DE3112124C2 - Formimidoylistamycin A und B, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen - Google Patents

Description

COCH₂NHCH=NH

in der X', Y' und R die angegebenen Bedeutungen haben, die Schutzgruppen R abspaltet und das erhaltene Formimidoylistamycin gegebenenfalls in ein Säureadditonssalz überführt.

(VI)

3. Pharmazeutische Zubereitungen, bestehend aus mindestens einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Träger- und Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B sowie die Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen. Die genannten Verbindungen sind halbsynthetische Aminoglycosid-Antibiotika. Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie entsprechende pharmazeutische Zubereitungen.

Bei den Untersuchungen zur Verbesserung der Antibiotika Istamycin A und lstamycin B, die von den Erfindern durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus, Streptomyces tenjimariensis FERM P-4932 (ATCC 31 603) DE-OS 30 12 014, »Journal of Antibiotics« 32, 964-966, 1979, gewonnen worden sind, konnte festgestellt werden, daß Formimidoylforiimicin A (Substanz SF-2052 »Journal of Antibiotics«, 32. 1354-1356 (1979)) eine stärkere antibakterielle Wirkung hat als Fortimicin A. Daraufhin wurde versucht, diese Erkenntnisse auch auf die Istamycine zu übertragen. D.h., es wurde versucht, die Aminogruppe in dem Glycinteil der Istamycine A und B in eine Amidingruppe umzuwandeln. Bei den erfolgreichen Versuchen ist es gelungen, neue Verbindungen, nämlich Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B herzustellen, deren antibakterielle Wirkung stärker ist als die von Fortimicin A und der der Istamycine A und B entspricht, jedoch bei einer geringeren Toxicität als sie

*5 die Istamycine A und B aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind die neuen Verbindungen Formimidoylistamycin A und Formimidoylistamycin B der Formel I, die in Anspruch 1 gekennzeichnet und beansprucht sind.

Die physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften der Formimidoylistamycine A und B sind in den folgenden Tabellen I und Ii zusammengestellt.

Tabelle I

Physikalisch-chemische Eigenschaften

Formimidoylistamycin A

• disulfat

• t.-ihyclrat

Formimidoylistamycin B - disulfat

• dihvtlrat

Aussehen
Zersetzungspunkt
Spezifische Drehung

farbloses Pulver 2O2-2O8°C

Md + ic 1. H₁O) farbloses Pulver
2O2-21O°C

IaW + 47°
(H, H₂O)

Fortsetzung

Gewichtsanalyse (%) C
H

Cellulosedünnschichtchromatographie

RP**)

Formimidoylistamycin A Formimidoylistamycin ß

• disulfat · disulfat

• trihyrirat · dihydrat

32,34 (32,42)*)
6,52 (6,95)*)

11,82(12,60)*) 9,69 (9,62)*) 0,39 (Einzelfieck)

33,67 (33,33)**) 6,94 (6,84)**)

12,35 (12,96)**) 9,02 (9,87)**)

0,42 (Einzelneck)

*) Berechnete Werte fur C₁₈H₃₆N₆O, · 2H₂SO₄ · 3H₂O. ·*) Berechnete Werte für C₁₈H₃₆N₆O₅ · 2H₂SO₄ ■ 2H₂O.

**♦) Lösungsmittelsystem: Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Vülumenverhältnis 15 : 10 :3 : 12). Farbreagenz: Ninhydrin.

Tabelle II

Biologische Eigenschaften (antibakterielle Wirkungispektren)

Test-Mikroorganismen Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml)**·) Formimidoyl- Formimidoyl-

lstamycin A*)	istamycin B")	50
1,56	0,39
<0,20	<0,20	1.56
1,56	0,78
1,56	0,78
0,39	0,39
0.39	0,39
0,39	<0,20
0,20	<0,20
0,39	<0,20
3,13	1,56
1,56	1,56
0,78	0,39
3.13	3.13
3.13	1,56
6,25	3.13
1.56	1,56
3.13
6,25
6.25
6,25
3,13
6,25
3.13
3.13
3.13
HK)	,56
3.13	.56
,56
.56
,56
,56
,56
.56
.56
.56

Staphylococcus aureus FDA 209P Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus aureus ApOl Staphylococcus epidermidis Micrococcus navus FDA 16 Sarcina lutea PCI 1001 Bacillus anthracis
Bacillus subtilis PCI 219 Bacillus subtilis NRRL B-558 Bacillus cereus ATCC 10702 Corynebacterium bovis 1810 Mycobacterium smegmatis ATCC Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K-12 Escherichia coli K-12 R5 Escherichir. coli K-12 R388 Escherichia coli K-12 J5R11-2 Escherichia coli K-12 ML1629 Escherichia coli K-12 ML1630 Escherichia coli K-12 ML1410 Escherichia coli K-12 ML1410 R81 Escherichia coli K-12 LA290 R55 Escherichia cdi K-12 LA290 R56 Escherichia coli K-12 LA29O R64 Escherichia coli W677 Escherichia coli JR66/W677 Escherichia coli K-12 C6CK) R F.scherici.ia coli JR225

Fortsetzung

Tcsl-MikronriMnismen

MiiHiosliuMiHiikcn/enlr.itiMii^n < pi	c,/mh···
ί'ΟΓΠίΠΙΙ I1I(U 1- \	nrniiiiiuln
,;t..mycm Λ«)	,1.HIVh-I-, I!
3.13
6.25	3.13
12.5	3.13
6.25	3.13
12.5	-
1.56	0.78
3.13	1.56
1.56	0.78
25	1? c>

Klehsiella pneumoniae PCI6O2
Klehsiella pneumoniae 2203038
Shigella dysenteriae JSl 1910
Shigella flexrien 4B JSI1811
Shigella sonnei JSl 1756
Salmonella typhi T-63
Salmonella enteritidis 1891
Proteus vulgaris 0X19
Proteus rettgeri GN311

rmieus reüKcri GN466 6.25 d.25

Serratia marcescens 12.5 6.25

Serratia sp. SOr > 100 > 100

Seirntiii sp. 4 100 100

Providencia sp. PvT6 12.5 12.5

Provideneia sp. 2991 12.5 6.25

Pseudomonas aeruginosa A3 6.25 12.5

Pseudomonas aeruginosa No. 12 100 100

Pseudomonas aeruginosa 119 50 100

Pseudomonas aeruginosa Hl 1 100 >100

Pseudomonas aeruginosa TI-13 50 100

Pseudomonas aeruginosa ÜN315 25 50

Pseudomonas aeruginosa 99 >'.00 > 100

Pseudomonas aeruginosa B-13 > 100 > 100

Pseudomonas aeruginosa 21-75 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa PSTl > 100 > 100

Pseudomonas aeruginosa ROS 134/PU21 >100 > 100

Pseudomonas aeruginosa K-Ps 102 50 100

Pseudomonas maltophilia GN907 > 100 > 100

"ι In f irm des Disulfat-Tnhydratev
**) In Form des Disulfat-Dihydrates.

"**) Bestimmt nach der Standard-Methode der seriellen Verdünnung an Nähragarplatten bei 1"-stündiger Bebrütung bei 3"°C.

Die Formimidoylistamycine A und B zeichnen sich akzeptablen Säure in an sich bekannter Weise durch geringe Toxizität aus. Eine Bestimmung der 55 verbindet. Beispiele für pharmazeutisch akezptable akuten Toxizität dieser Verbindungen und von Istamy- Säuren sind anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffcin B bei Mäusen, denen die Verbindungen intravenös säure, Bromwasserstoffsäure. Schwefelsäure, Phosphorverabreicht wurden, zeigte, daß bei einer Dosis von säure und Salpetersäure sowie organische Säuren wie mg/kg Formimidoylistamycin A-Disulfit-Trihydrat Essigsäure. Apfelsäure. Zitronensäure, Ascorbinsäure oder Formimidoylistamycin B-disulfat-dihydrat alle 60 und Methansulfonsäure.

getesteten Mäuse überlebten, wogegen bei einer Dosis Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das

von nur 150 mg/kg Istamycin B alle Mäuse starben. Verfahren zur Herstellung der Formimidoylistamycine

Die erfindungsgemäßen Formimidoylistamycine A A und B der Formel !,welches in Anspruch 2 beansprucht

und B können in Form ihrer freien Basen als Hydrate und gekennzeichnet ist.

oder Carbonate gewonnen werden. Sie lassen sich. 65 Die Verbindungen der Formel V, die für das

vorzugsweise im Hinblick auf ihre Stabilität, in erfindungsgemäße Verfahren als Ausgangsrnatena!

Oharmazeutische, nicht toxische Säureanlagerungssalze benutzt werden, entsprechen den 1,2',6'-tri-N-geschütz-

amwandeln, indem man sie mit einer pharmazeutisch ten Derivaten der Istamycine A und B und können von

ilen Istamyciricn An bzw. Hn(vergl. |apan. Patentanmeldung I 17 91 2/79:dcr Formel Il

CHveins zur Acylierung der 4-Methylaminognippe um. so erhält man eine Verbindung ti' ' Formel IV

H₁CN

HNCH,

OH

OCH,

(II)

-X'

OH

OCH,

NCH,

COCH₂N

abgeleitet werden: in der Formel Il bedeuten im Falle von Istamycin A₁, X eine Aminogruppe und Y ein Wasserstnffatom und im Falle von Istamycin B₀ X Wasserstmf und Y eine Aminogruppe. Die Verbindungen der Formel V werden hergestellt, indem man g .-ichzeitig die Amino und Methylaminogruppen in der I-, 2- und 6'Stellung von Istamycin A₀ oder B₀ mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert, wodurch man eine Verbindung der Formel III

(iV)

X'

OH

OCH₃

HNCH,

erhält, in welcher bei der Istamycin Α-Reihe X' eine -NHR-Gruppe und Y' ein Wasserstoffatom darstellen und bei der Istamycin B-Reihe X' ein Wasserstoffatom und Y' eine —NHR-Gruppe bedeuter und R für eine einwertige Aminoschutzgruppe steht. Setzt man die Verbindung der Formel IH mit einem N-geschützten Glycin, dessen Aminoschutzgruppe von den Aminoschutzgruppen in den 1-, 2'- und 6'-Stellungen verschieden ist. oder mit einem reaktiven Derivat dieses in welcher X', Y' und R die angegebenen Bedeutungen haben. A ein Wasserstoffatom ist und B eine einwertige Aminoschutzgruppe darstellt; A und B zusammen können auch eine zweiwertige Aminoschutzgruppe bilden. Anschließend wird die Schutzgruppe an der Aminogruppe im Glycinteil des Moleküls entfernt.

π wodurch man die Verbindung der Formel V erhält, die der Verbindung der Formel IV entspricht, wenn sowohl A als auch B Wasserstoffatome sind.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Herstellung der Ausgangsverbindung der Formel V

■ίο angegeben.

Man geht zu diesem Zweck von Istamycin Ao oder Bn der Formel Il aus. In der ersten Verfahrensstufe werden die 1- und 2'-Aminogruppen und die 6'-Methylaminogruppe gleichzeitig durch eine einwertige Aminoschutz-

•*i gruppe geschützt, ohne daß es dabei zu einer Blockierung der 4-Methylaminogruppe kommt. Als einwertige Aminoschutzgruppe sind für diesen Zweck beispielsweise folgende Gruppen geeignet: Eine AIkoxycarbonylgruppe, insbesondere eine solche mit 2-7 Kohlenstoffatomen, z. B. tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl; eine Cycloalkyloxycarbonylgruppe. insbesondere eine solche mit 4-7 Kohlenstoffatomen, z. B. Cyclohexyloxycarbonyl; eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie Benzyloxycarbonyl: eine Acylgruppe.

insbesondere eine Alkanoylgruppe mit 2 — 7 Kohlenstoffatomen, z. B. Trifluoracetyl und o-Nitrophenoxyacetyl. Die Einführung einer solchen Aminoschutzgruppe kann in der aus der Synthese von Peptiden bekannten Weise durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung eines Säurehalogenides, eines Säureazides, eines aktiven Esters, eines Säureanhydrides usw. Verwendet man ein solches, zur Einführung der Aminoschutzgruppe geeignetes Reagenz in einer Menge von 2,5 bis 3,5 Mol pro Mol Istamycin Ao oder Bo, so ist es möglich, 1.2', 6'-tri-N-geschütztes Istamycin Ao oder Bo der Formel III herzustellen, und zwar infolge des Unterschiedes in der Reaktivität der entsprechenden Amino- und Methylaminogruppen von Istamycin Ao oder Bo. Andererseits kann

das i^'.ö'-tri-N-geschützte Istamycin An oder Bn der Formel 111 in höherer Ausbeute gewonnen werden, indem man Istamycin An oder Bn mit einem Moläquival'Nit eines zweiwertigen Kations eines zweiwertigen Übergangsmetalles wie Kupfer. Nickel, Kobalt oder Zink (II) umsetzt, sr· daß sich ein Metallkomplex bildet. Dieser Komplex wird dann mit 3 — 5 Mol eines /ur Einführung von /-.minoschutzgruppen geeigneten Reagenzes umgesetzt, worauf das Metallkation aus dem Reaktionsprodukt entfernt wird.

Die anschließende Acylierung mit Glycin der 4-Mcthylaminogruppe des 1,2',6-tri-N-geschützfen Istamycin An oder Bo der Formel 111 kann so durchgeführt werden, daß man die Verbindung mit Glycin oder einem reaktiven Derivat von Glycin umsetzt. Die Umsetzung LM^-IOIgt dabei mit Hilfe eines der üblichen, aus den PeptirJ-Synthcsen bekannten N-Acylierungsverfahren wie dem Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren, dem Verfuhren mi' gemischten Süurssnlvdrid^n ''^m δ vjH-verfahren, dem Verfahren mit aktiven Estern. In dem benutzten Glycin soll die Aminogruppe vorzugsweise geschützt sein; die für diesen Zweck benutzte Aminoschutzgruppe muß eine andere sein als die die zum Blockieren der I- und 2"-Aminogruppen und der 6'-Methylaminogruppeim Istamycin A₀oder B₀ verwendet worden sind, sie muß außerdem leicht entfernbar sein. Die Schutzgruppe für die Aminogruppe in dem Glycin kann folglich aus den vorstehend aufgezählten Aminoschutzgruppen ausgewählt werden; es ist aber auch möglich zweiwertige Aminoschutzgruppen vom Typ der Schiff'schen Basen zu wählen. Die Acylierung mit dem Glycin wird vorzugsweise nach dem Verfahren über einen aktiven Ester in einem organischen Lösungsmittel wie Dioxan unter Erwärmen auf eine Temperatur von 40 bis 60°C durchgeführt; dabei gewinnt man die Verbindung der Formel IV. In einem bevorzugten Beispiel wird l,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A₀ an einer 4-Methylaminogruppe mit dem N-Hydroxysuccinimidester von N-tert.-Butoxycarbonylglycin acyliert. wobei ein N-geschütztes Zwischenprodukt der Formel IV erhalten wird, in welcher R eine Benzyloxycarbonylgruppe. Λ Wasserstoff und B eine tert.-Butoxycarbonylgruppe bedeuten. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird 1,2'-6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin B₀ an der Methylaminogruppe mit dem N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzloxycarbonylglycin acyliert, wobei man ein N-geschütztes Zwischenprodukt der Formel IV gewinnt, in welchem R eine tert.-Butoxycarbonylgruppe, A Wasserstoff und B eine Benzyloxycarbonylgruppe darstellen.

Die nächste Verfahrensstufe dient der selektiven Entfernung der Aminogruppe aus dem Glycinteil der an der Amino- und Methylaminogruppe geschützten Verbindung der Formel IV, wodurch man die gewünschte Ausgangsverbindung der Formel V erhält, weiche einem l,2',6'-tri-N-geschützten Istamycin A oder B entspricht. Die Entfernung der Schutzgruppe an der Aminogruppe im Glycinteil der Verbindung der Formel IV kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Hydrierung in Gegenwart von Palladium, Platinoxid usw. als Katalysator, wenn es sich um die Entfemung einer Aralkyloxycarbonylgruppe handelt, oder durch Hydrolyse in einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure, Essigsäure usw. oder in verdünnter wäßriger Salzsäure, wenn es sich um die Entfernung der anderen Aminoschutzgruppen handelt

Typisch? Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im folgenden erläutert. In der ersten Stufe dieses ι erfahrens wird die Verbindung der Formel V mit einem Iminoäther umgesetzt, um die Aminogruppe in dem Glycinteil des 1,2',6'-tri-N-geschützten Istamycin Λ oder B in eine Ainidingruppe umzuwandeln. Der eingesetzte Iminoäther kann der allgemeinen Formel

ROCH=NH

in entsprechen, in welcher R' eine niedere Alkylgruppe oder eine Aralkylgruppe wie Benzyl darstellt; man kann auch ein Säureanlagerungssalz, beispielsweise das Hydrochlorid oder das Sulfat des Iminoäthers verwenden. Ein Iminoäther-Hydrochlorid wie Äthylformimidat-Hydrochlorid oder Benzylformimidat-Hydrochlorid hat sich als besonders günstig erwiesen. Die Umsetzung kann in einem organischen Lösungsmittel wie Dioxan oder Methanol oder in einer wäßrigen Lösung bei einer Temperatur unter WP in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die entstandene Verbindung der Formel Vl,das l.2'.6'-tri-N-geschützte FormimiJoylistamycin A oder B oder gegebenenfalls das Säureanlagerungsalz dieser Verbindung kann durch Säulenchromatographie an Silikagel u.a. gereinigt werden. In der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die verbliebenen Aminoschutzgruppen aus der Verbindung der Formel Vl ebenfalls in an sich bekannter Weise entfernt, so daß man schließlich das gewünschte Formimidoylistamycin A oder B der Formel I in Form eines Säureanlagerungssalzes erhält.

Durch Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Verfahren zur Herstellung der Ausgangsverbindung der Formel V ergibt sich so ein Verfahren zur Herstellung von Formimidoyiistamycin A oder B aus Istamycin A₀ oder Bo, welches per Saldo in der Acylierung der 4-Methylaminogruppe von Istamycin A₀ oder Bo mit Formimidoylglycin besteht. Das Gesamtverfahren besteht folglich aus den Stufen zum Schutz der 1 und 2'-Aminogruppen und der 6'Methylaminogruppe von Istamycin Ao oder Bo mit einer geeigneten Schutzgruppe, Einführung einer Glycylgruppe an der 4-Methylaminogruppe des l,2'-6'-tri-N-geschützten Istamycin A₀ oder B₀, Umwandlung der Glycylgruppe in eine Formimidoglycylgruppe und der schließlichen Entfernung aller Amino- und Methylaminoschutzgruppen aus der gewonnenen Verbindung.

Die Formimidoylistamycine A und B gemäß vorliegender Erfindung zeichnen sich durch hohe antibakterielle Wirkung bei geringer Toxizität für Tiere aus. Die Verbindungen sind infolgedessen in entsprechender Weise wie die bekannten Antibiotika als antibakterielle Mittel verwendbar. Sie können in an sich bekannter Weise in übliche pharmazeutische Verabreichungsformen gebracht und in diesen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft infolgedessen die im Anspruch 3 beanspruchten und gekennzeichneten pharmazeutischen Zubereitungen.

Die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen eignen

sich zur Bekämpfung und Unterdrückung des Bakterienwachstums bei Tieren. Die tatsächlich im Einzelfall zu verabreichenden effektiven Mengen an Formimidoylistamycin A oder B hängen dabei selbstverständlich von der Art der Zubereitung sowie vo.i der Art der zu in handelnden Krankheit und dem Zustand des Tieres ab. Viele Faktoren sind dabei zu berücksichtigen, so beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Ausmaß der Ausscheidung,

Mc 'ikamen^nkombinationen, Reaktionsempfindlichkcucn und Schwere der Krankheit des Patienten. Anhand dieser Faktoren kann der Fachmann leicht die optimal'' Dosis feststellen. Ganz allgemein kann gesagt werden, daß bei einer intramuskulären Injektion die Dosierung von Formimidoylistamycin Λ ode·' D bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei 50 bis 500 mg pro Person zwei- bis viermal pro Tag liegen kann.

Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und betreffen die Verfahrensstufen bei Verwendung von Istamycin A₀ oder Bo als Ausgangsmatcrial.

Beispiel I I lerstellung von Formimidoylistamycin A

(I) !^',o'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin An (Formel III; R = Benzyloxycarbonyl, X'= NHR,

Υ' _ U/nrrnj-ijIgrr

Zu einr^r Lösung von Istamycin A_n(LO g; 3.0 mMol) in 40 ml Methanol wurden 0.72 ml Triäthylamin gegeben. Anschließend wurde die Lösung mit N-Benzyloxycarbonylsuccinimid (2,1g; 8,1 mMol) in Methanol (12 ml) unter Rühren versetzt. Die entstandene Mischung wurde weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde in 60 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wurde mit 60 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Chloroformschicht zur Trockne eingeengt, wobei man 2,17 g eines pulverförmigen Rohproduktes erhielt. Dieses Pulver wurde in 3 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die 55 g Silikagel. CC-7⁰, enthielt. Die Kolonne wurde mit 560 ml einer Mischung aus Dichlormethan und Äthanol (Volumenverhältnis 150:1) gewaschen und anschließend mit demselben Lösungsmittelgemisch Volumenverhältnis jedoch 20 : 1) eluiert. Man erhielt auf diese Weise 931 mg der Titelverbindung in Form eines Pulvers. Ausbeute 42%.

(2) 1,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-2"-N-tert.-

butoxycarbonylistamycin A

(Formel IV; R = Benzyloxycarbonyl. A = Wasserstoff, B = tert.-butoxycarbonyl, X' = -NHR.

Y' = Wasserstoff

l^'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A₀ (931 mg: 1.27 mMol). welches gemäß Verfahrensstufe (1) erhalten worden ist, wurde in 30 ml Dioxan gelöst. Zu der Lösung wurden Triäthylamin (0,42 ml) und N-Hydroxysuccinimidester von N-tert.-Butoxycarbonylglycin (830 mg; 3,0 mMol) in Dicyan (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde 4.5 Stunden bei 60°C gerührt Danach wurde die Reaktionslösung zur Trockne eingeengt, wobei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhielt. Dieses Pulver wurde in 5 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde über eine Kolonne mit 150 g Silikagel, CC-7*, geleitet. Zum Eluieren der Kolonne wurde eine Mischung aus Dichlormethan und Äthanol (Volumenverhältnis 200 :1) verwendet. Das erhaltene pulverförmige Rohprodukt wurde in 5 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, welche einer einem Volumen vom iOOml entsprechende Menge Sephadex LH-20® enthielt. Die Kolonne wurde mit Methanol eluiert, wobei man die Tste'.verbindiing als reines pulverförmiges Produkt in einer Menge von 433 ml erhielt. Ausbeute 39%.

(3) Formimidoylistamycin A
(Formel i: < Amino, V-- Wasserstoff)

fas gemäß Stufe (2Ί erhaltene l.2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-2"-N-tert.-butoxycarbon\'.;sUimyciri A (388 mg; 0,44 mMol) wurde in 90%iger wäßriger Trifluoressigsäurelösung (5 ml) gelöst. Man ließ die Lösung 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen und engte sie dann zur Trockne ein. Der Rückstand wurde mit Äthyläther (20 ml) gewaschen. Man erhielt auf diese Weise i^'.fi'-Tri-N-benzyloxycarbonylistamycin A-Trifluoracetat (375 mg). Das Trifluoracetat wurde in einer Mischung aus 60 ml Methanol und 8 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde tropfenweise mit einer Lösung von Benzylformimidat-Hydrochlorid (624 mg; 2,5 mMol) in 10 ml Methanol versetzt, und zwar unter Eiskühlung im Verlauf von 15 Minuten, wobei der pH-Wert der Lösung

2n durch Zugaue von 0.5 η wäßriger Kaliumhydroxidlösung bei 8.5 gehalten wurde. Das Rcaktionsgcmisch wurde eine weitere Stunde unter Eiskühlung gerührt, damit die Einführung der Formimidoylgruppc -CH = NH, vervollständig werden konnte. Danach wurde durch Zugabe von 1 η Salzsäure der pl I-Wcrt auf 3,7 eingestellt und die Mischung zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde ir. 100 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (zweimal je 30 ml) gewaschen. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und zur Trockne eingeengt, so daß man ein pulverförmiges Rohprodukt (411 mg) erhielt. Dieses Pulver wurde in 3 ml einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 20:1) gelöst. Die Lösung wurde chromatographisch gereinigt, indem man sie über eine Kolonne mit 20 g Silikagel. CC-7\ leitete und die Kolonne anschließend mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 20:1) eluierte. Auf diese Weise erhielt man l,2'.6'-Tri-N-benzylox-'Carbonyl-2"-N-formimidoylistamycin A-Hy-

drochlorid( 193 mg) als Pulver. Ausbeute 54%. ■

Das so gewonnene Pu.ver(193 mg: 0.24 mMol) wurde in 12 ml einer Mischung aus Methanol. Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 2:1 : 1) gelöst. Die Lösung wurde über 5%igem Paliadium-auf-Kohle (100 mg) als Katalysator im Wasserstoffstrom bei Rauml -'nperatur im Verlauf von 4 Stunden hydriert, um die verbliebenen Aminoschutzgruppen zu entfernen. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde die Reaktionslösung zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde in 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 12 ml entsprechende Menge eines stark basischen Anionenaustauscherkatalysators. Amberlite IRA 400* (SCVForm). enthielt. Zum Eluieren der Kolonne wurde Wasser verwendet. Das Eluat wurde zur Trockne eingeengt und lieferte so die Titelverbindung in Form des Disulfat-Trihydratesals Pulver (134 mg). Ausbeute 82%.

Beispiel 2
Herstellung von Formimidoylistamycin B

(1) l^'.e'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin B₀

(Formel III: R = tert.-Butoxycarbonyl.

X' = Wasserstoff, Y^r = NHR)

Zu einer Lösung von Istamycin B₀ (500 mg: 1.5 mMol) in 20 ml Methanol wurde Zinkacetat (500 mg: 2.3 rr.Mo!) gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur

5 Stunden gerührt Anschließend wurde die Mischung mit 2-(tert-Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylacetonitril (17,1 g; 6,9 mMol; z. B. BOC - ON® versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt DaB auf diese Weise erhaltene Pulv&r wurde durch Säulenchromaiographic an Silikagel gereinigt (Silikagel: 100 g Wako gel C-200³; Eluierungsmittel: Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 10 :1). Man erhielt auf diese Weise die Titelverbindung als pulverförmiges Produkt in einer Menge von 412 mg. Ausbeute 44%. Zersetzungspunkt 71 bis 74°C; [α]? +50° (c 1,0; Methanol) R_r 0,28 bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel (Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 4 : 1).

(2)2"-N-BenzyIoxycarbonyl-l,2',6'-tri-N-tert.-

butoxycarbonylistamycin B

'Formel !V; R = tert.-Butox^vcarbonvl_f

A = Wasserstoff, B = Benzyloxycarbonvl,

X' = Wasserstoff. Y' = - N H R)

Das in Stufe (1) gewonnene 1.2',6'-Tri-N-tert.-butoxycarbonylistamycin Bo (200 mg; 032 mMol) wurde in 6 ml Dioxan gelöst. Die Lösung wurde mit 0,10 ml Triäthylamin und N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzyloxycarbo.iylglycin (235 mg; 0,76 mMol) versetzt. Die Mischung wurde bei 60⁰C 2 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingeengt, v/obei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhielt. Dieses Pulver wurde durch Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt (Silikagel: 30 g Wako gel C-200®: Eluierungsmittel: Äthylacetat-Toluol im Volumenverhältnis 3 :2). Das auf diese Weise gewonnene gereinigte Pulver wurde weiter gereinigt, indem man es in Methanol löste und über eine Kolonne leitete, die eine einem Volumen von 30 ml entsprechende Menge Sephadex LH-20® enthielt. Nach dem Einengen zur Trockne lag die Titelverbindung in Form eines Pulvers vor, und zwar in einer Menge von 246 mg. Ausbeute 94%. Zersetzungspunkt 104 bis !10⁰C; [ο.]·? +44° (el; Methanol); Rf 0.45 bei der Dünnschiciuchroniatographie an Silikagel (Äthylacetattoluol = im Volumenverhältnis 7 : 2).

(3) l^'.e'-Tri-tert.-butGxycarbonylistamycin B

(Formel V; R = tert-Butoxycarbonyl,

X' = Wasserstoff, Y'= - NHR).

-, Das in Stufe (2) gewonnene 2"-N-BenzyloxycarbonyI- !^',ö'-tri-N-tert-butoxycarbonylistamycin B (237 mg 03 mMol) wurde in 15 ml 80%igem Methanol und 0,01 ml Essigsäure gelöst Zur Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe wurde die Lösung im Wasserstoff-

η strom in Gegenwart von 50 mg eines 5%igen Palladium-auf-Kohle-ICatalysators bei Raumtemperafui und unter Atmosphärendruck hydriert Beim anschließenden Einengen der Lösung zur Trockne erhielt man die Titelverbindung als pulverförmiges Rohprodukt ir ■", Form ihres Acetates in einer Menge von 237 mg.

(4) Formimidoylistamycin B (Formel I)

Das in Stufe (3) gewonnene pulverförmige rohe 1,2' e'-Tri-N-tert-butoxycarbonylistamycin B- Acetal

;u (200 mg) wurde in 20 ml Methanol gelöst; die Lösung wurde mit Äthylformimidat-Hydrochlorid (233 mg 2.1 mMol) versetzt Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt; dabei wurde die Formimi doylgruppe -CH"NH eingeführt Die Reaktionslösung

r-, wurde zur Trockne eingeengt Das gewonnene Pulvei wurde durch Säulenchromatographie bei Silikage gereinigt tSüikagel: 42 g Wako gel C-200®; Eluierungs mittel: Chloroform-Methanol im Volumenverhältni; 7 : Ί). Auf diese Weise konnte 1.2',6'-tri-N-tert-buioxy

«ι carbonyl-formimidoylistamycin B-Hydrochlorid in Pul verforrn (82 g) gewonnen werden. Ausbeute 38%.

Dieses Pulver (54 g: 0,071 mMol) wurde in 2 m 90%;ger Trifluoressigsäure gelöst. Man ließ die Lösunj zwei Stunden bei 0 bis 5° C stehen, wobei die Abspaltunj

γ. der Schutzgruppen eintrat. Anschließend wurde zui Trockne eingeengt Das pulverförmige Rohprodukt welches auf diese Weise erhalten worden war, wurde ii Wasser gelöst. Die Lösung wurde über eine Kolonni geleitet, die eine einem Volumen von 4 ml entsprechen

'" de Menge eines stark basischen Anionenaustauscher harzes. Amberlite IRA 400* (SO^Form) enthielt. Zi Eluieren wurde Wasser verwendet. Anschließend wurdi das aufgefangene Eluat zur Trockne eingeengt. Mai erhielt so die Titelverbindung in Form des Disulfat-Di

^: - hydrates als Pulver (45 mg). Ausbeute 97%.

Ϊ08 1 09; ?'

Claims (2)

1. Patentansprüche: 1. Fonnimidoylistamycin A und B der Formel I

   NCH₃ COCH₂NHCH=NH

   mit folgender Substituenten-Bedeutung und Zuordnung: X Y

   NH₂
   H

   H NH₂

   <jnd deren Säureanlagerungssalze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

   Λ) ein l^'.ö'-tri-N-geschützies Istamycin der allgemeinen Formel V

   H₃CN-, / r O R
   4 ν /NH \ R V \/

   I OCH₃

   NCH₃ COCH₂NH₂

   mit folgender Siib'.tiluenten-Bedeutung und Zuordnung: \;V

   MIK

   (V)

   NHK

   wobei R eine übliche Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem Iminoäther umsetzt, B) aus der gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel Vl,

   X'

   OH

   OCH₃ NCH₃