10 ml Triethylamin und N-Hydroxysuccinimidester von ΝΙΟ Benzyloxycarbonylglycin (235 mg; 0,76 mMol) versetzt. Die Mischung wurde bei 6O⁰C 2 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingeengt, wobei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhielt. Dieses Pulver wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt (Silikagel: 30g Wako gel C-200®; El uierungsmittel: fithylacetat-Toluol ,im Volumenverhältnis 3 : 2). Das auf diese Weise gewonnene gereinigte Pulver wurde weiter gereinigt, indem man es in Methanol löste und über eine Kolonne leitete, die eine einem

(R) Volumen von 30 ml entsprechende Menge Sephadex LH-20 ^ enthielt. Nach dem Einengen zur Trockne lag die Titelverbindung in Form eines Pulvers vor, und zwar in. einer Menge von 246 mg. Ausbeute 94%. Zersetzungspunkt 104 bis 11O⁰C; I<Mp³ + 44° (c 1; Methanol); Rf 0,45 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel (Äthylacetat-Toluol = im Volumenverhältnis 7 : 2).

(3) 1,2',6'-Tri-tert.-butoxycarbonylistamycin B (Formel V; R = tert.-Butoxycarbonyl, X¹ = Wasserstoff, Y¹ = -NHR).

Das in Stufe (2) gewonnene 2"-N-Benzyloxycarbonyl-1,2',6'-tri-N-tert-butoxycarbonylistamycin B (237 mg; 0,29 mMol) wurde in 15 ml 80%igem Methanol und 0,01 ml Essigsäure gelöst. Zu Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe wurde die Lösung im Wasserstoffstrom in Gegen-

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wart von 50 mg eines 5%igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur und unter Atmosphärendruck hydriert. Beim anschließenden Einengen der Lösung zur Trockne erhielt man die Titel verbindung als pulverförmiges Rohprodukt in Form ihres Acetates in einer Menge von 237 mg.

(4) Formimidoylistamycin B (Formel I)

Das in Stufe (3) gewonnene pulverförmige rohe 1,2', 6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin B-Acetat (200 mg) wurdein20 ml Methanol gelöst; die Lösung wurde mit Äthylformimidat-Hydrochlorid (233 mg; 2,1 mMol) versetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt; dabei wurde die Formimidoylgruppe -CH¹¹NH eingeführt. Die Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt. Das gewonnene Pulver wurde durch Säulenchromatographie bei Silikagel gereinigt (Silikagel: 42 g Wako gel

C-200 ; Eluierungsmittel: Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 7 : 1). Auf diese Weise konnte l,2',6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonyl-formimidoylistamycin B-Hydrochlorid in Pulverform (82 g) gewonnen werden. Ausbeute 38%.

Dieses Pulver (54 g; 0,071 mMol) wurde in 2 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Man ließ die Lösung zwei Stunden bei 0 bis 5⁰C stehen, wobei die Abspaltung der Schutzgruppen eintrat. Anschließend wurde zur Trockne eingeengt. Das pulverförmige Rohprodukt, welches auf diese Weise erhalten worden war, wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 4 ml entsprechende Menge eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, Amberlite IRA 400® (SO^Form) enthielt. Zu Eluieren

wurde Wasser verwendet. Anschließend wurde das aufgefangene Eluat zur Trockne eingeengt. Man erhielt so die Titelverbindung in Form des Disulfat-Dihydrates als Pulver 45 mg). Ausbeute 97%.

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Claims (9)

MEISSNER & BOLTE BREMEN - 1 - Anmelder: ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI 14-23, Kami Osaki 3-chome, Shinagawa-ku Tokyo - Japan PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. HANS MEISSNER DIPL.-ING. ERICH BOLTE D 52800 BREMEN J. Sievogtstraße 21 Bundesrepublik Deutschland Telefon 0421-342019 Telegramme: PATMEIS BREMEN Telex: 246157 (nrieibo d) Datum 30. März 1981 Unser Zeichen 5111/9312 Ihr Zeichen Neue Derivate der Istamycin A und B und Verfahren zur Herstellung derselben Patentansprüche:

1./ Formimidoylistamycine A und B der Formel I

6'

(D

It I

\ OCH-,

NCH, ^

COCH₂NHCH=NH

Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nicht ZLruJkqgltQiey, ©"Uth/etlififodfiihUAbreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestelllen Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Di- linsen berechnet.

Gerichtsstand und Erfüllungsort Biernen.
Bremer Bank, BLZ 290 80010) Nr. 2310 028 - Die Sparkasse in Bremen (BLZ 290 50101) Nr. 104 5855 - Postscheckkonto. Hamburg (BLZ 20010020) 339 52-202

in welcher im FaTIe des Formimidoylistamycin A X eine Aminogruppe und Y ein Wasserstoffatom darstellen und im Fall des Formimidoylistamycin B X ein Wasserstoffatom und Y eine Aminogruppe bedeuten, einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben.

2. Formimidoylistamycin A und dessen Säurean-1agerungssalze.

10

3. Formimidoylistamycin B und dessen Säurean· 1agerungssalze.

15 20

4. Verfahren zur Herstellung von Formimidoylistamycin A oder B der Formel I:

(D

COCH₂NHCH=NH

in welcher im Fall des Formimidoylistamycin A X eine Aminogruppe und Y ein Wasserstoffatom darstellen und im Falle des Formimidoylistamycin B X ein Wasserstoffatom und Y eine Aminogruppe bedeuten, einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel V

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3 -

COCH₂NH₂

(V)

in welcher bei der Istamycin Α-Reihe X' eine -NHR-Gruppe und Y' ein Wasserstoffatom darstellen und

bei der Istamycin B-Reihe X' ein Wasserstoffatom und Y¹ eine -NHR-Gruppe bedeuten und R für eine
einwertige Aminoschutzgruppe steht, mit einem Iminoäther umsetzt, um die Aminogruppe im Gycinteil
der Verbindung der Formel V in eine Amidingruppe umzuwandeln, so da3 eine Verbindung der Formel VI

(VI)

COCH₂NHCH=NH

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^EICHTl

10

entsteht, in welcher X¹, Y' und R die bereits angegebene Bedeutung haben, und daß man schließlich die Aminoschutzgruppen in der 1-, 2'- und 6'-Stellung aus der Verbindung der Formel VI entfernt.

5. Pharmazeutische Zubereitung, bestehend aus einer antibakteriell wirksamen Menge wenigstens einer der Verbindungen Formimidoylistamycin A, Formimidoylistamycin B oder einem pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalz dieser Verbindungen in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.

6. Die Verwendung von Formimidoylistamycin A, Formimidoylistamycin B oder einem pharmazeutisch akzeptablen Säurea.nlagerungssal ζ dieser Verbindungen in ausreichender Menge zur Bekämpfung des Bakterienwachstums bei Tieren.

7. 1,2',6'-N-tri-geschUtzte Istamycine A und B der Formel V

30

35

COCH₂NH₂

(V)

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in welcher bei der Istamycin Α-Reihe X¹ eine -NHR-Gruppe und Y¹ ein Wasserstoffatom darstellen und bei der Istamycin B-Reihe X' ein Wasserstoffatom und Y¹ eine -NHR-Gruppe bedeuten und R¹ für eine einwertige Aminoschutzgruppe steht, einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben.

8. 1,2',6'-Tri-tert.-butoxycarbonylistamycine

A und B einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben.

9. 1,2'·,6¹-Tri-benzyloxycarbonylistamycin A

und B einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben.

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